TW577894B - Methods for conversion of protein isoforms and products thereof - Google Patents

Description

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於本案揭示中’將參考各種公告，專利和專”㈣。這 :公告、專利和專利申請案的揭示内容均被併於此以供參 發明領域 本發明係關.蛋白質的分離和純化。特別是，本發明關於 蛋白質的分離、蛋白質異構物的分離和將異構物轉換成欲 求的蛋白質。 發明背景 天然產生的蛋白質廣泛地使用於研究和臨床上。這些蛋 白質可能從其天然的來源獲得，但再組合技術可允許這些 蛋白質從非天然來源製得。例如，經再組合技術組成的微 生物’如變性細菌’發酵產生大量人體干擾素比起能利用 的天然來源大幅降低成本。這種再組合DNA技術亦被利用 在產生其他重要蛋白質，如胰島素和胞漿素原活化劑。 然而，藉再組合技術改變細菌同時產生污損物和欲求蛋 白質的結構異構物。這些污損物和異構物包括低聚合蛋白 質和還原態蛋白質異構物（見D’Andrea等人著之美國專利第 4,765,903號），細胞殘屑和病毒（見Georgiadis等人著之美 國專利第4,732,683號）和丙酮酸連結異·構物（見Rose等人著 之 J· Biol· Chem. 287:19101 (1992) ; Prome等人著之 J· Biol. Chem. 266:13050 (1991) ; Stevens 等人著之 J· Biol· Chem. 252:2998 (1997);和 Shapiro 等人著之J·Biol· Chem· 255:2120 (1980))。所以在蛋白質純化時移除這些污損物是 需要的。 -4 本紙張尺度適用中國國家標準（CNS)A4規格（210 X 297公爱） (請先閱讀背面之注意事項再填寫本頁) iiitf---------線· 經濟部智慧財產局員工消費合作社印製 577894 A7

經濟部智慧財產局員工消費合作社印製 明顯地，這些蛋白質異構物降低想要的蛋白 移除異構物的加工過程會減少全部的產率。然而，砘度且 物可以轉換成欲求的蛋白質’就不需移除 、吏王4蛋白質產率有意義地增加。鑑別非欲托 ’ 構物和將其轉換成欲求的蛋白質方法是需求的部白質異 明明白地指引出這些需求。 刀0本發 發明概述 本發明係提供一種製造高度純化的蛋白質之高產 二:Π乃藉分離出附屬的異構物並將其轉換：欲求: 犯蛋白負。在其中一種實例中，本發明提供—種増加 =組成產率的方法，此方法包含轉換附屬的異二:成 干擾素α。雖然本發明並不限^特別的干擾素α， 好實例中的干擾h爲干擾h2b。 在另-個實例中，本發明提供—種轉換再組合.時產 附屬異構物成欲求蛋白質的方法，此方法包含以化學法移 除附屬異構物上的可裂解基團。 本發明並不限定經由可裂解基團的移除。在其中一個實 例中可裂解基團包含丙酮酸。 本發明亦不限定經由化學法移除可裂解基團的方法，在 其中，個實例中’作法中包含將附屬異構物曝露於酸溶液 中田附屬異構物爲干擾素Q的丙酮酸附屬異構物，較好 的馱了液p H約5.5。在這個實例中，更好的酸溶液溫度在 3j-、40 C。然而在另一個實例中，附屬異構物是曝露在含鋅 /合液中。在較好的實例中，含鋅溶液的pH是7 8至8 6。在 I ^ -----------------訂--------- (請先閱讀背面之注音？事項再填寫本頁) -5- 577894 A7

