KR100922454B1 - 인터페론 알파의 피루베이트 부가 이소형을 인터페론 알파로 변환시켜 인터페론 알파 조성물의 수율을 증가시키는 방법 - Google Patents
인터페론 알파의 피루베이트 부가 이소형을 인터페론 알파로 변환시켜 인터페론 알파 조성물의 수율을 증가시키는 방법 Download PDFInfo
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Abstract
본 발명에서는, 단백질의 부가 이소형(adjunct isoform)을 분리하고나서, 이를 목적하는 단백질로 변환시키는 방법을 제공한다. 본 발명의 바람직한 양태에서는, 산성 용액 또는 아연 용액을 사용하여 목적하는 단백질로부터 화학 그룹을 제거한다. 본 발명의 다른 바람직한 양태에서는, 화학 그룹이 제거된 환원된 설프하이드릴 그룹을 산화시켜 목적하는 기능을 나타내는 단백질을 제조한다.
부가 이소형, 목적하는 단백질, 고수율, 인터페론 알파, 피루베이트, 아연
Description
본원 명세서 전반에 걸쳐, 여러 간행물, 특허 및 특허원이 인용되어 있다. 이러한 간행물, 특허 및 특허원의 기재 내용들은 본원에 인용 문헌으로 삽입되어 있다.
본 발명은, 단백질의 분리 및 정제 방법에 관한 것이다. 특히, 본 발명은, 단백질의 분리 방법, 단백질 이소형(protein isoform)의 분리 방법, 및 단백질 이소형을 목적하는 단백질로 변환시키는 방법에 관한 것이다.
천연 단백질은 연구용 및 임상용으로 널리 사용되고 있다. 이러한 천연 단백질은, 천연 공급원으로부터 입수할 수 있으나, 재조합 기술을 이용하여 비-천연 공급원으로부터 제조할 수도 있다. 예를 들면, 재조합 기술을 이용하여 작제된 미생물(예를 들면, 형질전환된 세균)을 발효시키면, 천연 공급원을 이용하는 것보다 실질적으로 보다 낮은 비용으로 사람의 인터페론을 대량으로 제조할 수 있다. 또한, 이러한 DNA 재조합 기술을 사용하여, 다른 중요한 단백질(예를 들면, 인슐린 및 조직 플라스미노겐 활성 인자)을 제조할 수도 있다.
하지만, 재조합 기술을 이용하여 변형시킨 세균은, 오염 물질 및 생산하고자 하는 단백질과 구조적으로 이소형인 단백질 또한 생산하게 된다. 이러한 오염 물질 및 이소형의 단백질에는, 올리고머 단백질 및 환원된 단백질-이소형(참조: D'Andrea 등의 미국 특허 제4,765,903호), 세포 파편 및 바이러스(참조: Georgiadis 등의 미국 특허 제4,732,683호), 및 피루베이트-연결된 이소형[참조: Rose 등, J.Biol.Chem.287:19101 (1992); Prome 등, J.Biol.Chem.266:13050 (1991); Stevens 등, J.Biol.Chem.252:2998 (1977); Shapiro 등, J.Biol.Chem.255:3120 (1980)]이 포함된다. 단백질을 정제하는 동안에, 상기한 오염 물질을 제거하는 것이 바람직하다.
분명한 점은, 이러한 단백질 이소형이 목적하는 단백질의 순도를 떨어뜨리며, 이러한 단백질 이소형을 제거하기 위한 공정이 전체 수율을 떨어뜨린다는 것이다. 하지만, 이러한 단백질 이소형을 목적하는 단백질로 변환시킬 수 있다면, 단백질 이소형의 제거 공정이 불필요하게 되어, 전체적인 단백질의 수율이 크게 증가하게 될 것이다. 이를 위해 필요한 것은, 목적하지 않는 단백질 이소형을 확인하여, 이를 목적하는 단백질로 변환시키는 방법이다. 본 발명은 이러한 요구를 해결한 것이다.
발명의 요약
본 발명은, 부가 이소형(adjunct isoform)의 단백질을 분리하여 이를 목적하는 기능을 가진 단백질로 변환시킴으로써, 고도로 정제된 단백질을 고수율로 제조하는 방법을 제공한다. 본 발명의 한 양태에서는, 부가 이성형을 인터페론 알파로 변환시키는 단계를 포함하여, 인터페론 알파 조성물의 수율을 증가시키는 방법을 제공한다. 본 발명은 특정의 인터페론 알파에 한정되지는 않으나, 바람직한 한 양태에서의 인터페론 알파는 인터페론 알파 2b이다.
본 발명의 다른 양태에서는, 부가 이성형에서 절단가능한 그룹(cleavable group)을 화학적으로 제거하는 단계를 포함하여, 재조합 방법으로 제조된 부가 이소형의 단백질을 목적하는 단백질로 변환시키는 방법을 제공한다.
본 발명은, 제거되는 절단가능한 그룹에 의해 한정되지 않는다. 본 발명의 한 양태에서, 상기한 절단가능한 그룹에는 피루베이트가 포함된다.
또한, 본 발명은, 상기한 절단가능한 그룹을 화학적으로 제거하는 방법에 의해 한정되지 않는다. 본 발명의 한 양태에서의 상기한 제거 방법은, 상기한 부가 이소형의 단백질을 산성 용액에 노출시키는 단계를 포함한다. 상기한 부가 이소형이 인터페론 알파의 피루베이트 부가 이소형인 경우, 상기한 산성 용액의 pH가 약 5.5 인 것이 바람직하다. 또한, 상기한 양태에서, 상기한 산성 용액의 온도가 34 내지 40℃인 것이 바람직하다. 하지만, 본 발명의 다른 양태에서는, 상기한 부가 이소형을 아연 용액에 노출시킨다. 본 발명의 바람직한 한 양태에서는, 상기한 아연 용액의 pH가 7.8 내지 8.6이다. 또 다른 본 발명의 바람직한 한 양태에서는, 상기한 아연 용액의 온도가 30 내지 38℃이다.
또한, 본 발명은, 사용되는 산성 용액 또는 아연 용액의 형태에 의해 한정되지 않는다. 바람직한 양태에 있어서, 상기한 산성 용액 또는 아연 용액은 항산화제를 포함한다. 특히 바람직한 양태에 있어서, 상기한 항산화제는 메티오닌을 포함한다. 상기 양태에 있어서, 메티오닌의 바람직한 농도는 5 내지 40mM이다.
