JPH07501695A - Ｉｆｎ‐ガンマ‐アンタゴニストサイトカイン - Google Patents

Abstract

(57)【要約】本公報は電子出願前の出願データであるため要約のデータは記録されません。

Description

【発明の詳細な説明】 １１、　請求の範囲第４項または第５項に記載のＤＮＡ配列を含んでなる生物学 的機能を有する、クローニングベクター。

１２、　請求の範囲第１１項に記載のクローニングベクターによって安定に形質 転換またはトランスフェクションされた、宿主細胞。

１３、　前記サイトカインを、細胞培養物の上清から精製する、請求の範囲第１ 項〜第３項のいずれか１項に記載のサイトカインの製造法。

１４、　細胞を、血清の混入タンパク質を欠いている適当な栄養培地で培養する 、請求の範囲第１３項に記載の方法。

１５、　血清が、分子量が５０ｋＤ以下に対して透過性である透析バッグに含ま れている、請求の範囲第１３項または第１４項に記載の方法。

１６、　請求の範囲第９項、第１０項または第１２項のいずれか１項に記載の宿 主細胞を適当な培地で培養し、サイトカインを発現するようにし、かつ所望なサ イトカインを特徴する請求の範囲第１項〜第３項のいずれか１項に記載のサイト カインの製造法。

１７、　請求の範囲第１項〜第３項のいずれか１項に記載のサイトカインに対す る、モノクローナル抗体。

１８、　請求の範囲第１項〜第３項のいずれか１項に記載のサイトカインに対す る、または請求の範囲第１３項〜第１６項のいずれか１項に記載の方法によって 得られる、免疫血清。

１９、　活性成分として、請求の範囲第１項〜第３項のいずれか１項に記載の、 または請求の範囲第１３項〜第１６項のいずれが１項に記載の方法によって得ら れるサイトカインを含んでなる、治療用組成物。

２、特許請求の範囲第４項〜第８項のいずれか１項に記載のＤＮＡ配列を活性成 分として含んでなる、治療用組物。

２、特許請求の範囲第１７項に記載の抗体または請求の範囲第１８項に記載の免 疫血清を活性成分として含んでなる、治療用組成物。

２、特許請求の範囲第１７項に記載の少なくとも１個の抗体を含む、請求の範囲 第１項〜第３項の一つに記載のサイトカインの存在を診断するためのキット。

明　細　書 ＩＦＮ−ガンマーアンタゴニストサイト力イン本発明は、新規なサイトカインに 関し、それは細胞表面でのクラス１１の組織適合性抗原の発現のインターフェロ ン−７による誘導の特異的アンタゴニストである。

体内の総ての細胞は、その表面でクラスＩ組織適合性抗原として知られる糖タン パク質を発現する。

また、免疫担当細胞によってだけ発現される種類の糖タンパク質であるクラス１ １の組織適合性抗原が存在する。

これらの抗原は、ヒトでは第６染色体に配置された遺伝子ファミリーによってコ ードされ、これは主要組織適合性複合体 （ＭＨＣ）またはヒトでは（ＨＬ　Ａ）として知られている。

クラスＩ＋の組織適合性抗原は、免疫応答の際に、特にＢ細胞とＴ細胞との間の 、または抗原を生じる細胞とＴ細胞との間の相互作用の関係において、重要な役 割を果たしている。インターフェロン−γは、多数の細胞の種類による主要組織 適合性複合体（ＭＨＣ）の抗原の発現を誘導することにより、免疫担当細胞の機 能を促進する（Ｂｅｃｋｅｒ、１９８５）。抗原を生じさせる能力は、補助細胞 の表面上に存在するクラス１１分子（ＨＬ　Ａ）の量に比例する。従って、イン ターフェロン−γは、これらの細胞が十分にクラス１１分子（ＨＬ　Ａ）を発現 させて、抗原を生じさせる。インターフェロン−γ依存性の制御機構は、未だ解 明されていない。

クラスＩＩ（ＨＬＡ）抗原は、分化マーカーであるとも考エラレテオリ、コレハ 、ｆｌｉ系（Ｒｘｄｋａ　ｅｔ　ａｌ、、１９８６）またはウシ肝臓（Ｎａｔａ ｌｉ　ｅｔ　ａｌ、、１９８４）の細胞について明らかにされているが、細胞分 化中のそれらの機能は未だ確立されていない。また、クラス１１抗原の存在は、 腫瘍化の現象中に何らかの役割を果たしていると思われる（Ｆｅｓｌｅｎｓｆｅ ｉｎ　＆　Ｇａ＋ｔｉｄｏ、１９８６１゜クラス１１抗原は、Ｂ細胞において発 現される。

Ａｃｃｏｌｌａ　ら（＋９８５）およびＤｅ　Ｐｅｔｙｚｌ　ら（１９８５１は 、この発。

現が遺伝子レベルでトランスに作用する因子によって制御されることを示してい る。

クラスＩ＋抗原を制御するモデルは、Ｂｏｓｓ　＆Ｓｔｚｍｉｎｇｅｒ　（１９ ８６）によって提案されている。このモデ）Ｌ、Ｔ−は、遺伝子の５′フランキ ング領域のゲノムレベルでは、組織適合性抗原の発現を制御する４個の連続する 領域である、負の調節要素、２個の正の制御領域、およびもう一つの負の制御領 域がある。ゲノムレベルでのクラスＩ＋抗原ＨＬＡの調節に関する更に最近の研 究では、主要組織適合性複合体の遺伝子の５′領域におけるＥとして知られるプ ロモーターおよびＥαプロモーターに結合できる２個のタンパク質が明らかにさ れている（Ｄｏｗｎｅｌ　ａｌ、、１９８８．Ｄａｒｎ　ｅｌ　ａｌ、、１９８ ９；　Ｋｏｃｈ　ｅｔ　ａｌ、。

１９８９）。

誘導の効率は、問題となっている細胞系によって異なる。実際には、幾つかの細 胞系（Ｋ５６２白血病系、胎児性線維芽細胞など）は誘導は起きたとしても極め て困難であるが、他の細胞系（成人の線維芽細胞、結腸癌細胞など）はインター フェロン−γを少量投与して誘導した後にクラス１１抗原ＨＬＡを発現する。

本発明に関して、いわゆる無反応性細胞上でのインターフェロン−γによるクラ ス１１抗原ＨＬＡの誘導が困難であることは、可溶性の内在性インヒビターが自 然に産生されることが原因であることが明らかにされた。

従って、本発明は、インターフェロン−γによる、細胞表面でのクラス１１の組 織適合性抗原の発現の誘導の特異的アンタゴニストであり、 一部１図に記載されているようなペプチド配列の全部または一部を含んでなるも のであるか、または前記の生物学的活性を保持しているその変異体であり、−細 胞によって天然に分泌されたもの、または−原核または真核細胞中の外来性ＤＮ Ａ配列の発現生成物である、 サイトカインに関する。

が、本発明はこのサイトカインの変異体、特にＮ−またはＣ−末端の欠失によっ て得られる変異体、１個以上のアミノ酸の置換によって得られる変異体、および １個以上のアミノ酸、例えば、サイトカインを細菌中で発現させるときＮ−末端 におけるアミノ酸であるメチオニンを付加することによって得られる付加変異体 にも関する。

本発明は、サイトカインの活性なエピトープであって互いに結合しているかまた は異なる配列を介して結合しているものを含む化合物にも関し、以後これも変異 体と呼ぶ。

用いられる宿主細胞の性質によっては、サイトカインはグリコジル化されて、哺 乳類細胞の生物学的活性にとって好ましい翻訳後修飾が行なわれるようにするこ とができる。

天然タンパク質は、前記の特徴の外に、５ＤＳ−ポリアクリルアミドゲル上では 分子量が１９，０００程度であり、そのインヒビター活性は熱およびトリプシン 感受性である。

このタンパク質は、５０％硫酸アンモニウム溶液中で沈澱を生じる。

このタンパク質は、天然では細胞培養の上清中に分泌生成物として得ることがで きる。これは、原核細胞または更に有利には真核細胞中で外来性ＤＮＡ配列の発 現により得ることもできる。この場合には、外来性ＤＮＡ配列は特に相補性ＤＮ Ａ配列であることができ、あるいはゲノムＤＮＡ配列であることもできる。

本発明によるＤＮＡ配列は、原核宿主細胞または真核宿主細胞中で新規なサイト カインを発現させることができる配列を含んでいる： 本発明による配列は、更に具体的には、下記の配列から選択されるものに関する ： り　第１図のＤＮＡ配列またはその相補性鎖、ｂ）りのＤＮＡ配列またはその一 部とハイブリダイゼーションするＤＮＡ配列、および Ｃ）　遺伝子コードが縮重しでいるため、ａ）またはｂ）と同じアミノ酸配列を 有するサイトカインをコードする配列 ｄ）　前記のサイトカインの変異体をコードし、前記の生物学的活性を保持して いる配列。

従って、本発明は、前記のような変異体の発現をコードするＤＮＡ配列にも関す る。本発明は、前記のＤＮＡ配列またはその１個以上のフラグメントとハイブリ ダイゼーションするＤＮＡ配列にも関する。

本発明による配列は、共有的に結合させ、あるいは同位体標識（■など）または 非同位体性標識（ビオチンなど）で標識した分子と結合させることができるので 、それらは容易に検出することができる。

本発明は、前記のＤＮＡ配列で形質転換またはトランスフェクションを行い、宿 主細胞中で前記のサイトカインを発現させるようにした真核または原核宿主細胞 にも関する。

本発明は、前記のＤＮＡ配列を含む生物学的機能を有するクローニングベクター 、並びにこのクローニングベクターによって安定に形質転換またはトランスフェ クションされた真核または原核宿主細胞にも関する。

