KR20010083900A

KR20010083900A - 활성 β-ＮＧＦ의 제조방법

Info

Publication number: KR20010083900A
Application number: KR1020017004512A
Authority: KR
Inventors: 앙케 라텐홀; 엘리자베스 쉬바르츠; 아델베르트 그로쓰만
Original assignee: 추후기재; 쉴 프로테인즈 게엠베하
Priority date: 1998-10-09
Filing date: 1999-10-11
Publication date: 2001-09-03
Also published as: US8501439B2; JP5275306B2; US20100203589A1; CA2346257C; AU1034800A; WO2000022119A1; ES2213861T3; US8318671B1; DE59810555D1; AU765810B2; ZA200102780B; FR17C0007I2; BR9914393B1; JP2002527062A; JP4634611B2; KR100593831B1; CA2346257A1; ATE257514T1; JP2010280717A; BR9914393A

Abstract

본 발명은 프로 형태의 proNGF로부터 생물학적으로 활성인 β-NGF를 제조하는 방법에 관한 것이다. β-NGF의 프로 형태가 발현된 후, 원핵 숙주세포에서 재조합 단백질의 불용성 비활성 집합체(봉입체)의 형태로 분리시킨다. 결합 형태로 강한 분리제로 이를 용해시키고 고유 β-NGF 중에 존재하는 디설파이드 결합에 의해 측정되는 활성인 형태로 이를 전환시킨 후, 그 다음 프로 서열을 단리시킴으로써 생물학적으로 활성 β-NGF를 얻는다.

Description

활성 β-ＮＧＦ의 제조방법{METHOD FOR OBTAINING ACTIVE β-NGF}

신경 성장 인자(β-NFG)는 교감 신경 및 감각 뉴런의 성장 및 생존에 필요한 신경영양성 인자이다(Levi-Montalcini, R., Science 237(1987) 1154; Thoenen, H., et al., Physiol. Rev. 60(1980) 1284; Yankner, B.A., et al., Annu. Rev. Biochem. 51(1982) 845). 더욱 또한, β-NGF는 중추 신경계의 콜린성 뉴런의 성장, 분화 및 생존력을 증진시킨다(Hefti, F.J., J. Neurobiol. 25(1994) 1418). 재조합 인간 신경 성장 인자에 가능한 치료 적응증으로는 말초 감각 신경병, 예를 들어 당뇨병과 관련된 신경병 또는 AIDS 치료에서 가능한 부작용으로서의 신경병이 있다. rh β-NGF에 대한 다른 적응증은 중추 신경병, 예를 들어 알쯔하이머 병이다. 이 경우에, 기억력의 상실은 콜린성 뉴런이 상실된 결과이다.

인간 β-NGF는 241 개 아미노산으로 이루어진 프리프로단백질(prepro-protein)로서 번역된다. 상기 프리펩티드(18 개 아미노산)는 전좌 도중소포체(ER)로 절단되며, 한편으로 생성된 프로단백질은 후속적으로 그의 N 및 C 말단이 프로세스된다(상기 프로 서열(103 개 아미노산) 및 최종 2 개 아미노산의 제거). 따라서, 성숙한 인간 NGF는 118 개의 아미노산을 함유한다. 이는 쥐의 β-NGF와 상동성을 나타내며 단지 12 개의 아미노산 교환만이 상기 단백질과 다르다. 임상 연구를 수행하거나 또는 치료제로서 사용하기 위해서는, 상기 β-NGF를 다량으로 입수해야 한다. 보다 많은 양의 상기 인자의 천연 공급원은 쥐의 하악선이다. 그러나, 이들 제제는 상이한 이량체들의 이종 혼합물이며 치료 용도로는 부적합하다. 더욱 또한, 환자에게는 인간 형태의 단백질을 투여하는 것이 바람직하다. 그러나, 인간 조직에서, 신경영양성 인자는 단지 미소한 농도로만 존재한다.

따라서, β-NGF를 치료제로서 사용하기 위해서는, 재조합에 의한 상기 단백질의 제조만이 가능하다. 이는 2 가지 방식, 즉 세포 배양액 또는 세균에서의 재조합체 발현에 의해서 성취될 수 있다. 진핵 세포 발현 시스템은 단지 매우 소량의 단백질만을 제공하는 경향이 있으며 비교적 비용이 많이 든다(Barnett, J., et al., J. Neurochem. 57(1991) 1052; Schmelzer, C.H., et al., J. Neurochem. 59(1992) 1675; 미국 특허 제 5,683,894 호).

대조적으로, 원핵 세포 발현 시스템은 다량의 목적하는 단백질을 제공한다. 그러나, 진핵 세포 발현 시스템과는 대조적으로 세균은 정확한 방식으로 전구 단백질을 프로세스할 수 없다. 다수의 다른 재조합 포유류 유전자의 발현에서와 같이, 세균에서의 재조합 β-NGF의 생산은 생물학적으로 불활성인 번역 생성물을 생성시키고, 이어서 상기는 집합체(소위 봉입체(IB))의 형태로 세포 중에 축적된다.

그러나 봉입체와 같은 성숙한 β-NGF 형태의 결합은 매우 낮은 단백질 농도(10 ㎍/㎖ 이하)의 경우에만 가능하며 수율(약 10% 이하)이 매우 적다. 이러한 방법의 예가 EP-A 0 544 293, 미국 특허 제 5,606,301 호 및 5,235,043 호뿐만 아니라 WO 97/47735에 개시되어 있다. NGF/BDNF 계열의 신경영양성 인자의 설피토라이시스(sulfitolysis)를 통한 결합이 WO 95/30686에 개시되어 있다.

