HUP0104113A2 - Eljárás interferon izoformok konvertálására és termékeik - Google Patents

Abstract

A találmány tárgya eljárások fehérjék kísérő izoformjainak izolálásáraés a kívánt fehérjévé konvertálására. Az előnyös megvalósításokbansavas oldatok vagy cinkoldatok használatával egy kémiai csoportothasítanak le a kívánt fehérjéről. További előnyös megvalósításokban akémiai csoport lehasítása után a redukált szulfhidrilcsoportokatoxidálják, hogy a kívánt fehérje funkcióképes formáját kapják meg. Ó

Description

.

PO! ^’13

KÖZZÉTÉTELI

PÉLDÁttíií.

H-1062 Budapest. Andrássy út 113. Telefon: 34-24-950, Fax: 34-24-323 .'429/BE

Eljárás interferon izoformok konvertálására és termékeik

A találmány tárgyát fehérjék izolálása és tisztítása képezi. Pontosabban, a találmány tárgyát fehérjék izolálása, fehérjék izoformjainak izolálása és az izoformoknak a kívánt fehérjékké való átalakítása képezi.

A természetben előforduló fehérjéket kiterjedten használják kutatási és klinikai célokra. Bar az ilyen fehérjék a természetes forrásaikból is nyerhetők, a rekombináns technikák lehetővé teszik, hogy ezeket a fehérjéket a természetestől eltérő források is termeljék. így például rekombináns technológiával létrehozott mikroorganizmusok, például transzformált baktériumok fermentálásával nagy mennyiségű humán interferon állítható elő lényegesen alacsonyabb költséggel, mint a természetes forrás használata esetén. Az ilyen rekombináns DNS technikákat más fontos fehérjék, például az inzulin és a szöveti plazminogén—aktivátor termelésére is használják.

A rekombináns technikákkal módosított baktériumok azonban a termeltetni kívánt fehérje szerkezeti izoformjait és szennyezéseket is termelnek. Az ilyen szennyeződések és izoformok közé tartoznak az oligomer fehérjék és a redukált fehérje-izoformok (US 4,765,903 számú szabadalmi irat), a sejttörmelékek és a vírusok (US 4,732,683), és a piruváthoz kötött izoformok [Rose et al., J. Bioi. Chem. 287, 19101 (1992); Prome et al., J. Bioi. Chem. 266, 13050 (1991); Stevens et al., J. Bioi. Chem. 252, 2998 (1977); Shapiro et al., J. Bioi. Chem. 255, 3120 (1980)]. Kívánatos, hogy ezeket a szennyeződéseket a fehérje tisztítása

·..· : ..·· ··.·.során eltávolítsuk.

Világos, hogy ezek a fehérje izoformok csökkentik a kívánt fehérje tisztaságát, és az izoformok eltávolítására szolgáló eljárások csökkentik a kitermelést. Ha azonban a fehérje- izoformokat át lehetnek alakítani a kívánt fehérjévé, akkor szükségtelenné válna az eltávolításuk és a fehérje hozama jelentősen megnövekedne. Szükség van tehát egy módszerre, amellyel a nem kívánatos fehérje izoformok felismerhetők és a kívánt fehérjévé konvertálhatók. Találmányunk ezt a szükségletet elégíti ki.

Találmányunk tárgyát tehát eljárások képezik nagy tisztaságú fehérjék nagy hozammal történő előállítására azáltal, hogy izoláljuk a kísérő izoformokat és átalakítjuk azokat a kívánt, funkcionális fehérjévé. A találmány egyik megvalósítása egy eljárás egy α-interferon készítmény előállítására, amely eljárás egy kísérő izoform α-interferonná való konvertálását foglalja magában. Bár találmányunk nem korlátozódik egy adott a-interferonra, egy előnyös megvalósításban az α-interferon az a-2b interferon .

Egy másik megvalósításban találmányunk egy eljárást biztosít egy rekombináns úton előállított kísérő izoformnak a kívánt fehérjévé való átalakítására, amely eljárás egy leválasztható csoportnak a kísérő izoformról kémiai úton történő eltávolítását foglalja magában.

Találmányunk nem korlátozott az eltávolított leválasztható csoport által. Az egyik megvalósításban a leválasztható csoport a piruvátcsoport.

Találmányunkat a leválasztható csoport eltávolítására alkal72.429/BE mázott kémiai eljárás sem korlátozza. Az egyik megvalósításban az eljárás a kísérő izoform savas oldattal való érintkeztetését foglalja magában. Ha a kísérő izoform az a-interferőn piruvátizoformja, akkor előnyös, ha a savas oldat pH-ja körülbelül 5,5. Ebben a megvalósításban az is előnyös, ha a savas oldat hőmérséklete 34-40 °C. Egy másik megvalósításban azonban a kísérő izoformot egy cinkoldattal érintkeztetjük. Egy előnyös megvalósításban a cinkoldat pH-ja 7,8-8,6. Egy további előnyös megvalósításban a cinkoldat hőmérséklete 30-38 °C.

