JPS6384487A - リンパ系細胞増殖用組成物及び増殖方法 - Google Patents
リンパ系細胞増殖用組成物及び増殖方法Info
- Publication number
- JPS6384487A JPS6384487A JP61227189A JP22718986A JPS6384487A JP S6384487 A JPS6384487 A JP S6384487A JP 61227189 A JP61227189 A JP 61227189A JP 22718986 A JP22718986 A JP 22718986A JP S6384487 A JPS6384487 A JP S6384487A
- Authority
- JP
- Japan
- Prior art keywords
- medium
- serum
- cells
- physiologically active
- composition
- Prior art date
- Legal status (The legal status is an assumption and is not a legal conclusion. Google has not performed a legal analysis and makes no representation as to the accuracy of the status listed.)
- Granted
Links
- 239000013543 active substance Substances 0.000 title claims abstract description 23
- 239000000203 mixture Substances 0.000 title claims abstract description 22
- 238000000034 method Methods 0.000 title claims description 22
- 238000004519 manufacturing process Methods 0.000 title claims description 9
- 230000001926 lymphatic effect Effects 0.000 title abstract 5
- 210000002966 serum Anatomy 0.000 claims abstract description 33
- 229920000036 polyvinylpyrrolidone Polymers 0.000 claims abstract description 30
- 235000013855 polyvinylpyrrolidone Nutrition 0.000 claims abstract description 30
- 239000001267 polyvinylpyrrolidone Substances 0.000 claims abstract description 17
- 239000001963 growth medium Substances 0.000 claims abstract description 13
- HZAXFHJVJLSVMW-UHFFFAOYSA-N 2-Aminoethan-1-ol Chemical compound NCCO HZAXFHJVJLSVMW-UHFFFAOYSA-N 0.000 claims abstract description 8
- NOESYZHRGYRDHS-UHFFFAOYSA-N insulin Chemical compound N1C(=O)C(NC(=O)C(CCC(N)=O)NC(=O)C(CCC(O)=O)NC(=O)C(C(C)C)NC(=O)C(NC(=O)CN)C(C)CC)CSSCC(C(NC(CO)C(=O)NC(CC(C)C)C(=O)NC(CC=2C=CC(O)=CC=2)C(=O)NC(CCC(N)=O)C(=O)NC(CC(C)C)C(=O)NC(CCC(O)=O)C(=O)NC(CC(N)=O)C(=O)NC(CC=2C=CC(O)=CC=2)C(=O)NC(CSSCC(NC(=O)C(C(C)C)NC(=O)C(CC(C)C)NC(=O)C(CC=2C=CC(O)=CC=2)NC(=O)C(CC(C)C)NC(=O)C(C)NC(=O)C(CCC(O)=O)NC(=O)C(C(C)C)NC(=O)C(CC(C)C)NC(=O)C(CC=2NC=NC=2)NC(=O)C(CO)NC(=O)CNC2=O)C(=O)NCC(=O)NC(CCC(O)=O)C(=O)NC(CCCNC(N)=N)C(=O)NCC(=O)NC(CC=3C=CC=CC=3)C(=O)NC(CC=3C=CC=CC=3)C(=O)NC(CC=3C=CC(O)=CC=3)C(=O)NC(C(C)O)C(=O)N3C(CCC3)C(=O)NC(CCCCN)C(=O)NC(C)C(O)=O)C(=O)NC(CC(N)=O)C(O)=O)=O)NC(=O)C(C(C)CC)NC(=O)C(CO)NC(=O)C(C(C)O)NC(=O)C1CSSCC2NC(=O)C(CC(C)C)NC(=O)C(NC(=O)C(CCC(N)=O)NC(=O)C(CC(N)=O)NC(=O)C(NC(=O)C(N)CC=1C=CC=CC=1)C(C)C)CC1=CN=CN1 NOESYZHRGYRDHS-UHFFFAOYSA-N 0.000 claims abstract description 8
- 102000004877 Insulin Human genes 0.000 claims abstract description 4
- 108090001061 Insulin Proteins 0.000 claims abstract description 4
- 229940125396 insulin Drugs 0.000 claims abstract description 4
- 102000004338 Transferrin Human genes 0.000 claims abstract description 3
- 108090000901 Transferrin Proteins 0.000 claims abstract description 3
- 239000012581 transferrin Substances 0.000 claims abstract description 3
- 210000004698 lymphocyte Anatomy 0.000 claims description 50
- 239000002609 medium Substances 0.000 claims description 38
- 238000012258 culturing Methods 0.000 claims description 14
- 239000007640 basal medium Substances 0.000 claims description 12
- 230000035755 proliferation Effects 0.000 claims description 11
- 230000010261 cell growth Effects 0.000 claims description 7
- 230000004663 cell proliferation Effects 0.000 claims description 6
- 239000012679 serum free medium Substances 0.000 claims description 6
- 239000000126 substance Substances 0.000 claims description 6
- 230000002062 proliferating effect Effects 0.000 claims description 4
- 239000007787 solid Substances 0.000 claims description 3
- 239000007864 aqueous solution Substances 0.000 claims description 2
- 229940082569 selenite Drugs 0.000 claims 1
- MCAHWIHFGHIESP-UHFFFAOYSA-L selenite(2-) Chemical compound [O-][Se]([O-])=O MCAHWIHFGHIESP-UHFFFAOYSA-L 0.000 claims 1
- 241000283690 Bos taurus Species 0.000 abstract description 2
- 229940000207 selenious acid Drugs 0.000 abstract 1
- MCAHWIHFGHIESP-UHFFFAOYSA-N selenous acid Chemical compound O[Se](O)=O MCAHWIHFGHIESP-UHFFFAOYSA-N 0.000 abstract 1
- 210000004027 cell Anatomy 0.000 description 30
- CURLTUGMZLYLDI-UHFFFAOYSA-N Carbon dioxide Chemical compound O=C=O CURLTUGMZLYLDI-UHFFFAOYSA-N 0.000 description 14
- 239000003814 drug Substances 0.000 description 11
- 229940079593 drug Drugs 0.000 description 10
- 239000001569 carbon dioxide Substances 0.000 description 7
- 229910002092 carbon dioxide Inorganic materials 0.000 description 7
- 239000000872 buffer Substances 0.000 description 6
- 102000004169 proteins and genes Human genes 0.000 description 5
- 108090000623 proteins and genes Proteins 0.000 description 5
- 239000000243 solution Substances 0.000 description 5