WO 97/47735에는 단백질의 개선된 결합 방법이 개시되어 있다. 이 방법에서는, 불활성 단백질을 티올 그룹을 함유하는 저 분자량 물질의 존재 하에서 분리 농도의 분리제 용액에 용해시킨다. 그 후에, 상기 용해된 단백질을 상기 강한 분리 용액으로부터 상기 단백질을 분리시키지 않거나 단지 약하게 분리시킴으로써 상기 단백질이 생물학적으로 활성인 형태를 취하는 또 다른 용액으로 옮기며, 이때 디설파이드 결합은 상기 티올 성분에 의해 개방되고 후속적으로 단백질이 생물학적으로 활성인 형태를 취하는 방식으로 상기 단백질 중에 새롭게 형성된다. 이러한 유형의 개선된 방법을 사용하여, 약 10%의 β-NGF의 결합 수율이 성취될 수 있다.

본 발명의 목적은 간단하고 높은 수율의 활성 NGF를 제공하는 β-NGF의 개선된 제조방법을 제공하는 것이다.

상기 목적은 불활성 형태로 존재하고 매우 불충분한 용해도를 갖는 프로 형태의 결합을 사용하여 생물학적으로 활성인 β-NGF를 제조하는 방법을 제공함으로써 해결되었으며, 이때 상기 프로 형태는 바람직하게는 원핵세포에서 재조합체 재조 후에 봉입체의 형태로 입수될 수 있고, 상기 방법은 불충분한 용해도를 갖는 불활성 형태의 proNGF를 분리 농도의 분리제 용액에 용해시키고, proNGF를 분리시키지 않거나 또는 약하게 분리시키는 용액으로 옮켜 상기 용해된 분리된 proNGF가 고유 NGF 중에 존재하는 디설파이드 결합에 의해 측정되는 생물학적으로 활성인 형태를 취하는 용해도를 유지시키고, 그 후에 프로서열을 제거하고, 이에 의해 단리될 수 있는 활성 NGF를 수득함을 특징으로 한다.

놀랍게도, 생체 외에서 불활성 β-NGF가 결합되는 동안 프로서열이 상기 결합 과정에 대해 필수적이고 긍정적인 영향을 갖는 것으로 나타났으며, 본 발명에 따라 가장 간단한 방식으로 재생(renaturation)을 수행할 수 있고 이에 의해 지금까지 공지되지 않았고 가능한 것 같지 않았던 결합된 활성 β-NGF가 수득될 수 있게 되었다.

본 발명은 분리된(denatured) 불활성 proNGF의 결합(naturation) 및 상기 프로 서열의 절단에 의한 β-NGF의 제조방법에 관한 것이다.

도 1은 재조합 인간 proNGF의 발현을 위한 proNGF 플라스미드 구조물인 pET11a-proNGF를 나타낸다.

도 2는 각각 유도 전과 유도 후의 이 콜라이 균주 BL21(DE3) pET11a-proNGF/pUBS520의 조 추출물 및 IB 제제의 SDS PAGE 겔(15%)(문헌[Laemmli, UK, Nature 227(1970) 680]에 따른 SDS PAGE)의 쿠마씨 염색을 나타낸다(U: 유도 전의 조 추출물, I: 4 시간 유도 후의 조 추출물, P: IB 펠릿, S: 가용성 상등액).

도 2a는 10 ℃에서 100 mM 트리스/HCl, 1 M L-아르기닌, 5 mM GSH, 1 mM GSSG, 5 mM EDTA 중의 rh proNGF의 중첩에 대한 pH 값의 영향을 나타낸다. 단백질 농도는 50 ㎍/㎖이고, 중첩 기간은 3 시간이었다. 2 개의 연속 측정치의평균값을 나타낸다.

도 2b는 rh proNGF의 중첩에 대한 L-아르기닌의 다양한 농도들의 영향을 나타낸다. 재생은 9.5의 pH에서 일어났으며, 다른 조건들은 pH 변화에 사용된 것들과 동일하였다. 2개의 연속 측정치의 평균값을 나타낸다.

도 2c는 rh proNGF의 중첩에 대한 상이한 GSH 농도의 영향을 나타낸다. GSSG의 농도는 1 mM이었고, L-아르기닌의 농도는 1 M이었다. 재생에 대한 다른 변수들은 아르기닌 변화에 사용된 것들과 동일하였다. 2 개의 연속 측정치의 평균값을 나타낸다.

도 2d는 rh proNGF의 중첩에 대한 상이한 GSSG 농도의 영향을 나타낸다. GSH의 농도는 5 mM이었다. 다른 중첩 변수들은 GSH 변화에 사용된 것들과 동일하였다. 2 개의 연속 측정치의 평균값을 나타낸다.

도 2e는 고유 rh proNGF의 수율에 대한 상이한 양의 GdmCl의 영향을 나타낸다. GSH 및 GSSG의 양은 각각 5 mM 및 0.5 mM이었다. 다른 재생 조건들은 GSSG 변화에 사용된 것들과 동일하였다. 2 개의 연속 측정치의 평균값을 나타낸다.

도 2f는 rh proNGF의 중첩 수율에 대한 상이한 단백질 농도의 영향을 나타낸다. 모든 샘플에서, GdmCl의 농도는 200 mM이었다. 모든 다른 중첩 변수들은 GdmCl 변화에 사용된 것들과 동일하였다. 단일의 연속 측정치를 나타낸다.

도 3은 포로스(Poros) 20 HS(Perseptive Biosystems, 컬럼 부피 1.7 ㎖) 상의 양이온 교환 크로마토그래피에 의한 rh proNGF의 정제에 대한 용출 프로파일을나타낸다.