Találmányunk számára a sav vagy a cinkoldat mibenléte sem jelent korlátot. Az előnyös megvalósításokban a savas oldat vagy a cinkoldat egy antioxidánst tartalmaz. A különösen előnyös megvalósításokban az antioxidáns a metionin. Egy ilyen megvalósításban a metionin előnyös koncentrációja 5-40 mM.

Leírásunkban a „kívánt fehérje kifejezés azt a fehérjét jelenti, amelyet meg akarunk tisztítani. A kívánt fehérje meghatározása természetesen a tisztítási eljárás végső céljától függ, így például a tisztítási folyamat során kívánatos lehet egész fehérje-csoportot vagy csoportokat kinyerni egy közbeeső lépésben, de függetlenül egy átmeneti fehérje-csoport kinyerésének fontosságától csak azt a fehérje-csoportot tekintjük „kívánt fehérjének, amely a tisztítási eljárás végső célja.

A „kísérő izoform kifejezés egy olyan fehérje—izoformot jelent, amelynek szerkezeti és/vagy funkcionális jellemzői hasonlóak a kívánt fehérjééhez, és amiből egy leválasztható csoport eltávolításával megkapjuk a kívánt fehérjét. A „leválasztható csoport egy kémiai, a kívánt fehérjéhez kapcsolódó csoportot

72,429/BE jelent, amely kémiai úton eltávolítható. A „kémiai eltávolítás vagy „kémiai úton való eltávolítás kifejezések azt jelentik, hogy egy kémiai csoportot kémiai eszközökkel, például savas vagy lúgos oldatokkal, fémionos katalízissel, és a többi, választunk le egy fehérjéről.

Bár ez nem szükséges a találmányunk megvalósításához, de ha a leválasztható csoport kémiailag meghatározható, akkor a kísérő izoformot egy megadott típusú kísérő izoformnak nevezhetjük. így például a „kísérő piruvát-izoform kifejezés egy olyan kívánt fehérjét jelent, amelyen a leválasztható csoport piruvátcsoportként azonosítható.

Az „oxidációs reakció egy olyan reakciót jelent, amelyben két cisztein szulfhidril-csoportja egy diszulfid-híddá alakul át.

Az „α-interferon az indukálható, szekretált fehérjék egy olyan családjának neve, amely vírusok elleni rezisztenciát biztosít a célsejtek számára, gátolja a sejtek burjánzását és szabályozza az MHC I. osztályú antigének kifejeződését. Ebbe a családba tartoznak nem kizárólag az a^-2a (Roférőn, Hoffman La— Roche, Nutley, N.J.), az a-2b (Intron, Schering-Plough, Madison, N.J. ), az oc-2c (Berofor Alpha, Boehringer Ingelheim, Ingelheim, NSZK) vagy a konszenzus interferon, amelynek szekvenciája a természetben előforduló α-interferonokban közös.

A találmány tárgyát tehát fehérjék izolálása és tisztítása képezi. Találmányunk egyik megvalósítása a kísérő izoformok azonosítását és tisztítását biztosítja. Találmányunk egy másik megvalósítása eljárások egy kívánt fehérje előállítására a kísérő

72.429/BE izoformokból. Találmányunk egy további megvalósítása egy nagy tisztaságú kívánt fehérjét biztosít azáltal, hogy a kívánt fehérjét együtt tisztítjuk a kísérő izoformjaival, majd az izoformokat átalakítjuk a kívánt fehérjévé. így eljárva a kísérő izoform mennyisége csökken, a kívánt fehérje általános kitermelése növekszik és/vagy nagyobb tisztaságú lesz, mint amilyent korábban el lehetett érni. A kívánt fehérje kitermelése akár tízszeresére is fokozható ahhoz képest, amit az izoformok átalakítása nélkül lehet elérni.

Bár találmányunkat nem korlátozza a kívánt fehérje vagy a kísérő izoformok forrása, az egyik megvalósításban a forrást rekombináns technikákkal módosított mikroorganizmusok képezik. A szakemberek számos ilyen technikát ismernek. A transzformált mikroorganizmusok lehetnek eukarióta vagy prokarióta sejtek, baktériumok, emlős sejtek, és a többi. így például az a-interferont előállíthatjuk baktériumokkal az US 4,530,901 számú szabadalmi irat leírása szerint, vagy az EP 032,134 számú szabadalmi iratban leírt technikákkal.

Hasonlóképpen, találmányunk nem korlátozódik a kísérő izoformnak a termelő sejtből való extrahálására szolgáló egy adott eljárásra. Ha a kívánt fehérje az α-interferon, akkor megfelelőek például az US 4,135,852 és 4,364,863 számú szabadalmi iratokban leírt eljárások.

Ugyancsak, találmányunk nem korlátozódik a kísérő izoform vagy a kívánt fehérje izolálására szolgáló, meghatározott tisztítási technikákra. A szakemberek számos kromatográfiás vagy másféle elválasztási technikát ismernek, amelyek itt mind alkalmazhatók.

