JPH04169600A - 神経栄養活性抑制物質 - Google Patents
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Landscapes
- Medicines That Contain Protein Lipid Enzymes And Other Medicines (AREA)
- Peptides Or Proteins (AREA)
Abstract
(57)【要約】本公報は電子出願前の出願データであるた
め要約のデータは記録されません。
め要約のデータは記録されません。
Description
［０００１］
本発明は、新規で有用な蛋白に関するものであり、さら
に詳しくは、ヒト脳中に存在する神経栄養活性抑制作用
を有する蛋白質に関するものである。 ［０００２］
に詳しくは、ヒト脳中に存在する神経栄養活性抑制作用
を有する蛋白質に関するものである。 ［０００２］
高齢化社会の中で、老人性痴呆は、大きな関心を集め、
その予防と治療には、多くの努力が払われてきた。特に
、アルツハイマー（Ａｌｚｈｅｉｍｅｒ）病と言われる
老人性痴呆は、初老期（５０〜６０才）に来ることが多
く、その原因の究明と治療法の確立が急がれている。 現在までに得られた知見によれば、アルツハイマー病は
、老人斑、神経原線維変性などの病理学的特徴と、進行
性痴呆という臨床的特徴を有する器質性疾患であり、ニ
ューロンの代謝の光道や異常な再生が関与していると考
えられる。 ［０００３］ しかしながら、従来、このアルツハイマー病の有効な予
防法や治療法は、見出されておらず、その確立が要望さ
れている。 ［０００４］
その予防と治療には、多くの努力が払われてきた。特に
、アルツハイマー（Ａｌｚｈｅｉｍｅｒ）病と言われる
老人性痴呆は、初老期（５０〜６０才）に来ることが多
く、その原因の究明と治療法の確立が急がれている。 現在までに得られた知見によれば、アルツハイマー病は
、老人斑、神経原線維変性などの病理学的特徴と、進行
性痴呆という臨床的特徴を有する器質性疾患であり、ニ
ューロンの代謝の光道や異常な再生が関与していると考
えられる。 ［０００３］ しかしながら、従来、このアルツハイマー病の有効な予
防法や治療法は、見出されておらず、その確立が要望さ
れている。 ［０００４］
本発明の課題は、アルツハイマー病の治療に有効な新規
蛋白質である神経栄養活性抑制物資を提供することであ
る。 ［０００５］
蛋白質である神経栄養活性抑制物資を提供することであ
る。 ［０００５］
本発明者は、アルツハイマー病患者の脳中成分を研究す
る過程で、正常人の脳中には存在するが、アルツハイマ
ー病患者の脳には存在しなくなる新規な蛋白質であって
、神経栄養活性抑制作用があるものを見出し、この蛋白
質を取り出すことに成功した。 ［０００６］ すなわち、この蛋白質は、ヒト脳組織より抽出された抽
出液をそのまま、又は、濃縮したのち、限外口過、イオ
ン交換クロマトグラフィー ゲルろ過、高速液体クロマ
トグラフィーなどの操作を組合せて、具体的には、例え
ば、下記の実施例に示される手法により精製、採取する
ことができる。 ［０００７］ かくして得られた本発明の新規タンパク質は、以下の特
性を有する。 分子量 ： 約５，０００ （ＳＤＳ−ポリアクリル
アミドゲル電気泳動法による） 性状 ： 白色無定形粉末 安定ｐＨ範囲： ３．０〜７．７ 熱安定性 ： ３７℃で２０時間保温又は１００℃で５
分間加熱しても神経栄養活性抑制作用を保持する。 ［０００８］ 本発明の新規タンパク質の生理活性、すなわち、神経栄
養活性抑制作用は、下記試験例に示す方法で測定した。 ［０００９］ さらに、この新規蛋白質の全アミノ酸配列を、下記実施
例に示す方法により決定した。その結果、本物質は、下
記の全アミノ酸配列を有することがわかった。 ［００１０］ １１ｅｔ Ａｓｐ Ｐｒｏ Ｇｌｕ Ｔｈｒ
Ｃｙｓ Ｐｒｏ Ｃｙｓ Ｐｒｏ ５ｅｒＧ
ｌｙ Ｇｌｙ Ｓｅｒ Ｃｙｓ Ｔｈｒ Ｃｙｓ Ａｌ
ａ Ａｓｐ Ｓｅｒ ＣｙｓＬｙｓ Ｃｙｓ Ｇｌｕ
Ｇｌｙ Ｃｙｓ Ｌｙｓ Ｃｙｓ Ｔｈｒ Ｓｅｒ Ｃ
ｙｓＬｙｓ Ｌｙｓ Ｓｅｒ Ｃｙｓ Ｃｙｓ Ｓｅｒ
Ｃｙｓ Ｃｙｓ Ｐｒｏ ＡｌａＧｌｕ Ｃｙｓ Ｇ
ｌｕ Ｌｙｓ Ｃｙｓ Ａｌａ Ｌｙｓ Ａｓｐ Ｃｙ
ｓ Ｖａ１Ｃｙｓ Ｌｙｓ Ｇｌｙ Ｇｌｙ Ｇｌｕ
Ａｌａ Ａｌａ Ｇｌｕ Ａｌａ ＧｌｕＡｌａ Ｇｌ
ｕ Ｌｙｓ Ｃｙｓ Ｓｅｒ Ｃｙｓ Ｃｙｓ Ｇｉｎ
（配列表の配列番号１） ［００１１］ 下記試験例によっても示されるように、この新規な蛋白
質は、神経栄養活性抑制作用を示し、アルツハイマー病
の診断、予防又は治療に用いて有効な物質であることが
判る。 本発明者とその共同研究者は、さらに、この新規な蛋白