정의
본원에서의 용어 "목적하는 단백질"은, 정제하고자 하는 단백질을 의미한다. 따라서, 상기한 "목적하는 단백질"을 확인(identification)하는 것이, 상기한 정제 공정의 최종 목적이 된다. 예를 들면, 정제 공정 동안에, 정제 공정의 중간 단계에서, 오염 물질 (contaminant)을 포함하는 단백질 그룹(들)을 수득하는 것이 바람직할 수 있다. 중간 단계의 단백질 그룹을 수득하는 데에 흥미를 가지는 것과는 상관없이, 상기한 정제 공정의 최종 목적인 단백질 그룹이 상기한 "목적하는 단백질"로 간주된다.
본원에서의 용어 "부가 이소형(adjunct isoform)"은, 절단가능한 그룹을 단백질로부터 제거하여 목적하는 단백질을 제조할 수 있는, 목적하는 단백질과 구조상 및/또는 기능상으로 유사한 특성을 갖는 단백질 이소형(protein isoform)을 의미한다. 용어 "절단가능한 그룹 (cleavable group)"은, 목적하는 단백질에 부착되어 있는, 화학적으로 제거가능한 화학 그룹을 의미한다. 본원에서의 용어 "화학적으로 제거가능한" 또는 "화학적으로 제거된"은, 화학 그룹이 화학적 수단(산성 용액, 염기성 용액, 금속이온 촉매법 등을 포함하며, 이에 한정되지 않는다)에 의해 단백질로부터 분리되는 것을 의미한다.
본 발명을 실시하는 데에 반드시 필요한 것은 아니지만, 상기 절단가능한 그룹이 화학적으로 확인가능한 그룹인 경우, 상기한 부가 이소형은 특정 형태의 부가 이소형으로 지칭될 수 있다. 예를 들면, "피루베이트 부가 이소형"은, 부착된 절단가능한 화학 그룹이 피루베이트인 소정의 목적하는 단백질을 의미한다.
본원에서의 용어 "산화 반응"은, 2개의 시스테인 아미노산의 설프하이드릴 그룹이 디설파이드 결합을 형성하도록 유도하는 반응을 의미한다.
본원에서의 용어 "인터페론 알파"는, 표적 세포에 있어서 바이러스에 대한 내성을 가지게 하고, 세포 증식을 억제하며, MHC 제1형 항원의 발현을 조절하는, 자극에 반응하여 방출이 유도되는 단백질 부류를 의미한다. 이러한 단백질 부류에는, 인터페론 알파 2a[Roferon, 뉴저지주 너틀리 소재의 호프만 라-로슈(Hoffman La-Roche) 제조원], 인터페론 알파 2b[Intron, 뉴저지주 메디슨 소재의 쉐링-플라우(Schering-Plough) 제조원], 인터페론 알파 2c[Berofor Alpha, 독일 잉겔하임 소재의 베링거 인겔하임(Boehringer Ingelheim) 제조원], 또는 천연 인터페론 알파의 컨센서스 서열을 측정함으로써 정의되는 컨센서스 인터페론[(Infergen, 캘리포니아주 싸우전드 옥스 소재의 암젠(Amgen) 제조원]이 포함되며, 이에 한정되는 것은 아니다.
발명의 상세한 설명
본 발명은, 단백질을 분리 및 정제하는 방법에 관한 것이다. 본 발명의 한 양태에서, 본 발명은 단백질 부가 이소형을 확인 및 정제하는 방법을 제공한다. 본 발명의 다른 양태에서는, 부가 이소형으로부터 목적하는 단백질을 제조하는 방법을 제공한다. 또 다른 양태에서는, 목적하는 단백질 및 부가 이소형을 함께 정제한 후, 부가 이소형을 목적하는 단백질로 변환시킴으로써, 고도로 정제된 목적하는 단백질을 제공한다. 이러한 방법으로, 부가 이소형의 양을 감소시키고, 목적하는 단백질의 전체 수율을 증가시키고/증가시키거나, 예전에 비해 더 고도로 정제시킨다. 목적하는 단백질의 수율은, 부가 이소형을 변환시키지 않은 경우의 수율보다 10배 증가될 수 있다.
본 발명은 목적하는 단백질 또는 이소형의 공급원에 의해 제한되지 않으며, 본 발명의 한 양태에서는, 상기 공급원이 재조합 기술을 이용하여 작제된 미생물이다. 당업자에게 알려져 있는 상기한 재조합 기술에는 여러 가지가 있다. 상기한 형질전환된 미생물은, 진핵 또는 원핵 세포, 세균, 포유동물의 세포 등일 수 있다. 예를 들면, 와이스만(Weissman)의 미국 특허 제4,530,901호의 교시 또는 유럽특허원 공개번호 제EP032,134호에 기재된 기술을 이용하여, 세균 내에서 인터페론 알파를 생산할 수 있다.
이와 유사하게, 본 발명은 상기한 생산 세포로부터 상기한 부가 이소형을 추출하는 특정의 방법에 의해 제한되지 않는다. 예를 들면, 상기한 목적하는 단백질이 인터페론 알파인 경우, 레이보비츠(Leibowitz) 등의 미국 특허 제4,315,852호 및 제4,364,863호에 기재된 방법을 사용하는 것이 적합하다.
이와 유사하게, 본 발명은 상기한 부가 이소형 또는 목적하는 단백질을 분리하는 데에 사용되는 특정의 정제 기술에 의해 제한되지 않는다. 당업자에게 알려져 있는 여러 가지의 크로마토그래피 및 기타의 분리 기술들이 사용될 수 있다.
본 발명은 상기한 부가 이소형을 확인하는 방법에 의해 제한되지 않으나, 목적하는 단백질의 분자량 및 목적하는 단백질 보다 분자량이 큰 오염 물질을 연구하여 부가 이소형을 확인할 수 있다. 이러한 방법 중의 하나가 로제(Rose) 등의 문헌[참조: J.Biol.Chem.267:19101(1992)]에 기재되어 있다. 목적하는 단백질 보다 분자량이 큰 오염 물질을 분해 조건(예를 들면, 매우 강한 산성 또는 매우 강한 염기성 pH)에 노출시켜 분해 산물을 분석할 수 있다. 이러한 분해 산물 중 하나의 질량 및/또는 구조상 특성이 목적하는 단백질의 것과 동일한 경우, 상기 오염 물질은 절단가능한 그룹을 갖는 부가 이소형으로 간주될 수 있다.