72.429/BE

Noha találmányunkat nem korlátozza a kísérő izoformok azonosítására használt eljárás, a kísérő izoformok azonosítása úgy oldható meg, hogy meghatározzuk a kívánt fehérje és minden olyan szennyeződés molekulatömegét, amelyé nagyobb, mint a kívánt fehérjéé. Az egyik ilyen módszert Rose és munkatársai írták le [ J. Bioi. Chem. 2 67, 19101 (1992)] . Az olyan szennyeződéseket, amelyek molekulatömege nagyobb, mint a kívánt fehérjéé, lebontó eljárásokkal (például erősen savas vagy lúgos anyagokkal) kezeljük, majd megvizsgáljuk a bomlástermékeket. Ha a bomlástermékek egyikének molekulatömege és/vagy szerkezeti jellemzői azonosak a kívánt fehérjéével, akkor a szennyeződést egy kísérő izoformnak tekintjük, aminek egy leválasztható csoportja van.

Mivel találmányunk nem korlátozódik egyetlen, a kísérő izoformot a kívánt fehérjévé átalakító eljárásra, az egyik megvalósításban egy szűrővizsgálatot használhatunk az átalakítás megfelelő körülményeinek meghatározására. így például az egyik eljárásban lépésenként változtatjuk a reakcióelegy pH-ját addig a pontig, ahol a leválasztható csoport lehasad a kísérő izoformról és egy funkcióképes vagy reverzibilisen denaturált kívánt fehérjét kapunk.

Ezen kívül találmányunkat nem korlátozza a leválasztható csoport lehasítására szolgáló kémiai eljárás sem. Az egyik megvalósításban a csoportot úgy távolítjuk el vagy hasítjuk le, hogy a kísérő izoformot savas körülményeknek tesszük ki (például ecetsavat használva). Egy másféle megvalósításban a kísérő izoformot cinkkel kezeljük.

Találmányunkat az a hőmérséklet sem korlátozza, amelyen a 72.429/BE lehasító reakciót folytatjuk. Általában azonban minél magasabb a hőmérséklet, annál gyorsabban alakul át a kisérő izoform a kívánt fehérjévé.

Bár a leválasztható csoport kémiai eltávolítása eredményezhet egy olyan fehérjét, amelynek szerkezeti jellemzői azonosak a kívánt fehérjéével, néha szükségessé válhat, hogy redukált szulfhidril-csoportokat diszulfid-hidakká oxidáljunk. Ez teszi lehetővé, hogy a fehérje elnyerje a megfelelő térszerkezetet és funkcióképessé váljon. A szulfhidril-csoportok oxidálására szolgáló eljárások jól ismertek a szakterületen, és találmányunk nem korlátozódik egy adott oxidáló eljárásra.

Találmányunk egyik megvalósításában megfontolható a metionincsoportok vedelme az oxidáció alatt, hogy megelőzzük a me— tionin-szulfoxid keletkezését. A metionincsoportok védelmére szolgáló eljárások jól ismertek a szakterületen, és találmányunk nem korlátozódik egy adott, a metionincsoportok védelmére szolgáló eljárásra. Antioxidánsokat alkalmazó eljárások vannak leírva Lám és munkatársai közleményében [ J. Pharm. Sci. 86, 1250 (1997)] és az US 5,272,135 számú szabadalmi iratban.

Találmányunkat az oxidációs reakció kivitelezésének módja sem korlátozza. így például az egyik megvalósításban a leválasztható csoport eltávolítását követi a szulfhidril-csoportok oxidálása. Egy másik megvalósításban a leválasztható csoport eltávolítása és a szulfhidril-csoportok oxidálása ugyanolyan reakciókörülmények között történhet meg.

Hasonlóképpen, ha a leválasztható csoport eltávolítását és a fehérje oxidálását ugyanabban a reakcióban végezzük el, találmá

72.429/BE nyunkat semmilyen módon nem korlátozza a leválasztható csoport eltávolítását és az oxidálást szolgáló, adott eljárás. Az egyik megvalósításban azonban egy szűrővizsgálatot végzünk, hogy meghatározhassuk a legjobb reakciókörülményeket a leválasztható csoport eltávolítására. így például különböző pH mellett végzünk kísérleteket és megmérjük az ép szerkezetű (azaz nem irreverzibilisen denaturált) kívánt fehérje és/vagy a leválasztható csoport mennyiségét. A megfelelő szerkezeti integritású, kívánt fehérje mennyiségét a reakció pH-jának függvényében ábrázolva haranggöbét kapunk, amelynek legmagasabb pontja jelzi az ideális pH-t a leválasztható csoport lehasitásához. Egy ilyen megvalósításban hasonló szűrővizsgálatot végezhetünk az oxidációs reakcióval is. Ha a kémiai eltávolítás és az oxidációs reakció haranggörbéi metszik egymást, akkor a metszésponthoz tartozó pH a legmegfelelőbb a leválasztható csoport eltávolításához és a szulfhidril-csoportok oxidálásához ugyanabban a reakcióban. Az a-interferon piruvát-izoformja esetében a két görbe metszéspontja körülbelül pH = 5-nél van, ami a legjobb a kombinált reakció lefolytatásához. A további reakciókörülmények — amelyek hasonló módon meghatározhatók — közé tartoznak nem kizárólag a sókoncentráció, a hőmérséklet, és a többi.

