JP3458512B2 - 骨密度の変動推定方法又は骨そしょう症の診断方法及びこれに用いる試薬キット - Google Patents
骨密度の変動推定方法又は骨そしょう症の診断方法及びこれに用いる試薬キットInfo
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- G01N33/50—Chemical analysis of biological material, e.g. blood, urine; Testing involving biospecific ligand binding methods; Immunological testing
- G01N33/68—Chemical analysis of biological material, e.g. blood, urine; Testing involving biospecific ligand binding methods; Immunological testing involving proteins, peptides or amino acids
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Description
【０００１】
【産業上の利用分野】本発明は、骨密度の変動推定方法
又は骨そしょう症の診断方法及びこれに用いる試薬キッ
トに関するものであり、更に詳しくは血液試料中の可溶
性インタ−ロイキン−６レセプタ−（以下、ｓＩＬ−６
Ｒと略する）濃度若しくはその変動を測定することから
なる骨密度の変動推定方法又は骨そしょう症の診断方法
及び試料中のｓＩＬ−６Ｒ濃度を測定するための試薬か
らなる骨密度の変動推定若しくは骨そしょう症の診断の
ための試薬キットに関するものである。
又は骨そしょう症の診断方法及びこれに用いる試薬キッ
トに関するものであり、更に詳しくは血液試料中の可溶
性インタ−ロイキン−６レセプタ−（以下、ｓＩＬ−６
Ｒと略する）濃度若しくはその変動を測定することから
なる骨密度の変動推定方法又は骨そしょう症の診断方法
及び試料中のｓＩＬ−６Ｒ濃度を測定するための試薬か
らなる骨密度の変動推定若しくは骨そしょう症の診断の
ための試薬キットに関するものである。
【０００２】
【従来の技術】インターロイキン−６（以下、ＩＬ−６
と略する）は、多くの機能をもつサイトカインとして報
告されているが、近年、その作用の１つに骨吸収促進作
用があることが知られるようになった。一方で、閉経後
のエストラジオール分泌の低下によりＩＬ−６産生が上
昇することが知られており、これらの知見から、骨そし
ょう症の病態形成へのＩＬ−６関与の可能性が指摘され
ている。
と略する）は、多くの機能をもつサイトカインとして報
告されているが、近年、その作用の１つに骨吸収促進作
用があることが知られるようになった。一方で、閉経後
のエストラジオール分泌の低下によりＩＬ−６産生が上
昇することが知られており、これらの知見から、骨そし
ょう症の病態形成へのＩＬ−６関与の可能性が指摘され
ている。
【０００３】インターロイキン−６レセプター（以下、
ＩＬ−６Ｒと略する）は、分子量８０ＫＤａの、ＩＬ−
６と結合してリガンド−レセプター複合体を形成する蛋
白質である。ＩＬ−６とＩＬ−６Ｒの複合体は、更にｇ
ｐ１３０と呼ばれる分子量１３０ＫＤａの蛋白質と結合
することで、ＩＬ−６のシグナル伝達機能を担っている
（特開平４−２９９９７号公報参照）。
ＩＬ−６Ｒと略する）は、分子量８０ＫＤａの、ＩＬ−
６と結合してリガンド−レセプター複合体を形成する蛋
白質である。ＩＬ−６とＩＬ−６Ｒの複合体は、更にｇ
ｐ１３０と呼ばれる分子量１３０ＫＤａの蛋白質と結合
することで、ＩＬ−６のシグナル伝達機能を担っている
（特開平４−２９９９７号公報参照）。
【０００４】ＩＬ−６Ｒは膜蛋白質であり、細胞膜の膜
内部分、膜貫通部分及び膜外部分かを有しているが、こ
のうち５５ＫＤａの膜外部分が血清や尿中に検出される
ことが明らかとなっている（Ｅｕｒ．Ｊ．Ｉｍｍｕｎｏ
ｌ．２３巻、８２０〜８２４頁、１９９３年）。
内部分、膜貫通部分及び膜外部分かを有しているが、こ
のうち５５ＫＤａの膜外部分が血清や尿中に検出される
ことが明らかとなっている（Ｅｕｒ．Ｊ．Ｉｍｍｕｎｏ
ｌ．２３巻、８２０〜８２４頁、１９９３年）。
【０００５】血清や尿中に検出される、ＩＬ−６Ｒの一
部分であるｓＩＬ−６Ｒは、ミエローマやエイズ患者に
おいて上昇することが報告されており、ＩＬ−６が関連
する疾病においてｓＩＬ−６Ｒもまた重要な役割を担っ
ていると考えられている（Ｇａｉｌａｒｄ Ｊ．Ｐ．
ら、Ｅｕｒ．Ｊ．Ｉｍｍｕｎｏｌ．２３巻、８２０〜８
２４頁、１９９３年及びＨｏｎｄａ Ｍ．ら、Ｊ．Ｉｍ
ｍｕｎｏｌ．１４８巻、２１７５〜２１８０頁、１９９
２年）。
部分であるｓＩＬ−６Ｒは、ミエローマやエイズ患者に
おいて上昇することが報告されており、ＩＬ−６が関連
する疾病においてｓＩＬ−６Ｒもまた重要な役割を担っ
ていると考えられている（Ｇａｉｌａｒｄ Ｊ．Ｐ．
ら、Ｅｕｒ．Ｊ．Ｉｍｍｕｎｏｌ．２３巻、８２０〜８
２４頁、１９９３年及びＨｏｎｄａ Ｍ．ら、Ｊ．Ｉｍ