본 발명은 부가 이소형을 목적하는 단백질로 변환시키는 특정의 방법에 의해 제한되지 않으나, 본 발명의 한 양태에서는, 스크리닝 방법으로 적합한 변환 조건을 결정할 수 있다. 예를 들면, 상기한 절단가능한 그룹이 부가 이소형으로부터 제거되지만 기능성의 또는 가역적으로 변성된 목적하는 단백질이 생성되는 pH로 반응 용액의 pH를 단계적으로 조정하는 공정을 포함한다.
또한, 본 발명은, 절단가능한 그룹을 화학적으로 제거하는 방법에 의해 제한되지 않는다. 본 발명의 한 양태에서는, 상기한 절단가능한 그룹이, 부가 이소형을 산성 조건(예를 들면, 아세트산을 사용)에 노출시킴으로써 제거 또는 절단된다. 본 발명의 다른 양태에서는, 상기한 부가 이소형을 아연에 노출시킨다.
또한, 본 발명은 상기한 제거 반응이 진행되는 온도에 의해 제한되지 않는다. 하지만, 일반적으로, 반응 온도가 높을 수록, 부가 이소형이 목적하는 단백질로 변환되는 속도가 빠르다.
소정의 절단가능한 그룹을 화학적으로 제거함으로써 목적하는 단백질과 구조상 특성이 동일한 단백질을 생성할 수 있으나, 때때로 환원된 설프하이드릴 그룹 (sulfhydryl group)을 산화시켜 디설파이드 결합을 형성하도록 할 필요가 있다. 이로 인해, 접힘(folding) 상태가 적합하고 기능을 나타내는 단백질이 제조된다. 설프하이드릴 그룹을 산화시키는 방법은 당해 분야에 이미 공지되어 있으며, 본 발명은 특정의 산화 방법에 의해 제한되지 않는다.
본 발명의 한 양태에서는, 산화 공정 동안에 메티오닌 그룹을 보호하여 메티오닌 설폭사이드가 형성되는 것을 방지하는 단계를 포함한다. 메티오닌 그룹을 보호하는 방법은 이미 공지되어 있으며, 본 발명은 메티오닌 그룹을 보호하는 특정의 방법에 의해 제한되지 않는다. 하지만, 상기한 방법에서는, 람(Lam) 등의 문헌[참조: J. Pharm. Sci. 86:1250(1997)] 및 다크루리(Takruri)의 미국 특허 제5,272,135호에 기재된 바와 같이, 항-산화제의 사용을 포함한다.
또한, 본 발명은 산화 반응을 수행하는 방법에 의해 제한되지 않는다. 예를 들면, 본 발명의 한 양태에서는, 절단가능한 그룹을 제거한 후에 설프하이드릴 그룹을 산화시키는 것을 포함한다. 본 발명의 다른 양태에서는, 동일한 반응 조건하에서 절단가능한 그룹의 제거 및 설프하이드릴 그룹의 산화 반응을 수행하는 것을 포함한다.
이와 유사하게, 절단가능한 그룹의 화학적 제거 및 상기 단백질의 산화 반응이 동일한 반응 조건하에서 수행되는 경우, 본 발명은 부가 이소형으로부터 절단가능한 그룹을 제거시키고 산화시키는 특정의 방법에 의해 제한되지 않는다. 하지만, 본 발명의 한 양태에서는, 절단가능한 그룹을 화학적으로 제거하기에 가장 최적의 조건을 결정하기 위해, 스크리닝 공정을 수행한다. 예를 들면, 소정의 범위의 pH 조건을 사용하는 실험을 수행할 수 있으며, 이렇게 수득한 적합한 구조체를 갖는(즉, 비가역적으로 변성된 것이 아닌) 목적하는 단백질의 양 및/또는 제거가능한 그룹의 양을 측정할 수 있다. 일반적으로, 반응 pH에 대한 적합한 구조체를 갖는 목적하는 단백질 양을 나타내는 도표는 종형 곡선(bell curve)이 되는 데, 이러한 종형 곡선에서의 최고점은 절단가능한 그룹을 화학적으로 제거하기에 가장 이상적인 pH를 나타낸다. 상기한 양태에 있어서, 유사한 스크리닝 방법을 사용하여 상기 산화 반응을 수행할 수 있다. 상기한 화학적인 제거 반응 및 산화 반응의 종형 곡선이 교차하는 경우, 이러한 교차점은 동일한 반응에서 절단가능한 그룹의 제거 및 설프하이드릴 그룹의 산화를 위한 최적 pH를 나타낸다. 인터페론 알파의 피루베이트 부가 이소형의 화학적 제거 및 산화 반응에 있어서, 상기 2개의 곡선은 pH 5 부근에서 교차하는 데, 이는 최적 pH인 대략 pH 5에서 복합 반응이 수행됨을 의미한다. 평가될 수 있는 다른 반응 조건으로는, 염 농도, 온도 등이 포함되며, 이에 한정되는 것은 아니다.
부가 이소형을 목적하는 단백질로 변환시킨 후, 오염 물질로부터 목적하는 단백질을 정제하기 위해서는 추가의 크로마토그래피 단계가 필요할 수 있다.
목적하는 단백질이 적합하게 정제된 후, 필요한 경우, 치료학적 용도에 적합한 형태로 전환할 수 있다. 예를 들면, 목적하는 단백질이 인터페론 알파인 경우, 콴(Kwan)의 미국 특허 제4,847,079호 및 제4,496,537호와 옌(Yuen) 등의 미국 특허 제5,766,582호에 기재되어 있는 제형이 적합하다. 이와 달리, 약제학적으로 허용가능한 기타의 불활성 담체는 고체 또는 액체일 수 있다. 고형 제제로는 산제, 정제, 분산 과립제, 캡슐제, 캐쉬제(cachet) 및 좌제가 포함된다. 상기한 산제 및 정제는, 목적하는 단백질 약 5 내지 약 95%를 포함할 수 있다. 당해 분야에 공지되어 있는 적합한 고형 담체는, 예를 들면, 탄산 마그네슘, 스테아르산 마그네슘, 탈크, 당 또는 락토스이다. 정제, 산제, 캐쉬제 및 캡슐제는, 경구 투여에 적합한 고형 용량형으로 사용될 수 있다.
좌제를 제조하기 위해, 저온 용융 왁스(예를 들면, 코코아 버터와 같은 지방산 글리세라이드의 혼합물)를 우선 용융시킨 후, 교반하면서 상기 왁스 내에 상기 활성 성분을 균질 분산시킨다. 당해 균질 용융 혼합물은 간편한 크기의 주형에 부은 후, 식혀서 고형화시킨다.
