JPS6384487A - リンパ系細胞増殖用組成物及び増殖方法 - Google Patents

Abstract

(57)【要約】本公報は電子出願前の出願データであるた
め要約のデータは記録されません。

Description

【発明の詳細な説明】 産業上の利用分野 本発明は、リンパ系細胞を増殖するための組成物、リン
パ系細胞の増殖方法および生理活性物質の製造法に関す
る。

従来の技術 リンパ系細胞を用いて有用な生理活性物質、たとえばイ
ンターフェロンなどのリンホカイン類やモノクローナル
抗体などを効率よく生産させるための研究が、種々の面
から活発に進められている。

一方、血しょう増量剤として使用されるポリビニールピ
ロリドンか、ヘパトーマ細胞（ザ・ジャパニーズ・ジャ
ーナル・オブ・エキスベリメンタル０メデイスン（Ｔｈ
ｅ　Ｊａｐａｎｅｓｅ　Ｊｏｕｒｎａｌ　ｏｆ　Ｅｘｐ
ｅｒｉ−ｍｅｎｔａｌ　Ｍｅｄｉｃｉｎｅ）２９巻　４
５頁　１９５９年）、繊維芽細胞（ザ・ジャパニーズ・
ジャーナル・才ブ・エキスペリメンタル・メディスン　
２９巻　１９Ｉ頁　１９５９年）やヒーラ−細胞（ザ・
ジャパニーズ・ジャーナル・オブ・エキスペリメンタル
・メディスン　３０巻　＋４７頁　１９６０年）などの
増殖を促進することが古く勝田らによって報告されてい
るが、リンパ系細胞の増殖にも影響を及ぼすことは全く
知られていなかった。さらに本化合物を添加した培地で
培養すると生理活性物質が効率よく生産出来ることら全
く未知であった。従来リンパ系細胞の培養には、他の細
胞の場合と同様血清を約１０％程度添加し１こ培地が主
として用いられ、とりわけ牛胎児血清（ＦＣＳ）含有培
地が賞用されて来た。

発明が解決しようとする問題点 しかしながら、血ｔ＃は非常に高価であり、かつ原因不
明のロフト差があるため、細胞を大量に培養するには問
題が多い。さらに血清には多種類の異種蛋白質が含まれ
るため、生産される有用物質を培養液から回収精製する
際にも不都合が生ずる。

これらの不都合を解消しようとして、血清を含まない培
地（無血清培地）も種々開発されて来たが、一般に汎用
性が低く、増殖性および生理活性物質生産性の面でも血
清含有培地ｊご比べると必ずしも十分なものとはいえな
い。また無血清培地では、血清の代替として、各種細胞
増殖因子、ホルモン類などが添加されるが、これらの因
子類には高価なものも多く、血清含有培地より、むしろ
高価な場合もしばしば認められる。

いずれにしても従来知られている培地は、細胞培養によ
って有用物質を大量に効率よく得るためには必ずしも十
分満足できる乙のではなかった。

このように、安価で大量供給が可能で、しかも血清等に
由来する性質不明の蛋白質を出来るだけ含まないリンパ
系細胞増殖用培地を開発することが望まれる。該培地と
しては、無血清で汎用性があり、しかも細胞増殖能が高
い培地が理想的であるが、血清含有培地でもその血清の
使用量を大巾に減らずことが出来れば、培地の経済性お
よび培養液中の不純物含量の面での問題点を大巾に改善
することが可能である。

問題点を解決するだめの手段 上記した事情に鑑み、本発明者らは、リンパ系細胞の増
殖を促進する物質の探索を進めたところ、ポリビニール
ピロリドンを含有したリンパ系細胞増殖用組成物による
培地でリンパ系細胞または生理活性物質を生産するリン
パ系細胞を培養すると、リンパ系細胞が著しく増殖され
、またこれにより、産生される生理活性物質の量が増大
されることを見い出し、これに基づいてさらに研究した
結果、本発明を完成した。

