JPH0436189A - 肝細胞増殖因子の製造方法 - Google Patents

Abstract

(57)【要約】本公報は電子出願前の出願データであるた
め要約のデータは記録されません。

Description

【発明の詳細な説明】 産業上の利用分野 本発明は、肝細胞増殖因子（ｈｅｐａｔｏｃｙｔｅｇｒ
ｏｗｔｈ　ｆａｃｔｏｒ；　）（に　）’　）　（７）
製造方法、詳しくは各種動物の肝実質細胞の培養、肝機
能及び肝実質細胞に対する研究等に利用でき、また肝臓
病の治療と診断に利用できる上記肝細胞増殖因子の製造
方法に関する。

従来の技術 肝臓は、古くから臓器の中でも最も再生力の強いものと
して知られている。例えば若い成熟ラットの肝臓を７０
％切除しても翌日には活発な再生か始まり、１０日もす
るとほぼ元の肝臓重量に回復することが知られている。

この肝再性能を利用して、ヒトにおいても劇症肝炎患者
や肝癌患者等において肝組織の部分切除手術後、残存正
常肝組織の増殖を待つ治療法が行なわれている。

また上記肝臓の再生は、高等動物の中で最もドラマチッ
クな現象であり、その発見以来多くの研究者の注目を集
め、約３０年はど前に上記肝再生が肝再生因子と名付け
られた液性因子によってコントロールされていることか
示唆された。その後、１９８４年に中村らにより肝部分
切除後の再生肝ラットから、上記因子の部分精製に成功
したことか報告され、該因子は肝細胞増殖因子 （ｈｅｐａｔｏｃｙｔｅ　ｇｒｏｗｔｈ　Ｆａｃｔｏｒ
、ＨＧＦ）と名付ケラれた（Ｎａｋａｍｕｒａ、　Ｔ、
、ｅｔ、ａｌ、、　Ｂｉｏｃｈｅｍ、　Ｂｉｏｐｈｙｓ
Ｒｅｓ、　Ｃｏｍｍｕｎ、、　１２２．１４５０−１４
５９　（１９８４）　）。

上記肝細胞増殖因子（以下ｒＨＧＦＪと略称する）は、
また四塩化炭素やチオアセ上アミド等による肝障害ラッ
トの血清中にも存在することが報告され、金円らは劇症
肝炎患者の血液から、ヒトのＨＧＦの分離精製を報告し
り（Ｇｏｈｄａ、　Ｅ、　ｅｔ。

ａｌ、、　Ｅｘｐ、　Ｃｅ１ｌ　Ｒｅｓ、、　１６６、
１３９−１５６　（１９８６））。

該報告によれば、ヒ）ＨＧＦの分子量は約８２０００で
、還元条件下ではそれぞれ分子量３４０００と６９００
０の２種類のサブユニットからなるヘテロダイマーから
なるとされ、ラットＨＧＦと共にそのｃＤＮＡもクロー
ニングされ、ラットＨＧＦとヒトＨＧＦとの間には、約
９０％の相同性が認められティる（Ｎａｋａｍｕｒａ、
　Ｎ、　ｅｔ。

ａｌ、、　Ｎａｔｕｒｅ、　３４２．４４０−４４３　
（１９８９））。

ＨＧＦは熱及び酸に不安定な物質であり、メルカプトエ
タノールやジチオスレイトール処理によって還元すると
失活し、精製されたＨＧＦは１ｎｇ／　ｚｌで初代培養
肝細胞の増殖に有効であり、１０ｎｇ／ｚｌＴ：最大活
性を示す（Ｇｏｈｄａ、　Ｅ、　ｅｔ、ａｌ、。

Ｊ、　Ｃ１１ｎ、　Ｉｎｖｅｓｔ、、　８１．４１４−
４１９　（１９８Ｂ））。

肝再生ラット血清を用いて研究された結果、ＨＧＦはラ
ットの血小板に多量存在することが判明した。しかしな
がら、ヒト血小板には微量しか存在せず、ヒトの産生臓
器は肝臓の非実質細胞であると考えられている。