액형 제제에는, 액제, 현탁제 및 유제가 포함된다. 예를 들면, 비경구 주사용 물 또는 물 프로필렌 글리콜 용액이 포함되며, 경구용 액제, 현탁제 및 유제에 감미제 및 유백화제가 첨가된다. 또한, 액형 제제는 비강내 투여용 용액을 포함할 수 있다.
흡입용으로 적합한 에어로졸 제제에는, 약제학적으로 허용가능한 담체(예를 들면, 불활성 압착 가스)와 함께 사용될 수 있는 분말형 고체 및 용액이 포함될 수 있다.
또한, 본 발명은 경피 투여가 가능하다. 경피 조성물은, 크림형, 로션형, 에어로졸형 및/또는 유액 형태를 가질 수 있으며, 통상적으로 사용되는 매트릭스 또는 저장형의 경피 패치내에 포함될 수 있다.
단위 투여용 제제내의 활성 화합물의 양은, 약 0.01mg 내지 약 1000mg, 바람직하게는 약 0.01mg 내지 약 750mg로 조정될 수 있다. 이와 달리, 상기 활성 화합물은 국제 단위(international unit)로 제조할 수 있으며, 바람직한 용량은 3×106 내지 50×106 국제 단위이다. 상기 양태에 있어서, 3×106 , 5×106 , 18×106 , 25 ×106 및 50 ×106 단위 용량 형태가 고려될 수 있다.
또한, 사용하기 직전에 경구 투여용, 국부 투여용 또는 비경구 투여용의 액형 제제로 변환시키는 고형 제제도 포함된다.
하기의 실시예는 본 발명의 특정의 바람직한 양태를 설명하기 위한 것이며, 본 발명의 측면이 이의 영역으로 한정되는 것으로서 고려되지는 않는다.
실시예 1: 피루베이트 부가 이소형의 변환을 위한 스크리닝 공정
단백질의 N 말단 아미노산 잔기의 알파-아미노 그룹이 피루베이트의 카보닐 그룹과 축합되어 있는, 피루베이트 부가 이소형은 내부 세포에서 형성될 수 있다. 상기한 피루베이트가 단백질의 구조(conformation)를 방해하는 경우, 이러한 피루베이트-단백질 부가 이소형이 가수분해될 때(단백질로부터 피루베이트가 제거될 때)에만, 열역학적으로 우호적인 구조 변화를 통해서 상기 단백질은 목적하는 형태로 자유롭게 재접힘(refolding)될 수 있다. 목적하는 단백질이 디설파이드 결합(disulfide bond)을 가지는 경우, 목적하는 형태로의 재접힘의 일환으로서, 상기한 피루베이트의 제거로 생성되는 환원된 이소형을 산화시켜야 한다.
하기의 공정에서는, 단백질의 피루베이트 부가 이소형을 목적하는 형태로 변환시키기에 최적의 조건을 결정하는 방법을 설명하고 있다. 앞에서 기술한 바와 같이, 목적하는 단백질이 디설파이드 결합을 가지지 않는 경우, 단지 피루베이트의 제거(가수분해)를 최대로 하기 위한 스크리닝이 필요하다. 반면, 목적하는 단백질이 디설파이드 결합을 가지는 경우, 피루베이트의 제거(가수분해) 뿐만 아니라 디설파이드 결합의 형성(산화)을 최대로 하기 위한 스크리닝이 필요하다.
(1) 피루베이트의 분석
피루베이트 분석은, 피루베이트-절단 역학을 이해하기 위해 가수분해의 정도를 모니터링하기 위해 필요하다. 예를 들면, "유리(free) 피루베이트"는, 화학적 변형 방법 또는 효소 방법을 사용하여 정량적으로 분석할 수 있다. 2,4-디니트로페닐히드라진(DNPH)는, 피루베이트를 유도하는 데에 사용할 수 있다. 적합한 MWCO 막(예를 들면, 10K 막)을 사용하여 단백질의 피루베이트 부가 이소형을 제거하기 위해, 분석 표본을 초여과(ultrafilter)시켜야 한다. 유리 피루베이트와 반응하는 DNPH와 함께 여과물을 산성 pH에서 항온처리시킨다. DNPH-유도된 피루베이트인, 2,4-디니트로페닐히드라존은, 뉴클레오실 C8(5㎛) 칼럼과 같은 C8 칼럼을 사용하여 RP-HPLC 상에서 용이하게 분석할 수 있다.
상기한 유도체화 반응은 화학양론적(stoichiometric) 반응이므로, 피루베이트를 정량적으로 측정할 수 있다. 효소 킷트(예를 들면, 락테이트 데하이드로게나제/NADH)를 사용하여 피루베이트를 측정할 수도 있다. 이 방법은 표본 초여과를 필요로 하지 않는 데, 그 이유는 이 방법에서 사용하는 온화한 조건(mild condition)으로 인해 항온처리 동안에 피루베이트-단백질 부가 이소형으로부터 피루베이트가 제거되지 않기 때문이다.
단백질에 결합된 피루베이트 및 자유 피루베이트의 조합 양을 측정하기 위해, 상기 유도체화 반응 이전에 모든 결합된 피루베이트를 제거해야 한다. 상기한 DNPH 유도체화 방법은 산성이 매우 강한 pH 및 상대적으로 오랜 동안의 항온처리 시간을 필요로 하기 때문에, 피루베이트는 항온처리 동안에 제거될 수 있고 후속적으로 DNPH를 사용하여 유도체화시킬 수 있다. 따라서, 표본내의 유리 피루베이트 및 결합된 피루베이트의 조합 양을 측정하기 위해, 상기한 DNPH 유도체화 방법에서 초여과시키지 않고 표본을 사용하여야 한다.
(2) 이소형의 분석
디설파이드 결합을 가지는 단백질의 경우에는 적어도 3 종류의 이소형이 존재하고, 디설파이드 결합을 가지지 않는 단백질의 경우에는 2 종류의 이소형이 존재한다. 일반적으로, 목적하는 단백질 및 이의 환원된 형태는 RP-HPLC로 용이하게 분해될 수 있다.
