CZ20011303A3 - Způsob zvýšení výtěžku prostředku obsahujícího interferon alfa - Google Patents

Description

ZPŮSOB ZVÝŠENÍ VÝTĚŽKU PROSTŘEDKU OBSAHUJÍCÍHO INTERFERON a

OBLAST TECHNIKY

Navrhovaný vynález popisuje izolaci a způsoby přečištění proteinů. Konkrétně navrhovaný vynález popisuje izolaci proteinů, izolaci izoforem proteinů a změn izoforem na požadovaný protein.

DOSAVADNÍ STAV TECHNIKY

Přirozeně se vyskytující proteiny jsou široce používány ve výzkumu v klinické praxi. Ačkoliv tyto proteiny je možné získat z přirozených zdrojů, rekombinantní techniky mohou umožnit přípravu těchto proteinů z nepřirozených zdrojů. Například pomocí fermentace mohou mikroorganizmy připravené rekombinantními technologiemi, jako jsou transformované bakterie, produkovat velká množství lidského interferonu za podstatně nižší cenu, než by bylo možné při jeho získávání z přirozených zdrojů. Tyto rekombinantní DNA techniky mohou být také použity pro přípravu dalších důležitých proteinů, jako je inzulín a tkáňový aktivátor plazminogenu. Bakterie upravené rekombinantními technikami avšak také produkují příměsi a strukturní izoformy proteinu, který má být připravován (viz. patent US 4765903, Andrea et al.), buněčnou drť a viry (viz. patent US 4 732 683, Georgidias et al.), izoformy s připojeným pyruvátem (Rose et al., J Biol Chem, 252:2998 (1977), Prome et al. J Biol Chem, 266:13 050 (1991), Stevens et al. J Biol Chem, 252:2 998 (1977) a Shapiro et al. J Biol Chem, 255:3 120 (1980)). Je žádoucí tyto kontaminace během přečištění proteinu odstranit.

Je jasné, že izoformy proteinu snižují čistotu připravovaného proteinu a proces odstranění izoforem snižuje celkový výnos. Pokud by bylo možné izoformy proteinů změnit na požadovaný protein, jejich odstraňování by nebylo nezbytné a celkový výtěžek proteinu by byl podstatně zvýšen. Proto je třeba znát způsob identifikace izoforem s připojenou strukturou proteinů a způsob jejich změny na požadovaný protein. Navrhovaný vynález je zaměřen k tomuto účelu.

PODSTATA VYNÁLEZU

Navrhovaný vynález popisuje přípravu vysoce čistých proteinů při velkých výtěžcích pomocí izolace izoforem s připojenou strukturou a jejich změny na požadovaný funkční protein. V jedné variantě navrhovaného vynálezu je popsán způsob zvýšení výtěžku prostředku obsahujícího interferon a představující změnu izoforem s připojenou strukturou na interferon a. Přesto, že ··· · · · ···· ···· · · · · · · ·

9 9 · ······· · · • · · ··· ··· ······ ·· · ·· · · · navrhovaný vynález se neomezuje pouze na interferon a, nej vhodnější variantou interferonu a je interferon a2b.

V jiné variantě navrhovaný vynález popisuje způsob změny rekombinantně připravené izoformy s připojenou strukturou na požadovaný protein zahrnující chemické odstranění štěpítelných skupin v izoformě s připojenou skupinou.

Navrhovaný vynález není omezen pouze na odstraňování štěpitelných skupin. V jedné variantě navrhovaného vynálezu jsou těmito štěpitelnými skupinami pyruváty.

Navrhovaný vynález také není omezen na techniky chemického odstraňování štěpitelných skupin. V jedné variantě navrhovaného vynálezu tento způsob zahrnuje vystavení izoforem s připojenou strukturou v roztoku kyseliny. Pokud je touto izoformou s připojenou skupinou izoforma interferonu a obsahující pyruvát, je nejvhodnější pH použité kyseliny okolo 5_S5. V této konkrétní variantě je dále vhodné, aby roztok kyseliny měl teplotu mezi 34 °C až 40 °C. V jiné konkrétní variantě je izoforma s připojenou strukturou vystavena roztoku zinku. V této variantě by pH roztoku zinku mělo být mezi 7,8 až 8,6. V další konkrétní variantě navrhovaného vynálezu by roztok zinku měl mít teplotu 30 °C až 38 °C.

Navrhovaný vynález také není omezen typem kyseliny nebo roztoku zinku, který je použit.

V nejvhodnější variantě navrhovaného vynálezu obsahuje roztok kyseliny nebo zinku antioxidant. V nejvhodnější variantě navrhovaného vynálezu antioxidant obsahuje methionin.

V této variantě je potom koncentrace methioninu 5 až 40 mM.

Jak je používán zde, termín „požadovaný protein“ popisuje protein, který má být přečištěn. Identifikace požadovaného proteinu je samozřejmě cílem purifikaěního procesu. Například během přečištění může být žádoucí získat skupinu nebo skupiny proteinů včetně příměsí v mezikroku purifikaěního procesu. Bez ohledu na zájem při získání skupiny proteinů v mezikroku, skupina proteinů, která je cílem purifikaěního postupu, je rovněž označována jako požadovaný protein.