- 108091003079 Bovine Serum Albumin Proteins 0.000 description 4
- 206010028980 Neoplasm Diseases 0.000 description 4
- FAPWRFPIFSIZLT-UHFFFAOYSA-M Sodium chloride Chemical compound [Na+].[Cl-] FAPWRFPIFSIZLT-UHFFFAOYSA-M 0.000 description 4
- 201000011510 cancer Diseases 0.000 description 4
- 238000005516 engineering process Methods 0.000 description 4
- 239000004017 serum-free culture medium Substances 0.000 description 4
- 102000014150 Interferons Human genes 0.000 description 3
- 108010050904 Interferons Proteins 0.000 description 3
- 102000000588 Interleukin-2 Human genes 0.000 description 3
- 108010002350 Interleukin-2 Proteins 0.000 description 3
- 241000699666 Mus <mouse, genus> Species 0.000 description 3
- 238000005119 centrifugation Methods 0.000 description 3
- 230000000694 effects Effects 0.000 description 3
- 239000012894 fetal calf serum Substances 0.000 description 3
- 239000003102 growth factor Substances 0.000 description 3
- 210000004408 hybridoma Anatomy 0.000 description 3
- 208000032839 leukemia Diseases 0.000 description 3
- 239000006228 supernatant Substances 0.000 description 3
- 239000006144 Dulbecco’s modified Eagle's medium Substances 0.000 description 2
- 206010025323 Lymphomas Diseases 0.000 description 2
- 229960000074 biopharmaceutical Drugs 0.000 description 2
- 210000004369 blood Anatomy 0.000 description 2
- 239000008280 blood Substances 0.000 description 2
- 244000309466 calf Species 0.000 description 2
- 239000000919 ceramic Substances 0.000 description 2
- BVTBRVFYZUCAKH-UHFFFAOYSA-L disodium selenite Chemical compound [Na+].[Na+].[O-][Se]([O-])=O BVTBRVFYZUCAKH-UHFFFAOYSA-L 0.000 description 2
- 238000001914 filtration Methods 0.000 description 2
- 229940088597 hormone Drugs 0.000 description 2
- 229940047124 interferons Drugs 0.000 description 2
- 239000003094 microcapsule Substances 0.000 description 2
- 229940126619 mouse monoclonal antibody Drugs 0.000 description 2
- 239000011780 sodium chloride Substances 0.000 description 2
- 229960001471 sodium selenite Drugs 0.000 description 2
- 239000011781 sodium selenite Substances 0.000 description 2
- 235000015921 sodium selenite Nutrition 0.000 description 2
- 238000005406 washing Methods 0.000 description 2
- FBOUIAKEJMZPQG-AWNIVKPZSA-N (1E)-1-(2,4-dichlorophenyl)-4,4-dimethyl-2-(1,2,4-triazol-1-yl)pent-1-en-3-ol Chemical compound C1=NC=NN1/C(C(O)C(C)(C)C)=C/C1=CC=C(Cl)C=C1Cl FBOUIAKEJMZPQG-AWNIVKPZSA-N 0.000 description 1
- IVLXQGJVBGMLRR-UHFFFAOYSA-N 2-aminoacetic acid;hydron;chloride Chemical compound Cl.NCC(O)=O IVLXQGJVBGMLRR-UHFFFAOYSA-N 0.000 description 1
- UZOVYGYOLBIAJR-UHFFFAOYSA-N 4-isocyanato-4'-methyldiphenylmethane Chemical compound C1=CC(C)=CC=C1CC1=CC=C(N=C=O)C=C1 UZOVYGYOLBIAJR-UHFFFAOYSA-N 0.000 description 1
- 208000008720 Bone Marrow Neoplasms Diseases 0.000 description 1
- 241000283707 Capra Species 0.000 description 1
- 101100177262 Casuarina glauca HBII gene Proteins 0.000 description 1
- 241000699800 Cricetinae Species 0.000 description 1
- 238000002965 ELISA Methods 0.000 description 1
- 239000006145 Eagle's minimal essential medium Substances 0.000 description 1
- 102000018233 Fibroblast Growth Factor Human genes 0.000 description 1
- 108050007372 Fibroblast Growth Factor Proteins 0.000 description 1
- 241000287828 Gallus gallus Species 0.000 description 1
- JZNWSCPGTDBMEW-UHFFFAOYSA-N Glycerophosphorylethanolamin Natural products NCCOP(O)(=O)OCC(O)CO JZNWSCPGTDBMEW-UHFFFAOYSA-N 0.000 description 1
- 241000282412 Homo Species 0.000 description 1
- 102000006992 Interferon-alpha Human genes 0.000 description 1
- 108010047761 Interferon-alpha Proteins 0.000 description 1
- 102000008072 Lymphokines Human genes 0.000 description 1
- 108010074338 Lymphokines Proteins 0.000 description 1
- 239000007987 MES buffer Substances 0.000 description 1
- 235000013939 Malva Nutrition 0.000 description 1
- 240000000982 Malva neglecta Species 0.000 description 1
- 235000000060 Malva neglecta Nutrition 0.000 description 1
- 241000124008 Mammalia Species 0.000 description 1
- 241000699670 Mus sp. Species 0.000 description 1
- 241001325209 Nama Species 0.000 description 1
- 108010038512 Platelet-Derived Growth Factor Proteins 0.000 description 1
- 102000010780 Platelet-Derived Growth Factor Human genes 0.000 description 1
- 244000088415 Raphanus sativus Species 0.000 description 1
- 235000006140 Raphanus sativus var sativus Nutrition 0.000 description 1
- 241000700159 Rattus Species 0.000 description 1
- 239000006146 Roswell Park Memorial Institute medium Substances 0.000 description 1
- 239000007983 Tris buffer Substances 0.000 description 1
- 241000700605 Viruses Species 0.000 description 1
