JPH0635480B2 - 肝実質細胞増殖因子 - Google Patents
肝実質細胞増殖因子Info
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- JPH0635480B2 JPH0635480B2 JP60186146A JP18614685A JPH0635480B2 JP H0635480 B2 JPH0635480 B2 JP H0635480B2 JP 60186146 A JP60186146 A JP 60186146A JP 18614685 A JP18614685 A JP 18614685A JP H0635480 B2 JPH0635480 B2 JP H0635480B2
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- hgf
- nacl
- hours
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- Medicines That Contain Protein Lipid Enzymes And Other Medicines (AREA)
- Medicines Containing Material From Animals Or Micro-Organisms (AREA)
- Peptides Or Proteins (AREA)
Description
【発明の詳細な説明】 産業上の利用分野 本発明は、肝実質細胞増殖因子(hepatocytegrowth fact
or;HGF)、詳しくは肝実質細胞を生体外(in vitro)で培
養でき、これにより該細胞の維持、増殖を可能とする新
しい生理活性を有する蛋白質に関する。
or;HGF)、詳しくは肝実質細胞を生体外(in vitro)で培
養でき、これにより該細胞の維持、増殖を可能とする新
しい生理活性を有する蛋白質に関する。
従来の技術 肝臓は、生体中で最も高度に分化の進んだ最大の腺性器
官である。これは主に各種栄養素（糖質、蛋白質、脂
質、ビタミン、ホルモン等）の処理（代謝）、貯蔵、解
毒、分解、排泄等の重要な多種の機能を兼ね備えてお
り、なかでも生体内中間代謝の中心的役割を果たすこと
が知られている。また該肝臓の機能は、肝臓を構成する
各肝実質細胞が夫々担つていることが知られている。し
かるに生体内(in vivo)において肝臓は各種のホルモン
をはじめとする極めて複雑な環境下におかれており、こ
れを構成する上記肝実質細胞の機能等の研究は甚だ困難
である。
官である。これは主に各種栄養素（糖質、蛋白質、脂
質、ビタミン、ホルモン等）の処理（代謝）、貯蔵、解
毒、分解、排泄等の重要な多種の機能を兼ね備えてお
り、なかでも生体内中間代謝の中心的役割を果たすこと
が知られている。また該肝臓の機能は、肝臓を構成する
各肝実質細胞が夫々担つていることが知られている。し
かるに生体内(in vivo)において肝臓は各種のホルモン
をはじめとする極めて複雑な環境下におかれており、こ
れを構成する上記肝実質細胞の機能等の研究は甚だ困難
である。
従つて本発明者は、上記肝実質細胞を、生体内と同等の
機能を維持した状態で、単純な生体外の系で再現するこ
とができれば、上記した肝機能の研究、あるいは種々の
ホルモン類、薬物等の肝実質細胞に対する作用等の研究
に極めて有用であるとの観点から、上記肝実質細胞を、
安定に継代培養できる生体外培養系の確立を目的として
鋭意研究を重ねてきた。
機能を維持した状態で、単純な生体外の系で再現するこ
とができれば、上記した肝機能の研究、あるいは種々の
ホルモン類、薬物等の肝実質細胞に対する作用等の研究
に極めて有用であるとの観点から、上記肝実質細胞を、
安定に継代培養できる生体外培養系の確立を目的として
鋭意研究を重ねてきた。
しかしながら、肝実質細胞は近年組織培養技術の急速な
発展に伴い、既に確立された各種の株細胞が活発に増殖
する哺乳動物血清の存在下でも、全く増殖が認められ
ず、通常約１週間で脱落が起り、その生体外長期継代培
養は不可能であつた。また本発明者らの研究によつて、
公知の各種株細胞の増殖を支持する因子(growth facto
r)等、例えば線維芽細胞増殖因子(fibrolast growth fa
ctor；ＦＧＦ、Gospodarowicz、Ｄ．，Ｊ．Biol.Chem．
２５０、２５１５（１９７５））、血小板由来成長因子
(platelet-derived growth factor；ＰＤＧＦ，Ross,
R.,et al、Proc.Natl.Acad.Sci.ＵＳＡ．，７１，１２０
７（１９７４））、ソマトメジン(somatomedines；Van
Wyk.J.J.et al.,Rec.Prog.Hormone Res.３０，２５９
（１９７４））、インスリン様成長因子(insulin like
growth factor：ＩＧＦ、Rinderknecht,E.et al.,J.Bio
l.Chem.,２５３，２７６９（１９７８），マルチプリケ
ーシヨン ステイムレーテイング アクテイビテイ(mul
tiplication stimulating activity：ＭＳＡ，Dulak,N.
C.et al.,J.Cell,Physiol.８１，１５３（１９７
３）），トロンビン(thrombin)、トランスフエリン(tra
nsferrin)等は、いずれも上記肝実質細胞の増殖には、
効果を奏しえないことが確認された。僅かにインスリン
(insulin)及び表皮成長因子(epidermal growth facto
r；ＥＧＦ，Carpenter,G.et al.,Ann.Rev.Biochem．，
４８，１９３（１９７９））に、肝実質細胞のＤＮＡ合
成の促進活性が認められたが、これ等もまたその利用に
より上記肝実質細胞の生体外継代培養は困難であつた。
発展に伴い、既に確立された各種の株細胞が活発に増殖
する哺乳動物血清の存在下でも、全く増殖が認められ
ず、通常約１週間で脱落が起り、その生体外長期継代培
養は不可能であつた。また本発明者らの研究によつて、
公知の各種株細胞の増殖を支持する因子(growth facto
r)等、例えば線維芽細胞増殖因子(fibrolast growth fa
ctor；ＦＧＦ、Gospodarowicz、Ｄ．，Ｊ．Biol.Chem．
２５０、２５１５（１９７５））、血小板由来成長因子
(platelet-derived growth factor；ＰＤＧＦ，Ross,
R.,et al、Proc.Natl.Acad.Sci.ＵＳＡ．，７１，１２０
７（１９７４））、ソマトメジン(somatomedines；Van
Wyk.J.J.et al.,Rec.Prog.Hormone Res.３０，２５９
（１９７４））、インスリン様成長因子(insulin like
growth factor：ＩＧＦ、Rinderknecht,E.et al.,J.Bio
l.Chem.,２５３，２７６９（１９７８），マルチプリケ
ーシヨン ステイムレーテイング アクテイビテイ(mul
tiplication stimulating activity：ＭＳＡ，Dulak,N.