Jak je používán zde, termín „izoforma s připojenou strukturou “ znamená izoformu proteinu, která má strukturní nebo funkční charakteristiku podobnou požadovanému proteinu, přičemž štěpitelná skupina může být odstraněna tak, aby vznikl požadovaný protein. Termínem „štěpitelná skupina“ je rozuměna chemická skupina navázaná na požadovaný protein, která může být chemicky odstraněna. „Chemické odstranění“ nebo „chemicky odstraněná“, jak je zde používáno, popisuje takovou chemickou skupinu, která může být oddělena od proteinu chemickou cestou pomocí například roztoku kyseliny, zásaditého roztoku, pomocí katalýzy iontu kovu, atd.

• · ·· · · · ·· · • · · · · · ···« ···· · ··· · · · • · · · · · ···· · « · · ··· ··· · · · ···· ·· ·· « ·· ···

Ačkoliv to není nezbytné pro postupy podle navrhovaného vynálezu, tak pokud je štěpitelná skupina chemicky identifikovatelná, může být izoforma s připojenou strukturou označena podle konkrétního typu. Například „izoforma s připojenou strukturou s pyruvátem“ je požadovaný protein obsahující štěpitelnou skupinu, která byla identifikována jako pyruvát. Jak je používán zde, termín „oxidační reakce“ popisuje reakci určenou pro přinucení sulfidových skupin dvou cysteinů do formy disulfidické vazby.

Jak je používán zde, termín „interferon a“ popisuje rodinu indukovatelných sekretovaných proteinů, které zajišťují rezistenci cílové buňky proti virům, potlačují buněčné dělení a regulují expresi MHC antigenů třídy I. Tato rodina zahrnuje zejména interferon a2a (Roferon, Hoffman, La-Roche, Nutley, NJ), interferon cc2b (Intron, Schering-Plough, Madison, NJ), interferon a2c (Berofor Alfa, Boehringer, Ingelhein, Ingelhein, Germany) nebo směs interferonů, která byla definována určením sekvence přirozeně se vyskytujících interferonů a (Infergen, Amgen, Thousand Oaks, CA).

Navrhovaný vynález popisuje izolaci a přečištění proteinů. V jedné konkrétní variantě, navrhovaný vynález popisuje identifikaci a přečištění izoforem s připojenou strukturou . V další variantě navrhovaný vynález popisuje způsob přípravy požadovaného proteinu z izoforem s připojenou strukturou . V ještě další variantě, navrhovaný vynález popisuje vysoce přečištěný protein pomocí přečištění požadovaného proteinu zároveň s izoformami s připojenou strukturou a jejich následnou konverzi na požadovaný protein. Pomocí tohoto způsobu je množství izoformy s připojenou strukturou sníženo a celkový výtěžek požadovaného proteinu je zvýšen a/nebo je zvýšena jeho čistota. Výtěžek požadovaného proteinu může být zvýšen až desetkrát, vzhledem k objemům získaným bez konverze izoforem s připojenou strukturou .

Zatímco navrhovaný vynález není omezen původem požadovaného proteinu nebo izoformy s připojenou strukturou , v konkrétních variantách navrhovaného vynálezu, je jako zdroj použit mikroorganismus připravený pomocí rekombinantních technik. Každý odborník v současném stavu techniky, zná celou řadu těchto technik. Tyto transformované mikroorganismy mohou být eukaryotické nebo prokaryotické buňky, bakterie, savčí buňky, apod. Např. interferon a může být produkován v bakteriích podle patentu US 4 530 901, Weissman, nebo pomocí techniky popsané v evropské patentové aplikaci EP 032 134.

Podobně, navrhovaný vynález není omezen na konkrétní techniku extrakce izoforem s připojenou strukturou z buněk které je produkují. Pokud je požadovaným proteinem interferon a, mohou být použity techniky podle patentu US 4 315 852 a 4 364 863, Leibowitz et al.

• to · to to to to to to to ···· · ··· · · · • · ··· · · · · · * · · · ··· ··· ··· ···· ·· ·· · ·· ···

Podobně, navrhovaný vynález není omezen na konkrétní techniku použitou k oddělení izoformy s připojenou strukturou od požadovaného proteinu. Rada použitelných chromatografických a jiných separačních technik je známá v současném stavu techniky.

Zatímco navrhovaný vynález není limitován způsoby identifikace izoforem s připojenou strukturou , jejich identifikace může být provedena pomocí testování molekulových hmotností požadovaného proteinu a příměsí s vyšší molekulovou hmotností, než má požadovaný protein. Taková technika je popsána například v Rose et al., J Biol Chem 267:19101 (1992). Příměsi s vyšší molekulovou hmotností než má požadovaný protein mohou být např. degradovány (např. v kyselém nebo silně zásaditém prostředí) a mohou být analyzovány produkty degradace. Pokud jeden z těchto produktů degradace má stejnou hmotu a nebo strukturní charakteristiky jako požadovaný protein, je možné takovou příměs označit za izoformu s připojenou strukturou obsahující štěpitelnou skupinu.