- 230000001154 acute effect Effects 0.000 description 1
- 239000000654 additive Substances 0.000 description 1
- 238000005273 aeration Methods 0.000 description 1
- 238000001042 affinity chromatography Methods 0.000 description 1
- 238000013019 agitation Methods 0.000 description 1
- 150000001413 amino acids Chemical class 0.000 description 1
- BFNBIHQBYMNNAN-UHFFFAOYSA-N ammonium sulfate Chemical compound N.N.OS(O)(=O)=O BFNBIHQBYMNNAN-UHFFFAOYSA-N 0.000 description 1
- 229910052921 ammonium sulfate Inorganic materials 0.000 description 1
- 235000011130 ammonium sulphate Nutrition 0.000 description 1
- 201000006491 bone marrow cancer Diseases 0.000 description 1
- 239000004067 bulking agent Substances 0.000 description 1
- 238000004113 cell culture Methods 0.000 description 1
- 239000001913 cellulose Substances 0.000 description 1
- 229920002678 cellulose Polymers 0.000 description 1
- 238000004891 communication Methods 0.000 description 1
- 150000001875 compounds Chemical class 0.000 description 1
- 238000012136 culture method Methods 0.000 description 1
- 239000012228 culture supernatant Substances 0.000 description 1
- 230000003247 decreasing effect Effects 0.000 description 1
- 238000000502 dialysis Methods 0.000 description 1
- 238000010828 elution Methods 0.000 description 1
- -1 etc.) Proteins 0.000 description 1
- 239000012091 fetal bovine serum Substances 0.000 description 1
- 210000002950 fibroblast Anatomy 0.000 description 1
- 229940126864 fibroblast growth factor Drugs 0.000 description 1
- 230000002496 gastric effect Effects 0.000 description 1
- 238000002523 gelfiltration Methods 0.000 description 1
- 239000000122 growth hormone Substances 0.000 description 1
- 229960000789 guanidine hydrochloride Drugs 0.000 description 1
- PJJJBBJSCAKJQF-UHFFFAOYSA-N guanidinium chloride Chemical compound [Cl-].NC(N)=[NH2+] PJJJBBJSCAKJQF-UHFFFAOYSA-N 0.000 description 1
- 229910001385 heavy metal Inorganic materials 0.000 description 1
- 206010073071 hepatocellular carcinoma Diseases 0.000 description 1
- 239000005556 hormone Substances 0.000 description 1
- 230000002998 immunogenetic effect Effects 0.000 description 1
- 230000016784 immunoglobulin production Effects 0.000 description 1
- 239000012535 impurity Substances 0.000 description 1
- 238000009776 industrial production Methods 0.000 description 1
- 229940079322 interferon Drugs 0.000 description 1
- 238000004255 ion exchange chromatography Methods 0.000 description 1
- 238000001155 isoelectric focusing Methods 0.000 description 1
- 210000003127 knee Anatomy 0.000 description 1
- 210000000265 leukocyte Anatomy 0.000 description 1
- 210000002751 lymph Anatomy 0.000 description 1
- 239000011159 matrix material Substances 0.000 description 1
- 230000010412 perfusion Effects 0.000 description 1
- 150000008104 phosphatidylethanolamines Chemical class 0.000 description 1
- 150000003904 phospholipids Chemical class 0.000 description 1
- 238000000053 physical method Methods 0.000 description 1
- 238000002264 polyacrylamide gel electrophoresis Methods 0.000 description 1
- 229920000642 polymer Polymers 0.000 description 1
- 230000001376 precipitating effect Effects 0.000 description 1
- 238000001556 precipitation Methods 0.000 description 1
- 108090000765 processed proteins & peptides Proteins 0.000 description 1
- 239000000047 product Substances 0.000 description 1
- 238000000746 purification Methods 0.000 description 1
- 238000004007 reversed phase HPLC Methods 0.000 description 1
- 238000005185 salting out Methods 0.000 description 1
- 238000000926 separation method Methods 0.000 description 1
- 239000011734 sodium Substances 0.000 description 1
- 239000002904 solvent Substances 0.000 description 1
- 239000003270 steroid hormone Substances 0.000 description 1
- LENZDBCJOHFCAS-UHFFFAOYSA-N tris Chemical compound OCC(N)(CO)CO LENZDBCJOHFCAS-UHFFFAOYSA-N 0.000 description 1
- 238000000108 ultra-filtration Methods 0.000 description 1
- 238000002604 ultrasonography Methods 0.000 description 1
- VBEQCZHXXJYVRD-GACYYNSASA-N uroanthelone Chemical compound C([C@@H](C(=O)N[C@H](C(=O)N[C@@H](CS)C(=O)N[C@@H](CC(N)=O)C(=O)N[C@@H](CS)C(=O)N[C@H](C(=O)N[C@@H]([C@@H](C)CC)C(=O)NCC(=O)N[C@@H](CC=1C=CC(O)=CC=1)C(=O)N[C@@H](CO)C(=O)NCC(=O)N[C@@H](CC(O)=O)C(=O)N[C@@H](CCCNC(N)=N)C(=O)N[C@@H](CS)C(=O)N[C@@H](CCC(N)=O)C(=O)N[C@@H]([C@@H](C)O)C(=O)N[C@@H](CCCNC(N)=N)C(=O)N[C@@H](CC(O)=O)C(=O)N[C@@H](CC(C)C)C(=O)N[C@@H](CCCNC(N)=N)C(=O)N[C@@H](CC=1C2=CC=CC=C2NC=1)C(=O)N[C@@H](CC=1C2=CC=CC=C2NC=1)C(=O)N[C@@H](CCC(O)=O)C(=O)N[C@@H](CC(C)C)C(=O)N[C@@H](CCCNC(N)=N)C(O)=O)C(C)C)[C@@H](C)O)NC(=O)[C@H](CO)NC(=O)[C@H](CC(O)=O)NC(=O)[C@H](CC(C)C)NC(=O)[C@H](CO)NC(=O)[C@H](CCC(O)=O)NC(=O)[C@@H](NC(=O)[C@H](CC=1NC=NC=1)NC(=O)[C@H](CCSC)NC(=O)[C@H](CS)NC(=O)[C@@H](NC(=O)CNC(=O)CNC(=O)[C@H](CC(N)=O)NC(=O)[C@H](CC(C)C)NC(=O)[C@H](CS)NC(=O)[C@H](CC=1C=CC(O)=CC=1)NC(=O)CNC(=O)[C@H](CC(O)=O)NC(=O)[C@H](CC=1C=CC(O)=CC=1)NC(=O)[C@H](CO)NC(=O)[C@H](CO)NC(=O)[C@H]1N(CCC1)C(=O)[C@H](CS)NC(=O)CNC(=O)[C@H]1N(CCC1)C(=O)[C@H](CC=1C=CC(O)=CC=1)NC(=O)[C@H](CO)NC(=O)[C@@H](N)CC(N)=O)C(C)C)[C@@H](C)CC)C1=CC=C(O)C=C1 VBEQCZHXXJYVRD-GACYYNSASA-N 0.000 description 1