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五、發明說明（4 ) 經濟部智慧財產局員工消費合作社印製 形成雙硫鍵的反應。 此處所用之名詞”干擾素α ”係參考誘導分泌的蛋白質族 群其可賦與目標細胞抵抗病毒的能力，抑制細胞增生和調 整Μ H C第I類抗原的表現。這個族群包括，但不限定於干 擾素 a -2a(Roferon，Hoffman La-Roche，Nutley，NJ)，干擾 素 a2b(Intron，Schering-Plough，Madison，NJ)，干擾素沈_ 2c(Berof〇r Alpha, Boehringer Ingelheim, Ingelheim, Germany) 或藉天然產生干擾素α之相同序列決定作爲定義的相同干 擾素（Infergen，Amgen，Thousand Oaks，CA)。 發明詳細敘述 本發明係關蛋白質的分離和純化。在其中一個實例中， 本發明提供附屬異構物的鑑別和純化。在另一個實例中， 本發明提供由附屬異構物製造欲求的蛋白質之方法。又在 另一個實例中，本發明提供藉欲求蛋白質和附屬異構物一 起聯合純化和接著將附屬異構物轉換成欲求蛋白質之高度 純化的欲求蛋白質。在這個方法中，減少附屬異構物的量 =增加欲求蛋白質的全部產率和/或更高度純化比起以前 疋可達成的。欲求蛋白質的產率可比未將附屬異構物轉換 時的產率增加1 〇倍之多。 雖然本發明不限定欲求蛋白質和附屬異構物的來源，但 在其中一個實例中，微生物的來源經再組合技術組成。有 許多這方面的技術已爲嫻熟此藝者所知。這些變性的微生 物可旎是眞核或原核細胞，細菌，哺乳類的細胞等。例如 干擾素以可藉Weissman著之美國專利第4,530,901號的技術 IJ t --------訂--------- (請先閱讀背面之注意事項再填寫本頁)

577894 A7 B7 經濟部智慧財產局員工消費合作社印製 五、發明說明（5 產生的細菌來製造或藉歐洲專利應用編號EP 032,134的技 術製造。 同樣地，本發明並未限定自生產細胞抽取附屬異構物的 特別方法。當欲求蛋白質是干擾素從，例如Leibowitz等人 著之美國專利第4,315,852和4,364,863號的方法就合用。 同樣地，本發明並未限定使用於分離附屬異構物和欲求 蛋白負的特別純化技術。許多層析法和其他分離技術已爲 嫻熟此藝者所熟知並應用此。 雖然本發明並未限定鑑別附屬異構物的方法，但附屬異 構物的鑑定可以藉欲求蛋白質的分子量和分子量高於欲求 蛋白質的污損物之研究來達成。這方法之一見以“等人在 J· Biol· Chem· 267:19101中之論述。分子量高於欲求蛋白 質的》了損物可以曝露於降解條件中（如，極酸或極鹼pH値） 並刀析降解產物。如果降解產物之一具有與欲求蛋白質相 同質量和/或結構性質，此污損物可視爲帶可裂解基團的 附屬異構物。 雖然本發明並未限定將附屬異構物轉換成欲求蛋白質的 特殊方法，但在其中-個實例中，篩選過程可以決定正確 的轉換條件。例如，-個步⑽慢慢地調整反應溶液的 州至可裂解基團自附屬異構物移除的等電點，且生成功 月b上或非不可逆變性的欲求蛋白質。 ^而’本發明並未限定化學法移除可裂解基團的方法。 中，#基團是被移除或藉將附屬異構物暴露 條件τ(如’使用醋酸）裂解。在變化的實例中，附 Μ氏度翻巾關家標準（CNS)A4 χ 297公釐） — ^ I -----------------^ Αν— (請先閱讀背面之注意事項再填寫本頁) 經濟部智慧財產局員工消費合作社印製 577894 A7 -------- B7___ 五、發明說明（7 ) 裂解基團的量卻要加以測量。具有結構上足夠完整的欲求 蛋白質量對反應ρ Η値的圖形通常呈現鈴噹狀曲線，在曲 線的最高點表示可裂解基團之化學移除法的理想ρ Η値。 在這個實例中，相同的篩選亦執行於氧化反應。如果化學 移除反應和氧化反應的鈐噹狀曲線相交，此相交的點即代 表在相同反應中移除可裂解基團和氧化氫硫基的最佳ρΗ 値條件。在干擾素從的丙酮酸附屬異構物的化學移除法和 氧化反應二條曲線相交ρΗ 5附近，顯示此爲最佳ρ Η値去 執行聯合反應。其他反應條件亦包含在評估之内，但不限 於鹽類濃度、溫度等。 附屬異構物轉換成欲求蛋白質後，可能需要進行層析法 來自污損物中純化欲求蛋白質。 欲求蛋白質經適當純化後，如果需要其可置於適合治療 用的形式中。例如，當欲求蛋白質爲干擾素泛，敘述於

