JPH04352800A

JPH04352800A - 平滑筋分裂促進因子

Info

Publication number: JPH04352800A
Application number: JP3279676A
Authority: JP
Inventors: Jouda Falkman Moses; モーゼス　ジューダ　フォークマン; Yuen Shing; シンユエン
Original assignee: Childrens Medical Center Corp
Current assignee: Childrens Medical Center Corp
Priority date: 1990-10-26
Filing date: 1991-10-25
Publication date: 1992-12-07
Also published as: US5328986A

Abstract

(57)【要約】本公報は電子出願前の出願データであるた
め要約のデータは記録されません。

Description

【発明の詳細な説明】

【０００１】

【産業上の利用分野】本発明は、平滑筋細胞の成長を刺
激する新規な成長因子及びその用途に関するものである
。

【０００２】

【従来の技術及び発明が解決しようとする課題】平滑筋
細胞の増殖については広く研究されているが（例えば、
Ｓｃｈｗａｒｔｚ　等、サーキュレーション・リサーチ
（Ｃｉｒｃｕｌａｔｉｏｎ　Ｒｅｓｅａｒｃｈ）、第５
８巻、第４号、第４２７頁参照。これは、参照のために
ここに記載されている。）、平滑筋細胞の増殖を制御す
るシグナルについては、大部分が未知のままである。平
滑筋細胞増殖は、動脈硬化症（アテローム性動脈硬化症
及び高血圧症）のような病気において中心的な役割を演
じていることが知られている。幼児における平滑筋増殖
の欠如は、血管奇形においてもある役割を演じている。このように、平滑筋細胞複製ができない場合は、血管の
損傷を治療できなくなり、死に至ることも多い。アテロ
ーム性動脈硬化の損傷が形成されている間に、平滑筋細
胞の複製が起こることは、現在一般に知られているが、
プラークの履歴全体におけるその増殖応答の役割は、全
てが明らかになっているわけではない。２、３の研究者
は、動脈の発育中に起こる複製が、脂質蓄積及び内皮損
傷に先だって、アテローム性動脈硬化の損傷において起
こる最初のことであると示唆している。血管壁における
平滑筋複製を説明する主要な仮説は、損傷応答仮説であ
る。簡単に言うと、仮説は、血管壁の平滑筋細胞が、通
常、静止状態で存在すると言うことである。内皮が損傷
を受けると、血小板は、動脈内膜への平滑筋細胞の移動
及びその中での複製を刺激する因子を放出する［Ｒｏｓ
ｓ，　アルテリオスクレローシス（Ａｒｔｅｒｉｏｓｃ
ｌｅｒｏｓｉｓ）　１，　２９３−３１１　（１９８１
）］。Ｒｏｓｓ　は、培養平滑筋細胞の増殖には、血小
板由来成長因子（ＰＤＧＦ）が必要であることも示した
［Ｒｏｓｓ　及び　Ｇｌｏｍｓｅｔ、ニューイングラン
ド　ジャーナル　オブ　メディスン（Ｎ．　Ｅｎｇ．　
Ｊ．　Ｍｅｄ．）　２９５，　３６９−３７７，　４２
０−４２５　（１９７６）］。Ｒｏｓｓ　の観察は、そ
れに続くＰＤＧＦの精製、その受容体の同定、更に最近
では、２つのＰＤＧＦペプチド鎖のうちの１つの遺伝子
としてのオンコジーンｃ−ｓｉｓの同定をもたらした。