またＨＧＦは肝の実質細胞の増殖に関与する一方、劇症
肝炎で増加する事実から、肝疾患の治療及び診断に応用
できることが期待されている（Ｎａｋａｍｕｒａ、　Ｔ
、　ｅｔ、ａｌ、、　Ｐｒｏｃ、　Ｎａｔｌ、　Ａｃａ
ｄＳｃｉ、、　８３．６４８９−６４９３　（１９８６
））。

ＨＧＦは種特異性がなく、ラットＨＧＦはヒトを始めと
してブタ、イヌ等の肝細胞にも有効であルトイわれテイ
ル（Ｎａｋａｍｕｒａ、　Ｔ、　ｅｔ、ａｌ、、　Ｐｒ
ｏｃ。

Ｎａｔｌ、Ａｃａｄ、Ｓｃｉ、、８３．６４８９−６４
９３　　（１９８６）；Ｇｏｈｄａ、　Ｅ、　ｅｔ、ａ
ｌ、、　Ｊ、　Ｃｌ１ｎ、　Ｉｎｖｅｓｔ、、　８１．
４１４−４１９　（１９８Ｂ））。

しかしながら、ＨＧＦの単離精製には多量の原材料を必
要とし、ラット２０００匹、より精製されるＨＧＦの量
は僅かに３０μｇであり、ラットからＨＧＦを大量に得
ることは困難である。また劇症肝炎患者の血液からの精
製の場合も、劇症肝炎患者の発症はまれで、急激な病態
の変化もあり、原料血液材料自体の入手が困難である。

発明が解決しようとする課題 本発明者らは、上記のように従来のＨＧＦの製造にはそ
の収量の低さやヒトの材料において安定的な供給の難し
さがある点を解決して、効率よく安定したＨＧＦの製造
及び供給を可能とするべく鋭意研究を重ねた結果、ある
特定のヒト樹立細胞株より上記目的に合致するＨＧＦの
製造方法を確立し、ここに本発明を完成するに至った。

問題点を解決するための手段 即ち、本発明はヒト株化単球系細胞を培養して産生され
るＨＧＦを採取することを特徴とするＨＧＦの製造方法
に係わる。

本発明によれば、入手容易なヒト株化単球系細胞より高
収率で目的とするＨＧＦを製造することができる。しか
して、従来ＨＧＦは哺乳動物の血小板から単離精製され
ており、またヒト劇症肝炎患者の血液からも単離精製さ
れてきたが、之等の方法によってＨＧＦを得るには、原
料の供給か安定しない不利があったが、本発明によれば
かかる欠点かすべて解消される。

本発明により得られるＨＧＦは急性肝炎、慢性肝炎、肝
硬変、劇症肝炎等の肝疾患の治療乃至は肝切除術後の治
療薬として、また上記各疾患の免疫学的診断を確立する
ための抗原等として有用であり、更に該ＨＧＦの利用に
よれば、ヒトをはじめとして各種動物由来の肝細胞を、
該ＨＧＦの存在下に生体外で極めて容易に増殖、維持で
き、かくして増殖、維持される肝細胞は、例えば肝機能
等の基礎的研究用、各種ホルモンもしくは薬剤等の肝細
胞に対する作用の研究用、肝疾患治療薬等のスクリーニ
ング試験用等に有用であり、更に発癌試験用及び肝炎ウ
ィルスの生体外培養における宿主細胞としても有用であ
る。

以下、本発明のＨＧＦの製造法につき詳述する。

本発明方法においては、ヒト単球系樹立細胞株に、フォ
ルボールミリステートアセテート等の刺激因子（刺激剤
）を接触させることにより、単に上記細胞を培養するよ
りもより効率よく、しかも高収率で目的とするＨＧＦを
製造できる。ここで原料として用いられる細胞は、ＨＧ
Ｆが肝臓のマクロファージ系細胞のクツパー細胞より産
生されることより、特にヒト株化単球系細胞、即ちヒト
単球系樹立細胞が好ましい。このヒト単球系樹立細胞の
具体例としては、例えば白血病細胞株であるＨＬ−６０
（前骨髄性白血病細胞）、Ｕ−９３７（組織球性白血病
細胞）　、ＴＨＰ−１（急性単球性白血病細胞）等を例
示できる。