本発明は、（１）ポリビニールピロリドンを含有してな
るリンパ系細胞増殖用組成物。

（２）ポリビニールピロリドンを含有するリンパ系細胞
増殖用培地でリンパ系細胞を培養することを特徴とする
リンパ系細胞の増殖方法および（３）ポリビニールピロ
リドンを含有するリンパ系細胞増殖用培地で、生理活性
物質を生産するリンパ系細胞を培養し、培養物中にこれ
を生成蓄積せしめ、採取することを特徴とする生理活性
物質の製造法である。

本明細書においては、ポリビニールピロリドンをＰＶＰ
と略記することらある。

本発明の組成物は、基礎培地およびポリビニールピロリ
ドンからなる。

該基礎培地としては、リンパ系細胞の培養に用いること
のできるものであればいずれのものでらよい。

本発明に用いられる基礎培地としては、たとえば市販さ
れている各種基礎培地［たとえば、イーグルの最小必須
培地（ＭＥＭＸサイエンス（Ｓｃｉｅｎｃｅ）　１３０
巻　４３２頁　１９５９年）、イーグルの基礎培地（Ｂ
ＭＥＸプロシーディンゲス・オブ・ザ・ソサイエティ・
フォア・エキスベリメンタル・バイオロジー・アンド・
メディスン（Ｐｒｏｃｅｅ−ｄｉｎｇｓ　ｏｆ　ｔｈｅ
　５ｏｃｉｅｔｙ　ｆｏｒ　Ｅｘｐｅｒｉｍｅｎｔａｌ
Ｂｉｏｌｏｇｙ　ａｎｄ　Ｍｅｄｉｃｉｎｅ）８９巻　
３６２頁　１９６５年）、ダルベツコ改変イーグル培地
（ＤＭＥ）（パイロロジ−（Ｖｉｒｏｌｏｇｙ）　８巻
　３９６頁　１９５９年）、イスコフ改変ダルベツコ培
地（ｒＭＤＭＸザ・ジャーナル・オブ・エキスベリメン
タル・メディスン（Ｔｈｅ　Ｊｏｕｒｎａｌ　ｏｆ　Ｅ
ｘｐｅｒｉｍｅｎｔａｌ　Ｍｅｄｉｃｉｎｅ）　１４７
巻　９２３頁　１９７８年）、Ｌ−１５培地（アメリカ
ン・ジャーナル・オブ・ハイジーン（Ａｍｅｒｉｃａｎ
Ｊｏｕｒｎａｌ　ｏｒＨｙｇｉｅｎｅ）７８巻　＋７３
頁　１９６３年）。

マツコイ５ａ培地（プロシーディンゲス・オブ・ザ・ソ
サイエティ・フォア・エキスベリメンタル・バイオロジ
ー・アンド・メディスン１００巻１１５頁　１９５９年
）、ハムＦＩ２培地（プロシーディンゲス・オブ・ナシ
ョナル・アカデミ−・オブ・ザイエンス・ニー・ニス・
ニー（Ｐｒｏｃｅｅｄｉｎｇｓｏｆ　Ｎａｔｉｏｎａｌ
　Ａｃａｄｅｍｙ　ｏｆ　５ｃｉｅｎｃｅ、　ＵＳＡ）
５３巻２８８頁　１９６５年）、ＲＰＭＩ　Ｉ　６４０
培地（ジャーナル・オブ・ザ・アメリカン・メディカル
・アソンエーション（Ｊｏｕｒｎａｌ　ｏｆ　ｔｈｅ　
ＡｍｅｒｉｃａｎＭｅｄｉｃａｌ　Ａｓ５ｏｃｉａｔｉ
ｏｎ）　１９９巻　５１９頁　１９６７年）など］ある
いはこれらを混合した培地が挙げられる。該基礎培地に
それぞれの細胞の増殖に必須な因子（補助増殖因子）た
とえばホルモン類（たとえばインスリン、トランスフェ
リン、ステロイドホルモンなど）、蛋白性増殖因子［た
とえば上皮細胞増殖因子（ＥＧＦ）、血小板由来増殖因
子（ＰＤＧＦ）、繊維芽細胞増殖因子（ＦＧｒ’）など
］３３重金属類たとえば亜セレン酸ナトリウムなど）や
リン脂質（たとえばエタノールアミン、ホスファチジル
エタノールアミンなど）を必要により添加した無血清培
地が挙げられる。さらに、これらに通常の使用量または
それ以下の血清代替物質［たとえばＧＦＳ（第２回次世
代産業基盤技術シンポジウム−バイオテクノロジー　予
講集１６１頁、　１９８４年）、ＮＵ−シーラム（コラ
ボレーテイブリサーヂ社製）、シーラムプラス（ＫＣバ
イオロジカルズ社製）など］が添加された培地や、通常
の使用量以下の血清［たとえば牛胎児血清（Ｆ　ＣＳ　
）、新生子牛血清、子牛血清。

