SK287564B6 - Spôsob zvýšenia výťažku prostriedku obsahujúceho interferón-alfa - Google Patents

Abstract

Je opísaný spôsob zvýšenia výťažku prostriedku obsahujúceho interferón-alfa premenou izoformy interferónu-alfa s pripojenou štruktúrou pyruvátu na interferón-alfa, pričom na uvedenú izoformu s pripojenou štruktúrou pôsobí roztok zinku.

Description

Navrhovaný vynález opisuje spôsob zvýšenia výťažku prostriedku izoláciou a prečistením proteínov. Konkrétne navrhovaný vynález opisuje izoláciu proteínov, izoláciu izoforiem proteínov a zmien izoforiem na požadovaný proteín.

Doterajší stav techniky

Prirodzene sa vyskytujúce proteíny sú široko používané vo výskume v klinickej praxi. Hoci tieto proteíny je možné získať z prirodzených zdrojov, rekombinantné techniky môžu umožniť prípravu týchto proteínov z neprirodzených zdrojov. Napríklad pomocou fermentácie môžu mikroorganizmy pripravené rekombinantnými technológiami, ako sú transformované baktérie, produkovať veľké množstvá ľudského interferónu za podstatne nižšiu cenu, ako by bolo možné pri jeho získavaní z prirodzených zdrojov. Tieto rekombinantné DNA techniky môžu byť tiež použité na prípravu ďalších dôležitých proteínov, ako je inzulín a tkanivový aktivátor plazminogénu.

Baktérie upravené rekombintnanými technikami ale tiež produkujú prímesi a štruktúrne izoformy proteínu, ktorý má byť pripravovaný (pozri patent US 4 765 903, Andrea a kol.), bunkovú drvinu a vírusy (pozri patent US 4 732 683, Georgidias a kol.), izoformy s pripojeným pyruvátom (Rose a kol., J. Biol. Chem, 252:2998 (1997), Prome a kol. J. Biol. Chem, 266:13 050 (1991), Stevens a kol. J. Biol. Chem, 252:2 998 (1997) a Shapiro a kol. J. Biol. Chem, 255:3 120 (1980)). Je potrebné tieto kombinácie počas prečistenia proteínu odstrániť.

Je jasné, že izoformy proteínu znižujú čistotu pripravovaného proteínu a proces odstránenia izoforiem znižuje celkový výnos. Pokiaľ by bolo možné izoformy proteínov zmeniť na požadovaný proteín, ich odstraňovanie by nebolo nevyhnutné a celkový výťažok proteínu by bol podstatne zvýšený. Preto je potrebné poznať spôsob identifikácie izoforiem s pripojenou štruktúrou proteínov a spôsob ich zmeny na požadovaný proteín. Navrhovaný vynález je zameraný na tento cieľ.

Podstata vynálezu

Navrhovaný vynález opisuje prípravu vysoko čistých proteínov pri veľkých výťažkoch pomocou izolácie izoforiem s pripojenou štruktúrou a ich zmeny na požadovaný funkčný proteín. Konkrétne opisuje spôsob zvýšenia výťažku prostriedku obsahujúceho interferón-α, ktorý zahŕňa premenu izoformy interferónu-α s pripojenou štruktúrou pyruvátu na interferón-α, pričom na izoformu s pripojenou štruktúrou pôsobí roztok zinku.

Aj napriek tomu, že navrhovaný vynález sa neobmedzuje na inteferón-α, najvhodnejším variantom interferónu-α je interferón-a2b.

V inom variante navrhovaný vynález opisuje spôsob zmeny rekombinantné pripravenej izoformy s pripojenou štruktúrou na požadovaný proteín zahŕňajúci chemické odstránenie štiepiteľných skupín v izoforme s pripojenou skupinou.

Navrhovaný vynález nie je obmedzený len na odstraňovanie štiepiteľných skupín. V jednom variante navrhovaného vynálezu sú týmito štiepiteľnými skupinami pyruváty.

Navrhovaný vynález tiež nie je obmedzený na spôsoby chemického odstraňovania štiepiteľných skupín. V tomto konkrétnom variante je izoforma s pripojenou štruktúrou vystavená roztoku zinku. V tomto variante by pH roztoku zinku malo byť medzi 7,8 až 8,6. V ďalšom konkrétnom variante navrhovaného vynálezu by roztok zinku mal mať teplotu 30 °C až 38 °C.

V najvhodnejšom variante navrhovaného vynálezu obsahuje roztok zinku antioxidant. V najvhodnejšom variante navrhovaného vynálezu antioxidant obsahuje metionín. V tomto variante je potom koncentrácia metionínu 5-40 mM.

Tak ako je tu používaný termín „požadovaný proteín“, opisuje proteín, ktorý má byť prečistený. Identifikácia požadovaného proteínu je samozrejme cieľom purifikačného procesu. Napríklad počas prečistenia môže byť žiaduce získať skupinu alebo skupiny proteínov vrátane prímesi v medzikroku purifikačného procesu. Bez ohľadu na záujem pri získam skupiny proteínov v medzikroku, skupina proteínov, ktorá je cieľom purifikačného postupu, je rovnako označovaná ako požadovaný proteín.

