JP3172530B2

JP3172530B2 - 神経栄養活性抑制物質をコードするｄｎａおよびその用途

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Publication number: JP3172530B2
Application number: JP50176392A
Authority: JP
Inventors: 省次辻; 正宮武; 洋子内田; 康夫井原
Original assignee: Takeda Pharmaceutical Co Ltd
Current assignee: Takeda Pharmaceutical Co Ltd
Priority date: 1990-12-13
Filing date: 1991-12-13
Publication date: 2001-06-04
Anticipated expiration: 2016-06-04
Also published as: EP0567645B1; EP0567645A1; CA2077350A1; EP0567645A4; ATE178941T1; WO1992010568A1; US5489514A; DE69131140T2; DE69131140D1

Description

【発明の詳細な説明】［技術分野］本発明は、神経栄養活性抑制作用を有する蛋白質（以
下GIFという）をコードするDNA、該DNAを含む組換えベ
クター、該ベクターを保持する形質転換体および該形質
転換体を培地に培養することを特徴とするGIFの製造法
である。さらに本発明は、GIF遺伝子のプロモーター領
域を有する組換えDNA、および該組換えDNAを含む組換え
ベクターならびに該組換えベクターを保持する形質転換
体に関する。

［背景技術］高齢化社会の中で、老人性痴呆は、大きな関心を集
め、その予防と治療には、多くの努力が払われてきた。
特に、アルツハイマー（Alzheimer）病と言われる老人
性痴呆は、初老期（50〜60才）に来ることが多く、その
原因の究明と治療法の確立が急がれている。

現在までに得られた知見によれば、アルツハイマー病
は、老人斑、神経原線維変性などの病理学的特徴と、進
行性痴呆という臨床的特徴を有する器質性疾患であり、
ニューロンの代謝の亢進や異常な再生が関与していると
考えられている。

しかしながら、従来、アルツハイマー病の有効な予防
法や治療法は、見出されておらず、その確立が要望され
ている。

［発明の開示］本発明の課題は、アルツハイマー病の遺伝子診断に役
立つこと、および該疾患の治療に有効な新規蛋白質であ
るGIFの製造と、製造に有用な該蛋白質をコードする遺
伝子を提供することである。さらに本発明は、該疾患の
治療薬の開発に有用なGIF遺伝子のプロモーター領域も
提供する。

本発明者らの一人は、アルツハイマー病患者の脳中成
分を研究する過程で、正常人の脳中には存在するが、ア
ルツハイマー病患者の脳には存在しなくなる新規な蛋白
質であって、神経栄養活性抑制作用があるものを見出
し、この蛋白質GIFを取り出すことに成功した。

すなわち、この蛋白質は、ヒト脳組織より抽出された
抽出液をそのまま、又は、濃縮したのち、限外ろ過、イ
オン交換クロマトグラフィー、ゲルろ過、高速液体クロ
マトグラフィーなどの操作を組合せて、具体的には、例
えば、下記の実施例に示される手法により精製、採取す
ることができる。

かくして得られた本発明の新規蛋白質GIFは、以下の
特性を有する。

分子量 :約5,000（SDS−ポリアクリルアミドゲル電
気泳動法による）性状 :白色無定形粉末安定pH範囲:3.0〜7.7 熱安定性 :37℃で20時間保温又は100℃で５分間加熱し
ても神経栄養活性抑制作用を保持する。

本発明の新規蛋白質GIFの生理活性、すなち、神経栄
養活性抑制作用は、下記試験例に示す方法で測定した。

さらに、この新規蛋白質GIFの全アミノ酸配列を、下
記実施例に示す方法により決定した。その結果、本物質
は、下記の全アミノ酸配列を有することがわかった。

配列の長さ:68 配列の型：アミノ酸トポロジー：直鎖状（ただし、高次製造は直鎖ではない
複雑な構造をしている）配列の種類：ペプチド（蛋白）起源：ヒト脳組織抽出物配列：下記試験例によっても示されるように、この新規な蛋
白質GIFは、神経栄養活性抑制作用を示し、アルツハイ
マー病の診断、予防又は治療に用いて有効な物質である
ことが判るが、この物質は、ヒト脳中に存在する微量物
質であるため、このままでは、これを実際的に利用する
ことはできない。