【０００３】細胞周期進行のための第２の公知の要件は
、インシュリン様成長因子（ＩＧＦ−１）としても知ら
れるソマトメジンＣの利用性（ａｖａｉｌａｂｉｌｉｔ
ｙ）　である。ＩＧＦ−１それ自身は、平滑筋細胞によ
り合成することができ，ＩＧＦ−１に対する抗体は、細
胞周期の進行を抑制する。これらのデータは、ＰＤＧＦ
が、それ自体の進行因子の産生を刺激することが可能で
あることを示唆している。この観察は、血管壁に固有な
因子により平滑筋複製を制御できるかも知れないと言う
興味ある可能性に対し、かなり重要なことである。ＰＤ
ＧＦとは別に、平滑筋細胞の分裂を促進する他の物質も
研究されている。更に、血小板も、上皮細胞成長因子（
ＥＧＦ）に類似する蛋白質［Ｏｋａ　及びＯｒｔｈ、ジ
ャーナル・オブ・クリニカル・インヴェスティゲーショ
ン（Ｊ．　Ｃｌｉｎ．　Ｉｎｖｅｓｔ．）　７２、２４
９−２５９　（１９８３）並びにＡｓｓｏｉａｎ　等、
（１９９４）］及びβ腫瘍成長因子と呼ばれる、懸濁状
態の細胞の成長を助けることのできる因子［Ｔｕｃｋｅ
ｒ　等、サイエンス（Ｓｃｉｅｎｃｅ）　２２６、７０
５−７７７　（１９８４）］を含んでいる。増殖の刺激
に対するこれらのそれぞれの相対的な寄与については、
大部分が知られていない。高血圧症において平滑筋複製
を制御する刺激についても、大部分が未知のままである
。悪性高血圧症での微小血管の変化において、ＰＤＧＦ
は重要な役割を演じているかも知れないが、大きい血管
又はより穏やかな形若しくはより慢性的な形の高血圧に
より影響を受ける血管には、ＰＤＧＦは含まれていない
ように思われる。種々の病状における平滑筋の役割につ
いては、多くの研究があり、ＰＤＧＦのような成長因子
のいくつかの機構及び役割が探求されているが、平滑筋
細胞の増殖を刺激する分裂促進因子（マイトージェン）
についての新しい情報は、依然として必要である。このような分裂促進因子の同定によって、平滑筋分裂促
進因子に対する抗体又はこのような分裂促進因子の受容
体に結合する競合蛋白質を用いる競合的結合戦略のよう
な、種々の治療戦略を工夫することが可能となるであろ
う。平滑筋分裂促進因子は、血管奇形のような状態の治
療に、あるいは創傷／潰瘍治癒における成長因子として
、用いることもできる。

【０００４】

【課題を解決するための手段】本発明によれば、実質的
に各ベータ細胞がオンコジーンＳＶ４０ラージＴを発現
している、遺伝子導入マウス（ＲＩＰ１−Ｔａｇ２）か
ら当初誘導された膵臓腫瘍細胞の馴化培地から得ること
のできる新規な成長因子（以下、“ＢＴＣ−ＧＦ”と言
う）が提供される。ＢＴＣ−ＧＦが元来それから同定さ
れ、単離され、精製された膵臓腫瘍細胞（以下、“ＢＴ
Ｃ−３細胞”と言う）のサンプルは、ブダペスト条約に
より、アメリカン・タイプカルチャー・コレクション（
Ｔｈｅ　Ａｍｅｒｉｃａｎ　Ｔｙｐｅ　Ｃｕｌｔｕｒｅ
　Ｃｏｌｌｅｃｔｉｏｎ）にＡＴＣＣ寄託番号ＣＲＬ　
１０５８５として１９９０年１０月２６日に寄託されて
いる。ＢＴＣ−ＧＦは、サブラインの膵臓腫瘍細胞（以
下、ＢＴＣ−ＪＣ１０細胞と言う）から精製してもよく
、その細胞のサンプルは、ブダペスト条約により、アメ
リカン・タイプ・カルチャー・コレクションにＡＴＣＣ
寄託番号ＣＲＬ　１０８７５として１９９１年９月２４
日に寄託されている。本発明のＢＴＣ−ＧＦは、平滑筋
細胞、３Ｔ３線維芽細胞及び網膜色素上皮細胞のための
分裂促進因子であり、内皮細胞のためのものではない。ＢＴＣ−ＧＦは、煮沸、１０ｍＭジチオスレイトル及び
１Ｍ酢酸にさらすことによっても失活しない。ＢＴＣ−
ＧＦの生物活性は、ＳＤＳ−ＰＡＧＥにおいて、約３２
、０００の分子量を有する蛋白質の単一バンドとして存
在する。ＢＴＣ−３及びＢＴＣーＪＣ１０の両方から精
製されたＢＴＣ−ＧＦのＮ−末端アミノ酸配列を比較す
ることにより決定した、ＢＴＣ−ＧＦの部分Ｎ−末端ア
ミノ酸配列（配列番号：１）は、次の通りである。Ａｓｐ−Ｇｌｙ−Ｘａａ−Ｔｈｒ−Ｘａａ−Ａｒｇ−Ｔ
ｈｒ−Ｐｒｏ−Ｇｌｕ−Ｔｈｒ−Ａｓｎ−Ｇｌｙ−Ｓｅ
ｒ−Ｌｅｕ−Ｘａａ−Ｇｌｙ−Ａｌａ−Ｐｒｏ−Ｇｌｙ
−Ｇｌｕ−Ｇｌｕ−Ａｒｇ−Ｔｈｒ−Ａｒｇ　（図７参
照）翻訳されたＧＥＮＢＡＮＫ及びＮＢＲＦ蛋白質データベ
ースによるコンピューター調査では、同様の蛋白質は見
つからなかった。