ｍｕｎｏｌ．１４８巻、２１７５〜２１８０頁、１９９
２年）。
【０００６】
【発明が解決しようとする課題】高齢化社会の到来とと
もに、骨そしょう症の患者数は増大しており、その予防
と治療が重要な課題となっている。骨そしょう症に関し
て最も重要なことは、できるだけ早い時期に見出だし骨
折の発症を防止することである。
もに、骨そしょう症の患者数は増大しており、その予防
と治療が重要な課題となっている。骨そしょう症に関し
て最も重要なことは、できるだけ早い時期に見出だし骨
折の発症を防止することである。
【０００７】骨折の発生頻度と最も直接的に結び付くの
は骨量（骨密度）であり、これを測定する方法として画
像診断やＸ線吸収法が利用されている。中でも二重Ｘ線
吸収法（Ｄｕａｌ ｘ−ｒａｙ ａｂｓｏｒｐｔｉｏｍ
ｅｔｒｙ、ＤＸＡ法）は、現在日本で最もよく使用さ
れ、信頼性も高いが、装置自体が高価なためにこれを備
えた病院数は少なく、日常的に利用するのは困難であ
り、放射線被ばくを伴うことから妊婦等には使用できな
いという課題がある。ＤＸＡ法では、更に、測定時の骨
量を評価することはできるが、将来の骨量減少の程度を
予測する、即ち骨代謝回転を示すことはできない。
は骨量（骨密度）であり、これを測定する方法として画
像診断やＸ線吸収法が利用されている。中でも二重Ｘ線
吸収法（Ｄｕａｌ ｘ−ｒａｙ ａｂｓｏｒｐｔｉｏｍ
ｅｔｒｙ、ＤＸＡ法）は、現在日本で最もよく使用さ
れ、信頼性も高いが、装置自体が高価なためにこれを備
えた病院数は少なく、日常的に利用するのは困難であ
り、放射線被ばくを伴うことから妊婦等には使用できな
いという課題がある。ＤＸＡ法では、更に、測定時の骨
量を評価することはできるが、将来の骨量減少の程度を
予測する、即ち骨代謝回転を示すことはできない。
【０００８】一方、閉経後に生じる骨そしょう症は、骨
形成と骨吸収のバランスが崩れ、相対的に骨吸収が大き
くなる結果生じると考えられており、骨代謝回転をあら
わす骨代謝マーカーの測定が注目されている。骨吸収を
選択的に評価できる骨代謝マーカーとしてデオキシピリ
ジノリン、骨形成を評価できる骨代謝マーカーとしてオ
ステオカルシンが注目されているが、前者は尿中濃度を
測定するものであるため日内変動や腎機能の影響を受
け、またクレアチニン濃度による補正を必要とするとい
う課題がある。一方後者は、血清中に多様な分解物が存
在するため、測定対象が明確ではないという課題があ
る。
形成と骨吸収のバランスが崩れ、相対的に骨吸収が大き
くなる結果生じると考えられており、骨代謝回転をあら
わす骨代謝マーカーの測定が注目されている。骨吸収を
選択的に評価できる骨代謝マーカーとしてデオキシピリ
ジノリン、骨形成を評価できる骨代謝マーカーとしてオ
ステオカルシンが注目されているが、前者は尿中濃度を
測定するものであるため日内変動や腎機能の影響を受
け、またクレアチニン濃度による補正を必要とするとい
う課題がある。一方後者は、血清中に多様な分解物が存
在するため、測定対象が明確ではないという課題があ
る。
【０００９】以上のように、骨そしょう症の予知、診断
の重要性は認識されていながらも、前述の如き骨代謝マ
ーカーの測定はまだ一般的とはいえないのが現状であ
る。
の重要性は認識されていながらも、前述の如き骨代謝マ
ーカーの測定はまだ一般的とはいえないのが現状であ
る。
【００１０】
【課題を解決するための手段】本発明者らは、前述のよ
うな状況の中で、骨そしょう症を引き起こす骨密度の減
少や増加に連動して濃度が変動する物質の探索を行った
結果、血液試料中のｓＩＬ−６Ｒ濃度が骨密度の減少に
関連して増加することを見出だし、本発明を完成するに
至った。
うな状況の中で、骨そしょう症を引き起こす骨密度の減
少や増加に連動して濃度が変動する物質の探索を行った
結果、血液試料中のｓＩＬ−６Ｒ濃度が骨密度の減少に
関連して増加することを見出だし、本発明を完成するに
至った。
【００１１】即ち本発明は、血液試料中のｓＩＬ−６Ｒ
濃度の変動を測定することからなる骨密度の変動推定方
法である。また、骨そしょう症とは骨密度が健常人に比
較して減少した状態を意味するが、本発明は、血液試料
中のｓＩＬ−６Ｒ濃度を測定することからなる骨そしょ
う症の診断方法である。
濃度の変動を測定することからなる骨密度の変動推定方
法である。また、骨そしょう症とは骨密度が健常人に比
較して減少した状態を意味するが、本発明は、血液試料
中のｓＩＬ−６Ｒ濃度を測定することからなる骨そしょ
う症の診断方法である。
【００１２】更に本発明は、水不溶性担体と結合した抗
ｓＩＬ−６Ｒ抗体と検出可能な標識物質と結合し又は結
合し得る抗ｓＩＬ−６Ｒ抗体とを含んでなる、骨密度の
変動推定又は骨そしょう症の診断に用いる試薬キットで
ある。以下、本発明を詳細に説明する。
ｓＩＬ−６Ｒ抗体と検出可能な標識物質と結合し又は結
合し得る抗ｓＩＬ−６Ｒ抗体とを含んでなる、骨密度の
変動推定又は骨そしょう症の診断に用いる試薬キットで
ある。以下、本発明を詳細に説明する。
【００１３】本発明は、血液試料中のｓＩＬ−６Ｒを測
定することからなる骨密度の変動を推定し又は骨そしょ