도 4는 포로스 20 HS 상의 rh proNGF의 정제에 대한 SDS PAGE 겔(15%, 문헌[Nesterenko, M.V., et al., J. Biochem. Biophys. Methods 28(1994) 239]에 따른 은 염색)을 나타낸다(1: 컬럼에 건 재생된 proNGF; 2: 공극; 3: 분획 4(66 내지 69 ㎖); 4: 분획 5(69 내지 72 ㎖); 5: 분획 6(72 내지 75 ㎖); 6: 분획 7(75 내지 78 ㎖); 7: 분획 8(78 내지 81 ㎖); 8: 분획 9(81 내지 84 ㎖); 9: 분획 10(84 내지 87 ㎖)).

도 5는 rh proNGF의 UV 스펙트럼을 나타낸다.

도 6은 rh proNGF의 IEX-HPLC 용출 도식을 나타낸다(컬럼 재료: 포로스 20 HS, 100 ㎜ x 4.6 ㎜ 컬럼, Perseptive Biosystems company).

도 7은 rh proNGF의 RP-HPLC 용출 도식을 나타낸다(컬럼 재료: 포로스 10 R1, 100 ㎜ x 4.6 ㎜ 컬럼, Perseptive Biosystems company).

도 8은 트립신에 의한 rh proNGF의 제한된 단백질 분해에 대한 SDS 겔(15% 쿠마씨 염색)을 나타낸다(M: 10 kDA 마커, 1: rh proNGF 표준물; 2: rh β-NGF 표준물; 3: 질량비 트립신:rh proNGF∼1:40, 4: 1:100, 5: 1:250, 6: 1:500, 7: 1:1000, 8: 1:2000, 9: 1:2500, 10: 트립신 없이, STI를 사용한 대조군).

서열 식별 번호: 1 및 2는 pET11a-proNGF의 구조에 대한 올리고뉴클레오티드를 나타낸다.

서열 식별 번호: 3은 인간 proNGF의 cDNA의 뉴클레오티드 서열 뿐만 아니라 번역 생성물의 아미노산 서열을 나타낸다.

서열 식별 번호: 4는 번역 생성물의 아미노산 서열을 나타낸다.

“proNGF”란 용어는 N 말단에 프로서열이 결합된 β-NGF를 의미한다. 본 발명에 따라, 상기 프로서열로서 전체 프로서열(미국 특허 제 5,683,894 호; Ullrich, A., et al., Nature 303(1983) 821; SWISS-PROT 단백질 서열 데이터 베이스 P01138 번), 또는 그의 일부, 바람직하게는 완전한 영역을 사용할 수 있다. 문헌[Suter et al., EMBO J. 10, 2395(1991)]에서는 쥐 β-NGF의 프로펩티드의 생체 내 기능을 COS-7 세포 배양 시스템에서 정확한 분비를 근거로 상세히 연구하였다. 이를 위해서, 상기 프로서열을 5 개의 부분으로 분할하였다. 이들 서열 중 하나 이상이 결실된 돌연변이체를 제조하였다. 아미노산-52 내지 -26(“영역 I”)뿐만 아니라 -6 내지 -1(“영역 II”)을 함유하는 서열 부분들은 생물학적으로 활성인 β-NGF의 발현 및 분비에 필수적이다. 영역 I은 발현에 필수적인 반면, 영역 II는 정확한 단백질분해 과정에 필요하다. 놀랍게도, proNGF는 β-NGF와 유사한 생체 내 활성을 갖는 것으로 나타났다. 따라서, proNGF를 또한 치료제로서도 사용할 수 있다.

불충분한 용해도를 나타내는 불활성 proNGF는 원핵 세포의 시토졸에서 상기 단백질의 과발현 중에 형성된다. 이 경우에, 재조합에 의해 제조된 proNGF는 불용성의 집합된 형태로 세포질에 남아있는다. 이들 단백질의 집합, 단리 뿐만 아니라 정제가 예를 들어 문헌[Marston, F.A., Biochem. J. 240(1986)]에 개시되어 있다. 이들 불활성 단백질 집합체(봉입체)를 단리시키기 위해서, 원핵 세포를 발효 후에 파괴시킨다.

세포 파괴는 통상적인 방법으로, 예를 들어 초음파 처리, 고압 분산 또는 리소자임에 의해 수행될 수 있다(Rudolph, R., et al. (1997); Folding proteins In: Creighton, T.E.(ed.); Protein Function: A Practical Approach. Oxford University Press, pp. 57-99). 상기를 바람직하게는 pH를 중성에서 약산성으로 조절하기에 적합하고 현탁 매질, 예를 들어 0.1 몰/ℓ 트리스/HCl로서 작용하는 완충액에서 수행한다. 세포 파괴 후에, 불용성 성분들(봉입체)을 임의의 적합한 방식으로, 바람직하게는 원심분리 또는 여과에 이어서 상기 IB를 완전하게 남기지만 외래 세포 단백질은 용해시킬 수 있는 시약에 의한 하나 이상의 세척 단계에의해, 예를 들어 물 또는 포스페이트 완충액 중에서 임의로 Brij(등록상표)와 같은 순한 세제를 가하여 세척함으로써 제거한다. 그 후에, 상기 불용성 분획(펠릿)에 본 발명에 따른 용해 및 결합 방법을 가한다.

분리제로서, 편의상 봉입체 단백질의 용해에 대개 사용되는 분리제를 사용한다. 바람직하게는 구아니디늄 하이드로클로라이드 및 다른 구아니디늄 염, 예를 들어 티오시아네이트뿐만 아니라 우레아 및 그의 유도체가 사용된다. 더욱 또한, 이들 분리제의 혼합물을 사용할 수도 있다.