【０００５】本発明のＢＴＣ−ＧＦは、創傷／潰瘍等の
治療と共に、血管奇形の治療に用いられることができる
。ＢＴＣ−ＧＦは、抗体や偽ペプチド（ｆａｌｓｅ　ｐ
ｅｐｔｉｄｅｓ）のような競合剤を産生するのに使われ
てもよい。ＢＴＣ−ＧＦは、小島（ランゲルハンス氏島
）のインシュリン産生細胞に由来するために、このよう
な競合剤を、高血圧症と共に、糖尿病において認められ
るアテローム性動脈硬化症及び糖尿病性網膜症のような
平滑筋細胞増殖に起因する病気の治療に用いることもで
きる。また、この因子は診断テストにも用いられる。例
えば、この成長因子に対する抗体が、小島での死にかか
っている又は再生しつつあるベータ細胞がこの因子を放
出している糖尿病患者の血液中に、この因子を検出する
ことができる。

【０００６】本発明によれば、平滑筋細胞の成長を促進
する新規な成長因子ＢＴＣ−ＧＦが提供される。本発明
に従って作られたＢＴＣ−ＧＦは、ＳＤＳ−ＰＡＧＥに
おいて、約３２，０００の分子量を有しており、煮沸し
ても、熱に安定である。ＢＴＣ−ＧＦは、１０ｍＭジチ
オスレイトルの存在及び濃度１Ｍの酢酸にさらした場合
も、安定である。ＢＴＣ−ＧＦは、各ベータ細胞が実質
的にオンコジーンＳＶ４０　Ｔを発現している、遺伝子
導入マウス（ＲＩＰＩ−Ｔａｇ２）から当初誘導された
ＢＴＣ−３膵臓腫瘍細胞（ＡＴＣＣ　Ｎｏ．ＣＲＬ１０
５８５）の馴化培地から同定、単離された。ＢＴＣ−Ｇ
Ｆは、ＢＴＣ−ＪＣ１０（ＡＴＣＣ　Ｎｏ．ＣＲＬ１０
８７５）からも精製されている。ＢＴＣ−ＧＦを精製す
るには、多くの方法を用いることができるが、好ましい
方法の概要を次に述べ、実施例で更に詳細に説明する。

【０００７】まず、ベータ腫瘍細胞を、ローラびん内で
、５％子牛血清を含むＤＭＥＭにて４日間培養する。その後、培地を無血清培地と交換し、採取まで４８〜７
２時間培養する。次いで、無血清ベータ腫瘍細胞馴化培
地を濃縮し、バイオレックス（Ｂｉｏｒｅｘ）７０カラ
ム、フェニルセファロース（Ｓｅｐｈａｒｏｓｅ）カラ
ム、ＦＰＬＣヘパリンアフィニティーカラム、ＨＰＬＣ
逆相カラムなどの多数のカラムに通す。ＢＴＣ−３及び
ＢＴＣーＪＣ１０細胞からのＢＴＣ−ＧＦを比較するこ
とにより得たＢＴＣ−ＧＦのＮ−末端アミノ酸配列は、
ＡＢＩ　４７０Ａ　蛋白シーケンサー（ｐｒｏｔｅｉｎ
　ｓｅｑｕｅｎｃｅｒ）で決定した場合、次の通りであ
る。Ａｓｐ−Ｇｌｙ−Ｘａａ−Ｔｈｒ−Ｘａａ−Ａｒｇ
−Ｔｈｒ−Ｐｒｏ−Ｇｌｕ−Ｔｈｒ−Ａｓｎ−Ｇｌｙ−
Ｓｅｒ−Ｌｅｕ−Ｘａａ−Ｇｌｙ−Ａｌａ−Ｐｒｏ−Ｇ
ｌｙ−Ｇｌｕ−Ｇｌｕ−Ａｒｇ−Ｔｈｒ−Ａｒｇ（配列
番号：１）本発明による精製ＢＴＣ−ＧＦは、血管内注
入により、血管奇形のような病的状態を治療するのに、
又は競合阻害剤の投与により、アテローム性動脈硬化症
を治療するのに用いられることができる。

