JPS63185375A

JPS63185375A - 動物細胞増殖用組成物および増殖方法

Info

Publication number: JPS63185375A
Application number: JP61279773A
Authority: JP
Inventors: Kazuaki Kitano; 北野　一昭; Yasushi Shintani; 靖新谷
Original assignee: Agency of Industrial Science and Technology
Current assignee: National Institute of Advanced Industrial Science and Technology AIST
Priority date: 1986-09-27
Filing date: 1986-11-26
Publication date: 1988-07-30
Also published as: JPH0558706B2

Abstract

(57)【要約】本公報は電子出願前の出願データであるた
め要約のデータは記録されません。

Description

【発明の詳細な説明】産業上の利用分野本発明は、動物細胞を増殖するための組成物。

動物細胞の増殖方法および生理活性物質の製造法に関す
る。

従来の技術動物細胞を大量に効率よく培養する技術は、新しい有用
な生理活性物質の探索や生産に、さらに遺伝子操作技術
を施した細胞を用いる生理活性物質生産に必須の技術と
して、種々の方向からの研究か進められている。従来動
物細胞の培養には、血清を約１０％程度添加した培地が
主として用いられ、とりイつけ牛胎児血清（Ｆｅ２）含
有培地が賞用されて来た。

魚瞥が邂辺上洟やとする問題、ケしかしながら、血清は非常に高価であり、かつ原因不明
のロット差があるため、細胞を大儀に培養するには問題
が多い。さらに血清には多種類の異種蛋白質が含まれる
ため、生産される有用物質を培養液から回収精製する際
にも不都合が生ずる。

これらの不都合を解消しようとして、血清を含まない培
地（無血清培地）も種々開発されて来たが、一般に汎用
性が低く、増殖性および生理活性物質生産性の面でも血
清含有培地に比へると必ずしも十分なものとはいえない
。また無血清培地では、血清の代替として、各種細胞増
殖因子、ホルモン類などが添加されるが、これらの因子
類には高価なものも多く、血清含有培地より、むしろ高
価な場合もしばしば認められる。

いずれにしても従来知られている培地は、細胞培養によ
って有用物質を大量に効率よく得るためには必ずしも十
分満足できるものではなかった。

このように、安価で大量供給が可能で、しかも血清等に
由来する性質不明の蛋白質を出来るたけ含まない動物細
胞増殖用培地を開発することが望まれる。該培地として
は、無血清で汎用性かあり、しかも細胞増殖能が高い培
地が理想的であるが、血清含有培地でもその血清の使用
量を大巾に減らすことか出来れば、培地の経済性および
培養液中の不純物含量の面での問題点を大１］に改善す
ることが可能である。

叫孤卓そ鷹…−るための手拠 −１−記した事情に鑑み、本発明者らは、細胞増殖を促
進電る物質の探索を進めたところ、ポリビニールアルコ
ールまたは／およびポリプロピレンクリコールを含有し
た動物細胞増殖用組成物による培地で動物細胞または生
理活性物質を生産する動物細胞を培養すると、動物細胞
が著しく増殖され、またこれにより、産生される生理活
性物質の量が増大されることを見い出し、これに基づい
てさらに研究した結果、本発明を完成した。

本発明は、（１）ポリビニールアルコールまたは／およ
びポリプロピレングリコールを含有してなる動物細胞増
殖用組成物、（２）ポリビニールアルコールまたは／およびポリプロ
ピレングリコールを含有する動物細胞増殖用培地で動物
細胞を培養することを特徴とする動物細胞の増殖方法お
」；び（３）ポリビニールアルコールまたは／およびポリプロ
ピレングリコールを含有する動物細胞増殖用培地で、生
理活性物質を生産する動物細胞を培養し、培養物中にこ
れを生成蓄積せしめ、採取することを特徴とする生理活
性物質の製造法である。