분리제의 농도는 분리제의 유형에 따라 다르며 숙련가에 의해 쉽게 결정될 수 있다. 분리제의 농도(분리 농도)는 용해도가 불충분한 분리된 단백질의 완전한 용해가 이루어질 수 있다면 충분한 것이다. 구아니디늄 하이드로클로라이드에 대해서, 이들 농도는 대개 3 내지 8 몰/ℓ, 바람직하게는 5 내지 7 몰/ℓ이다. 우레아의 경우, 농도는 대개 6 내지 10 몰/ℓ의 범위이다. 약한 분리 용액은 단백질에 정확한 디설파이드 결합을 형성시킬 수 있으며, 이에 의해 상기 단백질의 고유의 3 차 구조를 형성시킬 수 있는 농도로 분리제를 함유하는 용액이다. 바람직하게는, 강한 변성 용액과 약한 변성 용액은 그의 농도에 있어서 100 배 이상 차이가 난다.

더욱 또한, 봉입체 단백질의 완전한 단량체화를 위해서 용해 과정 중에 환원제, 예를 들어 디티오쓰레이톨(DTT), 디티오에리쓰리톨(DTE) 또는 2-머캅토에탄올을 10 내지 400 mM, 특히 바람직하게는 20 내지 100 mM의 농도로 또한 가하는 것이 유리하다.

용해에 이어서, 바람직하게는 임의로 존재할 수도 있는 환원제를 제거하기 위해서 분리 농도의 분리제를 함유하는 용액에 대해 투석을 수행한다. 편의상, 투석을 수행하는 용액은 분리 용액 중에 존재하는 것과 동일한 농도로 분리제를 함유한다.

본 발명의 방법에 따른 후속의 결합을 중성 내지 알칼리성 범위의 pH, 바람직하게는 pH 7 내지 10, 특히 바람직하게는 pH 7.5 내지 9.5에서 수행한다. 완충액으로서, 임의의 통상적인 완충제를 사용할 수 있다. 바람직하게는, 당해 분야의 숙련가들에게 공지된 완충제, 예를 들어 트리스 또는 포스페이트 완충제를 재생제로서 사용한다. 분리된 단백질을 재생 완충제로 옮기기 위해서, 용해된 단백질을 재생 완충제로 희석하거나 또는 상기 재생 완충제에 투석시킨다. 이에 의해, 상기 분리제의 농도가 또한 희석되어(약한 분리 용액) 상기 단백질의 추가의 분리가 일어나지 않는다. 상기 분리제 농도의 초기 감소 도중에 이미 재생 과정이 일어날 수도 있다. 단백질이 실질적으로 용액 중에 남아있도록 단백질을 분리시키지 않거나 단지 약하게 분리시키는 용액으로 전달하는 조건을 적절히 선택해야 한다. 편의상, 이는 서서히 연속적으로 또는 단계적으로 희석시킴으로써 수행될 수 있다. 분리제를 단백질이 가능한 한 완전히 결합되거나 분리제가, 예를 들어 투석에 의해 거의 완전히 제거되는 방식으로 희석하는 것이 바람직하다.

바람직하게는, 결합을 결합 시의 수율에 긍정적인 효과를 갖는 저 분자량 보조제의 존재 하에서 수행한다. 이러한 보조제의 예가 미국 특허 제 5,593,865호에 개시되어 있다. 결합 중에 저 분자량 보조제로서 특히 바람직한 것은 아르기닌으로, 0.2 내지 1.5 M의 농도가 편리하다.

본 발명의 방법에 따라, 결합을 바람직하게는 환원 및 산화된 형태의 티올 성분을 첨가하여 수행한다. 바람직한 티올 성분으로는 환원(GSH) 및 산화된 형태(GSSG)의 글루타치온, 시스테아민 및 시스타민, 시스테인 및 시스틴 또는 2-머캅토에탄올 및 2-하이드록시 에틸디설파이드가 있다. 이들 티올 시약들을 환원 및 산화된 형태로 가함으로써, 재생 중에 중첩된 폴리펩티드 쇄 내에 디설파이드 결합을 형성시킬 수 있을 뿐만 아니라 상기 중첩된 폴리펩티드 쇄 내부 또는 상기 쇄들 간에 바르지 못한 디설파이드 결합을 “개편”시킬 수 있다(상기 중의 Rudolph et al., 1997).

편의상, 본 발명에 따른 방법을 결합 과정 동안 저온(바람직하게는 약 10 ℃)에서 수행한다. 본 발명에 따른 방법 중에 재생은 0.5 내지 5 시간, 바람직하게는 1 내지 2 시간 동안 수행한다.

공기 중에 존재하는 산소에 의한 환원제의 산화를 방지하고 유리 SH 그룹을 보호하기 위해서 착화제, 예를 들어 EDTA를 1 내지 20 mM, 특히 바람직하게는 약 10 mM의 양으로 가하는 것이 편리하다.

“β-NGF의 활성”이라는 용어는 β-NGF의 생물학적 활성을 의미한다. 생물학적으로 활성인 β-NGF는 이량체의 형태로 존재한다. 상기 활성을 DRG 분석(후근 신경절 분석)(Levi-Montalcini, R., et al., Cancer Res. 14(1954) 49, and Varon, S., et al., Meth. in Neurochemistry 3(9172) 203)에 따라 측정할 수있다. 상기 분석에서는, 병아리 태아로부터 분리된 후근 신경절의 감각 뉴런에 대한 자극 및 생존을 신경돌기 형성에 의해 감시한다.