【０００８】精製ＢＴＣ−ＧＦは、創傷、潰瘍などの治
療にも用いられることができる。本発明の精製ＢＴＣ−
ＧＦは、高血圧症と共に、アテローム性動脈硬化症及び
糖尿病性網膜症の治療に使用できる各種競合剤を作るの
にも、用いることができる。ＢＴＣ−ＧＦと競合し、及
び／又はＢＴＣ−ＧＦが平滑筋細胞の増殖を刺激するの
を妨げる、抗体や偽ペプチドのような競合剤を作ること
ができる。ＢＴＣ−ＧＦは、それ自身に対する抗体を生
成するのに用いられることもできる。生成される抗体は
、それがデザインされる特定の用途に応じて、ポリクロ
ーナル性でもモノクローナル性でもよい。このような抗
体は、当業者によく知られている技術によって調製され
ることができる。例えば、蛋白質又はその抗原蛋白質を
複合させてキーホール　リンペット　ヘモシアニン（Ｋ
ＬＨ）とし、兎等の動物の抗体を高めるのに用いること
ができる。代表的には、ペプチドーＫＬＨ複合体を、約
２カ月の期間にわたって数回注射して、抗体を生成する
。その後、標準技術により、血清から抗体を集める。一方、ハイブリドーマ細胞を形成する標準融合技術を用
いて、その蛋白質に対する抗体を作る細胞内に、モノク
ローナル抗体を作ることができる［ここに参照のために
記載されている　Ｇ．　Ｋｏｈｌｅｒ　等　ネイチャー
（Ｎａｔｕｒｅ）　２５６、４９５　（１９７５）］。この技術の代表的なものとしては、抗体産生細胞を骨髄
腫細胞のような不死化（ｉｍｍｏｒｔａｌ）細胞株と融
合させて、ハイブリッド細胞を作ることが挙げられる。一方、ここに参照のために記載されているＨｕｓｅ　等
、サイエンス（Ｓｃｉｅｎｃｅ）　２４６、１２７５　
（１９８９）　の方法により、細胞からモノクローナル
抗体を作ることができる。

【０００９】

【実施例】本発明の理解を助ける下記の実施例を参照し
て、更に本発明を説明するが、これらは本発明を限定す
るものとして解釈されるべきではない。実施例及び表１
において検討されている成長因子活性は、以前に述べた
ように、静止状態マウスＢａｌｂ／ｃ　３Ｔ３細胞のＤ
ＮＡへの［メチル−３Ｈ］チミジンの取り込みを測るこ
とにより測定された［Ｙ．　Ｓｈｉｎｇ、Ｓ．　Ｄａｖ
ｉｄｓｏｎ　及び　Ｍ．　Ｋｌａｇｓｂｕｒｎ、メソッ
ズ・イン・エンザイモロジー（Ｍｅｔｈｏｄｓ　ｉｎ　
Ｅｎｚｙｍｏｌｏｇｙ）１４６Ｂ、４２−４６　（１９
８７）、これは、ここに参照のために記載されている］
。