本明細書においては、ポリビニールアルコールおよびポ
リプロピレングリコールをそれぞれＰＶＡおよびＰＰＧ
と略記することもある。

〜ら− ＝４一本発明の組成物は、基礎培地およびＰＶＡまたは／およ
びＰＰＧからなる。

該基礎培地としては、動物細胞の培養に用いることので
きるものであればいずれのものでもよい。

本発明に用いられる基礎培地としては、たとえば市販さ
れている各種基礎培地［たとえば、イーグルの最小必須
培地（ＭＥＭＸサイエンス（Ｓｃｉｅｎｃｅ）　１３０
巻　４３２頁　１９５９年）、イーグルの基礎培地（Ｂ
　Ｍ　Ｅ　）（プロシーディンゲス・オブ・ザ・ソザイ
エティ・フォア・エキスベリメンタル・バイオロジー・
アンド・メディスン（Ｐｒｏｃｅｅ−ｄｉｎｇｓ　ｏｆ
ｔｈｅ　５ｏｃｉｅｔｙ　ｆｏｒ　Ｅｘｐｅｒｉｍｅｎ
ｔａｌＢｉｏｌｏｇｙ　ａｎｄ　Ｍｅｄｉｃｉｎｅ）　
８９巻　３６２頁　１９６５年）、ダルベツコ改変イー
クル培地（Ｄ　Ｍ　Ｅ　）（バイｃｙ　ｏジー（Ｖｉｒ
ｏｌｏｇ’Ｙ）　８巻　３９６頁　１９５９年）、イス
コツ改変ダルベツコ培地（ＩＭＤＭ）（ザ・ジャーナル
・オブ・エキスベリメンタル・メディスン（Ｔｈｅ　Ｊ
ｏｕｒｎａｌ　ｏｆ　Ｅｘｐｅｒｉｍｅｎｔａｌ　Ｍｅ
ｄｉｃｉｎｅ）　Ｉ　４７巻　９２３頁　１９７８年）
、Ｌ−１５培地（アメリカン・ジャーナル・オブ・ハイ
ノーン（Ａｍｅｒｉｃａｎ６一Ｊｏｕｒｎａｌ　ｏ［′ｔｌｙｇｉｅｎｅ）７８巻　１
７３頁　１９６３年）。

マツコイ５ａ培地（プロン−ディンゲス・オブ・ザ・ソ
サイエティ・フォア・エキスペリメンタル・バイオロジ
ー・アンド・メディスン１００巻　１１５頁　１９５９
年）、ハムＦ１２培地（ブロン−ディンゲス・オブ・ナ
ショナル・アカデミ−・オブ・サイエ：ｚス・ニー　・
ｘ７．　・ｘ−（Ｐｒｏｃｅｅｄｉｎｇｓ　ｏｆＮａｔ
ｉｏｎａｌ　Ａｃａｄｅｍｙ　ｏｆ　５ｃｉｅｎｃｅ、
　ＵＳＡ）５３巻２８８頁　１９６５年）、ＲＰＭＩ　
　１６４０培地（ジャーナル・オブ・ザ・アメリカン・
メディカル・アソンエーンヨン（Ｊｏｕｒｎａｌ　ｏｆ
　ｔｈｅ　ＡｍｅｒｉｃａｎＭｅｄｉｃａｌ　Ａｓ５ｏ
ｃｉａｔｉｏｎ）　１９９巻　５１９頁　１９６７年）
などコあるいはこれらを混合した培地が挙げられる。該
基礎培地にそれぞれの細胞の増殖に必須な因子（補助増
殖因子）たとえばホルモン類（たとえばインスリン、ト
ランスフェリン、ステロイドホルモンなど）、蛋白性増
殖因子［たとえば上皮細胞増殖因子（ＥＧＦ）、血小板
由来増殖因子（ＰＤＧＦ）、繊維芽細胞増殖因子（ＦＧ
Ｆ）など］９９重金属類たとえば亜セレン酸ナトリウム
など）やリン脂質（たとえばエタノールアミン、ホスフ
ァチジルエタノールアミンなど）を必要により添加した
無血清培地が挙げられる。さらに、これらに通常の使用
量またはそれ以下の血清代替物質［たとえばＧＦＳ（第
２回次世代産業基盤技術シンポジウム−バイオテクノロ
ジー予講集１６１頁、　１９８４年）、ＮＵ〜ンーラム
（コラポレーテイブリザーチ社製）、シーラムプラス（
ＫＣバイオロジカルズ社製）などコが添加された培地や
、通常の使用量以下の血清［たとえば牛胎児血清（Ｐ　
ＣＳ　）、新生子牛血清、仔牛血清、ブタ血清、ヤギ血
清、ニワトリ血清などコを添加した培地などが挙げられ
る。また市販の無血清培地［たとえばハイブリティー■
（日本薬品開発製）。