う症を診断する方法である。ヒト以外の哺乳動物におい
てもＩＬ−６やＩＬ−６Ｒ等が存在することが知られて
いることから（例えばマウスのＩＬ−６Ｒについては特
開平３−１５５７９５号公報参照）、本発明はヒト以外
の哺乳動物の骨密度の変動推定方法としても実施し得る
が、好ましくはヒトの骨密度の変動を推定し又は骨そし
ょう症を診断するために使用される。
定することからなる骨密度の変動を推定し又は骨そしょ
う症を診断する方法である。ヒト以外の哺乳動物におい
てもＩＬ−６やＩＬ−６Ｒ等が存在することが知られて
いることから（例えばマウスのＩＬ−６Ｒについては特
開平３−１５５７９５号公報参照）、本発明はヒト以外
の哺乳動物の骨密度の変動推定方法としても実施し得る
が、好ましくはヒトの骨密度の変動を推定し又は骨そし
ょう症を診断するために使用される。
【００１４】本発明でいうｓＩＬ−６Ｒとは、少なくと
もＩＬ−６Ｒの機能、即ちＩＬ−６のシグナル伝達機能
の発現に必要な機能部位を含むＩＬ−６断片を意味す
る。
もＩＬ−６Ｒの機能、即ちＩＬ−６のシグナル伝達機能
の発現に必要な機能部位を含むＩＬ−６断片を意味す
る。
【００１５】より詳しくは、ヒトのＩＬ−６Ｒの場合、
当該機能部位は４６８のアミノ酸残基からなるＩＬ−６
Ｒの全アミノ酸配列中、Ｎ末端から１２３位〜３２３位
までの部分に存在することから、少なくともこの部位を
有し、かつ、細胞膜から遊離して存在する種々の分子量
を有するＩＬ−６Ｒ断片である（例えばアメリカ登録特
許第５１７１８４０号公報参照）。代表的なｓＩＬ−６
Ｒとしては、前記の膜外部分のみからなる、５５ＫＤａ
のＩＬ−６Ｒ断片が例示できる。
当該機能部位は４６８のアミノ酸残基からなるＩＬ−６
Ｒの全アミノ酸配列中、Ｎ末端から１２３位〜３２３位
までの部分に存在することから、少なくともこの部位を
有し、かつ、細胞膜から遊離して存在する種々の分子量
を有するＩＬ−６Ｒ断片である（例えばアメリカ登録特
許第５１７１８４０号公報参照）。代表的なｓＩＬ−６
Ｒとしては、前記の膜外部分のみからなる、５５ＫＤａ
のＩＬ−６Ｒ断片が例示できる。
【００１６】血液試料としては、通常の免疫測定で使用
する血清等を使用すれば良く、ヒトの骨密度の変動を推
定し又はヒトの骨そしょう症を診断するためにはヒトの
血液試料、好ましくはヒト血清試料を使用すれば良い。
する血清等を使用すれば良く、ヒトの骨密度の変動を推
定し又はヒトの骨そしょう症を診断するためにはヒトの
血液試料、好ましくはヒト血清試料を使用すれば良い。
【００１７】ｓＩＬ−６Ｒの測定は、通常の免疫測定に
従えば良く、例えばサンドイッチ法や競合法により実施
することができる。例えばサンドイッチ法による場合、
水不溶性担体と結合した抗ｓＩＬ−６Ｒ抗体と、検出可
能な標識物質と結合し又は結合し得る抗ｓＩＬ−６Ｒ抗
体を用いることを例示できる。また例えば競合法による
場合には、水不溶性担体と結合した抗ｓＩＬ−６Ｒ抗体
と検出可能な標識物質と結合し又は結合し得る抗ｓＩＬ
−６Ｒを用いることを例示できる（ＩＬ−６Ｒの測定方
法の一例について、より具体的に特開平４−８９５６８
号公報に記載された方法を例示することもできる）。
従えば良く、例えばサンドイッチ法や競合法により実施
することができる。例えばサンドイッチ法による場合、
水不溶性担体と結合した抗ｓＩＬ−６Ｒ抗体と、検出可
能な標識物質と結合し又は結合し得る抗ｓＩＬ−６Ｒ抗
体を用いることを例示できる。また例えば競合法による
場合には、水不溶性担体と結合した抗ｓＩＬ−６Ｒ抗体
と検出可能な標識物質と結合し又は結合し得る抗ｓＩＬ
−６Ｒを用いることを例示できる（ＩＬ−６Ｒの測定方
法の一例について、より具体的に特開平４−８９５６８
号公報に記載された方法を例示することもできる）。
【００１８】これら測定法以外に、ＩＬ−６Ｒの物理的
特質を用いることもできる。即ち、ＩＬ−６ＲはＩＬ−
６と特異的に結合する性質、又は、ＩＬ−６ＲとＩＬ−
６の複合体はｇｐ１３０蛋白質と特異的に結合する性質
である。例えばＩＬ−６ＲとＩＬ−６との特異的結合を
利用する場合には、上述のサンドイッチ法による測定に
おけるいずれか一方の抗ｓＩＬ−６Ｒ抗体又は上述の競
合法による測定における抗ｓＩＬ−６Ｒ抗体をＩＬ−６
で置き換えることが可能である。
特質を用いることもできる。即ち、ＩＬ−６ＲはＩＬ−
６と特異的に結合する性質、又は、ＩＬ−６ＲとＩＬ−
６の複合体はｇｐ１３０蛋白質と特異的に結合する性質
である。例えばＩＬ−６ＲとＩＬ−６との特異的結合を
利用する場合には、上述のサンドイッチ法による測定に
おけるいずれか一方の抗ｓＩＬ−６Ｒ抗体又は上述の競
合法による測定における抗ｓＩＬ−６Ｒ抗体をＩＬ−６
で置き換えることが可能である。
【００１９】本発明でのｓＩＬ−６Ｒの測定において
は、上述の種々の測定方法のいずれを採用しても良い
が、測定試薬の調製の容易さや高感度性等の観点から、
水不溶性担体と結合した抗ｓＩＬ−６Ｒ抗体と、検出可
能な標識物質と結合し又は結合し得る抗ｓＩＬ−６Ｒ抗
体を用いるサンドイッチ法によることが最も好ましい。
は、上述の種々の測定方法のいずれを採用しても良い
が、測定試薬の調製の容易さや高感度性等の観点から、