Miután a kísérő izoformot átalakítottuk a kívánt fehérjévé, további kromatográfiás lépésekre lehet szükség a kívánt fehérje szennyeződésektől való megtisztításához.

Amikor a kívánt fehérje kellően tiszta, szükség szerint gyógyászati felhasználásra alkalmas formába hozható. így például ha a kívánt fehérje az α-interferon, akkor az US 4,847,079 és

72.429/BE

4,496,537 számú szabadalmi iratokban leírt készítmények a megfelelőek. Az inert, gyógyszerészetileg elfogadható vivőanyagok lehetnek folyadékok vagy szilárdak. A szilárd készítmények közé tartoznak a porok, tabletták, diszperz granulátumok, kapszulák, ostyák és kúpok. A porok és tabletták körülbelül 5-95 tömeg % arányban tartalmazhatják a kívánt fehérjét. A megfelelő, szilárd vivőanyagok jól ismertek a szakterületen; ilyenek például a magnézium-karbonát, magnézium-sztearát, talkum, szacharóz vagy laktóz. A tabletták, porok, ostyák és kapszulák orális beadásra alkalmas, szilárd adagolási formák.

A kúpok elkészítéséhez először megolvasztunk egy alacsony olvadáspontú viaszt, például zsírsav-gliceridek keverékét (kakaóvajat) , majd az olvadékban egyenletesen eloszlatjuk a hatóanyagot. Ezután az olvadt keveréket megfelelő méretű formákba öntjük és hagyjuk lehűlve megszilárdulni.

A folyékony készítmények oldatok, szuszpenziók vagy emulziók lehetnek. így például a vizes vagy a víz-propilénglikolos oldatok parenterális injekciókhoz megfelelőek, vagy édesítőszerek és zavarosító szerek hozzáadásával orálisan beadható oldatokká, szuszpenziókká vagy emulziókká alakíthatók. A folyékony készítmények közé tartoznak az intranazális alkalmazásra szánt oldatok is.

Az inhalációs alkalmazásra megfelelő aeroszol-készítmények oldatokat vagy porokat tartalmazhatnak, amelyek egy gyógyszerészetileg elfogadható vivőanyaggal, például egy inert, sűrített gázzal lehetnek kombinálva.

A találmány szerinti vegyületek transzdermálisan is alkalmazhatók. A transzdermális készítmények lehetnek krémek, bőrte

72.429/BE jek, aeroszolok és/vagy emulziók, vagy egy tartós felszabadulást biztosító tapasz anyagába lehetnek bedolgozva a szakterület hagyományai szerint.

A hatóanyag mennyisége egy készítmény egységadagjában körülbelül 0,01-1000 mg, előnyösen körülbelül 0,01-750 mg lehet. A hatóanyag nemzetközi egységben (IU) is mérhető, így az előnyös dózis körülbelül 3-50 millió IU. Egy ilyen megvalósításban a 3, 5, 18, 25 és 50 millió lU-et tartalmazó dózisok képzelhetők el.

Ide tartoznak az olyan szilárd készítmények is, amelyeket közvetlenül a felhasználás előtt kell orális, topikális vagy parenterális beadásra szolgáló, folyékony formába átalakítani.

A következő példák találmányunk bizonyos előnyös megvalósításait és szempontjait mutatják be, és nem korlátozzák annak oltalmi körét.

1. példa: A kísérő piruvát-izoformok konverziójának szűrővizsgálata

A kísérő piruvát-izoformok a sejtek belsejében keletkezhetnek, ahol a fehérje N-terminális aminosavának α-amino-csoportja a piruvát karbonilcsoportjával kondenzációs reakcióba lép. Ha a piruvátcsoport eltorzítja a fehérje térszerkezetét, úgy a fehérje csak akkor képes szabadon visszaállni a kívánt szerkezetű formájába — termodinamikailag előnyös térszerkezet-változás útján - ha az ilyen piruvát-izoformot hidrolizáljuk, azaz a piruvátcsoportot lehasítjuk a fehérjéről. Ha a kívánt fehérjében diszulfid-hid(ak) van(nak), úgy a piruvát lehasításával kapott, redukált izoformot oxidálni kell az eredeti formájába való hely

72.429/BE reállitás részeként.