Kwan著之美國專利第4,847,079和4,496,537，與Yuen等人著 之美國專利第5,766,5 82號中之配方爲合用的。可選擇地其 他惰性藥學上可接受之載劑可以是固態或液態。固態製品 包括粉末，錠劑，可分散顆粒、膠囊、糖衣錠和塞劑。粉 末和旋劑可以包含從5左右至9 5左右的欲求蛋白質。適合 的固體載劑是已知的技藝如碳酸錢、硬脂酸鎂、滑石粉、 蔗糖或乳糖。錠劑、粉末、糖衣錠和膠囊可以被使用在固 體劑量形式適合口服時。 製造塞劑時，低溶點的蠟如脂肪酸甘油酯（如可可脂）最 先溶解，而活性成份以攪拌均勻分散於其中。此溶融的均 -10- 本紙張尺度適用中國國家標準（CNS)A4規格（210 X 297公釐） ---------------------訂--------- (請先閱讀背面之注意事項再填寫本頁) 577894 Α7

五、發明說明（8 ) 勾漏合物接著置入一適當大小的模型中，使其冷卻並固 化。 液態製品包括溶液、懸浮液和乳化液。例如，水或靜脈 /主射用的水丙烯乙二醇溶液或添加的甜味劑和混澤劑皆可 用於口服溶液，懸浮液和乳化液。液態製品亦可能包含鼻 内投予溶液。 氣溶膠製品適用於吸入藥可能包含溶液和粉末狀固體， 其可與藥學上可接受之載劑結合，如惰性壓縮氣體。 本發明的化合物亦可經皮傳送。經皮的組合物可以被作 成乳霜、乳液，氣溶膠和/或乳化液且可以納入皮膚貼片 的間質中或爲傳統上此技藝中針對此目的的儲存形態。 活性化合物在製品中的單位劑量的量可以調整從001毫 克左右至1000毫克左右，且較好最從〇·〇1毫克左右至750毫 克左右。可選擇地，活性化合物以國際單位來製備，較好 的劑量於3百萬至5千萬國際單位之間。在這個實例中，3 百萬，5百萬，1仟8百萬，2仟5佰萬和5仟萬單位劑量形 式皆被試驗過。 同時亦包含易於被轉換成液態製品供口服、局部或靜脈 投予的固體。 下列實例供作説明確實較好的實施例和本發明的觀點但 不局限定其中的範圍。 實例1 :丙酮酸附屬異構物的轉換篩選過程 丙酮酸附屬異構物可從内臟細胞形成，其中蛋白質Ν -端 胺基酸殘基的α ·胺基被丙酮酸的羰基壓縮。如果丙酮酸 -11 - 本紙張尺度適用中國國家標準（CNS)A4規格（210 X 297公釐） (請先閱讀背面之注意事項再填寫本頁) Φ 訂---------線| 經濟部智慧財產局員工消費合作社印製 577894

五、發明說明（9 ) (請先閱讀背面之注意事項再填寫本頁) 妨害蛋白質結構，僅有當這種丙嗣酸-蛋白質附屬異構物 被水解（丙嗣酸自蛋白質中裂解出來）可使蛋白質經熱力學 偏好的結構變化自由地重新摺疊成欲求的形式。如果欲求 蛋白質具有雙硫Μ’丙_酸裂解造成的異構物㉟少應是被 氧化作爲重新摺璺成欲求形式中的一部份。 下列步驟説明如何決定轉換丙酮酸-蛋白質附異構物成 欲求蛋白質的最適條件。如同先前之討論，如果欲求蛋白 質具有雙硫鍵，洸需要簡單進行篩選定出丙酮酸裂解（水 解）的大量。如果欲求蛋白質具有雙硫鍵，不僅需要執行 篩選疋出丙酮酸裂解（水解）的最大量並且要能形成雙硫鍵 (氧化作用）。 1)丙酮酸分析： 經濟部智慧財產局員工消費合作社印製 分析丙酮酸是應監測水解程度所需爲了了解丙酮酸裂解 的動能。如”游離的”丙酮酸可以化學修飾法或酵素法來作 定量分析。2,4-二硝基苯肼（DNPH)可以用於謗出丙酮酸。 分樣本應經超過濾爲了使用正確的MWCO膜如10Κ膜去除 丙酮酸-蛋白質附屬異構物。濾出物在帶可與游離丙酮酸 作用的DNPH和酸性pH値下培養。DNPH誘出丙酮酸，2,4-二硝基苯腙可以容易地使用C 8管柱如Nucleosil C8(5微米） 管柱進行RP-HPLC分析。 因誘出反應是化學量論的，所以丙酮酸的定量測量是可 行的。一種酵素組（如乳酸脱氫酶/NADH)也可以用於測量 丙酮酸。這種方法不需要樣本進行超過濾因其溫和的條件 不會在培養期間使丙酮酸自丙酮酸蛋白質附屬異構物中裂 -12- 本紙張尺度適用中國國家標準（CNS)A4規格（210 X 297公釐） 經濟部智慧財產局員工消費合作社印製 577894 --------- B7 _________ 五、發明說明（1〇 ) 解出來。