水不溶性担体と結合した抗ｓＩＬ−６Ｒ抗体と、検出可
能な標識物質と結合し又は結合し得る抗ｓＩＬ−６Ｒ抗
体を用いるサンドイッチ法によることが最も好ましい。
【００２０】測定に使用する抗ｓＩＬ−６Ｒ抗体や競合
法におけるｓＩＬ−６Ｒ等は、例えば例えばアメリカ登
録特許第５１７１８４０号公報等を参照し、又はこれら
に記載されたｓＩＬ−６Ｒを調製し免疫原として使用す
ることで調整できる。なお抗マウスｓＩＬ−６Ｒ抗体等
は、例えば特開平４−９９８００号公報の記載されたマ
ウスＩＬ−６Ｒを調製し免疫原として使用することで調
製できる。
法におけるｓＩＬ−６Ｒ等は、例えば例えばアメリカ登
録特許第５１７１８４０号公報等を参照し、又はこれら
に記載されたｓＩＬ−６Ｒを調製し免疫原として使用す
ることで調整できる。なお抗マウスｓＩＬ−６Ｒ抗体等
は、例えば特開平４−９９８００号公報の記載されたマ
ウスＩＬ−６Ｒを調製し免疫原として使用することで調
製できる。
【００２１】測定において使用する標識に特別の制限は
なく、従来から使用されている蛍光物質、放射性同位元
素、吸光物質又は酵素等が使用できるが、取扱いが容易
で特別な施設等を必要とせずかつ測定感度に優れた酵素
を使用することが好ましい。具体的にアルカリフォスフ
ァタ−ゼ等の酵素が例示できる。
なく、従来から使用されている蛍光物質、放射性同位元
素、吸光物質又は酵素等が使用できるが、取扱いが容易
で特別な施設等を必要とせずかつ測定感度に優れた酵素
を使用することが好ましい。具体的にアルカリフォスフ
ァタ−ゼ等の酵素が例示できる。
【００２２】後に実施例において詳細に示す通り、血液
試料中のｓＩＬ−６Ｒ濃度の変動（上昇）と相関して骨
密度が変動（減少）する。従って、本発明によりｓＩＬ
−６Ｒ濃度の変動を観察することで骨濃度の変動を推定
することが可能である。特に、同一被検者からの血液試
料について本発明の方法を実施することにより、該被検
者の骨密度の変動をモニタ−することが可能である。
試料中のｓＩＬ−６Ｒ濃度の変動（上昇）と相関して骨
密度が変動（減少）する。従って、本発明によりｓＩＬ
−６Ｒ濃度の変動を観察することで骨濃度の変動を推定
することが可能である。特に、同一被検者からの血液試
料について本発明の方法を実施することにより、該被検
者の骨密度の変動をモニタ−することが可能である。
【００２３】更に、血液試料中のｓＩＬ−６Ｒ濃度が一
定値を越えた場合、骨そしょう症と診断することも可能
である。
定値を越えた場合、骨そしょう症と診断することも可能
である。
【００２４】
【実施例】以下、実施例により本発明を更に詳細に説明
するが、本発明はこれら実施例に限定されるものではな
い。
するが、本発明はこれら実施例に限定されるものではな
い。
【００２５】実施例１ ｓＩＬ６Ｒの測定方法の確立
ｓＩＬ−６Ｒと結合可能な抗ＩＬ−６Ｒモノクロ−ナル
抗体ＰＭ１（特開平３−１３９２９３号公報参照）を
０．１Ｍ炭酸緩衝液（ｐＨ９．６）に５μｇ／ｍｌにな
るように溶解し、これを９６穴プレート（水不溶性担
体）に１００μｌ／ウェルずつ加え、４℃で一晩放置し
て固相化した。このプレートを０．０２％ｔｗｅｅｎ２
０を含むＰＢＳ（リン酸緩衝生理食塩水）で洗浄した
後、０．５％ＢＳＡを含むＰＢＳを１５０μｌ／ウェル
ずつ加えて４℃で一晩放置し、ブロッキング処理を行っ
た。
抗体ＰＭ１（特開平３−１３９２９３号公報参照）を
０．１Ｍ炭酸緩衝液（ｐＨ９．６）に５μｇ／ｍｌにな
るように溶解し、これを９６穴プレート（水不溶性担
体）に１００μｌ／ウェルずつ加え、４℃で一晩放置し
て固相化した。このプレートを０．０２％ｔｗｅｅｎ２
０を含むＰＢＳ（リン酸緩衝生理食塩水）で洗浄した
後、０．５％ＢＳＡを含むＰＢＳを１５０μｌ／ウェル
ずつ加えて４℃で一晩放置し、ブロッキング処理を行っ
た。
【００２６】アルカリホスファターゼ（以下、ＡＬＰと
略する）標識抗ＩＬ−６Ｒモノクロ−ナル抗体は、ｓＩ
Ｌ−６Ｒと結合可能な抗ＩＬ−６Ｒモノクロ−ナル抗体
ＭＴ１８（特開平２−２８８８９８号公報参照）２ｍｇ
と市販のウシ小腸由来アルカリ性ホスファターゼ（バイ
オザイム製）２ｍｇを用い、これらをＳ−Ｓ結合により
結合させた後、ゲル瀘過（カラム：Ｇ３０００ＳＷ、東
ソ−（株）製；溶出：１５０ｍＭ ＮａＣｌを含む５０
ｍＭリン酸緩衡液（ｐＨ７））を行って精製したものを
用いた（石川栄治ら編集、酵素免疫測定法第３版、医学
書院、１１７頁〜参照）。
略する）標識抗ＩＬ−６Ｒモノクロ−ナル抗体は、ｓＩ
Ｌ−６Ｒと結合可能な抗ＩＬ−６Ｒモノクロ−ナル抗体
ＭＴ１８（特開平２−２８８８９８号公報参照）２ｍｇ
と市販のウシ小腸由来アルカリ性ホスファターゼ（バイ
オザイム製）２ｍｇを用い、これらをＳ−Ｓ結合により
結合させた後、ゲル瀘過（カラム：Ｇ３０００ＳＷ、東
ソ−（株）製；溶出：１５０ｍＭ ＮａＣｌを含む５０
ｍＭリン酸緩衡液（ｐＨ７））を行って精製したものを
用いた（石川栄治ら編集、酵素免疫測定法第３版、医学
書院、１１７頁〜参照）。
【００２７】標準ＩＬ−６Ｒ溶液は、保川らの方法（Ｙ
ａｓｕｋａｗａ Ｋ．ら、Ｊ．Ｂｉｏｃｈｅｍ．１０８
巻、６７３〜６７６頁、１９９０年）により調製したＩ