そこで、本発明者らは、この新規な蛋白質の産生を司
っている遺伝子を見出し、これを用いて、遺伝子工学的
な手法により、この新規蛋白質GIFを大量に生産し、こ
れを用いることにより、アルツハイマー病の診断、予防
及び治療を行なうことを考え、鋭意研究を行なった結
果、この蛋白質をコードする遺伝子（全長DNA）を見出
し、そのDNAの塩基配列を決定することに成功した。

本発明の遺伝子の分離と、その塩基配列の決定は、例
えば、下記実施例に具体的に示す方法によって行なうこ
とができる。

かくして決定された、ヒト脳中のGIFをコードするDNA
の塩基配列は次のとおりであった。

上記DNAを用いて、組換えベクターを作製し、これを
宿主に導入して形質転換体を作製する方法を以下に詳述
する。

DNAをプラスミドに組み込む方法としては、例えば、
T.Maniatisら、モレキュラー・クローニング（Molecula
r Cloning）コールド・スプリング・ハーバー・ラボラ
トリー（Cold Spring Harbor Laboratory）239（1982）
に記載の方法などが挙げられる。

クローン化された遺伝子は、発現に適したビークル
（ベクター）中のプロモーターの下流に連結して発現型
組換えベクターを得ることができる。

ベクターとしては、大腸菌由来プラスミド（例えば、
pBR322、pBR325、pUC12、pUC13）、枯草菌由来プラスミ
ド（例えば、pUB110、pTP5、pC194）、酵母由来プラス
ミド（例えば、pSH19、pSH15）、あるいはλファージな
どのバクテリオファージおよびレトロウイルス、ワクシ
ニアウイルスなどの動物ウイルスなどが挙げられる。

該遺伝子はその５′末端に翻訳開始コドンとしてのAT
Gを有し、また３′末端には翻訳終止コドンとしてのTA
A、TGAまたはTAGを有していてもよい。さらに該遺伝子
を発現させるにはその上流にプロモーターを接続する。
本発明で用いられるプロモーターとしては、遺伝子の発
現に用いる宿主に対応して適切なプロモーターであれば
いかなるものでもよい。

また、形質転換する際の宿主がエシェリキア属菌であ
る場合は、T7プロモーター、trpプロモーター、lacプロ
モーター、rec Ａプロモーター、λPLプロモーター、l
ppプロモーターなどが；宿主がバチルス属菌である場合
は、SPO1プロモーター、SPO2プロモーター、penPプロモ
ーターなど；宿主が酵母である場合は、HPO5プロモータ
ー、PGKプロモーター、GAPプロモーター、ADHプロモー
ターなどが好ましい。とりわけ宿主がエシェリキア属菌
でプロモーターがtrpプロモーターまたはλPLプロモー
ターであることが好ましい。

宿主が動物細胞である場合には、SV40由来のプロモー
ター、レトロウイルスのプロモーターなどが挙げられ、
とりわけSV40由来のプロモーターが好ましい。

このようにしてGIFをコードする塩基配列を有するDNA
を含む組換えベクターを用いて、該ベクターを保持する
形質転換体を製造する。

宿主としては、例えばエシェリキア属菌、バチルス属
菌、酵母、動物細胞などが挙げられる。

上記エシェリキア属菌の例としては、エキェリキア・
コリ（Escherichia coli）K12DH1［プロシージングス・
オブ・ザ・ナショナル・アカデミー・オブ・サイエンス
（Proc.Natl.Acad.Sci.USA）60.160（1968）］、JM103
［ヌクレイック・アシッズ・リサーチ（Nucleic Acids
Research）９.309（1981）］、JA221［ジャーナル・オ
ブ・モレキュラー・バイオロジー（Journal of Molecul
ar Biology）120.517（1978）］、HB101［ジャーナル・
オブ・モレキュラー・バイオロジー．41.459（196
9）］、C600［ジェネティックス（Genetics）39.440（1
954）］、MM294［（Proc.Natl.Acad.Sci.USA）73.4174
（1976）］などが挙げられる。

上記バチルス属菌としては、例えばバチルス・ズブチ
ルス（Bacillus subtills）MI114［（ジーン．24.255
（1983）］、207−21［ジャーナル・オブ・バイオケミ
ストリー（Journal of Biochemistry）95.87（1984）］
などが挙げられる。

上記酵母としは、例えばサッカロマイセス・セレビシ
アエ（Saccharomyces cerevisiae）AH22R^-、NA87−11
A、DKD−5Dなどが挙げられる。