Tak ako je tu používaný termín „izoforma s pripojenou štruktúrou“, znamená izoformu proteínu, ktorá má štruktúrnu alebo funkčnú charakteristiku podobnú požadovanému proteínu, pričom „štiepiteľná skupina“ môže byť odstránená tak, aby vznikol požadovaný proteín. Termínom „štiepiteľná skupina“ je chápaná chemická skupina naviazaná na požadovaný proteín, ktorá môže byť chemicky odstránená. „Chemické odstránenie“ alebo „chemicky odstránená“, ako je tu používané, opisuje takú chemickú skupinu, ktorá môže byť oddelená od proteínu chemickou cestou, napríklad pomocou roztoku kyseliny, zásaditého roztoku, pomocou katalýzy jónu kovu atď.

Hoci to nie je nevyhnutné pre postupy podľa navrhovaného vynálezu, tak pokiaľ je štiepiteľná skupina chemicky identifikovateľná, môže byť izoforma s pripojenou štruktúrou označená podľa konkrétneho typu. Napríklad „izoforma s pripojenou štruktúrou“ je požadovaný proteín obsahujúci štiepiteľnú skupinu, ktorá bola identifikovaná ako pyruvát. Ako je tu používané, termín „oxidačná reakcia“ opisuje reakciu určenú na prinútenie sulfidových skupín dvoch cysteínov do formy disulfidickej väzby.

Ako je tu používané, termín „interferón-α“ opisuje rodinu indukovateľných sekretovaných proteínov, ktoré zaisťujú rezistenciu cieľovej bunky proti vírusom, potlačujú bunkové delenie a regulujú expresiu MHC antigénov triedy I. Táto rodina zahŕňa predovšetkým interferón-a2a (Roferon, Hoffman, La-Roche, Nutley, NJ), interferón-a2b (Intron, Schering-Plough, Madison, NJ), interferón-a2c (Berofor Alfa, Boehringer, Ingelhein, Germany) alebo zmes interferónov, ktoré boli definované určením sekvencie prirodzene sa vyskytujúcich interferónov-α (Intergen, Amgen, Thousand Oaks, CA).

Navrhovaný vynález opisuje izoláciu a prečistenie proteínov. V jednom konkrétnom variante, navrhovaný vynález opisuje identifikáciu a prečistenie izoforiem s pripojenou štruktúrou. V ďalšom variante vynález opisuje spôsob prípravy požadovaného proteínu z izoforiem s pripojenou štruktúrou. V ešte ďalšom variante, navrhovaný vynález opisuje vysoko prečistený proteín pomocou prečistenia požadovaného proteínu zároveň s izoformami s pripojenou štruktúrou a ich následnú konverziu na požadovaný proteín. Pomocou tohto spôsobu je množstvo izoforiem s pripojenou štruktúrou znížené a celkový výťažok požadovaného proteínu je zvýšený a/alebo je zvýšená jeho čistota. Výťažok požadovaného proteínu môže byť zvýšený až desaťkrát, vzhľadom na objemy získané bez konverzie izoforiem s pripojenou štruktúrou.

Zatiaľ čo navrhovaný vynález nie je obmedzený pôvodom požadovaného proteínu alebo izoformy s pripojenou štruktúrou, v konkrétnych variantoch navrhovaného vynálezu je ako zdroj použitý mikroorganizmus pripravený pomocou rekombinantných techník. Každý odborník v súčasnom stave techniky pozná celý rad týchto techník. Tieto transformované mikroorganizmy môžu byť eukaryotické alebo prokaryotické bunky, baktérie, samčie bunky a pod. Napríklad interferón-α môže byť produkovaný v baktériách podľa patentu US 4 530 901, Weissman, alebo pomocou techniky opísanej v európskej patentovej prihláške EP 032 134.

Podobne, navrhovaný vynález nie je obmedzený na konkrétnu techniku extrakcie izoforiem s pripojenou štruktúrou z buniek, ktoré ich produkujú. Pokiaľ je požadovaným proteínom interferón-α, môžu byť použité techniky podľa patentu US 4 315 852 a 4 364 863, Leibowitz a kol.

Podobne, navrhovaný vynález nie je obmedzený na konkrétnu techniku použitú na oddelenie izoformy s pripojenou štruktúrou od požadovaného proteínu. Množstvo použiteľných chromatografických a iných separačných techník je známe v súčasnom stave techniky.

Zatiaľ čo navrhovaný vynález nie je limitovaný spôsobmi identifikácie izoforiem s pripojenou štruktúrou, ich identifikácia môže byť uskutočnená pomocou testovania molekulových hmotností požadovaného proteínu a prímesi s vyššou molekulovou hmotnosťou, ako má požadovaný proteín. Takáto technika je opísaná napríklad v Rose a kol., J. Biol. Chem. 267:19101 (1992). Prímesi s vyššou molekulovou hmotnosťou, ako má požadovaný proteín, môžu byť napr. degradované (napr. v kyslom prostredí alebo silno zásaditom prostredí) a môžu byť analyzované produkty degradácie. Pokiaľ jeden z týchto produktov degradácie má rovnakú hmotu a/alebo štruktúrne charakteristiky ako požadovaný proteín, je možné takúto hmotu označiť za izoformu s pripojenou štruktúrou obsahujúcou štiepiteľnú skupinu.