Ｌ−６Ｒを希釈液（０．１Ｍ トリス塩酸緩衝液（ｐＨ
８．０) 、１ｍＭ ＭｇＣｌ２、０．１ｍＭ ＺｎＣｌ
２、１％ＢＳＡ）で２５、１２．５、６．２５、３．１
３、１．５６、０．７８、０．３６ｎｇ／ｍｌになるよ
うに希釈したものを用いた。
ａｓｕｋａｗａ Ｋ．ら、Ｊ．Ｂｉｏｃｈｅｍ．１０８
巻、６７３〜６７６頁、１９９０年）により調製したＩ
Ｌ−６Ｒを希釈液（０．１Ｍ トリス塩酸緩衝液（ｐＨ
８．０) 、１ｍＭ ＭｇＣｌ２、０．１ｍＭ ＺｎＣｌ
２、１％ＢＳＡ）で２５、１２．５、６．２５、３．１
３、１．５６、０．７８、０．３６ｎｇ／ｍｌになるよ
うに希釈したものを用いた。
【００２８】前述のプレートを０．０２％ｔｗｅｅｎ２
０を含むＰＢＳで洗浄後、５０μｌの上記標準液及び１
ｍＡのＡＬＰ標識抗体（１ｍＡは２８０ｎｍの吸光度が
０．００１となる濃度になるように希釈液で希釈したも
の）の５０μｌを各ウェル加え、室温で２時間静置して
反応を行った。このプレートを洗浄後、ｐ−ニトロフェ
ニルホスフェート（シグマ社製）を１ｍｇ／ｍｌになる
ように０．０５Ｍ炭酸緩衝液（ｐＨ９．８) に溶解した
ものを加え、プレートに結合したＡＬＰ標識抗体による
発色反応を行い、生成したｐ−ニトロフェノールの量を
市販のプレ−トリ−ダ−（ＭＰＲ−Ａ４、東ソー（株）
製）により比色定量した。なお測定波長４０５ｎｍで、
対照波長は４９２ｎｍである。
０を含むＰＢＳで洗浄後、５０μｌの上記標準液及び１
ｍＡのＡＬＰ標識抗体（１ｍＡは２８０ｎｍの吸光度が
０．００１となる濃度になるように希釈液で希釈したも
の）の５０μｌを各ウェル加え、室温で２時間静置して
反応を行った。このプレートを洗浄後、ｐ−ニトロフェ
ニルホスフェート（シグマ社製）を１ｍｇ／ｍｌになる
ように０．０５Ｍ炭酸緩衝液（ｐＨ９．８) に溶解した
ものを加え、プレートに結合したＡＬＰ標識抗体による
発色反応を行い、生成したｐ−ニトロフェノールの量を
市販のプレ−トリ−ダ−（ＭＰＲ−Ａ４、東ソー（株）
製）により比色定量した。なお測定波長４０５ｎｍで、
対照波長は４９２ｎｍである。
【００２９】結果を図１に示す。図１に示す通り、０．
３９〜２５ｎｇ／ｍｌの範囲でＩＬ６Ｒを測定可能であ
った。
３９〜２５ｎｇ／ｍｌの範囲でＩＬ６Ｒを測定可能であ
った。
【００３０】実施例２ 閉経前後の女性血清中のｓＩＬ
６Ｒの測定 閉経前後の女性血清は、婦人科外来を訪れた健康な４４
〜６５才の女性１５１人より採取した。内訳は、閉経前
６５例、閉経進行中３５例、閉経後５１例である。
６Ｒの測定 閉経前後の女性血清は、婦人科外来を訪れた健康な４４
〜６５才の女性１５１人より採取した。内訳は、閉経前
６５例、閉経進行中３５例、閉経後５１例である。
【００３１】採取した血清は、測定まで−８０℃にて保
存した。ｓＩＬ−６Ｒ測定には、血清を実施例１に記載
した希釈液を用いて６０倍に希釈したものをサンプルと
し、実施例１に記載された方法により測定を行なった。
なお、比較のため、同血清中のＩＬ−６濃度を水不溶性
担体と結合した抗ＩＬ−６抗体とＡＬＰと結合した抗Ｉ
Ｌ−６抗体を用いるサンドイッチ法により測定した。
存した。ｓＩＬ−６Ｒ測定には、血清を実施例１に記載
した希釈液を用いて６０倍に希釈したものをサンプルと
し、実施例１に記載された方法により測定を行なった。
なお、比較のため、同血清中のＩＬ−６濃度を水不溶性
担体と結合した抗ＩＬ−６抗体とＡＬＰと結合した抗Ｉ
Ｌ−６抗体を用いるサンドイッチ法により測定した。
【００３２】図２に、測定結果を閉経前、閉経進行中、
閉経後の３群に分けて示す。血清中ｓＩＬ−６Ｒ濃度
（平均値±標準誤差）はそれぞれ１２５．９５±４．２
９ｎｇ／ｍｌ、１２２．８１±７．４０ｎｇ／ｍｌ、１
８０．２６±１５．１８ｎｇ／ｍｌとなり、閉経後女性
血清中のｓＩＬ−６Ｒ濃度は他の２群に比べて有意に上
昇していた。これに対してＩＬ−６濃度は、閉経前、閉
経進行中、閉経後の３群において有意な差を示さなかっ
た。なお、検定にはマン・ホイットニイ検定（Ｍａｎｎ
−Ｗｈｉｔｎｅｙ、いわゆるＵテスト）を用いた。
閉経後の３群に分けて示す。血清中ｓＩＬ−６Ｒ濃度
（平均値±標準誤差）はそれぞれ１２５．９５±４．２
９ｎｇ／ｍｌ、１２２．８１±７．４０ｎｇ／ｍｌ、１
８０．２６±１５．１８ｎｇ／ｍｌとなり、閉経後女性
血清中のｓＩＬ−６Ｒ濃度は他の２群に比べて有意に上
昇していた。これに対してＩＬ−６濃度は、閉経前、閉
経進行中、閉経後の３群において有意な差を示さなかっ
た。なお、検定にはマン・ホイットニイ検定（Ｍａｎｎ
−Ｗｈｉｔｎｅｙ、いわゆるＵテスト）を用いた。
【００３３】実施例３ ｓＩＬ−６Ｒ測定値とＤＸＡの
相関 閉経後の女性は骨密度が減少し、骨そしょう症につなが
ることが今までに報告されている。そこで、実施例２に
おける１５１人の腰椎骨密度をＬｕｎａｒ ＤＰＸ−Ｌ
（Ｌｕｎａｒ Ｉｎｃ．製）を用いて測定し、ｓＩＬ−
６Ｒ測定値との相関を調べた。結果を図３に示す。図３
からは、ｓＩＬ−６Ｒ測定値の高い女性ほど骨密度が低
値を示し、両者の相関係数は０．４であることが分か
る。
相関 閉経後の女性は骨密度が減少し、骨そしょう症につなが