Ｉ（＋３−＋０２（ハナ・メディア社製）、Ｉ−Ｉ　Ｌ
　−１（ベントレッド社製）など］も本発明の基礎培地
として用いることが可能であり、市販の基礎培地に準じ
てアミノ酸などの濃度を最適化した培地を作成して用い
ることも可能である。

本発明で用いられるポリビニールアルコールは、（−Ｃ
１１２Ｃ１ｌ（０１１）　−）　ｎ（ｎは重合度を表す
。）の構造を持つ高重合体であり、平均重合度が約５０
０ないし２，０００のものが好ましく、なかでも約５０
０のもの、１５００〜１８００のものが好ましい。ポリ
プロピレングリコールとしては、ジオールタイプのもの
、トリオールタイプのものなどが挙げられるが、トリオ
ールタイプのものが好ましく、平均分子量約３，０００
ないし４，０００のものが好ましく、なかでも約４，０
００のものが好ましい。ここでジオールタイプとは、Ｈ
Ｏ［：　　ＣＨ（ＣＨ３）Ｃｌ２Ｏ）　ｎ、Ｈ（ｎ＋は
重合度を表す。）の構造を持つ高重合体のことをいう。

一方、トリオールタイプとしては、例えばＲＯＣＩＩ２
ｅｌｌ（ＯＲ）ＣＨ，ＯＲの構造をもつ平均分子、ｉｌ
　３，０００の高重合体、　　ＣＨ３Ｃ８２Ｃ（ＣＨ２
０Ｒ）３の構造をもつ平均分子ｆｆ１４，０００の高重
合体などが挙げられる（式中、ＲはＣ−Ｃ１ｌ、ＣＨ（
ＣＩＩ３）０−）　ｎ２Ｈを表し、ｎ２は重合度を表す
。）。

本発明で用いられるポリビニールアルコールの量は、使
用時において約０．００１％（Ｙ／Ｖ）ないし１０％（
Ｗ／Ｖ）が好ましく、なかでも約０１吋％（Ｗ／Ｖ）な
いし３％（ｗ／ｖ）となる量がより好ましい。ポリプロ
ピレングリコールの最は、使用時において約ｏ、ｏｏｔ
％（Ｗ／Ｖ）ないし１　％（Ｗ／Ｖ）となる量か好まし
く、なかでも約０，０１％（Ｗ／Ｖ）ないし０．１％（
Ｗ／Ｖ）　ノ量が好ましい。

ポリビニールアルコールとポリプロピレングリコールは
単独で使用しても良いし、両者を同時に使用しても良い
。両者を同時に使用する場合、その混合比は、ＰＰＧを
ｌとした場合、ＰＶＡは約０５〜１００となるのが好ま
しくは、なかでも約ｌ〜２０となるように混合するのが
より好ましい。

これらの化合物に（ＣＨ２Ｃｌ１２０　　）　ｎ’　（
ｎ’は重合度を表す。）の構造を持つ高重合体であるポ
リエチレングリコール（以下、ＰＥＧと略記することも
ある。）を混合しても良い。混合するポリエチレングリ
コールとしては、平均分子量か約１．０００以上のもの
が好ましく、なかでも約２，０００ないし２０，０００
のものが好ましく、さらに約４，０００゜約６，０００
．約２０，０００のものが好ましい。ポリエチレングリ
コールの量としては、使用時において約０．０ＯＩ％（
Ｗ／Ｖ）ないし１０　％（ｗ／Ｖ）が好ましく、さ−ら
に好ましくは約００１％ＣＷ／Ｖ）ないし２％（Ｗ／Ｖ
）となる量である。ポリエチレンクリコールの混合比と
しては、ＰＥＧを１とした場合、ＰＶＡは約０．１〜１
０．ＰＰＧは約０．０１〜ｌが好ましく、なかでもＰＶ
Ａが約０５〜２．ＰＰＧが約０，０５〜１となるように
混合するのがより好ましい。ポリエチレングリコールは
、ポリビニールアルコール。ポリプロピレングリコール
を単独で使用しているものに混合しても良いし、両者を
同時に使用しているものに混合しても良い。