Zatiaľ čo navrhovaný vynález nie je limitovaný spôsobmi zmeny izoforiem s pripojenou štruktúrou na požadovaný proteín, v jednom konkrétnom variante môže testovací proces stanoviť správne podmienky konverzie. Napríklad jeden postup zahŕňa postupnú úpravu pH v reakčnej zmesi až do bodu, kedy je štiepiteľná skupina odstránená z izoformy a vznikne funkčný reverzibilne denaturovaný proteín.

Navyše navrhovaný vynález nie je limitovaný spôsobmi chemického odstraňovania štiepiteľných skupín. V jednom variante sú skupiny odstránené alebo odštiepené vystavením izoformy kyslému prostrediu (napr. použitím kyseliny octovej). V inom variante sú izoformy vystavené roztoku zinku.

Navrhovaný vynález nie je tiež obmedzený teplotou, pri ktorej sa uskutočňuje štiepenie. Všeobecne, čím je vyššia teplota, tým rýchlejšie bude izoforma premenená na požadovaný proteín.

Zatiaľ čo chemickým štiepením štiepiteľných skupín môže vzniknúť proteín s rovnakou štruktúrnou charakteristikou, akú má požadovaný proteín, je niekedy nevyhnutné oxidovať redukované skupiny obsahujúce síru tak, aby mohli tvoriť disulfidické väzby. To umožní proteínu získať správnu štruktúru a stať sa funkčným. Spôsoby oxidácie týchto skupín sú dobre známe v súčasnom stave techniky a navrhovaný vynález nie je obmedzený na žiadnu konkrétnu techniku oxidácie.

V jednom konkrétnom variante navrhovaného vynálezu je opísaná technika skupín metionínu počas oxidácie tak, aby bolo zabránené vytvoreniu metionín sulfoxidu. Spôsoby ochrany metionínových skupín sú dobre známe v súčasnom stave techniky a navrhovaný vynález nie je limitovaný technikou ochrany metionínových skupín. Tieto techniky sú opísané v Lam, a kol., J. Pharm. Sci 86:1250 (1997) a v patente US 5 272 135, Takruri.

Navrhovaný vynález nie je tiež obmedzený použitou oxidačnou reakciou. Napr. v jednom variante navrhovaného vynálezu je odstránenie štiepiteľných skupín nasledované oxidáciou sulfidických skupín. V inom variante navrhovaného vynálezu sa uskutočňuje odstránenie štiepiteľných skupín a oxidácia sulfidických skupín pri rovnakých reakčných podmienkach.

Podobne, len čo sú štiepiteľné skupiny odstraňované chemicky, oxidácia proteínu sa uskutočňuje zároveň s touto reakciou a navrhovaný vynález nie je obmedzený žiadnym spôsobom odstraňovania štiepiteľných skupín z izoforiem s pripojenou štruktúrou a oxidácie. V jednom variante je proces testovania zameraný na stanovenie ideálnych podmienok na chemické odštiepenie štiepiteľných skupín. Napr. experimenty testujúce rozsah pH môžu byť vykonávané tak, že je merané množstvo požadovaného proteínu s dostatočnou štrukturálnou integritou (t. j. nedenaturované) a/alebo množstvo štiepiteľnej skupiny. Vynesením množstva požadovaného proteínu s dostatočnou štrukturálnou integritou vzhľadom na reakčné pH by malo dať Gaussovu krivku, kde najvyšší bod tejto krivky predstavuje ideálne pH na chemické odstránenie tejto štiepiteľnej skupiny. V tomto variante je možné podobné testovanie vykonať aj pre oxidačnú reakciu. Pokiaľ sa tieto krivky predstavujúce priebeh chemického odštiepenia a oxidačnú reakciu pretínajú, potom priesečník predstavuje ideálne podmienky tak pH na odstránenie štiepiteľnej skupiny ako oxidáciu sulfidických skupín v jednej reakcii. Na chemické odstránenie skupín a oxidácie pyruvátu na izoformách s pripojenou štruktúrou interferónu-α sa tieto dve krivky pretínajú približne na pH 5, čím je dané ideálne pH na priebeh kombinovanej reakcie. Ďalšími reakčnými podmienkami, ktoré môžu byť stanovené, sú napríklad koncentrácia solí, teplota atď.

Po zmene izoforiem s pripojenou štruktúrou na požadovaný proteín môžu byť nevyhnutné niektoré chromatografícké postupy na prečistenie požadovaného proteínu od nečistôt.