質の産生を司っている遺伝子を見出し、これを用いて、
遺伝子工学的な手法により、この新規蛋白質を大量に生
産し、これを用いることにより、アルツハイマー病の診
断、予防及び治療を行うことを考え、鋭意研究を行った
結果、この蛋白質をコードする遺伝子（全長ｃＤＮＡ）
を見出し、その核酸配列を決定することに成功しな。 ［００１２］ 本発明の物質をコードする遺伝子の分離と、その核酸配
列の決定は、例えば、下記実施例に具体的に示される方
法によって行うことができる。 ［００１３］ かくして決定された、ヒト脳中の神経栄養活性抑制物質
をコードするｃＤＮＡの核酸配列は次のとおりであった
。 ［００１４］ ＡＴＧ ＧＡＣＣＣＴ ＧＡＧ ＡＣＣＴＧＣＣＣＣＴ
ＧＣＣＣＴ ＴＣＴ ＧＧＴ ＧＧＣＴＣＣＴＧＣＡＣ
ＣＴＧＣ４８ＧＣＧ ＧＡＣＴＣＣＴＧＣＡＡＧ ＴＧ
ＣＧＡＧ ＧＧＡ ＴＧＣＡＡＡ ＴＧＣＡＣＣＴＣＣ
ＴＧＣＡＡＧ ＡＡＧ ９６ＡＧＣＴＧＣＴＧＣＴＣ
ＣＴＧＣＴＧＣＣＣＴ ＧＣＧ ＧＡＧ ＴＧＴ ＧＡ
Ｇ ＡＡＧ ＴＧＴ ＧＣＣＡＡＧ ＧＡＣ１４４ＴＧ
Ｔ ＧＴＧ ＴＧＣＡＡＡ ＧＧＣＧＧＡ ＧＡＧ Ｇ
ＣＡ ＧＣＴ ＧＡＧ ＧＣＡ ＧＡＡ ＧＣＡ ＧＡ
Ｇ ＡＡＧ ＴＧＣ１９２ＡＧＣＴＧＣＴＧＣＣＡＧ
２０４（配列表の配列番号２） ［００１５］
る過程で、正常人の脳中には存在するが、アルツハイマ
ー病患者の脳には存在しなくなる新規な蛋白質であって
、神経栄養活性抑制作用があるものを見出し、この蛋白
質を取り出すことに成功した。 ［０００６］ すなわち、この蛋白質は、ヒト脳組織より抽出された抽
出液をそのまま、又は、濃縮したのち、限外口過、イオ
ン交換クロマトグラフィー ゲルろ過、高速液体クロマ
トグラフィーなどの操作を組合せて、具体的には、例え
ば、下記の実施例に示される手法により精製、採取する
ことができる。 ［０００７］ かくして得られた本発明の新規タンパク質は、以下の特
性を有する。 分子量 ： 約５，０００ （ＳＤＳ−ポリアクリル
アミドゲル電気泳動法による） 性状 ： 白色無定形粉末 安定ｐＨ範囲： ３．０〜７．７ 熱安定性 ： ３７℃で２０時間保温又は１００℃で５
分間加熱しても神経栄養活性抑制作用を保持する。 ［０００８］ 本発明の新規タンパク質の生理活性、すなわち、神経栄
養活性抑制作用は、下記試験例に示す方法で測定した。 ［０００９］ さらに、この新規蛋白質の全アミノ酸配列を、下記実施
例に示す方法により決定した。その結果、本物質は、下
記の全アミノ酸配列を有することがわかった。 ［００１０］ １１ｅｔ Ａｓｐ Ｐｒｏ Ｇｌｕ Ｔｈｒ
Ｃｙｓ Ｐｒｏ Ｃｙｓ Ｐｒｏ ５ｅｒＧ
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Ａｌａ Ａｌａ Ｇｌｕ Ａｌａ ＧｌｕＡｌａ Ｇｌ
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（配列表の配列番号１） ［００１１］ 下記試験例によっても示されるように、この新規な蛋白
質は、神経栄養活性抑制作用を示し、アルツハイマー病
の診断、予防又は治療に用いて有効な物質であることが
判る。 本発明者とその共同研究者は、さらに、この新規な蛋白
質の産生を司っている遺伝子を見出し、これを用いて、
遺伝子工学的な手法により、この新規蛋白質を大量に生
産し、これを用いることにより、アルツハイマー病の診
断、予防及び治療を行うことを考え、鋭意研究を行った
結果、この蛋白質をコードする遺伝子（全長ｃＤＮＡ）
を見出し、その核酸配列を決定することに成功しな。 ［００１２］ 本発明の物質をコードする遺伝子の分離と、その核酸配
列の決定は、例えば、下記実施例に具体的に示される方
法によって行うことができる。 ［００１３］ かくして決定された、ヒト脳中の神経栄養活性抑制物質
をコードするｃＤＮＡの核酸配列は次のとおりであった
。 ［００１４］ ＡＴＧ ＧＡＣＣＣＴ ＧＡＧ ＡＣＣＴＧＣＣＣＣＴ
ＧＣＣＣＴ ＴＣＴ ＧＧＴ ＧＧＣＴＣＣＴＧＣＡＣ
ＣＴＧＣ４８ＧＣＧ ＧＡＣＴＣＣＴＧＣＡＡＧ ＴＧ
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Ｇ ＡＡＧ ＴＧＣ１９２ＡＧＣＴＧＣＴＧＣＣＡＧ
２０４（配列表の配列番号２） ［００１５］
上記した新規蛋白質は、アルツハイマー病の診断、治療
に役立ち、さらには、上記した、この蛋白質をコードす
るｃＤＮＡは、遺伝子工学的手法によりこの蛋白質の大
量生産を可能にする有用な遺伝子である。また、この遺
伝子は、アルツハイマー病の診断に有効であり、さらに
は、直接的に遺伝子を導入することによりアルツハイマ