Az alábbi eljárás azt mutatja be, hogy miként határozzuk meg a piruvát-fehérje kísérő izoform kívánt formába való átalakításának optimális körülményeit. Amint fent írtuk, ha a kívánt fehérjének nincs(enek) diszulfid-hídja(i), akkor a szűrővizsgálatot egyszerűen a piruvát-lehasadás (hidrolízis) maximalizálása irányában folytatjuk. Ha a kívánt fehérjének van(nak) diszulfidhídja (i), akkor a szűrővizsgálattól nem csak a piruvát-lehasadás, hanem a diszulfid-híd képződés (oxidáció) maximalizálását is várjuk.

1. A piruvát mérése

A piruvát mérésére a hidrolízis követése érdekében van szükség, hogy megismerjük a piruvát-lehasítás kinetikáját. így például a „szabad piruvát kvantitatív mérése egy kémiai módosító eljárással vagy egy enzimes módszerrel valósítható meg. A mérhető píruvát-származék létrehozására a 2,4-dinitro-fenil-hidrazin (DNPH) alkalmas. Egy vizsgálati mintát ultrafiltrálunk egy megfelelő MWCO, például egy 10K membránon, hogy eltávolítsuk belőle a piruvát-fehérje izoformot. A szűrletet savas pH mellett a DNPH-val inkubáljuk, ami reagál a „szabad piruváttal. A piruvát DNPH-származéka könnyen meghatározható fordított fázisú HPLC-val egy C8, például egy Nucleosil C8 (5 μιη) oszlopon.

Mivel a származék-képző reakció sztöchiometrikus, a piruvát kvantitatívan is mérhető. Egy enzimes készlet (például laktátdehidrogenáz/NADH) is használható a piruvát mérésére. Ehhez az eljáráshoz nem szükséges a minta ultrafiltrálása, mert a kíméletes reakciókörülmények között nem hasad le piruvát a kísérő

72.429/BE izoformról.

Ahhoz, hogy a szabad és a fehérjéhez kötött piruvát együttes mennyiségét is megkapjuk, az összes piruvátot le kell hasítani a fehérjéről a származék-képzés előtt. Mivel a DNPH-származék képződése erősen savas pH-t és viszonylag hosszú inkubációs időt igényel, az összes piruvát leválik az inkubálás során és származékot képez a DNPH-val. így tehát egy mintát ultraszűrés nélkül is vizsgálni kell a DNPH-s eljárással, és így megkapjuk a szabad és a kötött piruvát együttes mennyiségét.

2. Az izoform mérése

Ά fehérjéknek legalább három, diszulfid-híddal rendelkező, és kettő, diszulfid-híddal nem rendelkező izoformjuk létezik. Általánosságban szólva, a kívánt fehérje és a redukált formája reverz fázisú (RP) HPLC-val könnyen szétválasztható.

A diszulfid-hidakkal bíró fehérjék szűrővizsgálata nagyon hatásos lesz, ha a három izoformot (kísérő izoform, redukált és kívánt fehérje) kvatitatívan analizáljuk RP-HPLC-val. Ilyenkor nincs szükség a piruvát megmérésére és lehetőség nyílik a sebesség-meghatározó lépés meghatározására, ha van ilyen. Azonban rendszerint nehéz egy piruvát—fehérje izoformot elválasztani egy redukált formától. Ebben az esetben a piruvát mérése elengedhetetlen az egyes konverziós lépések optimalizálásához.

3. Az izoform-összetétel meghatározása

Ha egy kívánt formának nincs(enek) diszulfid-hidja(i), akkor az izoform-összetételt nehézség nélkül meghatározhatjuk, mert a piruvát-fehérje kísérő izoform könnyen elválasztható a kívánt formától RP-HPLC-val.

72.429/BE

Ha a kívánt formának diszulfid-hídja(i) van(nak), és a kísérő izoform nem választható el a redukált formától, akkor a fehérjéhez kötött piruvátot kell megmérni hogy meghatározhassuk az izoformösszetételt. A fehérjéhez kötött piruvát mólban megadott mennyiségét — ami a kísérő izoform mennyisége is — úgy kapjuk meg, hogy az összes piruvát mennyiségéből kivonjuk a szabad piruvát mennyiségét. Ehhez egy ultraszűrt és egy szüretien mintát kell megmérnünk a DNPH-módszerrel. Ezután a redukált forma mennyisége a kísérő fehér je-izoform, a RP-HPLC-val mért redukált forma és a piruvátméréssel meghatározott fehérje mennyiségének különbsége.

4. Az optimális körülmények szűrővizsgálata

Akár van a kívánt formának diszulfid-hídja, akár nincs, a szűrővizsgálat követelményeinek azonosaknak kell lenniük, hogy maximalizálhassuk a kísérő izoform átalakulásának sebességét a kívánt formába.

4.1. Ha a kívánt fehérjének nincs diszulfid-hídja

Ebben az esetben a kívánt fehérje jelenik meg, amint a piruvátot lehasítjuk a piruvát-fehérje kísérő izoformról. Ilyenkor a piruvát lehasadását nem kell figyelemmel kísérni, mivel csak egyetlen lépés, a hidrolízis szükséges a kísérő izoform kívánt formába való átalakításához. így például elégséges a kísérő izoform eltűnésének és a kívánt forma megjelenésének figyelése reverz fázisú HPLC-val. A feladat az olyan inkubációs körülmények megtalálása, ahol a kísérő izoform átalakulása a kívánt fehérjévé maximális.