C.et al.,J.Cell,Physiol.８１，１５３（１９７
３）），トロンビン(thrombin)、トランスフエリン(tra
nsferrin)等は、いずれも上記肝実質細胞の増殖には、
効果を奏しえないことが確認された。僅かにインスリン
(insulin)及び表皮成長因子(epidermal growth facto
r；ＥＧＦ，Carpenter,G.et al.,Ann.Rev.Biochem．，
４８，１９３（１９７９））に、肝実質細胞のＤＮＡ合
成の促進活性が認められたが、これ等もまたその利用に
より上記肝実質細胞の生体外継代培養は困難であつた。
本発明者らは引続く研究において、肝実質細胞は、上記
の通り血清自体の存在下では全く増殖し得ないにかかわ
らず、該血清中に含まれるある特定の蛋白成分の存在下
において生体外で極めて良好に増殖し、継代培養が行な
い得ることを見し出し、該特定の血清成分の分離に成功
し、この知見に基づく発明を先に完成した（特開昭６０
−４５５３４号公報）。
の通り血清自体の存在下では全く増殖し得ないにかかわ
らず、該血清中に含まれるある特定の蛋白成分の存在下
において生体外で極めて良好に増殖し、継代培養が行な
い得ることを見し出し、該特定の血清成分の分離に成功
し、この知見に基づく発明を先に完成した（特開昭６０
−４５５３４号公報）。
発明が解決しようとする問題点 更に本発明者らは引続き鋭意研究を重ねた結果、哺乳動
物の血小板より、特定の蛋白質性の肝実質細胞増殖因子
を単離するに成功し、これが生体外において肝実質細胞
を極めて良好に増殖させる活性を有することを見出し、
この知見に基づいて本発明を完成するに至つた。
物の血小板より、特定の蛋白質性の肝実質細胞増殖因子
を単離するに成功し、これが生体外において肝実質細胞
を極めて良好に増殖させる活性を有することを見出し、
この知見に基づいて本発明を完成するに至つた。
問題点を解決するための手段 すなわち本発明は、下記理化学的性質及び生理活性を有
する塩基性蛋白質であることを特徴とする肝実質細胞増
殖因子（以下「ＨＧＦ」と呼ぶ）に係る。
する塩基性蛋白質であることを特徴とする肝実質細胞増
殖因子（以下「ＨＧＦ」と呼ぶ）に係る。
ａ）ＳＤＳ−ＰＡＧＥによる推定分子量が約２７０００
である、 ｂ）陽イオン交換クロマトグラフィー［モノＳ：ファル
マシア社製；０．１から１．０ＭＮａＣｌの濃度勾配溶
出：１０ｍＭ Ｎ−２−ヒドロキシエチルピペラジン−
Ｎ′−２−エタンスルホン酸及び２ｍＭ ＣａＣｌ２を
含む５０ｍＭ トリス−塩酸緩衝液（ｐＨ＝８．５）、
流速６０ml／ｈｒ］において、約０．６８ＭのＮａＣｌ
濃度に溶出され、ヘパリンクロマトグラフィー［ヘパリ
ン−セファロースＣＬ−６Ｂ：ファルマシア社製；０．
３から２．０Ｍ ＮａＣｌの濃度勾配溶出：１０ｍＭ
トリス−塩酸緩衝液（ｐＨ＝７．５）、流速２０ml／ｈ
ｒ］において、約１ＭのＮａＣｌ濃度に溶出される、 ｃ）７０〜１００℃、２０分間の加熱処理により肝実質
細胞増殖活性が失活する、 ｄ）１Ｎ酢酸水溶液による２０℃、５時間の処理により
肝実質細胞増殖活性が失活する、 ｅ）トリプシン消化（１０μｇ／ml、２時間、３７℃）
により肝実質細胞増殖活性が失活する、 ｆ）肝実質細胞を生体外において増殖させる活性を有す
る、 ｇ）哺乳動物の血小板に存在する。
である、 ｂ）陽イオン交換クロマトグラフィー［モノＳ：ファル
マシア社製；０．１から１．０ＭＮａＣｌの濃度勾配溶
出：１０ｍＭ Ｎ−２−ヒドロキシエチルピペラジン−
Ｎ′−２−エタンスルホン酸及び２ｍＭ ＣａＣｌ２を
含む５０ｍＭ トリス−塩酸緩衝液（ｐＨ＝８．５）、
流速６０ml／ｈｒ］において、約０．６８ＭのＮａＣｌ
濃度に溶出され、ヘパリンクロマトグラフィー［ヘパリ
ン−セファロースＣＬ−６Ｂ：ファルマシア社製；０．
３から２．０Ｍ ＮａＣｌの濃度勾配溶出：１０ｍＭ
トリス−塩酸緩衝液（ｐＨ＝７．５）、流速２０ml／ｈ
ｒ］において、約１ＭのＮａＣｌ濃度に溶出される、 ｃ）７０〜１００℃、２０分間の加熱処理により肝実質
細胞増殖活性が失活する、 ｄ）１Ｎ酢酸水溶液による２０℃、５時間の処理により
肝実質細胞増殖活性が失活する、 ｅ）トリプシン消化（１０μｇ／ml、２時間、３７℃）
により肝実質細胞増殖活性が失活する、 ｆ）肝実質細胞を生体外において増殖させる活性を有す
る、 ｇ）哺乳動物の血小板に存在する。
本発明のＨＧＦは、例えば哺乳動物の血小板より高収率
で単離され、且つ上記特性を有する点において特徴付け
られる。従来、哺乳動物の血小板由来の物質についても
各種の研究がなされているが、該血小板由来物質中に上
記肝実質細胞の増殖活性を有する因子が存在することは
全く知られておらず、勿論かかる因子を血小板より分離
した例は皆無であり、また現在までに血小板より分離さ
れた既知の物質は、いずれも上記活性を有していない。
更に、前記の血小板に由来するＰＤＧＦは、繊維芽細
胞、例えばBalb／ｃ３Ｔ３細胞を生体外で増殖させる活
性を有することにより特徴付けられるが、本発明のＨＧ
Ｆは該活性を有していない。