【００１０】実施例１１０％小牛血清を含むダルベッコ（Ｄｕｌｂｅｃｃｏ）
改変イーグル培地（ＤＭＥＭ）で、ＢＴＣ−３膵臓ベー
タ腫瘍細胞（ＡＴＣＣ寄託番号Ｎｏ．ＣＲＬ１０５８５
）の一次培養液を調製した。これらの培養液を、１６２
ｃｍ２の細胞フラスコ（Ｃｏｓｔａｒ　Ｃａｔ　＃３１
５０）中に入れ、３７℃の調湿ＣＯ２インキュベーター
内でインキュベートした。これらの細胞を、１２５ｍｌ
のインキュベーターを含有する９００ｃｍ２のグロース
　エリアのローラびん（Ｃｏｓｔｅｒ　Ｃａｔ　＃３９
０１）への播種源として使用した。４日後、各びん内の
培地を、無血清培地と交換した。培地を採取し、４８〜
７２時間インキュベートした後、新しい培地と交換した
。馴化培地６リットルを、成長因子の精製のための出発
材料として、毎週採取した。

【００１１】実施例２ＢＴＣ−３細胞からのＢＴＣ−ＧＦの精製方法工程１．
濃縮無血清ベータ腫瘍細胞馴化培地１０リットルを、分子量
１０，０００カットオフフィルターを用いたアミコン（
Ａｍｉｃｏｎ）中空繊維濃縮器により、４℃で５００ｍ
ｌに濃縮した。続いて、濃縮された培地を、連続透析に
より、５０ｍＭ　ＮａＣｌ、１０ｍＭ　Ｔｒｉｓ、ｐＨ
７に平衡させた。工程２．バイオレックス（Ｂｉｏｒｅｘ）　７０クロマ
トグラフィー濃縮された培地を、４℃で１０ｍＭ　Ｔｒｉｓ、ｐＨ７
により平衡させたバイオレックスカラム（床容積２００
ｍｌ）にかけた。このカラムを４００ｍｌの同一緩衝液
で洗浄し、次いで生物活性を、６０ｍｌ／時間の流速で
、０Ｍの４００ｍｌから０．６Ｍの４００ｍｌまでのＮ
ａＣｌ勾配により溶出した（図１）。工程３．フェニルーセファロースクロマトグラフィーバ
イオレックスカラムからの活性画分を集めて、５分間煮
沸し、遠心分離（１０，０００×ｇ、２０分）により透
明にした。透明上澄み液を１．５Ｍ（ＮＨ４）２ＳＯ４
とし、４℃で１．５Ｍ（ＮＨ４）２ＳＯ４に入れ、１０
ｍＭ燐酸カリウム、ｐＨ７により平衡させたフェニール
セファロースカラム（床容積２５ｍｌ）にかけた。この
カラムを１００ｍｌの平衡緩衝液で洗浄し、続いて、生
物活性を、３０ｍｌ／時間の流速で、ｐＨ７にて、１０
ｍＭ燐酸緩衝液中で１．５Ｍの１７０ｍｌから０Ｍの１
７０ｍｌまでの（ＮＨ４）２ＳＯ４勾配により溶出した
（図２）。工程４．ＦＰＬＣヘパリンアフィニティークロマトグラ
フィーフェニールセファロースカラムからの活性画分を集めて
、透析し、室温で、１０ｍＭＴｒｉｓ、ｐＨ７により平
衡させたＴＳＫ−ＧＥＬ　ヘパリン　５ＰＷガラスカラ
ム（７．５ｃｍ×８ｍｍ内径）にかけた。このカラムを
１０ｍｌの同一緩衝液で洗浄し、生物活性を、１ｍｌ／
分／画分の流速で、０から０．３ＭまでのＮａＣｌ勾配
により、その後、０．３から０．６Ｍまでの他のＮａＣ
ｌ勾配により溶出した（図３）。工程５．ＨＰＬＣ　Ｃ４逆相クロマトグラフィーヘパリ
ンカラムからの活性画分を集め、室温で、１０％アセト
ニトリルの０．１％ＴＦＡ溶液により平衡させたＨＰＬ
Ｃ逆相Ｃ４カラムに直接注入した。このカラムを２０ｍ
ｌの同一溶液で洗浄し、生物活性を、２ｍｌ／分の流速
で、１０％から３５％までのアセトニトリル勾配により
溶出して、１．５ｍｌの画分を集めた（図４）。ＳＤＳ　ＰＡＧＥにおいて銀染色された単一バンドを得
るために、この工程をもう一度繰り返した（図５）。