ー病の治療に用いうろことが期待される。 ［００１６］ 以下、本発明を実施例に基づき、さらに詳しく説明する
。 ［００１７］ 実施例上 本物質の分離、精製 正常ヒト大脳皮質の灰白質２０ｇに水６０ｍ１を加え、
ホモジナイズし、２０゜０００ｇで１時間遠心した後、
遠心上清を５５ｍ１得た。 ［００１８］ 得られた上清５５ｍ１を、にアミコンＹＭ−１０膜（商
品名）を用いて限外ろ過し、分子量１０キロダルトン以
上の両分をＤＥＡＥ−セファセルカラム（１，６ｃｍφ
Ｘ１６ｃｍ、ファルマシア社製）にのせ、洗浄バッファ
ー（５０ｍＭ ＮａＣｌ２０ｍＭ Ｔｒ ｉ ５−
ＣＩ （ｐＨ７，６））２００ｍｌで洗浄後、５０ｍ
Ｍから３００ｍＭＮａｃｌの直線濃度勾配をつけた２０
ｍＭ Ｔｒ １ｓ−Ｃ１（ｐＨ７，６）バ・ソファ−
３２０ｍ１で抽出した。上記ＤＥＡＥ−セファセルカラ
ムによるクロマトグラムを図１に示す。フラクションＮ
ｏ、 ３１から３８までの抑制活性を有する分画を集め
（４０ｍ１） 、透析後フィコール４００を用いて濃縮
後ＴＳＫ Ｇ２０００ＳＷ（）−ソー社製）でゲルろ
過（カラムサイズ７．５ｍｍφｘ６ｃｍ）Ｌ、フラクシ
ョンＮｏ、 ３０から３２の活性画分を集め（２，５ｍ
１） ５ｍＭリン酸バッファー（ｐＨ７，４）中で
透析した。上記ＴＳＫ Ｇ２０００ＳＷを用いたゲル
ろ過クロマトグラフィーの結果を図２に示す。液量を５
５０μｍまで濃縮後、Ｃ１８逆相ＨＰＬＣカラム（４，
６ｍｍφＸ２５ｃｍ、センシュー化学社製）にかけた。 溶出には、０％から８０％アセトニトリルの直線勾配を
つけた５ｍＭギ酸アンモニウム溶液を用いた。このＣ１
８逆相ＨＰＬＣクロマトグラフイーの結果を図３に示す
。 図３に示されるように、Ｃ１８逆相ＨＰＬＣクロマトグ
ラフイーによりシャープなピークが実質的に１つだけ得
られ、本発明の物質が単離されたことカリつかる。 ［００１９］ 実施侃Ａ 特性測定 実施例１で得られた物質について下記の種々の特性を測
定した。 ［００２０］ （１）紫外部吸収スペクトル 実施例１で得られた物質３μｇの蒸留水溶液を用いて分
光光度計（ベックマン社製ＤＵ６５型）で紫外部吸収ス
ペクトルを測定した。結果を４図に示す。 ［００２１］ （２）安定性 実施例１で得られた物質を２０μｇ／ｍｌの水溶液に調
製し、その１０μｍにトリフルオロ酢酸を最終濃度０．
１％となるように加え（ｐＨ３，０） ３７℃で２０
時間加温した後、凍結乾燥しな。これを、ダルベコ社製
リン酸バッファー（ＰＢＳ （−））１０μｌに溶解し
、下記実施例３に示す方法で抑制活性を測定したが活性
の抑制活性の減少は全く認められなかった。さらに、実
施例１で得た物質の２μｇ／ｍｌ水溶液の１００ｐｌを
とり、３７℃で２０時間又は１００℃で５分加熱した後
、この溶液の１０μｌを用いて、前述と同様にして安定
性試、験を行なったところ、全く抑制活性の減少が認め
られなかった。 ［００２２］ （３）分子量 実施例１で得られた物質５μｇを水１０μｌに溶解し、
分子量マーカー（キモトリプシノーゲンＡ（分子量２，
５００）、チトクロムＣ（分子量１２，５００）、アプ
ロチニン（分子量６，５００）、バイオラッド社製）を
用いて、７．５％から２０％の濃度勾配のある５ＤＳ−
ポリアクリルアミドゲル電気泳動で測定した結果、分子
量的５，０００ダルトンであることが確認された。この
電気泳動の結果を図５に示す。 ［００２３］ 試験伝神経栄養活性抑制活性の測定 新生児ラットの大脳皮質より調製した細胞をゲラチンー
ポリオルイチンを塗布した６ｍｍのミクロプレートに１
．７Ｘ１０４個の細胞を撒き、実施例１と同様の方法で
得られたアルツハイマー病躯抽出液を１２５μｇ／ｍｌ
濃度に調製した水溶液１００μｌを含む無血清培地ＭＥ
ＭＮ２ （イーグル基本培地にインシュリン、トランス
フェリン、プトレシン、プロゲステロン、亜セレン酸ナ
トリウムを添加）に実施例１で得られた物質２０ｎｇを
加え、５日間５％炭酸ガス培養槽中、３７℃で培養した
。パラホルムアルデヒドと９０％メタノール７５％酢酸
溶液で固定した後、マイクロチュープル結合タンパク２
（ＭＡＰ２）抗体（アマ−ジャム社製）を使ったＥＬＩ
ＳＡでＭＡＰ２量を定量した。一方、本物質を加えない
でアルツハイマー病躯抽出液を加えて培養した時のＭＡ
ＰＺ量を定量し、ＭＡＰＺ量が何％減少するかによって
抑制活性を表わした。 ［００２４］ 上記方法を用いて、本物質の量と抑制率との関係を測定
した。結果を図６に示す。図６に示すように、抑制活性
は、本物質０．２μｇ／ｍｌ濃度で平衡となり、その抑
制活性は約９０％であった。 ［００２５］ 実施（、ｌｆｌ ３ アミノ酸配列の分析実施例１で
得られた物質２００μｇを、常法によりピリジルエチル
化な。ピリジルエチル化した本物質５０μｇを常法によ
り臭化シアン分解した。ピリジルエチル化した本物質を