で単離され、且つ上記特性を有する点において特徴付け
られる。従来、哺乳動物の血小板由来の物質についても
各種の研究がなされているが、該血小板由来物質中に上
記肝実質細胞の増殖活性を有する因子が存在することは
全く知られておらず、勿論かかる因子を血小板より分離
した例は皆無であり、また現在までに血小板より分離さ
れた既知の物質は、いずれも上記活性を有していない。
更に、前記の血小板に由来するＰＤＧＦは、繊維芽細
胞、例えばBalb／ｃ３Ｔ３細胞を生体外で増殖させる活
性を有することにより特徴付けられるが、本発明のＨＧ
Ｆは該活性を有していない。
本発明ＨＧＦの上記特性及びその他の性状については、
後記実施例において詳述する。
後記実施例において詳述する。
本発明のＨＧＦは急性肝炎、慢性肝炎、肝硬変、劇症肝
炎等の肝疾患の治療薬や創傷治療薬として、また上記各
疾患の診断薬として有用である。更に該ＨＧＦの利用に
よれば、ヒトをはじめとして各種動物由来の肝実質細胞
を、該ＨＧＦの存在下に生体外で極めて容易に増殖、維
持することができ、かくして増殖、維持される肝実質細
胞は、例えば肝機能等の基礎的研究用に、また各種ホル
モン若しくは薬剤等の肝実質細胞に対する作用の研究用
に、肝疾患治療薬等のスクリーニング試験用に、更に発
癌試験用及び肝炎ウイルスの生体外培養における宿主細
胞としても極めて有用である。本発明はかかる有用な生
理活性物質を提供するものである。
炎等の肝疾患の治療薬や創傷治療薬として、また上記各
疾患の診断薬として有用である。更に該ＨＧＦの利用に
よれば、ヒトをはじめとして各種動物由来の肝実質細胞
を、該ＨＧＦの存在下に生体外で極めて容易に増殖、維
持することができ、かくして増殖、維持される肝実質細
胞は、例えば肝機能等の基礎的研究用に、また各種ホル
モン若しくは薬剤等の肝実質細胞に対する作用の研究用
に、肝疾患治療薬等のスクリーニング試験用に、更に発
癌試験用及び肝炎ウイルスの生体外培養における宿主細
胞としても極めて有用である。本発明はかかる有用な生
理活性物質を提供するものである。
以下、本発明のＨＧＦの製造方法につき詳述する。
本発明ＨＧＦは、例えば哺乳動物の血小板より効率よ
く、しかも高収率で単離することができる。ここで原料
として用いられる哺乳動物の血小板としては、特に限定
はなく例えばヒト、ウマ、ウシ、ブタ、ヒツジ、ウサ
ギ、マウス等に由来する血小板をいずれも利用すること
ができる。之等の血小板は、その起源とする哺乳動物の
血液より、常法に従い分離される。
く、しかも高収率で単離することができる。ここで原料
として用いられる哺乳動物の血小板としては、特に限定
はなく例えばヒト、ウマ、ウシ、ブタ、ヒツジ、ウサ
ギ、マウス等に由来する血小板をいずれも利用すること
ができる。之等の血小板は、その起源とする哺乳動物の
血液より、常法に従い分離される。
本発明ＨＧＦは、上記により分離された血小板に、好ま
しくは適当な溶剤中で血小板凝集活性化物質を作用させ
て目的とするＨＧＦを血小板外に放出させ、これを精製
することにより単離される。ここで用いられる血小板凝
集活性化物質としては、公知のもの、例えばコラーゲ
ン、トロンビン、１−Ｏ−ヘキサデカノイル−又は１−
Ｏ−オクタデカノイル−２−Ｏ−アセチル−sn−グリセ
ロ−３−ホスホコリン等の血小板活性化因子（ＰＡＦ）
等を例示できる。また溶媒としては、血小板を破壊しな
い等張液であればよく、その具体例としては、例えば生
理食塩水、リン酸緩衝生理食塩水（ＰＢＳ）等を例示で
きる。
しくは適当な溶剤中で血小板凝集活性化物質を作用させ
て目的とするＨＧＦを血小板外に放出させ、これを精製
することにより単離される。ここで用いられる血小板凝
集活性化物質としては、公知のもの、例えばコラーゲ
ン、トロンビン、１−Ｏ−ヘキサデカノイル−又は１−
Ｏ−オクタデカノイル−２−Ｏ−アセチル−sn−グリセ
ロ−３−ホスホコリン等の血小板活性化因子（ＰＡＦ）
等を例示できる。また溶媒としては、血小板を破壊しな
い等張液であればよく、その具体例としては、例えば生
理食塩水、リン酸緩衝生理食塩水（ＰＢＳ）等を例示で
きる。
ＨＧＦの精製は、該ＨＧＦの物理的、化学的性質を利用
した各種の分離手段により実施することができる。該方
法としては具体的には例えば通常の蛋白沈澱剤による処
理、限外過、分子ふるいクロマトグラフイー（ゲル
過）、遠心分離、電気泳動、イオン交換クロマトグラフ
イー、アフイニテイ−クロマトグラフイー、逆相クロマ
トグラフイー、疎水性クロマトグラフイー、透析法、こ
れらの組み合せ等が挙げられる。特に好ましい精製手段
の一例としては、陽イオン交換クロマトグラフイーとヘ
パリンアフイニテイクロマトグラテイーとを組合せた方
法を例示できる。
した各種の分離手段により実施することができる。該方
法としては具体的には例えば通常の蛋白沈澱剤による処
理、限外過、分子ふるいクロマトグラフイー（ゲル
過）、遠心分離、電気泳動、イオン交換クロマトグラフ
イー、アフイニテイ−クロマトグラフイー、逆相クロマ
トグラフイー、疎水性クロマトグラフイー、透析法、こ