ブタ血清、ヤギ血清、ニワトリ血清など］を添加した培
地などが挙げられる。また市販の無血清培地［たとえば
ハイブリティー１（日本薬品開発製）。

［（Ｉ３−１０２（ハナ・メディア社製）、ＨＬ−１（
ベントレッド社製）など］ち本発明の基礎培地として用
いることが可能であり、市販の基礎培地に準じてアミノ
酸などの濃度を最適化した培地を作成して用いることら
可能である。

本発明で用いられろポリビニールピロリドンは、持つ高
重合体であり、市販の平均分子量約１０．０００ないし
１，２００，０００のものが有利に使用される。

より具体的には平均分子ｆｆ１２５，０００のＰＶＰ　
Ｋ−２５，４０，ＯＯＯノＰＶＰ　Ｋ−３０またハｆ、
２００，０００のＰＶＰ　Ｋ−９０などが使用される。

本発明で用いられるポリビニールピロリドンの量として
は、使用時の濃度が約０．００１％（Ｗ／ｖ）ないし１
０％、より好ましくは約０．０１％ないし５％（胃／Ｖ
）、さらに好ましくは約０．１％ないし５％（Ｗ／Ｖ）
となる量である。

ポリビニールピロリドンは、あらかじめ組成物中に混合
されていても良いし、培地として使用する際に混入して
も良い。

本発明のリンパ系細胞増殖用組成物は、固体状態のちの
および水溶液であるもののいずれでもよい。固体状態の
らのは、それをたとえば水に溶解あるいは懸濁して用い
られる。

また、該組成物をリンパ系細胞増殖用の培地として用い
ることができるが、培地として用いる場合には、血清を
含まない培地としても良く、さらに、通常の使用量以下
の血清を含む培地としても良い。ここで、通常の使用量
としては、たとえば約１０％（Ｖ／Ｖ）が挙げられる。

本発明の組成物を培地として用いる場合には、通常の使
用量またはそれ以下の血清代替物を含む培地としてもよ
い。ここで、通常の使用量としては、たとえば、ＧＦＳ
の場合は約３〜４ｇ＃！（蛋白質として）であり、ＮＵ
−シーラムの場合は約１０％Ｖ／Ｖであり、シーラムプ
ラスの場合は約１０％Ｖ／Ｖである。

本発明方法によって培養されるリンパ系細胞としては、
ヒト、マウス、ラット、ウシ、ハムスターなどの哺乳動
物のリンパ球または白血病由来細胞であって初代培養細
胞、リンパ腫、白血病、骨髄腫瘍由来の細胞株１リンパ
球を片方の親細胞とするハイブリドーマやウィルス等で
変異したリンパ球細胞株などを挙げることが出来る。