欲測量游離丙酮酸和連結於蛋白質上的丙酮酸合併量， 全郅鍵結的丙酮酸應先以誘出法裂解出來。因DNPH謗出 法需要非常酸的p Η値和相對長時間的培養，丙酮酸可以 被裂解出來再接著於培養期間被DNPH謗出。因此，DNPH 身出法用之樣本不需要經過超過濾即可測量樣品中游離和 鏈結的丙酮酸合併量。 2)異構物分析： 至少有二種異構物存在於帶有雙硫鍵的蛋白質中和二種 異構物存在於不含雙硫鍵的蛋白質中。一般而言，欲求蛋 白質和其還原態可以輕易地以rP_HPlc分析出來。 在具有雙硫蛋白質的例子中，如果三種異構物（附屬異 構物，還原態和欲求蛋白質）可以Rp_HpLC定量分析出來 篩選將會是非常需要的。丙酮酸分析不是絕對的需要且其 如果有的話可能在速率限制步驟中鑑識出來。然而，通常 很難分析出還原態中的丙酮酸-蛋白質異構物。在這個例 子中，丙酮酸分析是不可缺少的爲了充份發揮每一個轉換 步驟。 3 )異構物組合物的測量·· 田奴求形式不具有雙硫鍵，異構物組合物不難決定因丙 酮酸-蛋白質附屬異構物可以輕易地從欲求形式的Rp_ HPLC中分出來。 ,當欲求形式具有雙鍵且蛋白質附屬異構物無法自其還原 形式中分離出來，_酸連結於蛋白質應可被測量以決定 -13- 本紙張尺度適財_家鮮（CNS)A4-------- I ----------------------訂--------- (請先閱讀背面之注意事項再填寫本頁) 經濟部智慧財產局員工消費合作社印製 577894 A7 _____ B7 五、發明說明（11 ) 異構物組合物。丙g同酸連結於蛋白質的莫耳量即蛋白質附 屬異構物的量爲游離和少於游離丙酮酸量的鍵結丙酮酸之 合併量。其可利用經和不經DNPH法超過濾的樣本測量。 然後’還原態的量是蛋白質附屬異構物和rP_HPLC測得之 還原態合併量和丙酮酸分析決定丙酮酸連結蛋白質量間的 差額。接著可以計算異構物組合物。 4 )篩選最適合條件： 不論欲求蛋白質是否具有雙硫鍵，篩選的要點應相同， 爲了達到附屬異構物到欲求蛋白質的轉換過程最大速率。 4.1)當欲求蛋白質不含雙硫鍵： 在這個例子中，欲求蛋白質形成是當丙酮酸自丙酮酸_ 蛋白質異構物中裂解出來後。在這個例子中丙酮酸的裂解 不須以丙酮酸分析加以偵測，因爲僅有一個步驟，，水解，，包 含在附屬異構物到欲求形式的轉換過程中。例如，偵測附 屬異構物的消失如rP-HPLC中欲求形式的形成是有意義 的。附屬異構物到欲求蛋白質的最大量轉換過程的培養條 件需要去發掘。 第一步驟爲調查反應動力學其關係到篩選時使用的蛋白 質附屬異構物濃度的作用範圍。如果動力學與相關的附屬 異構物濃度是第一順位，樣本的濃度在動力學上沒有任何 影響且篩選時或變數評估時可以使用任意濃度。另外 選時濃度須保持恆定。 可能有許多變數會影響水解步驟，主要的變數可能是 PH値’溫度，金屬離子（如辞，鐵，亞鐵，銅，錢 I i—------------------訂--------- (請先閱讀背面之注意事項再填寫本頁)