ることが今までに報告されている。そこで、実施例２に
おける１５１人の腰椎骨密度をＬｕｎａｒ ＤＰＸ−Ｌ
（Ｌｕｎａｒ Ｉｎｃ．製）を用いて測定し、ｓＩＬ−
６Ｒ測定値との相関を調べた。結果を図３に示す。図３
からは、ｓＩＬ−６Ｒ測定値の高い女性ほど骨密度が低
値を示し、両者の相関係数は０．４であることが分か
る。
【００３４】実施例４ ｓＩＬ−６Ｒ測定値と血清オス
テオカルシン値又は尿中デオキシピリジノリン値の相関 実施例２における１５１人について、骨代謝の指標とし
て知られている血清オステオカルシン値（intact-N末）
及び尿中デオキシピリジノリン（クレアチニン補正値）
値を測定し、ｓＩＬ−６Ｒ測定値と比較を行なった。
テオカルシン値又は尿中デオキシピリジノリン値の相関 実施例２における１５１人について、骨代謝の指標とし
て知られている血清オステオカルシン値（intact-N末）
及び尿中デオキシピリジノリン（クレアチニン補正値）
値を測定し、ｓＩＬ−６Ｒ測定値と比較を行なった。
【００３５】表１に骨密度とｓＩＬ−６Ｒ、血清オステ
オカルシン値及び尿中デオキシピリジノリン（クレアチ
ニン補正値）値との相関係数を示す。表１からは、これ
ら従来の骨代謝マーカーに比べ、ｓＩＬ−６Ｒがもっと
も骨密度との相関が高いことが明らかとなった。なお、
血清オステオカルシン値及びクレアチニン量で補正した
尿中デオキシピリジノリン値と血清ｓＩＬ−６Ｒとの間
にも相関があり、血清ｓＩＬ−６Ｒ値の上昇が確かに骨
代謝を反映した結果であることが示された。
オカルシン値及び尿中デオキシピリジノリン（クレアチ
ニン補正値）値との相関係数を示す。表１からは、これ
ら従来の骨代謝マーカーに比べ、ｓＩＬ−６Ｒがもっと
も骨密度との相関が高いことが明らかとなった。なお、
血清オステオカルシン値及びクレアチニン量で補正した
尿中デオキシピリジノリン値と血清ｓＩＬ−６Ｒとの間
にも相関があり、血清ｓＩＬ−６Ｒ値の上昇が確かに骨
代謝を反映した結果であることが示された。
【００３６】
【表１】
【００３７】
【発明の効果】本発明によれば、比較的採取が容易な血
清等の血液試料を用いることにより、骨密度の変動の推
定や骨そしょう症の診断が可能となる。本発明は、現在
では広く一般に普及している免疫測定の原理により実施
することが可能であり、特別の装置を必要としないた
め、必要に応じて日常的に実施することが可能である。
清等の血液試料を用いることにより、骨密度の変動の推
定や骨そしょう症の診断が可能となる。本発明は、現在
では広く一般に普及している免疫測定の原理により実施
することが可能であり、特別の装置を必要としないた
め、必要に応じて日常的に実施することが可能である。
【００３８】更に本発明では、放射線を人体に照射する
必要がなく、安全面でも優れた方法である。
必要がなく、安全面でも優れた方法である。
【００３９】これまでの説明で明らかなように、血液試
料中のｓＩＬ−６Ｒ濃度の上昇と相関して骨濃度が変動
（減少）する。従って、本発明によりｓＩＬ−６Ｒ濃度
の変動を観察することで骨濃度の変動をモニタ−するこ
とが可能であり、更には血液試料中のｓＩＬ−６Ｒ濃度
が一定値を越えた場合、骨そしょう症と診断することも
可能である。
料中のｓＩＬ−６Ｒ濃度の上昇と相関して骨濃度が変動
（減少）する。従って、本発明によりｓＩＬ−６Ｒ濃度
の変動を観察することで骨濃度の変動をモニタ−するこ
とが可能であり、更には血液試料中のｓＩＬ−６Ｒ濃度
が一定値を越えた場合、骨そしょう症と診断することも
可能である。
【図１】図１は、実施例１において構築したＩＬ−６Ｒ
のサンドイッチ測定系の標準曲線を示すものであり、縦
軸は吸光度、横軸はＩＬ−６Ｒ濃度（ｎｇ／ｍｌ）をそ
れぞれ示す。本図からは、当該サンドイッチ測定系が
０．３９〜２５ｎｇ／ｍｌの範囲でＩＬ６Ｒを測定可能
であることが分かる。なお図中の直線は、ｙ＝２．９５
７７×１０-2Ｘ−４．０２００×１０-5である。
のサンドイッチ測定系の標準曲線を示すものであり、縦
軸は吸光度、横軸はＩＬ−６Ｒ濃度（ｎｇ／ｍｌ）をそ
れぞれ示す。本図からは、当該サンドイッチ測定系が
０．３９〜２５ｎｇ／ｍｌの範囲でＩＬ６Ｒを測定可能
であることが分かる。なお図中の直線は、ｙ＝２．９５
７７×１０-2Ｘ−４．０２００×１０-5である。
【図２】図２は、実施例２における閉経前後の女性血清
中のＩＬ−６Ｒ及びｓＩＬ６Ｒの測定結果を示すもので
あり、縦軸はｓＩＬ−６Ｒ又はＩＬ−６濃度（ｎｇ／ｍ
ｌ又はｐｇ／ｍｌ）を、横軸は閉経前（ｐｒｅＭ）、閉
経進行中（ｐｅｒｉＭ）又は閉経後（ｐｏｓｔＭ）の群
のいずれであるかを示す。本図からは、ｓＩＬ−６Ｒ濃
度（斜線のバ−）は閉経前と閉経後の群において有意な
差を示すが、ＩＬ−６濃度（黒のバ−）は有意な差を示
さないことが分かる。
中のＩＬ−６Ｒ及びｓＩＬ６Ｒの測定結果を示すもので
あり、縦軸はｓＩＬ−６Ｒ又はＩＬ−６濃度（ｎｇ／ｍ
ｌ又はｐｇ／ｍｌ）を、横軸は閉経前（ｐｒｅＭ）、閉
経進行中（ｐｅｒｉＭ）又は閉経後（ｐｏｓｔＭ）の群
のいずれであるかを示す。本図からは、ｓＩＬ−６Ｒ濃
度（斜線のバ−）は閉経前と閉経後の群において有意な
