KR0144861B1 - 인간 b세포 자극인자-2에 대한 수용체 단백질 - Google Patents

인간 b세포 자극인자-2에 대한 수용체 단백질

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Abstract

내용 없음.

Description

인간 B세포 자극인자-2에 대한 수용체 단백질
제1도는 BSF2-비오틴-아비딘을 통해 형광 염색된 세포에 있어서의 형광염색 강도에 대한 세포의 분포를 나타낸 그래프로서, 여기서, (a)는 네가티브 벡터로 트랜스팩트된 세포에서 얻은 결과를 나타내고, (b)는 본 발명의 cDNA 함유 벡터로 트랜스팩트된 세포에서 얻은 결과를 나타내며, (c)는 과잉의 BSF2 존재하에서, 상기한 cDNA 함유 벡터로 트랜스팩트된 세포를 비오틴화된 BSF2로 처리하여 얻은 결과를 나타내며,
제2도는 본 발명의 실시예에 있어서의 모노사이트 U937 셀 라인에서 유래된, BSF2 수용체를 암호화하는 DNA 서열 함유 cDNA의 제한효소 절단지도이며, 여기서 사선 부분은 번역 개시 코돈 ATG로부터 번역 정지 코돈 TAG까지의 영역을 나타내며,
제3-1도 내지 제3-5도는 모노사이트 U937 셀 라인으로부터 유래된 BSF2 수용체를 암호화하는 영역을 함유하는 DNA 뉴클레오티드 서열과, 이 뉴클레이티드 서열로부터 추정되는 BSF2 수용체의 아미노산 서열을 나타낸 것으로, 여기서 하선 부분은 N-말단측의 소수성 영역을 나타내고, 2중 하선 부분은 C-말단측의 소수성 영역을 나타내며,
제4도는 노던 블로팅 분석 결과를 나타낸 것으로, 여기서 잡종화 신호의 유무는 모든 셀 라인으로부터 유래된 BSF2 수용체의 유무와 일치하는 것을 나타내며,
제5도는 플라스미드 p△BSF2RI.1의 제조과정을 나타낸 것이고,
제6도는 플라스미드 p△BSF2RII.5의 제조과정을 나타낸 것이고,
제7도는 플라스미드 p△BSF2R.236로 형질전환된 세포 COP의 형광염색에 있어서의 형광염색 강도에 대한 세포의 분포를 나타낸 그래프이고(여기서, a,b 및 c는 제1도에서와 같다.)
제8도는 플라스미드 p△BSF2RI.1로 형질전환된 세포 COP의 형광염색에 있어서의 형광염색 강도에 대한 세포의 분포를 나타낸 그래프이며(여기서, a,b 및 c는 제1도에서와 같다.)
제9도는 플라스미드 p△BSF2RII.5로 형질전환된 COP의 형광염색에 있어서의 형광염색 강도에 대한 세포의 분포를 나타낸 그래프이며(여기서, a,b 및 c는 제1도에서와 같다.)
제10도 a 및 b는 플라스미드 phBABSF2R의 제조과정과 이들의 구조를 나타낸 것이고,
제11도는 플라스미드 phBABSF2R에 의해 생산된 단백질이 BSF2와 특이적으로 결합하는 것을 나타낸 그래프이고,
제12도는 플라스미드 pSVL345의 제조과정을 나타낸 것이고,
제13도는 플라스미드 pSVL344의 제조과정을 나타낸 것이고,
제14도는 플라스미드 pSVL345 또는 pSVL324로 트랜스팩트된 COS-1 세포의 배양 상등액의 효소 면역어세이에 의한 가용성 BSF2 수용체 단백질의 검출 결과를 나타낸 것이고,
제15도는 플라스미드 pSVL345 또는 pSVL324로 트랜스팩트된 COS-1 세포의 배양 상등액중의 생성물이 BSF2와 특이적으로 결합하는 것을 나타낸 그래프이고,
제16도는 플라스미드 pSVL345 또는 pSVL324로 트랜스팩트된 COS-1 세포의 배양 상등액중의 생성물의125I-BSF2에로의 결합이 냉 BSF2에 의해 저해되는 것을 나타낸 그래프이고,
제17도는 플라스미드 pSVL345 또는 pSVL324로 트랜스팩트된 COS-1 세포의 배양 상등액중의 생성물이 MT18항체와 BSF2 양자와 결합하는 것을 나타낸 그래프이고,
제18도는 플라스미드 pSVL345 또는 pSVL324로 트랜스팩트된 COS-1 세포의 배양 상등액중의 생성물을 SDS-PAGE에 의해 분리하여 MT18 항체로 검출한, 전기 영동 패턴을 나타낸 것으로, 비교하기 위해 BSF2 수용체-생산세포 U266 세포 용해물의 결과도 겸하여 나타낸 도면이고,
제19도는 BSF2 수용체 단배질 및 이들의 단축형 단백질의 구조를 개략적으로 나타낸 도면이고,
제20도는 MT18 항체가 BSF2 수용체를 생산하는 세포에만 결합하는 것을 나타낸, 형광염색 강도에 대한 세포의 분포를 나타낸 그래프로서, 여기서, a는 BSF2 수용체를 생산하지 않는 JURKAT 세포에 대한 결과를 나타내고, b는 BSF2 수용체를 생산한느 NJBC8 세포에 대한 결과를 나타낸다.
본 발명은 인간 B세포 자극인자-2-에 대한 수용체 단백질(이하 BSF2 수용체라고 약칭한다) 및 BSF2 수용체를 암호화하는 DNA 서열, 그리고 유전공학기술을 이용하여 BSF2 수용체를 생산하는 방법에 관한 것이다.
B-세포 자극인자-2(BSF2)는 B-세포를 항체생산 세포로 분화시키는 인자로서 간주되어 왔다. 최근에는 BSF2를 암호화하는 cDNA가 분리되어, DNA 서열에 관한 정보와 정제된 BSF2의 부분 아미노산 서열에 관한 정보에 기초하여, BSF2는 28개의 아미노산 잔기로 구성되는 신호 펩티드를 가지는 184개의 아미노산 잔기로 이루어진 단백질로 확인되었다(T. Hirano, K. Yoshida and H. Harada et al, Nature, 324 73-76, 1986).
최근의 연구에 의하면, BSF2는 B-세포에 항체 생산을 유도하고, 히브리도마, 형질세포종, 골수종 등을 증식시켜 HLA류 I 항원의 발현을 유도하고, 헤파토시이트상에 급성기 단백질을 유도하며; 그리고 신경세포에 돌기를 유도하는 것으로 생각된다(T. Kishimoto and T. Hirano, Ann. Rev. Immunol. 6. 485, 1985).
상술한 바와 같이, BSF2는 여러가지 중요한 생리적인 활성을 가지고 있으며, 그리고 세포 증식에 광범위하게 관여하고 있다(Hirano et al, Summary of the 17th conference of Japan Immunology Association, p91, 1987).
한편, 히라노등은 BSF2의 비정상적 생성은 심방내 점액종, 자궁 경부암, 골수종, 만성 관절 류마티즘, 카슬만 증후군 등과 같은 병의 면역 장애의 병인인자가 될 수도 있다는 것을 보고하였다(Proc. Nat1. Acad. Sci, U.S.A., Vol. 84, pp228, 1987). 따라서, BSF2의 저해제의 개발은 상술한 질병의 진단약, 예방 또는 치료제의 개발에 연관이 되는 것으로 기대되고 있다.
티. 다가 등은 BSF2와 특이적으로 결합하는 세포막 상에 나타나는 BSF2 수용체를 분석하여, 각 세포상의 수와, BSF2와의 결합상수등을 보고하였다(J. Exp. Med. 196, pp967, 1987). 세포표면으로부터 이탈된 BSF2 수용체는 진단약, 예방 및 치료제 등으로서 기대되며, 따라서 BSF2 수용체에 대한 연구를 발전시키는데 큰 관심이 되고 있다.
BSF2 수용체의 연구를 더욱 발전시키고, 진단약, 예방 및 치료제를 개발하기 위해서는 많은 양의 정제된 BSF2 수용체를 얻을 필요가 있으나, 생체내에서 생산되는 이 수용체의 양은 매우 소량이다.
생체내에 매우 소량으로 존재하는 BSF2 수용체와 같은 단백질의 대량생산에는 유전자 조작으로 알려져 있기도 하는, 유전공학 기술이 사용된다. 이 기술에 의하면 목적하는 단백질을 암호화화는 DNA 서열이 클로운되고, 클로운 된 DNA 서열은 프로모터와 같은 조절 DNA 서열과 판독가능하게 연결되고, 그리고 이 DNA 서열은 벡터에 삽입되어 발현 벡터를 만들고 이어서 숙주 세포를 형질전환시키는데 사용된다. 형질전환세포는 배양에 의해 목적하는 단백질을 생산한다. 표적 단백질을 생산하기 위해, 이러한 유전공학 방법을 사용하는데 있어서는 표적 단백질을 암화화하는 DNA 서열을 얻는 것이 필요하다. 그러나, BSF2 수용체를 암호화하는 유전자는 아직까지 클로운 되지 않았다.
따라서, 본 발명은 BSF2 수용체 단백질, 이 BSF2 수용체 단백질을 암호화하는 DNA 서열, 이 DNA 서열을 함유하는 벡터; 이 벡터로 형질 전환된 숙주세포; 그리고 이 형질전환 세포를 사용하여 BSF2 수용체를 생산하는 방법을 제공한다.
더욱 상술하면, 본 발명은 인간 B세포 자극인자-2와 특이적으로 결합할 수 있는 인간 B세포 자극인자-2의 분리된 수용체 단백질을 제공한다. 본 발명은 또한 상술한 수용체 단백질을 암호화하는 DNA를 제공한다.
또한 본 발명은 상술한 DNA를 함유하는 발현 벡터를 제공한다.
나아가서는, 본 발명은 상술한 발현벡터로 형질전환된 숙주미생물을 제공한다.
이외에도, 본 발명은 배지내에서 숙주미생물을 배양하여, 수용체 단백질을 생성시키고, 이 생성된 수용체 단백질을 이 배양물로부터 회수하는 것을 특징으로 하는 수용체 단백질의 제조방법을 제공한다.
또한 본 발명은 수용체 단백질과 특이적으로 반응하는 항체를 제공한다.
본 발명은 또한 수용체 단백질과 특이적으로 반응하는 히브리도마를 생산하는 모노클로날 항체를 제공한다.
이하, 바람직한 실시형태를 기술한다.
BSF2 수용체
본 발명은 분리된 형태의 B세포 자극인자-2에 대한 인간 수용체(이후 BSF2 수용체라 함)에 관한 것이다. BSF2 수용체는 인간 B세포 자극인자-2와 특이적으로 결합하는 단백질이고, 원래는 생체내에서 생산되며, 세포막상에 존재한다. 본 발명에 의한 BSF2 수용체는 상술한 미생물학적 활성을 갖는 모든 단백질이 포함된다. 하나의 실시형태로서, 본 발명의 BSF2 수용체 단백질은 다음 아미노산 서열(I)을 갖는다:
Figure kpo00001
Figure kpo00002
여기서, Ala는 L-알라닌, Arg는 L-아르기닌, Asn은 L-아스파라긴을 나타내며, Asp는 L-아스파트산을 나타내며, Cys는 L-시스테인을 나타내며, Gln은 L-글루타민을 나타내며, Glu는 L-글루탐산을 나타내며, Gly는 글리신을 나타내며, His는 L-히스티딘을 나타내며, Ile은 L-이소로이신을 나타내며, Lue는 L-로이신을 나타내며, Lys은 L-라이신을 나타내며, Met는 L-메티오닌을 나타내며, Phe는 L-페닐알라닌을 나타내며, Pro는 L-프롤린을 나타내며, Ser은 L-세린을 나타내며, Thr은 L-트레오닌을 나타내며, Trp는 L-트립토판을 나타내며, Tyr은 L-티로신을 나타내며, 그리고 Val은 L-발린을 나타낸다.