Zatímco navrhovaný vynález není limitován způsoby změny izoforem s připojenou strukturou na požadovaný protein, v jedné konkrétní variantě může testovací proces stanovit správné podmínky konverze. Například jeden postup zahrnuje postupnou úpravu pH v reakčni směsi až do bodu, kdy je štěpítelná skupina odstraněna z izoformy a vznikne funkční reverzibilně denaturovaný protein.

Navíc navrhovaný vynález není limitován způsoby chemického odstraňování štěpitelných skupin. V jedné variantě jsou skupiny odstraněny nebo odštěpeny vystavením izoformy kyselému prostředí (např. použitím kyseliny octové). V jiné variantě jsou izoformy vystaveny roztoku zinku.

Navrhovaný vynález není také omezen teplotou při které štěpení probíhá. Obecně, čím vyšší teplota, tím rychleji bude izoforma přeměněna v požadovaný protein.

Zatímco chemické štěpení štěpitelných skupin může dát vzniknout proteinu se stejnou strukturní charakteristikou jakou má požadovaný protein, je někdy nezbytné oxidovat redukované skupiny obsahující síru tak, aby mohly tvořit disulfídické vazby. To umožní proteinu získat správnou strukturu a stát se funkčním. Způsoby oxidace těchto skupin jsou dobře známé v současném stavu techniky a navrhovaný vynález není omezen na žádnou konkrétní techniku oxidace.

V jedné konkrétní variantě navrhovaného vynálezu, je popsána technika skupin methioninu během oxidace tak aby bylo zabráněno vytvoření methionin sulfoxidu. Způsoby ochrany methioninových skupin jsou dobře známé v současném stavu techniky a navrhovaný vynález není limitován konkrétní technikou ochrany methioninových skupin. Tyto techniky jsou popsány v Lam, et al., J Pharm. Sci 86:1250 (1997) a patentu US 5 272 135, Takruri.

• · · · · · · · · φφφ · · · ··· φφφφ · ··· · · φ φ φφφ φ φ φ φ φ φ φ φ

Navrhovaný vynález není také omezen použitou oxidační reakcí. Např. v jedné variantě navrhovaného vynálezu je odstranění štěpitelných skupin následováno oxidací sulfídických skupin. V jiné variantě navrhovaného vynálezu probíhá odstranění štěpitelných skupin a oxidace sulfídických skupin za stejných reakčních podmínek.

Podobně, jakmile jsou štěpitelné skupiny odstraňovány chemicky , oxidace proteinu probíhá zároveň s touto reakcí a navrhovaný vynález není omezen žádným konkrétním způsobem odstraňování štěpitelných skupin z izoforem s připojenou strukturou a oxidace. V jedné variantě je proces testování zaměřen na stanovení ideálních podmínek pro chemické odštěpení štěpitelných skupin. Např. experimenty testující rozsah pH, mohou být prováděny tak, že je měřeno množství požadovaného proteinu s dostatečnou strukturální integritou (tzn. nedenaturované) a/nebo množství štěpitelné skupiny. Vynesením množství požadovaného proteinu s dostatečnou strukturální integritou vzhledem k reakčnímu pH by mělo dát Gaussovu křivku , kde nej vyšší bod této křivky představuje ideální pH pro chemické odstranění této štěpitelné skupiny. V této variantě je možné podobné testování provést i pro oxidační reakci. Pokud se tyto křivky představující průběh chemického odštěpování a oxidační reakce protínají, pak průsečík představuje ideální podmínky jak pH pro odstranění štěpitelné skupiny tak oxidaci sulfídických skupin v jedné reakci. Pro chemické odstranění skupin a oxidaci pyruvátu na izoformách s připojenou strukturou interferonu a, se tyto dvě křivky protínají přibližně na pH 5, čímž je dáno ideální pH pro průběh kombinované reakce. Dalšími reakčními podmínkami, které mohou být stanovovány, jsou například koncentrace solí, teplota atd.

Po změně izoforem s připojenou strukturou na požadovaný protein, mohou být nezbytné některé chromatografícké postupy pro přečištění požadovaného proteinu od nečistot.

Jakmile je požadovaný protein dostatečně přečištěn, může být převeden do formy použitelné pro terapeutické použití. Například, pokud je požadovaným proteinem interferon a, jsou použitelné lékové formy popsané v patentech US 4 847 079 a 4 496 537, Kwan, a patentu US 5 766 582, Yuen et al. Je také možné použít jiné inertní farmaceuticky přijatelné nosiče a to buď pevné nebo kapalné. Pevnou lékovou formou může být prášek, tableta, rozpustná granule, kapsule, nebo čípek. Práškové formy nebo tablety mohou obsahovat od 5 do asi 95 % požadovaného proteinu. Vhodnými pevnými nosiči známými v současném stavu techniky jsou např. uhličitan hořečnatý, stearát hořečnatý, mastek, cukr nebo laktóza. Tablety, prášky a kapsule mohou být použity jako pevné lékové formy použitelné pro orální aplikaci.