上記各種単球系樹立細胞の培養は、この種細胞培養に通
常利用されている各種培地を用いて実施される。該培地
としては、例えばＣＥＭ培地、ＣＭＲＬ−１０６６培地
、ＤＭ−１６０培地、イーグルの最小必須培地（Ｅａｇ
ｌｅ’ｓ　ＭＥＭ　）　、オ）クレープ可能ＭＥＭ、フ
ィッシャーの培地（Ｆｉｓｈｅｒ’ｓ　Ｍｅｄｉｕｍ　
）　、ｐ　−Ｉ　Ｑ培地、Ｆ−１２培地、Ｌ−１５培地
、ＮＣＴＣ−１０９培地、ＲＰＭＩ−１６４０培地等を
単独で用いるか又は之等に必要に応じて牛胎児血清（Ｆ
　ＣＳ）等の血清やアルブミン等の血清成分を添加して
用いるでとができる。

上記培地に接種する細胞の量は特に制限はないが、通常
約ｌＸ１０４〜ｌＸ１０７個／１／程度の濃度範囲とす
るのがよい。培養条件も特に制限はなく、通常の炭酸ガ
ス培養法におけるそれと同様のものとすることができ、
一般には約３０〜４０℃程度、好ましくは約３７℃前後
の温度条件下で１〜１０日間程度を要して実施できる。

上記細胞培養によるＨＧＦの産生には、刺激剤の利用が
好ましく、該刺激剤としては、例えばリポポリサッカラ
イド（ｌｉｐｏｐｏｌｙｓａｃｃｈａｒｉｄｅ、　ＬＰ
Ｓ）、０Ｋ−４３２、レンチナン、フォルボールミリス
テートアセテート（ｐｈｏｒｂｏｌｍｙｒｉｓｔａｔｅ
　ａｃｅｔａｔｅ。

ＰＭＡ　）等を例示でき、之等の内ではＰＭＡが好まし
い。上記刺激剤の使用量は、その種類に応じて適宜決定
でき、例えばＰＭＡでは約ｏ、ｏｉ〜１００　ｎｇ／　
ｘｉの範囲、好ましくは約０．５〜３ｎｇ／ｌ／の範囲
から選ばれるのがよい。

上記培養により、所望のＨＧＦが培養上清中に生産蓄積
される。

培養上清からの目的ＨＧＦの分離は、常法、例えば遠心
分離等の手段により実施でき、また目的ＨＧＦの精製は
、該ＨＧＦの物理的、化学的性質を利用した各種操作に
従い実施できる（「生化学データーブック■」、第１版
、第１刷、１１７５１２５９頁（１９８０年６月２３日
株式会社東京科学同人発行参照）。

該精製操作としては、具体的には例えば通常の蛋白沈澱
剤による処理、限外か過、分子ふるいクロマトグラフィ
ー（ゲルが過）、遠心分離、電気泳動、イオン交換クロ
マトグラフィー、アフィニティークロマトグラフィー、
逆相クロマトグラフィー、疎水性クロマトグラフィー、
透析法、これらの組み合せ等が挙げられる。特に好まし
い上記精製操作の一例としては、陽イオン交換クロマト
グラフィーとヘパリンアフィニティークロマトクラフィ
ーとを組合わせた方法を例示できる。

上記陽イオン交換クロマトグラフィーはより詳細には、
蛋白分離用の通常の各種陽イオン交換クロマトグラフィ
ー用担体、例えばＣＭ−セルロース（ワットマン社製）
、ＣＭ−セファデックス（ファルマシア社製）、Ｐ−セ
ルロース（ワットマン社製）、ＣＭ−トヨパール（５Ｐ
−Ｔｏｙｏｐｅａｒｌ同人社製）、Ｓ−セファロース・
ファースト・フロー（ファルマシア社製）、モノ３　（
ｍｏｎｏ　Ｓ、）アルマシア社製）等を用いて実施され
る。

またヘパリンアフィニティークロマトグラフィーは、例
えばセルロース、ポリアクリルアミド、ポリスチレン等
の各種の不溶性担体にヘパリンを共有結合により不溶化
させた担体を用いて実施される。