서열(I)에 의해 표시되는 본 발명의 BSF2 수용체 단백질의 아미노산 서열은 468개의 아미노산 잔기로 구성되어 있고, 두개의 소수성 영역, 즉, 두번째 로이신으로부터 22번째 프롤린까지의 N-말단 소수성 영역과 362번째 발린으로부터 386번째 로이신까지의 C-말단 소수성 영역을 함유한다. 전자는 신호 펩티드 영역으로 예측되며, 후자는 세포막을 통해 단백질의 투과에 기여하는 영역으로 예측된다(막투과 부위). 본 발명에서는 신호 펩티드 영역과 막 투과 영역간의 영역을 세포외 단백질 영역이라고 칭하고, 막 투과 영역으로부터 C-말단 영역을 세포내 단백질 영역이라고 칭한다.
본 발명의 BSF2 수용체에는 상술한 특정 아미노산 서열을 갖는 단백질 이외에, BSF2와 특이적으로 결합할 수 있는 모든 단백질 또는 폴리펩티드가 포함된다. 예를 들면, 천연 BSF2 수용체의 미생물학적 활성은 그대로 유지하면서, 상술한 아미노산 내의 하나 이상의 아미노산 잔기가 다른 아미노산 잔기로 대체된 것; 하나 이상의 아미노산 잔기가 제거된 것; 또는 상술한 아미노산 서열에 하나 이상의 아미노산 잔기가 첨가된 변성 단백질 또는 폴리펩티드이다. 예를 들면, BSF2와의 결합에 관련되는, 상술한 아미노산 서열내의 영역을 제외한 아미노산 서열 및/또는 아미노산 잔기가 제거되거나 또는 다른 아미노산 서열 및/또는 아미노산 잔기로 대체된 단백질, 그리고 이의 N-말단 및/또는 C-말단측의 상술한 아미노산 서열에 아미노산 서열 및/또는 아미노산 잔기가 첨가된 단백질이다. 더욱이, 본 발명의 BSF2 수용체는 상술한 단백질중 어느 하나가 인간 성장호르몬과 같은 다른 단백질과, 또는 이들의 단편과 융합된 융합단백질일 수 있다.
예를 들면, 상술한 아미노산 서열(I)내의 아미노산 잔기가 제거된 미생물학적으로 활성인 변성 단백질에는 아미노산 서열(I)내의 N-말단 부근의 아미노산 잔기가 제거된 단백질이 포함된다. 이러한 변성된 단백질은 아미노산 서열(I)에서 28번째 아미노산부터 109번째 아미노산까지의 아미노산 서열이 제거된 아미노산 서열을 가지며, 다음의 아미노산 서열(II)을 갖는다:
Figure kpo00003
Figure kpo00004
더 나아가, 미생물학적으로 활성인 변성 단백질의 다른 형태로서 상술한 아미노산 서열(I)내의 아미노산 잔기가 제거된 것으로는 아미노산 서열(I)내의 C-말단부의 아미노산 잔기가 제거된 단백질이 포함된다. 이러한 변성 단백질은 324번째 아미노산부터 468번째 아미노산까지의 아미노산 서열이 제거된 아미노산 서열을 가지며, 다음의 아미노산 서열(III)을 갖는다:
Figure kpo00005
아미노산 서열(I)의 C-말단부가 제거된 변성된, 또다른 단백질은 다음의 아미노산 서열(IV)을 갖는다.
Figure kpo00006
BSF2 수용체를 암호화하는 DNA 서열
본 발명의 DNA 서열은 상술한 BSF2 수용체 단백중 어느 하나를 암호화하는 DNA 서열을 포함한다.
한 실시형태에서, 본 발명의 DNA 서열은 서열(I)로 표시되는 아미노산 서열을 암호화하는 DNA 서열이다. 코돈의 디제너러시(degeneracy)에 기인하여, 많은 특수한 DNA 서열이 있을 수 있다. 본 발명의 DNA 서열은 종래의 어느 방법에 의해서나 제조될 수가 있다. 예를 들면, BSF2 수용체 단백질의 생산을 위해 선택된 숙주 세포내에서 자주 사용되는 코돈을 고려하여 상술한 아미노산 서열에 따라서 본 발명의 DNA의 뉴클레오티드 서열을 고안할 수 있으며, 그리고 화학적으로 합성할 수 있다. 이와 달리, 목적하는 DNA는 BSF2 수용체 생산세포의 게놈으로부터 제조될 수 있다.
그러나 가장 편리하게는, BSF2 수용체를 암호화하는 유전자를 함유한 DNA 단편은 NK 세포 YT, 모노사이트 셀 라인 U937, 미에로마 셀 라인 U266, B세포 CESS 등과 같은 BSF2 수용체 생산 세포로부터 cDNA로서 제조할 수 있다. 즉, mRNA는 통상의 방법으로 상술한 셀 라인중 어느 배양 세포에서 추출하여, 이 mRNA에 기초하여 cDNA 라이브라리(library)를 만들 수가 있다.
cDNA 라이브라리는 상술한 서열(II)의 일부에 대응하는 올리고 뉴클레오티드프로브를 사용하여 선별할 수 있다. 대안으로서, 바람직하기는 본 발명에 따라, cDNA 라이브라리를 프로브 없이 선별하는 것이다. 이 방법에서, cDNA 라이브라리를 사용하여 cDNA 함유 벡터를 제조한 다음, 이어서 이 벡터를 사용하여 동물세포를 형질전환시킨다. 이 형질전환된 세포는 이어서 배양하고, 배양된 세포는 비오틴화된 BSF2 제제로 처리한다. 이 과정 동안, BSF2 수용체를 발현한 세포는 비오틴화된 BSF2의 BSF2 잔기에 결합한다. 이와 같이 처리된 세포는 이어서 플루오레스세인 이소시아네이트와 콘쥬게이트된 아비딘으로 처리하여 세포에 고정된 비오틴잔기와 아비딘-플루오레스세인 이소시아네이트 콘쥬게이트의 아비딘 잔기를 반응시킨다. 이어서, BSF2 수용체를 발현하여 이로 인해 이들 표면상에 플루오레스세인이소시아네이트를 가지는 세포를 분리하는 세포 소오터(sorter)에 의해 선별한다. 이어서 선별된 세포로부터 BSF2 수용체를 암호화하는, 목적하는 cDNA를 추출한다. 이와 같이 하여 얻은 cDNA는 다음 서열(V)을 갖는다:
Figure kpo00007
Figure kpo00008
본 발명의 DNA 서열은, 상술한 서열(V)이외에 상술한 서열(V)내의 뉴클레오티드 하나 이상이 다른 뉴클레오티드로 대치된 것, 또는 상기 서열(V)로부터 하나 이상의 코돈이 첨가되거나 또는 제거된 것으로서 여전히 BSF2에 결합할 수 있는 단백질을 암화화하는 것이 포함된다.
예를 들면, 단축 또는 절단된 BSF2 수용체 단백질을 암호화하는 상술한 뉴클레오티드 서열(V)를 갖는 cDNA를 적절한 제한 효소로 절단하여 뉴클레오티드 서열 일부를 제거한 후, 필요에 따라 절단된 DNA 단편을 적절한 결합제를 통해 재연결시켜서 제조할 수가 있다.
예를 들면, 뉴클레이티드 서열(V)을 갖는 cDNA 함유 벡터는 실시예 6에 따라 조작하여 상기한 아미노산 서열(I)의 아미노산 서열 1내지 123 및 아미노산 서열 343 내지 468로 구성되는 단백질을 암호화하는 DNA 함유 벡터를 제조할 수 있다. 유사하게, 아미노산 서열(I)의 아미노산 서열 1 내지 27과 아미노산 서열 110 내지 468로 구성되는 단백질을 암호화하는 DNA 함유 벡터도 제조할 수 있다.
다른 실시 형태로서, 상술한 벡터내의 어느 뉴클레오티드는 부위-특이적 시험관내 돌연변이 유발에 의해 제거되거나 또는 다른 뉴클레오티드로 대체될 수 있다. 이와 같은 방법으로, 번역정지 코돈을 BSF2 수용체 단백질을 암호화하는 cDNA의 어느 위치에나 삽입하여 C-말단이 절단된 BSF2 수용체 단백질을 암호화하는 DNA를 얻을 수 있다. 예를 들면, 실시예 11에서 보는 바와 같이, 아미노산 서열(I)의 아미노산 서열 1 내지 344를 갖는 단백질을 암호화하는 DNA 함유 벡터를 제조할 수 있다. 이와 유사한 방법에 따라, 아미노산 서열(I)의 아미노산 서열 1 내지 323을 갖는 단백질을 암호화하는 DNA 함유 벡터를 제조할 수 있다.
다음에, DNA, 예를 들면, BSF2 수용체를 암호화하는 cDNA는 숙주내에서 BSF2 수용체의 발현에 필요한 DNA 서열과 연결한다. 이러한 DNA 서열에는 프로모터, 전사 및 번역의 개시 코돈 및 정지 코돈이 포함되며, 사용된 숙주의 특성에 따라서 선택된다. 발현에 필요한 DNA 서열중에서, 프로모터가 중요하다. 박테리아 숙주로서 사용될 수 있는 프로모터에는 β-락타마제 및 락토스 프로모터, 트립토판 프로모터와 같은 공지된 프로모터와 이들로부터 유도되는 히브리드 프로모터가 포함된다. 효모 숙주의 경우, 예를 들면, GAL4 프로모터가 사용될 수 있다.
상술한 BSF2 수용체의 발현에 필요한 DNA 서열이외에, 바람직하기로는 리보좀 결합부위와 같은 다른 조절 서열을 BSF2 수용체를 암호화하는 DNA와 연결시킨다.
BSF2 수용체를 암호화하는 DNA 서열은 상술한 BSF2 수용체의 발현에 필요한 DNA 서열에 연결되어서, BSF2 수용체를 암호화하는 DNA 서열이 BSF2의 발현에 필요한 DNA 서열의 조절하에 선택된 숙주내로 전사되어 형질전환할 수 있게 된다. 결합은 통상적으로 결합될 DNA 서열의 응집성 말단 또는 둔단(blunt ends)을 통해, 바람직하기는 응집성 말단을 통해 수행된다.
본 발명의 바람직한 실시형태에 의하면, BSF2 수용체 단백질은 인간 성장 호르몬 단백질과 같은, 파트너 단백질과의 융합 단백질로서 발현될 수 있다. 이런 경우에, BSF2 수용체를 암호화하는 DNA 서열의 5'-말단은 인간 성장 호르몬 단백질과 같은 파트너 단백질을 암호화하는 DNA 서열의 3'-말단과 리딩 프레임(reading frame)내에서 연결된다.