より具体的には、ヒトリンパ系細胞としては、Ｎａｍａ
ｌｖａ（ＡＴＣＣＣＲＬ　１４．３２Ｘインターナシヨ
ナル・ジャーナル・オブ・キャンサー（Ｉｎｔｅｒｎａ
ｔｉｏｎａｌ　Ｊｏｕｒｎａｌ　ｏｆ　ｃａｎｃｅｒ）
１２巻３９６頁　１９７３年）、Ｒａｊｉ（ＡＴＣＣＣ
ＣＬ８６）（ランセット（Ｌａｎｃｅｔ）　１巻　２３
８頁　１９６４年）。

ＥＢ−３（ＡＴＣＣＣＣＬ８５０ランセット１巻　２５
２頁　１９６４年）、Ｗ　Ｉ　−Ｌ　２　（キャンサー
（Ｃａｎｃｅｒ）　２２巻　５！７頁　１９６８年）、
　Ｄａｕｄｉ（ＡＴＣＣＣＣＬ２１３）（キャンサー・
リサーチ（Ｃａｎｃｅｒ　Ｒｅ５ｅａｒｃｈ）２８巻　
１３００頁１９６８年）、ＲＰＭｌ　　　８２２６（Ａ
ＴＣＣＣＣＬ１５５）（プロシーディンゲス・オブ・ザ
・ソサイエティ・フォア・エキスペリメンタル・バイオ
ロジー・アンド・メディスン　１２５巻　１２４６頁１
９６７年）、ＣＣＲＦ−ＯＥＭ（ＡＴＣＣｃｃｔ、ｔ　
ｒ　９０キヤンサー　１８巻　５２２頁　１９６５年）
、　ＲＰ　Ｍ　１１７８８（ＡＴＣＣＣＣＬ　ｌ　５６
Ｘジヤーナル・オブ・ザ・ナショナル・キャンサー・イ
ンスティチュート（ユナイティド・ステーブＸＪｏｕｒ
ｎａｌ　ｏｆｔｈｅ　Ｎａｔｉｏｎａｌ　Ｃａｎｃｅｒ
　Ｉｎ５ｔｉｔｕｔｅ　（Ｕｎｉｔｅｄ　５ｔａｔｅｓ
））４３巻　１１１９頁１９６９年）、ＣＲＣＦ−ＳＢ
（ＡＴＣＣＣＣＬ　１２０）（キャンサー・リサーチ　
２７巻　２４７９頁　１９６７年）、　Ｊｕｒｋａｔ（
イムノジェネティクス（ＩｍｍｕｎｏｇｅｎｅＨｃｓ）
　１０巻　２４７頁　１９８０年）などが、マウスリン
パ系細胞としては、たとえば、ＭＰＣ−ＩＩ（ＡＴＣＣ
ＣＣＬ１６７Ｘザ・ジャーナル・才ブ・エキスペリメン
タル・メディスン１３１巻　５１５頁　１９７０年）、
ＮＳ−１（ＡＴＣＣＴｌＢ１８Ｘユーロピアン・ジャー
ナル・才ブ・イムノロジー（Ｅｕｒｏｐｅａｎ　Ｊｏｕ
ｒｎａｌ　ｏｆ　Ｉｍｍｕｎｏ−＋ｏｇｙ）　６巻　５
１１Ｎ１９７６年）、Ｐ３Ｘ６３Ａｇ８Ｕ−１（Ｐ３Ｕ
ＩＸＡＴＣＣＣＲＬＩ５９７）（カレント・トピックス
・オブ・マイクロバイオロジー・アンド・イムノロジー
（Ｃｕｒｒｅｎｔ　Ｔｏｐｉｃｓｏｆ　Ｍｉｃｒｏｂｉ
ｏｌｏｇｙ　ａｎｄ　１ｍｍｕｎｏｌｏｇｙ）８１巻　
１頁１９７８年）などが、ハイブリドーマとしては、た
とえばマウスハイブリドーマＣＥＡ（第２回次計代産業
基盤技術シンポジウム〜バイオテクノロジー　予稿集　
１７５買　昭和５９年）、ｌ−１３−ＩＩ（同上）、Ｂ
２３５１６３（バイブリド−？　（！Ｉｙｂｒｉｄｏｍ
ａ）４巻　４７頁　１９８５年）、マウス・ヒト・ヒト
ヘテロハイブリドーマＮ１２−１６・６３（第２回次世
代産業基盤技術シンポジウム−バイオテクノロジー予稿
集　１７５頁　昭和５９年）、１１２−２２・２５　（
バイオケミカル・アンド・バイオフィンカル・リサーチ
・コミュニケーション（Ｂｉｏｃｈｅｍｉｃａｌ　ａｎ
ｄ　　Ｂｉｏｐｈｙｓｉｃａｌ　Ｒｅ５ｅａｒｃｈ　Ｃ
ｏｍｍｕ−ｎｉｃａｔｉｏｎ）　１２９巻　２６頁　１
９８５年）、　ＨＢＩＩ［−４３・ｌ（同上）などがそ
れぞれ挙げられる。