本発明で用いられる化合物は、あらかじめ組成物中に混
合されていても良いし、培地として使用する際に混入し
ても良い。

本発明の動物細胞増殖用組成物は、固体状態のものおよ
び水溶液であるもののいずれてもよい。

固体状態のちのは、それをたとえば水に溶解あるいは懸
濁して用いられる。

また、該組成物を動物細胞増殖用の培地として用いるこ
とができるが、培地として用いる場合には、血ＦＪを含
まない培地としても良く、さらに、通常の使用量以下の
血清を含む培地としても良い。

ここで、通常の使用ｍとしては、たとえば約ＩＯ％（Ｖ
／Ｖ）が挙げられる。

本発明の組成物を培地として用いる場合には、通常の使
用量またはそれ以下の血清代替物を含む培地としてもよ
い。ここで、通常の使用量としては、たとえば、ＧＦＳ
の場合は約３〜４ｇ／ρ（蛋白質として）であり、ＮＵ
−シーラムの場合は約ＩＯ％Ｖ／Ｖであり、シーラムプ
ラスの場合は約１０％Ｖ／Ｖである。

本発明方法によって培養される動物細胞としては、特に
限定されない。その例としては、たとえばヒト、マウス
、ラット、ウン、ハムスターなどの唾乳動物由来のリン
パ系細胞（例、正常リンパ球、ミエローマ細胞、Ｂ−リ
ンパ芽球様細胞、Ｔリンパ性白血病細胞など）、各種ハ
イブリドーマ（例、マウスハイブリトーマ、マウス・ヒ
トヘテロハイブリドーマ、ヒトハイブリドーマなど）、
正常２倍体細胞（例、繊維芽細胞など）、その他の種々
の接着依存性細胞などを挙げることが出来る。