れらの組み合せ等が挙げられる。特に好ましい精製手段
の一例としては、陽イオン交換クロマトグラフイーとヘ
パリンアフイニテイクロマトグラテイーとを組合せた方
法を例示できる。
該陽イオン交換クロマトグラテイーに用いられる担体と
しては、蛋白分離のために用いられている通常の各種陽
イオン交換クロマトグラフイー用の担体をいずれも用い
ることができる。その具体例としては、例えばＣＭ−セ
ルロース（ワツトマン社製）、ＣＭ−セフアデツクス
（フアルマシア社製）、Ｐ−セルロース（ワツトマン社
製）、ＣＭ−トヨパール（ＣＭ−Toyopearl、東洋ソー
ダー社製）、ＳＰ−トヨパール（ＳＰ−Toyopearl、同
上社製）、モノＳ（Mono S、フアルマシア社製）等の陽
イオン交換樹脂を例示できる。
しては、蛋白分離のために用いられている通常の各種陽
イオン交換クロマトグラフイー用の担体をいずれも用い
ることができる。その具体例としては、例えばＣＭ−セ
ルロース（ワツトマン社製）、ＣＭ−セフアデツクス
（フアルマシア社製）、Ｐ−セルロース（ワツトマン社
製）、ＣＭ−トヨパール（ＣＭ−Toyopearl、東洋ソー
ダー社製）、ＳＰ−トヨパール（ＳＰ−Toyopearl、同
上社製）、モノＳ（Mono S、フアルマシア社製）等の陽
イオン交換樹脂を例示できる。
ヘパリンアフイニテイクロマトグラフイーに用いられる
担体としては、例えばセルロース、セフアデツクス、セ
フアロース、ポリアクリルアミド、ポリスチレン等の各
種の不溶性担体にヘパリンを共有結合により不溶化させ
た担体であればいずれも使用できる。
担体としては、例えばセルロース、セフアデツクス、セ
フアロース、ポリアクリルアミド、ポリスチレン等の各
種の不溶性担体にヘパリンを共有結合により不溶化させ
た担体であればいずれも使用できる。
上記精製手段により精製された本発明のＨＧＦは、通常
の蛋白質の純度検定手段、例えばＳＤＳ−ＰＡＧＥ、逆
相高速液体クロマトグラフイー等により均一な単品であ
ることが確認される。
の蛋白質の純度検定手段、例えばＳＤＳ−ＰＡＧＥ、逆
相高速液体クロマトグラフイー等により均一な単品であ
ることが確認される。
実施例 以下に参考例及び実施例を示し、本発明をより具体的に
述べるが、本発明はこれらに限定されるものではない。
述べるが、本発明はこれらに限定されるものではない。
参考例１ ＜ＨＧＦ活性の測定＞ ウイスター系雄ラツト（１８０〜２００ｇ）を用い、コ
ラーゲン還流法〔Tanaka,K.et al.,J.Biochem.(Toky
o)，８４，９３７〜９４６（１９７８）〕により肝実質
細胞を分離、調製した。この肝実質細胞を５％牛血清及
び１０−８Ｍインスリンを添加したウイリアムスＥ培地
（フローラボラトリー社製）に懸濁させ、１２ウエル−
マルチプレート（リンブロン社製）に３．３×１０４個
／cm2の低濃度でまき込み、５％炭酸ガス及び３０％酸
素ガスの存在下で培養した。培養４時間後、培地を５％
牛血清及び５×１０−７Ｍデキサメサゾンを含むウイリ
アムスＥ培地に変換し、同時に所定量の被検試料（本発
明ＨＧＦ又は他の各種増殖因子）を添加した。２０時間
後、更に同一培地交換及び試料の添加を行なつた。
ラーゲン還流法〔Tanaka,K.et al.,J.Biochem.(Toky
o)，８４，９３７〜９４６（１９７８）〕により肝実質
細胞を分離、調製した。この肝実質細胞を５％牛血清及
び１０−８Ｍインスリンを添加したウイリアムスＥ培地
（フローラボラトリー社製）に懸濁させ、１２ウエル−
マルチプレート（リンブロン社製）に３．３×１０４個
／cm2の低濃度でまき込み、５％炭酸ガス及び３０％酸
素ガスの存在下で培養した。培養４時間後、培地を５％
牛血清及び５×１０−７Ｍデキサメサゾンを含むウイリ
アムスＥ培地に変換し、同時に所定量の被検試料（本発
明ＨＧＦ又は他の各種増殖因子）を添加した。２０時間
後、更に同一培地交換及び試料の添加を行なつた。
１２時間後、３Ｈ−チミジンの２．５μＣｉ／ml（５
４．２Ｃｉ／m mol）を添加し、２４時間培養した。
尚、上記３Ｈ−チミジンによるラベルの１５分前にアフ
イデイコリンの５μｇ／mlを添加した群をコントロール
群とした。上記２４時間の培養によるラベル後、細胞を
ＰＢＳで洗い、冷１０％トリクロル酢酸（ＴＣＡ）水溶
液で固定した。細胞を１ウエル当り０．５mlの１Ｎ水酸
化ナトリウム水溶液により可溶化し、一部をとつて蛋白
質をローリー法に従つて測定した。残液にＴＣＡを２０
％となるように添加し、ＴＣＡ不溶性画分を遠心沈殿に
より集め、５％ＴＣＡ水溶液で洗浄後、１０％ＴＣＡ水
溶液１mlを加え、９０℃で１５分間煮沸し、上清画分の
放射能をトルエン−エタノール系シンチレーターにより
測定した。
４．２Ｃｉ／m mol）を添加し、２４時間培養した。
尚、上記３Ｈ−チミジンによるラベルの１５分前にアフ
イデイコリンの５μｇ／mlを添加した群をコントロール
群とした。上記２４時間の培養によるラベル後、細胞を
ＰＢＳで洗い、冷１０％トリクロル酢酸（ＴＣＡ）水溶
液で固定した。細胞を１ウエル当り０．５mlの１Ｎ水酸