生物学的機能を有するクローニングベクターは、問題の配列を形質転換またはト ランスフェクションされた宿主中で発現させることができ、あるいはその配列を 染色体に組み込み、同種または異種プロモーターによって制御しながらそれを発 現することができるベクターを表わす。この種のベクターは、組換えＤＮＡの分 野で知られている。これは、自己複製的であるか、または宿主中で有効な復製起 点、例えばε、ｃｏｌｉ　についてのｐＢＲ３２２の複製起点、並びに配列を発 現させるための要素である一プロモーター、 一リポソーム結合部位、 −例えば、適当な場合には、酵母におけるターミネータ−１並びに 各種の制御要素を含むプラスミドであることができる。

これらのプラスミドは、特に選択用のマーカー遺伝子、または組換えによる組込 み用の相同配列を含む組込み配列を含むこともできる。

問題のベクターは、組換えウィルス、例えばワクシニア型のベクターウィルスで あることもできる。組換えおよびトランスフェクションの方法は周知であり、宿 主に適合するものでなければならない。宿主細胞はベクターによって修飾して、 成熟した形態および／または融合した形態でタンパク質を放出するようにするこ ともできる。

本発明は、新規なタンパク質の製造法であって、前記サイトカインを細胞培養物 の上清から精製するか、または前記原核または真核宿主細胞にサイトカインを発 現させた後、所望なサイトカインを単離することを特徴とする方法にも関する。

サイトカインが培養中の細胞によって自然に分泌される場合には、この細胞を血 清の混入タンパク質を欠いている適当な栄養培地で培養するのが好ましく、血清 は５０ｋＤ以下の分子量まで透過できる透析バッグ中に含まれるものである。

この方法は、宿主細胞が前記のベクターで処理した細胞であって、その培養には 血清を用いる必要があるものであるときにも用いることができるが、単一培地で 生育する宿主を用いるのが好ましい。

本発明によるサイトカインを産生ずることができる細胞はかなりの数に上るが、 その中では、ＮａｔｉｏｎａｌＩｎｓｔｉｔｕｔｅ　ｏｆ　Ｇｅｎｅｒａｌ　Ｍ ｅｄｉｃａｌ　５ｃｉｅｎｃｅｓからＧＭｔ１５３？２［１の番号で入手できる に５６２系を挙げるべきである。しかしながら、他の細胞、特に癌細胞または肝 臓癌細胞を用いることができる。

本発明によるサイトカインを組換えＤＮＡ技術によって製造するときには、Ｋ５ ６２のような細胞系および前記のサイトカインを発現しなくなったそのサブクロ ーンが宿主細胞として特に有利である。

本発明は、本発明によるサイトカインに向けられる抗体、特にモノクローナル抗 体にも関する。これらの抗体は、特に前記のタンパク質の存在の診断に関して用 いることができる。

本発明は、前記のサイトカインに向けられる免疫血清にも関する。

本発明によるサイトカインは、インターフェロン−γに関してこれらのタンパク 質の拮抗作用を増加させることが所望な場合には、治療組成物の活性成分として 用いることができる。

これらの治療組成物は、極めて具体的には、インターフェロン−γの活性を調節 する必要がある総ての状態において用いることができる。特に、本発明による組 成物は、ある種の自己免疫疾患の治療および／または予防に用いることができる が、幾つかの移植術のような外科的処置に用いることもできる。

本発明による組成物は、他のモノカインおよび／またはサイトカインを含むこと もできる。

本発明は、前記のサイトカインに対して向けられた抗体または免疫血清、または コード配列に対応するアンチセンス配列であって、その目的が特に循環するサイ トカインの量を制限することであるものも活性成分として含む治療組成物にも関 する。

本発明は、このタンパク質を検出することができ、このタンパク質に向けられる 少なくとも１個の抗体を含む診断キットにも関する。

下記の実施例および図は、本発明の他の利点および特徴を明らかにしようとする ものであり、発明の範囲を制限するものではない。本明細書に添付の図面におい て、第１図は、インヒビターに対応する相補性ＤＮＡのヌクレオチド配列および 推定したペプチド配列を示し、第２図は、１）　右側では、１．０００ＩＵ／ｍ ｌの濃度でグリコジル化したインターフェロン−γで誘導した後のに５６２細胞 上でのＨＬＡ　ＤＲ（ｂ）およびＨＬＡクラスＩ　（ｃ）抗原の発現についての フローサイトメーター（Ｅ、Ｃ，Ｃｏｕ目ｅ＋）上で得られたヒストグラムを示 し、（ａ）では、インターフェロン−γなしでの、特異抗体の存在下または非存 在下での負のコントロール（曲線は一致している）を示し、 ２）　左側では、Ｋ５６２細胞上でインターフェロン−γにより誘導されたＨＬ Ａ　ＤＲ抗原のα鎖（３２ｋ　Ｄ）およびβ鎖（２８ｋＤ）の免疫沈澱（＾）、 および負のコントロール（Ｂ）を示す。

第３図は、１００ＩＵ／ｍｌの濃度でグリコジル化したインターフェロン−γで 誘導した後のＩＣＩＧ−７細胞上でのＨＬ　Ａ　Ｄ　Ｒ（ｂ）およびＨＬＡクラ スＩ　（ｄ）抗原の発現についてのフローサイトメーター（Ｅ、　Ｃ。

Ｃｏｏｌｌｅｒ）で得たヒストグラムを示す。（１１では、インターフェロン− γなしでの、特異抗体の存在下または非存在下での負のコントロール（曲線は一 致している）を示す。１００ＩＵ／ｍｌの濃度およびに５６２細胞からのならし 培地の存在下でのグリコジル化したインターフェロン−γで誘導した後の、Ｉ　 ＣＩ　Ｇ−７細胞上でのＨＬＡ　ＤＲ（ｃ）およびＨＬＡクラスＩ　（ｅ）抗原 の発現。

第４図は、（Ａ）では、細胞培養、（Ｂ）では、ＭｏｎｏＱカラムの後に得た曲 線、および（Ｃ）では、５ｏｐｃ＋ｏｓｅ　１２の後に得た曲線の精製段階を示 す。活性画分は斜線を引いた部分にある。

急性発症の慢性のを偏性白血病に罹っている患者の胸膜滲出液由来のに５６２細 胞を、完全ＲＰＭＩ　１６４０培地で培養する。細胞を３７℃および５％ＣＯ２ でインキュベーターに入れる。細胞を、７２時間毎に２５０，０００個／ｍｌの 濃度で接種する。

Ｉ　ＣＩ　Ｇ−７細胞、すなわち正常なヒト胎児性線維芽細胞（これらの細胞は 、当研究室では正常なヒト胎児の肺から培養した）を、３７℃および５％ＣＯ２ の湿潤インキュベーターで完全ＭＥＭ培地で培養する。集密した（７２時間）付 着細胞を２〜３分間トリプシンを作用させて支持体から脱着させ（０，２５％、 ＭＥＭ中）、ｓｏ、ｏｏｏ個／ｃｍ２の濃度で再培養する。

２、　ならし培地 に５６２細胞を前記の条件で培養し、７２時間後に培養液を取り出して、遠心分 離し、０．２２μｍフィルターで濾過し、１０％ＦＣ３および２ｍＭグルタミン を補細菌Ｅ、　ｃｏｌｉから産生されるグリコジル化していない組換えインター フェロン−γは、Ｂｉｏｇｅｎ社（ＧＥＮＥＶ＾。

スイス）から入手し、その特異活性は２Ｘ１０７ＩＵ／ｍｇである。

ハムスターＣＨＯ細胞で産生されるグリコジル化した組換えイン９−７エロンー ７　（ＤＥＶＯ３ｅｔ　ａｔ、、１９８４）の特異活性は１．３ｘ１０８１Ｕ／ ｍｌである。

４、インターフェロン−γによる誘導 細胞（Ｋ５６２またはＩＣＩＧ−７）を６ウエルの多量培養プレート（９ｃｍ２ ／ウエル）で培養し、グリコジル化シｔ：Ｍ換工Ｉ　ＦＮ−７（ＣＨＯ）　１． 　０００　Ｉ　Ｕ／ｍｌまたはグリコジル化していない組換えＩＦＮ−γ（Ｅ、 ｃｏｌｉ）　１０．　０００１　Ｕ／ｍ　ｌの存在下にて７２時間で細胞濃度を ５×１０４個／ウェル／　２　ｍ　ｌとする。

５、　生物学的活性の試験 ＩＣＩＧ−７細胞を、ならし培地または完全ＭＥＭ培地で希釈する精製画分が存 在すること以外は、前節に記載の条件下で誘導する（精製を参照されたい）。

細胞表面での組織適合性抗原の発現を、間接免疫経口法によって測定した。細胞 をＨａｎｋｓ培養液で３回洗浄した後、５×１０５個／ｍｌの細胞濃度で再懸濁 した。この懸濁液２００μｌを丸底マイクロプレート（９６ウエル）のウェルに 分配する。このプレートを８００ｇで５分間遠心分離し、上溝を取り除いた。

次に、細胞を、湿潤室中で１０μｇ　／　ｍ　ｌの濃度の抗体、すなわちＨＬＡ クラス１１抗原に対してはＤｉ−１２（Ｃａ＋ｒｅｌ　ｅｆ　ａｌ、、１９８１ ）およびＨＬＡクラス■抗原に対してはＩ　ＯＴ　２　（Ｉｍｍｕｎｏｔｅｃｈ 社、フランス）を２０μｍと共に４℃で３０分間インキュベーションする。