Hneď ako je požadovaný proteín dostatočne prečistený, môže byť prevedený do formy použiteľnej na terapeutické použitie. Napríklad, pokiaľ je požadovaným proteínom interferón-α, sú použiteľné liekové formy opísané v patentoch US 4 847 079 a 4 496 537, Kwan, a v patente US 5 766 582, Yuen a kol. Je tiež možné použiť iné inertné farmaceutický prijateľné nosiče, a to buď pevné alebo kvapalné. Pevnou liekovou formou môže byť prášok, tabletka, rozpustné granuly, kapsuly, alebo čapík. Práškové formy alebo tabletky môžu obsahovať od 5 do asi 95 % požadovaného proteínu. Vhodnými pevnými nosičmi známymi v súčasnom stave techniky sú napr. uhličitan horečnatý, stearát horečnatý, mastok, cukor alebo laktóza. Tabletky, prášky a kapsuly môžu byť použité ako pevné liekové formy použiteľné na orálnu aplikáciu.

Na prípravu čapíkov je najprv roztavený vosk s nízkou teplotou topenia, akou je zmes glyceridov mastných kyselín (napr. kokosové maslo) a aktívna zložka je doň rovnomerne rozmiešaná. Roztavená homogénna zmes je naliata do vhodných foriem, v ktorých je ochladená do stuhnutia.

Kvapalné liekové formy zahŕňajú roztoky, suspenzie a emulzie. Sú to napr. roztoky vody alebo propylénglykolu vo vode určenej na parenterálnu injekcie, alebo pridanie sladidiel alebo kalidiel pre orálne podávané roztoky, suspenzie a emulzie. Kvapalné formy môžu tiež zahŕňať roztoky na intranazálne podanie.

Aerosólové prípravky, vhodné na inhaláciu, môžu zahŕňať tak roztoky, ako pevné látky vo forme prášku, ktoré môžu byť zmiešané s farmaceutický prijateľným nosičom, ako je inertný stlačený plyn.

Látky podľa navrhovaného vynálezu môžu byť tiež podávané transdermálne. Tieto transdermálne prostriedky zahŕňajú krémy, oleje, aerosóly a/alebo emulzie a môžu byť podané pomocou transdermálnych náplastí alebo nádob, ktoré sú na tento cieľ bežne používané v súčasnom stave techniky.

Množstvo aktívnej zložky v jednej dávke prípravku môže byť v rozmedzí od 0,01 mg do asi 1 000 mg, výhodnejšie potom od 0,01 mg do asi 750 mg. Ďalšou možnosťou je pripraviť látku v koncentrácii prepočítanú na medzinárodné jednotky, kedy najvhodnejšia dávka je v rozmedzí od 3 000 000 do 50 000 000 medzinárodných jednotiek. Vo variantoch podľa navrhovaného vynálezu sú použité liekové formy obsahujúce 3 000 000, 5 000 000, 18 000 000, 25 000 000 a 50 000 000.

Ďalej sú opisované pevné liekové formy, ktoré sú prispôsobené na vedenie do tekutej fázy, tesne pred použitím a určené na orálne povrchové alebo parenterálne podanie.

Nasledujúce príklady slúžia len na ilustráciu niekoľkých najvhodnejších konkrétnych variantov a aspektov navrhovaného vynálezu a nemôžu byť v žiadnom prípade brané ako limity navrhovaného vynálezu.

Príklady uskutočnenia vynálezu

Príklad 1

Spôsob testovania zmeny izoforiem s pripojenou štruktúrou obsahujúcich pyruvát

Izoformy s pripojenou skupinou obsahujúce pyruvát sú tvorené vnútri bunky, kedy cc-amino skupina Nterminálnej aminokyseliny proteínov je napojená na karbonylovú skupinu pyruvátu. Pokiaľ tento pyruvát narušuje konformáciu proteínov, potom len pokiaľ táto izoforma s pripojenou skupinou obsahujúca pyruvát je hydrolyzovaná (pyruvát je odštiepený od proteínov), môže sa tento proteín voľne preskupiť do požadovanej konformácie prostredníctvom termodynamicky stabilných konformačných zmien. Pokiaľ požadovaný proteín obsahuje disulfidické väzby, redukovaná izoforma vzniknutá po odštiepení pyruvátu môže byť oxidovaná ako súčasť procesu nevyhnutného preskupenia proteínu do požadovanej formy.

Nasledujúce postupy opisujú, ako stanoviť optimálne podmienky na zmenu izoformy s pripojenou skupinou obsahujúcou pyruvát na požadovanú formu proteínu. Ako je uvedené, pokiaľ požadovaný protein neobsahuje disulfidické väzby alebo väzbu, testovanie môže byť uskutočňované len so zámerom maximalizovať mieru odštepovania pyruvátu (hydrolýzu). Pokiaľ požadovaný protein obsahuje disulfidické väzby alebo väzbu, toto testovanie musí byť uskutočnené tak, aby bolo optimalizované nielen odštiepovanie pyruvátu (hydrolýza), ale zároveň vytváranie disulfidických väzieb (oxidácia).