Ｏ，ＩＭ Ｔｒ ｉ ｓ −ＣＩ （ｐＨ８，０）溶
液１００μｌに溶解し、ＴＰＣＫ−）リプシン（シグマ
社製）またはｅｎｄｏｐｒｏｔｅｉｎａｓｅ Ａ ｓ
ｐ −Ｎ （ベーリンガー社製）またはＳ、 ａｕｒｅ
ｕｓ Ｖ８ ｐｒｏｔｅａｓｅ （シグマ社製）０
．５μｇを加え、３７℃、５時間反応させた。以上の４
種類の方法を用いて得られたペプチド断片をそれぞれＣ
１８逆相ＨＰＬＣ（０〜８０％アセトニトリル１０．１
％トリフルオロ酢酸溶液）で分離し、タンパクシークエ
ンサー（アプライドバイオシステム社４７７Ａ型）にか
けて分析し、得られたピークの保持時間と標準物質のそ
れを比較解読して本物質の全アミノ酸配列を決定した。 その結果、本物質は下記の全アミノ酸配列を有すること
がわかった。 Ｍｅｔ Ａｓｐ Ｐｒｏ Ｇｌｕ Ｔｈｒ Ｃｙｓ Ｐ
ｒｏ Ｃｙｓ Ｐｒｏ ５ｅｒＧｌｙ Ｇｌｙ Ｓｅｒ
Ｃｙｓ Ｔｈｒ Ｃｙｓ Ａｌａ Ａｓｐ Ｓｅｒ
ＣｙｓＬｙｓ Ｃｙｓ Ｇｌｕ Ｇｌｙ Ｃｙｓ Ｌｙ
ｓ Ｃｙｓ Ｔｈｒ Ｓｅｒ ＣｙｓＬｙｓ Ｌｙｓ
Ｓｅｒ Ｃｙｓ Ｃｙｓ Ｓｅｒ Ｃｙｓ Ｃｙｓ Ｐ
ｒｏ ＡｌａＧｌｕ Ｃｙｓ Ｇｌｕ Ｌｙｓ Ｃｙｓ
Ａｌａ Ｌｙｓ Ａｓｐ Ｃｙｓ Ｖａ１Ｃｙｓ Ｌ
ｙｓ Ｇｌｙ Ｇｌｙ Ｇｌｕ Ａｌａ Ａｌａ Ｇｌ
ｕ Ａｌａ Ｇｌｕ６１ 、 ６５
６８Ａｌａ Ｇｌｕ Ｌｙｓ Ｃｙｓ Ｓｅ
ｒ Ｃｙｓ Ｃｙｓ Ｇｌｎ［００２６］ 参考似よ 本遺伝子の分離 ヒト脳から抽出された神経栄養活性抑制物質のアミノ酸
配列をもとに５ ’ ＡＴＧＧＡＴＣＣＣＧＡＧＡＣＣ
ＴＧＣＣＣ，５’ＣＴＧＧＣＡＧＣＡＧＣＴＧＣＡＣＴ
ＴＣＴＣの２つのオリゴヌクレオチドを合成しこれらを
プライマーとして、ヒト大脳より調製したメツセンジャ
ーＲＮＡを鋳型にして、逆転写酵素によりｃＤＮＡとし
た後、ポリメレース連鎖反応を行いその反応生成物をプ
ラスミドベクターｐＵＣ１９にサブクローン化し、その
塩基配列を決定し、これが神経栄養活性抑制物質のアミ
ノ酸配列と対応することを確認した。 ［００２７］ 正常ヒト大脳のメツセンジャーＲＮＡに対して作られた
ｃＤＮＡライブラリーを用いて、１×１０６個のクロー
ンをプレートに生育させ、ニトロセルロース膜に転写し
、上記のサブクローン化された核酸配列を３２Ｐ でラ
ベルしてプローブを作製しこれを５０％ホルムアミド、
５ Ｘ Ｓ Ｓ Ｃ（０，１５Ｍ ＮａＣ１，１５ｍＭ
クエン酸ナトリウム、ｐＨ７，０）を含むハイブリダイ
ゼーション液中で４２℃にて１８時間、上記ニトロセル
ロース膜にハイブリッド形成させ、その後フィルターを
洗浄し最終的に５５℃でＯ，ＬＸ ＳＳＣ（０，１５
ＭＮａＣ１，０，１５ｍＭクエン酸ナトリウム、ｐＨ７
，０）オートラジオグラフィーを行い上記プローブに対
して特異的なｃＤＮＡを２４個単離した。このｃＤＮＡ
の塩基配列を決定したところ６８個のアミノ酸をコード
する核酸配列の存在が見出された。 ［００２８］ 参考例え それぞれメツセンジャーＲＮＡを抽出し、その２マイク
ログラムを変性アガロースゲル中で電気泳動を行い、そ
の後ニトロセルロース膜に転写し、上記ｃＤＮＡをプロ
ーブとして上記と同様のハイブリダイゼーション液中で
４２℃で１８時間ハイブリッド形成を行い、その後フィ
ルターを洗浄し、最終的に０．ｌＸ５ＳＣ，０，１％Ｓ
ＤＳ中で６５℃で洗浄し、オートラジオグラフィーを行
った。 その結果アルツハイマー病、正常脳において、ともに約
５００ｂｐの大きさのメツセンジャーＲＮＡが認められ
、アルツハイマー病においてこのメツセンジャーＲＮＡ
の量が減少していることが見いだされた。
に役立ち、さらには、上記した、この蛋白質をコードす
るｃＤＮＡは、遺伝子工学的手法によりこの蛋白質の大
量生産を可能にする有用な遺伝子である。また、この遺
伝子は、アルツハイマー病の診断に有効であり、さらに
は、直接的に遺伝子を導入することによりアルツハイマ
ー病の治療に用いうろことが期待される。 ［００１６］ 以下、本発明を実施例に基づき、さらに詳しく説明する
。 ［００１７］ 実施例上 本物質の分離、精製 正常ヒト大脳皮質の灰白質２０ｇに水６０ｍ１を加え、
ホモジナイズし、２０゜０００ｇで１時間遠心した後、
遠心上清を５５ｍ１得た。 ［００１８］ 得られた上清５５ｍ１を、にアミコンＹＭ−１０膜（商
品名）を用いて限外ろ過し、分子量１０キロダルトン以
上の両分をＤＥＡＥ−セファセルカラム（１，６ｃｍφ
Ｘ１６ｃｍ、ファルマシア社製）にのせ、洗浄バッファ
ー（５０ｍＭ ＮａＣｌ２０ｍＭ Ｔｒ ｉ ５−
ＣＩ （ｐＨ７，６））２００ｍｌで洗浄後、５０ｍ
Ｍから３００ｍＭＮａｃｌの直線濃度勾配をつけた２０
ｍＭ Ｔｒ １ｓ−Ｃ１（ｐＨ７，６）バ・ソファ−