【００１２】精製結果の大略を表１に示す。

【００１３】

【表１】

【００１４】数値は、馴化培地１０リットルの処理に基
づくものであった。生物活性は、マウス３Ｔ３細胞にお
けるＤＮＡ合成により測定した。成長因子活性１単位は
［メチル−３Ｈ］チミジンのＤＮＡへの最大取り込み値
の半分（ｈａｌｆ−ｍａｘｉｍａｌ　ｉｎｃｏｒｐｏｒ
ａｔｉｏｎ）を促すのに必要な成長因子の量として定義
された。蛋白質質量は１ｍｇ／ｍｌ溶液について、Ａ２
８０＝１．０を用いて算出された。＊　　蛋白質質量は標準蛋白質の強度と比較した銀染色
の強度及びアミノ酸分析により算出された。

【００１５】実施例３平滑筋細胞に対するＢＴＣ−ＧＦの細胞分裂促進活性実
施例２の精製ＢＴＣ−ＧＦは、牛大動脈平滑筋細胞（Ｓ
ＭＣ）の増殖を刺激した（図６）。１％子牛血清を含む
ＤＭＥＭ中で培養されたＳＭＣで、ＢＴＣ−ＧＦの分裂
促進活性をテストした。このテストサンプルを培養液に
加えた後４日目に、細胞をトリプシン処理し、２４ウエ
ルプレートの各ウエル内の細胞数をコウルター（Ｃｏｕ
ｌｔｅｒ）カウンターで数えた。上に例示した精製法に
より調製された蛋白質は、下記の特性を有している。Ｂ
ＴＣ−ＧＦは、Ｎ−末端アミノ酸配列Ａｓｐ−Ｇｌｙ−Ｘａａ−Ｔｈｒ−Ｘａａ−Ａｒｇ−Ｔ
ｈｒ−Ｐｒｏ−Ｇｌｕ−Ｘａａ−Ａｓｎ−Ｇｌｙ−Ｓｅ
ｒ−Ｌｅｕ−Ｘａａ−Ｘａａ−Ａｌａ−Ｐｒｏ−Ｘａａ
−Ｘａａ−Ｘａａ−Ｘａａ−Ｘａａ−Ｘａａ（配列番号
：２）を有するポリペプチドである。ＳＤＳポリアクリルアミ
ドゲル電気泳動により測定した場合、分子量は３２，０
００である。高温（１００℃、５分）、スルフヒドリル
還元剤（１０ｍＭジチオスレイトル）又は酸性状態（ｐ
Ｈ２．２）にさらすことによっても、その分裂促進活性
は失活しない。

【００１６】実施例４ＢＴＣーＪＣ１０を、１０％子牛血清を加えたダルベッ
コ改変イーグル培地（ＤＭＥＭ）中に保持した。馴化培
地を生成するために、８リットルの撹拌フラスコ［ベル
コグラス（Ｂｅｌｃｏ　ｇｌａｓｓ）］内にて、２ｍＭ
グルタミン、１００Ｕ／ｍｌペニシリン及び１００μｇ
／ｍｌストレプトマイシンを加えたＤＭＥＭ／Ｆ１２（
１：１）培地、０．５％インシュリン、トランスフェリ
ン及びセレン［ＩＴＳ、シグマ（Ｓｉｇｍａ）］並びに
０．１％ポリエチレングリコール４００中で、１０４個
／ｍｌのＢＴＣ−ＪＣ１０細胞を懸濁液中でふやした。細胞濃度が２×１０５個／ｍｌになった時に、馴化培地
を集めた。ＢＴＣ−３細胞からＢＴＣ−ＧＦを精製した
のと同様な方法により、ＢＴＣ−ＪＣ１０馴化培地から
ＢＴＣ−ＧＦを精製した。ＢＴＣ−ＪＣ１０細胞から精
製されたＢＴＣ−ＧＦの部分Ｎ−末端アミノ酸配列は、
配列番号：１で示される。図７から分かるように、ＢＴ
Ｃ−３細胞及びＢＴＣ−ＪＣ１０細胞からのＢＴＣ−Ｇ
ＦのＮ−末端アミノ酸配列は、同じであると思われ、こ
のことは両タイプの細胞から得られた２種の蛋白質が同
じであることを示している。