발현벡터
본 발명의 발현 벡터는 BSF2 수용체의 발현에 필요한 DNA 서열과 결합된 상술한 BSF2 수용체를 암호화하는 DNA 서열 이외에, 복제 원(origin)과 하나 이상의 선택성 표지체 유전자를 함유한다. 발현벡터의 이들 성분들은 사용되는 숙주미생물에 따라 선택된다. 예를 들면, E. Coli와 같은 박테리아가 숙주로서 사용될 때에는, 복제원은 pBR322, pBR337 등과 같은 통상적인 E. Coli 플라스미드로부터 유래된다. 효모 숙주의 경우, 복제원은 Cal4 또는 α-인자가 바람직하다. 포유류 세포와 같은 동물 세포가 숙주 세포로 사용될 때에는, 복제원은 SV40 바이러스와 같은 바이러스로부터 유래된 것이 바람직하다.
또한 선택성 표지체 유전자의 선택은 숙주 미생물에 따라 달라진다. 박테리아 숙주에 유용한 선택성 표지체 유전자는, 예를 들면 암피실린 내성 유전자, 테트라사이클린 내성 유전자 등이다.
숙주미생물
본 발명에서, 미생물을 포함한 통상적인 숙주 미생물 및 동물세포가 사용될 수 있다. 박테리아 숙주로서, K-12, X-1776, W-3110, MC 1009 등과 같은 E. Coli의 각종 균주가 전형적으로 사용된다. 또한 바실루스 서브틸리스(Bacillus subtilis)와 같은 바실루스, 살모넬라 티피머리움(Salmonella Typhimurium), 세라티아 마르세신스(Serratia marcescens), 슈도모나스(Pseudomonas), 그리고 일부 고온성 박테리아도 사용할 수 있다. 효소숙주로서, 예를 들면, 사카로마이세스, 세레비시아(Saccharomyces cerevisiae)와 같은 사카로마이세스(Saccharomyces)도 사용될 수 있다. 그리고 포유류 숙주로서, 원숭이의 신장 섬유 아세포로부터 유래된 COS 세포, CHO 세포(챠이니스 햄스터 난소 세포), W138, BHK, 3T3, VERO, HeLa, 등과 같은 셀 라인이 사용될 수 있다.
형질 전환체를 사용한 BSF2 수용체의 생산
BSF2 수용체는 상술한 숙주를 상술한 발현 벡터로 형질전환시켜서 제조한 형질전환체 세포를 배양하여 BSF2 수용체를 발현시키고, 배양물로부터 BSF2 수용체를 회수하여 생산한다. 발현은 발현벡터 내의 프로모터의 탈-억제 또는 활성화에 의해서 유발된다. 통상, 형질전환체 세포는 프로모터가 억제되는 조건하에서 소정밀도로 증식시키고, 그후, 프로모터를 탈-억제 또는 활성화시켜서 BSF2 수용체를 발현시킨다. 이 목적을 위해서, 예를 들면, trp 프로모터용으로 인돌 아세트산(IAA)이, tac 프로모터용으로는 이소프로필-β-D-티오갈락토피라노시드(IPTG)가 사용된다.
BSF2 수용체에 대한 항체
본 발명은 또한 BSF2 수용체에 대한 항체를 제공한다. 본 발명의 항체는 상술한 BSF2 수용체를 생산하는 셀 라인에 의해 생산되는 BSF2 수용체 또는 상술한 재조합 BSF2 수용체와 특이적으로 결합하는 모든 항체가 포함된다. 항체는 폴리클로날 또는 모노클로날이 포함되며, 인간, 쥐, 토끼, 양, 염소 또는 이들 동물로부터 유래되는 히브리도마에 의해 생산될 수 있다. 폴리클로날 항체를 생산하기 위해 동물을 면역시키거나 또는 모노클로날 항체의 생산을 위한 히브리도마를 제조하는데 사용되는 항원으로서, BSF2 수용체를 발현하는 세포, 상술한 셀 라인에 의해 생산된 BSF2 수용체 단백질 및 각종의 재조합 BSF2 수용체 단백질이 사용될 수가 있다.
본 발명에 의한 폴리클로닐 및 모노클로날 항체는 공지된 방법으로 제조할 수 있다.
본 발명에 따라, BSF2 수용체 단백질을 암호화하는 DNA 서열, 이 DNA 서열을 함유한 발현 벡터, 그리고 이 DNA 서열을 함유한 형질전환체가 제공된다. 형질전환체를 사용하여 비정상적인 BSF2의 생산에서 수반되는 질병 또는 장애에 대한 예방, 치료약품 및 진단시약의 개발에 기여하는, 많은 양의 BSF2 수용체 단백질을 생산할 수 있다. 또한, 정제된 형태의 BSF2 수용체 단백질을 이용할 수 있게 됨으로써 BSF2 또는 BSF2 수용체와 관련된 면역 메카니즘의 연구를 촉진시킬 수 있다.
또한 DNA 서열 그 자체는 관련된 유전자를 선별하는 프로브로서 유용하다.
[실시예]
하기 실시예는 본 발명을 더욱 상세히 설명하기 위해 제시된 것이며, 이들 실시예로서 본 발명을 제한하기 위한 것은 아니다.
[실시예 1]
셀라인 상의 BSF2 수용체의 존재 확인
BSF2 수용체는 BSF2와 특이적으로 결합한다[T. Taga et al., J. Exp. Med., 166, pp967, 1987]. 이러한 성질을 이용함으로써, NK 세포 YT, 모토사이트 U937 셀 라인, 골수종 U266 셀라인, T-세포 Jurkat 셀라인, B-세포 CESS 셀 라인 및 B-세포 BL29 셀 라인에 대해 BSF2 수용체의 존재여부에 대한 시험을 행하였다.
이들 각 셀 라인의 세포를 10%의 송아지 태아 혈청(FCS)을 첨가한 둘베코의 개량된 이글 배지(D-MEM; Dulbeccos)중에서 통상의 방법에 따라 배양하였다. BSF2는 문헌(Nature 324(6) p. 73-76, 1986)에 기술된 방법에 따라 제조하였다. BSF2는 또한 일본국 특허출원 공개 (소)61-24697호에 기술된 방법에 따라 제조할 수도 있다.
이와 같이 하여 제조된 BSF2는 티. 타가 등의 방법(T. Taga et al., J. Exp. Med. 166, 967, 1987]에 따라124I로 표지하였다.124I로 표지된 BSF2는 상기한 타가 등의 방법에 따라 상기에서 언급한 배양된 세포와 반응시켰다. 세포와 비-특이적으로 결합된124I로 표지 BSF2는 세척해 낸후, BSF2 생산 세포와 특이적으로 결합한124I를 신틸레이션 계수기로 검색하였다. 이 결과, BSF2 수용체는 B-세포 BL29 셀 라인 및 T-세포 Jurkat 셀 라인의 경우를 제외하고는, 시험된 모든 셀라인의 세포에서 검출되었다.
[실시예 2]
mRNA의 분리
mRNA의 분리는 매니스티스 등의 방법(Manistis et al., Molecular Cloning, Cold Spring Harbor Laboratory, 1982)에 따라 수행하였다.
모노사이트 U937(ATCC-CRL-1593)은 실시예 1에 기술된 방법과 동일한 방법으로 배양하고, 배양된 세포는 생리 염수로 세척하였다. 세척한 세포를 50% 구아니딘이소티오시아네이트 용액에 현탁시키고 이 현탁액을 5.7M 염화세슘 및 2.7M 염화세슘을 사용하여 32000rpm에서 20시간동안 염화세슘 밀도균배 원심분리를 행하여 m-RNA의 혼합물을 수득하였다. mRNA는 나트륨 라우로일 사르코시네이트 용액에 현탁시키고 페놀 추출 및 에탄올 침전에 의해 정제하였다.
[실시예 3]
cDNA 라이브라리의 제조
수득한 mRNA 획분을 cDNA 합성용 템퍼레이트(temperate)로서 사용하였다. cDNA 합성 킷트(Applied Biosystems)를 사용하여 합성하여 cDNA 라이브라리를 얻었다.
[실시예 4]
목적하는 cDNA 클로운의 클로닝
숙주로서 COS 세포(COS-7 세포)를 사용하고, COS 세포에 적합한 벡터로서는 문헌(Brian Seed, Nature 329, p.840, 1987)에 기술된 CDM8 벡터를 사용하였다. 이 CDM8 벡터에는 시토메갈로바이러스(cytomegalovirus) 프로모터와 SV40 바이러스로부터의 복제원 뿐만 아니라 시토메갈로바이러스 프로모터 하류의 제한 효소 절단 부위가 함유된다.
절제한 cDNA's는 제한효소 Bst×1으로 소화한 CDM8 벡터에 연결시킨 다음, 얻어진 cDNA 삽입물을 함유하는 벡터를 사용하여 COS 세포를 형질전환시켰다. 즉 COS 세포를 10% FCS가 첨가된 D-MEN중에서 배양한 후, DEAE-덱스트란법에 따라 형질전환시키고 형질전환된 세포를 2일간 더 배양하였다. 배양된 COS 세포에 비오틴화된 BSF2를 첨가한 염색 완충액(2% FCS, 0.1% NaN3를 함유한 RPMI 1640)을 가한다음, 혼합물을 37℃에서 2시간 배양하여 배양된 COS 세포상에 발현된 BSF2 수용체와 비오틴화된 BSF2 잔기가 결합하도록 하였다. 처리된 세포를 염색 완충액(비오틴화 BSF2 비함유)으로 2회 세척하고, 이 세척된 세포에 플루오레스세인 이소시아네이트(FITC)와 콘쥬게이트된 아비딘을 가하여 세포에 고정된 비오틴 잔기와 아비딘-FITC 콘쥬게이트의 아비딘 잔기가 결합되도록 하였다. 그후 처리한 세포를 염색 완충액으로 3회 세척하였다.
사멸된 세포를 프로피디움 요다이드(PI)를 가하여 제거한 후, 형광-표지된 COS 세포를 형광 활성화 세포(Shorter FACS: Becton Dickinson)을 사용하여 검출 및 분리하였다.
비교하기 위해, cDNA를 함유하지 않은 벡터로 트랜스팩트된 COS 세포를 상기한 바와 동일한 방법으로 처리하였다.
cDNA-함유 벡터로 트랜스팩트된 COS 세포는 과량의 유리 BSF2 존재하에 비오틴화된 BSF2로 처리하여, COS 세포상에 발현된 BSF2 수용체에 결합하도록 비오틴화 BSF2와 유리 BSF2간에 경쟁을 유발시켰다. 비오틴화된 BSF2-처리 COS 세포를 상술한 방법에 따라 FITC-아비딘으로 처리한 후, 세포를 FACS로 분석하고, 그 결과를 제1도에 나타내었다. 제1도에서, 횡축은 형광강도를, 종축은 상이한 형광-강도를 나타내는 세포의 분포수를 나타낸다. 도면에서, a는 cDNA비 함유 벡터로 트랜스팩트된 세포에서 얻은 결과를 나타낸 것이고, b는 본 발명에 따른 cDNA 함유 벡터로 트랜스팩트된 세포에서 얻은 결과를 나타낸 것이며, c는 FSF2 수용체 cDNA 함유 벡터로 트랜스팩트 되었으나, 과량의 유리 BSF2 존재하에 비오틴화된 BSF2로 처리된 세포에서 얻은 결과를 나타낸 것이다.