より具体的には、ヒトリンパ系細胞としては、Ｎａｍａ
ｌｖａ（ＡＴＣＣＣＲＬ　ｌ　４３２）（インターナシ
ョナル・ジャーナル・オブ・キャンザ−（Ｉｎｔｅｒｎ
ａｔｉｏｎａｌ　Ｊｏｕｒｎａｌ　ｏｆｃａｎｃｅｒ）
１２巻　３９６頁　１９７３年）、　Ｒａｊｉ（ＡＴＣ
ＣＣＣＬ　８６）（ランセット（Ｌａｎｃｅｔ）　１巻
　２３８頁　１９６４年）、ＥＢ−３（ＡＴＣＣＣＣＬ
８５）（ランセット１巻２５２頁　１９６４年）、ＷＩ
−Ｌ２（キャンザ−（Ｃａｎｃｅｒ）　２２巻　５１７
頁　１９６８年）、　Ｄａｕｄｉ（ＡＴＣＣＣＣＬ２＋
３）（キャンザー・リサーチ（Ｃａｎｃｅｒ　Ｒｅ５ｅ
ａｒｃｈ）２８巻　１３００頁１９６８年）、　ＲＰｔ
ｖｌ＋　　８２２６（Ａ’ｌ”ＣＣＣＣＬＩ５５）（プ
ロノーディンゲス・オブ・ザ・ソザイエティ・フォア・
エキスペリメンタル・バイオロジー・アンド・メディス
ン　１２５巻　１２４６頁１９６７年）、ＣＣｒｔＦ−
ＯＥＭ（ＡＴＣＣＣＣＬｌ１９）（キャンサー　１８巻
　５２２頁　１９６５年）、ＩＩＰＭｌｌ　７８８（Ａ
ＴＣＣＣＣＬ　ｌ　５６）（ジャーナル・オブ・ザ・ナ
ンヨナル・キャンサー・インスティデユード（ユナイテ
ィド・ステーブ）（Ｊｏｕｒｎａｌ　ｏｆｔｈｅ　Ｎａ
ｔｉｏｎａｌ　Ｃａｎｃｅｒ　Ｉｎ５ｔｉｔｕｔｅ　（
Ｕｎｉｔｅｄ　５ｔａｔｅｓ））４３巻　１１１９頁１
９６９年）、ＣＲＣＦ−８Ｂ（ＡＴＣＣＣＣＬ　Ｉ　２
０）（キャンサー・リサーチ　２７巻２４７９頁　１９
６７年）などが、マウスリンパ系細胞としては、たとえ
ば、ＭＰＣ−ＩＩ（ＡＴＣｃ　　ｃｃ、、＋６７）（ザ
・ジャーナル・オブ・エキスペリメンタル・タデイス２
１３１巻　５１５頁１９７０年）、ＮＳ−１（ＡＴＣＣ
Ｔｌｌ３１８）（ユーロピアン・ツヤ−ナル・オブ・イ
ムノロン−（Ｅｕｒｏｐｅａｎ　Ｊｏｕｒｎａｌ　ｏｒ
　Ｉｍｍｕｎｏｌｏｇｙ）６巻　５１１頁　１９７６年
）、Ｐ３Ｘ６３Ａｇ８Ｕ−１（Ｐ２Ｏ３）（ＡＴＣＣＣ
ＲＬ　Ｉ　５９７Ｘカレント・トピックス・オブ・マイ
クロバイオロジー・アンド・イｌ＼ノロジー（Ｃｕｒｒ
ｅｎｔ　Ｔｏｐｉｃｓ　ｏｆ　Ｍｉｃｒｏｂｉｏｌｏｇ
ｙａｎｄ　Ｉｍｍｕｎｏｌｏｇｙ）８１巻　１頁　１９
７８年）などが、ハイブリトーマとしては、たとえばマ
ウスハイブリトーマＣＥＡ（第２回次世代産業基盤技術
シンボノウム−バイオテクノロジー　予稿集　＋７５頁
　昭和５９年）、Ｈ９−ＩＩ（同」二）、Ｅ２３５１６
３（バイブリド−ｖ　（Ｈｙｂｒｉｄｏｍａ）　４巻　
４７頁１９８５年）、マウス・ヒト・ヒトヘテロハイブ
リドーマＮ１２−１６・６３（第２回次世代産業基盤技
術シンポジウム−バイオテクノロジー　予稿集１７５頁
　昭和５９年）、１１２−２２・２５（バイオケミカル
・アンド・バイオフィジカル・リサーチ・コミュニケー
ション（Ｂｉｏｃｈｅｍｉｃａｌ　ａｎｄＢｉｏｐｈｙ
ｓｉｃａｌ　Ｒｅ５ｅａｒｃｈ　Ｃｏｍｍｕｎｉｃａｔ
ｉｏｎ）　１２９巻２６頁　１９８５年）、ＨＢＩ［−
４３・ｌ（同上）などが、接着依存性細胞としては、た
とえば）；’Ｌ（ＡＴＣＣＣＣＬ６２にプロシーデイン
ダス・オブ・ザ・ソザイエティ・フォア・エキスペリメ
ンタル・バイオロジー・アンド・メディスン　９４巻５
３２頁　１９５７年）、ＨｅＬａ（ＡＴＣＣＣＣＬ２）
（キャンサー・リサーチ　１２巻　２６４頁　１９５２
年）、Ｗｉｓｈ（ＡＴＣＣＣＣＬ　２５Ｘ、］１キスペ
リメンタル・セル・リサーチ（Ｅｘｐｅｒｉｍｅｎｔａ
ｌ　　Ｃｅ１ｌＲｅｓｅａｒｃｈ　）２３巻　１４頁　
１９６１年）、ＣＨＯ−Ｋｌ（ＡＴＣＣＣＣＬ６１）（
ザ・ジャーナル・オブ・エキスペリメンタル・メディス
ン１０８巻　９４５頁　１９５８年）、Ｌ細胞（ＡＴＣ
ＣＣＣＬＩＸジャーナル・オブ・ザ・ナショナル・キャ
ンサー・インスチチュート（ユナイティド・ステープ）
９巻　２２９頁　１９４８年）などがそれぞれ挙げられ
る。

本発明の生理活性物質の製造法において用いられる生理
活性物質を生産する動物細胞としては、たとえば、マウ
スモノクローナル抗体を産生ずる（、ＥＡ、Ｈ９−ｎ、
Ｅ２３５１６３など、ヒトモノクローナル抗体を産生ず
るＮｌ　２−１６・６３゜１１２−２２・２５．ＨＢＩ
Ｉｌ−４３・１などが、白血球インターフェロンを産生
するＮａｍａｌｖａ細胞。

インターロイキン−２を産生ずる遺伝子組換え細胞マウ
スＬ−Ｉ　Ｌ−２１３−３細胞、ヒトＰＬ−ｒＬ３８５
−６細胞、ハムスターＣ−ＩＬ４８５−１４細胞（特開
昭６１−６３２８２号公報参照）などが挙げられる。