差を示すが、ＩＬ−６濃度（黒のバ−）は有意な差を示
さないことが分かる。
【図３】図３は、ｓＩＬ−６Ｒ測定値とＤＸＡの相関を
示すものであり、縦軸はＤＸＡの測定値（骨密度；Ｂｏ
ｎｅ Ｍｉｎｅｒａｌ Ｄｅｎｓｉｔｙ、ｇ／ｃｍ2 ）
を、横軸はｓＩＬ−６Ｒ測定値（ｎｇ／ｍｌ）をそれぞ
れ示す。本図からは、ｓＩＬ−６Ｒ測定値が低いほどＤ
ＸＡ測定値が高い、即ち骨密度が高く、逆にｓＩＬ−６
Ｒ測定値が高いほどＤＸＡ測定値が低い、即ち骨密度が
低いことが分かる。
示すものであり、縦軸はＤＸＡの測定値（骨密度；Ｂｏ
ｎｅ Ｍｉｎｅｒａｌ Ｄｅｎｓｉｔｙ、ｇ／ｃｍ2 ）
を、横軸はｓＩＬ−６Ｒ測定値（ｎｇ／ｍｌ）をそれぞ
れ示す。本図からは、ｓＩＬ−６Ｒ測定値が低いほどＤ
ＸＡ測定値が高い、即ち骨密度が高く、逆にｓＩＬ−６
Ｒ測定値が高いほどＤＸＡ測定値が低い、即ち骨密度が
低いことが分かる。
Claims (6)
- 【請求項１】 血液試料中の可溶性インターロイキン−
６レセプター濃度の変動を測定することからなる骨密度
の変動推定方法。 - 【請求項２】 血液試料中の可溶性インターロイキン−
６レセプター濃度を測定することからなる骨そしょう症
の検出方法。 - 【請求項３】 血液試料が血清であることを特徴とする
請求項１項又は２項の方法。 - 【請求項４】 水不溶性担体と結合した抗可溶性インタ
ーロイキン−６レセプター抗体と、検出可能な標識物質
と結合し又は結合し得る抗可溶性インターロイキン−６
レセプター抗体を用いることを特徴とする請求項１項又
は２項の方法。 - 【請求項５】 血液試料がヒト由来のものであり、測定
されるべき可溶性インターロイキン−６レセプターがヒ
ト可溶性インターロイキン−６レセプターであることを
特徴とする請求項１項又は２項の方法。 - 【請求項６】 水不溶性担体と結合した抗可溶性インタ
ーロイキン−６レセプター抗体と検出可能な標識物質と
結合し又は結合し得る抗可溶性インターロイキン−６レ
セプター抗体とを含んでなる、骨密度の変動推定又は骨
そしょう症の診断に用いる試薬キット。
Priority Applications (4)
| Application Number | Priority Date | Filing Date | Title |
|---|---|---|---|
| JP03534995A JP3458512B2 (ja) | 1995-02-23 | 1995-02-23 | 骨密度の変動推定方法又は骨そしょう症の診断方法及びこれに用いる試薬キット |
| US08/603,121 US6258552B1 (en) | 1995-02-23 | 1996-02-20 | Estimation of change in bone mineral density and diagnosis of osteoporosis |
| DE69622799T DE69622799T2 (de) | 1995-02-23 | 1996-02-23 | Abschätzung der Veränderung von Knochen-Mineraldichten und Diagnose von Osteoporose |
| EP96102737A EP0757251B1 (en) | 1995-02-23 | 1996-02-23 | Estimation of change in bone mineral density and diagnosis of osteoporosis |
Applications Claiming Priority (1)
| Application Number | Priority Date | Filing Date | Title |
|---|---|---|---|
| JP03534995A JP3458512B2 (ja) | 1995-02-23 | 1995-02-23 | 骨密度の変動推定方法又は骨そしょう症の診断方法及びこれに用いる試薬キット |
Publications (2)
| Publication Number | Publication Date |
|---|---|
| JPH08233814A JPH08233814A (ja) | 1996-09-13 |
| JP3458512B2 true JP3458512B2 (ja) | 2003-10-20 |
Family
ID=12439392
Family Applications (1)
| Application Number | Title | Priority Date | Filing Date |
|---|---|---|---|
| JP03534995A Expired - Fee Related JP3458512B2 (ja) | 1995-02-23 | 1995-02-23 | 骨密度の変動推定方法又は骨そしょう症の診断方法及びこれに用いる試薬キット |
Country Status (4)
| Country | Link |
|---|---|
| US (1) | US6258552B1 (ja) |
| EP (1) | EP0757251B1 (ja) |