Ｈａｎｋ＋培養液中で８００ｇで５分間遠心分離によって３回洗浄し、上清を除 いた後、細胞を製造業者によって指示された希釈率でフルオレセイン（ＦＩＴＣ ）ｆＩｍｍｕｎｏｔｅｃｈ社、フランス）とカップリングしたヤギ抗マウス免疫 グロブリン抗体２０μｌと共に湿潤室で４℃で３０分間インキュベーションする 。細胞をＨｘｎｋｓ培養液中で３回洗浄し、フローサイトメトリーによって分析 する（ＡＴＣＯｄａｍ　Ｂ＋ｕｃｋｅ＋、フランス）。分析は、５，０００また は１０，０００個の細胞について４８８ｎｍの波長で行う。結果は、細胞分布ヒ ストグラムの形態で示され、螢光強度（対数尺度）を横軸として、細胞数を縦軸 とする。

実施例２：　サイトカインの精製 １、　細胞培養 に５６２細胞をＲＰＭ１１６４０　（フェノールレッドなし）中で３回洗浄して 、微量のＦｅ２を除去した後、ＲＰＭ１１６４０　（フェノールレッドなし）に 再懸濁し、２ｍＭグルタミンを加える。純粋なウシ胎児血清１０ｍ１を含む細孔 度５０ｋＤの透析バッグ （Ｓｐｅｃｌ＋ａｐｏ＋、Ｓｐｅｃｔｒｕｍ）を、ＲＰＭ１１６４０　Ｃフェノ ールレッドもＦｅ８もなし）９０ｍｌと２．５×１０７個の細胞とを含む培養フ ラスコに導入する。精製には、培養物２リツトルが必要であった。

細胞を３７℃で７２時間培養し、培養液を８００ｇで１５分間遠心分離し、ペレ ットを取り除き、上清を再度８００ｇで１５分間遠心分離した後、０，２２μｍ フィルターで濾過する。ＰＭＳ　Ｆを上清に加え、最終濃度を１ｍＭとする。

２、　第一の精製段階 上清をＡＩＪＩＣＯＮ　ＹＭＩＯ膜上で１００倍に濃縮した後、大容量の１ｍＭ 　ＰＭＳＦを含む１０ｍＭ／ｐＨ７，４リン酸緩衝液に対して透析を行う。アニ オン交換カラム（Ｍｏｎｏ　Ｑ、Ｐｈａ＋ｍａｃｉａ社、スウェーデン）を１０ 　ｍ　Ｍ　／　ｐＨ７，４リン酸緩衝液１０ｍ１で平衡にする。試料をカラムに 適用した後、１０ｍＭ／ｐＨ７，４緩衝液中でＮａＣ１を０から０．２５Ｍまで のグラディエンド２０ｍ１によって溶出する。

０．５ｍ１画分をカラム出口で集め、ＳＤＳの存在下にてポリアクリルアミドゲ ル（８から２５％までグラディエンド）上で分析する。次いで、ゲルを、製造業 者による指示通りに硝酸銀で染色する（Ｐｈａ＋ｔ　Ｓ７ｕｅｍ。

Ｐｈａ＋ｍａｃｉａ社、スウェーデン）。

次に、それぞれの画分の生物学的活性を、前記のプロトコールに従って完全ＲＰ Ｍ１１６４０培養液中で幾つかの希釈率で試験する。

３、　第二の精製段階 生物学的活性を有する画分をプールし、ＡＭＩＣＯＮ　ＹＭＩＯ膜上で１０倍に 濃縮し、試料をゲル濾過カラム（Ｓａｐｅ＋ｏ＋ｅ　１２．　Ｐｈａ＋ｍａｃｉ ａ社、スウェーデン）　５ＷＥＤＥＮ）に適用した後、濾過を１０ｍＭリン酸塩 １０．１５ＭＮ　ａ　Ｃｌ　／　ｐ　Ｈ ７，４緩衝液を用いて濾過を行う。カラムは予め一組の既知分子量のタンパク質 （Ｐｈａ＋ｍａｃｉａ　Ｋｉｔ）で検定しておき、１０ｍＭリン酸塩１０．１５ Ｍ　ＮａＣ１／ｐＨ７，４緩衝液で平衡にしておく。

０．２５ｍ１画分をカラム出口で集め、前記のプロトコールに従って分析する。

実施例３：　モノクローナル抗体の産生１、　免疫化 Ａ、　Ｂａ１ｂ／Ｃマウスを、下記のプロトコールに従って免疫化する。

ＰＢＳｏ、２５０ｍ１およびフロイント完全アジュバント０．２５０ｍ１中に精 製タンパク質１ｏｌ１ｇを含む溶液０．５ｍｌを皮下注射する。

８日後および２１日後に、フロインドアジュバントを含まないＰＨ１０，５ｍｌ 中に精製タンパク質１０μｇを含む溶液の第二および第三の皮下注射を行う。

最後の皮下注射は、フロインドアジュバントを含まないＰＨ１０，５ｍｌ中に精 製タンパク質１０μｇを含む溶液を用いて、細胞融合の５日前に行う。

２、　融合 ａ）　融合の前日に以下のことを行う。

ＨＡＴ培養液および融合溶液を調製する。

ＮＳＩマウス骨職骨細腫細胞２５０，０００個／ｍｌの濃度で完全ＲＰＭ１１６ ４０培養液に再懸濁する。

Ｂａ１ｂ／Ｃマウスの腹膜マクロファージを、冷０．１５Ｍ　ＮａＣｌ３ｍ１を 用いて腹膜腔を洗浄して取り出す。マクロファージを８００ｇで１０分間遠心分 離した後、５Ｘ１０”個／ｍｌの濃度でＨＡＴ培地に再懸濁し、ウェル当たり１ ００μｌで５個の微量培養プレート（９６ウエル）に分配する。次に、微量プレ ートをＣＯ２インキユベータ−（３７℃、７％ｃｏ２）に置く　。

ｂ）　融合の日に以下のことを行う。

ＮＳ１細胞を、ＲＰＭ１１６４０中で８ｏｏｇで１０分間遠心分離することによ って４回洗浄した後、ペレットを１０７個／ｍｌの濃度でＲＰＭ１１６４０中に 吸収させる。

免疫化したマウスの膵臓を取出し、ＲＰＭ１１６４０中で細断し、得られた細胞 を８００ｇで１０分間遠心分離し、ペレットをＲＰＭ１１６４０に１０７個／ｍ ｌの濃度で吸収させる。

ハイブリダイゼーション：　細胞融合は、５０ｍ１試験管中で、膵臓細胞５ｍｌ 　（５×１０７個）、Ｎｓ１細胞３ｍｌ　（３Ｘ１０７個）、およびＲＰＭ１１ ６４０４２ｍｌを混合することによって行う。試験管を８００ｇで１０分間遠心 分離し、ペレットを融合溶液１ｍｌに吸収させ、絶えず振盪を行いながら１分間 をがけて加えた。次に、試験管を振盪を行いながら、３７℃の水浴に９０秒間浸 漬する。

下記のプロトコールに従って完全ＲＰＭ１１６４０培地５０ｍ１を加えて、融合 を停止する。

３０秒間掛けて１ｍ１１ ３０秒間掛けて３ｍ　ｌ。

１分間掛けて１６ｍ　ｌ。

その後３０ｍ１゜ 試験官を室温で５分間放置、２００ｇで１０分間遠心分離し、得られたペレット を完全ＲＰＭ１１６４０培養液で２回洗浄し、２００ｇで１０分間遠心分離を行 う。

それぞれの遠心分離の後、細胞をできるだけ穏やかに処理する。細胞をＨＡＴ培 養液５０ｍ１に再懸濁し、マクロファージを含む微量プレートに、１００μｌ／ ウエルずつ分配する。プレートを００２インキユベーターに移す。

クローンの保存、　６日間培養した後に培養液の上溝を抜き取ってこれを新しい 培養液に代えることによって培養液を新しくする。培養の第二および第三週中に 、培養液によって選択されるハイブリッド細胞から成るコロニーが幾つかのウェ ルに出現した。

培養物上清を採取し、抗体の存在と反応性について試験し、目的とするクローン を取り出し、完全ＰＲＭ１１６４０培養液２ｍｌおよび正常なりａｌ’ｂ／Ｃマ ウスに由来する２×１０６個の牌臓細胞を含む２４ウエルの多量培養プレートに 移す。

サブクローンを行い、分泌クローンが培養中に保持されることを確かめる必要が ある。サブクローニングは限定希釈することによって行い、このために２００個 の細胞を完全ＲＰＭＩ　１６４０培養液１０ｍ１に再懸濁し、懸濁液を９６ウエ ルの微量培養プレートに分配し、６日間培養した後に培養液の上清を抜き取って これを新しい培養液に代えることによって培養液を新しくする。培養の第二およ び第三週中に、コロニーが幾つかのウェルに出現し、このクローンの培養物上清 を試験する。

精製タンパク質の微量ＥＬＩＳＡ微量プレートへの結合は、ｐＨ９，６の０．５ Ｍ炭炭酸塩型炭酸塩緩衝液中０．１μｇ　／　ｍ　ｌの濃度のタンパク質溶液を ウェル当たり１００μｍを３７℃で１時間インキュベーションすることによって 行う。過剰のタンパク質をＮａＣ１／Ｔｖｅｅｎ緩衝液で５回洗浄して除去する 。次に、プレートをＰ　Ｂ　Ｓ／３％ＢＳＡ　（ウシ血清アルブミン）溶液を用 いて３７℃で１時間飽和する。Ｎ　ａ　Ｃｌ　／　Ｔｖｅｅｎ緩衝液で５回洗浄 した後、異なるクローンの培養物上清１００μｌ／ｍｌを予めＰＢＳｌｏ、１％ Ｔｖｅｅｎ　２０で１／２に希釈しておいたものを加え、３７℃で１時間３０分 間インキュベーションする。