本発明の生理活性物質の製造法において用いられる生理
活性物質を生産するリンパ系細胞としては、たとえばマ
ウスモノクローナル抗体を産生するＣＥＡ、Ｈ８−Ｉ［
、Ｂ２３５１６３など、ヒトモノクローナル抗体を産生
ずるＮ１２−１６・６３゜ｒ１２−２２・２５．ＨＢ［
−４３・１などが、白血球インターフェロンを産生する
Ｎａｍａｌｖａ細胞。

インターロイキン−２を産生ずるＪ　ｕｒｋａｔ細胞な
どが挙げられる。

本発明方法の培養には通常培養に用いられろ容器または
装置が用いられる。たとえば、マルヂウエルプレート、
培養フラスコ、スピナーフラスコ。

ジャーファーメンタ−、ファーメンタ−１さらに十ロー
フアイバー培養装置、セラミックマトリックスを用いた
培養装置やマイクロカプセル培養法などが適宜採用され
る。

本発明の培養は、用いられるリンパ系細胞の培養に適し
た条件が採用される。一般的には、培養温度約３７°Ｃ
前後で、ｐＨ約６．５〜７．５で、数日〜３か月培養さ
れる。たとえば、本発明の培地に通常ｏ、ｉ〜５ｘ１０
５個／ｍｌの細胞を播種し、マルヂウエルプレートやフ
ラスコの場合には約３７℃、５％炭酸ガス培養器（炭酸
ガス濃度５％の培養器）中でｐＨ約６，５〜７．５で約
１〜２０日間培養される。ジャーファーメンタ−やファ
ーメンタ−などでは通気攪拌培養が行われる。またこれ
らの培養槽や本ローフアイバー、セラミックマトリック
ス、マイクロカプセルなどを用いた培養においては培地
を回分的、または連続的に交換することにより生理活性
物質の生産性を向上させることができる。連続潅流培養
の場合には１ないし数ケ月（約３か月）も続ける場合が
ある。また、必要により通気される。

培養液から細胞を採取するには、培養液を直接遠心分離
機やろ逸機にかけて集めろ。またリンパ系細胞の培養に
よって生産される生理活性物質は、その物質が培養液中
に蓄積される場合、ろ過または遠心分離によって上澄液
を得、これから採取される。また細胞内に蓄積される物
質の場合には、ろ過または遠心分離によって得た細胞を
物理的方法（例、超音波、フレンチプレス、ダイノミル
など）または化学的方法（例、塩酸グアニジン等）にて
処理し、生産物を抽出したのち、上澄液を得る。

上記上澄液から生理活性物質を分離、精製するには自体
公知の分離、精製法を適宜組み合わせて行うことができ
る。たとえば生理活性物質が蛋白質またはペプチドの場
合には、塩析や溶媒沈澱法などの溶解度を利用する方法
、透析法、限外ろ適法。