化ナトリウム水溶液により可溶化し、一部をとつて蛋白
質をローリー法に従つて測定した。残液にＴＣＡを２０
％となるように添加し、ＴＣＡ不溶性画分を遠心沈殿に
より集め、５％ＴＣＡ水溶液で洗浄後、１０％ＴＣＡ水
溶液１mlを加え、９０℃で１５分間煮沸し、上清画分の
放射能をトルエン−エタノール系シンチレーターにより
測定した。
被検試料により肝実質細胞ＤＮＡに取込まれた３Ｈ−チ
ミジン量をコントロールとのカウントの差として求め、
これを肝実質細胞１mg蛋白量当りに換算してＤＮＡ合成
活性（dpm／mg蛋白）とし、これを被検試料のＨＧＦ活
性の指標とした。
ミジン量をコントロールとのカウントの差として求め、
これを肝実質細胞１mg蛋白量当りに換算してＤＮＡ合成
活性（dpm／mg蛋白）とし、これを被検試料のＨＧＦ活
性の指標とした。
尚、ＨＧＦ活性を単位（Ｕ）で示す場合は、同一試験に
おいてＥＧＦ２０ng／mlを用いた場合のＤＮＡ合成活性
（ＥＧＦは該用量で最大活性を示す）の５０％に相当す
る活性を１単位として定義する。
おいてＥＧＦ２０ng／mlを用いた場合のＤＮＡ合成活性
（ＥＧＦは該用量で最大活性を示す）の５０％に相当す
る活性を１単位として定義する。
参考例２ ＜ＰＤＧＦ活性の測定＞ ＰＤＧＦ活性の測定は、Balb／ｃ ３Ｔ３細胞のＤＮＡ
合成促進活性により行なつた。
合成促進活性により行なつた。
即ち、該３Ｔ３細胞を、１０％牛血清を含むダルベツコ
改質ＭＥＭ培地（ＤＭＥ、日水産業社製）に懸濁させ、
１２ウエル−マルチプレートに１．２５×１０４個／ml
の濃度でまき込み、５％炭酸ガスの存在下で４〜５日培
養した。次いで０．５％牛血清を含むＤＭＥに培地交換
し、同時に所定量の被検試料を添加して２０時間培養
後、３Ｈチミジン５４．２Ｃｉ／m molを添加（２．５
μＣｉ／ml）し、更に４時間培養を続けた。尚、上記３
Ｈチミジンによるラベルの１５分前にハイドロキシウレ
ア２５ｍＭを添加した群をコントロール群とした。上記
４時間の培養によるラベル後、細胞をＰＢＳで洗い、冷
１０％ＴＣＡ水溶液で固定し、更に５％ＴＣＡ水溶液で
２回洗浄した。
改質ＭＥＭ培地（ＤＭＥ、日水産業社製）に懸濁させ、
１２ウエル−マルチプレートに１．２５×１０４個／ml
の濃度でまき込み、５％炭酸ガスの存在下で４〜５日培
養した。次いで０．５％牛血清を含むＤＭＥに培地交換
し、同時に所定量の被検試料を添加して２０時間培養
後、３Ｈチミジン５４．２Ｃｉ／m molを添加（２．５
μＣｉ／ml）し、更に４時間培養を続けた。尚、上記３
Ｈチミジンによるラベルの１５分前にハイドロキシウレ
ア２５ｍＭを添加した群をコントロール群とした。上記
４時間の培養によるラベル後、細胞をＰＢＳで洗い、冷
１０％ＴＣＡ水溶液で固定し、更に５％ＴＣＡ水溶液で
２回洗浄した。
細胞を１ウエル当り０．５mlの０．１Ｎ水酸化ナトリウ
ム水溶液によつて可溶化し、その放射能をトルエン−エ
タノール系シンチレーターにより測定した。被検試料に
より３Ｔ３細胞ＤＮＡにとり込まれた３Ｈチミジン量を
コントロールとのカウントの差として求め、これをウエ
ル当りに換算してＤＮＡ合成活性（dpm／ウエル）と
し、これを被検試料のＰＤＧＦ活性の指標とした。
ム水溶液によつて可溶化し、その放射能をトルエン−エ
タノール系シンチレーターにより測定した。被検試料に
より３Ｔ３細胞ＤＮＡにとり込まれた３Ｈチミジン量を
コントロールとのカウントの差として求め、これをウエ
ル当りに換算してＤＮＡ合成活性（dpm／ウエル）と
し、これを被検試料のＰＤＧＦ活性の指標とした。
実施例１ １００匹のラツト（２００〜４００ｇ）から採血した
血液を遠心分離（２００×ｇ、１５分）して上清を得、
これを更に遠心分離（２５００×ｇ、１５分）して血小
板を沈渣として得た。これをリン酸緩衝生理食塩水（Ｐ
ＢＳ）にて２回遠心洗浄して、９９％以上の純度の血小
板を得た。これをＰＢＳに１×1011個／mlの濃度に懸濁
させ、２単位／mlのトロンビン（シグマ社製）の存在下
に３７℃で１５分間インキユベートして、血小板凝集を
誘発させた。
血液を遠心分離（２００×ｇ、１５分）して上清を得、
これを更に遠心分離（２５００×ｇ、１５分）して血小
板を沈渣として得た。これをリン酸緩衝生理食塩水（Ｐ
ＢＳ）にて２回遠心洗浄して、９９％以上の純度の血小
板を得た。これをＰＢＳに１×1011個／mlの濃度に懸濁
させ、２単位／mlのトロンビン（シグマ社製）の存在下
に３７℃で１５分間インキユベートして、血小板凝集を
誘発させた。
凝集完了後、血小板懸濁液に、フエニルメチルスルホニ
ルフルオリド（ＰＭＳＦ）を最終濃度１ｍＭとなるよう
に加え、遠心分離（１５０００×ｇ、１０分間）して上
清を得た。以下これを「血小板遊出液」という。該血小
板遊出液のＨＧＦ活性を下記第１表に示す。
ルフルオリド（ＰＭＳＦ）を最終濃度１ｍＭとなるよう
に加え、遠心分離（１５０００×ｇ、１０分間）して上
清を得た。以下これを「血小板遊出液」という。該血小
板遊出液のＨＧＦ活性を下記第１表に示す。
上記で得た血小板遊出液を、あらかじめ０．１５Ｍ