A7 A7 經濟部智慧財產局員工消費合作社印製 發明說明（12 ) 導龟係數，緩衝液，光線和 ^ ^ ^ 果和攪動。經測量附屬異構物到欲 义蛋白質的轉換過程之蠻赵外鹿々 例如，-含有丙酮酸-蛋白；都可以有所發揮。 身培養於有意義地不同的ρΗ^異：物的樣本的數個分 假想最佳的數値上、===他變數則在其相對 袖八ή 奴時間培養後（如隔夜），測量每 刀身的轉換反應。即可辦4 田a T獲侍有取鬲轉換作用的pH値且 微蘇nP H値。這樣的試驗重覆於以利用發揮極致的 =數〈最適値代其先前的最佳制値使其他變數亦發揮到 極致。這是一種傳統的極限作用技術。 培養時的pH値會影響水解速率。一般而言，較低的邙 値致使較高度水解。較高的溫度也會增加水解。然而水解 在非常酸的pH値下如pH 2可能無法作用因爲附屬異構物 或’欠长蛋白質發生不可逆沈殿或者蛋白質發生不可逆變 陡口午^金屬陽離子的存在可以催化水解。虽隹然金屬陽離 子可催化丙酮酸裂解，但催化分解有很大的金屬陽離子濃 度依賴性。因此，當篩選金屬陽離子應使用較廣範圍的金 屬陽離子濃度。 各變種中可能會交互影響。例如，當陽離子會影響轉換 作用時根據這些金屬陽離子的存在與否可能有不同的最適 p Η値。在丙酮酸附屬異構物的例子中，鋅陽離子的存在 導致丙綱酸裂解時有不同的最適pH値（pH 7.8-8.6)。因 此’在同時間改變不僅改變一個新變數使之發揮極限是必 須的’其他重要的變數亦是爲了眞正能使其揮發極致。 4.2)當欲求蛋白質具有雙硫鍵： -15- 本紙張尺度適用中國國家標準（CNS)A4規格（210 X 297公釐） -----U----------------訂--------- (請先閱讀背面之注噫事項再填寫本頁) 577894 A7 B7 經濟部智慧財產局員工消費合作社印製 五、發明說明（13 在二段式轉換過程中，還原態自附屬異構物裂解移除是 經水解作用再經氧化轉換成欲求形式。 理論上説，蛋白質附屬異構物和還原態被分離出來而如 上不含雙硫鍵之蛋白質的例子所述的步驟被應用於每一種 附屬異構物和還原態上爲了使每—步驟能獲得發揮。最大 的不同是氧原子的轉移和許多氧化劑如氧化穀胱甘肽（GS_ SG)加之於上列變數上可以使氧化步驟發揮極限。如果gs SG僅氧化還原態，其將大幅提昇氧化作用或雙硫鍵形成 步驟〇然而，如果GS-SG同時氧化附屬異構物且氧化的附 屬異構物不易水解很有可能會降低產率或轉換作用。 從每個最適條件中，附屬異構物到欲求形式的轉換作用 之最適條件可加以估算。如果皆能合理辦妥，中間條件即 設爲最適條件。理論上説，根據樣本中丙酮酸-蛋白質附 屬異構物變成還原態的起始比率應有不同的最適條件。例 如’當附屬異構物是絕對多數比上#還原態是絕對多數時 最適條件應該不同。因&，當從水解和氧化作用的個別最 適條件估算最適條件時應鑑識所考慮的樣本組合物。 最後，轉換作用最適條件被加以實驗確認，如果有的 話，在精密和調的轉換最適條件中㈣】速率限制步驟是有 用的’培養期間還原態穩定地累積指出氧化作用是速率限 制步驟。當發生累積更適合氧化的條件如更多的氧，較高 的PH値和較高的溫度可以應賴達到形成最多的欲求形 式雖欲求形式的有意義生成速率如果還原蛋白質一直 處於低量的話’裂解步驟是速率限制步驟。當此現象發生 (請先閱讀背面之注意事項再填寫本頁} --------tr---------線▲ -16 - 577894 A7 五、發明說明（U ) f，培養條件可以被改變以致其可促進裂解反應， 求形式生成最大量。 (請先閱讀背面之注意事項再填寫本頁) 如果可裂解基團的化學法移除之最適條件和蛋白質氧化 的最適條件距離很遠，可使用漸進方式。例如，首先使用 水解步驟的最適條件與當水解幾乎完成時再使 的最適條件。 孔仏作用 當分離各種異構物是不可行的，丙酮酸分析變成不可缺 夕的，特別是當二種異構物無法以RP_HPLC分析。藉偵測 丙酮酸的釋出，水解作用首先發揮。當第一步驟幾^完成 或速率緩慢第二步驟就可以發揮。從這些最適條件中，全 部的轉換作用最適條件被估算並實驗加以證明。更改步二 爲水解作用發揮後全部的轉換作用再發揮。當因有意義地 引起干擾和連續性附屬異構物水解使第二步驟很難^揮此 方法可能更特別。如同前述，pH値、溫度、氧原子轉 移、金屬離子和抗氧化劑皆是發揮作用時的重要變數。 在二步式轉換過程中各變數間的交互用變得比單一步驟 的轉換過程更重要。 經濟部智慧財產局員工消費合作社印製 確認卻求形式的最適條件變數沒有任何影響，欲求形式 應加以統化且其性質包括生物活性和純度應充份確定。 實例2 :丙酮酸附屬異構物轉換成干擾素Q2b的轉換過程 丙酮酸的裂解和雙硫鍵的形成在溫度（3〇-371)下進行且 反應的pH値是5.2-5.6。這些反應條件在相同反應條件下 二反應接續地發生上是獨一無二的並獲得生物活性蛋白 質0 -17- 本紙張尺度適用中國國家標準（CNS)A4規格（210 X 297公釐） 577894 Α7