디설파이드 결합을 가지는 단백질의 경우, 3 종류의 이소형(부가 이소형, 환원된 단백질, 및 목적하는 단백질)를 RP-HPLC 상에서 정량적으로 분석할 수 있다면, 매우 효과적으로 스크리닝할 수 있다. 상기한 피루베이트 분석을 반드시 할 필요가 없으며, (만약 존재한다면) 어느 단계가 반응 속도 조절 단계(rate-limiting step)인 지를 확인할 수 있다. 하지만, 대개, 단백질의 피루베이트 부가 이소형을 환원된 형태로부터 분해시키는 것은 어렵다. 이러한 경우, 각 변환 단계를 최적화하기 위해서, 피루베이트 분석이 필수적이다.
(3) 이소형 조성물의 측정
목적하는 형태의 단백질이 디설파이드 결합을 가지지 않는 경우, RP-HPLC 상에서 단백질의 피루베이트 부가 이소형이 목적하는 형태로부터 용이하게 분해될 수 있기 때문에, 이소형 조성물은 어려움 없이 측정할 수 있다.
목적하는 형태의 단백질이 디설파이드 결합을 갖고 단백질의 부가 이소형이 환원된 형태로부터 분리될 수 없는 경우, 이소형 조성물을 측정하기 위해 단백질에 결합된 피루베이트를 측정하여야 한다. 단백질의 부가 이소형의 양을 나타내는, 단백질에 결합된 피루베이트의 몰량(molar amount)은, 유리 피루베이트 및 결합된 피루베이트의 조합 양에서 유리 피루베이트의 양을 뺀 양이다. 이는, 상기한 DNPH 방법에서 초여과를 한 표본과 초여과를 하지 않은 표본을 사용하여 측정할 수 있다. 이 때, 환원된 형태의 양은, RP-HPLC에 의해 측정된 단백질의 부가 이소형 및 환원된 형태의 복합양과 피루베이트 분석에 의해 측정된 단백질에 결합된 피루베이트의 양의 차이값이다. 이 때, 이소형 조성물을 계산할 수 있다.
(4) 최적 조건의 스크리닝
부가 이소형의 목적하는 형태로의 특이적 변환율을 최대로 하기 위해서, 목적하는 형태의 단백질이 디설파이드 결합을 가지든지 가지지 않든지 상관없이, 스크리닝 기준은 동일해야 한다.
- 4.1. 목적하는 단백질이 디설파이드 결합을 가지고 있지 않는 경우
이 경우, 피루베이트가 단백질의 피루베이트 부가 이소형으로부터 절단됨에 따라, 목적하는 단백질이 형성된다. 상기 부가 이소형이 목적하는 형태로 변환되는 1 단계(가수분해 단계)만이 관여하기 때문에, 피루베이트 분석을 통해 피루베이트 절단 공정을 모니터링할 필요가 없다. 예를 들면, RP-HPLC 상에서 상기 부가 이소형의 제거 및 목적하는 형태의 형성 모두를 모니터링하는 것으로 충분하다. 부가 이소형을 목적하는 단백질로 변환시키는 것을 최대화하는 항온처리 조건을 찾을 필요가 있다.
제1 단계는, 스크리닝 공정에 사용되는 단백질의 부가 이소형의 농도의 실시 범위에 대한 반응 역학을 검토하는 것이다. 이러한 반응 역학이 상기 부가 이소형의 농도에 대해 1차 반응인 경우, 상기 표본의 농도는 반응 역학에 영향을 끼치지 않으며, 스크리닝 또는 파라미터 평가시에 어떠한 농도도 사용할 수 있다. 그렇지 않은 경우, 스크리닝 동안에 상기 표본 농도를 일정하게 유지시켜야 한다.
상기한 가수분해 단계에 영향을 끼치는 파라미터는 여러 가지일 수 있다. 주요 파라미터로는, pH, 온도, 금속 이온(예를 들면, 아연, 제2철, 제1철, Cu, Mg 등), 전도성, 완충액(buffer), 빛 및 교반이 있다. 부가 이소형이 목적하는 형태로 변환하는 데에 미치는 항온처리 파라미터의 영향을 측정함으로써, 각 파라미터를 최적화할 수 있다. 예를 들면, 단백질의 피루베이트 부가 이소형을 함유하는 표본을 일부 분취량(aliquot) 취하여, 충분한 범위의 상이한 pH에서 (기타의 다른 모든 파라미터는 각각 최적의 추정치로 함) 항온처리시킨다. 각각의 분취량의 표본에서의 변환 반응은, 소정의 항온처리 기간(예를 들면, 밤새) 항온처리시킨 후에 측정한다. 가장 변환율이 높은 pH를 최적 pH로 정한다. 상기 실험을 반복하여, 다른 파라미터들도 최적화하고, 상기 최적 추정치(best-guessed value) 대신에 최적화된 파라미터의 최적치를 사용한다. 이것이 대표적인 최적화 기술이다.
상기한 항온처리 pH는 상기한 가수분해율에 영향을 끼친다. 일반적으로, 낮은 pH를 사용하면 가수분해가 더 많이 된다. 또한, 온도가 높을 수록 가수분해가 더 많이 된다. 그러나, 부가 이소형 또는 목적하는 단백질이 비가역적으로 침전하거나, 목적하는 단백질이 비가역적으로 변성되는 경우, 산성이 매우 큰 pH(예를 들면, pH 2)에서는 가수분해가 되지 않을 수 있다. 몇몇 금속 양이온이 존재하면 가수분해를 촉매할 수 있다. 소정의 금속 양이온이 피루베이트 제거를 촉매한다 하더라도, 이러한 촉매 반응은 금속 양이온의 농도에 크게 의존한다. 따라서, 금속 양이온이 스크리닝될 때, 광범위한 범위의 금속 양이온의 농도가 사용되어야 한다.
또한, 파라미터 간에 상호 작용이 존재할 수 있다. 예를 들면, 금속 양이온이 상기 변환 공정에 영향을 미치는 경우, 일부 금속 이온의 존재 여부에 따라 최적 pH가 달라진다. 피루베이트 부가 이소형의 경우, Zn 양이온이 존재하면 피루베이트 제거를 위한 최적 pH가 달라진다(pH 7.8 내지 8.6). 따라서, 새로운 파라미터를 진정으로 최적화시키기 위해서는, 최적화할 새로운 파라미터 뿐만 아니라 기타의 중요한 다른 파라미터 또한 동시에 변화시킬 필요가 있다.
- 4.2. 목적하는 단백질이 디설파이드 결합을 가지고 있는 경우
2 단계의 변환 공정에서, 가수분해를 통해 상기한 부가 이소형으로부터 환원된 형태가 제거된 후, 산화 반응을 통해 목적하는 형태로 변환된다.