Ｎ　ａ　Ｃｌ　／　Ｔｖｅｅｎ緩衝液で５回洗浄した後、プレートに結合したマ ウス免疫グロブリンを、ペルオキシダーゼで標識したヤギ抗マウス免疫グロブリ ン抗体であって、ＰＢＳｌｏ、０５％Ｔｗｅｅｎ　２０／　３％ＢＳＡで（製造 業者の指示した希釈度まで）希釈したもの１００μｍ／ウェルと共にインキュベ ーションすることによって可視化する。プレートを３７°Ｃで１時間３０分間イ ンキュベーションした後、Ｎ　ａ　Ｃ１／　Ｔｗｅｅｎ緩衝液で５回洗浄する。

プレートに結合したペルオキシダーゼで標識した抗体の含量を、過酸化水素（Ｈ ２Ｏ２）（緩衝液１００ｍ　１当たりＯＰＤ４０ｍｇおよび１１０容のＨ２０２ ２０μｌを使用時に加える）の存在下にてＯＰＤ緩衝液中にオルト−フェニレン ジアミン（ＯＰ　Ｄ）を溶解したものを用いてペルオキシダーゼ活性を測定する ことによって評価する。

このＯＰＤ溶液２００μｌをそれぞれのウェルに加えると、数分後に暗所で着色 が現れ、次にこの反応を０．１Ｎ　Ｈ２Ｓ０４５０μｌ／ウエルを加えることに よって停止する。プレートを読み取るため、自動分光光度計を用いて４９２ｎｍ で吸光度を測定する。

ｂ）　抑制活性のブロック ＩＣＩＧ−７細胞を６ウエルの多量培養プレート（９０ｍ２／ウエル）中で組換 えＩ　ＦＮ−７（ＣＨＯ）の存在下にて細胞密度５×１０４個／ウェル／　２　 ｍ　ｌまで７２時間培養し、精製タンパク質およびハイブリドーマ上清を、抗体 を含む完全ＭＥＭ培養液で１／２まで希釈する。

Ｃ）　免疫プロット に５６２細胞の上清をＡＭＩＣＯＮ　ＹＭＩＯ膜上で１００倍に濃縮した後、多 量の１０ｍＭ／Ｉ）Ｈ７，４のリン酸緩衝液に対して透析する。この溶液１０μ ｌを、Ｌａｅｍｍｌｉ試料緩衝液４０μｌで希釈する。この試料を１００℃まで ２分間加熱した後、８〜２５％のグラディエンドを有するポリアクリルアミドゲ ル（Ｐｈａｒｍａｃｉａ社）に適用し、移動させて、（製造業者の指示したプロ トコールに従って、ＰｈａｓｔＳｙｓｌｅｍ　＋ｎｄ　Ｐｈａ＋ｔＴ＋ａｎｓｌ ！＋　Ｐｈａ＋ｍａｃｉａ）０．　４５１１ｍニトロセルロース膜上に移した後 、膜をＰ　Ｂ　Ｓ／３％ＢＳＡ溶液中で室温で３０分間インキュベーションする 。

ニトロセルロースを切断してストリップとして、分子に関して様々なモノクロー ナル抗体の反応性を試験する。

それぞれストリップを、ＰＢＳｌｏ、１％Ｔｖｅｅｎ　２０溶液で１／２に希釈 したそれぞれのハイブリドーマ培養物上清２ｍｌと共に４℃で一晩インキユベー ションする。Ｎａ　Ｃｌ　／　Ｔｖｅｅｎ緩衝液で５分間３回洗浄した後、スト リップをウサギ抗マウス免疫グロブリン抗体（ウサギ抗マウス、ＤＡＫＯ２４＋ ２）であって、Ｎ　ａ　Ｃｌ　／　Ｔｖｅｅｎ緩衝液で１１５００に希釈したも のと共に室温で１．５時間インキュベーションする。

Ｎ　ａ　Ｃｌ　／　Ｔｖｅｅｎ緩衝液中で４回洗浄した後、ストリップをＮ　ａ 　Ｃ１／　Ｔｗｅｅｎ緩衝液で１／４００に希釈した＾ＰＡＡＰ　Ｃｏｍｐｌｅ ｘ　（Ｓｅ＋ａ　Ｌａｂ）と共に室温で１．５時間インキュベーションする。ス トリップをＮ　ａ　Ｃ１／　Ｔｖｅｅｎ緩衝液で更に４回洗浄する。結合した抗 体を、下記のプロトコールに従って可視化する。ＮＢＴ　（５０ｍｇ／ｍ１）４ ００μｌをＮＢＴ緩衝液６０ｍ１に加え、解離の後、ＢＣＩ　Ｐ　（５０ｍｇ／ ｍ　ｌ）　２００ｕ　ｌを溶液に加える。

ストリップをこの溶液中に約５分間放置した後、水で洗浄し、Ｗｈａｆｍｘｎ　 ３ＭＭ　Ｃｈ＋ペーパー上で乾燥する。

実施例４：　相補性ＤＮＡのクローニング単離したコロニーを取り出し、ＬＢ１ ｍｌ中で３７℃で撹拌しながら３〜４時間インキュベーションし、細菌を次にＬ Ｂ５０ｍｌに移し、３７℃で撹拌しながらインキュベーションする。細菌を１， ２００ｇで２０分間遠心分離し、ペレットをＳＭ緩衝液２０ｍ１に吸収させる。

Ｙ１０９０細菌３００μＩを、３Ｍ緩衝液中で１１５００．０００１：希釈シタ ファージ１ｏｏμｌに加え、ファージ／細菌混合物を３７℃で２５分間インキュ ベーションする。軟質寒天（上面寒天）７．５ｍｌを加え、直ちにＬＢ／寒天／ アンピシリンを含む１５０ｍｍの皿に塗布する。この皿を４２°Ｃで４時間イン キュベーションした後、溶菌プラークを計数して、ライブラリーのタイターを測 定する。

Ｃ）　−回目のスクリーニング 試験のために６本の試験管を準備する。

ＳＭ／１０ｍＭ　ＭｇＳＯ４中にライブラリー由来の３×１０４個のファージを 含む懸濁液１００μｌを、新たに調製したＳＭ中のＹ１０９０細菌３００μｍに 加え、混合物を３７℃で２５分間インキュベーションする。上面寒天７．５ｍｌ をそれぞれの試験管に加え、直ちにＬＢ／寒天／アンピシリンを含む１５０ｍｍ の皿に塗布する。この皿を４２℃で４時間インキュベーションする。

６つの０．４５μｍニトロセルロースフィルターを１０ｍＭ　ＩＰＴＧ溶液に浸 漬し、数分間乾燥した後回の上に敷く。次いで、皿を３７℃で２時間インキュベ ーションする。フィルターを取り出した後、実験室温度でＰＢＳ／３％ＢＳＡ緩 衝液中で３０分間インキュベーションする（皿を試験の残りの間中４℃で保存す る）。

フィルターを、腹水の形態で産生されたものから選択され、Ｎ　ａ　Ｃ１／　Ｔ ｖｅｅｎ緩衝液で１１５００に希釈された４種の抗体の混合物に移す。フィルタ ーを４℃で一晩インキユベーションし、Ｎ　ａ　Ｃｌ　／Ｔｖｅｅｎ緩衝液中で ５分間４回洗浄した後、Ｎ　ａ　Ｃ１／　Ｔｖｅｅｎ緩衝液で１１５００に希釈 したウサギ抗マウス免疫グロブリン抗体（ウサギ抗マウスＤＡＫＯｚ４１２）と 共に実験室温度で１．５時間インキュベーションする。

Ｎ　ａ　ＣＬ　／　Ｔｖｅｅｎ緩衝液で５分間４回洗浄した後、フィルター（ｌ ａｃｕｎａｌをＮａＣｌ／τｗｒｅｎ緩衝液で１／４００に希釈したＡＰＡＡＰ 　Ｃｏｍｐｌｅｘ　（Ｓｅ＋ａ　Ｌａｂ）と共に、室温で１．５時間インキュベ ーションする。そのフィルターをＮａＣ１／Ｔｗｅｅｎ緩衝液で再び４回洗う。

陽性の溶菌プラークは下記のプロトコールに従って可視化する。

ＮＢＴ　（５０ｍｇ／ｍ１）４００μｍをＮＢＴ緩衝液６０ｍ１に加え、解離し た後、ＢＣＩ　Ｐ　（５０ｍｇ／ｍ１）２００μｌをこの溶液に加える。フィル ターをこの溶液中に、陽性の溶菌プラークが出現するまで（約５分間）暗所で放 置し、次に、フィルターを水で洗浄し、Ｗｂａｌｍａｎ　３ＨＣｈｔペーパー上 で数分間乾燥する。

ｄｌ　２回目の精製 一回目に陽性の溶菌プラークを逆パスツールピペットを用いて取り出し、このよ うにして取り出したそれぞれのプラグをＳ　Ｍ　／　１０　ｍ　Ｍ　Ｍ　ｇ　Ｓ 　Ｏ４緩衝液１ｍｌ中で一晩拡散させる。ファージを、ライブラリーの滴定につ いて記載した方法で滴定する。

それぞれの溶菌プラークには、８Ｍ７１０ｍＭＭｇＳＯ４緩衝液１００μＩに２ ００個のファージを懸濁したものを、ＳＭ中で新たに調製したＹ１０９０細菌１ ００μｌに加える。混合物３７℃で２５分間インキュベーションし、上面寒天３ ．５ｍｌをそれぞれの試験管に加え、直ちにＬＢ／寒天／アンピシリンを含む９ ０ｍｍの皿に塗布する。皿を４２℃でインキュベーションし、−回目と同様に処 理する。