ＮａＣｌ、１０ｍＭＮ−２−ヒドロキシエチルピペラジ
ン−Ｎ′−２−エタンスルホン酸（ＨＥＰＥＳ）及び２
ｍＭＣａＣｌ２を含む５０ｍＭトリス−塩酸緩衝液（ｐ
Ｈ＝８．５）で平衡化したモノＳカラム（Mono S；フア
ルマシア社製、カラムサイズ１×１０cm）の陽イオン交
換クロマトグラフイー〔ＦＰＬＣ；フアルマシア社製〕
に付し、同緩衝液にて洗浄後、０．１から１．０ＭＮａ
Ｃｌの直線濃度勾配により溶出させた（流速６０ml／ｈ
ｒ、２ml／チユーブ）。その結果を第１図に示す。
ＮａＣｌ、１０ｍＭＮ−２−ヒドロキシエチルピペラジ
ン−Ｎ′−２−エタンスルホン酸（ＨＥＰＥＳ）及び２
ｍＭＣａＣｌ２を含む５０ｍＭトリス−塩酸緩衝液（ｐ
Ｈ＝８．５）で平衡化したモノＳカラム（Mono S；フア
ルマシア社製、カラムサイズ１×１０cm）の陽イオン交
換クロマトグラフイー〔ＦＰＬＣ；フアルマシア社製〕
に付し、同緩衝液にて洗浄後、０．１から１．０ＭＮａ
Ｃｌの直線濃度勾配により溶出させた（流速６０ml／ｈ
ｒ、２ml／チユーブ）。その結果を第１図に示す。
図において縦軸（１）は２８０nmにおける吸光度（Ａ28
0）を、（２）はＨＧＦ活性（ＤＮＡ合成活性）を、
（３）はＰＤＧＦ活性（ＤＮＡ合成活性）を、また
（４）はＮａＣｌ濃度を各々示し、横軸はフラクシヨン
No.を示す。
0）を、（２）はＨＧＦ活性（ＤＮＡ合成活性）を、
（３）はＰＤＧＦ活性（ＤＮＡ合成活性）を、また
（４）はＮａＣｌ濃度を各々示し、横軸はフラクシヨン
No.を示す。
該図よりＨＧＦは、約０．６８ＭのＮａＣｌ濃度（フラ
クシヨンNo.２６〜３０）に溶出され、ＰＤＧＦとは明
確に区別されることが判る。
クシヨンNo.２６〜３０）に溶出され、ＰＤＧＦとは明
確に区別されることが判る。
上記のフラクシヨンNo.２６〜３０の画分を、１Ｎ
ＨＣｌにてｐＨ７．５に調製し、蒸留水にて３倍希釈し
た。これを０．３ＭＮａＣｌを含む１０ｍＭトリス−塩
酸緩衝液（ｐＨ＝７．５）で平衡化したヘパリン−セフ
アロースＣＬ−６Ｂ（フアルマシア社製）ベツドボリウ
ム２．２ml）に付し、同緩衝液で洗浄後、０．３から
２．０ＭＮａＣｌの濃度勾配溶出（流速２０ml／ｈｒ、
１ml／チユーブ）を行なつた。結果を第２図に示す。
ＨＣｌにてｐＨ７．５に調製し、蒸留水にて３倍希釈し
た。これを０．３ＭＮａＣｌを含む１０ｍＭトリス−塩
酸緩衝液（ｐＨ＝７．５）で平衡化したヘパリン−セフ
アロースＣＬ−６Ｂ（フアルマシア社製）ベツドボリウ
ム２．２ml）に付し、同緩衝液で洗浄後、０．３から
２．０ＭＮａＣｌの濃度勾配溶出（流速２０ml／ｈｒ、
１ml／チユーブ）を行なつた。結果を第２図に示す。
図において（１）は２１５nmにおける吸光度（Ａ215）
を、（２）はＨＧＦ活性（ＤＮＡ合成活性）を、（３）
はＮａＣｌ濃度を各々示し、横軸はフラクシヨンNo.を
示す。
を、（２）はＨＧＦ活性（ＤＮＡ合成活性）を、（３）
はＮａＣｌ濃度を各々示し、横軸はフラクシヨンNo.を
示す。
該図よりＮａＣｌ濃度約１Ｍ（フラクシヨンNo.３７〜
４０）にＨＧＦを得た。
４０）にＨＧＦを得た。
上記〜の精製工程の結果を下記第２表に示す。
また上記各工程で得られたＨＧＦの肝実質細胞増殖に与
える効果（ＨＧＦ活性）の用量依存効果を下記第３表に
示す。
える効果（ＨＧＦ活性）の用量依存効果を下記第３表に
示す。
また上記で得たＨＧＦと、ＥＧＦ及びインスリン(In
s)のＨＧＦ活性を下記第４表に示す。
s)のＨＧＦ活性を下記第４表に示す。
第４表より、ＨＧＦ、ＥＧＦ及びInsの効果は、各々相
加的であることが判る。
加的であることが判る。
上記で得たＨＧＦの２００μを０．１（ｖ／ｖ）
％のトリフルオロ酢酸（ＴＦＡ）及び１０（ｖ／ｖ）％
のアセトニトリル水溶液で平衡化したプロＲＰＣＨＲ５
／５カラム〔ＰroＲＰＣＨＲ５／５（Ｃ８）、フアルマ
シア社製〕の逆相クロマトグラフイー（ＦＰＬＣ、フア
ルマシア社製）に付し、平衡化液（Ａ液）からアセトニ
トリル５０（ｖ／ｖ）の０．１（ｖ／ｖ）％ＴＦＡ液
（Ｂ液）までの直線濃度勾配（９０分）により溶出させ
た（流速３０ml／ｈｒ、１ml／チユーブ）。その結果を
第３図に示す。
％のトリフルオロ酢酸（ＴＦＡ）及び１０（ｖ／ｖ）％
のアセトニトリル水溶液で平衡化したプロＲＰＣＨＲ５
／５カラム〔ＰroＲＰＣＨＲ５／５（Ｃ８）、フアルマ
シア社製〕の逆相クロマトグラフイー（ＦＰＬＣ、フア
ルマシア社製）に付し、平衡化液（Ａ液）からアセトニ
トリル５０（ｖ／ｖ）の０．１（ｖ／ｖ）％ＴＦＡ液
（Ｂ液）までの直線濃度勾配（９０分）により溶出させ
た（流速３０ml／ｈｒ、１ml／チユーブ）。その結果を
第３図に示す。
図において（１）は２１５nmにおける吸光度（Ａ215）
を、（２）はＢ液の百分率（Ｂ％）を示し、横軸はフラ
クシヨンNo.である。
を、（２）はＢ液の百分率（Ｂ％）を示し、横軸はフラ
クシヨンNo.である。
該図より、上記で得たＨＧＦは、単一の蛋白ピークを
示し、均一であることが判る。
示し、均一であることが判る。
ＳＤＳ−ポリアクリルアミドゲル電気泳動 （ＳＤＳ−ＰＡＧＥ） １２．５％アクリルアミドを用い、ラムリらの方法〔La