動物細胞としては、例えばサル細胞COS−７、Vero、
チャイニーズハムスター細胞CHO、マウスＬ細胞、ヒトF
L細胞などが挙げられる。

上記エシェリキア属菌を形質転換するには、例えばPr
oc.Natl.Acad.Sci.USA.69,2110（1972）、ジーン．17.1
07（1982）などに記載の方法に従って行なわれる。

バチルス属菌を形質転換するには、例えばモレキュラ
ー・アンド・ジェネラル・ジェネティックス（Molecula
r ＆ General Genetics）．168.111（1979）などに記載
の方法に従って行なわれる。

酵母を形質転換するには、例えばProc.Natl.Acad.Sc
i.USA 75;1929（1978）に記載の方法に従って行なわれ
る。

動物細胞を転換するには、例えばヴィロロジー（Viro
logy）52.456（1973）に記載の方法に従って行なわれ
る。

このようにして、GIFをコードする塩基配列を有するD
NAを含む組換えベクターを保持する形質転換体が得られ
る。

該形質転換体を培地に培養することによりGIFが産生
される。

宿主がエシェリキア属菌、バチルス属菌である形質転
換体を培養する際、培養に使用される培地としては液体
培地が適当であり、その中には該形質転換体の生育に必
要な炭素源、窒素源、無機物その他を含有させる。炭素
源としては、例えばグルコース、デキストリン、可溶性
澱粉、ショ糖など、窒素源としては、例えばアンモニウ
ム塩類、硝酸塩類、コーンスチープ・リカー、ペプト
ン、カゼイン、肉エキス、大豆粕、バレイショ抽出液な
どの無機または有機物質、無機物としては例えば塩化カ
ルシウム、リン酸二水素ナトリウム、塩化マグネシウム
などが挙げられる。また、酵母、ビタミン類、成長促進
因子などを添加してもよい。

培地のpHは約６〜８が望ましい。

エシェリキア属菌を培養する際の培地としては、例え
ばグルコース、カザミノ酸を含むM9培地［Miller.ジャ
ーナル・オブ・エクスペリメンツ・イン・モレキュラー
・ジェネティックス（Journal of Experiments in Mole
cular Genetics）431−433.Cold Spring Harbor Labora
tory,New York（1972）］が好ましい。ここに必要によ
りプロモーターを効率よく働かせるために、例えば３β
−インドリルアクリル酸のような薬剤を加えることが
できる。

宿主がエシェリキア属菌の場合、培養は通常約15〜43
℃で約３〜24時間行ない、必要により、通気や撹拌を加
えることもできる。

宿主がバチルス属菌の場合、培養は通常約30〜40℃で
約６〜24時間行ない、必要により通気や撹拌を行えるこ
ともできる。

宿主が酵母である形質転換体を培養する際、培地とし
ては、例えばバークホールダー（Burkholder）最小培地
［Bostian.K.L.ら、Proc.Natl.Acad.Sci.USA.77.4505
（1980）］が挙げられる。培地のpHは約５〜８に調整す
るのが好ましい。培養は通常約20℃〜35℃で約24〜72時
間行ない、必要に応じて通気や撹拌を加える。

宿主が動物細胞である形質転換体を培養する際、培地
としては、例えば約５〜20％の胎児牛血清を含むMEM培
地［サイエンス（Science）122.501（1952）］、DMEM培
地［ヴィロロジー（Virology）８.396（1959）］、RPMI
1640培地［ジャーナル・オブ・ザ・アメリカン・メディ
カル・アソシエーション（The Journal of the America
n Medical Association）199.519（1967）］、199培地
［ブロシーディング・オブ・ザ・ソサイエティ・フォー
ザ・バイオロジカル・メディスン（Proceeding of the
Society for the Biological Medicine）73.1（195
0）］などが挙げられる。pHは約６〜８であるのが好ま
しい。培養が通常約30〜40℃で約15〜60時間行ない、必
要に応じて通気や撹拌を加える。

上記培養物からGIFを分離精製するには、例えば下記
の方法により行なうことができる。

GIFを培養菌体あるいは細胞から抽出するに際して
は、培養後、公知の方法で菌体あるいは細胞を集め、こ
れを塩酸グアニジンなどの蛋白質変性剤を含む緩衝液に
懸濁して菌体外に目的の蛋白を溶出させる方法、フレン
チプレス、超音波、リゾチームおよび（または）凍結融
解によって菌体あるいは細胞を破壊したのち、遠心分離
によりGIFを得る方法などが適宜用い得る。とりわけ、
リゾチームと超音波処理を併用する方法が好ましい。