그래프 b는 높은 형광 강도를 가진 세포가 존재하는 것을 나타내며, 이것은 본 발명에 따라 제조된 cDNA 함유 벡터로 트랜스팩트된 세포군이 BSF2와 결합이 가능한 물질을 생산하는 세포를 유의적인 비율로 함유하고 있음을 드러내고 있다. 이와 반대로, 그래프 c의 경우는, 과량의 유리 BSF2와 경쟁적인 조건하에 비오틴화된 BSF2로 처리된 세포군은 높은 형광강도를 가진 세포를 함유하지 않고 있음을 볼수 있는데, 이것은 COS 세포와 비오틴화된 BSF2와의 결합이 BSF2-특이적이라는 것을 드러낸 것이다.
형광 강도가 높은 세포로부터 추출한 벡터를 사용하여 E. Coli MC1009(ATCC 33760)를 형질전환시키고, 이 형질전환체를 배양하여 BSF2 수용체를 암호화하는 cDNA 삽입물을 함유하는 벡터를 중폭시켰다.
그중에서 시험용 벡터 하나를 선택하여 pBSF2R.236으로 명명하였다.
플라스미드 pBSF2R.236을 XhoI로 부분적으로 소화하여 전(全) BSF2 수용체 단백질을 암호화하는 뉴클레오티드 서열 함유 DNA 단편을 얻고, 이 DNA 단편을 플라스미드 pIBI176(IBI에서 시판하고 있음)의 Sal I 부위에 삽입하여 플라스미드 pIBISF2R을 제조하였다. 플라스미드 pIBISF2R을 함유하는 에스케리키아 콜리는 부다페스트 조약하에 1989년 1월 9일자로 기탁기관(Fermentation Research Institute Agency of Industrial Science and Technology: 일본국 이바라기껭 쓰꾸바시 히가시 1죠메 1-3에 소재)에 FERM BP-2232로서 기탁되어 있다.
플라스미드 pIBISF2R은 통상의 방법에 따라 적합한 제한효소로 절단되어 BSF2 수용체 단백질을 암호화하는 뉴클레오티드 서열 함유 DNA 단편을 얻을 수 있으며, 이 DNA 단편을 사용하여 다시 플라스미드를 제조할 수 있다.
[실시예 5]
cDNA의 분석
실시예 4에서 제조한 벡터 DNA pBSF2R.236을 제한효소로 소화시켜 BSF2을 암호화하는 cDNA 삽입물을 절제한 후, 제한효소 절단지도와 뉴클레오티드 서열을 문헌에 기술된 M13방법(J. Messing, Methods in Enzymol. vol. 101, p.20, 1983)에 따라 결정하였다.
결과는 제2도와 제3-1도 내지 제3-5도에 나타내었다. BSF2 수용체를 암호화하는 DNA는 5'-말단에서의 번역 개시 코돈 ATG와 3'-말단에서의 번역 정지 코돈 TGA에 의해 접합된 1404개의 염기쌍으로 구성되어 있다.
[실시예 6]
BSF2수용체를 암호화하는 cDNA의 확인
클로운된 cDNA가 표적 BSF2 수용체 단백질을 암호화한다는 것을 확인하기 위해, 상기한 셀 라인, 즉 NK 셀 라인 YT, 모노사이트 셀 라인 U937, 골수종 셀 라인 U266, T-세포 Jurkat, B-세포 CESS 및 B-세포 BL29를 배양하고, 실시예 2에 기술된 방법과 동일한 방법으로 정제하였다.
정제한 mRNA는 올리고-dT 수지(Boehringer 제품)로 농축하고, 농축된 mRNA 1 μg을 0.8% 아가로즈 겔 전기영동시킨 후, 노던 블로팅(Northern blotting)에 의해 니트로셀룰로스 필터로 전이시켰다.
이와 반대로, 실시예 4에서 제조한 벡터 DNA를 제한효소 XhoI로 소화하여 BSF2 수용체를 암호화하는 DNA 단편을 절제하고 니크(nick)-번역하여 프로브를 제조하였다.
잡종화를 위해, 상기한 노던-블로팅한 니트로셀룰로스 시트를 50% 포름알데히드, 5×덴하트(1×텐하트 = 0.02g/100㎖ Ficoll 폴리비닐 피롤리돈 및 0.02g/㎖ 소혈청 알부민), 5×SSC(1×SSC=8.77g/ℓ NaCl 및 4.41g/ℓ 나트륨 시트레이트, pH 7.0) 및 상기한 프로브 1×107cpm/㎖를 첨가한 10μg/㎖ 연어 정액 DNA로 이루어진 잡종화 완충액과 접촉하도록 42℃에서 24시간 동안 넣어두었다.
잡종화 후, 니트로셀룰로스 시트를 각기 1/10 SSC로 50℃에서 20분동안 2회 세척하여 니트로셀룰로스 시트에 비-특이적으로 부착된 프로브를 제거하고, 건조하였다. 이 시트를 방사선 자동사진 X-선 필름에 노출시키고, 그 결과를 제4도에 나타내었다.
도면에서 보는 바와 같이, 실시예 1에서 BSF2 수용체를 발현하는 것으로 이미 확인한 바 있는, 모노사이트 셀 라인 U937, 골수종 셀 라인 U266, B-셀 라인 CESS, 및 NK 셀 라인 YT로부터 추출한 mRNA's는 클로운된 cDNA로 잡종화되었다. 한편, BSF2 수용체를 발현하지 않는 것으로 이미 확인한 바 있는, B-셀 라인 BL29 및 T-셀 라인 Jurkat로 부터 추출한 mRNA's는 클로운된 DNA로 잡종화 되지 않았다. 이러한 결과는 본 발명의 클로운된 cDNA가 BSF2 수용체 단백질을 실제적으로 암호화 한다는 것을 뒷받침 해주는 것이다.
상기한 티. 타가의 문헌에는 몇몇의 셀 라인의 경우, 세포당 BSF2 수용체의 수가 다음과 같이 기술되어 있다:
Figure kpo00009
티. 타가등의 결과 역시 상술한 결론을 뒷받침하고 있다.
제3도는 본 발명의 DNA 서열 이외에, 468개의 아미노산 전기로 이루어지고, N-말단 아미노산이 번역 개시 코돈에 상응하는 메티오닌인, 본 발명의 BSF2 수용체의 추정 아미노산 서열을 나타낸 것이다. 아미노산 서열은 두개의 소수성 영역, 즉 N-말단측에 위치하고 단일 펩티드로 간주되는 하나의 영역과 C-말단측에 위치하고 세포막을 통해 단백질을 투과하는 영역으로 간주되는 다른 하나의 영역을 함유하였다. 이것은 BSF2 수용체가 세포막을 투과하여 세포의 내벽에 도달하게 된다는 추정을 뒷받침하고 있는 것이다.
플라스미드 p△BSF2RI.1의 제조(제5도)
천연 단백질의 중심부가 제거된 변형 BSF2 수용체 단백질을 암호화하는 DNA 함유 플라스미드를 제조하기 위해, 실시예 4에서 제조하고 전 BSF2 수용체 단백질을 암호화하는 cDNA 함유 플라스미드 pBSF2R.236을 사용하였다.
플라스미드 pBSF2R.236DMF Hind III 및 MroI로 절단하여 생성된 DNA 단편을 DNA 폴리머라제의 클레노우(Klenow)단편으로 둔단하고, XhoI로 절단하여 DNA 단편 A를 얻었다. 또한 pBSF2R.236을 SspI 및 PstI로 절단하여 800bp DNA 단편 B를 얻었다. CDM8 벡터는 XhoI 및 PstI로 절단하고 BAP로 처리하여 벡터 단편 C를 얻었다. 상기한 단편 A,B 및 C를 리가제를 사용하여 연결시키고, 연결된 혼합물을 사용하여 E. coli MC1016/P3을 형질전환시키고, 125μg/㎖의 암피실린 및 75μg/㎖의 테트라시클린에 내성인 콜로니를 목적 클로운으로서 선택하여 이로부터 얻은 플라스미드를 p△BSF2RI.1로 명명하였다.
이 플라스미드는 아미노산 서열(I)에서 124 내지 342의 아미노산을 암호화하는 DNA 부분이 결여되고, 1 내지 123 및 343 내지 468의 아미노산으로 이루어진 단백질을 암호화하는 DNA를 함유한다.
[실시예 7]
플라스미드 p△BSF2RII.5의 제조(제6도)
천연 BSF2 수용체 단백질의 N-말단부근의 부위가 제거된 변형 BSF2 벡터 단백질을 암호화하는 DNA 함유 플라스미드를 제조하기 위해, 실시예 4에서 제조되고, 전 BSF2 수용체 단백질을 암호화하는 cDNA 함유 플라스미드 pBSF2R.236을 사용하였다.
플라스미드 pBSF2R.236을 XhoI 및 FspI로 전달하여 450 bp DNA 단편 D를 분리하였다. 또한 pBSF2R.236을 ApaLI 및 XbaI로 절단하여 1.5kbp DNA 단편을 분리한후, 멍(Mung) 빈 뉴클리아제로 처리하고 PstI로 절단하여 DNA 단편 E를 얻었다. 또한 CDM8 벡터는 XhoI 및 PspI로 절단하고 BAP로 처리하여 벡터 DNA 단편 F를 얻었다. 다음에, 상기에서 제조한 DNA 단편 D, E 및 F를 DNA 리가제를 사용하여 연결 시켰다. 연결된 혼합물을 사용하여 E. coli MC1061/P3을 형질전환시키고 125μg/㎖의 암피실린 및 75μg/㎖의 테트라시클린에 내성인 콜로니를 선택하여 목적하는 클로운을 얻고, 이로부터 얻은 플라스미드를 pBSF2RII.5로 명명하였다.
이 플라스미드는 아미노산 서열(I)에서 28 내지 109의 아미노산을 암호화하는 DNA 부분이 결여되고, 1 내지 27 및 110 내지 468의 아미노산으로 이루어진 단백질을 암호화하는 DNA를 함유한다.
[실시예 8]
BSF2 수용체 단백질의 발현 확인
실시예 4에서 제조한 플라스미드 pBSF2R.236. 실시예 6에서 제조한 플라스미드 p△BSF2RI.I 및 실시예 7에서 제조한 p△BSF2RII.5를 각각 DEAE-덱스트란 법(Secd, B. and Aruffo, A., PNAS, 84:3365)으로 마우스 COP 세포로 형질도입하고 (C. Tyndall et al., Nucleic acid Res., 9, 6231, 1981), 세포를 20% 태아 송아지 혈청(FCS)을 함유하는 DMEM 배지중에서 배양하였다. 실시예 1에 기술한 것과 동일한 방법을 사용하여, 배양된 세포가 목적하는 단백질을 발현했는지의 여부를 형광염색(FACS440)을 이용하는 세포 소오터 내에서 측정하였다. 결과는 pBSF2R.236의 경우 제7도에, p△BSF2RI.1의 경우 제8도에, p△BSF2RII.5의 경우 제9도에 나타내었다. 이들 도면에서 나타난 바와 같이, pBSF2R.236(제7도 b)로 형질도입된 COP 세포와 pBSF2RII.5(제9도 b)로 형질도입된 COP 세포는 염색이 되었으나, p△BSF2RI.1(제8도 b)로 형질도입된 COP 세포는 염색이 되지 않았다. 염색은 과량의 재조합 BSI2(제7도 c 및 제9도 c)의 첨가에 의해 저해되었다. 이러한 결과에 의해, pBSF2R.236 및 pBSF2RII.5는 모두 BSF2 수용체 활성을 갖는 단백질을 생산하는 것이 확인되었으며, 이것은 천연 BSF2 수용체 단백질의 N-말단 부근의 아미노산 서열의 일부가 제거된 단백질도 BSF2 수용체 활성을 발휘한다는 것을 입증하는 것이다.