上記により本発明ＨＧＦが単離精製される。これは通常
の蛋白質の純度検定手段、例えば５ＤＳＰＡＧＥ、逆相
クロマトグラフィー等により均一な単品であることが確
認される。上記逆相クロマトグラフィーは、例えばＣ１
、Ｃ３、Ｃ４のアルキル基、シアノプロピル基、フェニ
ル基等の官能基がシリカゲル等の基体に結合された担体
を用いて実施できる。より具体的には例えばＣ４ハイボ
ア一逆相ＨＰＬＣカラム（ＲＰ−３０４、バイオラド社
製）を用いて、移動相としてアセトニトリル、トリフル
オロ酢酸（ＴＦＡ）、水等及び之等の混合溶媒を用いて
実施される。

本発明方法によれば、容易に高収率、高純度で所望のＨ
ＧＦを製造できる。

実　　施　　　例 以下に実施例を示し、本発明をより具体的に述べるが、
本発明はこれらに限定されるものではない。尚、実施例
においてＨＧＦの活性測定及びＨＧＦの産生量の測定は
、下記参考例に示す方法により行われたものである。

参考例　１ 肝細胞増殖活性（ＨＧＦ活性）の測定 セグＬｉ　ン（Ｓｅｇｌｅｎ）＋７）方法［Ｍｅｔｈｏ
ｄｓ　ｉｎ　ＣｅｌｌＢｉｏｌｏｇｙ、　ｖｏｌ、１３
．ｐ２９．　Ａｃａｄｅｍｉｃ　Ｐｒｅｓｓ、　Ｎｅｗ
Ｙｏｒｋ（１９７６））に従い、ウィスター系雄ラット
（体重１５０　ｇ）より、０．０５％コラ−ゲナーゼ（
タイプ■、シグマ社）を用いて肝実質細胞を単離した。

この肝実質細胞を直径２．４ｃｍのウェルを有するマル
チウェル　プラスチック　デイツシュ（Ｎｕｎｃ）ｉニ
ー　５　Ｘ　１０　’個／１ｙ／／ｃＩ［１２）濃度テ
マキ込み、３０％ＣＯ２＋　７’０％０２混合ガス気相
下、３７℃で単層培養した［Ｔｏｍｉｔａ、　Ｙ、　ｅ
ｔ　ａｌ、。

Ｅｘｐ、　Ｃｅ１１．　Ｒｅｓ、、　１３５．３６３−
３７１　（１９８１）］　。培養培地としては５％牛血
清（）ｉ’　３３３．　Ｆｌｏｗ　ＬａｂＮａｒｔｈ　
Ｒｙｄｅ、　Ａｕ５ｔｒａｌｉａ）、２ｎＭインスリン
、１μＭデキサメサゾン、１００Ｕ／ｚ／ペニシリン及
び１００μｇ　／　ｘｌｌストレプトマイシンを添加し
たウィリアムスＥ培地（フローラボラトリーズ社、以下
「基本培地」と略す）を使用した。培養開始後、２４時
間目にＦＢＳを含まない基本培地に培地交換し、同時に
適量（５０μｌ以下）の被検試料を添加した。

ＨＧＦ活性は、被検試料添加による被検細胞のＤＮＡ合
成の増加によって検討した。これは上記被検試料添加後
、１２時間目に　　Ｔ−アオキシウリジン（アマジャム
社製）１μＣｉ　／　５０μｌを加え、更に２４時間培
養を継続し、この継続培養後、被検細胞をＰＢＳで２回
、５％ＴＣＡ　（和光紬薬工業社製）で１回洗浄し、次
いでＩＮＮ　ａ　ＯＨ１ｘｉで可溶化して、該細胞核中
のＤＮＡに取り込まれた　　■−アオキシウリジン量を
、ガンマカウンター（アロカ社製）を用いて測定するこ
とにより実施した。

被検試料により肝実質細胞ＤＮＡに取り込まれた　　ｒ
−７オキシウリジン量を、被検試料無添加群とのカウン
トの差として求め、これをＤＮＡ合成活性（ｃｐｍ　／
ウェル）とし、被検試料のＨＧＦ活性の指標とした。

参考例　２ ＨＧＦ産生量の測定 ＨＧＦ産生量の測定は、ＥＬＴＳＡ法により以下の通り
行ない、イムツリアクティビティ（ｉｍｍｕｎｏｒｅａ
ｃｔｉｖｉｔｙ）で表示した。