emmeli et al.,Nature，２２７，６８０−６８５（１９
７０）〕に従つて、上記で得たＨＧＦのＳＤＳ−ＰＡ
ＧＥを行なつた。泳動後、ゲルを４０％メタノール−１
０％酢酸で９０分にて固定化し、１０％エタノール−５
％酢酸で洗浄後、銀染色を行なつた。
emmeli et al.,Nature，２２７，６８０−６８５（１９
７０）〕に従つて、上記で得たＨＧＦのＳＤＳ−ＰＡ
ＧＥを行なつた。泳動後、ゲルを４０％メタノール−１
０％酢酸で９０分にて固定化し、１０％エタノール−５
％酢酸で洗浄後、銀染色を行なつた。
ＨＧＦは、単一のバンドとして染色され、その相対移動
度(Relative movility)より、約２７キロダルトン（Ｋ
Ｄ）の分子量を有すると推定された。
度(Relative movility)より、約２７キロダルトン（Ｋ
Ｄ）の分子量を有すると推定された。
その結果を第４図に示す。
図において●はＨＧＦを示し、○の１〜６はそれぞれ以
下の分子量を有する分子量マーカーを示す。
下の分子量を有する分子量マーカーを示す。
○１…フオスホリラーゼb ；９４ＫＤ ○２…ＢＳＡ ；６７ＫＤ ○３…オバアルブミン ；４３ＫＤ ○４…炭素脱水酵素 ；３０ＫＤ ○５…大豆トリプシンインヒビター ；２０．１ＫＤ ○６…α−ラクトアルブミン ；１４．４ＫＤ ＨＧＦの安定性試験 前記で得たＨＧＦを、５ng蛋白量／mlに調製し、以下
の処理によるＨＧＦ活性の変化を調べた。
の処理によるＨＧＦ活性の変化を調べた。
熱処理 ；７０℃、２０分処理した。
酸処理 ；酢酸を１Ｎとなるように加え、２０℃、
５時間処理した。
５時間処理した。
トリプシン処理 ；トリプシン（シグマ社製）を１０
μｇ／mlとなるように 加え、３７
℃、２時間処理後、ＰＭＳＦを１ｍＭとなるように
加えて反応を停止した。
μｇ／mlとなるように 加え、３７
℃、２時間処理後、ＰＭＳＦを１ｍＭとなるように
加えて反応を停止した。
結果を下記第５表に示す。なお、第５表におけるラベリ
ングインデツクスは、肝実質細胞の増殖を反映する。該
インデツクスとは、前記参考例１において２４時間の培
養によるラベル後、細胞を冷ＰＢＳで２回数洗浄し、固
定化（ジエンダー溶液、５分）後、サクラＮＲ−Ｍ２
（小西六写真工業社製）でコートし、ラジオオートグラ
ムの調製に１０日間感光させ、細胞をエオジン染色後、
５０個の細胞を測定し、３Ｈ−チミジンでラベルされた
核数（％、labelled nuclei）の測定値により表わされ
る。
ングインデツクスは、肝実質細胞の増殖を反映する。該
インデツクスとは、前記参考例１において２４時間の培
養によるラベル後、細胞を冷ＰＢＳで２回数洗浄し、固
定化（ジエンダー溶液、５分）後、サクラＮＲ−Ｍ２
（小西六写真工業社製）でコートし、ラジオオートグラ
ムの調製に１０日間感光させ、細胞をエオジン染色後、
５０個の細胞を測定し、３Ｈ−チミジンでラベルされた
核数（％、labelled nuclei）の測定値により表わされ
る。
第１図はモノＳカラムを用いた陽イオン交換クロマトグ
ラフイーによる本発明ＨＧＦ及び他の因子の溶出曲線を
示すものである。第２図はヘパリン−セフアロースＣＬ
−６Ｂを用いたヘパリン親和性カラムクロマトグラフイ
ーによる本発明ＨＧＦの精製を示すグラフである。第３
図はプロＲＰＣ ＨＲ５／５カラムを用いた逆相クロマ
トグラフイーによる本発明ＨＧＦの溶出曲線を示す物で
ある。第４図はＳＤＳ−ＰＡＧＥによる本発明ＨＧＦの
推定分子量を求めたグラフである。
ラフイーによる本発明ＨＧＦ及び他の因子の溶出曲線を
示すものである。第２図はヘパリン−セフアロースＣＬ
−６Ｂを用いたヘパリン親和性カラムクロマトグラフイ
ーによる本発明ＨＧＦの精製を示すグラフである。第３
図はプロＲＰＣ ＨＲ５／５カラムを用いた逆相クロマ
トグラフイーによる本発明ＨＧＦの溶出曲線を示す物で
ある。第４図はＳＤＳ−ＰＡＧＥによる本発明ＨＧＦの
推定分子量を求めたグラフである。
───────────────────────────────────────────────────── フロントページの続き (51)Int.Cl.5 識別記号 庁内整理番号 ＦＩ 技術表示箇所 Ｃ１２Ｒ 1:91）
Claims (1)
- 【請求項１】下記理化学的性質及び生理活性を有する塩
基性蛋白質であることを特徴とする肝実質細胞増殖因
子。 ａ）ＳＤＳ−ＰＡＧＥによる推定分子量が約２７０００
である、 ｂ）陽イオン交換クロマトグラフィー［モノＳ：ファル
マシア社製；０．１から１．０ＭＮａＣｌの濃度勾配溶
出：１０ｍＭ Ｎ−２−ヒドロキシエチルピペラジン−
Ｎ′−２−エタンスルホン酸及び２ｍＭ ＣａＣｌ２を
含む５０ｍＭ トリス−塩酸緩衝液（ｐＨ＝８．５）、
流速６０ml／ｈｒ］において、約０．６８ＭのＮａＣｌ
濃度に溶出され、ヘパリンクロマトグラフィー［ヘパリ
ン−セファロースＣＬ−６Ｂ：ファルマシア社製；０．
３から２．０Ｍ ＮａＣｌの濃度勾配溶出：１０ｍＭ
トリス−塩酸緩衝液（ｐＨ＝７．５）、流速２０ml／ｈ