| JP (1) | JP3458512B2 (ja) |
| DE (1) | DE69622799T2 (ja) |
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| Publication number | Priority date | Publication date | Assignee | Title |
|---|---|---|---|---|
| US6510197B1 (en) | 2000-01-11 | 2003-01-21 | Alara, Inc. | Method and apparatus for osteoporosis screening |
| JP2003535338A (ja) * | 2000-06-02 | 2003-11-25 | サイトメトリー、アプリケーションズ、インコーポレーテッド | 無洗浄ビーズアッセイ、キットおよび操作 |
Family Cites Families (10)
| Publication number | Priority date | Publication date | Assignee | Title |
|---|---|---|---|---|
| US4959302A (en) | 1987-08-20 | 1990-09-25 | Endogen, Inc. | Method of evaluating immune system response to allografts, viral infection and immunosuppressive therapy |
| US5171840A (en) | 1988-01-22 | 1992-12-15 | Tadamitsu Kishimoto | Receptor protein for human B cell stimulatory factor-2 |
| DE3919942A1 (de) | 1989-06-19 | 1990-12-20 | Merck Patent Gmbh | Elektrooptisches fluessigkristallsystem |
| DE122009000023I2 (de) | 1989-07-20 | 2010-12-16 | Kishimoto | Antikörper gegen menschlichen Interleukin-6-Rezeptor |
| JP2898064B2 (ja) | 1989-08-03 | 1999-05-31 | 忠三 岸本 | ヒトｇｐ１３０蛋白質 |
| US5223611A (en) | 1989-08-03 | 1993-06-29 | Tadamitsu Kishimoto | DNA encoding for human GP130 protein |
| JPH03155795A (ja) | 1989-11-13 | 1991-07-03 | Chuzo Kishimoto | マウス・インターロイキン―６レセプター蛋白質 |
| JP3049613B2 (ja) | 1990-08-17 | 2000-06-05 | 忠三 岸本 | 組換えマウスｉｌ―６レセプターの製造方法 |
| JP3155795B2 (ja) | 1991-12-19 | 2001-04-16 | キヤノン株式会社 | 開閉可能な表示部を有する電子機器 |
| JP3139293B2 (ja) | 1994-07-14 | 2001-02-26 | 東芝ライテック株式会社 | 照明器具のソケット構造 |
-
1995
- 1995-02-23 JP JP03534995A patent/JP3458512B2/ja not_active Expired - Fee Related
-
1996
- 1996-02-20 US US08/603,121 patent/US6258552B1/en not_active Expired - Fee Related
- 1996-02-23 DE DE69622799T patent/DE69622799T2/de not_active Expired - Lifetime
- 1996-02-23 EP EP96102737A patent/EP0757251B1/en not_active Expired - Lifetime
Also Published As
| Publication number | Publication date |
|---|---|
| DE69622799D1 (de) | 2002-09-12 |
| US6258552B1 (en) | 2001-07-10 |
| EP0757251A2 (en) | 1997-02-05 |
| EP0757251B1 (en) | 2002-08-07 |
| JPH08233814A (ja) | 1996-09-13 |
| EP0757251A3 (en) | 1999-07-07 |
| DE69622799T2 (de) | 2003-05-28 |
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