ｅ）　３回目の精製 ２回目に陽性の溶菌プラークをパスツールピペットを用いて採取し、このように して取り出したそれぞれのプラグをＳ　Ｍ／　１０　ｍ　Ｍ　Ｍ　ｇ　Ｓ　Ｏ４ 緩衝液１ｍｌ中で一晩拡散させる。ファージを、ライブラリーの滴定について記 載した方法で滴定する。それぞれの溶菌プラークには、Ｓ　Ｍ／　１０　ｍ　Ｍ 　Ｍ　ｇ　Ｓ　Ｏ４緩衝液１００μｍに５０個のファージを懸濁したものを、Ｓ Ｍ中で新たに調製したＹ１０９０細菌１００μ【に加える。混合物３７℃で２５ 分間インキュベーションする。上面寒天３．５ｍｌをそれぞれの試験管に加え、 直ちにＬＢ／寒天／アンピシリンを含む９０ｍｍの皿に塗布する。皿を４２℃で インキュベーションし、−回目と同様に処理する。

幅を行う５×１０４個のファージを懸濁したものを、ＳＭ中で新たに調製したＹ １０９０細菌３００μｍに加え、混合物３７℃で２５分間インキュベーションす る。

上面寒天７．５ｍｌをそれぞれの試験管に加え、直ちにＬＢ／寒天／アンピシリ ンを含む１５０ｍｍ皿に塗布する。皿を４２℃で４時間インキュベーションした 後、ＳＭＩ　Ｏｍ　ｌ中で４℃で一晩インキユベーションする。拡散生成物を回 収し、皿をＳＭ緩衝液５ｍｌで洗浄する。

ファージを、ライブラリーの滴定について記載した方法で滴定する。

ｇ）　精製したファージの調製 Ｙ１０９０細菌の単離したコロニーを採取し、撹拌しながら３７℃でＬＢ１ｍｌ 中で３〜４時間インキュベーションした後、Ｌ８５０ｍｌに移し、３７℃で撹拌 しながら一晩インキユベーションする。細菌を１，２００ｇで２０分間遠心分離 し、ペレットをＳＭ緩衝液２０ｍ１に吸収させる。細菌の濃度を測定する（６０ ０　ｎｍでの１０Ｄ単位は８×１０８個／　ｍ　１の細菌に相当する）。

細菌およびファージを、２０の多重度で接触させる：ＳＭ／１０ｍＭ　Ｍｇ５０ ４１００μｌ中で１２×１０９個の細菌を３７℃で２５分間インキュベーション し、次にＬＢ／１０ｍＭ　ＭｇＭｇＳＯ４４Ｏ０を混合物に加える。この調製物 を撹拌しながら３７℃で３〜４時間インキュベーションする。６００ｎｍでの吸 光度を１時間後とに測定する。これは１．５に達し、０．５まで落ちるべきであ る。クロロホルムを加える（４００ｍ　ｌ当たり２ｍ　ｌ）。

混合物を撹拌しながら３７℃で２０分間インキュベーションする。４℃で１０， ０００ｒｐｍにて３０分間遠心分離した後、上清を回収し、最終濃度が２．５μ ｇ／ｍ１のＤＮＡ５ｅおよびＲＮＡ５ｅを加える。

調製物を撹拌しながら３７℃で４５分間インキュベーションし、（４００ｍ１当 たり）ＮａＣ１２４ｇおよび（４００ｍ　ｌ当たり）ＰＥＧ６０００　４０ｇを 連続して加える。０℃で１時間（または−晩）沈澱させた後、混合物を４℃にて １０．０００ｒｐｍで３０分間遠心分離する。上清を取り出して、試験管を吸取 り紙上で排水する。ペレットをＳＭ緩衝液１ｍｌに吸収させ、１０％ＳＤＳ　１ ０μｌおよびｐＨ８の０．５Ｍ　ＥＤＴＡＩＯμｌを加える。試験管を６８℃で １５分間インキュベーションする。

連続抽出は次のように行う＝１）クロロホルム、２）２×フエノール抽出、３） ２×フエノール／クロロホルム抽出、４）クロロホルム、５）４×エーテル抽出 。最終的な水層を６５℃で４０分間インキュベーションした後、冷イソプロパツ ール１容で沈澱させ、４℃にて１２．０００ｇで１５分間遠心分離する。上清を 除き、ペレットを８０％エタノール５００μｌで洗浄した後、４℃、１２．００ ０ｇにて１５分間遠心分離する。ペレットをｐＨ８のＴＥ緩衝液５０μＩに吸収 させ、２６０ｎｍでＯＤを測定した後、濃度を１００μｇ　／　ｍ　１に調制限 酵素ＥｃｏＲＩで消化した後、インサートを回収する： 精製ファージ２５μｌ　（２，５μｇ）１０×酵素緩衝液５０μｌ　（製造業者 により供給）ＭｉｌｌｉＱ　（Ｍｉｌｌｉｐｏ＋ｅ）蒸溜水４１５μＩＥｃｏＲ Ｉ酵素（９Ｉ　Ｕ／μｌ）　１０ｔｔ　ｌ。

混合物を３７℃で１．５時間インキュベーションし、次にＲＮＡ５ｅ　（１０ｇ ｇ／ｍ１）１０μｌを加えた後３７℃で３０分間インキュベーションする（ＲＮ Ａｓｅは使用前に１００℃に２０分間加熱した後、水冷する）。

１％アガロースゲル／Ｉ　ＸＴＡＥ緩衝液で消化を監視する。このために、溶液 ８μｌを採取し、負荷緩衝液２μｌを加える。ＩＸＴＡＥ緩衝液および０．５μ ｇ／ｍｌの濃度のＢＥＴの存在下にて、ミニ電気泳動セル中では８０ボルトで移 動が起こる。

消化溶液５００μｌをエッペンドルフ管に移し、フェノール／クロロホルム（Ｖ ／Ｖ）５００μｍを加える。

管を振盪して、１２，０００ｇで５分間遠心分離した後上部の水相を２本の新し い試験管に移して沈澱させる。

４Ｍ酢酸アンモニウム２５０μｌおよび冷無水エタノール１ｍｌを加える。試験 管をドライアイス中に１５分間放置し、数秒間加温し、４℃で１２’、０００ｇ にて１５分間遠心分離する。

上清を注意しながら除き、ペレットを８０％エタノール５００μｌで洗浄し、４ ℃、１２，０００ｇで１５分間遠心分離した後、乾燥する。ペレットを、蒸溜水 １０μｌに吸収させる。

プラスミドをＥｃｏＲＩで消化する。

プラスミドＣ１ｔｔｇ／ｕ　１）２０μＩ。

１０×酵素緩衝液（製造業者により供給）１０ｇ１１蒸溜水６０μｍ、 ＥｃｏＲＩ　（９１Ｕ／μ１）１０μｉ。

混合物を３７℃で１時間インキュベーションし、消化を１％アガロースゲル上で 前記の方法で確かめる。

消化溶液１００μｌをエツペンドルフ管に移し、フェノール／クロロホルム（Ｖ ／Ｖ）１００μｌを加える。

管を振盪し、１２．０００ｇ、４℃にて５分間遠心分離した後、上部水相を新し い管に移す。４Ｍ酢酸アンモニウム１００μｌおよび冷無水エタノール５００μ ｍを加え、管をドライアイス中に１５分間放置し、数秒間加温し、１２．０００ ｇ、４℃で１５分間遠心分離する。

上清を注意しながら取り除き、ペレット８０％エタノール５００μｌで洗浄し、 １２．０００ｇ、４℃テ１５分間遠心分離した後、乾燥する。ペレットを蒸溜水 １゜μｌに吸収させる。プラスミドをリン酸塩で処理する。

プラスミド１０μｍ、 １０×緩衝液１０μ１１ ホスファターゼ（ＩＩＵ）５μ１１ 蒸溜水７５μｍ。

試験管を３７℃で１時間半インキュベーションし、次にプラスミドを前記の方法 で沈澱させ、ペレットをｐＨ８のＴＥ緩衝液１０μｌに吸収させる。

ｂ）　ゲル上のプラスミドおよびインサートの精製Ｓｃ！Ｐｌａｑ＋ｕ　ＧＴＧ アガロース（ＦＭＣＢｉｏ？ｏｄｕｃＮｌの０．８％ゲルをＩＸＴＡＥ緩衝液中 で調製する。プラスミド１０μｌまたはファージＤＮＡｌ０μｌに、負荷緩衝液 ２μＩを加える。試料をゲルに適用すると、最終濃度が０．５μｇ／ｍｌのＢＥ Ｔの存在下にてＩＸＴＡＥ緩衝液中で２０ボルトで移動が起こり、移動前線は１ ０ｃｍに達する。

プラスミドおよびインサートに相当するアガロースのストリップをＵＶ照射下に て切り出し、エッペンドルフ管に回収し、管を６５℃に加熱し、溶融アガロース の容積を測定する。

Ｃ）　ライゲーション ライゲーションのために、 精製ベクター（２００ｎｇ）２μｌ。

精製インサート（２００ｎ　ｇ）　２μｍ、１０×リガーゼ緩衝液（製造業者に より供給）２μ１１蒸溜水１２μ１１および Ｔ４ＤＮＡリガーゼ２μｌ を含む試験管を１５℃で一晩インキユベーションする。