Az első lépés a reakciókinetika vizsgálata a kísérő izoform gyakorlati koncentrációhatárai között. Ha a reakciókinetika el

72.429/BE sőrendű az izoform koncentrációjának függvényében, akkor a minta koncentrációjának nincs befolyása a kinetikára, és bármilyen koncentrációt használhatunk a szűrővizsgálatban vagy paraméterkeresésben. Egyébként a koncentrációt állandó értéken kellene tartani a szűrővizsgálat során.

Számos paraméter befolyásolhatja a hidrolízis-lépést. A fontosabbak a pH, a hőmérséklet, a fémionok (például cink-, vas (II)-, vas(III)-, réz- vagy magnéziumion), a vezetőképesség, pufferek, fény és keverés. Ha megmérjük egy inkubációs paraméter hatását a kísérő izoform konverziójára, akkor minden egyes paraméter optimalizálható. így például egy piruvát-fehérje kísérő izoformot tartalmazó minta számos alikvotját megfelelő határok között különböző pH-kon inkubáljuk, míg az összes többi paramétert a legjobbnak becsült értékén tartjuk. Egy adott inkubációs idő (például egy éjszaka) után minden alikvotban meghatározzuk az izoform átalakulásának mértékét. Azt a pH-t tekintjük optimálisnak, amely mellett a konverzió a legnagyobb fokú. Az ilyen kísérleteket addig ismételjük a további paraméterekkel, amíg az összes esetben az optimális értéket nem használhatjuk a legjobb becsült érték helyett. Ez egy tipikus optimalizálási technika.

Az inkubáció pH-ja befolyásolja a hidrolízis sebességét. Általában alacsonyabb pH-η gyorsabb a hidrolízis. Igen savas pH-n azonban — például pH = 2-nél — a hidrolízis már nem megy végbe, mert a kísérő izoform vagy a kívánt fehérje irreverzibilisen kicsapódik vagy denaturálódik. Néhány fémion jelenléte katalitikus hatással van a hidrolízisre. Még akkor is, ha egy fémion katalizálja piruvát lehasadását, az ilyen katalízis nagy mértékben függ72.429/BE het a fémion koncentrációjától. így tehát a fémionok szűrővizsgálatában a koncentrációt széles határok között kell változtatni.

A paraméterek között kölcsönhatások is felléphetnek. így például más lehet az optimális pH attól függően, hogy van—e jelen fémion vagy sem, ha a kationnak hatása van az átalakulásra. Egy piruvát-izoform esetében, a cinkion jelenlétében más a piruvát lehasadásának optimális pH-ja (7,8 - 8,6) . így tehát nemcsak az szükséges, hogy egy új paraméter értékeit változtassuk az optimalizálás során, de a többi fontos paraméter értékét is változtatni kell annak érdekében, hogy igazán optimalizálva legyenek.

4.2. Ha a kívánt fehérjének díszulfíd-hídja (i) van(nak)

Egy két lépéses konverziós eljárásban egy redukált forma keletkezik a kísérő izoformból hidrolízissel, majd ezután oxidációval alakítjuk át a kívánt formává.

Elméletileg a kísérő izoform és a redukált izoform elválaszthatók egymástól, és a fent leírt módszer külön-külön alkalmazható azokra az egyes lépések optimalizálása céljából. A különbség az, hogy az oxigén-transzfert és bizonyos oxidálószerek - mint amilyen az oxidált glutation (GS-SG) — koncentrációját is optimalizálni kell a fenti paraméterek mellett. Ha a GS-SG csak a redukált formát oxidálja, az nagyban fokozza az oxidációs vagy diszulfid-híd formáló lépés eredményességét. Azonban valószínűleg alacsony lesz a kitermelés vagy konverzió akkor, ha a GS-SG a kísérő izoformot is oxidálja, es az oxidált kísérő izoform nehezen hidrolizálódik.

Az egyes paraméterek optimumából megállapítható a kísérő izoform kíván formába való átalakításának optimális környezete. Ha ésszerűen közel állnak egymáshoz, akkor a köztes körülménye72.429/BE két választhatjuk optimális környezetnek. Elméletileg mások lehetnek az optimális körülmények attól függően, hogy milyen a piruvát-fehérje kísérő izoform kezdeti átalakulási sebessége a redukált formává egy mintában. így például az optimális körülményeknek másnak kell lenniük, ha a kísérő izoform abszolút túlsúlyban van jelen, vagy ha a redukált forma van túlsúlyban. Be kell látni, hogy a minta összetételét is figyelembe kell vennünk, amikor az optimális körülményeket a hidrolízis és az oxidáció egyedi optimális értékeiből kívánjuk meghatározni.