ゲルろ適法、５ＤＳ−ポリアクリルアミドゲル電気泳動
法などの主として分子量の差を利用する方法、イオン交
換クロマトグラフィーなどの荷電の差を利用する方法、
アフィニティクロマトグラフイーなどの特異的親和性を
利用する方法、逆相高速液体クロマトグラフィーなどの
疎水性の差を利用する方法１等電点電気泳動などの等電
点の差を利用する方法などが適用されろ。

本発明の方法に従って増殖さ什たリンパ系細胞は、各種
リンフ才力イン類（たとえば白血球インターフェロン類
、免疫インターフェロン、インターロイキン−２など）
や各種モノクローナル抗体（例、マウスモノクローナル
抗体やヒトモノクローナル抗体など）などの生産に利用
される。また正常リンパ球をたとえばインターロイキン
−２で刺激しつつ本発明の方法に従って増殖し、集めた
細胞を直接ヒトの血液中にもどすアトブチイブ・イムノ
０テラビー（Ａｄｏｐｔｉｖｅ　Ｉｍｍｕｎｏｔｈｅｒ
ａｐｙ）などにも利用することが出来る。

本発明方法により、リンパ系細胞を効率良く増殖させる
ことができるので、リンパ系細胞を工業的に大王に増殖
させる方法として有利に用いることができる。

本発明方法において、生理活性物質を生産するリンパ系
細胞を培養した場合には、該細胞が効率良く増殖される
ので、生理活性物質を効率良く生産することができ、工
業的生産上有利である。

実施例 以下に実施例を挙げて本発明を更に具体的に説明する。

ＰＶＰの添加％はＷ／Ｖ％を表わす。血清の添加％はＶ
／Ｖ％を表わす。

実施例１ ＩＭＤＭ、ハムＦ１２およびＬ−１５培地を１：ｌ・２
の比率で混合した培地に、２　ｍｇ／σインスリン、　
２　Ｊｌ１ｇ／１２　）ランスフェリン、２Ｘ１０°Ｉ
ＩＭエタノールアミン、２．５ｘ　Ｉ　Ｏ°ｓＭ亜セレ
ン酸ナトリウム（４つを合せてＩＴＥＳと称する。）を
添加し、これに各種濃度のＰＶＰ　Ｋ−９０（平均分子
ｍ１．２００，０００）を添加した無血清培地を調製し
、これを２４穴マルヂウエルプレートへ１ｍｌ宛分注し
た。

これにヒトリンパ芽球由来の〜ＶＩ−Ｌ２細胞をｌ×１
０５個／ｍｌの割合で播種し、３７６Ｃ，５％炭酸ガス
培養器中で４日間培養後、コールタ−カウンターにて細
胞数を測定し、第１図の結果を得た。

この図から明らかなように、ＰＶＰを添加しない培地で
の細胞数は４．２Ｘ　Ｉ　Ｏ’個／ｍｌであったのに対
し、ＰＶＰを添加した場合にはその濃度の増加に供なっ
て細胞数が増加し、０．２〜０．８％の添加で約１．５
Ｘ　１０’個／ｍｌにも達した。

実施例２ 実施例１と同じ基礎培地にＩＴＥＳを添加し、更に各種
濃度のｐｖｐ　Ｋ−９０（平均分子量１．２００，００
０）を添加した無血清培地および各種濃度のＰＶＰ　Ｋ
−３０（平均分子量４０，０００）を添加した無血清培
地を調製し、これを２４穴マルヂウエルプレートへ１ｍ
ｌ宛分注した。　これにマウス・ヒト・ヒトヘテロハイ
ブリドーマＮ１２−１６・６３の細胞をｌＸＩＯ３個／
ｍｌの割合で播種し、３７℃、５％炭酸ガス培養器中で
５日間培養後、コールタ−カウンターにて細胞数を測定
し、第２図の結果を得た。ＰＶＰ　Ｋ−９０の場合（−
−１−で示される。）、至適濃度は０．４％付近であっ
たが、ＰＶＰ　Ｋ−３０の場合（−イヒーで示される。