- XLYOFNOQVPJJNP-UHFFFAOYSA-N water Substances O XLYOFNOQVPJJNP-UHFFFAOYSA-N 0.000 description 1
Landscapes
- Preparation Of Compounds By Using Micro-Organisms (AREA)
- Micro-Organisms Or Cultivation Processes Thereof (AREA)
- Medicines Containing Antibodies Or Antigens For Use As Internal Diagnostic Agents (AREA)
- Pharmaceuticals Containing Other Organic And Inorganic Compounds (AREA)
Abstract
(57)【要約】本公報は電子出願前の出願データであるた
め要約のデータは記録されません。
め要約のデータは記録されません。
Description
【発明の詳細な説明】
産業上の利用分野
本発明は、リンパ系細胞を増殖するための組成物、リン
パ系細胞の増殖方法および生理活性物質の製造法に関す
る。
パ系細胞の増殖方法および生理活性物質の製造法に関す
る。
従来の技術
リンパ系細胞を用いて有用な生理活性物質、たとえばイ
ンターフェロンなどのリンホカイン類やモノクローナル
抗体などを効率よく生産させるための研究が、種々の面
から活発に進められている。
ンターフェロンなどのリンホカイン類やモノクローナル
抗体などを効率よく生産させるための研究が、種々の面
から活発に進められている。
一方、血しょう増量剤として使用されるポリビニールピ
ロリドンか、ヘパトーマ細胞(ザ・ジャパニーズ・ジャ
ーナル・オブ・エキスベリメンタル0メデイスン(Th
e Japanese Journal of Exp
eri−mental Medicine)29巻 4
5頁 1959年)、繊維芽細胞(ザ・ジャパニーズ・
ジャーナル・才ブ・エキスペリメンタル・メディスン
29巻 19I頁 1959年)やヒーラ−細胞(ザ・
ジャパニーズ・ジャーナル・オブ・エキスペリメンタル
・メディスン 30巻 +47頁 1960年)などの
増殖を促進することが古く勝田らによって報告されてい
るが、リンパ系細胞の増殖にも影響を及ぼすことは全く
知られていなかった。さらに本化合物を添加した培地で
培養すると生理活性物質が効率よく生産出来ることら全
く未知であった。従来リンパ系細胞の培養には、他の細
胞の場合と同様血清を約10%程度添加し1こ培地が主
として用いられ、とりわけ牛胎児血清(FCS)含有培
地が賞用されて来た。
ロリドンか、ヘパトーマ細胞(ザ・ジャパニーズ・ジャ
ーナル・オブ・エキスベリメンタル0メデイスン(Th
e Japanese Journal of Exp
eri−mental Medicine)29巻 4
5頁 1959年)、繊維芽細胞(ザ・ジャパニーズ・
ジャーナル・才ブ・エキスペリメンタル・メディスン
29巻 19I頁 1959年)やヒーラ−細胞(ザ・
ジャパニーズ・ジャーナル・オブ・エキスペリメンタル
・メディスン 30巻 +47頁 1960年)などの
増殖を促進することが古く勝田らによって報告されてい
るが、リンパ系細胞の増殖にも影響を及ぼすことは全く
知られていなかった。さらに本化合物を添加した培地で
培養すると生理活性物質が効率よく生産出来ることら全
く未知であった。従来リンパ系細胞の培養には、他の細
胞の場合と同様血清を約10%程度添加し1こ培地が主
として用いられ、とりわけ牛胎児血清(FCS)含有培
地が賞用されて来た。
発明が解決しようとする問題点
しかしながら、血t#は非常に高価であり、かつ原因不
明のロフト差があるため、細胞を大量に培養するには問
題が多い。さらに血清には多種類の異種蛋白質が含まれ
るため、生産される有用物質を培養液から回収精製する
際にも不都合が生ずる。
明のロフト差があるため、細胞を大量に培養するには問
題が多い。さらに血清には多種類の異種蛋白質が含まれ
るため、生産される有用物質を培養液から回収精製する
際にも不都合が生ずる。
これらの不都合を解消しようとして、血清を含まない培
地(無血清培地)も種々開発されて来たが、一般に汎用
性が低く、増殖性および生理活性物質生産性の面でも血
清含有培地jご比べると必ずしも十分なものとはいえな
い。また無血清培地では、血清の代替として、各種細胞
増殖因子、ホルモン類などが添加されるが、これらの因
子類には高価なものも多く、血清含有培地より、むしろ
高価な場合もしばしば認められる。
地(無血清培地)も種々開発されて来たが、一般に汎用
性が低く、増殖性および生理活性物質生産性の面でも血
清含有培地jご比べると必ずしも十分なものとはいえな
い。また無血清培地では、血清の代替として、各種細胞
増殖因子、ホルモン類などが添加されるが、これらの因
子類には高価なものも多く、血清含有培地より、むしろ
高価な場合もしばしば認められる。
いずれにしても従来知られている培地は、細胞培養によ
って有用物質を大量に効率よく得るためには必ずしも十
分満足できる乙のではなかった。
って有用物質を大量に効率よく得るためには必ずしも十
分満足できる乙のではなかった。
このように、安価で大量供給が可能で、しかも血清等に
由来する性質不明の蛋白質を出来るだけ含まないリンパ
系細胞増殖用培地を開発することが望まれる。該培地と
しては、無血清で汎用性があり、しかも細胞増殖能が高
い培地が理想的であるが、血清含有培地でもその血清の
使用量を大巾に減らずことが出来れば、培地の経済性お
よび培養液中の不純物含量の面での問題点を大巾に改善
することが可能である。
由来する性質不明の蛋白質を出来るだけ含まないリンパ
系細胞増殖用培地を開発することが望まれる。該培地と
しては、無血清で汎用性があり、しかも細胞増殖能が高
い培地が理想的であるが、血清含有培地でもその血清の
使用量を大巾に減らずことが出来れば、培地の経済性お
よび培養液中の不純物含量の面での問題点を大巾に改善
することが可能である。
問題点を解決するだめの手段
上記した事情に鑑み、本発明者らは、リンパ系細胞の増
殖を促進する物質の探索を進めたところ、ポリビニール
ピロリドンを含有したリンパ系細胞増殖用組成物による
培地でリンパ系細胞または生理活性物質を生産するリン
パ系細胞を培養すると、リンパ系細胞が著しく増殖され
、またこれにより、産生される生理活性物質の量が増大
されることを見い出し、これに基づいてさらに研究した
結果、本発明を完成した。
殖を促進する物質の探索を進めたところ、ポリビニール
ピロリドンを含有したリンパ系細胞増殖用組成物による
培地でリンパ系細胞または生理活性物質を生産するリン
パ系細胞を培養すると、リンパ系細胞が著しく増殖され
、またこれにより、産生される生理活性物質の量が増大
されることを見い出し、これに基づいてさらに研究した
結果、本発明を完成した。
本発明は、(1)ポリビニールピロリドンを含有してな
るリンパ系細胞増殖用組成物。
るリンパ系細胞増殖用組成物。
(2)ポリビニールピロリドンを含有するリンパ系細胞
増殖用培地でリンパ系細胞を培養することを特徴とする
リンパ系細胞の増殖方法および(3)ポリビニールピロ
リドンを含有するリンパ系細胞増殖用培地で、生理活性
物質を生産するリンパ系細胞を培養し、培養物中にこれ
を生成蓄積せしめ、採取することを特徴とする生理活性
物質の製造法である。
増殖用培地でリンパ系細胞を培養することを特徴とする
リンパ系細胞の増殖方法および(3)ポリビニールピロ
リドンを含有するリンパ系細胞増殖用培地で、生理活性
物質を生産するリンパ系細胞を培養し、培養物中にこれ
を生成蓄積せしめ、採取することを特徴とする生理活性
物質の製造法である。
本明細書においては、ポリビニールピロリドンをPVP
と略記することらある。
と略記することらある。
本発明の組成物は、基礎培地およびポリビニールピロリ
ドンからなる。
ドンからなる。
該基礎培地としては、リンパ系細胞の培養に用いること
のできるものであればいずれのものでらよい。
のできるものであればいずれのものでらよい。
本発明に用いられる基礎培地としては、たとえば市販さ
れている各種基礎培地[たとえば、イーグルの最小必須
培地(MEMXサイエンス(Science) 130
巻 432頁 1959年)、イーグルの基礎培地(B
MEXプロシーディンゲス・オブ・ザ・ソサイエティ・
フォア・エキスベリメンタル・バイオロジー・アンド・
メディスン(Procee−dings of the
5ociety for Experimental
Biology and Medicine)89巻
362頁 1965年)、ダルベツコ改変イーグル培地
(DME)(パイロロジ−(Virology) 8巻
396頁 1959年)、イスコフ改変ダルベツコ培
地(rMDMXザ・ジャーナル・オブ・エキスベリメン
タル・メディスン(The Journal of E
xperimental Medicine) 147
巻 923頁 1978年)、L−15培地(アメリカ
ン・ジャーナル・オブ・ハイジーン(American
Journal orHygiene)78巻 +73
頁 1963年)。
れている各種基礎培地[たとえば、イーグルの最小必須
培地(MEMXサイエンス(Science) 130
巻 432頁 1959年)、イーグルの基礎培地(B