３２０ｍ１で抽出した。上記ＤＥＡＥ−セファセルカラ
ムによるクロマトグラムを図１に示す。フラクションＮ
ｏ、 ３１から３８までの抑制活性を有する分画を集め
（４０ｍ１） 、透析後フィコール４００を用いて濃縮
後ＴＳＫ Ｇ２０００ＳＷ（）−ソー社製）でゲルろ
過（カラムサイズ７．５ｍｍφｘ６ｃｍ）Ｌ、フラクシ
ョンＮｏ、 ３０から３２の活性画分を集め（２，５ｍ
１） ５ｍＭリン酸バッファー（ｐＨ７，４）中で
透析した。上記ＴＳＫ Ｇ２０００ＳＷを用いたゲル
ろ過クロマトグラフィーの結果を図２に示す。液量を５
５０μｍまで濃縮後、Ｃ１８逆相ＨＰＬＣカラム（４，
６ｍｍφＸ２５ｃｍ、センシュー化学社製）にかけた。 溶出には、０％から８０％アセトニトリルの直線勾配を
つけた５ｍＭギ酸アンモニウム溶液を用いた。このＣ１
８逆相ＨＰＬＣクロマトグラフイーの結果を図３に示す
。 図３に示されるように、Ｃ１８逆相ＨＰＬＣクロマトグ
ラフイーによりシャープなピークが実質的に１つだけ得
られ、本発明の物質が単離されたことカリつかる。 ［００１９］ 実施侃Ａ 特性測定 実施例１で得られた物質について下記の種々の特性を測
定した。 ［００２０］ （１）紫外部吸収スペクトル 実施例１で得られた物質３μｇの蒸留水溶液を用いて分
光光度計（ベックマン社製ＤＵ６５型）で紫外部吸収ス
ペクトルを測定した。結果を４図に示す。 ［００２１］ （２）安定性 実施例１で得られた物質を２０μｇ／ｍｌの水溶液に調
製し、その１０μｍにトリフルオロ酢酸を最終濃度０．
１％となるように加え（ｐＨ３，０） ３７℃で２０
時間加温した後、凍結乾燥しな。これを、ダルベコ社製
リン酸バッファー（ＰＢＳ （−））１０μｌに溶解し
、下記実施例３に示す方法で抑制活性を測定したが活性
の抑制活性の減少は全く認められなかった。さらに、実
施例１で得た物質の２μｇ／ｍｌ水溶液の１００ｐｌを
とり、３７℃で２０時間又は１００℃で５分加熱した後
、この溶液の１０μｌを用いて、前述と同様にして安定
性試、験を行なったところ、全く抑制活性の減少が認め
られなかった。 ［００２２］ （３）分子量 実施例１で得られた物質５μｇを水１０μｌに溶解し、
分子量マーカー（キモトリプシノーゲンＡ（分子量２，
５００）、チトクロムＣ（分子量１２，５００）、アプ
ロチニン（分子量６，５００）、バイオラッド社製）を
用いて、７．５％から２０％の濃度勾配のある５ＤＳ−
ポリアクリルアミドゲル電気泳動で測定した結果、分子
量的５，０００ダルトンであることが確認された。この
電気泳動の結果を図５に示す。 ［００２３］ 試験伝神経栄養活性抑制活性の測定 新生児ラットの大脳皮質より調製した細胞をゲラチンー
ポリオルイチンを塗布した６ｍｍのミクロプレートに１
．７Ｘ１０４個の細胞を撒き、実施例１と同様の方法で
得られたアルツハイマー病躯抽出液を１２５μｇ／ｍｌ
濃度に調製した水溶液１００μｌを含む無血清培地ＭＥ
ＭＮ２ （イーグル基本培地にインシュリン、トランス
フェリン、プトレシン、プロゲステロン、亜セレン酸ナ
トリウムを添加）に実施例１で得られた物質２０ｎｇを
加え、５日間５％炭酸ガス培養槽中、３７℃で培養した
。パラホルムアルデヒドと９０％メタノール７５％酢酸
溶液で固定した後、マイクロチュープル結合タンパク２
（ＭＡＰ２）抗体（アマ−ジャム社製）を使ったＥＬＩ
ＳＡでＭＡＰ２量を定量した。一方、本物質を加えない
でアルツハイマー病躯抽出液を加えて培養した時のＭＡ
ＰＺ量を定量し、ＭＡＰＺ量が何％減少するかによって
抑制活性を表わした。 ［００２４］ 上記方法を用いて、本物質の量と抑制率との関係を測定
した。結果を図６に示す。図６に示すように、抑制活性
は、本物質０．２μｇ／ｍｌ濃度で平衡となり、その抑
制活性は約９０％であった。 ［００２５］ 実施（、ｌｆｌ ３ アミノ酸配列の分析実施例１で
得られた物質２００μｇを、常法によりピリジルエチル
化な。ピリジルエチル化した本物質５０μｇを常法によ
り臭化シアン分解した。ピリジルエチル化した本物質を
Ｏ，ＩＭ Ｔｒ ｉ ｓ −ＣＩ （ｐＨ８，０）溶
液１００μｌに溶解し、ＴＰＣＫ−）リプシン（シグマ
社製）またはｅｎｄｏｐｒｏｔｅｉｎａｓｅ Ａ ｓ
ｐ −Ｎ （ベーリンガー社製）またはＳ、 ａｕｒｅ
ｕｓ Ｖ８ ｐｒｏｔｅａｓｅ （シグマ社製）０
．５μｇを加え、３７℃、５時間反応させた。以上の４
種類の方法を用いて得られたペプチド断片をそれぞれＣ
１８逆相ＨＰＬＣ（０〜８０％アセトニトリル１０．１
％トリフルオロ酢酸溶液）で分離し、タンパクシークエ
ンサー（アプライドバイオシステム社４７７Ａ型）にか
けて分析し、得られたピークの保持時間と標準物質のそ
れを比較解読して本物質の全アミノ酸配列を決定した。 その結果、本物質は下記の全アミノ酸配列を有すること