프로서열은 성숙한 단백질과 별도의 영역이다. 이들 2 개 영역 사이에 노출된 프로테아제 절단 부위가 있다. 이러한 절단 부위는 적합한 프로테아제에 의해 특이적으로 프로세스될 수 있다. 예를 들어, 트립신은 염기성 아미노산, 예를 들어 리신 또는 아르기닌의 뒤를 절단한다. proNGF 대 트립신의 비를 적합하게 조절하면, 정확하게 중첩된 성숙한 단백질은 상기 프로테아제에 의해 절단되지 않을 것이다. 대조적으로, 분리된 단백질 뿐만 아니라 중첩 중간체들은 프로테아제에 의해 공격받기 쉬운 서열을 노출시킨다. 트립신-형 기질 특이성을 갖는 프로테아제가 proNGF의 프로세스에 바람직하다. 이들 프로테아제는 단백질 분자의 활성 부분을 절단시키지 않으면서 상기 단백질을 절단한다. 트립신-형 프로테아제로서 다수의 세린 프로테아제들(예: 트립신 자체 또는 γ-NGF)이 고려된다. 바람직하게는 트립신이 사용된다. 제한된 단백질 분해를 위해서, 단백질을 1:40 내지 1:2500(트립신:proNGF 비), 바람직하게는 1:40 내지 1:250의 질량 비로 사용한다. 단백질 분해를 0 내지 37 ℃, 바람직하게는 0 내지 20 ℃의 온도에서 1 분 내지 24 시간, 바람직하게는 1 내지 60 분의 배양 시간을 사용하여 수행한다. 완충제로서, 프로테아제의 활성을 억제하지 않는 완충제를 사용한다. 10 내지 100 mM 농도 범위의 포스페이트 및 트리스 완충제가 바람직하다. 제한된 단백질 분해를 프로테아제의 최적 pH 범위에서 수행하며, pH 7 내지 8의 매질이 바람직하다. 배양 시간이 종료된 후에, 특정한 억제제, 바람직하게는 1 내지 5 mM PMSF(페닐메틸설포닐플루오라이드) 또는 대두 트립신 억제제, 바람직하게는 트립신 0.1 내지 5 ㎎ 당 1 ㎎의 억제제를 가하거나, 또는 산, 바람직하게는 HCl의 첨가에 의해 pH를 2 내지 3으로 감소시킴으로써 단백질 분해를 중단시킨다(Rudolph, R., et al., (1997); Folding proteins. In: Creighton, T.E.(ed.): Protein Function: A Practical Approach. Oxford University Press, pp. 57-99; 미국 특허 제 5,683,894 호).

하기 실시예, 간행물 및 도면은 본 발명을 추가로 예시하며, 본 발명의 범위는 청구의 범위로부터 명백하다. 개시된 방법들은 본 발명의 목적을 예시하고 개시하고자 하는 것이며, 또한 변화가 동반되기도 한다.

실시예 1

이 콜라이 발현 벡터내로의 proNGF 암호화 cDNA의 클로닝

proNGF 구조물의 클로닝을 위해서, 노바겐(Novagen)의 T7 발현 시스템(Studier, F.U., et al., J. Mol. Biol. 189(1986) 113)을 선택하였다. proNGF를 암호화하는 DNA 서열은 강한 T7 전사 신호의 조절 하에 있다. 숙주 균주로서, 이 콜라이 BL21(DE3)을 사용한다. 염색체는 T7 RNA 폴리머라제 유전자를 함유한다. 상기 RNA 폴리머라제의 발현 및 이에 의한 proNGF의 발현을 IPTG(이소프로필-β-D-티오갈락토시드)에 의해 유도한다.

인간 proNGF의 cDNA를 베링거 만하임(Boehringer Mannheim)의 벡터 pMGL-SIG-proNGF(PL No. 1905)로부터 PCR 증폭에 의해 수득하였다. 변이유발 프라이머를 사용하여 proNGF를 암호화하는 DNA 서열의 5' 말단에 NdeI 제한 부위를 도입시키고 3' 말단에 BamHI 제한 부위를 도입시켰다. PCR 산물을 벡터 pET11a(노바겐)의 중복 클로닝 부분의 NdeI/BamHI 제한 부위내로 삽입시켰다(도 1).

하기의 프라이머들을 PCR에 사용하였다:

전방 프라이머 “FwProNGF”:

5'-CG GAA TTCCA｜T ATGGAA CCA CAC TCA GAG AGC-3'(서열번호: 1)

Met Glu Pro His Ser Glu Ser

역 프라이머 “RevNGF”:

5'-CC G｜GA TCC TTA TCA TCT CAC AGC CTT TCT AGA-3'(서열번호: 2)

stop stopArg Val Ala Lys Arg Ser

벡터내로 클로닝시킨 후에, 뉴클레오티드 서열을 DNA 서열화에 의해 확인하였다.

실시예 2

a) 이 콜라이에서의 인간 proNGF의 발현

재조합 세균 균주의 배양을 위해서, 밤새 배양액을 제조하였다. 이를 위해서, 적합한 부피의 LB 배지에 100 ㎍/㎖의 암피실린 및 50 ㎍/㎖의 가나마이신을 가하였다.

LB 배지(1 ℓ): 트립신 10 g, 효모 추출물 10 g, NaCl 5 g

상기 배지에 단일 콜로니를 접종하고 37 ℃에서 밤새 교반하였다. 다음날 아침, 100 ㎍/㎖의 암피실린 및 50 ㎍/㎖의 가나마이신을 함유하는 목적하는 부피의 2xYT 배지에 상기 밤새 배양액을 1:100의 비(v/v)로 접종하였다. 상기 배양액을 OD₆₀₀이 0.5 내지 0.8에 도달할 때까지 37 ℃ 및 200 내지 250 rpm에서 교반하였다. 그 후에, proNGF의 발현을 동일한 온도에서 4 시간 동안 3 mM IPTG에 의해 유도하였다. 후속적으로, 원심분리에 의해 세포들을 수확하고, 즉시 파괴하거나 -70 ℃에서 냉동 보관하였다.