Pro přípravu čípků, je nejprve roztaven vosk s nízkou teplotou tání, jako je směs glyceridů mastných kyselin (např. kokosové máslo) a aktivní složka je do něj rovnoměrně rozmíchána.

Roztavená homogenní směs je nalita do vhodných forem, ve kterých je ochlazena do ztuhnutí.

• · « β φφφφ ♦ · · · · · · φ φ · · · Β ΦΦΦΦ ΦΦΦ Φ 6Φ Φ · ΦΦΦ ΦΦΦ

ΦΦΦΦ ·Φ · Φ · Φ· ···

Kapalné lékové formy zahrnují roztoky, suspenze a emulze. Jsou to např. roztoky vody nebo propylenglykolu ve vodě určené pro parenterální injekce, nebo přidání sladidel nebo kalidel pro orálně podávané roztoky, suspenze a emulze. Kapalné formy mohou také zahrnovat roztoky pro intranasální podání.

Aerosolové přípravky, vhodné pro inhalaci, mohou zahrnovat jak roztoky, tak pevné látky ve formě prášku, které mohou být smíchány s farmaceuticky přijatelným nosičem, jako je inertní stlačený plyn.

Látky podle navrhovaného vynálezu mohou být také podávány transdermálně. Tyto transdermální prostředky zahrnují krémy, oleje, aerosoly a/nebo emulze a mohou být podány pomocí transdermálních náplastí, nebo nádob, které jsou k tomuto účelu běžně používány v současném stavu techniky.

Množství aktivní složky v jedné dávce přípravku může být v rozmezí od 0,01 mg do asi 1000 mg, lépe pak od 0,01 mg do asi 750 mg. Další možností je připravit látku v koncentraci přepočtenou na mezinárodní jednotky, kdy nejvhodnější dávka je v rozmezí od 3 000 000 do 50 000 000 mezinárodních jednotek. Ve variantách podle navrhovaného vynálezu jsou použity lékové formy obsahující 3000 000, 5 000 000, 18 000 000, 25 000 000 a 50 000 000.

Dále jsou popisovány pevné lékové formy, které jsou přizpůsobeny pro převedení do tekuté fáze, těsně před použitím a určené pro orální povrchové nebo parenterální podání.

Následující příklady slouží pouze pro ilustraci několika nej vhodnějších konkrétních variant a aspektů navrhovaného vynálezu nemohou být v žádném případě brány jako limity navrhovaného vynálezu.

PŘÍKLADY PROVEDENÍ VYNÁLEZU

PŘÍKLAD 1: Proces testování změny izoforem s připojenou strukturou obsahujících pyruvát

Izoformy s připojenou skupinou obsahující pyruvát jsou tvořeny uvnitř buňky, kdy oc-amino skupina N-terminální aminokyseliny proteinů je napojena na karbonylovou skupinu pyruvátu. Pokud tento pyruvát narušuje konformaci proteinů, pak pouze pokud tato izoforma s připojenou skupinou obsahující pyruvát je hydrolyzována (pyruvát je odštěpen od proteinů), může se tento protein volně přeskupit do požadované konformace prostřednictvím termodynamicky stabilních konformačních změn. Pokud požadovaný protein obsahuje disulfídické vazby, redukovaná izoforma vzniklá po odštěpení pyruvátu může být oxidována jako součást procesu nezbytného přeskupení proteinu do požadované formy.

Následující postupy popisují, jak stanovit optimální podmínky pro změnu izoformy s připojenou skupinou obsahující pyruvát na požadovanou formu proteinu. Jak se uvedeno výše, pokud ·· ·

požadovaný protein neobsahuje disulfidické vazby nebo vazbu, testování může probíhat pouze se záměrem maximalizovat míru odštěpování pyruvátu (hydrolýzu). Pokud požadovaný protein obsahuje disulfidické vazby nebo vazbu, toto testování musí probíhat tak, aby bylo optimalizováno nejen odštěpování pyruvátu (hydrolýza), ale zároveň vytváření disulfídických vazeb (oxidace).

Odštěpení pyruvátu

Technika odštěpení pyruvátu musí být optimalizována pro maximální hydrolýzu tak, aby bylo možno stanovit kinetiku odštěpování pyruvátu. Například, volní pyruvát může být kvantifikován pomocí chemických modifikačních technik nebo enzymatických postupů. 2,4- dinitrofenylhydrazin (DNPH) může být použit jako látka tvořící deriváty pyruvátu. Vzorek poté projde ultrafiltrací tak, aby byly odstraněny nežádoucí formy obsahující pyruvát pomocí vhodné, např. 10K, MWCO membrány. Filtrát je poté inkubován při kyselém pH s DNPH, který reaguje s volným pyruvátem. DNPH-derivát pyruvátu, může být snadno analyzován na RP-HPLC za použití C8 kolony jako je například Nucleosil C8 (5pm) kolona.