五、發明說明（15 ) k蛋白質分離層析法沖洗出含蛋白質uv_吸收性的波峯 的，份被加在一起並以0·45 濾膜過濾除菌。 每公升蛋白質池的3克甲硫胺酸被添加至蛋白質池中並 揽掉至落解。池中的PH値以稀釋氫氧化鈉調整至5.2_ 5.6。氣化鈉濃度未調整：其介於15〇_2〇〇毫莫耳濃度加⑷ 氣化鈉間。 含有10 mM，pH 5.5醋酸，200 mM甲硫胺酸和200 mM氣 化鋼的原液被添加主蛋白質池中直至甲硫胺酸最後濃度爲 20 mM 〇 蛋白質池被轉換到反應器皿中且溫度上升至37〇c持續攪 拌。蛋白質池在36-3 8。(：下培養2 4-3 0小時。 在2 4 - 3 0小時的時間點上，反應混合經深厚的過濾器過 滤’再經0.45 //Μ濾膜過濾去除沈澱。接著濃縮且通過過 ;慮對比2 -1 〇 C時1 〇 mM pH 5.5的醋酸。 實例3 :利用鋅將丙酮酸附屬異構物轉換成干擾素從2b的 轉換作用 丙酮酸附屬異構物在34Ό，pH 8.2含鋅（1M)的條件下轉 換成干擾素a2b。反應溶液於反應時要攪動。當轉換作用 約80%，反應溶液溫度會降至4 °C中止反應。 溶液製備：1M Tris緩衝液：保持在4°C，在pH 8.3時1M Tris鹼加鹽酸在pH 5.5時1 mM鋅溶液··保持在4°C，1 mM 含水硫酸鋅加10 mM醋酸鈉在pH 5.5時加175 mM氣化鈉。 從蛋白質分離層析法沖洗出含蛋白質UV-吸收性的波茱 的部份被加在一起並以0.2 // Μ濾膜過濾除菌。約〇_〇83 18- 本紙張尺度適用中國國家標準（CNS)A4規格（210 X 297公釐） (請先閱讀背面之注意事項再填寫本頁) Φ 訂---------線< 經濟部智慧財產局員工消費合作社印製 A7