Odštiepenie pyruvátu

Technika odštiepenia pyruvátu musí byť optimalizovaná pre maximálnu hydrolýzu tak, aby bolo možné stanoviť kinetiku odštiepovania pyruvátu. Napríklad, voľný pyruvát môže byť kvantifikovaný pomocou chemických modifikačných techník alebo enzymatických postupov. 2,4-Dinitrofenylhydrazín (DNPH) môže byť použitý ako látka tvoriaca deriváty pyruvátu. Vzorka potom prejde ultrafiltráciou tak, aby boli odstránené nežiaduce formy obsahujúce pyruvát pomocou vhodnej, napr. 10K, MWCO membrány. Filtrát je potom inkubovaný pri kyslom pH s DNPH, ktorý reaguje s voľným pyruvátom. DNPH-derivát pyruvátu môže byť ľahko analyzovaný na RP-HPLC pri použití C8 kolóny, ako je napríklad Nucleosil C8 (5 pm) kolóna.

Aj keď derivatizačná reakcia je stechiometrická, je možné tiež uskutočniť kvantitatívne meranie pyruvátu. Enzymový kit (napr. laktát dehydrogenáza/NADH) môže byť tiež použitý na stanovenie pyruvátu. Táto technika nevyžaduje ultrafiltráciu vzorky, pretože použité postupy sú natoľko šetrné, že neumožňujú oštiepenie pyruvátu z nežiaducej formy obsahujúcej pyruvát počas inkubácie.

Na stanovenie množstva tak voľného pyruvátuako aj naviazaného na protein, celkový naviazaný pyruvát môže byť odštiepený pred reakciou s DNHP. Aj keď reakcia s DNPH vyžaduje veľmi kyslé pH a relatívne dlhý inkubačný čas, pyruvát môže byť odštiepený a následne reagovať s DNPH počas jedinej inkubácie. Z tohto dôvodu je možné použiť vzorku bez ultrafiltrácie na reakciu s DNPH, pokiaľ je cieľom merať celkové množstvo voľného a naviazaného pyruvátu vo vzorke.

Izoformy

Existujú aspoň tri izoformy proteínu s disulfickými väzbami a dve izoformy proteínu bez disulfidických väzieb. Všeobecne, požadovaný protein a jeho redukovaná forma môžu byť ľahko rozlíšené pomocou RP-HPLC.

V prípade proteínu obsahujúceho disulfidické väzby, testovanie bude veľmi účinné pre tri izoformy (izoforma s pripojenou skupinou, redukovaný protein a požadovaný protein) a môže byť kvantitatívne analyzované na RP-HPLC. V tomto prípade nie je nutné použiť pyruvátovú techniku a je ľahké identifikovať, ktorý z krokov je limitujúci. Bohužiaľ, obyčajne je veľmi náročné rozlíšiť izoformu s pripojenou skupinou obsahujúcu pyruvát od redukovanej formy. V tomto prípade je pyruvátová technika nenahraditeľná na optimalizáciu všetkých krokov premeny.

Stanovenie izoforiem v prostriedku

Pokiaľ požadovaná forma neobsahuje disulfidické väzby, prostriedok obsahujúci izoformy môže byť analyzovaný veľmi ľahko, pretože izoforma s pripojenou skupinou obsahujúca pyruvát môže byť ľahko odlíšená od požadovaného proteínu pomocou RP-HPLC.

Pokiaľ požadovaná forma obsahuje disulfidické väzby a izoforma s pripojenou skupinou proteínu nie je oddeliteľná od redukovanej formy, pyruvát naviazaný na protein musí byť stanovený tak, aby bolo možné určiť obsah izoforiem v prostriedku. Moláme množstvo pyruvátu naviazaného na protein, ktoré zodpovedá množstvu izoformy s pripojenou skupinou obsahujúcou pyruvát, je vlastne celkové množstvo voľného a naviazaného pyruvátu bez množstva voľného pyruvátu. Toto môže byť stanovené vo vzorke pomocou techník s a bez ultrafiltrácie, pomocou DNPH techniky. Množstvo redukovanej formy je teda rozdiel medzi kombinovaným množstvom izoformy s pripojenou skupinou proteínu a redukovanej formy stanovenej pomocou RP-HPLC a množstva pyruvátu naviazaného na protein stanoveného pomocou pyruvátovej techniky. Z týchto hodnôt je možné vypočítať zloženie izoforiem v prostriedku.

Testovanie optimálnych podmienok

Či požadovaná forma obsahuje disulfidické väzby alebo neobsahuje, testovacie kritériá sú rovnaké s cieľom maximalizovať mieru špecifickej konverzie izoforiem s pripojenou štruktúrou na požadovanú formu.

Požadovaný protein nemá disulfidické väzby

V tomto prípade požadovaný protein vznikne hneď po odštiepení pyruvátu z izoformy s pripojenou skupinou obsahujúcou pyruvát. Miera štiepenia pyruvátu nemusí byť monitorovaná pyruvátovou technikou v tomto prípade, pretože ide len o jediný krok, hydrolýzu, ktorá ovplyvňuje zmenu izoformy s pripojenou sku pinou na požadovanú formu. Napríklad, monitorovanie ako úbytku izoformy s pripojenou skupinou, tak naberanie požadovanej formy pomocou RP-HPLC, je úplne dostatočné. Je potrebné nájsť len inkubačné podmienky, ktoré maximalizujú zmenu izoformy s pripojenou skupinou na požadovanú formu proteínu.