がわかった。 Ｍｅｔ Ａｓｐ Ｐｒｏ Ｇｌｕ Ｔｈｒ Ｃｙｓ Ｐ
ｒｏ Ｃｙｓ Ｐｒｏ ５ｅｒＧｌｙ Ｇｌｙ Ｓｅｒ
Ｃｙｓ Ｔｈｒ Ｃｙｓ Ａｌａ Ａｓｐ Ｓｅｒ
ＣｙｓＬｙｓ Ｃｙｓ Ｇｌｕ Ｇｌｙ Ｃｙｓ Ｌｙ
ｓ Ｃｙｓ Ｔｈｒ Ｓｅｒ ＣｙｓＬｙｓ Ｌｙｓ
Ｓｅｒ Ｃｙｓ Ｃｙｓ Ｓｅｒ Ｃｙｓ Ｃｙｓ Ｐ
ｒｏ ＡｌａＧｌｕ Ｃｙｓ Ｇｌｕ Ｌｙｓ Ｃｙｓ
Ａｌａ Ｌｙｓ Ａｓｐ Ｃｙｓ Ｖａ１Ｃｙｓ Ｌ
ｙｓ Ｇｌｙ Ｇｌｙ Ｇｌｕ Ａｌａ Ａｌａ Ｇｌ
ｕ Ａｌａ Ｇｌｕ６１ 、 ６５
６８Ａｌａ Ｇｌｕ Ｌｙｓ Ｃｙｓ Ｓｅ
ｒ Ｃｙｓ Ｃｙｓ Ｇｌｎ［００２６］ 参考似よ 本遺伝子の分離 ヒト脳から抽出された神経栄養活性抑制物質のアミノ酸
配列をもとに５ ’ ＡＴＧＧＡＴＣＣＣＧＡＧＡＣＣ
ＴＧＣＣＣ，５’ＣＴＧＧＣＡＧＣＡＧＣＴＧＣＡＣＴ
ＴＣＴＣの２つのオリゴヌクレオチドを合成しこれらを
プライマーとして、ヒト大脳より調製したメツセンジャ
ーＲＮＡを鋳型にして、逆転写酵素によりｃＤＮＡとし
た後、ポリメレース連鎖反応を行いその反応生成物をプ
ラスミドベクターｐＵＣ１９にサブクローン化し、その
塩基配列を決定し、これが神経栄養活性抑制物質のアミ
ノ酸配列と対応することを確認した。 ［００２７］ 正常ヒト大脳のメツセンジャーＲＮＡに対して作られた
ｃＤＮＡライブラリーを用いて、１×１０６個のクロー
ンをプレートに生育させ、ニトロセルロース膜に転写し
、上記のサブクローン化された核酸配列を３２Ｐ でラ
ベルしてプローブを作製しこれを５０％ホルムアミド、
５ Ｘ Ｓ Ｓ Ｃ（０，１５Ｍ ＮａＣ１，１５ｍＭ
クエン酸ナトリウム、ｐＨ７，０）を含むハイブリダイ
ゼーション液中で４２℃にて１８時間、上記ニトロセル
ロース膜にハイブリッド形成させ、その後フィルターを
洗浄し最終的に５５℃でＯ，ＬＸ ＳＳＣ（０，１５
ＭＮａＣ１，０，１５ｍＭクエン酸ナトリウム、ｐＨ７
，０）オートラジオグラフィーを行い上記プローブに対
して特異的なｃＤＮＡを２４個単離した。このｃＤＮＡ
の塩基配列を決定したところ６８個のアミノ酸をコード
する核酸配列の存在が見出された。 ［００２８］ 参考例え それぞれメツセンジャーＲＮＡを抽出し、その２マイク
ログラムを変性アガロースゲル中で電気泳動を行い、そ
の後ニトロセルロース膜に転写し、上記ｃＤＮＡをプロ
ーブとして上記と同様のハイブリダイゼーション液中で
４２℃で１８時間ハイブリッド形成を行い、その後フィ
ルターを洗浄し、最終的に０．ｌＸ５ＳＣ，０，１％Ｓ
ＤＳ中で６５℃で洗浄し、オートラジオグラフィーを行
った。 その結果アルツハイマー病、正常脳において、ともに約
５００ｂｐの大きさのメツセンジャーＲＮＡが認められ
、アルツハイマー病においてこのメツセンジャーＲＮＡ
の量が減少していることが見いだされた。
［００２９］
配列番号：１
配列の長さ：６８
配列の型ニアミノ酸
トポロジー：直鎖状
（ただし、高次構造は直鎖ではない複雑な構造をしてい
る配列の種類：ペプチド（蛋白） 起源：ヒト脳組織抽出物 配列： Ｍｅｔ Ａｓｐ Ｐｒｏ Ｇｌｕ Ｔｈｒ Ｃｙｓ Ｐ
ｒｏ Ｃｙｓ Ｐｒｏ ＳｅｒＧｌｙ Ｇｌｙ Ｓｅｒ
Ｃｙｓ Ｔｈｒ Ｃｙｓ Ａｌａ Ａｓｐ Ｓｅｒ
ＣｙｓＬｙｓ Ｃｙｓ Ｇｌｕ Ｇｌｙ Ｃｙｓ Ｌｙ
ｓ Ｃｙｓ Ｔｈｒ Ｓｅｒ ＣｙｓＬｙｓ Ｌｙｓ
Ｓｅｒ Ｃｙｓ Ｃｙｓ Ｓｅｒ Ｃｙｓ Ｃｙｓ Ｐ
ｒｏ ＡｌａＧｌｕ Ｃｙｓ Ｇｌｕ Ｌｙｓ Ｃｙｓ
Ａｌａ Ｌｙｓ Ａｓｐ Ｃｙｓ Ｖａ１Ｃｙｓ Ｌ
ｙｓ Ｇｌｙ Ｇｌｙ Ｇｌｕ Ａｌａ Ａｌａ Ｇｌ
ｕ Ａｌａ ＧｌｕＡｌａ Ｇｌｕ Ｌｙｓ Ｃｙｓ
Ｓｅｒ Ｃｙｓ Ｃｙｓ Ｇｌｎ［００３０］ 配列番号：２ 配列の長さ：２０４ 配列の型：核酸 鎖の数ニー本鎖 トポロジー：直鎖状 配列の種類：ｃＤＮＡ ｔｏ ｍｅｓｓｅｎｇｅｒ
ＲＮＡ起源：ヒト大脳 配列： ＡＴＧ ＧＡＣＣＣＴ ＧＡＧ ＡＣＣＴＧＣＣＣＣＴ
ＧＣＣＣＴ ＴＣＴ ＧＧＴ ＧＧＣＴＣＣＴＧＣＡＣ
ＣＴＧＣＧＣＧ ＧＡＣＴＣＣＴＧＣＡＡＧ ＴＧＣＧ
ＡＧ ＧＧＡ ＴＧＣＡＡＡ ＴＧＣＡＣＣＴＣＣＴＧ
ＣＡＡＧ ＡＡＧＡＧＣＴＧＣＴＧＣＴＣＣＴＧＣＴＧ
ＣＣＣＴ ＧＣＧ ＧＡＧ ＴＧＴ ＧＡＧ ＡＡＧ
ＴＧＴ ＧＣＣＡＡＧ ＧＡＣＴＧＴ ＧＴＧ ＴＧＣ
ＡＡＡ ＧＧＣＧＧＡ ＧＡＧ ＧＣＡ ＧＣＴ ＧＡ
Ｇ ＧＣＡ ＧＡＡ ＧＣＡ ＧＡＧ ＡＡＧ ＴＧＣ
ＡＧＣＴＧＣＴＧＣＣＡＧ ［００３１］
る配列の種類：ペプチド（蛋白） 起源：ヒト脳組織抽出物 配列： Ｍｅｔ Ａｓｐ Ｐｒｏ Ｇｌｕ Ｔｈｒ Ｃｙｓ Ｐ
ｒｏ Ｃｙｓ Ｐｒｏ ＳｅｒＧｌｙ Ｇｌｙ Ｓｅｒ
Ｃｙｓ Ｔｈｒ Ｃｙｓ Ａｌａ Ａｓｐ Ｓｅｒ
ＣｙｓＬｙｓ Ｃｙｓ Ｇｌｕ Ｇｌｙ Ｃｙｓ Ｌｙ