本発明方法の培養には通常培養に用いられる容器または
装置が用いられる。たとえば浮遊細胞の場合には、マル
チウェルプレート、培養フラスコ。

スピナーフラスコ、ジャーファーメンタ−、ファーメン
タ−などが用いられ、さらにホローファイバー培養装置
、セラミックマトリックスを用いた培養装置さらにマイ
クロカプセル培養法などが適宜採用される。接着依存性
細胞の場合には、マルヂウエルプレート、培養フラスコ
、ローラーボトル。

マイクロキャリアー培養法、ホローファイバー培養法、
セラミックマトリックス培養法などが用いられる。

本発明の培養は、用いられる動物細胞の培養に適した条
件が採用される。一般的には、培養温度５％炭酸ガス培
養器（炭酸ガス濃度５％の培養器）中でＩ）Ｈ約６．５
〜７．５で約１〜２０日間培養される。ジャーファーメ
ンタ−やファーメンタ−などでは通気攪拌培養が行われ
る。またこれらの培養槽やホローファイバー、セラミッ
クマトリックス、マイクロカプセルなどを用いた培養に
おいては培地を回分的、または連続的に交換することに
より生理活性物質の生産性を向上させることができる。

連続潅流培養の場合には１ないし数ケ月（約３か月）も
続ける場合がある。また、必要により通気される。

培養液から細胞を採取するには、たとえば、浮遊細胞の
場合は、培養液を直接遠心分離機やろ逸機にかけて集め
る。接着依存性細胞の場合にはたとえば、０　、１　ｍ
ｇ／ｍｌのＥＤＴＡおよび１．２５ｍｇ／ｍ１のトリプ
シンを添加して、３７℃、１〜２分反応させて細胞を分
散させたのち、遠心分離またはろ過によって集める。

細胞培養によって生産される生理活性物質は、法（例、
超音波、フレンチプレス、ダイノミルなど）または化学
的方法（例、塩酸グアニジン等）にて処理し、生産物を
抽出したのち、上澄液を得る。

上記」二層液から生理活性物質を分離、精製するには自
体公知の分離、精製法を適宜組み合イっせて行うことか
できる。たとえば生理活性物質が蛋白質またはペプチド
の場合には、塩析や溶媒沈澱法などの溶解度を利用する
方法、透析法、限外ろ適法。

ゲルろ適法、５ＤＳ−ポリアクリルアミドゲル電気泳動
法などの主として分子量の差を利用する方法、イオン交
換クロマトグラフィーなどの荷電の差を利用する方法、
アフィニティクロマトグラフイーなどの特異的親和性を
利用する方法、逆相高速液体クロマトグラフィーなどの
疎水性の差を利用する方法１等電点電気泳動などの等電
点の差を利用する方法などが適用される。

本発明の方法に従って増殖させた動物細胞は、たとえば
これにウィルスを感染させてワクチンの製造に利用した
り、各種リンフ才力イン類（例、生産に利用される。ま
た遺伝子操作によって特定の遺伝子を導入した細胞を用
いることにより該物質を効率よく生産させることができ
る。また本発明の方法に従って増殖し、集めた細胞を直
接に、人工皮膚や人工器官（例、膵臓ベータ島細胞や、
肝細胞など）として利用することもできる。

本発明方法により、動物細胞を効率良く増殖させること
ができるので、動物細胞を工業的に大量に増殖させる方
法として有利に用いることができる。

本発明方法において、生理活性物質を生産する動物細胞
を培養した場合には、該細胞が効率良く増殖されるので
、生理活性物質を効率良く生産することができ、工業生
産上有利である。

及１牲以下に実施例を挙げて本発明を更に具体的に説明する。

ＰＶＡ、ＰＰＧおよびＰＥＧの添加％はＷ／Ｖ％を表わ
す。血清の添加％はＶ／Ｖ％を表イっす。

実施例１ＴＭＤＭ、ハムＦ１２およびＬ−１５培地をに゛つを合
せてＩＴＥ、Ｓと称する。）を添加し、これに各種濃度
のＰＶＡ（平均重合度５００）またはＰＰＧ（）ジオー
ルタイプ。平均分子量４，０００）を添加した培地を調
製し、これをマルヂウェルプレートへ１ｍｌ宛分注した
。これにマウス・ヒト・ヒトヘテロハイブリドーマＮ１
２〜１６・６３株の細胞をＩＸＬＯ５個／ｍｌになるよ
うに播種し、５％炭酸ガス培養器中で３７℃５日間培養
後、コールタ−カウンターにて細胞数を測定した。結果
を第１図、第２図に示す。