ｒ］において、約１ＭのＮａＣｌ濃度に溶出される、 ｃ）７０〜１００℃、２０分間の加熱処理により肝実質
細胞増殖活性が失活する、 ｄ）１Ｎ酢酸水溶液による２０℃、５時間の処理により
肝実質細胞増殖活性が失活する、 ｅ）トリプシン消化（１０μｇ／ml、２時間、３７℃）
により肝実質細胞増殖活性が失活する、 ｆ）肝実質細胞を生体外において増殖させる活性を有す
る、 ｇ）哺乳動物の血小板に存在する。
Priority Applications (1)
| Application Number | Priority Date | Filing Date | Title |
|---|---|---|---|
| JP60186146A JPH0635480B2 (ja) | 1985-08-23 | 1985-08-23 | 肝実質細胞増殖因子 |
Applications Claiming Priority (1)
| Application Number | Priority Date | Filing Date | Title |
|---|---|---|---|
| JP60186146A JPH0635480B2 (ja) | 1985-08-23 | 1985-08-23 | 肝実質細胞増殖因子 |
Publications (2)
| Publication Number | Publication Date |
|---|---|
| JPS6245530A JPS6245530A (ja) | 1987-02-27 |
| JPH0635480B2 true JPH0635480B2 (ja) | 1994-05-11 |
Family
ID=16183183
Family Applications (1)
| Application Number | Title | Priority Date | Filing Date |
|---|---|---|---|
| JP60186146A Expired - Lifetime JPH0635480B2 (ja) | 1985-08-23 | 1985-08-23 | 肝実質細胞増殖因子 |
Country Status (1)
| Country | Link |
|---|---|
| JP (1) | JPH0635480B2 (ja) |
Families Citing this family (7)
| Publication number | Priority date | Publication date | Assignee | Title |
|---|---|---|---|---|
| JPS643199A (en) * | 1987-06-25 | 1989-01-06 | Yasushi Daikuhara | Monoclonal antibody |
| JP2564632B2 (ja) * | 1988-11-21 | 1996-12-18 | マルハ株式会社 | β−グルカン類に対する特異性の高いアメボサイト・ライセート及びその製造方法 |
| JP2560139B2 (ja) * | 1990-07-19 | 1996-12-04 | マルハ株式会社 | βーグルカン類に対する特異性の高いアメボサイト・ライセート及びその製造方法 |
| CA2118012A1 (en) * | 1992-05-18 | 1993-11-25 | Paul J. Godowski | Hepatocyte growth factor variants |
| US5328837A (en) * | 1992-05-18 | 1994-07-12 | Genentech, Inc. | Hepatocyte growth factor protease domain variants |
| US5316921A (en) * | 1992-05-18 | 1994-05-31 | Genentech, Inc. | Single-chain hepatocyte growth factor variants |
| JPH08501314A (ja) * | 1992-09-16 | 1996-02-13 | ジェネンテク，インコーポレイテッド | Ｈｇｆによる肝臓障害に対する保護 |
-
1985
- 1985-08-23 JP JP60186146A patent/JPH0635480B2/ja not_active Expired - Lifetime
Also Published As
| Publication number | Publication date |
|---|---|
| JPS6245530A (ja) | 1987-02-27 |
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Legal Events
| Date | Code | Title | Description |
|---|---|---|---|
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