ｓ Ｃｙｓ Ｔｈｒ Ｓｅｒ ＣｙｓＬｙｓ Ｌｙｓ
Ｓｅｒ Ｃｙｓ Ｃｙｓ Ｓｅｒ Ｃｙｓ Ｃｙｓ Ｐ
ｒｏ ＡｌａＧｌｕ Ｃｙｓ Ｇｌｕ Ｌｙｓ Ｃｙｓ
Ａｌａ Ｌｙｓ Ａｓｐ Ｃｙｓ Ｖａ１Ｃｙｓ Ｌ
ｙｓ Ｇｌｙ Ｇｌｙ Ｇｌｕ Ａｌａ Ａｌａ Ｇｌ
ｕ Ａｌａ ＧｌｕＡｌａ Ｇｌｕ Ｌｙｓ Ｃｙｓ
Ｓｅｒ Ｃｙｓ Ｃｙｓ Ｇｌｎ［００３０］ 配列番号：２ 配列の長さ：２０４ 配列の型：核酸 鎖の数ニー本鎖 トポロジー：直鎖状 配列の種類：ｃＤＮＡ ｔｏ ｍｅｓｓｅｎｇｅｒ
ＲＮＡ起源：ヒト大脳 配列： ＡＴＧ ＧＡＣＣＣＴ ＧＡＧ ＡＣＣＴＧＣＣＣＣＴ
ＧＣＣＣＴ ＴＣＴ ＧＧＴ ＧＧＣＴＣＣＴＧＣＡＣ
ＣＴＧＣＧＣＧ ＧＡＣＴＣＣＴＧＣＡＡＧ ＴＧＣＧ
ＡＧ ＧＧＡ ＴＧＣＡＡＡ ＴＧＣＡＣＣＴＣＣＴＧ
ＣＡＡＧ ＡＡＧＡＧＣＴＧＣＴＧＣＴＣＣＴＧＣＴＧ
ＣＣＣＴ ＧＣＧ ＧＡＧ ＴＧＴ ＧＡＧ ＡＡＧ
ＴＧＴ ＧＣＣＡＡＧ ＧＡＣＴＧＴ ＧＴＧ ＴＧＣ
ＡＡＡ ＧＧＣＧＧＡ ＧＡＧ ＧＣＡ ＧＣＴ ＧＡ
Ｇ ＧＣＡ ＧＡＡ ＧＣＡ ＧＡＧ ＡＡＧ ＴＧＣ
ＡＧＣＴＧＣＴＧＣＣＡＧ ［００３１］
【図１】
正常ヒト大脳皮質をホモジナイズして限外ろ過し、分子
量１０キロダルトン以上の画分をＤＥＡＥ−セファセル
カラムにかけたクロマトグラムである。
量１０キロダルトン以上の画分をＤＥＡＥ−セファセル
カラムにかけたクロマトグラムである。
【図２】
本発明の物質（蛋白質）の精製過程において、抑制活性
を有するフラクションをゲルろ過したクロマトグラムで
ある。
を有するフラクションをゲルろ過したクロマトグラムで
ある。
【図３】
本発明の物質をＣ１８逆相ＨＰＬＣにかけたクロマトグ
ラムである。
ラムである。
【図４】
本発明の物質の紫外部吸収スペクトル図である。
【図５】
本発明の物質の５ＤＳ−ＰＡＧＥの泳動パターンを示す
図である。
図である。
【図６】
本発明の物質の量と抑制率との関係を示す図である。
【図７】
ヒト神経栄養活性抑制物質ｃＤＮＡをプローブとしたノ
ーザン解析の結果を示す。アルツハイマー病において神
経栄養活性抑制物質のメツセンジャーＲＮＡ量が減少し
ていることを示す、クロマトグラムである。
ーザン解析の結果を示す。アルツハイマー病において神
経栄養活性抑制物質のメツセンジャーＲＮＡ量が減少し
ていることを示す、クロマトグラムである。
【図１】
図面
【図２】
【図３】
【図４】
【図５】
【図６】
【図７】
Claims (4)
- 【請求項１】ヒト脳中に存在し、神経栄養活性抑制作用
を有する蛋白である神経栄養活性抑制物質。 - 【請求項２】下記の特性、すなわち、 分子量：約５，０００（ＳＤＳ−ポリアクリルアミドゲ
ル電気泳動法による） 性状：白色無定形粉末 安定ｐＨ範囲：３．０〜７．７ 熱安定性：３７℃で２０時間保温後も安定１００℃で５
時間加熱後も安定 を有する請求項１記載の物質。 - 【請求項３】 Ａｓｐ Ｃｙｓ Ｖａｌ Ｃｙｓ Ｌｙｓ Ｇｌｙ Ｇ
ｌｙ Ｇｌｕ Ａｌａ Ａｌａ Ｇｌｕ Ａｌａ Ｇｌ
ｕ Ａｌａ Ｇｌｕ Ｌｙｓ Ｃｙｓ Ｓｅｒ Ｃｙｓ
Ｃｙｓ Ｇｌｎなる部分アミノ酸配列を有する請求項
１または２記載の物質。 - 【請求項４】 【遺伝子配列があります】 【遺伝子配列があります】 なる全アミノ酸配列を有する請求項１〜３のいずれか１
項記載の物質。
Priority Applications (4)
| Application Number | Priority Date | Filing Date | Title |
|---|---|---|---|
| US07/696,051 US5214031A (en) | 1990-05-09 | 1991-05-06 | Growth-inhibitory factor obtained from human brain |
| DE69121964T DE69121964T2 (de) | 1990-05-09 | 1991-05-07 | Wachstumsinhibierender Faktor und für den wachstumsinhibierenden Faktor kodierender cDNS |
| AT91401221T ATE142643T1 (de) | 1990-05-09 | 1991-05-07 | Wachstumsinhibierender faktor und für den wachstumsinhibierenden faktor kodierender cdns |
| EP91401221A EP0458673B1 (en) | 1990-05-09 | 1991-05-07 | Growth-inhibitory factor and cDNA coding for growth inhibitory factor |