577894 五、發明說明（16 ) (v/v)的1M Tds緩衝液緩緩地加入蛋白質池中（典型蛋白質 池pH値範圍在5.2至5.5)至到pH値上升至8.2左右。 1 mM鋅溶液緩緩地加入驗性蛋白質池期間並加以攪拌爲 了達到鋅陽離子對總丙酮酸附屬異構物〇·6至1〇莫耳比 率，如，若丙酮酸異構物濃度是h〇毫克/毫升，就需要3〇 "M的鋅或〇.〇3(V/V)的1 mM鋅溶液。使用新鮮的鋅陽離子 溶液。 反應落液在反應器中加熱至34°C並持續攪拌。反應溫度 控制在34°C。連續攪動需達有效混合反應溶液但不會猛^ 到產生泡泡的程度。反應器的許多通氣口應允許氧傳送至 反應溶液中，另一方面，如果反應器約有半滿的反應溶 液’如此的通氣孔是不須要的。反應期間，反應樣本置入 RP-HPLC進行轉換作用。當反應結束，溫度會降至斗^再 進行層析步驟。 從上述中。清楚了解本發明係提供一種鑑別不良蛋白質 異構物和將其轉化成欲求蛋白質的方法，並增加欲求蛋白 質的全部產率和純度。 (請先閱讀背面之注意事項再填寫本頁) --------訂---------線* 經濟部智慧財產局員工消費合作社印製 -19- 本紙張尺度適用中國國家標準（CNS)A4規格（210 X 297公釐）

Claims (1)

1. I jii HH9號專利申請案 口中專利範圍替換本(92年10月） 申请專利把圍 1· 一種增加干擾素α組合物產率的方法，包括將干擾素 α之丙酮酸附屬異構物轉換成干擾素α，其係藉由使 該干擾素α之丙酮酸附屬異構物暴露於（a)具有ρ Η值至 少為5 · 0之溶液或（b )鋅催化劑中。 2.根據申請專利範圍第丨項之方法，其中該干擾素α是干 擾素a2b。 3 ·根據申請專利範圍第2項之方法，其中該附屬異構物係 暴露於ρ Η值界於約5 · 2至約5.6之酸溶液中。 4 ·根據申請專利範圍第3項之方法，其中該酸溶液ρ η值 約 5.5 〇 5 ·根據申請專利範圍第4項之方法，其中該酸溶液溫度在 34-40〇C。 6 ·根據申請專利範圍第5項之方法，其中該酸溶液包含抗 氧化劑。 7 ·根據申請專利範圍第6項之方法，其中該抗氧化劑包含 甲硫胺酸。 8 ·根據申請專利範圍第7項之方法，其中該甲硫胺酸濃度 是 5 - 40 mM 〇 9·根據申凊專利範圍第2項之方法，其中該附屬異構物暴 露於鋅溶液中。 ' 10. 根據申請專利範圍第9項之方法，其中該鋅溶液是pH 7.8至pH 8·6。 11. 根據申請專利範圍第10項之方法，其中該鋅溶液溫度 是 30-38°C。 、 本紙張尺度適用中國國家標準(CNS) A4規格(21〇 X 297公董） 577894 A8 B8 C8 D8 、申請專利範圍 12. 根據申請專利範圍第1 1項之方法，其中該鋅溶液包含 抗氧化劑。 13. 根據申請專利範圍第1 2項之方法，其中該抗氧化劑包 含甲硫胺酸。 14. 根據申請專利範圍第1 3項之方法，其中該甲硫胺酸濃 度是 5-40 mM。 15. 根據申請專利範圍第8項之方法，更進一步包含使用層 析法純化該干擾素a 2b。 16. 根據申請專利範圍第1 5項之方法，其中該層析法包含 洋菜基染色親和性層析法，隨後洋菜基陰離子交換層 析法，之後為結晶步驟。 -2- 本紙張尺度適用中國國家標準(CNS) A4規格(210 X 297公釐）