Jelikož derivatizační reakce je stechiometrická, je možné také provést kvantitativní měření pyruvátu. Enzymový kit (např. laktát dehydrogenáza / NADH) může být také použit pro stanovení pyruvátu. Tato techniky nevyžaduje ultrafíltraci vzorku, neboť použité postupy jsou natolik šetrné, že neumožňují oštěpení pyruvátu z nežádoucí formy obsahující pyruvát během inkubace.

Pro stanovení množství jak volném pyruvátu, tak pyruvátu navázaného na protein, celkový navázaný pyruvát může být odštěpen před reakcí s DNPH. Jelikož reakce s DNPH vyžaduje velmi kyselé pH a relativně dlouhý inkubaění čas, pyruvát může být odštěpen a následně reagovat s DNPH během jediné inkubace. Z tohoto důvodu je možné použít vzorek bez ultrafiltrace pro reakci s DNPH, pokud je účelem měřit celkové množství volného a navázaného pyruvátu ve vzorku.

Izoformy

Existují alespoň tři izoformy proteinu s disulfidickými vazbami a dvě izoformy proteinu bez disulfídických vazeb. Obecně, požadovaný protein a jeho redukovaná forma mohou být snadno rozlišeny pomocí RP-HPLC.

V případě proteinu obsahujícího disulfidické vazby, testování bude velmi účinné pro tři izoformy (izoforma s připojenou skupinou, redukovaný protein a požadovaný protein) a může být kvantitativně analyzováno na RP-HPLC. V tomto případě není nutné použít pyruvátovou ·· Φ· φ· · ·· · φφφ φφφ φφφφ • ΦΦΦ · · · φ · · · φ φ · · · φ φφφφ · · φ ·

8··· · · · φφφ φφφ φ φφ φφ ♦ ·· ··· techniku a je snadné identifikovat, který z kroků je limitující. Bohužel, je obvykle velmi obtížné rozlišit izoformu s připojenou skupinou obsahující pyruvát od redukované formy. V tomto případě je pyruvátová technika nenahraditelná pro optimalizaci všech kroků přeměny.

Stanovení izoforem v prostředku

Pokud požadovaná forma neobsahuje disulfídické vazby, prostředek obsahující izoformy může být analyzován velmi snadno, neboť izoforma s připojenou skupinou obsahující pyruvát může být snadno odlišena od požadovaného proteinu pomocí RP-HPLC.

Pokud požadovaná forma obsahuje disulfídické vazby a izoforma s připojenou skupinou proteinu není oddělitelná od redukované formy, pyruvát navázaný na protein musí být stanoven tak, aby bylo možno určit obsah izoforem v prostředku. Molární množství pyruvátu navázaného na protein, které odpovídá množství izoformy s připojenou skupinou obsahující pyruvát, je vlastně celkové množství volného a navázaného pyruvátu bez množství volného pyruvátu. Toto může být stanoveno ve vzorku pomocí technik s a bez ultrafiltrace, pomocí DNPH techniky. Množství redukované formy je tedy rozdíl mezi kombinovaným množstvím izoformy s připojenou skupinou proteinu a redukované formy stanovené pomocí RP-HPLC a množství pyruvátu navázaného na protein stanoveného pomocí pyruvátové techniky. Z těchto hodnot je mono vypočítat složení izoforem v prostředku.

Testování optimálních podmínek

Ať požadovaná forma obsahuje disulfídické vazby nebo neobsahuje, testovací kritéria jsou stejná za účelem maximalizovat míru specifické konverze izoforem s připojenou strukturou na požadovanou formu.

Požadovaný protein nemá disulfídické vazby

V tomto případě požadovaný protein vznikne okamžitě po odštěpení pyruvátu z izoformy s připojenou skupinou obsahující pyruvát. Míra štěpení pyruvátu nemusí být monitorována pyruvátovou technikou v tomto případě, neboť se jedná pouze o jediný krok, hydrolýzu, který ovlivňuje změnu izoformy s připojenou skupinou na požadovanou formu. Například, monitorování jak úbytku izoformy s připojenou skupinou, tak přibývání požadované formy pomocí RP-HPLC je zcela dostatečné. Je třeba nalézt pouze inkubační podmínky, které maximalizují změnu izoformy s připojenou skupinou na požadovanou formu proteinu.