即ち、まずヒトＨＧＦモノクローナル抗体（Ｈ４〜２）
（特開昭６４−２７４９１号参照）を、その濃度が１μ
ｇ　／　ｙｌとなるように、０．１ＭＮａＨＣＯ３で調
整し、これを１００μｌ／ウエルの割合でプレートにコ
ートした。これを−晩４℃で放置した後、リン酸緩衝化
生理食塩水（Ｐ　Ｂ　Ｓ）緩衝液で洗浄し、プレートを
ブロッキングするため１％ウシ胎児血清アルブミン（Ｂ
ＳＡ）溶液２５０μｌ／ウエルを加え、−晩４℃で放置
した。

次に、１％ＢＳＡ及び０．４Ｍ　　ＮａＣＡ’を含む０
．１Ｍリン酸緩衝液（ｐＨ６，５）８０μｌと、被検試
料２０μｌを加え、２時間インキュベートした後、０．
０５％ツウイーン２０　（Ｔｗｅｅｎ２０、シグマ社製
）を含むＰＢＳ溶液で３回洗浄し、更に０．１％ＢＳＡ
を含む０．１Ｍリン酸緩衝液に３０００倍に希釈したモ
ノクローナル抗体（Ｈ４−２）を１００μ／／ウエルで
加え、２時間インキュベートした後、０．０５％ツウイ
ーンを含むＰＢＳで３回洗浄し、１％ＢＳＡ及び０．１
５Ｍ　　ＮａＣ１を含む０．１Ｍリン酸緩衝液に３００
０倍希釈した抗体（抗−ラッ）ＩｇＧｐｏｘ、カッペル
社製）を加えて、２時間インキュベートした。０．０５
％ツウィーンを含むＰＢＳで３回洗浄後、オルトフェニ
レンジアミン（ＯＰ　Ｄ、和光紬薬工業社製）２５■／
　１００　ｘｌｌ溶液を１００μ！添加して発色させた
。１０分後、２Ｎ硫酸１００μｌを加えて反応を停止さ
せ、０Ｄ４９２の波長にて測定を行なった。

予め同様の測定により作成した標準曲線より、ＨＧＦの
産生量をイムノリアクティブＨＧＦ（Ｉｍｍｕｎｏｒｅ
ａｃｔｘｖｅ　ＨＧＦ　　ｎｇ　／　ｙ／）として求メ
タ。

実施例　Ｉ ＨＧＦの製造 この例で用いたヒト単球系樹立細胞株は、ＨＬ−６０（
前骨髄性白血病細胞）であり、これはガロ（Ｒｏｂｅｒ
ｔ　Ｇａ１ｌｏ）らにより樹立されアメリカンタイプカ
ルチャーコレクション（ＡＴＣＣ）にｒＡＴｃｃＮｏ、
ＣＣＬ−２４０Ｊ、として受託されており、ソノ性質は
文献（Ｇａｌｌｏ、　Ｒ，Ｃ，、ｅｔａｌ、、　Ｂｌｏ
ｏｄ、　５４．７１３　（１９７９））　ニ記載されテ
いル。

上記ＨＬ−６０を、５％ＦＣ３−ＲＰｔＩ−１６４０培
養液（日永製薬社製）にて、３７℃、５％Ｃ０２下で９
６時間培養して、以下の操作に用いた。

１２ウエルマイクロプレート（フロラ社製）の各ウェル
に培養細胞株を１ウェル当りｌＸ１０６個／　ｚｌとな
るように５％ＦＣ３−ＲＰＭＩ−１６４０培養液にて調
整して加えた。

次に、フォルボールミリステートアセテート（ｐｈｏｒ
ｂｏｌｍｙｒｉｓｔａｔｅ　ａｃｅｔａｔｅ、以下ｒＰ
ＭＡＪと略称する、シグマ社製）をＲＰＭＩ−１６４０
培養液に、各ウェルに加えた時点での終濃度が０．０８
．０．１５．０．３．０．６．１．３．２．５．５．０
及び１０．Ｏｎｇ／ｚｌの濃度となるように希釈調整し
た。