이상적으로는, 단백질의 부가 이소형 및 환원된 형태를 분리시킨 후, 디설파이드 결합을 가지지 않는 단백질에 대한 상술한 공정을 각각의 부가 이소형 및 환원형에 적용시켜 각 단계를 최적화한다. 주요 차이점은, 상기한 파라미터 이외에 산소 이동 및 산화된 글루타티온 (GS-SG)과 같은 일부의 산화가 상기한 산화 단계를 최적화시킬 수 있다는 점이다. GS-SG가 환원된 형태만을 산화시키는 경우, 산화 단계(또는, 디설파이드 결합 형성 단계)를 크게 강화시킬 수 있다. 하지만, GS-SG가 부가 이소형을 산화시키고 이렇게 산화된 부가 이소형이 용이하게 가수분해되지 않는 경우, 수율(또는 변환율)이 낮게 될 것이다.
각각의 최적 조건으로부터, 부가 이소형이 목적하는 형태로 변환되는 최적 조건이 측정될 수 있다. 중간 조건(intermediate condition)이 최적 조건에 상당히 근접한 경우, 이를 최적 조건으로 정한다. 이론적으로는, 표본내에서 단백질의 피루베이트 부가 이소형: 환원 형태의 최초 비율에 따라, 최적 조건이 상이할 수 있다. 예를 들면, 환원된 형태가 절대적으로 다수인 때와 부가 이소형이 절대적인 다수인 때의 최적 조건은 상이하다. 따라서, 가수분해 및 산화 단계에서의 개개의 최적 조건으로부터 최적 조건을 평가할 때, 표본 조성물을 고려해야 한다는 점을 명심해야 한다.
마지막으로, 상기한 변환 최적 조건은 실험적으로 확인된다. 흔히, (만약 존재한다면) 반응 속도 조절 단계(rate-limiting step)를 확인하는 것이 변환 최적 조건을 미세 조정(fine-tuning)하는 데에 유용하다. 항온처리 시간이 경과함에 따라 환원된 형태가 지속적으로 축적이 된다는 것은, 산화 단계가 반응 속도 조절 단계라는 것을 나타낸다. 축적이 발생하면, 산화에 보다 우호적인 조건들(예를 들면, 산소, 높은 pH, 높은 온도)을 적용하여 목적하는 형태의 형성을 최대화하여야 한다. 목적하는 형태의 형성률이 매우 크지만 낮은 수준의 환원된 단백질이 항상 존재하는 경우, 제거 단계가 반응 속도 조절 단계이다. 이러한 경우, 상기한 제거 단계가 향상되도록 항온처리 조건을 변화시켜 목적하는 형태의 단백질 형성을 최대화할 수 있다.
마지막으로, 상기한 변환 최적 조건은 실험적으로 확인된다. 흔히, (만약 존재한다면) 반응 속도 조절 단계(rate-limiting step)를 확인하는 것이 변환 최적 조건을 미세 조정(fine-tuning)하는 데에 유용하다. 항온처리 시간이 경과함에 따라 환원된 형태가 지속적으로 축적이 된다는 것은, 산화 단계가 반응 속도 조절 단계라는 것을 나타낸다. 축적이 발생하면, 산화에 보다 우호적인 조건들(예를 들면, 산소, 높은 pH, 높은 온도)을 적용하여 목적하는 형태의 형성을 최대화하여야 한다. 목적하는 형태의 형성률이 매우 크지만 낮은 수준의 환원된 단백질이 항상 존재하는 경우, 제거 단계가 반응 속도 조절 단계이다. 이러한 경우, 상기한 제거 단계가 향상되도록 항온처리 조건을 변화시켜 목적하는 형태의 단백질 형성을 최대화할 수 있다.
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절단가능한 그룹의 화학적 제거 단계 및 단백질의 산화 단계를 위한 최적 조건이 크게 차이가 나는 경우, 단계별로 최적 조건을 적용할 수 있다. 예를 들면, 상기 가수분해 단계에 대한 최적 조건을 먼저 적용한 후, 가수분해 단계가 거의 종료할 때에 상기 산화 단계에 대한 최적 조건을 적용한다.
각각의 이소형을 분리하는 것이 불가능한 경우, 특히 상기한 2 종류의 이소형이 RP-HPLC 상에서 분해될 수 없는 경우, 피루베이트 분석은 필수적이다. 피루베이트의 방출을 모니터링함으로써, 상기 가수분해 단계를 우선 최적화할 수 있다. 제1 단계가 거의 끝날 때 또는 매우 느리게 진행될 때, 제2 단계를 최적화한다. 이러한 최적화 조건들로부터, 전체적인 변환 최적 조건을 평가하고 실험적으로 확인한다. 이에 대한 대안적인 방법은, 상기 가수분해 단계가 최적화된 후에 전체적인 변환 공정을 최적화하는 것이다. 특히, 이 방법은, 대규모 및 지속적으로 부가 이소형이 가수분해됨으로써 발생하는 간섭(interference)에 의해 제2 단계를 최적화하는 것이 어려울 때에 보다 실용적일 수 있다. 상술한 바와 같이, pH, 온도, 산소 이동, 금속 양이온 및 산화제가 최적화하는 데에 중요한 파라미터이다.
상기한 1단계-변환 공정에서 보다 2단계-변환 공정에서 파라미터들 간의 상호 작용이 더 중요하다.
상기한 최적 조건-파라미터가 목적하는 형태에 영향을 미치지 않도록, 목적하는 형태를 정제하고 나서, 이의 특성(특정 생물학적 활성 및 순도를 포함)을 완전히 검사해야 한다.
실시예 2: 피루베이트 부가 이소형의 인터페론 알파 2b로의 변환
승온(30 내지 37℃) 및 반응 pH 5.2 내지 5.6에서, 피루베이트의 제거 및 디설파이드 결합의 형성 반응을 수행한다. 상기 반응 조건은, 상기한 두 반응을 동일한 반응 조건하에서 순차적으로 발생시켜 생물 활성 단백질을 회수한다는 점에 서, 유일하다.
상기한 단백질 분리 크로마토그래피로부터 용출되는 단백질 UV-흡광도의 피크를 함유하는 분획을 함께 혼주(pool)한 후, 멸균을 위해 0.45μM 여과시킨다.
단백질 혼주물 1L 당 메티오닌 3g을 단백질 혼주물에 첨가한 후, 용해될 때까지 교반한다. 희석시킨 수산화나트륨을 사용하여 단백질 혼주물의 pH를 5.2 내지 5.6으로 조절한다. 염화나트륨의 농도는 조정하지 않으며, 150 내지 200mM의 NaCl이다.