[실시예 9]
가용성 BSF2 수용체 단백질(1)의 제조(제10도 및 제11도)
가용성 BSF2 수용체 단백질을 제조하기 위해, BSF2 수용체 단백질의 C-말단측에 존재하는 막 투과 영역으로 예상되는 부분과 세포내 단백질 영역으로 예상되는 부분을 제거한 단백질을 제조하였다. 이 목적을 위해, 플라스미드 PUC9을 기본 백터부분으로 하고, 인간 β액틴 프로모터(S. Nakajima et al., Proc. Natl, Acad. Sci, USA, 82, 6133, 1985), 가용성 BSF2 수용체 cDNA와 이 순서대로 결합된 번역정지 코돈을 포함하여 이루어지는 수용체 발현 단위 함유 발현 플라스미드 phβABSF2R을 제조하였다.
즉, 플라스미드 pBSF2R.236을 SphI로 절단하여 천연 BSF2 수용체의 첫번째 아미노산 내지 402번째 아미노산의 코돈을 함유하는 cDNA 단편을 수득하였다. 이 단편은 파아지 벡터 M13 mp18의 SphI 부위에 삽입하고, 올리고뉴클레오티드 프리머 5'-ATATTCTCTAGAGAGATTCT-3' 및 부위 특이적 시험관내 돌연변이 유발 계(Amersham)를 사용하여 부위 특이적 시험관내 돌연변이를 유발시켜서 TGA 말단 코돈이 344번째 아미노산 코돈 바로 다음에 삽입된 돌연변이체 파아지 M13 mp18(345)를 제조하였다. 복제 형태의 이 돌연변이체 파아지를 Hind III 및 SalI로 절단하여 345번째 아미노산 코돈이 번역 말단 코돈 TGA로 대체된 BSF2 수용체 단백질의 N-말단을 암호화하는 DNA 단편(A)을 얻었다. 더욱이, β-글로빈 폴리 A를 함유하는 플라스미드(L. Ellis et al., Cell, 45, 721, 1986)는 SalI 및 BamHI로 절단하여 β-글로빈폴리 A를 함유하는 DNA 단편(B)을 얻었다. 또한, 플라스미드 PUC9에 삽입된 인간 β액틴 프로모터로 이루어진 플라스미드를 Hind III 및 BamHI로 절단하여 인간 β프로모터 및 PUC9 벡터로 이루어진 선형의 플라스미드(C)를 얻었다. 다음에, 이들 DNA 단편들을 DNA 리가제를 사용하여 연결시켜서 발현 플라스미드 phβABSF2R을 제조하였다. 이 플라스미드의 제조과정과 구조는 제10도에 나타낸 바와 같다.
가용성 BSF2 수용체 단백질은 플라스미드 phβABSF2R을 사용하여 다음과 같이 제조하였다. 통상의 방법으로 DMEM 배지에 배양한 쥐의 섬유아세포 L 세포(ATCC CCL1)에 인산칼슘법 킷트(Pharmacia 제품)를 사용하여 패트리 접시당 phβABSF2R 20μg을 첨가하였다. 다음날 배지는 교체하고 다시 2일간 배양후 배양 상등액을 회수하였다. 상등액내의 가용성 BSF2 수용체 단백질의 검색은 실시예 11에 기술된 벙법으로 제조한 MT18 항체와 실시예 1에 기술된 방법으로 제조한125I-BSF2를 사용하여 수행하였다. 즉, MT18 항체 1μg/㎖을 함유하는 PBS 각 100㎕를 96-웰 마이크로타이터 플레이트의 각 웰에 넣고, 이 플레이트를 4℃에서 하룻밤 배양하였다. 세척후, 웰당 1% BSA 100㎕를 가하고, 플레이트를 실온에서 2시간동안 배양하였다. 세척후, L 배지에서 얻은 상기한 배양 상등액 100㎕/웰을 실온에서 2시간동안 배양한 후, 세척하였다. 다음에, 20,000cpm/웰에 상응하는125I-BSF2 100㎕/웰을 웰에 가하고 플레이트를 실온에서 2시간동안 배양한 후, 세척하였다. 플레이트를 잘라서 각 웰을 분리시키고 결합 방사능을 γ-카운터로 측정하였다. 생성물의 특이성을 확인하기 위해, 상등액만을 사용하는 것 대신에 비-표지된 BSF2 200ng/㎖를 첨가한 상등액을 사용하여 상기한 방법대로 실시하였다.
비교하기 위해, 세포는 접종안된, 10% FCS를 함유하는 DMEM 및 플라스미드가 도입되지 않은 L세포의 배양상등액을 상술한 것과 동일한 방법으로 처리하고 결합 방사능을 β-카운터로 측정하였다.
결과는 제11도에 표시한 바와 같다. 이 도면에서 보는 바와 같이, 10% FCS를 함유하는 DMEM 배지 및 플라스미드가 도입되지 않은 L세포의 배양 상등액과는 달리, phβABSF2R가 도입된 L세포의 배양 상등액중에는 TM18 항체 및125I-BSF2를 모두 결합하는 물질이 함유되었다. 또한 단독의 상등액 대신에, L세포의 배양 상등액에 phβABSF2R가 도입되고 비-표지된 BSF2 200ng/㎖을 첨가한 경우, 결합 방사능이 유의적으로 감소하였다. 이것은 생성물이 가용성 BSF2 수용체인 것을 나타내는 것이다.
[실시예 10]
가용성 BSF2 수용체 단백질(2)의 제조(제12도 내지 제18도) 플라스미드 pSVL345의 제조
COS-1 세포내에서 가용성 BSF2 수용체 단백질을 제조하기 위해, BSF2 수용체 단백질의 C-말단측에 존재하는 세포내 단백질 영역으로 예상되는 부분과 막 투과영역으로 예상되는 부분이 제거된 단백질을 제조하였다. 이 목적을 위해, 플라스미드 pSVL(Pharmacia 제품)을 기본 벡터로 하고; pSVL에 함유된 SV40 후기 프로모터, 가용성 BSF2 수용체 cDNA 및 이 순서대로 결합된 번역 정지 코돈을 포함하여 이루어지는 BSF2 수용체 발현 단위 및 SV40 폴리아데닐화 신호를 함유하는 발현 플라스미드 pSVL345를 제조하였다.
즉, 플라스미드 pBSF2R.236을 ShpI로 절단하여 천연 BSF2 수용체의 첫번째 아미노산 내지 402번째 아미노산의 코돈 함유 cDNA 단편을 수득하였다. 이 단편은 파아지 벡터 M13 mp18의 SphI 부위에 삽입하고 올리고 뉴클레오티드 프리머 5'-ATATTCTCTAGAGAGATTCT-3' 및 부위 특이적 시험관내 돌연변이 유발제(Amersham 제품)를 사용하여 부위 특이적 시험관내 돌연변이 유발을 일으켜서 345번째 아미노산 코돈 대신에, TAG 말단 코돈이 삽입된 돌연변이체 파아지 M13 mp18(345)를 제조하였다. 이 복제 형태의 돌연변이체 파아지는 Hind III 및 SalI로 절단하여 345번째 아미노산 코돈이 번역말단 코돈 TAG로 대체된 BSF2 수용체 단백질의 N-말단측을 암호화하는 DNA 단편을 얻었다.
이 DNA 단편은 플라스미드 pSP73(Promegabiotech 제품)의 SphI 부위에 삽입하여 XhoI 부위가 BSF2 수용체의 5'-측 부근에 존재하고, BamHI 부위는 BSF2 수용체 유전자의 3'-측 부근에 존재하도록 DNA 단편을 삽입한 플라스미드를 제조하였다. 플라스미드는 XhoI 및 BamHI로 절단하여 BSF2 수용체의 N-말단측의 344개의 아미노산을 암호화하는 뉴클레오티드 서열 함유 DNA 단편(A)을 수득하였다. 한편, 기본 플라스미드 pSVL을 XhoI 및 BamHI로 절단하고 알카리성 포스파타제로 처리하여 선형 플라스미드 DNA를 수득하였다. 다음에, 이 선형 DNA 및 DNA 단편(A)을 T4 DNA 리가제로 연결시켜서 발현 플라스미드 pSVL 345를 제조하였다. 이 플라스미드의 제조과정은 제12도에 나타낸 바와 같다.
플라스미드 pSVL 324의 제조
가용성 BSF2 수용체 단백질을 제조하기 위해, BSF2 수용체 단백질의 C-말단측에 존재하는 세포내 단백질 영역으로 예상되는 부분과 막 투과 영역으로 예상되는 부분을 제거한 단백질을 제조하였다. 이 목적을 위해, 플라스미드 pSVL(Pharmacia 제품)을 기본 벡터로 하고; pSVL에 함유된 SV40 후기 프로모터, 가용성 BSF2 수용체 cDNA 및 이 순서대로 결합된 번역 정지 코돈으로 이루어진 BSF2 수용체 발현단위 및 SV40 폴리아데닐화 신호를 함유하는 발현 플라스미드 pSVL 345를 제조하였다.
즉, 플라스미드 pBSF2R.236을 SphI로 절단하여 천연 BSF2 수용체의 첫번째 아미노산 내지 402번째 아미노산의 코돈을 함유하는 cDNA 단편을 수득하였다. 이 단편은 파이지 벡터 M13 mp18의 SphI 부위에 삽입하고, 올리고 뉴클레오티드 프리머 5'-GTCCTCCAGTCTAGAACGAGGT-3' 및 부위 특이적 시험관내 돌연변이 유발계(Amersham 제품)을 사용하여 부위 특이적 시험관내 돌연변이를 유발시켜서 324 아미노산 코돈 대신에, TAG 말단 코돈이 삽입된 돌연변이에 파이지 M13 mp18(324)를 제조하였다. 복제 형태의 이 돌연변이체 파아지는 SphI로 절단하여 323번째 알라닌의 코돈이 발린의 코돈으로 변경되고 324번째 아미노산 코돈이 번역 말단 코돈 TAG로 대체된 BSF2 수용체 단백질의 N-말단측을 암호화하는 DNA 단편을 수득하였다.