ＰＶ／ｌ）至適濃度＋；ｔ、　０　、２〜０　、８　％
、　Ｐ　Ｐ　Ｇ　（７）場合は０．０２５％であった。

至適濃度条件下では、無添加の場合と比較すると、ＰＶ
Ａで約４゜５倍、ＰＰＧで約３倍まで細胞数が増加した
。

実施例２実施例１と同じ基礎培地に同じ濃度のＩＴＥＳを添加し
た培地（１）、更にこれに０．２％ＰＶＡ（平均重合度
５００）を添加した培地（２）、および００２５％ＰＰ
Ｇ（）リオールタイプ、平均分子ｆｆｉ　４，０００）
を添加した培地（３）を用意し、これを２４穴マルヂウ
エルプレートへ１ｍｌ宛分注した。こ８れに表１に示す
各種細胞を１ｘ１０５個／ｍｌの割合で播種し、３７℃
、５％炭酸ガス培養器中で５．１１間培養したのち、コールタ−カウンターで細胞数を計
数し、表１の結果を得た。

（以下余白）表１　無血清培地における各種細胞の増殖に及ぼすＮａ
ｍａｌｖａ　　ヒトバーキット　２．１Ｘ１０５１，３
Ｘ１０°　８．９ｘ１．０５リンパ腫ＣＲＣＦ　−８Ｂ　　ヒト急性リンパ　６．ＯＸ　１０
’　　３．３Ｘ　１０５１．８Ｘ　１０５芽球性白血病Ｐ３Ｕｌ　　　マウスミニロー　５．ＩＸ　１０’　　
１．３Ｘ　１０５６．ＩＸ　１０’マ実施例３実施例１と同じ基礎培地に１％牛脂児血清（Ｆｅ２）を
添加し、これに０２％ＰＶＡ（平均重合度５００）また
は０．０２５％ＰＰＧ（）ジオールタイプ。平均分子量
４，０００）を添加した培地と無添加培地を用意し、こ
れにマウス・ヒト・ヒトヘテロハイブリドーマＮ１２−
１６・６３またはマウスハイブリドーマＥ２３５１６３
をｌＸＩＯ３細胞／ｍｌ宛播種し、３７℃、５％炭酸ガ
ス培養器中で５日間培養し、細胞数をコールタ−カウン
ターで測定し、表２の結果を得た。

表２　低濃度血清を添加した培地におけるＰＶＡ実施例
４マウス・ヒト・ヒトヘテロハイブリドーマ１１２−２２
・２５株を実施例１と同じ基礎培地に同、ｐ濃度のＩＴ
ＥＳおよび表３（こ示す濃度のＰＶＡ（平均重合度５０
０）またはＰＰＧ（）リオールタ♀プ、平均分子量４，
０００）を添加した培地に、１×１０５細胞／ｍｌにな
るように播種したのち、５％炭酸ガス培養器中、３７℃
６日間培養し、細胞数および抗体産生量を測定し、表３
の結果を得た。

＝２３− 表３　マウス・ヒト・ヒトヘテロハイブリドーマによる
ヒトモノクローナル抗体生産におよＱ、２％ＰＶＡ　　
　　６　Ｘ　１０５２６Ｇ０．０２５％ＰＰＧ　　　４
ＸＩ０５１５０”無添加培地での生産量を１００として
相対値で示した。

各培地での培養上清缶ＩＱに硫酸アンモニウムを加えて
３７％〜５０％（飽和度）で沈澱する両分を集め、透析
後、０．０７ＭＮａＣ１を添加した０、０２Ｍトリス・
塩酸緩衝液（ｐＨ７、９）にて平衡化したワットマンＤ
Ｅ５２カラムにかけ、素通り画分を集めた。透析後凍結
乾燥して、３５ｔ＋＋１の０．００５ＭＮａＣ１を含む
０．０５Ｍ　ＭＥＳ緩衝液（ｐＨ６、０）に溶かし、Ｍ
ｏｎｏ　Ｓ　ＨＲ５１５カラ加培地からは９８０μｇヒ
トモノクローナル抗体が得られたのに対し、ＰＶＡおよ
びＰＰＧ添加培地からは、それぞれ２４００μｇ、１５
２０μｇの抗体が得られた。