インサートを除いた試験管も調製する。

ＨＢＩＯＩ細菌の単離コロニーを取り出し、３７℃で一晩しＢ５０ｍｌ中で培養 する。密度を６００ｎｍで測定し、細菌をＬＢで希釈し、吸光度が０．１の細菌 ５００ｍ１を得る。細菌を撹拌しながら３７℃で吸光度が０．６となるまで再度 培養し、次にできるだけ手早く０℃まで冷却し、０℃、１，５００ｇで５分間遠 心分離し、上清を除いて、ペレットを冷５０ｍＭＣａＣ１２５００ｍｌに吸収さ せ、０℃で１時間インキュベーションする。１，２００ｇ、０℃で５分間遠心分 離をした後、上清を取り除いて、細菌を５０ｍＭＣａ　Ｃ１２／　２０％グリセ ロール５０ｍ１に再懸濁する。

細菌を直ちに使用し、または分割して一８０℃で凍結する。

２）　形質転換 ライゲーションのため、水中に保持した、滅菌した５ｍｌ試験管に、下記のもの を入れる。

ｐＨ８の１０ｍＭトリス−ＨＣｌ　２０μｌ、ライゲーション生成物５μ１１ １０ＸＴＭＣ緩衝液１０μ１１ コンピテント細菌（新たに調製したものまたは凍結晶）６５μ１０ 試験管を４℃で１５分間インキュベーションした後、４０℃で２分間、最後に室 温で１０分間インキュベーションする。Ｌ８１ｍｌをそれぞれの試験管に加え、 試験管を３７℃で１時間インキュベーションし、この懸濁液３００μｌを、ＬＢ ／寒天／アンピシリンを含む９０ｍｍ皿に塗布する。皿を３７℃で一晩インキュ ベー爪楊枝を用いて皿からコロニーを採取して、Ｌ８３ｍｌを含む試験管に入れ た後、３７℃で撹拌しながら一晩インキユベーションする。それぞれ懸濁液１． ２ｍｌをエツペンドルフ管に移し、細菌を１２，０００ｇ　（４℃）で１５分間 遠心分離することによって回収する。

上清を除いて、ペレットを置Ｔ緩衝液１００μｍおよびリゾチーム１０μＩに吸 収させる。試験管を１００℃で１分間、水中に５分間式れた後、室温で１０分間 遠心分離する。ペレットを爪楊枝を用いて取り出した後、冷無水エタノール２２ ０μｌ／管を加え、試験管をドライアイス中に１５分分間式る。試験管を加温し た後、４℃、１．２００ｇで１５分間遠心分離し、上清を除いて、ペレットを冷 ８０％エタノール５００μｌ／管で洗浄し、１２，０００ｇ、４℃で１０分間遠 心分離する。ペレットを乾燥し、次にそれぞれペレットを、ｐＨ７，５の１０ｍ Ｍトリス−ＨＣｌ　３０　μｌ　ｉ、：吸収させる。

］）　インサートの存在の確認 ミニ調製物１０μ１１ ＥｃｏＲＩ酵素緩衝液２μｍ。

蒸溜水６μｍ、 ＥｃｏＲＩ　（５０ＩＵ／、ｃｚ　１）２ａ　１０試験管を３７℃で１時間イン キュベーションする。それぞれの調製物１０μｌであって、消化したものまたは 消化していないもの、をアガロースゲル、ＩＸＴＡＥ緩衝液の１％に適用すると 、最終濃度０．５μｇ　／　ｍ　ｌでのＢＥＴを含むＩＸＴＡＥ緩衝液中で８０ ボルトで移動インサートを含むプラスミドの一つを増幅する。このために、目的 とするプラスミドを含む細菌５０μｌを、アンピシリンを含むＬＢ１０ｍｌ中で ３７℃で撹拌しながら一晩インキユベーションする。

吸光度を６００ｎｍで測定し、細菌をアンピシリンを含むＬＢで希釈し、吸光度 が０．１の培養物５００ｍｌを得る。細菌を２リツトル三角フラスコ中で３７℃ で撹拌しながら一晩インキユベーションする。細菌を４℃、１２．０００ｇで２ ０分間遠心分離し、プラスミドの精製は、Ｑｕ目ｇｅｌｌカラム上で製造業者の 指示に従って行う。

ｂ）　オリゴヌクレオチド合成 オリゴヌクレオチド合成を自動合成装置（ＡｐｐｌｉｅｄｂｉｏＢｕｅｍ）を用 いて行い、得られたオリゴヌクレオチドをカラムに結合させる。これを、カラム から２５％アンモニア溶液（３００μｍ、３００μｌおよび４００μｌ）を１ｍ ｌシリンジを用いて３回通過させることによって溶出させ、別のシリンジを用い て他端で回収する。アンモニア溶液のそれぞれの導入では、室温での１５分間の インキュベーションを行う。オリゴヌクレオチドを試験管に回収し、これを６５ ℃で一晩放置する。

オリゴヌクレオチドを４Ｍ硫酸アンモニウム１容および冷無水エタノール２．５ 容で沈澱させ、試験管をドライアイス中に１５分間置き、加温して、１．２，０ ００ｇ。

４℃で１５分間遠心分離する。上清［１ａｃｕｎａ］を除き、ペレットを冷８０ ％エタノール５００μｌで洗浄する。ペレットを乾燥し、蒸溜水５００μｌに吸 収させる。吸光度の測定は、２６０ｎｍで行い、オリゴヌクレオチド濃度を０． ８μＭに調整し、これを配列決定に用いることができる。

配列決定は、製造業者によって記載されている手法に従って、Ｐｈａ＋ｍａｃｉ ａ　Ｔ７配列決定キットを用いて行った。

反応生成物について、４６％尿素の存在下にて、ＩＸＴＢＥ緩衝液中で厚みが０ ．４ｍｍの８％ポリアクリルアミドゲル上で電気泳動を行った。それぞれ配列決 定の２回の適用は、２時間の間隔を置いて行う。

配列は幾つかの反応によって決定した。最初の２つの配列決定反応は、プラスミ ドのインサートの挿入部位に相当する２個のオリゴヌクレオチドを用いて行った 。次の２つの配列決定反応は、インサート上で読み取ることができる最後の塩基 に相当する２個の１５マーオリゴヌクレオチドを用いて行った。次の配列決定反 応は同様にして行い、すなわち２個の新規なオリゴヌクレオチドを選択して、合 成した。完全な配列が得られるまで、反応を連続して行った。

４、　ＰＣＲによるファージインサートの増幅ＰＣＲによるインサートは、Ｐｅ ＋ｋｉｎ　Ｅｌｍｅｒ−Ｃｒｔｕｓ装置上で増幅した。

３×１０７個／　ｍ　ｌのファージを含む保存溶液から、１０μＩを採取し、蒸 溜水４０μｌを加えた。試料を、１００℃に２分間加熱し、１２，０００ｇで１ ０分間遠心分離し、上清を回収する（ＰＣＲ用のＤＮＡ）。

ＰＣＲ反応： ＰＣＲ用のＤＮＡｌ０μ１１ １０×酵素緩衝液１０μ１１ １２４ｇＭ　ｄＮＴＰ２μｍ、 オリゴヌクレオチド１　（５０ｐＭ）１μ１１オリゴヌクレオチド２　（５０ｐ Ｍ）１μｍ、［３２Ｐ］　ＡＴＰで標識したオリゴヌクレオチド（３ｕＭ）１　 μ　１、 Ｔａｑ酵素（０，５１Ｕ／ｕ　ｌ）０．５μｍ。

蒸溜水７５．５μ１１ ３０サイクル： 変性：９４℃で３０秒間、 オリゴヌクレオチド結合：５５℃で４０秒間、伸張、７２℃で４０秒間。

最後のサイクルの伸張は、１０分間継続する。

５、ＰＣＲ後の配列決定 ＰＣＲ生成物を用い、（Ｍａｘａｍ　ａｎｄ　Ｇ１１ｂｅ＋ｔの配列決定用、Ａ ｍｅｒｓｈａｍ　ＲＰＮ　１５００）紙の切片上でｌｌａ！ａｍとＧ１１ｂｅ＋ ＋の手法に従って配列決定を行う。

Ａ＋Ｇ反応反応紙を６６％ギ酸水溶液中で室温で１０分間インキュベーションス ル。

Ｃ反応　紙を、ｐＨ６のヒドロキシルアミン／ヒドロクロリド２７５ｍｇ／ｍｌ 　１ｍｌ中で室温で１０分間インキュベーションする。

Ｃ反応、　紙を、ＤＭ３７μｌを含む５０ｍＭギ酸アンモニウム（ｐＨ３，５） １ｍｌ中で、室温で５分間インキュベーションする。

Ｔ＋Ｃ反応：　紙を、過マンガン酸カリウム１ｍｌ中で、室温で１０分間２回イ ンキュベーションする。

それぞれのフラグメントを蒸溜水で３０秒間３回洗浄し、９６％エタノール中で ３０秒間１回洗浄し、紙を空気中でそれぞれの洗浄の間に２分間乾燥する。次に 、フラグメントをピペリジン３００．ｃｚｌを含むエッペンドルフ管に移し、９ ０℃で３０分後、フラグメントを取り除き、管を乾燥させる。

ペレットを管当たり蒸溜水４０μｌに吸収させた後、乾燥する。この操作を３回 繰り返す。それぞれのペレットを、負荷緩衝液１５μｌに吸収させ、配列決定を 停止しくＰｈａ＋ｍａｃｉａ　ｋｉ＋）、試料を前記の様に８％ポリアクリルア ミドゲルに適用する。