上記培養細胞中に各濃度のＰＭＡ希釈液をそれぞれ５０
μｌ加えて刺激した。次に、３７℃、５％Ｃ０２下に７
２時間培養した後、１０００　ｒｐｍ５分間の条件で遠
心分離（トーヨーソーダー社製、ＨＬＣ−８０３使用）
して、培養上清を得た。

試験例　Ｉ ＨＧＦ産生のための刺激剤の濃度 上記実施例１で得られた培養上清中のＨＧＦ産生量を測
定した結果を第１図に示す。

該図は各種ＰＭＡ濃度（ｎｇ／Ｉｌ、横軸）でのイムノ
リアクティブＨＧＦ量（ｎｇ／７Ａ’、縦軸）をプロッ
トしたものであり、該図よりＨＧ　Ｆ産生のためのＰＭ
Ａ量は１．　３１ｇ／ｚｌ付近か適量であることが判る
。

試験例　２ ＨＧＦ産生の経時的変化 実施例１においてＰＭＡの刺激量を１．Ｏｎｇ／ｌｌと
し、ＰＭＡ添加後の細胞培養時間（時間、横軸）とＨＧ
Ｆ産生量（イムノリアクティブＨＧＦ。

ｎｇ／ｙｌ、縦軸）の関係を求めた。

得られた結果を第２図に曲線（１）として示す。

尚、第２図には対照として上記においてＰＭＡの代わり
に同量のＲＰＭＩ−１６４０培養液を用いて行なった対
照試験の結果を曲線（２）として併記する。

第２図より、ＰＭＡ刺激後の培養時間の経過ＨＧＦ産生
量は増加することが判る。

試験例　３ ＨＧＦ産生のための最適細胞濃度 上記試験例１及び試験例２の結果より、実施例１におい
てＰＭＡ濃度をｌｎｇ／ｚ／とし且つ刺激後の細胞培養
時間を７２時間とし、細胞濃度を２×１０５個／　ｘｉ
から６×１０６個／１１の範囲で変化させて、同様にし
て細胞培養を行なって、ＨＧＦ量を調べた。

その結果を第３図に示す。

図中、横軸は細胞濃度（／ｌｙ／）を、縦軸はイムノリ
アクティブＨＧＦ量（ｎｇ／ｙ／）を示す。

該図より、ＨＧＦ産生のための最適細胞濃度は約２Ｘ１
０６個／　ｘｉ付近であることが判る。

実施例　２ ＨＧＦの精製 上記各側の結果に基づき、実施例１において細胞濃度を
２×１０６個／ｚｌ、ＨＧＦ産生のためのＰＭＡ濃度を
１．　　Ｏｎｇ／３Ｆ／及び細胞培養時間を７２時間と
し、同様にして細胞培養を行なって、培養上清を得た。

上記で得られた培養上清１０００ｚＡ’を、予め０．１
５Ｍ　　ＮａＣｌ、１０ｍＭ　　Ｎ−２−ヒドロキシエ
チルピペラジン−Ｎ’−２−エタンスルホン酸（ＨＥＰ
ＥＳ）及び２ｍＭ　ＣａＣｌ２を含む５０　ｍ　Ｍ　）
リス−塩酸緩衝液（ｐ　Ｈ８，５）で平衡化したモノＳ
カラム（Ｍｏｎｏ　Ｓ　；ファルマシア社製）にアプラ
イし、同緩衝液で洗浄後、０．１から１．０Ｍ　　Ｎａ
Ｃ１の直線濃度勾配にて溶出させた（流速１１１／分、
２１１／チユーブ）。

その結果を第４図に示す。

図において縦軸は（１）が２８０ｎｍにおける吸光度（
Ａ２８０ｎｍ）を、（２）がＨＧＦ活性（ＤＮＡ合成活
性、Ｃｐ”Ｘ１０４）を、（３）が免疫活性（イムノリ
アクティブＨＧＦ量、ｎｇ／ｚｌ）を、（４）がＮａＣ
１濃度（Ｍ）をそれぞれ示し、横軸はフラクションＮｏ
、を示す。