Prvním krokem je stanovit reakční kinetiku vzhledem k pracovnímu rozmezí koncentrací izoformy s připojenou skupinou proteinu, které jsou použity při testování. Pokud se jedná o ·· ·« ♦♦ · ♦· · ··· · · · ··♦· • · · · · · · · · · · • · « · · 9 ···· · · · · • · · · · · ♦ · · ······ 9 9 · 99 9 9 9 kinetiku prvního řádu vzhledem ke koncentraci izoformy s připojenou skupinou, koncentrace vzorků nemá vliv na kinetiku a žádný parametr koncentrace nemusí být testován během hledání ideálních parametrů. Naopak koncentrace by měla být během testování udržována konstantní. Hydrolýzu pravděpodobně ovlivňuje velké množství parametrů. Nejdůležitější jsou pH, teplota, koncentrace kovových iontů (jako jsou ionty zinečné, železité, železnaté, měďnaté, hořečnaté, atd.), vodivost, pufry, světlo a míchání. Pomocí stanovení efektu těchto inkubačních parametrů na změnu izoformy s připojenou skupinou na požadovanou formu umožní optimalizaci každého parametru. Např. některé alikvoty vzorku obsahující izoformu s připojenou skupinou obsahující pyruvát jsou inkubovány v dostatečném rozmezí různých hodnot pH se všemi ostatními parametry nastavenými na nejvhodnější hodnoty. Rychlost reakce v každém alikvotu je poté stanovována v několika časových intervalech inkubace (např. přes noc). Hodnota pH, při které je dosaženo nejlepší míry přeměny, je poté stanovena jako optimální pH. Tento experiment je opakován pro optimalizaci dalších parametrů pomocí optimálních hodnot dříve optimalizovaných parametrů na místo dříve použitých nej vhodnějších teoretických hodnot. Toto je typický postup optimalizace.

Hodnota pH při inkubaci výrazně ovlivní míru hydrolýzy. Obecně, nižší pH zajistí vyšší míru hydrolýzy. Zvýšená teplota také zvyšuje míru hydrolýzy. Tedy hydrolýza při velmi kyselém pH, jako je například pH 2, nemusí probíhat, neboť dojde k nevratnému sražení izoformy s připojenou skupinou nebo požadovaného proteinu nebo k nevratné denaturaci proteinu. Přítomnost některých kationtů kovu mohou katalyzovat hydrolýzu. Pokud je tato katalýza způsobována přítomností kovových kationtů, rychlost odštěpování pyruvátu je silně závislé na koncentraci kovových kationtů. Z toho vyplývá, že při hledání optimální koncentrace je třeba použít velmi široké koncentrační rozmezí kovových kationtů. Může se však stát, že mezi parametry dochází k interakcím. Například, je možné, že jsou zjištěna různá optimální pH v závislosti na přítomnosti některého kovového iontu, nebo v případě, že tento kation ovlivňuje přeměnu. V případě izoforem s připojenou strukturou obsahujících pyruvát přítomnost kationtů zinku ovlivní optimální pH pro odštěpení pyruvátu (pH 7,8 až 8,6). Proto je nezbytné měnit ve stejnou chvíli nejenom nový optimalizovaný parametr, ale i dříve zjištěné důležité parametry, aby došlo k skutečné optimalizaci systému.

Požadovaný protein obsahuje disulfidickou vazbu nebo vazby

V procesu přeměny složeném ze dvou kroků je redukovaná forma připravena z izoformy s připojenou skupinou pomocí hydrolýzy a následně přeměněna na požadovanou formu pomocí oxidace.

·9 Μ • · · 9

9 99 9 9 · 9 9 · * •9 999 9999999 9 · _1Z. 9 9 9 9 9 9 9 9 9

V ideálním případě jsou izoforma s připojenou skupinou proteinu a redukovaná forma izolovány a je použit proces popsaný výše pro protein bez disulfidických vazeb jak na izoformu s připojenou skupinou, tak na redukovanou formu po optimalizaci jednotlivých kroků. Největším rozdílem je další parametr, který je třeba optimalizovat pro oxidační krok, kromě parametrů uvedených výše, který je nezbytný pro přenos kyslíku a přidání některých oxidačních činidel, jako je oxidovaný glutathion (GS-SG). Pokud pomocí GS-SG je oxidována pouze redukovaná forma, zvyšuje to podstatně účinnost oxidace a tak vlastně tvorby disulfidických vazeb. Je pravděpodobné, že výtěžky budou velmi nízké, pokud při přeměně za použití GS-SG je také oxidována izoforma s připojenou skupinou, neboť tato izoforma s připojenou skupinou po oxidaci je velmi těžko hydrolyzovatelná. Ze všech optimálních podmínek je třeba zvolit takovou optimální sestavu parametrů, při které bude docházet k přeměně izoformy s připojenou skupinou na požadovaný protein. Pokud jsou v rozumném rozsahu, jsou tyto podmínky brány jako optimální podmínky. Teoreticky, můžou být různé optimální podmínky v závislosti na výchozím poměru izoformy s připojenou skupinou obsahujících pyruvát k redukované formě ve vzorku. Například, optimální podmínky můžou být různé, pokud je izoforma s připojenou skupinou v absolutní většině, něž pokud je v absolutní většině redukovaná forma. Je tedy jasné, že optimální reakční podmínky pro jednotlivé vzorky je třeba navzájem porovnat a teprve z těchto hodnot vyvodit průměrné optimální podmínky pro každý další vzorek.