ファージから精製したインサートをフレノウ酵素で処理する。

インサート（２００ｎｇ）２０μｌ。

ｄＡＴＰ　（０，５ｍＭ）２ｕ　１゜ ｄＣＴＰ　（０，５ｍＭ）２μＩ。

ｄＧＴＰ　（０，５ｍＭ）２ｕ　ｌ。

ｄＴＴＰ　（０，５ｍＭ）２．ＣＺ　ｌ。

１０×酵素緩衝液４μｌ。

蒸溜水６μｌ フレノウ酵素（２１Ｕ／μｍ）２μ１０試験管を３７℃で３０分間インキュベー ションした後、４Ｍ酢酸アンモニウム１容および冷無水エタノール２．５容を加 えてＤＮＡを沈澱させ、試験管をドライアイス中に１５分間置き、加温し、１２ ，０００ｇ、４℃で１５分間遠心分離する。上清を除いた後、ペレットを冷８０ ％エタノール５００μｌで洗浄し、１２，０００ｇ、４℃で１５分間遠心分離し 、乾燥して、蒸溜水１０μｌに吸収させる。

ライゲーション： この溶液５μ１１ ＢｓｔＸ１アダプター（３μｇ）３μ１１１０Ｘ酵素緩衝液１μｍ、 Ｔ４　ＤＮＡ　リガーゼ（２，５１Ｕ／μｌ）１μ１０試験管を１５℃で一晩イ ンキユベーションし、未結合アダプターを、Ｐｈａ＋ｍａｃｉａ　５ｅｐｈａｄ ｅｘ　５４００のカラム上で、製造業者の指示に従って除く。回収されたＤＮＡ を前記の方法で沈澱させ、ペレットを蒸溜水２１μｍに吸収させる。

次に、Ｂｓ　ｔ　Ｘｉ　（Ｉｎ　ｖＮ＋ｏｇｅｎ　Ｏ，２ｔｔｇ／ｕ　Ｉ）　Ｓ で切断したベクターＣＤＭ８　４μ１１ライゲーシヨン緩衝液（製造業者により 供給）３μ１１およびＴ４　ＤＮＡリガーゼ（２，５ＩＵ／μｍ）２μｌを加え 、試験管を１５℃で一晩インキユベーションする。試験管を一２０℃で保存する 。

細菌の単離コロニーを採取し、ＬＢ５０ｍｌ中で撹拌しながら３７℃で一晩培養 する。密度を６００ｎｍで測定し、これをＬＢで希釈し、吸光度０．１の細菌５ ００ｍ１を得る。この細菌を、６００ｎｍの吸光度が０．４〜０．５となるまで ３７℃で撹拌しながら再度培養し、細菌をできるだけ速やかに０℃まで冷却し、 ０℃で１５分間放置する。

細菌を、０℃、１，２００ｇで２０分間遠心分離し、上清を除いて、ペレットを 給蒸溜水１／２初期容積に吸収させ、この操作を４回繰り返す。上清を除いて、 ペレットを３０％グリセロール１容に吸収させ、細菌を直ちに用いるか、または 小分けにして一８０℃で凍結する。

ｂ）　エレクトロポレーション ライゲーション生成物２μｌおよびコンピテント細菌５０μｌを０．２ｃｍエレ クトロポレーションセル中で混合し、装置を２．４７０ｍＶ、４００オームおよ び２５μＦに設定する。

エレクトロポレーションの直後に、細菌をＳＯＣ培地１ｍｌに吸収させ、次に３ ７℃で撹拌しながら１時間インキュベーションする。細菌を、ＬＢ／寒天／アン ピシリン／テトラサイクリンの３個の皿に、１０μｍ１１００μｍまたは５００ μｌを塗布する。これらの皿を３７℃で一晩インキユベーションする。ミニ調製 物を作成し、前記の様にして、挿入を確認する。

インサートを有するコロニーから、プラスミドの大きめの調製物を前記と同様に して作成する。次いで、配列決定を行い、挿入の方向を決定する。

ｓ、　ｃｏｓ細胞の形質転換 タンパク質を合成することができる挿入方向を有するプラスミドの一つを用いて 、ＣＯ８細胞の電気泳動を行う。　ＣＯ８細胞を完全ＤＭＥＭ培地に接種し、２ ４時間後（５０〜７０％集密）に集める。細胞を、冷ＰＢＳ中で８００ｇで５分 間遠心分離することにより２回洗浄し、エレクトロポレーション緩衝液中に１０ ７個／ｍｌの細胞数で再懸濁する。

細胞懸濁液０．８ｍｌおよびプラスミド／インサート６０μｇを０．４ｃｍエレ クトロポレーションセル中で混合する。このセルを水中に１０分間置き、装置を ３８０ｍＶおよび２５μＦに設定する。エレクトロポレーションの直後に、セル を水中に１０分間置き、次に、細胞を７５Ｃｍ２フラスコ中で再度培養する。上 清を、４８時間後に採取して試験を行う。

９、　組換えタンパク質の活性の確認 エレクトロポレーションを行ったＣＯ８細胞の上清を用いて、ＩＣＩＧ−７細胞 の試験を行い、上清を完全ＭＥＭ培地で様々な希釈度で用い、試験を前記のよう にして行う。

参考文献 ＡＣＣＯＬＬＡ　Ｒ，Ｓ、、　ＣＡＲＲＡ　Ｇ、、　ＧＵＡＲＤＩＯＬＡ　Ｉｌ 、　Ｐ、　Ｎ、　Ａ、　Ｓ、　。

１９８５、８２：　５１４５−５１４９゜ＢＥＣＫＥＲＳ、；　５ｏｒｔ、１ｍ ｍｕｎｏ１．　Ｒｅｓ、、１９８５．　４＋　１３４−１４５゜８Ｏ３Ｓ　１． Ｍ、、ＳＴＲＯＭＩＮＧＥＲＩ、Ｌ、、　Ｐ、Ｎ、Ａ、Ｓ、、１９８６．　８３ ：９１３９−９１４３゜ ＤＥ　ＰＲＥＶＡＬ　Ｃ，、ＬＩＳＯＷＳＫＡ−ＧＲＯＳＰＩＥＲＲＥ　Ｂ、、 　ＬＯＣＨＥ　Ｍ、。

ＧＲＩＳＣＨＥＬＬＩ　Ｃ，、ＭＡＣＨＢ、、Ｎａｔｕｒｅ、１９８５．　３１ ８＋　２９１−２９３゜ＤＯＲＮ　Ａ、、　ＦＥＨＬＩＮＧ　Ｈ，Ｊ、、　ＫＯ ＣＨＷ、、ＬＥ　ＭεＵＲＭ、。

ＧＥＲＬＩＮＧＥＲＰ、、ＢＥＮＯＩＳＴ　Ｃ，、ＭＡＴＨＩＳ　Ｄ、；　Ｌｌ ｅｃｕｌａｒ　ｘｎｄＣｅｌｌｕｌａ「Ｂｉｏｌｏｇ７．　１９８Ｂ、ｇ：　３ ８７５−３９１１７゜ＤＯＲＮ　Ａ、、ＢＥＮＯＩＳＴ　Ｃ，、ＭＡＴＨＩＳ　 Ｄ、　；　Ｍｏ１ｅｃｕｌｚ＋　ａｎｄＣｅｌｌｕｌａｒ　ＢｉｏｌｏｇＦ、ｌ ！ｌｉｔ！１．　９：　３１２−３２０゜ＦＥＳＴＥＮＳＴＥＩＮ　Ｆ、、　Ｇ ＡＲＲＩＤＯＧ、：Ｌａ１ｕ＋ｅ、１９８６．　３２２．５０２−５［１３゜ ＫＯＣＨＷ、、　ＢＥＮＯＩＳＴ　Ｃ，、ＭＡＴＨＩＳ　Ｄ、　；　Ｍｏ１ｅｃ ｕｌｚ＋　ａｎｄＣｅｌｌｕｌａｒ　Ｂｉｏｌｏｇｙ、１９８９．　９：　３０ ３−３１１１゜ＮＡＴＡＬＩ　Ｐ、Ｇ、、５ＥＧＡＴＴＯＯ，、ＦＥＲＲＯＮＥ 　Ｓ、、　ＴＯＳＩ　Ｒ，。

Ｃ０ＲＴＥ　Ｇ、；　１ｍｍｕｎｏｇｅｎｒｔｉｃ＋、１９８４．　１９：　１ ０９−１１６゜ＲＡＤＫＡ　Ｓ、Ｆ、、　ＣＨＡＲＲＯＮ　Ｄｌ、、ＢＲＯＤＳ ＫＹ　Ｆ、Ｍ、；　Ｈｕｍ。

１ｍｍｕｎｏ１．、　１９８６．　１６：　３９Ｇ−４００゜ＩＣＩＧ−フ インヒビターの精製 濃縮および透析 Ｆ−Ｐ、　Ｌ、　Ｃ，５ｕｐｅｒｏｓｅ　１２補正書の翻訳文提出書（特許法第 １８４条の８）１、　特許出願の表示 ＰＣＴ／ＦＲ９２１０１１２３ ２、発明の名称 ＩＦＮ−ガンマーアンタゴニストサイトカイン３、特許出願人 住　所　フランス国パリ、リュ、ド、トルビアク、１０１名　称　アンステイテ ユ、ナショナル、ド、う、サント、工、ド、う、ルシェルシュ、メディカル（ア ンセルム）４、代　理　人 （郵便番号１００） （１）　補正書の翻訳文　１　通 請求の範囲 １、インターフェロン−γによる、細胞表面でのクラス１１の組織適合性抗原の 発現の誘導の特異的アンタゴニストであるサイトカインであって、 −第１図に記載のペプチド配列の全部または一部を含んでなるものであるか、ま たは前記の生物学的活性を保持するその変異体であり、 一細胞によって天然に分泌されたもの、または−原核または真核細胞における外 来性ＤＮＡ配列の発現生成物である、サイトカイン。