2xYT 배지(1 ℓ): 트립톤 17 g, 효모 추출물 10 g, NaCl 5 g

b) IB의 단리

세균 세포에서, 재조합 단백질은 집합체의 형태로 존재한다. 이들 “봉입체”의 제조를 문헌[Rudolph, R., et al. (1987); Folding proteins. In: Creighton, T.E.(ed.): Protein Function: A Practical Approach. Oxford University Press, pp. 57-99]에 따라 수행하였다.

세포 파괴를 위해서, 각각 5 g의 세포 펠릿을 25 ㎖의 100 mM 트리스/HCl(pH 7.0); 1 mM EDTA에 재현탁시켰다. 그 후에, 습윤 세포 질량 g 당 리소자임 1.5 ㎎을 가하고, 4 ℃에서 30 분간 배양하고, 후속적으로 세포들을 걸린(Gaulin) 세포 분쇄기를 사용하여 분쇄하였다. 이어서, MgCl₂3 mM 뿐만 아니라 DNase 10 ㎍/㎖을 조 균질물에 가하고 25 ℃에서 30 분간 배양하였다. DNase 절단 후에 불용성 세포 성분들을 0.5 부피의 60 mM EDTA, 6% 트리톤 X-100, 1.5 M NaCl(pH 7.0)을 가하여 용해시키고, 이어서 4 ℃에서 30 분간 배양하였다. 13,000 rpm에서 10 분간 원심분리시켜 IB를 수거하였다. 그 후에, 이를 매번 100 ㎖의 100 mM 트리스/HCl(pH 7.0); 20 mM EDTA로 4 회 세척하고 -20 ℃에서 보관하였다.

이와 같은 방식으로, 약 4 g의 IB 펠릿을 이 콜라이 배양액 10 ℓ(약 44 g의 습윤 세포 중량)로부터 재현적으로 수득할 수 있다. 상기 제제는 항상 대략 90 내지 95%의 rh proNGF를 함유하였다(도 2).

실시예 3

a) IB의 용해

IB 펠릿 400 ㎎을 용해 완충제(100 mM 트리스/HCl pH 8.0; 6 mM GdmCl; 100 mM DTT; 10 mM EDTA) 2 ㎖에 현탁시키고, 25 ℃에서 2 시간 동안 배양하고 냉장실에서 13,000 rpm에서 30 분간 원심분리시켰다. 그 후에, 상등액을 제거하고 1 M HCl을 사용하여 pH 3 내지 4로 조절하였다. 용해된 물질을 각각 300 ㎖의 6 M GdmCl pH 4.0, 10 mM EDTA에 대해 3 회, 즉 25 ℃에서 2 시간 동안 2 회 및 냉장실(12 ℃, 16 시간 내지 18 시간)에서 밤새 1 회 투석시켰다. 이어서 단백질 농도를 문헌[Bradford, M.M., Anal. Biochem. 72(1976) 248]의 방법을 사용하여 측정하였다. rh proNGF의 농도는 40 내지 50 ㎎/㎖이었다.

b) rh proNGF 재생의 최적화

실시예 3a)에서 제조된 용해된 물질로부터 생물학적으로 활성인 rh proNGF를 제조하기 위해서, 상기 물질을 다양한 재생 완충제로 희석하였다. 최적 중첩 조건을 결정하기 위해서, 하기 변수들을 나열된 순서로 변화시켰다:

a) 온도 및 시간

b) pH

c) 아르기닌 농도

d) GSH/GSSG 농도

e) GdmCl 농도

f) 단백질 농도

결과들을 표 1 및 2뿐만 아니라 도 2a 내지 2f에 나타낸다. 중첩 샘플 중의 재생된 proNGF의 양을 RP-HPLC에 의해 측정하였다. 이를 위해서, 각각의 중첩 샘플 925 ㎕을 예정된 시점에서 회수하고 32% HCl 75 ㎕로 처리하여 중첩 반응을 중단시켰다. RP-HPLC 분석을 위해서, 포로스 10 R1 HPLC 컬럼 및 벡크만 골드 HPLC 시스템(용매 모듈 125 NM, 탐지기 168, 자동샘플러 507 및 분석 소프트웨어 “골드 V 8.10” 사용)을 사용하였다. 수득된 용출 피이크를 “피이크합치” 프로그램 버전 2.01을 사용하여 합치시켰다. 수율의 정량적인 측정을 위해서, 정제된 고유 rh proNGF를 사용하여 표준 그래프를 작성하였다. rh proNGF IB는 매우 순수하기 때문에, 재생 샘플에 사용된 단백질의 총량은 상기 정량 분석을 위한 rh proNGF의 양과 동등하였다. 측정 결과는 각각 2 회 측정치의 평균값이다.

rh proNGF 중첩 중의 최적 온도 및 최적 시간의 측정
온도[℃]	전체 수율[%]	대략 하기 시간 후에 추가의 증가가 없음	속도 상수k[s^-1]
4	25.8	3.3 시간	2.569 x 10^-4s^-1
10	29.0	1.6 시간	4.865 x 10^-4s^-1
15	22.4	1.1 시간	6.399 x 10^-4s^-1
20	12.0	1.0 시간	1.065 x 10^-4s^-1
25	11.4	0.8 시간	1.935 x 10^-4s^-1
각각의 재생 샘플 중의 단백질 농도는 50 ㎍/㎖이었다. 중첩 완충제는 100 mM 트리스/HCl pH 9.5; 1 M L-아르기닌; 5 mM GSH; 1 mM GSSG; 5 mM EDTA로 이루어졌다. 일련의 측정을 수회 수행하였고 지수 함수를 사용하여 합치시켰다. 2 회 측정치의 평균 값을 나타낸다.