Optimální podmínky přeměny jsou experimentálně potvrzeny. V případě jemného dolaďování optimálních podmínek přeměny je vhodné identifikovat hlavní limitující krok. Studiem akumulace redukovaných forem během inkubace ukazuje, že limitujícím krokem je krok oxidace. Pokud dojde k akumulaci, je třeba použít silnější podmínky pro oxidaci, jako je například vyšší přívod kyslíku, vyšší pH a vyšší teplota, které po aplikaci maximalizují tvorbu požadované formy. Pokud je ve vzorku neustále nízké množství redukovaného proteinu a míra tvorby požadovaného proteinu je nízká, je limitujícím faktorem krok štěpení. Pokud dochází k tomuto, je potřeba inkubační podmínky pozměnit tak, aby byl posílen krok štěpení, což povede k maximalizaci tvorby požadovaného proteinu. Pokud optimální podmínky pro chemické odstranění štěpitelné skupiny a pro oxidaci proteinu jsou velmi vzdálené, je třeba je aplikovat ve dvou krocích. Například, nejprve jsou aplikovány optimální podmínky pro hydrolýzu a teprve když hydrolýza je v podstatě kompletní jsou podmínky pozměněny na podmínky optimální oxidaci.

Pokud není možné izolovat všechny izoformy je pyruvátová technika nepoužitelná, zejména pokud tyto dvě izoformy nejsou rozlišitelné pomocí RT-HPLC. Sledováním uvolňování pyruvátu, může být nejprve optimalizován krok hydrolýzy jako první. Další krok může být φφ · • Φ φφ φ φ φ φφφ φ φφφφ φ φφφ φ φ · φ φ ··· φφφφφφφ · · φφφ φφφ φφφ φφφφ φφ φφ · ·· ··· optimalizován pokud je první krok ukončen nebo téměř ukončen. Z těchto optimálních podmínek jsou optimální podmínky pro celkovou přeměnu vyhodnoceny a experimentálně potvrzeny.Jinou alternativou je, že celková optimální přeměna je optimalizována po optimalizaci hydrolýzy. Tento přístup je výhodnější pokud je obtížné optimalizovat druhý krok díky vlivu kontinuální hydrolýzy izoformy s připojenou strukturou . Jak bylo řečeno výše, pH, teplota, přívod kyslíku, kovové ionty a oxydanty jsou důležité parametry které je třeba optimalizovat.

Interakce mezi parametry jsou důležitější pro konverzi ve dvou krocích, než v přeměně během jednoho kroku.

Pro potvrzení, že nedošlo k poškození požadovaného proteinu ve stanovených optimálních podmínkách, je třeba požadovaný protein přečistit a ověřit jeho vlastnosti, včetně biologické specifity a aktivity.

PŘÍKLAD 2: Změna izoformy s připojenou strukturou obsahující pyruvát na interferon oc2b Štěpení pyruvátu a vytváření disulfídických vazeb probíhá při zvýšené teplotě (30 až 37 °C) a reakčním pH 5,2 až 5,6. Tyto reakční podmínky jsou jedinečné vtom, že obě reakce probíhají následně za stejných reakčních podmínek a výsledkem je bioaktivní protein.

Frakce obsahující maximum proteinu zjištěné pomocí UV absorbance při vymývání proteinu během preparativní chromatografie a jsou smíchány a přes filtr s 0,45 uM filtrováno do sterility.

Je přidáno 3 g methioninu na litr roztoku proteinu a za stálého míchání rozpuštěno. Hodnota pH je upravena 5,2 až 5,6 pomocí přidání hydroxidu sodného. Koncentrace chloridu sodného není upravena, je v rozmezí od 150 až 200 mM NaCl.

Roztok obsahující 10 mM kyselinu octovou pH 5,5, 200 mM methionin a 200 mM NaCl je přidán k roztoku proteinu do celkové koncentrace methioninu 20 mM.

Roztok proteinu je přenesen do reakční nádoby a teplota je zvýšena na 37 °C za stálého míchání. Reakční směs obsahující protein je poté míchána při 36 až 38 °C po dobu 24 až 30 hodin.

Po uplynutí 24 až 30 hodin je reakční směs filtrována přes filtr a poté přes 0,45 uM filtr, tak aby byly odstraněny sraženiny. Reakční směs je poté zakoncentrována a diafiltrována proti 10 mM kyselině octové o pH 5,5 při 2 až 10 °C.

PŘÍKLAD 3: Změna izoformy s připojenou strukturou obsahující pyruvát na interferon a2b za použití iontů zinku

Izoforma s připojenou strukturou obsahující pyruvát je přeměněna interferon a2b při 34 °C a pH

8,2 pomocí roztoku zinku (1 M). Během reakce je reakční směs míchána. Jakmile je přeměna dokončena na 80 %, je teplota reakční směsi je snížena na 4 °C a tím je reakce zastavena.

·· · ·Φ φ · 9 9 9 9 9 9 99

9999 9 9 9 9 9 9 9

9 9 9 9 9999 9 9 · · • · · φφφ · · ·

........ · .....