上記上澄液からGIFを精製するには、それ自体公知の
分離、精製法を適切に組み合わせて行なうことができ
る。これらの公知の分離、精製法としては、塩析や溶媒
沈澱法などの溶解度を利用する方法、透析法、限外ろ過
法、ゲルろ過法、およびSDS−ポルアクリルアミドゲル
電気泳動法などの主として分子量の差を利用する方法、
イオン交換クロマトグラフィーなどの荷電の差を利用す
る方法、アフィニティークロマトグラフィーなどの特異
的親和性を利用する方法、逆相高速液体クロマトグラフ
ィーなどの疎水性の差を利用する方法、等電点電気泳動
法などの等電点の差を利用する方法などが挙げられる。

このようにして得られた製品は、透析、凍結乾燥を行
ない、乾燥粉末とすることもできる。さらに、担体とし
て血清アルブミンなどを添加して保存することは、製品
の容器への吸着を防ぐことができ好適である。

また、精製過程あるいは保存過程での微量の還元剤の
共存は、該製品の酸化を防ぐのに好適である。還元剤と
してはβ−メルカプトエタノール、ジチオスレイトー
ル、グルタチオンなどが挙げられる。

このようにして、実質的にパイロジエンもエンドトキ
シンも含まない、実質的に純粋なGIFが得られる。該実
質的に純粋なGIFとしては、蛋白質含量としてGIFを90％
（w/w）以上含むもの、さらに好ましくはGIFの95％（w/
w）以上含むものである。

本発明のGIFを医薬として用いるには、そのまま粉末
として、または他の薬理学的に許容されうる担体、賦形
剤、希釈剤と共に医薬組成物（例えば、注射剤、錠剤、
カプセル剤愛、液剤、軟膏）として、温血動物（例え
ば、ヒト、マウス、ラット、ハムスター、ウサギ、犬、
ネコ）に対して非経口的または経口的に安全に投与する
ことができる。

注射剤の製剤化は、例えば生理食塩水またはブドウ糖
やその他の補助剤を含む水溶液を用い、常法に従って行
なわれる。錠剤、カプセル剤等の医薬組成物も常法に従
って調製しうる。

本発明のGIFを上記した医薬として用いる場合には、
例えば上記した温血動物に、投与ルート、症状などを考
慮して、１日量約1ngないし100mg/kgの中から適当量を
選んで投与する。

GIFは正常人の脳で特異的に産生される。従ってGIF遺
伝子のプロモーターは脳で特異的に作動することが期待
できる。そこで本発明者らは脳で特異的に作動するプロ
モーターを取り出すことを目的として、GIFcDNAをプロ
ーブとしてGIFゲノム遺伝子をクローニングし、GIFプロ
モーターを見い出すことに成功した。

このようなGIFのプロモーター領域を有する組換えDNA
を含む組換えベクターにおいて、GIFプロモーターを組
み込む組換え用ベクターとしては、特に限定されない
が、例えばpCDベクター、CDM8ベクター［Aruffo.A.とSe
ed.B.,プロシージングス・オブ・ザ・ナショナル・アカ
デミー・オブ・サイエンス（Proc.Natl.Acad.Sci.USA）
84.8573−8577（1987）］、レトロウイルスベクター［C
one.R.D.とMulligan,R.C,Proc.Natl.Acad.Sci.USA,81.6
349−6353（1984）］など動物細胞用のもの、pUC［Viei
ra.J.とMessing J.,Methods in Enzymology 153.3−11
（1987）］など大腸菌用のものなどが挙げられる。

組換えベクターにおいて、プロモーター領域の下流に
連結される構造遺伝子としては、種々の遺伝子産物の脳
における中枢神経系での機能を知るためのポリペプチド
をコードする構造遺伝子が挙げられる。

その例としては、例えば神経細胞成長因子（NGF）、
塩基性線維芽細胞成長因子（basic FGF）、酸性線維芽
細胞成長因子（acidic FGF）などの神経栄養因子を始め
とする他の成長因子、リンホカインなどが挙げられる。

上記構造遺伝子として、後述のレポーター遺伝子を用
いてもよい。レポーター遺伝子としては、CAT（クロラ
ムフェニコール・アセチル・トランスフェラーゼ遺伝
子、アルカリホスファターゼ遺伝子の他に、βガラクト
シダーゼ遺伝子が汎用されているが、他のいかなる構造
遺伝子であっても、その遺伝子産物の検出法があれば使
用できる。