Prvým krokom je stanoviť reakčnú kinetiku vzhľadom na pracovné rozmedzie koncentrácií izoformy s pripojenou skupinou proteínu, ktoré sú použité pri testovaní. Pokiaľ ide o kinetiku prvého radu vzhľadom na koncentráciu izoformy s pripojenou skupinou, koncentrácia vzoriek nemá vplyv na kinetiku a žiadny parameter koncentrácie nemusí byť testovaný počas hľadania ideálnych parametrov. Naopak koncentrácia by mala byť počas testovania udržovaná konštantné.

Hydrolýzu pravdepodobne ovplyvňuje veľké množstvo parametrov. Najdôležitejšie sú pH, teplota, koncentrácia kovových iónov (ako sú ióny zinkové, železité, meďnaté, horečnaté atď.), vodivosť, pufry, svetlo a miešanie. Pomocou stanovenia efektu týchto inkubačných parametrov na zmenu izoformy s pripojenou skupinou na požadovanú formu umožní optimalizáciu každého parametru. Napr. niektoré alikvoty vzorky obsahujúce izoformu s pripojenou skupinou obsahujúcou pyruvát sú inkubované v dostatočnom rozmedzí rôznych hodnôt pH so všetkými ostatnými parametrami nastavenými na najvhodnejšie hodnoty. Rýchlosť reakcie v každom alikvote je potom stanovovaná v niekoľko časových intervaloch inkubácie (napr. cez noc). Hodnota pH, pri ktorej je dosiahnutá najlepšia miera premeny, je potom stanovená ako optimálne pH. Tento experiment je opakovaný na optimalizáciu ďalších parametrov pomocou hodnôt skôr optimalizovaných parametrov namiesto skôr použitých najvhodnejších teoretických hodnôt. Toto je typický postup optimalizácie.

Hodnota pH pri inkubácii výrazne ovplyvňuje mieru hydrolýzy. Všeobecne, nižšie pH zaistí vyššiu mieru hydrolýzy. Zvýšená teplota tiež zvyšuje mieru hydrolýzy. Teda hydrolýza pri veľmi kyslom pH, ako je napríklad pH 2, nemusí byť uskutočnená, pretože dôjde k nevratnému zrazeniu izoformy s pripojenou skupinou alebo požadovaného proteínu, alebo k nevratnej denaturácii proteínu.

Prítomnosť niektorých katiónov kovu môžu katalyzovať hydrolýzu. Pokiaľ je táto katalýza spôsobovaná prítomnosťou katiónov, rýchlosť odštepovania pyruvátu je silno závislé od koncentrácie kovových katiónov. Z toho vyplýva, že pri hľadaní optimálnej koncentrácie je potrebné použiť veľmi široké koncentračné rozmedzie kovových katiónov. Môže sa však stať, že medzi parametrami dochádza k interakciám. Napríklad, je možné, že sú zistené rôzne optimálne pH v závislosti od prítomnosti niektorého kovového iónu, alebo v prípade, že tento katión ovplyvňuje premenu. V prípade izoforiem s pripojenou štruktúrou obsahujúcich pyruvát prítomnosť katiónov zinku ovplyvní optimálne pH na odštiepenie pyruvátu (pH 7,8 až 8,6). Preto je nevyhnutné meniť v rovnaký čas nový optimalizovaný parameter, ale aj skôr zistené dôležité parametre, aby došlo k skutočnej optimalizácii systému.

Požadovaný proteín obsahuje disulfídickú väzbu alebo väzby

V procese premeny zloženej z dvoch krokov je redukovaná forma pripravená z izoformy s pripojenou skupinou pomocou hydrolýzy a následne premenená na požadovanú formu pomocou oxidácie.