【００１７】

【配列表】

配列番号：１配列の長さ：２４配列の型：アミノ酸トポロジー：直鎖状配列の種類：ペプチド

【００１８】配列番号：２配列の長さ：２４配列の型：アミノ酸トポロジー：直鎖状配列の種類：ペプチド

【図面の簡単な説明】

【図１】濃縮無血清ベータ腫瘍細胞馴化培地をバイオレ
ックス７０カチオン交換カラムに通した後のＢＴＣ−Ｇ
Ｆの３Ｔ３細胞成長因子活性を示す。

【図２】フェニールセファロースカラムに通した場合の
、図１から集められた活性画分の３Ｔ３細胞成長因子活
性を示す。

【図３】ＦＰＬＣヘパリンアフィニティーカラムに通し
た場合の、フェニールセファロースカラムから集められ
た活性画分の３Ｔ３細胞成長因子活性を示す。

【図４】ＨＰＬＣ　Ｃ４逆相カラムに通した場合の、ヘ
パリンアフィニティーカラムから集められた活性画分の
３Ｔ３細胞成長因子活性を示す。

【図５】ＨＰＬＣ　Ｃ４逆相カラム精製を繰り返すこと
により得られた、プールされた活性画分のゲルにおける
ＢＴＣ−ＧＦの銀染色図である。

【図６】牛平滑筋細胞に対するＢＴＣ−ＧＦの分裂促進
活性を示す。

【図７】ＢＴＣ−３及びＢＴＣ−ＪＣ１０から、それぞ
れ精製されたＢＴＣ−ＧＦのＮ−末端アミノ酸配列を示
す。

Claims

【特許請求の範囲】

【請求項１】　　配列番号：１を含むＮ末端アミノ酸配
列を有する精製蛋白質であり、該蛋白質が平滑筋細胞の
増殖を刺激することを特徴とする精製蛋白質。
【請求項２】　　蛋白質が、ＢＴＣ−ＪＣ１０ベータ腫
瘍細胞ＡＴＣＣ寄託番号ＣＲＬ１０８７５から得ること
ができるものである請求項１記載の精製蛋白質。
【請求項３】　　配列番号：２を含むＮ末端アミノ酸配
列を有する精製蛋白質であり、該蛋白質が平滑筋細胞の
増殖を刺激することを特徴とする精製蛋白質。
【請求項４】　　蛋白質が、ＢＴＣ−３ベータ腫瘍細胞
ＡＴＣＣ寄託番号ＣＲＬ１０５８５から得ることができ
るものである請求項３記載の精製蛋白質。
【請求項５】　　蛋白質が、ＳＤＳ−ＰＡＧＥで約３２
，０００の分子量を有するものである請求項１又は３記
載の精製蛋白質。
【請求項６】　　１００℃で５分間加熱後、その活性の
少なくとも約５０％を有する請求項１又は３記載の精製
蛋白質。
【請求項７】　　蛋白質が１Ｍの酢酸にさらされたとき
、安定である請求項１又は３記載の精製蛋白質。
【請求項８】　　蛋白質が１０ｍＭのジチオスレイトル
にさらされたとき、蛋白質が安定である請求項１又は３
記載の精製蛋白質。
【請求項９】　　ａ）無血清ベータ腫瘍細胞馴化培地を
濃縮し、ｂ）工程ａ）の馴化培地をバイオレックス（Ｂｉｏｒｅ
ｘ）カラムにかけ、ｃ）工程ｂ）から得られた活性画分を、フェニルセファ
ロース（Ｓｅｐｈａｒｏｓｅ）カラムにかけ、ｄ）工程
ｃ）から得られた活性画分を、ヘパリンアフィニティー
カラムにかけ、ｅ）工程ｄ）から得られた活性画分を、逆相カラムにか
け、ｆ）工程ｅ）から得られた活性画分を採取することを特
徴とする請求項１又は３記載の精製蛋白質の製造方法。
【請求項１０】　　製造された精製蛋白質が、約２．９
Ｘ１０７　Ｕ／ｍｇの比活性を有するものである請求項
９記載の方法。
【請求項１１】　　配列番号：１又は配列番号：２のア
ミノ酸配列を含むポリペプチド。
【請求項１２】　　天然型である請求項１又は３記載の
精製蛋白質。