rh proNGF의 중첩에 대한 다양한 농도의 GSH/GSSG의 효과(GSH=환원된 글루타치온; GSSG=산화된 글루타치온)
샘플 번호	GSH/GSSG[mM]의 비	수율[%]
1	5/0.5	37.7
2	5/1	35.0
3	5/5	34.0
4	5/2.5	33.1
5	1/1	29.4
6	5/10	27.6
7	5/20	26.0
8	2.5/1	22.1
9	10/1	21.2
10	1/5	18.9
11	20/1	10.9
12	0/1	9.85
13	0/0	0
14	5/0	0
사용된 재생 완충제는 100 mM 트리스/HCl pH 9.5; 1 M L-아르기닌; 5 mM EDTA이었다. 중첩 시간은 10 ℃에서 3 시간이었다. 개별적인 중첩 샘플을 수율이 감소하는 순서로 나타낸다. 2 회 연속 측정치의 평균값을 나타낸다.

c) 예비 규모의 rh proNGF의 재생

rh proNGF를 중첩 완충제(100 mM 트리스/HCl pH 9.5; 1 M L-아르기닌; 5 mM GSH; 0.5 mM GSSG; 5 mM EDTA)로 희석하여 재생시켰다. 중첩을 50 ㎍/㎖의 단백질 농도로 수행하였다. 재생 샘플을 10 ℃에서 3 시간 동안 배양하였다.

d) 이온 교환 크로마토그래피에 의한 정제

재생된 물질을 10 ℓ의 50 mM Na-포스페이트 pH 7.0; 1 mM EDTA(IEX 완충제 A)에 투석시키고 20,000 rpm에서 30 분간 원심분리시켰다. 상등액을 포로스 20 HS 컬럼에 걸고 염 구배(IEX 완충제 B: 50 mM Na-포스페이트 pH 7.0, 1 M NaCl, 1 mM EDTA)를 사용하여 용출시켰다. 단백질이 980 mM NaCl에서 용출되었다(도 3). 비-고유 rh proNGF는 단지 분리 조건에 의해서 상기 컬럼으로부터 제거될수 있다.

실시예 4

rh proNGF의 특성화

a) UV 분광광도 측정법에 의한 농도 및 분자량의 측정

정제된 샘플 중의 rh proNGF의 농도를 측정하기 위해서, 샘플로부터 240 내지 340 ㎚의 UV 스펙트럼을 취하고 50 mM Na-포스페이트 pH 7.0, 1 mM EDTA에 대해 투석시켰다(도 5; 상기 스펙트럼을 벡크만 DU 640 분광 광도계를 사용하여 얻었다). 샘플 중의 rh proNGF 농도를 280 ㎚에서의 흡광도에 의해 측정하였다. 상기 평가는 25,680 ℓ/(몰 x ㎝)의 이론적인 몰 흡광 계수(문헌[Gill, S.C., et al., Anal. Biochem. 182(1989) 319]에 따라 계산된 것임)와 24,869 Da/단량체의 분자량(ExPASy 프로그램 “pI/Mw”에 의해 계산되고 3 개의 디설파이드 결합에 대해 보정된 것임)을 근거로 하였다. 스펙트럼을 사용하여 얻어진 값들은 브래드포드(Bradford) 방법에 의해 측정된 농도와 밀접한 상관이 있었다. 분자량 측정을 전자 분무 질량 분광측정법에 의해 수행하였다. 재조합 proNGF의 이론적 질량은 24,869 Da이다. 실험적으로 측정된 값은 24,871 Da이었다.

b) SDS 폴리아크릴아미드 겔 전기영동법을 사용한 순도 분석 및 분자량 측정

15% 폴리아크릴아미드 겔을 사용하였다. 각각의 샘플은 1%(v/v) 2-머캅토에탄올을 함유하였다. SDS 겔에서, 재조합 인간 proNGF는 예상보다 약간 더 큰 겉보기 분자량, 대략 30 kDa(24.8 kDa 대신에)을 나타낸다(도 2).

c) IEX-HPLC에 의한 순도 분석

단백질 24 ㎍(0.48 ㎎/㎖의 rh proNGF를 함유하는 샘플 50 ㎕)을 50 mM Na-포스페이트 pH 7.0; 1 mM EDTA로 평형화시킨 포로스 20 HS 컬럼(125 ×4 ㎜)에 걸고, 10 분의 기간 동안 0 내지 100% B(B=50 mM Na-포스페이트 pH 7.0; 2 M NaCl; 1 mM EDTA)의 선형 구배를 사용하여 5 ㎖/분의 유속으로 용출시켰다. 280 ㎚에서의 흡광도를 검출에 사용하였다(분석 소프트웨어 Chromeleon version 3.14를 사용하는 Gyncotek HPLC 시스템).

d) RP C4 HPLC를 사용한 순도 분석

rh proNGF 3.1 ㎍(0.21 ㎎/㎖ 농도의 rh proNGF 15 ㎕)을 0.13% TFA로 평형화시킨 포로스 10 R1 컬럼(100 ㎜ ×4 ㎜; Perseptive Biosystems)에 걸었다. 단백질을 33 분의 기간 동안 비-선형 구배(0 내지 4 분: 6% B; 4 내지 9 분: 6 내지 30% B; 9 내지 24 분: 30 내지 69% B; 24 내지 25 분: 69 내지 100% B; 25 내지 30 분: 100% B)를 사용하여 0.8 ㎖/분의 유속으로 용출시켰다. 용출제 B로서 80%(v/v) 아세토니트릴 중의 0.1%(v/v) TFA를 사용하였다. 220 ㎚에서의 흡광도를 검출에 사용하였다(분석 소프트웨어 “Gold V 8.10”을 사용하는 벡크만 “Gold” HPLC 시스템). 고유 rh proNGF가 14.28 분의 유지 시간에서 단일 피이크로 용출되었다(도 7).