V ideálnom prípade sú izoforma s pripojenou skupinou proteínu a redukovaná forma izolované a je použitý opísaný proces pre proteín bez disulfídických väzieb tak na izoformu s pripojenou skupinou, ako i na redukovanú formu po otpimalizácii jednotlivých krokov. Najväčším rozdielom je ďalší parameter, ktorý je potrebné optimalizovať na oxidačný krok, okrem uvedených parametrov, ktorý je nevyhnutný na prenos kyslíka a pridanie niektorých oxidačných činidiel, ako je oxidovaný glutatión (GS-SG). Pokiaľ pomocou GS-SG je oxidovaná len redukovaná forma, zvyšuje to podstatne účinnosť oxidácie a tak vlastne tvorby disulfídických väzieb. Je pravdepodobné, že výťažky budú veľmi nízke, pokiaľ pri premene pri použití GS-SG je tiež oxidovaná izoforma s pripojenou skupinou, pretože táto izoforma s pripojenou skupinou po oxidácii je veľmi ťažko hydrolyzovateľná. Zo všetkých optimálnych podmienok je potrebné zvoliť takú optimálnu zostavu parametrov, pri ktorej bude dochádzať k premene izoformy s pripojenou skupinou na požadovaný proteín. Pokiaľ sú v rozumnom rozsahu, sú tieto podmienky brané ako optimálne podmienky. Teoreticky, môžu byť rôzne optimálne podmienky v závislosti od východiskového pomeru izoformy s pripojenou skupinou obsahujúcej pyruvát k redukovanej forme vo vzorke. Napríklad, optimálne podmienky môžu byť rôzne, pokiaľ je izoforma s pripojenou skupinou v absolútnej väčšine, ako pokiaľ je v absolútnej väčšine redukovaná forma. Je teda jasné, že optimálne redukčné podmienky na jednotlivé vzorky je potrebné navzájom porovnať a potom z týchto hodnôt vyvodiť priemerné optimálne podmienky pre každú ďalšiu vzorku.

Optimálne podmienky premeny sú experimentálne potvrdené. V prípade jemného dolaďovania optimálnych podmienok premeny je vhodné identifikovať hlavný limitujúci krok. Štúdium akumulácie redukovaných foriem počas inkubácie ukazuje, že limitujúcim krokom je krok oxidácie. Pokiaľ dôjde k akumulácii, je potrebné použiť silnejšie podmienky na oxidáciu, ako je napríklad vyšší prívod kyslíka, vyššie pH a vyššiu teplotu, ktoré po aplikácii maximalizujú tvorbu požadovanej formy. Pokiaľ je vo vzorke neustále nízke množstvo redukovaného proteínu a miera tvorby požadovaného proteínu je nízka, je limitujúcim faktorom krok štiepenia. Pokiaľ dochádza k tomuto, je potrebné inkubačné podmienky pozmeniť tak, aby bol posilnený krok štiepenia, čo povedie k maximalizácii tvorby požadovaného proteínu. Pokiaľ optimálne podmienky na chemické odstránenie štiepiteľnej skupiny a na oxidáciu proteínu sú veľmi vzdialené, je potrebné ich apli kovať v dvoch krokoch. Napríklad, najprv sú aplikované optimálne podmienky na hydrolýzu a potom keď hydrolýza je v podstate kompletná, sú podmienky pozmenené na podmienky optimálnej oxidácie.

Pokiaľ nie je možné izolovať všetky izoformy, je pyruvátová technika nepoužiteľná, predovšetkým pokiaľ tieto dve izoformy nie sú rozlíšiteľné pomocou RT-HPLC. Sledovaním uvoľňovania pyruvátu môže byť najprv optimalizovaný krok hydrolýzy ako prvý. Ďalší krok môže byť optimalizovaný, pokiaľ je prvý krok ukončený alebo takmer ukončený. Z týchto optimálnych podmienok sú optimálne podmienky na celkovú premenu vyhodnotené a experimentálne potvrdené. Inou alternatívou je, že celková optimálna premena je optimalizovaná po optimalizácii hydrolýzy. Tento prístup je výhodnejší, pokiaľ je náročné optimalizovať druhý krok vďaka vplyvu kontinuálnej hydrolýzy izoformy s pripojenou štruktúrou. Ako bolo povedané, pH, teplota, prívod kyslíka, kovové ióny a oxidanty sú dôležité parametre, ktoré je potrebné optimalizovať.

Interakcie medzi parametrami sú dôležité na konverziu v dvoch krokoch, ako v premene počas jedného kroku.

Na potvrdenie, že nedošlo k poškodeniu požadovaného proteínu v stanovených optimálnych podmienkach, je potrebné požadovaný proteín prečistiť a overiť jeho vlastnosti, vrátane biologickej špecifíty a aktivity·

Príklad 2

Zmena izoformy s pripojenou štruktúrou obsahujúcou pyruvát na interferón-a2b

Štiepenie pyruvátu a vytváranie disulfidických väzieb sa uskutočňuje pri zvýšenej teplote (30 až 37 °C) a reakčným pH 5,2 až 5,6. Tieto reakčné podmienky sú jedinečné v tom, že obe reakcie sú uskutočňované následne pri rovnakých reakčných podmienkach a výsledkom je bioaktívny proteín.

Frakcie obsahujúce maximum proteínu zistené pomocou UV absorbancie pri vymývaní proteínu počas preparatívnej chromatografie sú miešané a cez filter s 0,48 uM filtrované do sterility.

Je pridaných 3 g metionínu na liter roztoku proteínu a za stáleho miešania rozpustených. Hodnota pH je upravená 5,2 až 5,6 pomocou pridania hydroxidu sodného. Koncentrácia chloridu sodného nie je upravená, je v rozmedzí od 150 až 200 mM NaCl.

Roztok obsahujúci 10 mM kyseliny octovej pH 5,5, 200 mM metionínu a 200 mM NaCl je pridaný k roztoku proteínu do celkovej koncentrácie metionínu 20 mM.