）には、０．２〜６．４％の広い範囲で特に有効であっ
た。

実施例３ 実施例１と同じ基礎培地にＩＴＥＳを添加した培地（１
）、更にこれに０．２％ＰＶＰ　Ｋ−３０（平均分子ｆ
ｆ１４０，０００）を添加した培地（２）、および０．
２％ＰＶＰ　Ｋ−９０（平均分子量１，２００，０００
）を添加した培地（３）を用意し、これらを２４穴マル
チウエルプレートへ１ｍｌ宛分注した。これに表１に示
す各種リンパ系細胞をＩｘ１０５個／ｍｌの割合で播種
し、３７℃、５％炭酸ガス培養器中て゛　４日間培養し
たのちコールタ−カウンターで細胞数を計数し表１の結
果を得た。

（以下余白） 表１　無血清培地における各種リンパ系細胞の増殖Ｎａ
ｍａｌｖａ　　ヒトバーキット　２．ｌＸ１０５９．５
Ｘ１０５１．ｌＸ１０’リンパ腫 ＣＲＣＦ−ＳＢ　　ヒト急性リンパ　６．ＯＸ　１０’
　　２．９Ｘ　１０’　　３．ＩＸ　ｔｏ’芽球性白血
病 Ｐ３Ｕｌ　　　マ’）スミｘ、ロー５．ｌＸ１０’　　
８．９Ｘ１０’　　９．５ｘ１０’マ ）Ｅ２３５１６３　７　ウス−バイブ　３．５ｘ１０５
６．６ｘ１０５６，４ｘ１０５リドーマ Ｎ１２−１６　・６３７ウスーヒト　２．６ＸＩＯ５７
，７ＸＩＯ’　　６．５Ｘ１０５・ヒトヘテロハ イブリドーマ 実施例４ マウス・ヒト・ヒトヘテロハイブリドーマＮ１２−１６
・６３妹を、実施例１と同じ基礎培地にＩＴＥＳおよび
表２に示す各種添加物を添加した培地に、ｌ　Ｘ　１０
５ｇ／ｍｌになる様に播種し、３７°Ｃ，５％炭酸ガス
培養器中で５日間培養し、細胞数をコールタ−カウンタ
ーで抗体産生ｆｆｉ（ＩｇＭ）をＥＬ　Ｉ　ＳＡ法で測
定し、表２の結果を得た。