MEXプロシーディンゲス・オブ・ザ・ソサイエティ・
フォア・エキスベリメンタル・バイオロジー・アンド・
メディスン(Procee−dings of the
5ociety for Experimental
Biology and Medicine)89巻
362頁 1965年)、ダルベツコ改変イーグル培地
(DME)(パイロロジ−(Virology) 8巻
396頁 1959年)、イスコフ改変ダルベツコ培
地(rMDMXザ・ジャーナル・オブ・エキスベリメン
タル・メディスン(The Journal of E
xperimental Medicine) 147
巻 923頁 1978年)、L−15培地(アメリカ
ン・ジャーナル・オブ・ハイジーン(American
Journal orHygiene)78巻 +73
頁 1963年)。
マツコイ5a培地(プロシーディンゲス・オブ・ザ・ソ
サイエティ・フォア・エキスベリメンタル・バイオロジ
ー・アンド・メディスン100巻115頁 1959年
)、ハムFI2培地(プロシーディンゲス・オブ・ナシ
ョナル・アカデミ−・オブ・ザイエンス・ニー・ニス・
ニー(Proceedingsof National
Academy of 5cience、 USA)
53巻288頁 1965年)、RPMI I 640
培地(ジャーナル・オブ・ザ・アメリカン・メディカル
・アソンエーション(Journal of the
AmericanMedical As5ociati
on) 199巻 519頁 1967年)など]ある
いはこれらを混合した培地が挙げられる。該基礎培地に
それぞれの細胞の増殖に必須な因子(補助増殖因子)た
とえばホルモン類(たとえばインスリン、トランスフェ
リン、ステロイドホルモンなど)、蛋白性増殖因子[た
とえば上皮細胞増殖因子(EGF)、血小板由来増殖因
子(PDGF)、繊維芽細胞増殖因子(FGr’)など
]33重金属類たとえば亜セレン酸ナトリウムなど)や
リン脂質(たとえばエタノールアミン、ホスファチジル
エタノールアミンなど)を必要により添加した無血清培
地が挙げられる。さらに、これらに通常の使用量または
それ以下の血清代替物質[たとえばGFS(第2回次世
代産業基盤技術シンポジウム−バイオテクノロジー 予
講集161頁、 1984年)、NU−シーラム(コラ
ボレーテイブリサーヂ社製)、シーラムプラス(KCバ
イオロジカルズ社製)など]が添加された培地や、通常
の使用量以下の血清[たとえば牛胎児血清(F CS
)、新生子牛血清、子牛血清。
サイエティ・フォア・エキスベリメンタル・バイオロジ
ー・アンド・メディスン100巻115頁 1959年
)、ハムFI2培地(プロシーディンゲス・オブ・ナシ
ョナル・アカデミ−・オブ・ザイエンス・ニー・ニス・
ニー(Proceedingsof National
Academy of 5cience、 USA)
53巻288頁 1965年)、RPMI I 640
培地(ジャーナル・オブ・ザ・アメリカン・メディカル
・アソンエーション(Journal of the
AmericanMedical As5ociati
on) 199巻 519頁 1967年)など]ある
いはこれらを混合した培地が挙げられる。該基礎培地に
それぞれの細胞の増殖に必須な因子(補助増殖因子)た
とえばホルモン類(たとえばインスリン、トランスフェ
リン、ステロイドホルモンなど)、蛋白性増殖因子[た
とえば上皮細胞増殖因子(EGF)、血小板由来増殖因
子(PDGF)、繊維芽細胞増殖因子(FGr’)など
]33重金属類たとえば亜セレン酸ナトリウムなど)や
リン脂質(たとえばエタノールアミン、ホスファチジル
エタノールアミンなど)を必要により添加した無血清培
地が挙げられる。さらに、これらに通常の使用量または
それ以下の血清代替物質[たとえばGFS(第2回次世
代産業基盤技術シンポジウム−バイオテクノロジー 予
講集161頁、 1984年)、NU−シーラム(コラ
ボレーテイブリサーヂ社製)、シーラムプラス(KCバ
イオロジカルズ社製)など]が添加された培地や、通常
の使用量以下の血清[たとえば牛胎児血清(F CS
)、新生子牛血清、子牛血清。
ブタ血清、ヤギ血清、ニワトリ血清など]を添加した培
地などが挙げられる。また市販の無血清培地[たとえば
ハイブリティー1(日本薬品開発製)。
地などが挙げられる。また市販の無血清培地[たとえば
ハイブリティー1(日本薬品開発製)。
[(I3−102(ハナ・メディア社製)、HL−1(
ベントレッド社製)など]ち本発明の基礎培地として用
いることが可能であり、市販の基礎培地に準じてアミノ
酸などの濃度を最適化した培地を作成して用いることら
可能である。
ベントレッド社製)など]ち本発明の基礎培地として用
いることが可能であり、市販の基礎培地に準じてアミノ
酸などの濃度を最適化した培地を作成して用いることら
可能である。
本発明で用いられろポリビニールピロリドンは、持つ高
重合体であり、市販の平均分子量約10.000ないし
1,200,000のものが有利に使用される。
重合体であり、市販の平均分子量約10.000ないし
1,200,000のものが有利に使用される。
より具体的には平均分子ff125,000のPVP
K−25,40,OOOノPVP K−30またハf、
200,000のPVP K−90などが使用される。
K−25,40,OOOノPVP K−30またハf、
200,000のPVP K−90などが使用される。
本発明で用いられるポリビニールピロリドンの量として
は、使用時の濃度が約0.001%(W/v)ないし1
0%、より好ましくは約0.01%ないし5%(胃/V
)、さらに好ましくは約0.1%ないし5%(W/V)
となる量である。
は、使用時の濃度が約0.001%(W/v)ないし1
0%、より好ましくは約0.01%ないし5%(胃/V
)、さらに好ましくは約0.1%ないし5%(W/V)
となる量である。
ポリビニールピロリドンは、あらかじめ組成物中に混合
されていても良いし、培地として使用する際に混入して
も良い。
されていても良いし、培地として使用する際に混入して
も良い。
本発明のリンパ系細胞増殖用組成物は、固体状態のちの
および水溶液であるもののいずれでもよい。固体状態の
らのは、それをたとえば水に溶解あるいは懸濁して用い
られる。
および水溶液であるもののいずれでもよい。固体状態の
らのは、それをたとえば水に溶解あるいは懸濁して用い
られる。
また、該組成物をリンパ系細胞増殖用の培地として用い
ることができるが、培地として用いる場合には、血清を
含まない培地としても良く、さらに、通常の使用量以下
の血清を含む培地としても良い。ここで、通常の使用量
としては、たとえば約10%(V/V)が挙げられる。
ることができるが、培地として用いる場合には、血清を
含まない培地としても良く、さらに、通常の使用量以下
の血清を含む培地としても良い。ここで、通常の使用量
としては、たとえば約10%(V/V)が挙げられる。
本発明の組成物を培地として用いる場合には、通常の使
用量またはそれ以下の血清代替物を含む培地としてもよ
い。ここで、通常の使用量としては、たとえば、GFS
の場合は約3〜4g#!(蛋白質として)であり、NU
−シーラムの場合は約10%V/Vであり、シーラムプ
ラスの場合は約10%V/Vである。
用量またはそれ以下の血清代替物を含む培地としてもよ
い。ここで、通常の使用量としては、たとえば、GFS
の場合は約3〜4g#!(蛋白質として)であり、NU
−シーラムの場合は約10%V/Vであり、シーラムプ
ラスの場合は約10%V/Vである。
本発明方法によって培養されるリンパ系細胞としては、
ヒト、マウス、ラット、ウシ、ハムスターなどの哺乳動
物のリンパ球または白血病由来細胞であって初代培養細
胞、リンパ腫、白血病、骨髄腫瘍由来の細胞株1リンパ
球を片方の親細胞とするハイブリドーマやウィルス等で
変異したリンパ球細胞株などを挙げることが出来る。
ヒト、マウス、ラット、ウシ、ハムスターなどの哺乳動
物のリンパ球または白血病由来細胞であって初代培養細
胞、リンパ腫、白血病、骨髄腫瘍由来の細胞株1リンパ
球を片方の親細胞とするハイブリドーマやウィルス等で
変異したリンパ球細胞株などを挙げることが出来る。
より具体的には、ヒトリンパ系細胞としては、Nama
lva(ATCCCRL 14.32Xインターナシヨ
ナル・ジャーナル・オブ・キャンサー(Interna
tional Journal of cancer)
12巻396頁 1973年)、Raji(ATCCC
CL86)(ランセット(Lancet) 1巻 23
8頁 1964年)。
lva(ATCCCRL 14.32Xインターナシヨ
ナル・ジャーナル・オブ・キャンサー(Interna
tional Journal of cancer)
12巻396頁 1973年)、Raji(ATCCC
CL86)(ランセット(Lancet) 1巻 23
8頁 1964年)。
EB−3(ATCCCCL850ランセット1巻 25
2頁 1964年)、W I −L 2 (キャンサー
(Cancer) 22巻 5!7頁 1968年)、
Daudi(ATCCCCL213)(キャンサー・
リサーチ(Cancer Re5earch)28巻
1300頁1968年)、RPMl 8226(A
TCCCCL155)(プロシーディンゲス・オブ・ザ
・ソサイエティ・フォア・エキスペリメンタル・バイオ
ロジー・アンド・メディスン 125巻 1246頁1
967年)、CCRF−OEM(ATCCcct、t
r 90キヤンサー 18巻 522頁 1965年)
、 RP M 11788(ATCCCCL l 56
Xジヤーナル・オブ・ザ・ナショナル・キャンサー・イ
ンスティチュート(ユナイティド・ステーブXJour
nal ofthe National Cancer
In5titute (United 5tates
))43巻 1119頁1969年)、CRCF−SB
(ATCCCCL 120)(キャンサー・リサーチ
27巻 2479頁 1967年)、 Jurkat(
イムノジェネティクス(ImmunogeneHcs)
10巻 247頁 1980年)などが、マウスリン
パ系細胞としては、たとえば、MPC−II(ATCC
CCL167Xザ・ジャーナル・才ブ・エキスペリメン
タル・メディスン131巻 515頁 1970年)、
NS−1(ATCCTlB18Xユーロピアン・ジャー
ナル・才ブ・イムノロジー(European Jou
rnal of Immuno−+ogy) 6巻 5
11N1976年)、P3X63Ag8U−1(P3U
IXATCCCRLI597)(カレント・トピックス
・オブ・マイクロバイオロジー・アンド・イムノロジー