이 DNA 단편을 플라스미드 pSP73(Promegabiotch 제품)의 SphI 부위에 삽입하여 XhoI 부위가 BSF2 수용체의 5'-측 부근에 존재하고 BamHI 부위는 BSF2 수용체 유전자의 3'-측 부근에 존재하도록 DNA 단편을 삽입한 플라스미드를 제조하였다. 이 플라스미드는 XhoI 및 BamHI로 절단하여 BSF2 수용체의 N-말단측의 323개의 아미노산을 암호화하는 뉴클레오티드 서열 함유 DNA 단편(B)을 수득하였다. 한편, 기본 플라스미드 pSVL은 XhoI 및 BamHI로 절단하고 알카리성 포스파타제로 처리하여 선형의 플라스미드 DNA를 수득하였다. 다음에, 이 선형 DNA 및 DNA 단편(B)을 T4 DNA 리카제로 연결하여 발현 플라스미드 pSVL 324를 제조하였다. 이 플라스미드의 제조과정은 제13도에 표시한 바와 같다.
가용성 BSF2 수용체 단백질의 발현
상기한 플라스미드 pSVL 345 및 pSVL 324를 사용하여 가용성 BSF2 수용체 단백질의 발현을 다음과 같이 수행하였다. 아프리카산 그린 원숭이의 신장세포에서 유도된 COS-1 세포(ATCC CRL 1650)를 통상의 방법으로 10%(v/v) 태아 송아지 혈청(Gibco)을 첨가한 DMEM 배지중에서 배양하였다. 이 배양된 세포에 플라스미드 pSVL 345 및 pSVL 324와 BSF2 발현단위를 함유하지 않는 플라스미드 pSVL(Moch)를 인산 칼슘법에 의해 따로 따로 도입시켰다(Wigler, et al, Cell. 14, 725-731, 1978). 즉, 각 플라스미드의 경우, ×106세포/10㎖를 직경 100mm의 패트리 접시에 넣고 하룻밤 배양한 후, 인산칼슘액 1㎖중의 20μg의 플라스미드를 각 배양물에 가하였다. 다음날, 배지를 교환하고 상기 배지 10㎖를 가한 후, 3일간 더 배양시킨 다음 상등액을 회수하였다.
상등액중의 가용성 BSF2 수용체의 검출
먼저, 실시예 11에 기술한 MT18 항체를 사용하여 효소 면역학적 어세이를 실시하였다. 즉, 상술한 방법으로 제조한 상등액을 희석하고 희석한 상등액 200㎕를 96-웰 마이크로-타이터 플레이트의 각 웰에 넣었다. 4℃에서 하룻밤 배양한 후, 플레이트를 세척액으로 세척하였다. 그후, BSA 1% 용액을 각 웰에 가하고 플레이트를 실온에서 90분간 방치하여 웰을 블로킹하였다. 다음에, 플레이트를 세척하고 MT18 항체를 웰에 가하고 실온에서 90분간 배양하였다. 다시 플레이트를 세척하고 항-마우스 IgG26 토끼 항체를 웰에 가하고, 실온에서 60분간 배양한 다음, 플레이트를 세척하고, 효소-표지 항-토끼 IgG 염소항체를 웰에 가한후 실온에서 60분간 배양하였다. 플레이트를 세척한 후, p-니트로페닐 포스페이트를 기질로서 웰에 가하여 30분간 효소반응을 시키고, 이 반응후 마이크로플레이트 판독기(일본국 Toso, 제품)로 흡광도(외경 504 내지 600nm)를 측정하였다.
결과는 제14도에 표시한 바와 같다. 제14도에서 보는 바와 같이, pSVL 345 및 pSVL 324가 도입된 COS-1 세포에서 얻은 상등액에는 MT18 항체를 결합하는 생성물이 함유된 반면, BSF2 수용체 발현 단위를 함유하지 않은 pSVL가 도입된 COS-1 세포로부터 얻은 상등액에는 MT18 항체를 결합하는 생성물이 함유되지 않았다.
다음에, 상등액내의 가용성 BSF2 수용체를 실시예 9와 동일한 방법으로, MT18 항체 및125I-BSF2를 사용하는 방법에 의해 검출하였다. 결과는 제15도에 나타낸 바와 같다. 제15도에서 보는 바와 같이, pSVL이 도입된 COS-1 세포에서 얻은 상등액과는 달리, pSVL 345 및 pSVL 324가 각기 도입된 COS-1 세포에서 얻은 상등액은 MT18 항체 및125I-BSF2 양자에 결합하는 생성물이 함유되어 있었다. 더욱이, 상등액에 냉 BSF2를 첨가했을 때 첨가량에 의존하여 카운트가 감소하였다. 이것은 상등액중의 생성물이 가용성 BSF2 수용체인 것을 입증하는 것이다(참조, 제16도).
또다른 확인으로서, 상등액중 가용성 BSF2 수용체가 존재하는 것이 MT18 항체, BSF2 및 항-BSF2 토끼 항체 사용법에 의해 확인되었다. 즉, 5μg/㎖ MT18 항체 200㎕를 마이크로타이터 플레이트의 각 웰에 가하고 플레이트를 40℃에서 하룻밤 배양시켰다. 플레이트를 세척한 후, 웰을 BSA 1% 용액으로 실온에서 90분간 블로킹하고 다시 플레이트를 세척한 다음, 적합하게 희석한 배양 상등액을 웰에 가하고, 실온에서 60분간 배양을 실시하였다. 그후 세척하고, 10% FCS를 함유한 100ng/㎖ BSF2 용액을 웰에 가하고, 실온에서 60분간 배양시켰다. 다시 세척한후, 500ng/㎖ 항-BSF2 토끼 IgG 항체를 웰에 가하고, 실온에서 60분간 배양하고 또다시 세척한 다음, 효소-표지된 항-토끼 IgG 염소 IgG 항체를 웰에 가하고 실온에서 60분간 배양하였다. 이어서, 플레이트를 상술한 방법에 따라 처리하였다. 결과는 제17도에 표시한 바와 같다. pSVL이 도입된 COS-1 세포에서 얻은 상등액과의 비교해서, psSVL 345 및 pSVL 324가 각기 도입된 COS-1 세포에서 얻은 상등액에는 MT18 항체 및 BSF2 둘다에 결합하는 생성물을 함유한 것이 확인되었다.
마지막으로, 상등액을 SDS-폴리아크릴아미드 겔 전기영동시키고, 전기영동 패턴을 니트로셀룰로스 시트에 트랜스블로팅한 다음, MT18 항체를 니트로셀루로스 시트에 가하였다. 그후, 니트로셀룰로스 시트에 비오틴화 항-마우스 IgG 항체를 가한후, 이어서, 스트랩토아비딘-알카리성 포스파타제를 가하였다. 최종적으로, 기질로서 NBT/BCIP를 니트로셀룰로스 시트에 가하여 생성물을 발색시켰다. 이 결과는 제18도에 나타낸 바와 같다. pSVL 324가 도입된 COS-1 세포에서 얻은 상등액의 경우 42KD에서 밴드가 나타났고, pSVL 345가 도입된 COS-1 세포에서 얻은 상등액의 경우 50KD에서 밴드가 나타났는데, 이것은 상등액중에 가용성 BSF2 수용체가 존재하는 것을 입증하는 것이다.
제19도는 실시예 8, 9 및 10에서 제조된 단백질의 구조를 나타낸 것이다. 이 도면에서, BSFS2R.236은 플라스미드 pBSF2R.236에 의해 제조된 단백질로서, 천연 BSF2 수용체에 상응한다. △BSF2RI.1은 플라스미드 p△BSF24I.1에 의해 제조된 단백질을 나타내고, △BSF2RII.5는 플라스미드 p△BSF24II.5에 의해 제조된 단백질을 나타내고, SVL 324는 플라스미드 pSVL 324에 의해 제조된 단백질을 나타내고, hβABSF2R은 플라스미드 phβASF2R에 의해 제조된 단백질을 나타내며, SVL 345는 플라스미드 pSVL 345에 의해 제조된 단백질을 나타낸다. BSF2R.236 뿐만 아니라 △BSF24II.5, DRNI 및 hβABSF2R이 BSFR 수용체 활성을 나타내기 때문에, 천연 BSF2 수용체 단백질의 N-말단 부근의 아미노산 서열부분이 제거된 단축형 단백질과, 천연 BSF2 수용체 단백질의 세포내 단백질 영역 및 막투과 영역을 포함하는 C-말단부분이 제거된 단축형 단백질은 여전히 BSF2 수용체 활성을 나타낸다는 것이 확인되었다.
[실시예 11]
BSF2 수용체에 대한 모노클로날 항체 생산
BSF2 수용체에 대한 모노클로날 항체 생산용 면역원을 제조하기 위해, 표면상에 인간 BSF2 수용체를 발현하는 마우스 T 셀 라인을 다음과 같이 제조하였다. 실시예 4에 기술한 플라스미드 pBSF2R.236 및 플라스미드 pSV2 네오를 마우스 셀 라인 CTLL-2(ATTC T1B 214)의 세포에 도입한 후, G-418을 사용하여 선별 시험을 행하여 BSF2 수용체 약 30,000/세포를 발현하는 셀 라인을 수립하고, CTBC3로 명명하였다.
CTBC3 세포를 통상의 방법으로 RPMI 1640중에서 배양하고, 배양된 세포를 PBS완충액으로 3회 세척하였다. 세척한 세포를 마우스당 1×107세포의 양으로 C57BL6 마우스에 1주에 한번씩 총 6회에 걸쳐 복강내 주사하여 마우스를 면역시켰다. 면역이 된 마우스로부터 얻은 비장 세포를 폴리에틸렌글리콜을 사용하여 통상의 방법에 따라 골수종 셀 라인 P301과 융합시키고 목적하는 히브리도마를 다음과 같이 선택하였다. BSF2 수용체 네가티브인, 인간 T 셀 라인 JURKAT(ATCC CRL8163)에 pBSF2R.236 및 pSV2 네오를 도입시키고, 도입된 세포를 선별하였다. BSF2 수용체 100,000/세포를 발현하는 셀 라인을 수립하고 NJBC8로 명명하였다. 히브리도마 MT18에 의해 생산된 모노클로날 항체는 MT18 항체로 명명하였다. 제20도는 MT18 항체가 BSF2 수용체를 특이적으로 인식하는 것을 나타낸 것이다. 이 도면에서, a는 JURKAT 세포가 플루오레스세인 이소시아네이트로 표지된 MT18 항체에 의해 착새된 경우의 세포분포 대 형광염색 강도의 그래프를 나타낸 것이고, b는 NJBC8 세포가 유사하게 착색된 경우에 얻어진 결과를 나타낸 것이다.

Claims (42)

  1. 다음의 아미노산 서열(I)을 포함하는, 인간 B세포 자극인자-2와 특이적으로 결합할 수 있는 인간 B세포 자극이자-2에 대한 분리된 수용체 단백질.
    Figure kpo00010
    Figure kpo00011
    Figure kpo00012
  2. 제 1항에 따른 아미노산 서열을 암호화하는 DNA.
  3. 제 2항에 따른 DNA 및 상기 DNA의 발현을 조절하는 서열을 포함하여 구성되는 DNA.
  4. 제 3항에 따른 DNA를 포함하여 구성되는 벡터.
  5. 제 4항에 따른 벡터로 형질 전환된 숙주 세포로서, 상기 세포가 E. coli 세포, 바실루스 서브틸리스 세포, 효모세포, COS 세포 또는 CHO 세포인 것을 특징으로 하는 숙주 세포.