該図より、ＨＧＦはＰＭＡ刺激刺激７問養上清のモノＳ
カラム−ＦＰＬＣのＨＧＦ活性と免疫活性との溶出位置
は共に０．８Ｍ付近であることが判る。

このことから、本発明により得られるＨＧＦはラットＨ
　Ｇ　Ｆ　　（Ｎａｋａｍｒａ，　Ｔ．、　ｅｔ．ａｌ
．、　Ｂｉｏｃｈｅｍ。

Ｂｉｏｐｈｙｓ．　Ｒｅｓ．　Ｃｏｍｍｕｎ．、　１２
２．１４５０−１４５９　（１９８４）　）及びヒトＨ
　Ｇ　Ｆ　（Ｇｏｈｄａ，　Ｅ．　ｅｔ．ａｌ．、　Ｅ
ｘｐ．　Ｃｅ１ｌＲｅｓ．、　１６６、　１３９−１５
６　（１９８６）　）　（７）それらと上記溶出位置に
おいて一致するものであることが確認された。

実施例　３ 実施例２の溶出画分を、ＩＮ　　ＨＣｌにてｐＨ７、９
に調整し、蒸留水にて３倍希釈した。これを０．３Ｍ　
　ＮａＣＡ’を含む５０ｍＭ）リス塩酸緩衝液（ｐＨ７
．９）で平衡化したヘパリン−セファロースＣＬ−６Ｂ
　（ファルマシア社製、ベツドボリウム２．２ｙ／）に
アプライし、同緩衝液にて洗浄後、０．３から２，ＯＭ
　　ＮａＣ１の直線濃度勾配により溶出させた（流速０
．５ｙＡ’／分、１１／／チユーブ）。

上記溶出パターンを第５図に示す。

図において横軸はフラクションＮｏ，を、縦軸は２８０
ｎｍにおける吸光度（Ａ　２　Ｆ３　０ｎｍ，曲線（１
））　、ＨＧＦの免疫活性（曲線（２））及びＮａＣ１
濃度（曲線（３））をそれぞれ示す。

該図より、本発明方法により得られるＨＧＦは、ＮａＣ
１濃度約１．２Ｍ付近に溶出されるこ表が判る。

この溶出位置は、前記ラットＨＧＦ及びヒトＨＧＦのそ
れらと一致した。

上記で得られたＨＧＦを、更にハイーポアーＲｐ３０４
カラム（Ｈｉ−ｐｏｒｅ　Ｒｐ３０４　ｃｏｌｕｍｎ　
（Ｃ４）、４．６Ｘ２５０ｍｍ、バイオ・ラド社製）の
逆相クロマトグラフィー（ＨＰＬＣ，ＬＫＢ社製）で精
製した。

かくして精製されたＨＧＦを用いて、ラムリらの方法（
Ｌａｅｍｍｅｌｉ　ｅｔ、ａｌ、、　Ｎａｔｕｒｅ、　
２２７．６８０−６８５　（１９７（）））　１．：従
ッテ、５ＤＳ−ＰＡＧＥｔ−行なった。

その結果、本発明方法により得られたＨＧＦの分子量は
、非還元条件下では約８２ｋｄであり、還元条件下では
約６０ｋｄの重鎖及び３２ｋｄと３４ｋｄの２種の軽鎖
が検出された。これもまた前記ラットＨＧＦ及びヒトＨ
ＧＦのそれらと一致した。

【図面の簡単な説明】 第１図は試験例１に従うＨＧＦ産生のための刺激剤の使
用濃度とＨＧＦ産生量との関係を示すグラフである。 第２図は試験例２に従う細胞培養時間とＨＧＦ産生量と
の関係を示すグラフである。 第３図は試験例３に従う培養細胞濃度とＨＧＦ産生量と
の関係を示すグラフである。 第４図は実施例２に従いＨＧＦをモノＳカラムを用いて
精製した結果を示す溶出パターンである。 第５図は実施例３に従いＨＧＦをヘパリン−セファロー
スＣＬ−６Ｂカラムを用いて精製した結果を示す溶出パ
ターンである。 （以　上） 第 図 ぜＬ蚤 時 間 （ｈ「） 薯 図 太田Ｗ己濃度 ７ｍ１）

Claims (1)

【特許請求の範囲】
1. （１）ヒト株化単球系細胞を培養して産生される肝細胞
   増殖因子を採取することを特徴とする肝細胞増殖因子の
   製造方法。