10mM 아세테이트(pH 5.5), 200mM 메티오닌 및 200mM 염화나트륨으로 이루어진 원료 용액(stock solution)을 상기 단백질 혼주물에 첨가하여, 최종 메티오닌 농도가 20mM이 되도록 한다.
상기 단백질 혼주물을 반응 용기에 옮긴 후, 지속적으로 교반하면서 상기한 반응 온도를 37℃로 증가시킨다. 상기 단백질 혼주물을 36 내지 38℃에서 24 내지 30시간 동안 항온처리시킨다.
24 내지 30시간 경과 후, 상기 반응 혼합물을 심층 여과기(depth filter)로 여과시킨 후, 0.45μM 여과기로 여과하여, 침전물을 제거한다. 그리고 나서, 상기 단백질 혼주물을 농축시킨 후, 2 내지 10℃에서 10mM 아세테이트(pH 5.5)에 대해 디아필터(diafilter)시킨다.
실시예 3: 아연을 사용한, 피루베이트 부가 이소형의 인터페론 알파 2b로의 변환
34℃ 및 pH 8.2에서 Zn (1M)을 함께 사용하여, 피루베이트 부가 이소형을 인터페론 알파 2b로 변환시킨다. 상기 반응 용액을 반응이 일어나는 동안에 교반시킨다. 약 80%가 변환되면, 상기 반응 용액의 온도를 4℃로 떨어뜨려서 반응을 종결시킨다.
용액 제조: 1M 트리스 완충액 - 4℃로 유지, 1M 트리스 염기 + HCl (pH 8.3); 1mM Zn 용액 - 4℃로 유지, 1mM ZnSO4H2O + 10mM 아세트산 나트륨 + 175mM 염화나트륨 (pH 5.5).
상기한 단백질 정제 크로마토그래피로부터 용출되는 UV-흡광도의 피크를 함유하는 분획을 함께 혼주한 후, 멸균을위해 0.2μM 여과시킨다. 1M 트리스 완충액 약 0.083(V/V)를 천천히 단백질 혼주물(통상적인 단백질 혼주물의 pH는 5.2 내지 5.5의 범위이다)에 첨가하고 이를 교반하여 pH가 약 8.2가 되도록 한다.
교반하면서, 상기 1mM Zn 용액을 상기 염기성 단백질 혼주물에 천천히 첨가하여, Zn 양이온 : 전체 피루베이트 부가 이소형의 몰비가 0.6:1.0이 되도록 한다. 예를 들면, 피루베이트 부가 이소형의 농도가 1.0mg/ml인 경우, Zn 30μM 또는 1mM Zn 용액 0.03(V/V)가 필요하다. 새로이 제조한 Zn 양이온 용액을 사용한다.
교반하면서, 반응기 속에서 상기 반응 용액을 34℃로 가열한다. 전체 반응 기간 동안에 반응 온도를 34℃로 조절한다. 또한, 상기 반응 용액 속에서 혼합시키는 것으로 충분하지만 거품이 발생하지 않을 정도로, 지속적인 교반이 필요하다. 산소가 반응 용액내로 이동될 수 있도록, 반응기 속에서 어느 정도 환기가 허용되어야 한다. 반면, 반응기 속에 상기 반응 용액이 거의 반 정도가 차게 되면, 상기한 환기는 필요없다. 상기 반응 동안, RP-HPLC를 사용하여 변환시킨 후에 반응 표본을 취득할 수 있다. 상기 반응이 종료하면, 온도를 4℃로 떨어뜨려서 후속하는 크로마토그래피 단계를 준비한다.
상술한 바와 같이, 본 발명에서는 목적하지 않는 단백질의 이소형을 확인하여 이를 목적하는 단백질로 변환시켜, 목적하는 단백질의 전체 수율 및 순도를 향상시키는 방법을 제공한다.
Claims (44)
- 인터페론 알파의 피루베이트 부가 이소형(pyruvate adjunct isoform)을, (1) pH가 5.0 이상인 산성 용액에 노출시키거나, 또는 (2) 아연 양이온을 함유하는 염기성 용액에 노출시킴으로써, 인터페론 알파의 피루베이트 부가 이소형을 인터페론 알파로 변환시키는 단계를 포함하여, 인터페론 알파 조성물의 수율을 증가시키는 방법.
- 제1항에 있어서, 인터페론 알파가 인터페론 알파 2b인 방법.
- 제2항에 있어서, 산성 용액의 pH가 5.2 내지 5.6인 방법.
- 제3항에 있어서, 산성 용액의 온도가 30 내지 37℃인 방법.
- 제1항 내지 제3항 중의 어느 한 항에 있어서, 산성 용액의 pH가 5.5인 방법.
- 제5항에 있어서, 산성 용액의 온도가 34 내지 40℃인 방법.
- 제3항에 있어서, 인터페론 알파의 피루베이트 부가 이소형이 산성 용액에 24 내지 30시간 동안 노출되는 방법.
- 제1항 내지 제4항 중의 어느 한 항에 있어서, 산성 용액이 항산화제를 추가로 포함하는 방법.
- 제8항에 있어서, 항산화제가 메티오닌을 포함하는 방법.
- 제9항에 있어서, 메티오닌의 농도가 5 내지 40mM인 방법.
- 제10항에 있어서, 메티오닌 농도가 20mM인 방법.
- 제1항 또는 제2항에 있어서, 염기성 용액의 pH가 7.8 내지 8.6인 방법.
- 제12항에 있어서, 염기성 용액의 온도가 30 내지 38℃인 방법.
- 제12항에 있어서, 인터페론 알파가 인터페론 알파 2b이고, 염기성 용액의 pH가 8.2이며 온도가 34℃인 방법.
- 제14항에 있어서, 염기성 용액 중 아연 이온 대 이소형의 비가 0.6 대 1.0인 방법.
- 제15항에 있어서, 이소형의 80%가 인터페론 알파 2b로 변환될 때까지 당해 이소형을 염기성 용액에 노출시키는 방법.
- 제12항에 있어서, 염기성 용액이 항산화제를 추가로 포함하는 방법.
- 제17항에 있어서, 항산화제가 메티오닌을 포함하는 방법.
- 제18항에 있어서, 메티오닌의 농도가 5 내지 40mM인 방법.
- 제2항 내지 제4항 중의 어느 한 항에 있어서, 크로마토그래피를 사용하여 인터페론 알파 2b를 정제하는 단계를 추가로 포함하는 방법.