上記構造遺伝子をベクターに組み込むには、プロモー
ター領域の下流に存在する適当な制限酵素切断部位に、
上記構造遺伝子が正しく転写される方向に連結すればよ
い。

上記組換えベクターにより形質転換する宿主として
は、動物細胞、特にグリア細胞の脳神経系の細胞が用い
られる。また動物個体へのDNA移入への一過程としての
卵細胞、あるいはES細胞［Evans.M.J.とKaufman.K.H.,
ネイチャー（Nature）.,292.154（1981）］も使用でき
る。

これらの細胞の形質転換の方法としては、リン酸カル
シウム法［Grahamら、ヴィロロジー（Virology）52.456
（1973）］、エレクトロポレーション法［石崎ら、細胞
工学，５.557（1986）］、マイクロインジェクション法
などが用いられる。

本発明のプロモーターを用いることにより、脳神経系
などの細胞に、前記のような種々のポリペプチドを作ら
せることができる。

また上記構造遺伝子としてmyc、rasをはじめとした癌
遺伝子を用いると、得られたベクターを動物（例えば、
マウス、ラット、イヌ、ネコ）に投与し、該動物の脳神
経系において、癌をはじめとする特定の病変をひき起こ
させた疾患モデル動物を製造することができる。

さらに、上記構造遺伝子が脳の遺伝子疾患（例えば、
アルツハイマー病、パーキンソン病）の治療に役立つペ
プチドをコードするものである場合には、本発明の組換
えベクターを直接、哺乳読物（例えば、マウス、ラッ
ト、イヌ、ネコ、ヒト）の脳内に投与、あるいは培養し
た脳由来細胞に組換えベクターを導入した後に、脳内に
移植することにより、該疾患の治療を行なうことができ
る。

また、癌抑制遺伝子を構造遺伝子として組換えベクタ
ーを構築し、該ベクターを腫瘍細胞に直接導入すること
により、脳腫瘍の治療を行なうことができる。

またさらに、本発明のプロモーターが、脳神経系の細
胞において、特定の化合物によりプロモーター活性のコ
ントロールが行なわれることが分かれば、特定の化合物
を生体の脳に到達するように投与した場合、該特定の化
合物のプロモーター活性のコントロール能を知ることが
できるので、該化合物が脳内におけるGIF遺伝子のプロ
モーターを活性化し、脳内においてGIFの産生量を増大
させ、これによりアルツハイマー型痴呆症の治療を行な
うことができる。

上記形質転換体は、該特定の化合物の存在下に培養
し、培養物中の遺伝子産物の量を測定し比較することに
より、該化合物のプロモーター活性のコントロール能を
知ることができる。

該形質転換体の培養はそれ自体公知の方法で行なう。
培地としては、例えば約５〜20％の牛血清を含むMEM培
地［サイエンス（Science）122.501（1952）］、DMEM培
地［ヴィロロジー（Virology）８.396（1959）］、RPMI
1640培地［ザ・ジャーナル・オブ・ザ・アメリカン・メ
ディカル・アソシエーション（The Journal of the Ame
rican Medical Association）199.519（1967）］、199
培地［ブロシーシング・オブ・ザ・ソサイエティ・フォ
ー・ザ・バイオロジカル・メディスン（Proceeding of
the Society for the Biological Medicine）73.1（195
0）］などが挙げられる。pHは約６〜８であるのが好ま
しい。培養は通常約30〜40℃で約15〜60時間行ない、必
要に応じて通気や撹拌を加える。

［産業上の利用可能性］本発明は、アルツハイマー病の遺伝子診断に役立ち、
さらには、直接的に該遺伝子を脳細胞に導入することに
よりアルツハイマー病の治療に用いうることが期待され
る。さらには、この神経栄養活性抑制作用を有する蛋白
質（GIF）をコードするDNAは、遺伝子工学的手法により
この蛋白質の生産を可能にする形質転換体を得、これを
培養することによりGIFを大量生産することができる。
さらに、GIFプロモーターを用いて該疾患の治療薬を開
発することができる。