実施例５実施例１と同じ基礎培地に同じ濃度のＩＴＥＳおよび表
４に示す量のＰ　Ｅ　Ｇ　２０，０００（平均分子量２
０．０００）、　Ｐ　Ｖ　Ａ　（平均重合度５００）お
よびＰＰＧ（トリオールタイプ、平均分子量４，０００
）をそれぞれ単独または混合して添加した培地に、マウ
ス・ヒト・ヒトヘテロハイブリドーマＮ１２−１６・６
３株をｌＸｌ０’細胞／ｍｌになる様に播種したのち、
５％炭酸ガス培養器中３７℃、５日間培養し、細胞数を
コールタ−カウンターで測定し、表４の結果を得た。

表４　各ポリマーの併用効果０　　　０　　　　’０　　　　　２．０ｘ１０５０，
０２００６，０Ｘ１０５０　　　０．０２　　０　　　　　５．２Ｘ１０５０　
　　０　　　０．０２　　　３．５Ｘ　１０５０．０２
　　０．０２　　０　　　　　８．５ｘ　１０’０．０
２　　０　　　０．０２　　　８．ＯＸ　１０５０　　
　０．０２　　０．０２　　　７．５ｘ　１０５実施例
６実施例１と同じ基礎培地に同じ濃度のＩＴＥＳを添加し
た培地（１）、更にこれに０．２％ＰＶＡ（平均重合度
１５００〜１８００）を添加した培地（２）を用意し、
これを２４穴マルチウエルプレートへ１ｍｌ宛分注した
。これに表５に示す各種細胞をｌＸＩＯ３個／ｍｌの割
合で播種し、３７℃、５％炭酸ガス培養器中で４日間培
養したのち、コールタ−カウンターで細胞数を計数し、
表５の結果を得た。

表５　無血清培地における各種細胞の増殖に及ぼす１ｌ
−Ｌ２　　　ヒトリンパ芽球　６．９Ｘ　１０５２．５
Ｘ　１０８Ｅ２３５＋６３　　マウス・バイブ　３．５
ｘ　１０５５．４ｘ　１０５リドーマＮ１２−１６・６３マウス・ヒト　２．６ｘ　１０５５
．２ｘ　１０５・ヒトヘテロハ発明の効果本発明の動物細胞増殖用組成物による培地を用いると動
物細胞を大量に効率良く増殖させることができる。また
、生理活性物質を生産する動物細胞を培養すると、該細
胞が大量に効率良く増殖されるので、生理活性物質を効
率よく生産させることができる。

【図面の簡単な説明】

第１図は、実施例１で得られたポリビニールアルコール
の添加効果を示す。第２図は、実施例１で得られたポリプロピレングリコー
ルの添加効果を示す。

Claims

【特許請求の範囲】

（１）、ポリビニールアルコールまたは／およびポリプ
ロピレングリコールを含有してなる動物細胞増殖用組成
物。
（２）、固体状態にある特許請求の範囲第１項記載の組
成物。
（３）、水溶液である特許請求の範囲第１項記載の組成
物。
（４）、血清を含まない特許請求の範囲第３項記載の組
成物。
（５）、通常の使用量以下の血清を含む特許請求の範囲
第３項記載の組成物。
（６）、ポリビニールアルコールまたは／およびポリプ
ロピレングリコールを含有する動物細胞増殖用培地で動
物細胞を培養することを特徴とする動物細胞の増殖方法
。
（７）、動物細胞増殖用培地が血清を含まない培地であ
る特許請求の範囲第６項記載の増殖方法。
（８）、動物細胞増殖用培地が通常の使用量以下の血清
を含む特許請求の範囲第６項記載の増殖方法。
（９）、ポリビニールアルコールまたは／およびポリプ
ロピレングリコールを含有する動物細胞増殖用培地で、
生理活性物質を生産する動物細胞を培養し、培養物中に
これを生成蓄積せしめ、採取することを特徴とする生理
活性物質の製造法。
（１０）、動物細胞増殖用培地が血清を含まない培地で
ある特許請求の範囲第９項記載の製造法。
（１１）、動物細胞増殖用培地が通常の使用量以下の血
清を含む培地である特許請求の範囲第９項記載の製造法
。