(Current Topicsof Microbi
ology and 1mmunology)81巻
1頁1978年)などが、ハイブリドーマとしては、た
とえばマウスハイブリドーマCEA(第2回次計代産業
基盤技術シンポジウム〜バイオテクノロジー 予稿集
175買 昭和59年)、l−13−II(同上)、B
235163(バイブリド−? (!Iybridom
a)4巻 47頁 1985年)、マウス・ヒト・ヒト
ヘテロハイブリドーマN12−16・63(第2回次世
代産業基盤技術シンポジウム−バイオテクノロジー予稿
集 175頁 昭和59年)、112−22・25 (
バイオケミカル・アンド・バイオフィンカル・リサーチ
・コミュニケーション(Biochemical an
d Biophysical Re5earch C
ommu−nication) 129巻 26頁 1
985年)、 HBII[−43・l(同上)などがそ
れぞれ挙げられる。
2頁 1964年)、W I −L 2 (キャンサー
(Cancer) 22巻 5!7頁 1968年)、
Daudi(ATCCCCL213)(キャンサー・
リサーチ(Cancer Re5earch)28巻
1300頁1968年)、RPMl 8226(A
TCCCCL155)(プロシーディンゲス・オブ・ザ
・ソサイエティ・フォア・エキスペリメンタル・バイオ
ロジー・アンド・メディスン 125巻 1246頁1
967年)、CCRF−OEM(ATCCcct、t
r 90キヤンサー 18巻 522頁 1965年)
、 RP M 11788(ATCCCCL l 56
Xジヤーナル・オブ・ザ・ナショナル・キャンサー・イ
ンスティチュート(ユナイティド・ステーブXJour
nal ofthe National Cancer
In5titute (United 5tates
))43巻 1119頁1969年)、CRCF−SB
(ATCCCCL 120)(キャンサー・リサーチ
27巻 2479頁 1967年)、 Jurkat(
イムノジェネティクス(ImmunogeneHcs)
10巻 247頁 1980年)などが、マウスリン
パ系細胞としては、たとえば、MPC−II(ATCC
CCL167Xザ・ジャーナル・才ブ・エキスペリメン
タル・メディスン131巻 515頁 1970年)、
NS−1(ATCCTlB18Xユーロピアン・ジャー
ナル・才ブ・イムノロジー(European Jou
rnal of Immuno−+ogy) 6巻 5
11N1976年)、P3X63Ag8U−1(P3U
IXATCCCRLI597)(カレント・トピックス
・オブ・マイクロバイオロジー・アンド・イムノロジー
(Current Topicsof Microbi
ology and 1mmunology)81巻
1頁1978年)などが、ハイブリドーマとしては、た
とえばマウスハイブリドーマCEA(第2回次計代産業
基盤技術シンポジウム〜バイオテクノロジー 予稿集
175買 昭和59年)、l−13−II(同上)、B
235163(バイブリド−? (!Iybridom
a)4巻 47頁 1985年)、マウス・ヒト・ヒト
ヘテロハイブリドーマN12−16・63(第2回次世
代産業基盤技術シンポジウム−バイオテクノロジー予稿
集 175頁 昭和59年)、112−22・25 (
バイオケミカル・アンド・バイオフィンカル・リサーチ
・コミュニケーション(Biochemical an
d Biophysical Re5earch C
ommu−nication) 129巻 26頁 1
985年)、 HBII[−43・l(同上)などがそ
れぞれ挙げられる。
本発明の生理活性物質の製造法において用いられる生理
活性物質を生産するリンパ系細胞としては、たとえばマ
ウスモノクローナル抗体を産生するCEA、H8−I[
、B235163など、ヒトモノクローナル抗体を産生
ずるN12−16・63゜r12−22・25.HB[
−43・1などが、白血球インターフェロンを産生する
Namalva細胞。
活性物質を生産するリンパ系細胞としては、たとえばマ
ウスモノクローナル抗体を産生するCEA、H8−I[
、B235163など、ヒトモノクローナル抗体を産生
ずるN12−16・63゜r12−22・25.HB[
−43・1などが、白血球インターフェロンを産生する
Namalva細胞。
インターロイキン−2を産生ずるJ urkat細胞な
どが挙げられる。
どが挙げられる。
本発明方法の培養には通常培養に用いられろ容器または
装置が用いられる。たとえば、マルヂウエルプレート、
培養フラスコ、スピナーフラスコ。
装置が用いられる。たとえば、マルヂウエルプレート、
培養フラスコ、スピナーフラスコ。
ジャーファーメンタ−、ファーメンタ−1さらに十ロー
フアイバー培養装置、セラミックマトリックスを用いた
培養装置やマイクロカプセル培養法などが適宜採用され
る。
フアイバー培養装置、セラミックマトリックスを用いた
培養装置やマイクロカプセル培養法などが適宜採用され
る。
本発明の培養は、用いられるリンパ系細胞の培養に適し
た条件が採用される。一般的には、培養温度約37°C
前後で、pH約6.5〜7.5で、数日〜3か月培養さ
れる。たとえば、本発明の培地に通常o、i〜5x10
5個/mlの細胞を播種し、マルヂウエルプレートやフ
ラスコの場合には約37℃、5%炭酸ガス培養器(炭酸
ガス濃度5%の培養器)中でpH約6,5〜7.5で約
1〜20日間培養される。ジャーファーメンタ−やファ
ーメンタ−などでは通気攪拌培養が行われる。またこれ
らの培養槽や本ローフアイバー、セラミックマトリック
ス、マイクロカプセルなどを用いた培養においては培地
を回分的、または連続的に交換することにより生理活性
物質の生産性を向上させることができる。連続潅流培養
の場合には1ないし数ケ月(約3か月)も続ける場合が
ある。また、必要により通気される。
た条件が採用される。一般的には、培養温度約37°C
前後で、pH約6.5〜7.5で、数日〜3か月培養さ
れる。たとえば、本発明の培地に通常o、i〜5x10
5個/mlの細胞を播種し、マルヂウエルプレートやフ
ラスコの場合には約37℃、5%炭酸ガス培養器(炭酸
ガス濃度5%の培養器)中でpH約6,5〜7.5で約
1〜20日間培養される。ジャーファーメンタ−やファ
ーメンタ−などでは通気攪拌培養が行われる。またこれ
らの培養槽や本ローフアイバー、セラミックマトリック
ス、マイクロカプセルなどを用いた培養においては培地
を回分的、または連続的に交換することにより生理活性
物質の生産性を向上させることができる。連続潅流培養
の場合には1ないし数ケ月(約3か月)も続ける場合が
ある。また、必要により通気される。
培養液から細胞を採取するには、培養液を直接遠心分離
機やろ逸機にかけて集めろ。またリンパ系細胞の培養に
よって生産される生理活性物質は、その物質が培養液中
に蓄積される場合、ろ過または遠心分離によって上澄液
を得、これから採取される。また細胞内に蓄積される物
質の場合には、ろ過または遠心分離によって得た細胞を
物理的方法(例、超音波、フレンチプレス、ダイノミル
など)または化学的方法(例、塩酸グアニジン等)にて
処理し、生産物を抽出したのち、上澄液を得る。
機やろ逸機にかけて集めろ。またリンパ系細胞の培養に
よって生産される生理活性物質は、その物質が培養液中
に蓄積される場合、ろ過または遠心分離によって上澄液
を得、これから採取される。また細胞内に蓄積される物
質の場合には、ろ過または遠心分離によって得た細胞を
物理的方法(例、超音波、フレンチプレス、ダイノミル
など)または化学的方法(例、塩酸グアニジン等)にて
処理し、生産物を抽出したのち、上澄液を得る。
上記上澄液から生理活性物質を分離、精製するには自体
公知の分離、精製法を適宜組み合わせて行うことができ
る。たとえば生理活性物質が蛋白質またはペプチドの場
合には、塩析や溶媒沈澱法などの溶解度を利用する方法
、透析法、限外ろ適法。
公知の分離、精製法を適宜組み合わせて行うことができ
る。たとえば生理活性物質が蛋白質またはペプチドの場
合には、塩析や溶媒沈澱法などの溶解度を利用する方法
、透析法、限外ろ適法。
ゲルろ適法、5DS−ポリアクリルアミドゲル電気泳動
法などの主として分子量の差を利用する方法、イオン交
換クロマトグラフィーなどの荷電の差を利用する方法、
アフィニティクロマトグラフイーなどの特異的親和性を
利用する方法、逆相高速液体クロマトグラフィーなどの
疎水性の差を利用する方法1等電点電気泳動などの等電
点の差を利用する方法などが適用されろ。
法などの主として分子量の差を利用する方法、イオン交
換クロマトグラフィーなどの荷電の差を利用する方法、
アフィニティクロマトグラフイーなどの特異的親和性を
利用する方法、逆相高速液体クロマトグラフィーなどの
疎水性の差を利用する方法1等電点電気泳動などの等電
点の差を利用する方法などが適用されろ。
本発明の方法に従って増殖さ什たリンパ系細胞は、各種
リンフ才力イン類(たとえば白血球インターフェロン類
、免疫インターフェロン、インターロイキン−2など)
や各種モノクローナル抗体(例、マウスモノクローナル
抗体やヒトモノクローナル抗体など)などの生産に利用
される。また正常リンパ球をたとえばインターロイキン
−2で刺激しつつ本発明の方法に従って増殖し、集めた
細胞を直接ヒトの血液中にもどすアトブチイブ・イムノ
0テラビー(Adoptive Immunother
apy)などにも利用することが出来る。
リンフ才力イン類(たとえば白血球インターフェロン類
、免疫インターフェロン、インターロイキン−2など)
や各種モノクローナル抗体(例、マウスモノクローナル
抗体やヒトモノクローナル抗体など)などの生産に利用
される。また正常リンパ球をたとえばインターロイキン
−2で刺激しつつ本発明の方法に従って増殖し、集めた
細胞を直接ヒトの血液中にもどすアトブチイブ・イムノ
0テラビー(Adoptive Immunother
apy)などにも利用することが出来る。
本発明方法により、リンパ系細胞を効率良く増殖させる
ことができるので、リンパ系細胞を工業的に大王に増殖
させる方法として有利に用いることができる。
ことができるので、リンパ系細胞を工業的に大王に増殖
させる方法として有利に用いることができる。
本発明方法において、生理活性物質を生産するリンパ系
細胞を培養した場合には、該細胞が効率良く増殖される
ので、生理活性物質を効率良く生産することができ、工
業的生産上有利である。
細胞を培養した場合には、該細胞が効率良く増殖される
ので、生理活性物質を効率良く生産することができ、工
業的生産上有利である。