Roztok proteínu je prenesený do reakčnej nádoby a teplota je zvýšená na 37 °C za stáleho miešania. Reakčná zmes obsahujúca proteín je potom miešaná pri 36 až 38 °C v čase 24 až 30 hodín.

Po uplynutí 24 až 30 hodín je reakčná zmes filtrovaná cez filter a potom cez 0,45 μΜ filter tak, aby boli odstránené zrazeniny. Reakčná zmes je potom skoncetrovaná a diafiltrovaná proti 10 mM kyseline octovej s pH 5,5 pri 2 až 10 °C.

Príklad 3

Zmena izoformy s pripojenou štruktúrou obsahujúca pyruvát na interferón-a2b s použitím iónov zinku

Izoforma s pripojenou štruktúrou obsahujúcou pyruvát je premenená interferón-a2b pri 34 °C a pH 8,2 pomocou roztoku zinku (1 M). Počas reakcie je reakčná zmes miešaná. Len čo je premena dokončená na 80 %, je teplota reakčnej zmesi znížená na 4 °C a tým je reakcia zastavená.

Potrebné roztoky: IM Tris pufor skladovaný pri 4 °C, IM Tris bázy + HCI s pH 8,3, lmM roztok zinku, skladovaný pri 4 °C, 1 mM ZnSO₄H₂O + 10 mM octan sodný + 175 mM NaCl s pH 5,5.

Frakcie obsahujúce maximum proteínu zistené pomocou UV absorbancie pri vymývam proteínu počas preparatívnej chromatografie a sú miešané a 0,2 uM filtrované do sterility. Asi 0,083 (V/V) IM Tris pufia je pomaly pridané k roztoku proteínu (pH obvyklého roztoku proteínu je v rozsahu od 5,2 do 5,5) za stáleho miešania, až je dosiahnuté pH asi 8,2.

mM roztoku zinku je pomaly pridané k proteínu za stáleho miešania tak, aby bolo dosiahnuté 0,6 k 1,0 molámeho pomeru katiónov Zn k celkovému množstvu izoformy pripojenou štruktúrou obsahujúcou pyruvát, t. j. pokiaľ koncentrácia izoformy s pripojenou štruktúrou obsahujúca pyruvát je 1,0 mg/ml, je potrebné 30 μΜ roztoku Zn alebo 0,03 (V/V) 1 mM roztoku Zn. Je potrebné použiť čerstvý roztok katiónov zinku.

Reakčná zmes je zohriata na 34 °C v reakčnej nádobe za stáleho miešania. Teplota reakčnej zmesi je udržovaná na 34 °C počas celej reakcie. Nepretržité miešanie je nevyhnutné udržovať v takej miere, aby bolo dostatočné, ale nie natoľko, aby mohli vzniknúť bubliny. Do reakčnej nádoby je potrebné zaviesť ventiláciu, ktorá zaisťuje dostatočný prívod kyslíka. Pokiaľ je však reakčná nádoba naplnená len do polovice, táto ventilácia nie je nevyhnutná. Počas reakcie môžu byť odobraté vzorky, aby bolo možné sledovať priebeh premeny pomocou RP-HPLC. Hneď ako je reakcia na konci, reakčná zmes je ochladená na 4 °C pre ďalší krok chromatografie.

Z uvedeného je zrejmé, že navrhovaný vynález opisuje techniku identifikácie nežiaducich foriem proteínu a zmeniť ich na požadovaný proteín, so zvýšenou účinnosťou a čistotou požadovaného proteínu.

Claims (1)

1. Spôsob zvýšenia výťažku prostriedku obsahujúceho interferón-α, vyznačujúci sa tým, že zahŕňa premenu izoformy interferónu-α s pripojenou štruktúrou pyruvátu na interferón-α, pričom na izoformu s pripojenou štruktúrou pôsobí roztok zinku.

Spôsob podľa nároku 1, Spôsob podľa nároku 1, Spôsob podľa nároku 1,

Spôsob podľa nároku 1, Spôsob podľa nároku 5,

Spôsob podľa nároku 6, Spôsob podľa nároku 1, vy z vy z vy z vy z vy z vy z n n n n n n č č č č u J u j u j u j u j u j ú ú ú ú ú ú

C I c i c i c i c i c i vyznačujúci s s s s s s a a a a a a m m m m tý tý tý tý t ý m t ý m tým, že interferón-α je interferón a2b. že roztok zinku má pH 7,8 až 8,6.

že roztok zinku má teplotu 30 až 38 °C. že roztok zinku obsahuje antioxidant. že antioxidant obsahuje metionín.

že metionín je v koncentrácii 5-40 mM. že ďalej zahrnuje purifikáciu interferó2.

3.

4.

5.

6.

7.

8.

nu-a2b s použitím chromatografie.

9. Spôsob podľa nároku 8, vyznačujúci nitnú chromatografiu na agaróze, nasledovanú aniónomeničovou chromatografiou na agaróze, ktorá je nasledovaná procesom kryštalizácie.

tým, že chromatografia zahŕňa farebnú afi-