Applications Claiming Priority (2)
| Application Number | Priority Date | Filing Date | Title |
|---|---|---|---|
| JP2-279371 | 1990-10-19 | ||
| JP27937190 | 1990-10-19 |
Publications (2)
| Publication Number | Publication Date |
|---|---|
| JPH04169600A true JPH04169600A (ja) | 1992-06-17 |
| JP2904935B2 JP2904935B2 (ja) | 1999-06-14 |
Family
ID=17610222
Family Applications (1)
| Application Number | Title | Priority Date | Filing Date |
|---|---|---|---|
| JP2410164A Expired - Fee Related JP2904935B2 (ja) | 1990-05-09 | 1990-12-13 | 神経栄養活性抑制物質 |
Country Status (1)
| Country | Link |
|---|---|
| JP (1) | JP2904935B2 (ja) |
Cited By (4)
| Publication number | Priority date | Publication date | Assignee | Title |
|---|---|---|---|---|
| US5534615A (en) * | 1994-04-25 | 1996-07-09 | Genentech, Inc. | Cardiac hypertrophy factor and uses therefor |
| US5571675A (en) * | 1994-04-25 | 1996-11-05 | Genentech, Inc. | Detection and amplification of candiotrophin-1(cardiac hypertrophy factor) |
| US6472585B1 (en) | 1994-04-25 | 2002-10-29 | Genentech, Inc. | Cardiotrophin-1 defective mouse |
| US7258983B2 (en) | 1994-04-25 | 2007-08-21 | Genentech, Inc. | Cardiotrophin-1 compositions and methods for the treatment of tumor |
-
1990
- 1990-12-13 JP JP2410164A patent/JP2904935B2/ja not_active Expired - Fee Related
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| Publication number | Priority date | Publication date | Assignee | Title |
|---|---|---|---|---|
| US5534615A (en) * | 1994-04-25 | 1996-07-09 | Genentech, Inc. | Cardiac hypertrophy factor and uses therefor |
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| US6472585B1 (en) | 1994-04-25 | 2002-10-29 | Genentech, Inc. | Cardiotrophin-1 defective mouse |
| US7258983B2 (en) | 1994-04-25 | 2007-08-21 | Genentech, Inc. | Cardiotrophin-1 compositions and methods for the treatment of tumor |
Also Published As
| Publication number | Publication date |
|---|---|
| JP2904935B2 (ja) | 1999-06-14 |
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