- 제20항에 있어서, 크로마토그래피 방법이, 아가로즈계 염료 친화성 크로마토그래피(agarose-based dye affinity chromatography) 단계, 아가로즈계 음이온 교환 크로마토그래피(agarose-based anion exchange chromatography) 단계, 및 결정화 단계를 순차적으로 포함하는 방법.
- 제5항에 있어서, 산성 용액이 항산화제를 추가로 포함하는 방법.
- 제6항에 있어서, 산성 용액이 항산화제를 추가로 포함하는 방법.
- 제13항에 있어서, 인터페론 알파가 인터페론 알파 2b이고, 염기성 용액의 pH가 8.2이며 온도가 34℃인 방법.
- 제13항에 있어서, 염기성 용액이 항산화제를 추가로 포함하는 방법.
- 제5항에 있어서, 크로마토그래피를 사용하여 인터페론 알파 2b를 정제하는 단계를 추가로 포함하는 방법.
- 제6항에 있어서, 크로마토그래피를 사용하여 인터페론 알파 2b를 정제하는 단계를 추가로 포함하는 방법.
- 제8항에 있어서, 크로마토그래피를 사용하여 인터페론 알파 2b를 정제하는 단계를 추가로 포함하는 방법.
- 제9항에 있어서, 크로마토그래피를 사용하여 인터페론 알파 2b를 정제하는 단계를 추가로 포함하는 방법.
- 제12항에 있어서, 크로마토그래피를 사용하여 인터페론 알파 2b를 정제하는 단계를 추가로 포함하는 방법.
- 제13항에 있어서, 크로마토그래피를 사용하여 인터페론 알파 2b를 정제하는 단계를 추가로 포함하는 방법.
- 제7항에 있어서, 산성 용액이 항산화제를 추가로 포함하는 방법.
- 제14항에 있어서, 염기성 용액이 항산화제를 추가로 포함하는 방법.
- 제15항에 있어서, 염기성 용액이 항산화제를 추가로 포함하는 방법.
- 제16항에 있어서, 염기성 용액이 항산화제를 추가로 포함하는 방법.
- 제7항에 있어서, 크로마토그래피를 사용하여 인터페론 알파 2b를 정제하는 단계를 추가로 포함하는 방법.
- 제10항에 있어서, 크로마토그래피를 사용하여 인터페론 알파 2b를 정제하는 단계를 추가로 포함하는 방법.
- 제11항에 있어서, 크로마토그래피를 사용하여 인터페론 알파 2b를 정제하는 단계를 추가로 포함하는 방법.
- 제14항에 있어서, 크로마토그래피를 사용하여 인터페론 알파 2b를 정제하는 단계를 추가로 포함하는 방법.
- 제15항에 있어서, 크로마토그래피를 사용하여 인터페론 알파 2b를 정제하는 단계를 추가로 포함하는 방법.
- 제16항에 있어서, 크로마토그래피를 사용하여 인터페론 알파 2b를 정제하는 단계를 추가로 포함하는 방법.
- 제17항에 있어서, 크로마토그래피를 사용하여 인터페론 알파 2b를 정제하는 단계를 추가로 포함하는 방법.
- 제18항에 있어서, 크로마토그래피를 사용하여 인터페론 알파 2b를 정제하는 단계를 추가로 포함하는 방법.
- 제19항에 있어서, 크로마토그래피를 사용하여 인터페론 알파 2b를 정제하는 단계를 추가로 포함하는 방법.
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Citations (1)
| Publication number | Priority date | Publication date | Assignee | Title |
|---|---|---|---|---|
| EP0553494A1 (en) * | 1991-12-31 | 1993-08-04 | Lucky Ltd. | Recombinant gene coding for human alpha interferon and expression vector thereof, ETC. |
Family Cites Families (13)
| Publication number | Priority date | Publication date | Assignee | Title |
|---|---|---|---|---|
| US4530901A (en) | 1980-01-08 | 1985-07-23 | Biogen N.V. | Recombinant DNA molecules and their use in producing human interferon-like polypeptides |
| CA1341567C (en) | 1980-01-08 | 2008-02-19 | Charles Weissmann | Dna sequences, recombinant dna molecules and processes for producing human interferon - like polypeptides |
| US4315852A (en) | 1980-11-26 | 1982-02-16 | Schering Corporation | Extraction of interferon from bacteria |
| US4364863A (en) * | 1980-12-29 | 1982-12-21 | Schering Corporation | Extraction of interferon from bacteria |
| EP0082481B2 (en) | 1981-12-23 | 1990-09-12 | Schering Corporation | Stabilised alpha-interferon formulations and their preparation |
| DE3515336C2 (de) * | 1985-04-27 | 1994-01-20 | Boehringer Ingelheim Int | Verfahren zur Herstellung und Reinigung von â-Interferon |
| US4847079A (en) | 1985-07-29 | 1989-07-11 | Schering Corporation | Biologically stable interferon compositions comprising thimerosal |
| US4732683A (en) | 1986-12-02 | 1988-03-22 | Biospectrum, Inc. | Purification method for alpha interferon |
| US4765903A (en) | 1987-10-06 | 1988-08-23 | Interferon Sciences, Inc. | Purification of monomeric interferon |
| US5272135A (en) | 1991-03-01 | 1993-12-21 | Chiron Ophthalmics, Inc. | Method for the stabilization of methionine-containing polypeptides |
| EP1104809A1 (en) * | 1994-04-09 | 2001-06-06 | F. Hoffmann-La Roche Ag | Process for producing alpha-interferon |
| US5766582A (en) | 1994-10-11 | 1998-06-16 | Schering Corporation | Stable, aqueous alfa interferon solution formulations |
| AR023906A1 (es) * | 1998-11-12 | 2002-09-04 | Schering Corp | MÉTODOS PARA AUMENTAR EL RENDIMIENTO DE UNA COMPOSICIoN INTERFERoN ALFA QUE COMPRENDE LA CONVERSIoN DE ISOFORMA ADJUNTA DEL PIRUVATO DEL INTERFERoN ALFA EN INTERFERoN ALFA. |
-
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Patent Citations (1)
| Publication number | Priority date | Publication date | Assignee | Title |
|---|---|---|---|---|
| EP0553494A1 (en) * | 1991-12-31 | 1993-08-04 | Lucky Ltd. | Recombinant gene coding for human alpha interferon and expression vector thereof, ETC. |
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| Quelle et al. | High-level expression and purification of a recombinant human erythropoietin produced using a baculovirus vector | |
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