Potřebné roztoky: 1 Μ Tris pufr skladován při 4 °C, 1 M Tris báze + HC1 o pH 8,3, 1 mM roztok zinku, skladován při 4 °C, 1 mM ZnSOzffLO + 10 mM octan sodný + 175 mM NaCl o pH 5,5.

Frakce obsahující maximum proteinu zjištěné pomocí UV absorbance při vymývání proteinu během preparativní chromatografie a jsou smíchány a 0,2 uM filtrováno do sterility. Asi 0,083 (V/V) 1 M Tris pufru je pomalu přidáno k roztoku proteinu (pH obvyklého roztoku proteinu je v rozsahu od 5,2 do 5,5) za stálého míchání až je dosaženo pH asi 8,2.

lmM roztoku zinku je pomalu přidáno k proteinu za stálého míchání tak aby bylo dosaženo 0,6 k 1,0 molárního poměru kationtů Zn k celkovému množství izoformy s připojenou strukturou obsahující pyruvát, tzn. pokud je koncentrace izoformy s připojenou strukturou obsahující pyruvát je 1,0 mg/ml, je zapotřebí 30 μΜ roztoku Zn nebo 0,03 (V/V) 1 mM roztoku Zn. Je třeba použít čerstvý roztok kationtů zinku.

Reakční směs je zahřáta na 34 °C v reakční nádobě za stálého míchání. Teplota reakční směsi je udržována na 34 °C v průběhu celé reakce. Nepřetržité míchání je nezbytné udržovat v takové míře, aby bylo dostatečné, ale ne natolik aby dalo vzniknou bublinám. Do reakční nádoby je třeba zavést ventilaci, která zajišťuje dostatečný přívod kyslíku. Pokud je ovšem reakční nádoba naplněna jen do poloviny, tato ventilace není nezbytná. Během reakce mohou být odebírány vzorky aby bylo možno sledovat průběh přeměny pomocí RP-HPLC. Jakmile je reakce u konce, reakční směs je ochlazena na 4 °C pro další kroky chromatografie.

Z výše uvedeného je zřejmé, že navrhovaný vynález popisuje techniku identifikace nežádoucích forem proteinů a změnit je na požadovaný protein, se zvýšenou účinností a čistotou požadovaného proteinu.

Claims (17)

1. PATENTOVÉ NÁROKY

   1. Způsob zvýšení výtěžku prostředku obsahujícího interferon a, vyznačující se tím, že zahrnuje přeměnu izoformy s připojenou strukturou na interferon a.
2. 2. Způsob podle nároku 1, v y z n a č u j í c í se t í m, že tato izoforma s připojenou strukturou je izoforma obsahující pyruvát.
3. 3. Způsob podle nároku 2, v y z n a č uj í c í se t í m, že tento interferon a je interferon a2b.
4. 4. Způsob podle nároku 3, vyznačující se tím, že tato izoforma s připojenou strukturou je vystavena kyselému roztoku.
5. 5. Způsob podle nároku 4, vyznačující se tím, že tento kyselý roztok má pH asi 5,5.
6. 6. Způsob podle nároku 5, vyznačuj ící se tím, že tento kyselý roztok má teplotu 34 až 40 °C.
7. 7. Způsob podle nároku 6, vyznačující se tím, že tento kyselý roztok obsahuje antioxidant.
8. 8. Způsob podle nároku 7, vyznačující se tím, že tento antioxidant představuje methionin.
9. 9. Způsob podle nároku 8, vyznačuj ící se tím, že methionin je v koncentraci od 5 do 40 mM.
10. 10. Způsob podle nároku 3, vyznačující se tím, že tato izoforma s připojenou strukturou je vystavena roztoku zinku.
11. 11. Způsob podle nároku 10, vyznačující se tím, že tento roztoku zinku má pH od 7,8 do 8,6.
12. 12. Způsob podle nároku 11, vyznačující se tím, že tento roztoku zinku má teplotu 30 až 38 °C.
13. 13. Způsob podle nároku 12, vyznačující se tím, že tento roztoku zinku obsahuje antioxidant.

    • Φ 4» 44 4 • · · » · · ·

    444» · · · 4 4 · · φ φ · · · I 140 · · · ·

    ΦΦΦΦ44 ΦΦ· ··4 Φ 4β ·· > «4 «4 Φ
14. 14. Způsob podle nároku 13, vyznačující se tím, že tento antioxidant představuje methionin.
15. 15. Způsob podle nároku 14, vyznačuj ící se tím, že methionin je v koncentraci od 5 do 40 mM.
16. 16. Způsob podle nároku 9, vyznačující se tím, že dále zahrnuje přečištění interferonu a2b za použití chromatografie
17. 17. Způsob podle nároku 16, vyznačující se tím, že tato chromatografie zahrnuje barvenou afínitní chromatografii na agaróze, následovanou iontoměničovou chromatografií na agaróze, která je následována procesem krystalizace.