以下、本発明を実施例に基づき、さらに詳しく説明す
る。

実施例１本物質の分離、精製正常ヒト大脳皮質の灰白質20gに水60mlを加え、ホモ
ジナイズし、20,000gで１時間遠心した後、遠心上清を5
5ml得た。

得られた上清55mlをアミコンYM−10膜（商品名）を用
いて限外ろ過し、分子量10キロダルトン以上の画分をDE
AE−セファセルカラム（1.6cmφ×16cm、ファルマシア
社製）にのせ、洗浄バッファー（50mM NaCl 20mMトリ
ス−HCl（pH7.6））200mlで洗浄後、50mMから300mM Na
Clの直線濃度勾配をつけた20mMトリス−HCl（pH7.6）バ
ッファー320mlで抽出した。上記DEAE−セファセルカラ
ムによるクロマトグラムを図１に示す。フラクションN
o.31からNo.38までの抑制活性を有する分画を集め（40m
l）、透析後、フィコール400を用いて濃縮後、TSK G20
00SW（トーソー社製）でゲルろ過（カラムサイズ7.5mm
φ×6cm）し、フラクションNo.30からNo.32の活性画分
を集め（2.5ml）、5mMリン酸バッファー（pH7.4）中で
透析した。上記TSK G2000SWを用いたゲルろ過クロマト
グラフィーの結果を図２に示す。液量を550μｌまで濃
縮後、C18逆相HPLCカラム（4.6mmφ×25cm、センシュー
化学社製）にかけた。溶出には、０％から80％アセトニ
トリルの直線勾配をつけた5mMギ酸アンモニウム溶液を
用いた。このC18逆相HPLCクロマトグラフィーの結果を
図３に示す。図３に示されるように、C18逆相HPLCクロ
マトグラフィーによりシャープなピークが実質的に１つ
だけ得られ、本発明の物質GIFが単離されたことがわか
る。

実施例２特定測定実施例１で得られた物質について下記の種々の特性を
測定した。

（１）紫外部吸収スペクトル実施例１で得られた物質３μｇの蒸留水溶液を用いて
分光光度計（ベックマン社製DU65型）で紫外線吸収スペ
クトルを測定した。結果を図４に示す。

（２）安定性実施例１で得られた物質を20μg/mlの水溶液に調整
し、その10μｌにトリフルオロ酢酸を最終濃度0.1％と
なるように加え（pH3.0）、37℃で20時間加温した後、
凍結乾燥した。これを、ダルベコ社製リン酸バッファー
（PBS（−））10μｌに溶解し、下記実施例３に示す方
法で抑制活性を測定したが、活性の抑制活性の減少は全
く認められなかった。さらに、実施例１で得られた物質
の２μg/ml水溶液の100μｌをとり、37℃で20時間又は1
00℃で５分間加熱した後、この溶液の10μｌを用いて、
前述と同様にして安定性試験を行なったところ、全く抑
制活性の減少が認められなかった。

（３）分子量実施例１で得られた物質５μｇを水10μｌに溶解し、
分子量マーカー（キモトリプシノーゲンＡ（分子量2,50
0），チトクロムＣ（分子量12,500），アプロチニン
（分子量6,500）、バイオラッド社製）を用いて、7.5％
から20％の濃度勾配のあるドデシル硫酸ナトリウム（SD
S）−ポリアクリルアミドゲル電気泳動（PAGE）で測定
した結果、分子量約5,000ダルトンでることが確認され
た。この電気泳動の結果を図５に示す。

試験例神経栄養活性抑制活性の測定新生児ラットの大脳皮質より調製した細胞を、ゼラチ
ン−ポリオルニチンを塗布した6mmのミクロプレートに
1.7×10⁴個撤き、実施例１と同様の方法で得られたアル
ツハイマー病脳抽出液を、125μg/ml濃度に調製した水
溶液100μｌを含む無血清培地MEMN2（イーグル基本培地
にインシュリン、トランスフェリン、プトレシン、プロ
ゲステロン、合セレン酸ナトリウムを添加）に実施例１
で得られた物質20ngを加えた培地中で、５日間、５％炭
酸ガス培養槽中、37℃で培養した。パラホルムアルデヒ
ドと90％メタノール/5％酢酸溶液で固定した後、マイク
ロチューブル結合タンパク２（MPA2）抗体（アマーシャ
ム社製）を使ったELISAで、MAP2の量を定量した。一
方、本物質を加えないでアルツハイマー病脳抽出液を加
えて培養した時のMAP2の量を定量し、MPA2の量が何％減
少するかによって抑制活性を表わした。