２、５ＤＳ−ポリアクリルアミドゲル上で測定した分子量が約１９，０００であ る、請求の範囲第１項に記載のサイトカイン。

３、　真核細胞における外来性ＤＮＡ配列の発現によって得られる、請求の範囲 第１項または第２項に記載のサイトカイン。

４、　宿主細胞での発現において、インターフェロン−γによる、細胞表面での クラス１１の組織適合性抗原の発現の誘導の特異的アンタゴニストであるサイト カインをコードするＤＮＡ配列、またはその配列に相補的なりＮＡ鎖であって、 下記のものから選択される、ＤＮＡ配列 ａ）　第１図のＤＮＡ配列、 ｂ）　遺伝子コードが縮重しているため、ａ）の配列によってコードされるもの と同じアミノ酸配列を有するサイトカインをコードする配列、 Ｃ）　前記のサイトカインのアミノ酸配列の変異体をコードし、前記の生物学的 活性を保持している配列。

５、　請求の範囲第１〜３項のいずれか１項に記載のサイトカインの全部または 一部、並びにその類似体および／または誘導体であって、前記のような前記サイ トカインの活性を保持するものの発現を特徴とする請求の範囲第４項に記載のＤ ＮＡ配列。

６、　検出可能な標識された分子と共有結合している、請求の範囲第４項または 第５項に記載のＤＮＡ配列。

７、　標識が同位体標識である、請求の範囲第６項に記載のＤＮＡ配列。

８、　標識が非同位体標識である、請求の範囲第６項に記載のＤＮＡ配列。

９、　形質転換され、または請求の範囲第４項または５項に記載のＤＮＡ配列で 形質転換またはトランスフェクションを行って、宿主細胞中において前記のサイ トカインを発現するようにした、真核性または原核性宿主細胞。

１０、　真核細胞である、請求の範囲第９項に記載の宿主細胞。

１１、　請求の範囲第４項または第５項に記載のＤＮＡ配列を含んでなる生物学 的機能を有するクローニングベクター。

１２、　請求の範囲第１１項に記載のクローニングベクターによって安定に形質 転換またはトランスフェクションされた、宿主細胞。

１３、　前記のサイトカインを、請求の範囲第９項、第１０項または第１２項の いずれか１項に記載の細胞の培養物の上清から精製する、請求の範囲第１項〜第 ３項のいずれか１項に記載のサイトカインの製造法。

１４、　細胞を、血清の混入タンパク質を欠いている適当な栄養培地で培養する 、請求の範囲第１３項に記載の方法。

１５、　血清が、分子量が５０ｋＤ以下に対して透過性である透析バッグに含ま れている、請求の範囲第１３項または第１４項に記載の方法。

１６、　請求の範囲第９項、第１０項または第１２項のいずれか１項に記載の宿 主細胞を適当な培地で培養し、サイトカインを発現するようにし、かつ所望なサ イトカインを特徴する請求の範囲第１項〜第３項のいずれか１項に記載のサイト カインの製造法。

１７、　請求の範囲第１項〜第３項のいずれか１項に記載のサイトカインに対す る、モノクローナル抗体。

１８、　請求の範囲第１項〜第３項のいずれか１項に記載のサイトカインに対す る、または請求の範囲第１３項〜第１６項のいずれが１項に記載の方法によって 得られる、免疫血清。

１９６　活性成分として、請求の範囲第１項〜第３項のいずれか１項に記載の、 または請求の範囲第１３項〜第１６項のいずれが１項に記載の方法によって得ら れるサイトカインを含んでなる、治療用組成物。

２、特許請求の範囲第４項〜第８項のいずれが１項に記載のＤＮＡ配列を活性成 分として含んでなる、治療用組成物。

２、特許請求の範囲第１７項に記載の抗体または請求の範囲第１８項に記載の免 疫血清を活性成分として含んでなる、治療用組成物。

２、特許請求の範囲第１７項に記載の少なくとも１個の抗体を含む、請求の範囲 第１項〜第３項の一つに記載のサイトカインの存在を診断するためのキット。

国際調査報告　ＰＣＴ／ＦＲ９２１０１１２３ＰＣＴ／ＦＲ９２１０１１２３ フロントベージの続き （５１）　Ｉｎｔ、　Ｃ１，６識別記号　庁内整理番号Ａ６１Ｋ　３９／３９５ 　Ｕ　９２８４−４ＣＣＯ７Ｋ　１４１５２　８３１８−４ＨＣ１２Ｎ　５／１ ０ Ｃ１２Ｐ　２１１０８　９１６１−４ＢＧＯＩＮ　３３１５３　Ｐ　８３１０− ２Ｊ／／（Ｃ１２Ｐ　２１１０２ Ｃ１２Ｒに９１） （Ｃ１２Ｐ　２１１０８ （７２）発明者　オージリーブルジエ、イベットフランス国パリ、リュ、エミー ルーデュポワ、６ Ｉ Ａ６１Ｋ　３７１０２　ＡＧＺ （７２）発明者　ブーシエ、クロード フランス国ビルジュイ、アレ、デ、フイヤンテイーヌ、２ （７２）発明者　ジャスマン、クロードフランス国パリ、リュ、レヌアール、７ ４

Claims (22)

【特許請求の範囲】
1. １．インターフェロン−γによる、細胞表面でのクラス１１の組織適合性抗原の 発現の誘導の特異的アンタゴニストであるサイトカインであって、 −第１図に記載のペプチド配列の全部または一部を含んでなるものであるか、ま たは上記の生物学的活性を保持するその変異体であり、 −細胞によって天然に分泌されたもの、または−原核または真核細胞における外 来性ＤＮＡ配列の発現生成物である、サイトカイン。
2. ２．ＳＤＳ−ポリアクリルアミドゲル上で測定した分子量が約１９、０００であ る、請求の範囲第１項に記載のサイトカイン。
3. ３．真核細胞における外来性ＤＮＡ配列の発現によって得られる、請求の範囲第 １項または第２項に記載のサイトカイン。
4. ４．宿主細胞での発現において、インターフェロン−γによる、細胞表面でのク ラス１１の組織適合性抗原の発現の誘導の特異的アンタゴニストであるサイトカ インをコードし、下記のものから選択される、ＤＮＡ配列。 ａ）第１図のＤＮＡ配列またはその相補性鎖、ｂ）ａ）のＤＮＡ配列またはその 一部とハイブリダイゼーションするＤＮＡ配列、および ｃ）遺伝子コードが縮重しているため、ａ）またはｂ）と同じアミノ酸配列を有 するサイトカインをコードする配列。 ｄ）前記のサイトカインの変異体をコードし、前記の生物学的活性を保持してい る配列。
5. ５．請求の範囲第１〜３項のいずれか１項に記載のサイトカインの全部または一 部、並びにその類似体および／または誘導体であって前記のような前記サイトカ インの活性を保持するものの発現をコードする、請求の範囲第４項に記載のＤＮ Ａ配列。
6. ６．検出可能な標識された分子と共有結合している、請求の範囲第４項または第 ５項に記載のＤＮＡ配列。
7. ７．標識が同位体標識である、請求の範囲第６項に記載のＤＮＡ配列。
8. ８．標識が非同位体標識である、請求の範囲第６項に記載のＤＮＡ配列。
9. ９．形質転換され、または請求の範囲第４項または５項に記載のＤＮＡ配列で形 質転換またはトランスフェクションを行って、宿主細胞中において前記のサイト カインを発現するようにした、真核性または原核性宿主細胞。
10. １０．真核細胞である、請求の範囲第９項に記載の宿主細胞。
11. １１．請求の範囲第４項または第５項に記載のＤＮＡ配列を含んでなる生物学的 機能を有する、クローニングベクター。
12. １２．請求の範囲第１１項に記載のクローニングベクターによって安定に形質転 換またはトランスフェクションされた、宿主細胞。
13. １３．前記サイトカインを、細胞培養物の上清から精製する、請求の範囲第１項 〜第３項のいずれか１項に記載のサイトカインの製造法。
14. １４．細胞を、血清の混入タンパク質を欠いている適当な栄養培地で培養する、 請求の範囲第１３項に記載の方法。
15. １５．血清が、分子量が５０ｋＤ以下に対して透過性である透析バッグに含まれ ている、請求の範囲第１３項または第１４項に記載の方法。
16. １６．請求の範囲第９項、第１０項または第１２項のいずれか１項に記載の宿主 細胞を適当な培地で培養し、サイトカインを発現するようにし、かつ所望なサイ トカインを単離する、請求の範囲第１項〜第３項のいずれか１項に記載のサイト カインの製造法。
17. １７．請求の範囲第１項〜第３項のいずれか１項に記載のサイトカインに対する 、モノクローナル抗体。
18. １８．請求の範囲第１項〜第３項のいずれか１項に記載のサイトカインに対する 、または請求の範囲第１３項〜第１６項のいずれか１項に記載の方法によって得 られる、免疫血清。
19. １９．活性成分として、請求の範囲第１項〜第３項のいずれか１項に記載の、ま たは請求の範囲第１３項〜第１６項のいずれか１項に記載の方法によって得られ るサイトカインを含んでなる、治療用組成物。
20. ２０．請求の範囲第４項〜第８項のいずれか１項に記載のＤＮＡ配列を活性成分 として含んでなる、治療組用成物。
21. ２１．請求の範囲第１７項に記載の抗体または請求の範囲第１８項に記載の免疫 血清を活性成分として含んでなる、治療用組成物。
22. ２２．請求の範囲第１７項に記載の少なくとも１個の抗体を含む、請求の範囲第 １項〜第３項の一つに記載のサイトカインの存在を診断するためのキット。