表２　無血清、低血清または低濃度血清代替物質添加０
　　　　　　　０　　　　１、Ｏｘ　１０’　　１ｕ　
ｇ／ｍ１ＦＣＳ　１　％０　　　　４．Ｏｘ　１０５６
μ’ｇ／ｍｌ′１′通常の使用濃度は３ｍｇ／ｍｌ 実施例５ マウス・ヒト・ヒトヘテロハイブリドーマ１１２−２２
・２５株を、実施例１と同じ基礎培地に（１）ＩＴＥＳ
および０．３ｍｇ／ｍｌのＧＦＳを添加した培地、　　
（２）　Ｉ　Ｔ　Ｅ　Ｓ　、０．３ｍｇ／ｍｌＧ　Ｆ　
Ｓおよび０．２％ＰＶＰ　　Ｋ−９０を添加した培地お
よび（３）ＩＴＥＳと３　ｍｇ／ｍｌＧ　Ｆ　Ｓを添加
した培地を分注したスピナーフラスコに、Ｉ　Ｘ　Ｉ　
Ｏ’ｇ／　ｍｌの割合で播種し、３７°Ｃ，５％炭酸ガ
ス培養器中で２５ｒｐｍで５日間培養した。遠心分離に
よって培養上清を各ＩＱずつ集め、これに硫酸アンモニ
ウムを加えて３７％〜５０％（飽和度）で沈澱する画分
を集めた。これを０．０７ＭＮａＣ１を添加した０、０
２Ｍトリス・塩酸緩衝液（ｐＨ７，９）に対して透析し
たのち、同じ緩衝液で平衡化したワットマンＤＥ５２セ
ルロースカラムにかけ、素通り画分を集めた。次に０　
、　Ｉ　５　ＭＮａＣＩを含む０．０５Ｍトリス−塩酸
緩衝液で平衡化したプロティンＡカラムに通液してＩｇ
Ｇを吸着させた。同じ緩衝液で洗滌後、０．１５ＭＮａ
Ｃ１を含む０．０５Ｍグリシン−塩酸緩衝液（ｐＨ２，
２）で溶出して活性画分を集めた。この活性画分を透匠
後凍結乾燥して０．００５ＭＮａＣ１を含む０．０５Ｍ
　ＭＥＳ緩衝液（ｐｌ（６，９）に溶かし、Ｍｏｎｏ　
Ｓ　　ＨＲ５１５カラム（ファーマシア）を用いたＦＰ
ＬＣにかけ、同じ緩衝液にて洗滌後、ＩＭＮａＣｌを含
む０．０５ＭＭＥＳ緩衝液（ｐＨ６，０）で直線濃度勾
配をかけて溶出し、ＩｇＧ画分を集めたところ、（１）
〜（３）の培養液からそれぞれ６２０組ｇ、４８００μ
ｇおよび３２００μｇのヒトＩｇＧが得られた。

発明の効果 本発明のリンパ系細胞増殖用組成物による培地を用いる
とリンパ系細胞を効率よく増殖させることができる。ま
た、生理活性物質を生産するリンパ系細胞を培養すると
、生理活性物質を効率良く生産させることができる。

【図面の簡単な説明】

第１図は、実施例１で得られたポリビニールピロリドン
の添加効果を示す。 第２図は、実施例２で得られたポリビニールピロリドン
の添加効果を示す。 出願人　工業技術院長　飯　塚　幸　三＄　１　図

Claims (13)

【特許請求の範囲】
1. （１）ポリビニールピロリドンを含有してなるリンパ系
   細胞増殖用組成物。
2. （２）固体状態にある特許請求の範囲第１項記載の組成
   物。
3. （３）水溶液である特許請求の範囲第１項記載の組成物
   。
4. （４）基礎培地の成分がイスコフ培地、ハム培地、Ｌ−
   １５培地またはそれらの２種以上の混合培地の成分と同
   じである、特許請求の範囲第１項記載の組成物。
5. （５）インスリン、トランスフェリン、エタノールアミ
   ンおよび亜セレン酸の１種以上を添加した特許請求の範
   囲第１項または第４項記載の組成物。
6. （６）血清を含まない特許請求の範囲第３項記載の組成
   物。
7. （７）通常の使用量以下の血清を含む特許請求の範囲第
   ３項記載の組成物。
8. （８）ポリビニールピロリドンを含有するリンパ系細胞
   増殖用培地でリンパ系細胞を培養することを特徴とする
   リンパ系細胞の増殖方法。
9. （９）リンパ系細胞増殖用培地が血清を含まない培地で
   ある特許請求の範囲第８項記載の増殖方法。
10. （１０）リンパ系細胞増殖用培地が通常の使用量以下の
    血清を含む特許請求の範囲第８項記載の増殖方法。
11. （１１）ポリビニールピロリドンを含有するリンパ系細
    胞増殖用培地で、生理活性物質を生産するリンパ系細胞
    を培養し、培養物中にこれを生成蓄積せしめ、採取する
    ことを特徴とする生理活性物質の製造法。
12. （１２）リンパ系細胞増殖用培地が血清を含まない培地
    である特許請求の範囲第１１項記載の製造法。
13. （１３）リンパ系細胞増殖用培地が通常の使用量以下の
    血清を含む培地である特許請求の範囲第１１項記載の製
    造法。