上記方法を用いて、GIFの量と抑制率との関係を測定
した。結果を図６に示す。図６に示すように、抑制活性
は、GIF0.2μg/ml濃度で平衡となり、その抑制活性は約
90％であった。

実施例３アミノ酸配列の分析実施例１で得られた物質200μｇを、常法によりピリ
ジルエチル化した。ピリジルエチル化した本物質50μｇ
を常法により臭化シアン分解した。ピリジルエチル化し
た本物質を0.1Mトリス−HCl（pH8.0）溶液100μｌに溶
解し、トシルフェニルアラニルクロロメチルケトン（TP
CK）−トリプシン（シグマ社製）またはエンドプロテイ
ナーゼ（endoproteinase）Asp−Ｎ（ベーリンガー社
製）またはストレプトミセズ・オーレウス（S.aureus）
V8プロテアーゼ（シグマ社製）0.5μｇを加え、37℃で
５時間反応させた。以上の４種類の方法を用いて得らて
たペプチド断片を、それぞれC18逆相HPLC（０〜80％ア
セトニトル/0.1％トリフルオロ酢酸溶液）で、分離し、
タンパクシークエンサー（アプライド・バイオシステム
社477A型）にかけて分析し、得られたピークの保持時間
と標準物質のそれを比較解読して本物質の全アミノ酸配
列を決定した。その結果、GIFは前記のとおりの全アミ
ノ酸配列を有することがわかった。

実施例４本遺伝子の分離ヒト脳から抽出されたGIFのアミノ酸配列をもとに、
５′ATGGATCCCGAGACCTGCCC、５′CTGGCAGCAGCTGCATTCTC
の２つのオリゴヌクレオチドを合成し、これらをプライ
マーとして、ヒト大脳より調製したmRNAを鋳型にして、
逆転移酵素によりcDNAとした後、ポリメラーゼによる連
鎖反応を行ない、その反応生成物をプラスミドベクター
pUC 19にサブクローン化し、その塩基配列を前記のよう
に決定した。これは前記GIFのアミノ酸配列と一致する
ことも確認した。

正常ヒト大脳のmRNAに対して作られたcDNAライブラリ
ーを用いて、１×10⁶個のクローンをプレートに生育さ
せ、ニトロセルロース膜に転写し、上記のサブクローン
化されたオリゴヌクレオチドを³²Pで標識したプローブ
を作製し、これを50％ホルムアミド、５×SSC（0.15M N
aCl,0.15Mクエン酸ナトリウム、pH7.0）を含むハイブリ
ダイゼーション液中で42℃にて18時間、上記ニトロセル
ロース膜にハイブリッド形成させ、その後フィルターを
洗浄し、最終的に55℃で0.1×SSC（0.15M NaCl,15mMク
エン酸ナトリウム、pH7.0）オートラジオグラフィーを
行ない、上記プローブに対して特異的なcDNAを24個単離
した。このcDNAの塩基配列を決定したところ、68個のア
ミノ酸をコードする塩基配列の存在が見出された（図
８）。

実施例５正常人およびアルツハイマー痴呆症の患者の
脳からそれぞれmRNAを抽出し、その２μｇをアルカリ変
性アガロースゲル中で電気泳動を行ない、その後ニトロ
セルロース膜に転写し、上記cDNAをプローブとして上記
と同様のハイブリダイゼーション液中で42℃で18時間ハ
イブリッド形成を行ない、その後フィルターを洗浄し、
最終的に0.1×SSC,0.1％SDS中で65℃で洗浄し、オート
ラジオグラフィーを行なった。その結果アルツハイマー
病、正常脳において、ともに約500bpの大きさのmRNAが
認められ、アルツハイマー病においてこのmRANの量が減
少していることが見いだされた（図７）。

実施例６ヒトGIFゲノムDNAのクローニング実施例４で得られたヒトGIFcDNAをプローブとし、コ
スミドヒトゲノムDNAライブラリー（pWE15）をスクリー
ニングした。反応は、５×SSC,1×デンハルト（denhal
t's）,10％デキストラン硫酸,50％ホルムアミド,20mM N
a−ホスフェート中、42℃で18時間行なった。反応後フ
ィルターを２×SSCで室温で15分２回、さらに0.1×SCC,
0.1％SDS,55℃で15分２回洗浄し、フィルターのオート
ラジオグラムをとり、プローブに対して反応するコスミ
ドを探した。その結果、陽性クローンを得ることかで
き、サザンブロットハイブリダイゼーションにより、こ
のコスミドに組み込まれたDNAはプローブと交差するこ
とが示された。そこでこのDNA断片（約35Kb）の全塩基
配列を決定した結果、GIFゲノムDNAは図９に示したエク
ソン・イントロン構造を示しており、エクソンとイント
ロンの端は図９に示した塩基配列を示していることが判
明した。またcDNA（エクソン１）の上流部分はヒトGIF
プロモーター領域であって、図10に示した塩基配列であ
ることが明らかになった。