Végül a konverzió optimális körülményeit kísérlettel erősítjük meg. Gyakran jól használható az optimális körülmények finom beállítása során, ha azonosítjuk a sebességkorlátozó lépést (ha van egyáltalán). Ha a redukált forma egyenletes felhalmozódását látjuk az inkubációs idő függvényében, akkor az oxidáció a sebességkorlátozó lépés. Ha ez bekövetkezik, úgy az oxidáció számára kedvezőbb körülményeket - több oxigén, magasabb pH, magasabb hőmérséklet - kell biztosítanunk, hogy maximalizáljuk a kívánt forma keletkezését. Ha a redukált fehérje szintje végig alacsony és a kívánt forma jelentős sebességgel keletkezik, akkor a lehasító lépés a sebességkorlátozó. Ilyenkor az inkubáció körülményeit úgy kell megváltoztatnunk, hogy kedvezőbbé váljanak a hidrolízis számára, mert ezzel maximalizálhatjuk a kívánt forma keletkezését.

Ha a leválasztható csoport kémiai eltávolításának és a fehérje oxidálásának optimális körülményei nagyon távol állnak egymástól, akkor a két folyamatot külön lépésenként hajthatjuk végre. így például először a hidrolízis optimális körülményeit állítjuk be, majd az oxidációs lépést akkor indítjuk meg, amikor

72.429/BE a hidrolízis csaknem teljesen végbement.

Ha az izoformok izolálása nem valósítható meg, a piruvát mérése elengedhetetlenné válik, különösen akkor, ha a két izoform nem választható el egymástól RP-HPLC-val. Ilyenkor a piruvátfelszabadulás követésével először a hidrolízis-lépés optimalizálható. A második lépés optimalizálása azután végezhető el, hogy az első lépés csaknem végbement vagy már nagyon lassú. Ezekből az optimális körülményekből a teljes konverzió optimális körülményei megállapíthatók és kísérletesen megerősíthetők. Egy alternatív megközelítés szerint először a hidrolízis-lépést, majd az egész konverziót optimalizáljuk. Ez a megoldás sokkal gyakorlatiasabb lehet éppen akkor, ha a második lépés optimalizálása nehézségbe ütközik a jelentős mértékű és folytonos izoform-hidrolízis zavaró hatása miatt. Amint már említettük, a pH, a hőmérséklet, az oxigén-transzfer, a fémionok és az oxidálószerek azok a fontos paraméterek, amelyeket optimalizálni kell.

A paraméterek közötti kölcsönhatások sokkal fontosabbak a két lépéses konverziós eljárásban, mint az egy lépéses eljárásokban.

Annak megerősítése érdekében, hogy a paraméterek optimális értékeinek nincs befolyása egy kívánt formára, a kívánt formát meg kell tisztítani és tulajdonságait, köztük biológiai specifikus aktivitását és tisztaságát, teljes mélységig ellenőrizni kell.

2. példa: Kísérő piruvát-izoform konverziója a-2b interferonná

A piruvát lehasítását és a diszulfid-hidak kialakítását magasabb (30—37 C) hőmérsékleten és pH = 5,2-5,6 között végezzük. Ezek a reakciókörülmények egyediek abból a szempontból, hogy

72.429/BE mindkét reakció ugyanazon körülmények között, egymás után megy végbe és bioaktív fehérjét kapunk.

A fehérje UV-elnyelése alapján kiválasztott kromatográfiás frakciókat egyesítjük és 0,45 pm-es szűrőn sterilre szűrjük.

A fehérje-oldathoz 3 g/1 metionint adunk és feloldódásig keverjük. Az oldat pH-ját 5,2-5,6-ra állítjuk be híg nátrium-hidroxid-oldattal. A nátrium-klorid koncentrációját nem változtatjuk: rendesen 150-200 mM között van.

A fehérje-oldathoz egy törzsoldatból (10 mM acetát, pH = 5,5; 200 mM metionin, 200 mM nátrium-klorid) annyit adunk, hogy a metionin végkoncentrációja 20 mM legyen.

A fehérje-oldatot átvisszük egy reaktorba és a hőmérsékletet 37 °C-ra emeljük folyamatos keverés közben. Az oldatot 36-38 °Con inkubáljuk 24-30 órán keresztül.

Ezután a reakcióelegyet először rétegszűrőn, majd 0,45 μιη-es szűrőn át szűrjük a csapadék eltávolítása céljából. Az oldatot bekoncentráljuk és 10 mM-os acetát-pufferrel (pH = 5,5) szemben dializáljuk 2-10 °C-on.

3. példa:

Kísérő piruvát-izoform konverziója a-2b interferonná cink használatával

A kísérő piruvát-izoformot a-2b interferonná konvertáljuk 34 °C-on és pH = 8,2-nél, 1 M cink jelenlétében. A reakcióelegyet keverjük a reakció folyamán. Ha a konverzió körülbelül 80 %-ig végbement, a reakcióelegy hőmérsékletét 4 °C-ra hűtve leállítjuk a reakciót.