実施例
以下に実施例を挙げて本発明を更に具体的に説明する。
PVPの添加%はW/V%を表わす。血清の添加%はV
/V%を表わす。
/V%を表わす。
実施例1
IMDM、ハムF12およびL−15培地を1:l・2
の比率で混合した培地に、2 mg/σインスリン、
2 Jl1g/12 )ランスフェリン、2X10°I
IMエタノールアミン、2.5x I O°sM亜セレ
ン酸ナトリウム(4つを合せてITESと称する。)を
添加し、これに各種濃度のPVP K−90(平均分子
m1.200,000)を添加した無血清培地を調製し
、これを24穴マルヂウエルプレートへ1ml宛分注し
た。
の比率で混合した培地に、2 mg/σインスリン、
2 Jl1g/12 )ランスフェリン、2X10°I
IMエタノールアミン、2.5x I O°sM亜セレ
ン酸ナトリウム(4つを合せてITESと称する。)を
添加し、これに各種濃度のPVP K−90(平均分子
m1.200,000)を添加した無血清培地を調製し
、これを24穴マルヂウエルプレートへ1ml宛分注し
た。
これにヒトリンパ芽球由来の〜VI−L2細胞をl×1
05個/mlの割合で播種し、376C,5%炭酸ガス
培養器中で4日間培養後、コールタ−カウンターにて細
胞数を測定し、第1図の結果を得た。
05個/mlの割合で播種し、376C,5%炭酸ガス
培養器中で4日間培養後、コールタ−カウンターにて細
胞数を測定し、第1図の結果を得た。
この図から明らかなように、PVPを添加しない培地で
の細胞数は4.2X I O’個/mlであったのに対
し、PVPを添加した場合にはその濃度の増加に供なっ
て細胞数が増加し、0.2〜0.8%の添加で約1.5
X 10’個/mlにも達した。
の細胞数は4.2X I O’個/mlであったのに対
し、PVPを添加した場合にはその濃度の増加に供なっ
て細胞数が増加し、0.2〜0.8%の添加で約1.5
X 10’個/mlにも達した。
実施例2
実施例1と同じ基礎培地にITESを添加し、更に各種
濃度のpvp K−90(平均分子量1.200,00
0)を添加した無血清培地および各種濃度のPVP K
−30(平均分子量40,000)を添加した無血清培
地を調製し、これを24穴マルヂウエルプレートへ1m
l宛分注した。 これにマウス・ヒト・ヒトヘテロハイ
ブリドーマN12−16・63の細胞をlXIO3個/
mlの割合で播種し、37℃、5%炭酸ガス培養器中で
5日間培養後、コールタ−カウンターにて細胞数を測定
し、第2図の結果を得た。PVP K−90の場合(−
−1−で示される。)、至適濃度は0.4%付近であっ
たが、PVP K−30の場合(−イヒーで示される。
濃度のpvp K−90(平均分子量1.200,00
0)を添加した無血清培地および各種濃度のPVP K
−30(平均分子量40,000)を添加した無血清培
地を調製し、これを24穴マルヂウエルプレートへ1m
l宛分注した。 これにマウス・ヒト・ヒトヘテロハイ
ブリドーマN12−16・63の細胞をlXIO3個/
mlの割合で播種し、37℃、5%炭酸ガス培養器中で
5日間培養後、コールタ−カウンターにて細胞数を測定
し、第2図の結果を得た。PVP K−90の場合(−
−1−で示される。)、至適濃度は0.4%付近であっ
たが、PVP K−30の場合(−イヒーで示される。
)には、0.2〜6.4%の広い範囲で特に有効であっ
た。
た。
実施例3
実施例1と同じ基礎培地にITESを添加した培地(1
)、更にこれに0.2%PVP K−30(平均分子f
f140,000)を添加した培地(2)、および0.
2%PVP K−90(平均分子量1,200,000
)を添加した培地(3)を用意し、これらを24穴マル
チウエルプレートへ1ml宛分注した。これに表1に示
す各種リンパ系細胞をIx105個/mlの割合で播種
し、37℃、5%炭酸ガス培養器中て゛ 4日間培養し
たのちコールタ−カウンターで細胞数を計数し表1の結
果を得た。
)、更にこれに0.2%PVP K−30(平均分子f
f140,000)を添加した培地(2)、および0.
2%PVP K−90(平均分子量1,200,000
)を添加した培地(3)を用意し、これらを24穴マル
チウエルプレートへ1ml宛分注した。これに表1に示
す各種リンパ系細胞をIx105個/mlの割合で播種
し、37℃、5%炭酸ガス培養器中て゛ 4日間培養し
たのちコールタ−カウンターで細胞数を計数し表1の結
果を得た。
(以下余白)
表1 無血清培地における各種リンパ系細胞の増殖Na
malva ヒトバーキット 2.lX1059.5
X1051.lX10’リンパ腫 CRCF−SB ヒト急性リンパ 6.OX 10’
2.9X 10’ 3.IX to’芽球性白血
病 P3Ul マ’)スミx、ロー5.lX10’
8.9X10’ 9.5x10’マ )E235163 7 ウス−バイブ 3.5x105
6.6x1056,4x105リドーマ N12−16 ・637ウスーヒト 2.6XIO57
,7XIO’ 6.5X105・ヒトヘテロハ イブリドーマ 実施例4 マウス・ヒト・ヒトヘテロハイブリドーマN12−16
・63妹を、実施例1と同じ基礎培地にITESおよび
表2に示す各種添加物を添加した培地に、l X 10
5g/mlになる様に播種し、37°C,5%炭酸ガス
培養器中で5日間培養し、細胞数をコールタ−カウンタ
ーで抗体産生ffi(IgM)をEL I SA法で測
定し、表2の結果を得た。
malva ヒトバーキット 2.lX1059.5
X1051.lX10’リンパ腫 CRCF−SB ヒト急性リンパ 6.OX 10’
2.9X 10’ 3.IX to’芽球性白血
病 P3Ul マ’)スミx、ロー5.lX10’
8.9X10’ 9.5x10’マ )E235163 7 ウス−バイブ 3.5x105
6.6x1056,4x105リドーマ N12−16 ・637ウスーヒト 2.6XIO57
,7XIO’ 6.5X105・ヒトヘテロハ イブリドーマ 実施例4 マウス・ヒト・ヒトヘテロハイブリドーマN12−16
・63妹を、実施例1と同じ基礎培地にITESおよび
表2に示す各種添加物を添加した培地に、l X 10
5g/mlになる様に播種し、37°C,5%炭酸ガス
培養器中で5日間培養し、細胞数をコールタ−カウンタ
ーで抗体産生ffi(IgM)をEL I SA法で測
定し、表2の結果を得た。
表2 無血清、低血清または低濃度血清代替物質添加0
0 1、Ox 10’ 1u
g/m1FCS 1 %0 4.Ox 1056
μ’g/ml′1′通常の使用濃度は3mg/ml 実施例5 マウス・ヒト・ヒトヘテロハイブリドーマ112−22
・25株を、実施例1と同じ基礎培地に(1)ITES
および0.3mg/mlのGFSを添加した培地、
(2) I T E S 、0.3mg/mlG F
Sおよび0.2%PVP K−90を添加した培地お
よび(3)ITESと3 mg/mlG F Sを添加
した培地を分注したスピナーフラスコに、I X I
O’g/ mlの割合で播種し、37°C,5%炭酸ガ
ス培養器中で25rpmで5日間培養した。遠心分離に
よって培養上清を各IQずつ集め、これに硫酸アンモニ
ウムを加えて37%〜50%(飽和度)で沈澱する画分
を集めた。これを0.07MNaC1を添加した0、0
2Mトリス・塩酸緩衝液(pH7,9)に対して透析し
たのち、同じ緩衝液で平衡化したワットマンDE52セ
ルロースカラムにかけ、素通り画分を集めた。次に0
、 I 5 MNaCIを含む0.05Mトリス−塩酸
緩衝液で平衡化したプロティンAカラムに通液してIg
Gを吸着させた。同じ緩衝液で洗滌後、0.15MNa
C1を含む0.05Mグリシン−塩酸緩衝液(pH2,
2)で溶出して活性画分を集めた。この活性画分を透匠
後凍結乾燥して0.005MNaC1を含む0.05M
MES緩衝液(pl(6,9)に溶かし、Mono
S HR515カラム(ファーマシア)を用いたFP
LCにかけ、同じ緩衝液にて洗滌後、IMNaClを含
む0.05MMES緩衝液(pH6,0)で直線濃度勾
配をかけて溶出し、IgG画分を集めたところ、(1)
〜(3)の培養液からそれぞれ620組g、4800μ
gおよび3200μgのヒトIgGが得られた。
0 1、Ox 10’ 1u
g/m1FCS 1 %0 4.Ox 1056
μ’g/ml′1′通常の使用濃度は3mg/ml 実施例5 マウス・ヒト・ヒトヘテロハイブリドーマ112−22
・25株を、実施例1と同じ基礎培地に(1)ITES
および0.3mg/mlのGFSを添加した培地、
(2) I T E S 、0.3mg/mlG F
Sおよび0.2%PVP K−90を添加した培地お
よび(3)ITESと3 mg/mlG F Sを添加
した培地を分注したスピナーフラスコに、I X I
O’g/ mlの割合で播種し、37°C,5%炭酸ガ
ス培養器中で25rpmで5日間培養した。遠心分離に
よって培養上清を各IQずつ集め、これに硫酸アンモニ
ウムを加えて37%〜50%(飽和度)で沈澱する画分
を集めた。これを0.07MNaC1を添加した0、0
2Mトリス・塩酸緩衝液(pH7,9)に対して透析し
たのち、同じ緩衝液で平衡化したワットマンDE52セ
ルロースカラムにかけ、素通り画分を集めた。次に0
、 I 5 MNaCIを含む0.05Mトリス−塩酸
緩衝液で平衡化したプロティンAカラムに通液してIg
Gを吸着させた。同じ緩衝液で洗滌後、0.15MNa
C1を含む0.05Mグリシン−塩酸緩衝液(pH2,
2)で溶出して活性画分を集めた。この活性画分を透匠
後凍結乾燥して0.005MNaC1を含む0.05M
MES緩衝液(pl(6,9)に溶かし、Mono
S HR515カラム(ファーマシア)を用いたFP
LCにかけ、同じ緩衝液にて洗滌後、IMNaClを含
む0.05MMES緩衝液(pH6,0)で直線濃度勾
配をかけて溶出し、IgG画分を集めたところ、(1)
〜(3)の培養液からそれぞれ620組g、4800μ
gおよび3200μgのヒトIgGが得られた。
発明の効果
本発明のリンパ系細胞増殖用組成物による培地を用いる
とリンパ系細胞を効率よく増殖させることができる。ま
た、生理活性物質を生産するリンパ系細胞を培養すると
、生理活性物質を効率良く生産させることができる。
とリンパ系細胞を効率よく増殖させることができる。ま
た、生理活性物質を生産するリンパ系細胞を培養すると
、生理活性物質を効率良く生産させることができる。
第1図は、実施例1で得られたポリビニールピロリドン
の添加効果を示す。 第2図は、実施例2で得られたポリビニールピロリドン
の添加効果を示す。 出願人 工業技術院長 飯 塚 幸 三$ 1 図