  6. 제 5항에 따른 숙주 세포를 배양하고, 상기 배양물로부터 수용체 단백질을 회수하는 단계를 포함하여 구성되는 인간 B세포 자극인자-2와 특이적으로 결합할 수 있는, 인간 B세포 자극인자-2를 위한 수용체 단백질의 제조방법.
  7. 다음의 아미노산 서열(II)을 포함하는, 인간 B세포 자극인자-2와 특이적으로 결합할 수 있는 인간 B포세 자극 인자-2에 대한 분리된 수용체 단백질.
    Figure kpo00013
    Figure kpo00014
    Figure kpo00015
  8. 제 7항에 따른 아미노산 서열을 암호화하는 DNA.
  9. 제 8항에 따른 DNA 및 상기 DNA의 발현을 조절하는 서열을 포함하여 구성되는 DNA.
  10. 제 9항에 따른 DNA를 포함하여 구성되는 벡터.
  11. 제 10항에 따른 벡터로 형질 전환된 숙주 세포로서, 상기 세포가 E. coli 세포, 바실루스 서브틸리스 세포, 효모세포, COS 세포 또는 CHO 세포인 것을 특징으로 하는 숙주 세포.
  12. 제 11항에 따른 숙주 세포를 배양하고, 상기 배양물로부터 수용체 단백질을 회수하는 단계를 포함하여 구성되는 인간 B세포 자극인자-2와 특이적으로 결합할 수 있는, 인간 B세포 자극인자-2를 위한 수용체 단백질의 제조방법.
  13. 다음의 아미노산 서열(III)을 포함하는, 인간 B세포 자극인자-2와 특이적으로 결합할 수 있는 인간 B세포 자극 인자-2에 대한 분리된 수용체 단백질.
    Figure kpo00016
    Figure kpo00017
  14. 다음의 서열(IV)을 포함하는, 인간 B세포 자극인자-2와 특이적으로 결합할 수 있는 인간 B세포 자극인자-2에 대한 분리된 수용체 단백질.
    Figure kpo00018
    Figure kpo00019
    Figure kpo00020
  15. 제 13항에 따른 아미노산 서열을 암호화하는 DNA.
  16. 제 15항에 따른 DNA 및 상기 DNA의 발현을 조절하는 서열을 포함하여 구성되는 DNA.
  17. 제 16항에 따른 DNA를 포함하여 구성되는 벡터.
  18. 제 17항에 따른 벡터로 형질 전환된 숙주 세포로서, 상기 세포가 E. coli 세포, 바실루스 서브틸리스 세포, 효모세포, COS 세포 또는 CHO 세포인 것을 특징으로 하는 숙주 세포.
  19. 제 18항에 따른 숙주 세포를 배양하고, 상기 배양물로부터 수용체 단백질을 회수하는 단계를 포함하여 구성되는 인간 B세포 자극인자-2와 특이적으로 결합할 수 있는, 인간 B세포 자극인자-2를 위한 수용체 단백질의 제조방법.
  20. 다음의 아미노산 서열(V)를 포함하는, 인간 B세포 자극인자-2와 특이적으로 결합할 수 있는 인간 B세포 자극인자-2에 대한 분리된 수용체 단백질.
    Figure kpo00021
    Figure kpo00022
  21. 다음의 아미노산 서열(VI)를 포함하는, 인간 B세포 자극인자-2와 특이적으로 결합할 수 있는 인간 B세포 자극인자-2에 대한 분리된 수용체 단백질.
    Figure kpo00023
    Figure kpo00024
  22. 제 20항에 따른 아미노산 서열을 암호화하는 DNA.
  23. 제 22항에 따른 DNA 및 상기 DNA의 발현을 조절하는 서열을 포함하여 구성되는 DNA.
  24. 제 23항에 따른 DNA를 포함하여 구성되는 벡터.
  25. 제 24항에 따른 벡터로 형질 전환된 숙주 세포로서, 상기 세포가 E. coli 세포, 바실루스 서브틸리스 세포, 효모세포, COS 세포 또는 CHO 세포인 것을 특징으호 하는 숙주 세포.
  26. 제 25항에 따른 숙주 세포를 배양하고, 상기 배양물로부터 수용체 단백질을 회수하는 단계를 포함하여 구성되는 인간 B세포 자극인자-2와 특이적으로 결합할 수 있는, 인간 B세포 자극인자-2를 위한 수용체 단백질의 제조방법.
  27. 다음의 아미노산 서열(VII)을 포함하는, 인간 B세포 자극인자-2와 특이적으로 결합할 수 있는 인간 B세포 자극인자-2에 대한 분리된 수용체 단백질.
    Figure kpo00025
    Figure kpo00026
  28. 제 27항에 따른 아미노산 서열을 암호화하는 DNA.
  29. 제 28항에 따른 DNA 및 상기 DNA의 발현을 조절하는 서열을 포함하여 구성되는 DNA.
  30. 제 29항에 따른 DNA를 포함하여 구성되는 벡터.
  31. 제 30항에 따른 벡터로 형질 전환된 숙주 세포로서, 상기 세포가 E. coli 세포, 바실루스 서브틸리스 세포, 효모세포, COS 세포 또는 CHO 세포인 것을 특징으로 하는 숙주 세포.
  32. 제 31항에 따른 숙주 세포를 배양하고, 상기 배양물로부터 수용체 단백질을 회수하는 단계를 포함하여 구성되는 인간 B세포 자극인자-2와 특이적으로 결합할 수 있는, 인간 B세포 자극인자-2를 위한 수용체 단백질의 제조방법.
  33. 제 14항에 따른 아미노산 서열을 암호화하는 DNA.
  34. 제 33항에 따른 DNA 및 상기 DNA의 발현을 조절하는 서열을 포함하여 구성되는 DNA.
  35. 제 34항에 따른 DNA를 포함하여 구성되는 벡터.
  36. 제 35항에 따른 벡터로 형질 전환된 숙주 세포로서, 상기 세포가 E. coli 세포, 바실루스 서브틸리스 세포, 효모세포, COS 세포 또는 CHO 세포인 것을 특징으로 하는 숙주 세포.
  37. 제 36항에 따른 숙주 세포를 배양하고, 상기 배양물로부터 수용체 단백질을 회수하는 단계를 포함하여 구성되는 인간 B세포 자극인자-2와 특이적으로 결합할 수 있는, 인간 B세포 자극인자-2를 위한 수용체 단백질의 제조방법.
  38. 제 21항에 따른 아미노산 서열을 암호화하는 DNA.
  39. 제 38항에 따른 DNA 및 상기 DNA의 발현을 조절하는 서열을 포함하여 구성되는 DNA.
  40. 제 39항에 따른 DNA를 포함하여 구성되는 벡터.
  41. 제 40항에 따른 벡터로 형질 전환된 숙주 세포로서, 상기 세포가 E. coli 세포, 바실루스 서브틸리스 세포, 효모세포, COS 세포 또는 CHO 세포인 것을 특징으로 하는 숙주 세포.
  42. 제 41항에 따른 숙주 세포를 배양하고, 상기 배양물로부터 수용체 단백질을 회수하는 단계를 포함하여 구성되는 인간 B세포 자극인자-2와 특이적으로 결합할 수 있는, 인간 B세포 자극인자-2를 위한 수용체 단백질의 제조방법.
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Families Citing this family (75)

* Cited by examiner, † Cited by third party
Publication number Priority date Publication date Assignee Title
US6428979B1 (en) 1988-01-22 2002-08-06 Tadamitsu Kishimoto Receptor protein for human B cell stimulatory factor-2
CA1341152C (en) 1988-01-22 2000-12-12 Tadamitsu Kishimoto Receptor protein for human b cell stimulatory factor-2
US5670373A (en) * 1988-01-22 1997-09-23 Kishimoto; Tadamitsu Antibody to human interleukin-6 receptor
US5216128A (en) * 1989-06-01 1993-06-01 Yeda Research And Development Co., Ltd. IFN-β2/IL-6 receptor its preparation and pharmaceutical compositions containing it
ATE144713T1 (de) * 1989-07-20 1996-11-15 Tadamitsu Kishimoto Antikörper gegen menschlichen interleukin-6- rezeptor
US5453491A (en) * 1990-09-11 1995-09-26 Kiyoshi Takatsu Murine interleukin-5 receptor
WO1994025036A1 (en) * 1993-04-30 1994-11-10 Chugai Seiyaku Kabushiki Kaisha Expression inhibitor containing antisense oligonucleotide derivative against human interleukin-6 receptor
US5578301A (en) * 1993-12-14 1996-11-26 Sandoz Ltd. Method for using GM-CSF to reduce the acute phase response in a patient being administered IL-6 therapy
US5599536A (en) * 1993-12-13 1997-02-04 Sandoz Ltd. Method for suppressing the acute phase response in a patient receiving IL-6 therapy
US5518882A (en) * 1993-12-21 1996-05-21 Biotex Laboratories, Inc. Immunological methods of component selection and recovery
US8017121B2 (en) 1994-06-30 2011-09-13 Chugai Seiyaku Kabushika Kaisha Chronic rheumatoid arthritis therapy containing IL-6 antagonist as effective component
ES2384222T3 (es) 1994-10-07 2012-07-02 Chugai Seiyaku Kabushiki Kaisha Inhibición del crecimiento anómalo de células sinoviales utilizando un antagonista de IL-6 como principio activo
CN100350973C (zh) 1994-10-21 2007-11-28 岸本忠三 用于治疗il－6产生所致疾病的药物组合物
WO1996018416A1 (fr) * 1994-12-16 1996-06-20 Chugai Seiyaku Kabushiki Kaisha Inhibiteur d'expression contre le recepteur humain de l'interleukine-6
JP3458512B2 (ja) 1995-02-23 2003-10-20 東ソー株式会社 骨密度の変動推定方法又は骨そしょう症の診断方法及びこれに用いる試薬キット
ATE547119T1 (de) 1997-03-21 2012-03-15 Chugai Pharmaceutical Co Ltd Präventives oder therapeutisches mittel mit einem il-6-antagonisten als wirkstoff für durch sensibilisierte t-zellen vermittelte erkrankungen
US20060122373A1 (en) 1997-04-04 2006-06-08 Millennium Pharmaceuticals, Inc. Delta3, FTHMA-070, Tango85, Tango77, SPOIL,NEOKINE, Tango129 and integrin alpha subunit protein and nucleic acid molecules and uses thereof
KR20010022846A (ko) 1997-08-15 2001-03-26 나가야마 오사무 항 인터루킨-6 수용체 항체를 유효성분으로서 함유하는 전신성 홍반성 낭창의 예방 및/또는 치료제
US6723319B1 (en) * 1998-03-17 2004-04-20 Chugai Seiyaku Kabushiki Kaisha Method of treating inflammatory intestinal diseases containing as the ingredient IL-6 receptors antibodies
AU7078200A (en) * 1999-08-27 2001-03-26 United States Of America, Represented By The Secretary, Department Of Health And Human Services, The Polypeptides, comprising il-6 ligand-binding receptor domains and related nucleic acids, antibodies, compositions, and methods of use
UA80091C2 (en) * 2001-04-02 2007-08-27 Chugai Pharmaceutical Co Ltd Remedies for infant chronic arthritis-relating diseases and still's disease which contain an interleukin-6 (il-6) antagonist
SI1475101T1 (sl) 2002-02-14 2011-03-31 Chugai Pharmaceutical Co Ltd Farmacevtski proizvodi iz raztopine, ki vsebuje protitelo
GB2401040A (en) 2003-04-28 2004-11-03 Chugai Pharmaceutical Co Ltd Method for treating interleukin-6 related diseases
US8617550B2 (en) * 2003-12-19 2013-12-31 Chugai Seiyaku Kabushiki Kaisha Treatment of vasculitis with IL-6 antagonist
EP3269738A1 (en) 2004-03-24 2018-01-17 Chugai Seiyaku Kabushiki Kaisha Subtypes of humanized antibody against interleukin-6 receptor
CA2625773C (en) 2005-10-14 2015-05-12 Fukuoka University Inhibition of interleukin-6 (il-6) receptor promotes pancreatic islet transplantation
KR101239051B1 (ko) 2005-10-21 2013-03-04 추가이 세이야쿠 가부시키가이샤 심장질환 치료제
AR057582A1 (es) 2005-11-15 2007-12-05 Nat Hospital Organization Agentes para suprimir la induccion de linfocitos t citotoxicos
EP1967209B1 (en) 2005-11-25 2012-06-06 Keio University Therapeutic agent for prostate cancer
AU2007208678B2 (en) 2006-01-27 2013-01-10 Chugai Seiyaku Kabushiki Kaisha Therapeutic agents for diseases involving choroidal neovascularization
US9260516B2 (en) 2006-04-07 2016-02-16 Osaka University Method for promoting muscle regeneration by administering an antibody to the IL-6 receptor
MY159787A (en) 2006-06-02 2017-01-31 Regeneron Pharma High affinity antibodies to human il-6 receptor
US8080248B2 (en) 2006-06-02 2011-12-20 Regeneron Pharmaceuticals, Inc. Method of treating rheumatoid arthritis with an IL-6R antibody
AU2007285695B2 (en) 2006-08-18 2012-05-24 Ablynx N.V. Amino acid sequences directed against IL-6R and polypeptides comprising the same for the treatment of diseases and disorders associated with IL-6-mediated signalling
EP2123302B1 (en) 2007-01-23 2015-12-09 Shinshu University Il-6 inhibitors to treat chronic rejection
JP5424330B2 (ja) 2007-07-26 2014-02-26 国立大学法人大阪大学 インターロイキン６受容体阻害剤を有効成分とする眼炎症疾患治療剤
BRPI0817482B8 (pt) 2007-10-02 2021-05-25 Chugai Pharmaceutical Co Ltd uso de um anticorpo do receptor da interleucina-6 (il-6) no tratamento da doença do enxerto versus hospedeiro (gvhd)
EP2217264B8 (en) * 2007-11-28 2013-02-27 Hadasit Medical Research Services and Development Ltd. Use of an il-6/il-6 receptor complex for preventing xerostomia induced by radiotherapy or chemotherapy
PE20091174A1 (es) 2007-12-27 2009-08-03 Chugai Pharmaceutical Co Ltd Formulacion liquida con contenido de alta concentracion de anticuerpo
MX2010012031A (es) 2008-05-13 2011-01-20 Novimmune Sa Anticuerpos anti-il-6/il-6r y metodos de uso de los mismos.