実施例７ヒトGIFの大腸菌における発現実施例４で得られたヒトGIFcDNAのGIFをコードする領
域の上流（ATG上流）および下流に、各々Nco IおよびHi
nd IIIサイトをもつプライマーを用いたPCR法により、N
co IおよびHind IIIサイトを導入した。次に、このヒト
GIFcDNAをNco IおよびHind IIIで切断し、得られたDAN
断片をプラスミドpKK233−２（ファルマシア社）のNco
I−Hind III部位に組み込んだ（図11）。このGIF発現用
プラスミドを大腸菌JM105株に導入し、Amp^r株を選択し
た。次にこの大腸菌を培養し、増殖が対数増殖期に入っ
た時、イソプロピル−β−Ｄ−チオガラクトシド（IPT
G）を1mMになるように加え、さらに5.5時間培養を続け
た。菌体を集め超音波処理した後遠心して粗抽出液を
得、実施例１に準じた方法により組換え型ヒトGIFを精
製した。

実施例８組換え型ヒトGIFの神経栄養活性抑制活性実施例７で選られた組換え型ヒトGIFの神経栄養活性
抑制活性を、実施例２に示した方法を用いて測定した。
その結果、組換え型ヒトGIFは天然型ヒトGIFの約1/10の
活性を持つことが分かった（図12）。

［図面の簡単な説明］図１は、正常ヒト大脳皮質をホモジナイズして限外ろ
過し、分子量10キロダルトン以上の画分をDEAE−セルフ
ァセルカラムにかけたクロマトグラムである。

図２は、GIFの精製過程において、神経栄養活性抑制
活性を有するフラクションをゲルろ過したクロマトグラ
ムである。

図３は、GIFをC18逆相HPLCにかけたクロマトグラムで
ある。

図４は、GIFの紫外線吸収スペクトルである。

図５は、GIFのSDS−PAGEの電気泳動パターンを示す。

図６は、GIFの量と神経栄養活性抑制率との関係を示
すグラフである。

図７は、GIFcDNAをプローブとしたサザンブロット解
析の結果を示すクロマトグラムである。アルツハイマー
病疾患（１、２）において神経栄養活性抑制物質のmRNA
量が正常人（３、４）に比べて減少していることを示
す。

図８は、GIFをコードするcDNAの塩基配列およびアミ
ノ酸配列を示す。

図９は、GIFゲノムDNAをエクソン・イントロン構造の
塩基配列を示す。

図10は、GIFプロモーター領域の塩基配列を示す。

図11は、GIF発現用プラスミドの構築の模式図を示
す。

図12は、組換え型GIFの神経栄養活性抑制活性を示す
グラフである。

───────────────────────────────────────────────────── フロントページの続き (51)Int.Cl.⁷ 識別記号ＦＩ (Ｃ１２Ｐ 21/02 Ｃ１２Ｒ 1:19） (72)発明者井原康夫神奈川県横浜市緑区美しが丘４―30―５ (58)調査した分野(Int.Cl.⁷，ＤＢ名) C12N 15/09 ZNA C12N 1/21 C12P 21/02 ＢＩＯＳＩＳ（ＤＩＡＬＯＧ) ＧｅｎＢａｎｋ／ＥＭＢＬ／ＤＤＢＪ（ＧＥＮＥＴＹＸ) ＭＥＤＬＩＮＥ（ＳＴＮ)

Claims

(57)【特許請求の範囲】

【請求項１】神経栄養活性抑制作用を有し次のアミノ酸
配列を有するGIFをコードするDNAを含む組換えベクタ
ー。
【請求項２】GIFをコードするDNAが、次の塩基配列を有
する請求項１記載のDNAを含む組換えベクター。
【請求項３】請求項１または２記載のベクターを保持す
る形質転換体。
【請求項４】請求項３記載の形質転換体を培地に培養す
ることを特徴とするGIFの製造法。