の添加効果を示す。 第2図は、実施例2で得られたポリビニールピロリドン
の添加効果を示す。 出願人 工業技術院長 飯 塚 幸 三$ 1 図
Claims (13)
- (1)ポリビニールピロリドンを含有してなるリンパ系
細胞増殖用組成物。 - (2)固体状態にある特許請求の範囲第1項記載の組成
物。 - (3)水溶液である特許請求の範囲第1項記載の組成物
。 - (4)基礎培地の成分がイスコフ培地、ハム培地、L−
15培地またはそれらの2種以上の混合培地の成分と同
じである、特許請求の範囲第1項記載の組成物。 - (5)インスリン、トランスフェリン、エタノールアミ
ンおよび亜セレン酸の1種以上を添加した特許請求の範
囲第1項または第4項記載の組成物。 - (6)血清を含まない特許請求の範囲第3項記載の組成
物。 - (7)通常の使用量以下の血清を含む特許請求の範囲第
3項記載の組成物。 - (8)ポリビニールピロリドンを含有するリンパ系細胞
増殖用培地でリンパ系細胞を培養することを特徴とする
リンパ系細胞の増殖方法。 - (9)リンパ系細胞増殖用培地が血清を含まない培地で
ある特許請求の範囲第8項記載の増殖方法。 - (10)リンパ系細胞増殖用培地が通常の使用量以下の
血清を含む特許請求の範囲第8項記載の増殖方法。 - (11)ポリビニールピロリドンを含有するリンパ系細
胞増殖用培地で、生理活性物質を生産するリンパ系細胞
を培養し、培養物中にこれを生成蓄積せしめ、採取する
ことを特徴とする生理活性物質の製造法。 - (12)リンパ系細胞増殖用培地が血清を含まない培地
である特許請求の範囲第11項記載の製造法。 - (13)リンパ系細胞増殖用培地が通常の使用量以下の
血清を含む培地である特許請求の範囲第11項記載の製
造法。
Priority Applications (1)
Application Number | Priority Date | Filing Date | Title |
---|---|---|---|
JP61227189A JPS6384487A (ja) | 1986-09-27 | 1986-09-27 | リンパ系細胞増殖用組成物及び増殖方法 |
Applications Claiming Priority (1)
Application Number | Priority Date | Filing Date | Title |
---|---|---|---|
JP61227189A JPS6384487A (ja) | 1986-09-27 | 1986-09-27 | リンパ系細胞増殖用組成物及び増殖方法 |
Publications (2)
Publication Number | Publication Date |
---|---|
JPS6384487A true JPS6384487A (ja) | 1988-04-15 |
JPH0561908B2 JPH0561908B2 (ja) | 1993-09-07 |
Family
ID=16856884
Family Applications (1)
Application Number | Title | Priority Date | Filing Date |
---|---|---|---|
JP61227189A Granted JPS6384487A (ja) | 1986-09-27 | 1986-09-27 | リンパ系細胞増殖用組成物及び増殖方法 |
Country Status (1)
Country | Link |
---|---|
JP (1) | JPS6384487A (ja) |
Cited By (1)
Publication number | Priority date | Publication date | Assignee | Title |
---|---|---|---|---|
FR2635008A1 (fr) * | 1988-08-05 | 1990-02-09 | Sanofi Sa | Agent activateur de la productivite specifique des cellules animales recombinantes a base de polyvinylpyrrolidone et milieu de culture defini le contenant |
Citations (1)
Publication number | Priority date | Publication date | Assignee | Title |
---|---|---|---|---|
JPS62181780A (ja) * | 1986-02-05 | 1987-08-10 | Teijin Ltd | 動物細胞の培養方法 |
-
1986
- 1986-09-27 JP JP61227189A patent/JPS6384487A/ja active Granted
Patent Citations (1)
Publication number | Priority date | Publication date | Assignee | Title |
---|---|---|---|---|
JPS62181780A (ja) * | 1986-02-05 | 1987-08-10 | Teijin Ltd | 動物細胞の培養方法 |
Cited By (1)
Publication number | Priority date | Publication date | Assignee | Title |
---|---|---|---|---|
FR2635008A1 (fr) * | 1988-08-05 | 1990-02-09 | Sanofi Sa | Agent activateur de la productivite specifique des cellules animales recombinantes a base de polyvinylpyrrolidone et milieu de culture defini le contenant |
Also Published As
Publication number | Publication date |
---|---|
JPH0561908B2 (ja) | 1993-09-07 |
Similar Documents
Publication | Publication Date | Title |
---|---|---|
US4533634A (en) | Tissue culture medium | |
EP0066284B1 (en) | Culture medium and its use | |
US5378612A (en) | Culture medium for production of recombinant protein | |
US4473647A (en) | Tissue culture medium | |
JPS58190397A (ja) | インターリューキン−2およびその純化方法 | |
Scott et al. | Changes in membrane structure associated with cell contact | |
EP3059305B1 (en) | Mammalian cell culture media which comprise supernatant from cohn fractionation stages and use thereof | |
Wu et al. | Common pattern of two distinct types of colony-stimulating factor in human tissues and cultured cells. | |
EP0248656B1 (en) | Composition for cell cultivation and use thereof | |
US4469790A (en) | Continuous and spontaneous interferon producing lymphoblastoid cell lines, process for preparing the same, and process for the human interferon production by the same | |
JPS6384487A (ja) | リンパ系細胞増殖用組成物及び増殖方法 | |
EP0148770B1 (en) | Composition for cell cultivation, production and use thereof | |
EP0201800B1 (en) | A cholesterol-rich fraction, process therefor and use thereof in cell culture | |
JPH0436189A (ja) | 肝細胞増殖因子の製造方法 | |
TW577894B (en) | Methods for conversion of protein isoforms and products thereof | |
JP2500384B2 (ja) | 生理活性物質の製造法 | |
EP0295605B1 (en) | Antibody production-stimulating factor derived from human B lymphoblastoid cell and process for producing antibody by using said stimulating factor | |
CA1215335A (en) | Tissue culture medium | |
JPS63133982A (ja) | 動物細胞増殖用組成物およびそれを用いる動物細胞の増殖方法 | |
Polet | The effect of lymphokines on the growth, the metabolism, and the functions of the cellular membrane of Chang liver cells in vitro | |
GB2232998A (en) | Culture medium for hybridoma cells | |
JPH0561907B2 (ja) | ||
AU8338082A (en) | Tissue culture medium | |
JPS63185375A (ja) | 動物細胞増殖用組成物および増殖方法 | |
JPH0510074B2 (ja) |