TW201503898A (zh) 2008-06-05 2015-02-01 Chugai Pharmaceutical Co Ltd 神經浸潤抑制劑
BRPI1013877A2 (pt) 2009-04-10 2017-08-15 Ablynx Nv Sequências de aminoácidos melhoradas contra il-6r e polipeptídeos que compreendem os mesmos para o tratamento de doenças e distúrbios relacionados com il-6r
EP2417162A2 (en) 2009-04-10 2012-02-15 Ablynx N.V. Improved amino acid sequences directed against il-6r and polypeptides comprising the same for the treatment of il-6r related diseases and disorders
TWI523661B (zh) 2009-07-31 2016-03-01 Shin Maeda Anti-IL-6 receptor antibody in the manufacture of inhibitors of metastatic inhibition of lung cancer metastasis to the liver
SI3202785T1 (sl) 2009-10-26 2024-08-30 F. Hoffmann-La Roche Ag Postopek za proizvodnjo glikoziliranega imunoglobulina
JO3417B1 (ar) 2010-01-08 2019-10-20 Regeneron Pharma الصيغ المستقرة التي تحتوي على الأجسام المضادة لمضاد مستقبل( interleukin-6 (il-6r
DK2578231T3 (da) 2010-05-28 2022-12-12 Chugai Pharmaceutical Co Ltd Antitumor-t-celle-reaktionsforstærker
US20130149302A1 (en) 2010-05-28 2013-06-13 Chugai Seiyaku Kabushiki Kaisha Therapeutic agents for pancreatic cancer
WO2012064627A2 (en) 2010-11-08 2012-05-18 Genentech, Inc. Subcutaneously administered anti-il-6 receptor antibody
WO2012101251A1 (en) 2011-01-28 2012-08-02 Sanofi Human antibodies to pcsk9 for use in methods of treatment based on particular dosage regimens
AR087305A1 (es) 2011-07-28 2014-03-12 Regeneron Pharma Formulaciones estabilizadas que contienen anticuerpos anti-pcsk9, metodo de preparacion y kit
EP2747782B1 (en) 2011-09-23 2018-01-17 Ablynx NV Prolonged inhibition of interleukin-6 mediated signaling
TWI589299B (zh) 2011-10-11 2017-07-01 再生元醫藥公司 用於治療類風濕性關節炎之組成物及其使用方法
WO2013059548A1 (en) 2011-10-19 2013-04-25 Sanofi Compositions and methods for treating cancer using jak2 inhibitor
JO3370B1 (ar) 2011-11-10 2019-03-13 Regeneron Pharma طريقة لتثبيط نمو الورم عن طريق تثبيط مستقبل انترلوكين 6
US9487590B2 (en) 2012-09-25 2016-11-08 Cytomx Therapeutics, Inc. Activatable antibodies that bind interleukin-6 receptor and methods of use thereof
JP6442404B2 (ja) 2013-06-11 2018-12-19 国立研究開発法人国立精神・神経医療研究センター 再発寛解型多発性硬化症（ｒｒｍｓ）患者の治療予後予測方法、及び新規治療適応判断方法
RU2674996C2 (ru) 2013-07-04 2018-12-14 Ф. Хоффманн-Ля Рош Аг Иммуноферментный анализ с подавлением интерференции для определения антител к лекарствам в образцах сыворотки
US9017678B1 (en) 2014-07-15 2015-04-28 Kymab Limited Method of treating rheumatoid arthritis using antibody to IL6R
DE202014010499U1 (de) 2013-12-17 2015-10-20 Kymab Limited Targeting von humaner PCSK9 zur Cholesterinbehandlung
WO2015116852A1 (en) 2014-01-29 2015-08-06 Regeneron Pharmaceuticals, Inc. Methods for treating rheumatoid arthritis by administering an il-6r antibody
EP3209327A1 (en) 2014-10-21 2017-08-30 Ablynx N.V. Treatment of il-6r related diseases
CN107249637A (zh) 2015-02-27 2017-10-13 中外制药株式会社 用于治疗il‑6相关疾病的组合物
CN107922507B (zh) 2015-08-18 2022-04-05 瑞泽恩制药公司 抗pcsk9抑制性抗体用来治疗接受脂蛋白单采的高脂血症患者
WO2017147169A1 (en) 2016-02-22 2017-08-31 Ohio State Innovation Foundation Chemoprevention using controlled-release formulations of anti-interleukin 6 agents, synthetic vitamin a analogues or metabolites, and estradiol metabolites
EP3596175A4 (en) 2017-03-17 2021-01-13 The Ohio State Innovation Foundation NANOPARTICLE FOR THE DELIVERY OF CHEMOPREVENTIVE AGENTS
US11851486B2 (en) 2017-05-02 2023-12-26 National Center Of Neurology And Psychiatry Method for predicting and evaluating therapeutic effect in diseases related to IL-6 and neutrophils
JP7235249B2 (ja) 2017-10-20 2023-03-08 学校法人兵庫医科大学 抗ｉｌ－６受容体抗体を含有する術後の癒着を抑制するための医薬組成物
US20210363238A1 (en) 2018-01-31 2021-11-25 Motokazu Kato Therapeutic agent for asthma containing il-6 inhibitor
CN112955222A (zh) 2018-08-29 2021-06-11 里珍纳龙药品有限公司 用于治疗患有类风湿性关节炎的个体的方法和组合物
CN114206442A (zh) 2019-01-31 2022-03-18 赛诺菲生物技术公司 用于治疗幼年特发性关节炎的抗il-6受体抗体
WO2020201362A2 (en) 2019-04-02 2020-10-08 INSERM (Institut National de la Santé et de la Recherche Médicale) Methods of predicting and preventing cancer in patients having premalignant lesions
KR20220019670A (ko) 2019-04-17 2022-02-17 고쿠리츠다이가쿠호진 히로시마다이가쿠 Il-6 저해제 및 ccr2 저해제를 조합하여 투여하는 것을 특징으로 하는 비뇨기암의 치료제
KR20230123497A (ko) 2020-12-18 2023-08-23 아블린쓰 엔.브이. IL-6 및 TNF-α를 표적화하는 면역글로불린 단일 가변도메인을 포함하는 폴리펩티드
WO2022191306A1 (ja) 2021-03-12 2022-09-15 中外製薬株式会社 重症筋無力症の治療または予防用の医薬組成物

Family Cites Families (6)

* Cited by examiner, † Cited by third party
Publication number Priority date Publication date Assignee Title
JPS6124697A (ja) * 1984-07-11 1986-02-03 Tanaka Kikai Sangyo Kk 船舶における圧力流体の冷却方法
JPH01501206A (ja) * 1986-10-28 1989-04-27 メモリアル・スローン―ケッテリング・キヤンサー・センター Ｆｃレセプタ―タンパクを発現するＤＮＡ
JPS649774A (en) * 1987-07-02 1989-01-13 Fujitsu Ltd Thermal transfer printing method
JP2629712B2 (ja) * 1987-07-03 1997-07-16 日東紡績株式会社 インクジェット記録用紙
JP2598666B2 (ja) * 1987-10-19 1997-04-09 忠三 岸本 抗ヒトｂｃｄｆモノクローナル抗体
CA1341152C (en) * 1988-01-22 2000-12-12 Tadamitsu Kishimoto Receptor protein for human b cell stimulatory factor-2

Also Published As

Publication number Publication date
AU2872089A (en) 1989-07-27
IL89011A0 (en) 1989-08-15
KR890012000A (ko) 1989-08-23
US5480796A (en) 1996-01-02
IL89011A (en) 1995-03-15
EP0325474A3 (en) 1990-06-06
US5851793A (en) 1998-12-22
JP2865300B2 (ja) 1999-03-08
ATE123295T1 (de) 1995-06-15
DE68922869T2 (de) 1995-10-19
DE68922869D1 (de) 1995-07-06
AU615715B2 (en) 1991-10-10
JPH02288898A (ja) 1990-11-28
CA1341152C (en) 2000-12-12
HK49997A (en) 1997-04-25
EP0325474A2 (en) 1989-07-26
EP0325474B1 (en) 1995-05-31
ES2072892T3 (es) 1995-08-01
US5990282A (en) 1999-11-23
US5171840A (en) 1992-12-15
US6410691B1 (en) 2002-06-25

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