Oldatok: 1 M-os Tris-puffer (pH = 8,3; 4 °C-on tartjuk), 1

T2.429/BE mM-os cink-oldat (1 mM cink-szulfát — viz, 10 mM nátrium-acetát, 175 mM nátrium-klorid, pH = 5,5; 4 °C-on tartjuk).

A fehérje-tisztító kromatográfia megfelelő frakcióit egyesítjük és 0,2 pm-es szűrőn sterilre szűrjük. A fehérje-oldathoz körülbelül 0,083 térfogatnyi Tris-puffert adunk lassan addig, amíg a pH-ja körülbelül 8,2 nem lesz (egy fehérje-oldat pH-ja tipikusan 5,2-5,5).

Az 1 M-os cinkoldatot lassan, keverés közben hozzáadjuk a lúgos fehérje-oldathoz, hogy elérjük a cinkion 0,6-1,0 mólarányát a teljes piruvát-izoform mennyiségéhez viszonyítva (ha a piruvát-izoform koncentrációja 1,0 mg/ml, akkor 30 μΜ cinkre vagy 0,03 térfogatnyi cinkoldatra van szükség). Mindig friss cinkoldatot használunk.

Ezután a reakcióelegyet keverés közben 34 °C-ra melegítjük egy reaktorban. A hőmérsékletet végig 34 °C-on tartjuk. A keverést úgy folytatjuk, hogy az oldat kellően elegyedjen, de ne keletkezzenek buborékok benne. A reaktort szellőztetjük, hogy oxigén jusson az oldatba (ha a reaktor csak félig van megtöltve, a szellőztetésre nincs szükség). A reakció alatt mintákat veszünk és a konverziót RP-HPLC-val követjük. A reakció végén a hőmérsékletet 4 °C-ra csökkentük a következő kromatográfiás lépéshez.

A fentiekből kitűnik hogy találmányunk eljárásokat nyújt a nem kívánatos fehérje-izoform azonosításához és a kívánt fehérjévé való átalakításához, amivel a kívánt fehérje kitermelése és tisztasága fokozható.

72.429/BE

Claims (17)

1. SZABADALMI IGÉNYPONTOK

   1. Eljárás egy α-interferon készítmény kitermelésének fokozására, azzal jellemezve, hogy egy kísérő izoformot α-interferonná konvertálunk.
2. 2. Az 1. igénypont szerinti eljárás, azzal jellemezve, hogy az említett kísérő izoform egy piruvát-izoform.
3. 3. A 2. igénypont szerinti eljárás, azzal jellemezve, hogy az említett α-interferon az oc-2b interferon.
4. 4. A3, igénypont szerinti eljárás, azzal jellemezve, hogy az említett kísérő izoformot savas oldattal kezeljük.
5. 5. A 4. igénypont szerinti eljárás, azzal jellemezve, hogy az említett savas oldat pH-ja körülbelül 5,5.
6. 6. Az 5. igénypont szerinti eljárás, azzal jellemezve, hogy az említett savas oldat hőmérséklete 34-40 °C.
7. 7. A 6. igénypont szerinti eljárás, azzal jellemezve, hogy az említett savas oldat egy antioxidánst tartalmaz.
8. 8. A 7. igénypont szerinti eljárás, azzal jellemezve, hogy az említett antioxidáns metionint tartalmaz.
9. 9. A 8. igénypont szerinti eljárás, azzal jellemezve, hogy az említett metionin koncentrációja 5-40 mM.
10. 10. A3, igénypont szerinti eljárás, azzal jellemezve, hogy az említett kísérő izoformot cinkoldattal kezeljük.
11. 11. A 10. igénypont szerinti eljárás, azzal jellemezve, hogy az említett cinkoldat pH-ja 7,8-8,6.
12. 12. A 11. igénypont szerinti eljárás, azzal jellemezve, hogy az említett cinkoldat hőmérséklete 30-38 °C.

    72.429/BE
13. 13. A 12. igénypont szerinti eljárás, azzal jellemezve, hogy az említett cinkoldat egy antioxidánst tartalmaz.
14. 14. A 13. igénypont szerinti eljárás, azzal jellemezve, hogy az említett antioxidáns metionint tartalmaz.
15. 15. A 14. igénypont szerinti eljárás, azzal jellemezve, hogy az említett metionin koncentrációja 5-40 mM.
16. 16. A 9. igénypont szerinti eljárás, azzal jellemezve, hogy az említett a-2b interferont kromatográfiával tisztítjuk tovább.
17. 17. A 16. igénypont szerinti eljárás, azzal jellemezve, hogy az említett kromatográfiás tisztítás tartalmaz egy agaróz alapú festék-affinitás kromatográfiás lépést, utána egy agaróz alapú anioncserélő kromatográfiás lépést, majd egy kristályosítási lépést.

    A meghatalmazott:

    72.429/BE