e) N 말단 서열의 분석

N 말단 서열 분석을 위해서, RP HPLC에 의해 대충 정제된 용해된 IB를 사용하였다. N 말단 서열을 어플라이드 바이오시스템스(Applied Biosystems) 476A단백질 서열화 장치를 사용하여 측정하였다. 하기의 아미노산 서열을 얻었다: HN-Met-Glu-Pro-His-Ser-Glu-Ser-Asn-Val

f) 재조합 인간 proNGF의 생물학적 활성

rh proNGF의 생리학적 활성을 DRG 분석(=후근 신경절 분석)(Levi-Montalcini, R., et al., Cancer Res. 14(1954) 49, and Varon, S., et al., Meth. in Neurochemistry 3(9172) 203)을 사용하여 측정하였다. 상기 분석에서, 7 내지 8 일된 병아리 태아로부터 분리된 후근 신경절의 감각 뉴런에 대한 자극 및 생존을 신경돌기의 형성에 의해 측정한다. 상기 rh proNGF 샘플을 배양 배지를 사용하여 0.019 내지 20.00 ng/㎖의 농도로 조절하였다. 시험 샘플 당 15,000 개의 뉴런을 사용하였다. 37 ℃에서 48 시간 동안 배양시킨 후에 생존 세포의 수를 측정하였다. 기지 농도의 rh β-NGF 용액을 기준 샘플로서 사용하였다. 정량적인 평가는 소의 EC₅₀값, 즉 뉴런의 1/2의 생존을 조장하는 NGF의 농도를 근거로 한다. rh proNGF에 대해서 0.369 ng/㎖의 EC₅₀값이 얻어졌다. 대조적으로, rh β-NGF에 대해 얻어진 EC₅₀값은 0.106 ng/㎖이었다. 상이한 분자량의 rh β-NGF 및 rh proNGF를 고려하는 경우, 성숙한 rh β-NGF의 생물학적 활성은 rh proNGF 활성의 약 2 배로 높다.

실시예 5

a) rh proNGF의 제한된 단백질 분해에 의한 생물학적으로 활성인 성숙한 rh β-NGF의 제조

인간 proNGF는 프로서열의 최종 아미노산으로서 아르기닌 잔기를 함유한다. 따라서, 상기 전구체로부터 성숙한 rh β-NGF를 트립신과 같은 적합한 기질 특이성을 갖는 프로테아제를 사용하여 제한된 단백질 분해에 의해 생체 외에서 수득할 수도 있다.

정제된 rh proNGF 500 ㎕를 50 mM 트리스/HCl pH 8.0에 대해 투석시켰다. 투석에 이어서, UV 스펙트럼을 실시하여 0.49 ㎎/㎖의 단백질 농도를 측정하였다. 절단 샘플 당 proNGF 20 ㎍을 사용하였다. 단백질 분해 후에, 상기 샘플 3 ㎍(6 ㎕에 해당함)을 SDS PAGE에 의해 분석하였다. 트립신 모액으로서 각각 0.1 ㎍/㎖ 또는 0.01 ㎍/㎖을 사용하였다. 대두 트립신 억제제(STI)의 농도는 1 ㎎/㎖이었다. 상기 2 개의 단백질 모두 동결건조된 분말의 형태로 제공되었으며(제조사: 각각 베링거 만하임 및 시그마 사) 상기 언급한 완충제에 용해시켰다.

제한된 단백질 분해에 상이한 질량 비의 트립신/rh proNGF를 사용하였다(표 3을 참조하시오). 얼음 상에서 30 분간 배양시킨 후에, 각각의 반응을 STI 5 ㎍으로 중단시켰다. 대조를 목적으로 프로테아제가 첨가되지 않은 rh proNGF를 또한 얼음 상에서 배양시킨 다음 STI를 가하였다.

트립신:rh proNGF의 비	M(트립신)[㎍]	V(트립신)[㎕]	V(rh proNGF)[㎕]	V(STI)[㎕]
1:40	0.5	5(0.1 ㎍/㎖)	40	5
1:100	0.2	2(0.1 ㎍/㎖)	40	5
1:250	0.08	0.8(0.1 ㎍/㎖)	40	5
1:500	0.04	4(0.01 ㎍/㎖)	40	5
1:1000	0.02	2(0.01 ㎍/㎖)	40	5
1:2000	0.01	1(0.01 ㎍/㎖)	40	5
1:2500	0.008	0.8(0.01 ㎍/㎖)	40	5
대조군	-	-	20	2.5

g) N 말단 서열화에 의한 절단 생성물의 분석

트립신:rh proNGF의 질량비가 a) 1:40; b) 1:100 및 c) 1:250인 절단 샘플에 대해서 N 말단 서열화에 의해 보다 세부적인 분석을 수행하였다. 13 kDa 밴드는 여러 종들을 함유하였다(도 8):

N 말단 1: Met^-104....;

N 말단 2: Val^-35....;

N 말단 3: Ser^-1....(성숙한 rh β-NGF);

N 말단 4: Gly¹⁰.....

이들 펩티드는 상이한 양으로 상이한 샘플들에 존재하였다.

샘플 a): N 말단 2:N 말단 3:N 말단 4=4:5:2.

샘플 b): N 말단 2:N 말단 3=1:1; N 말단 4는 미량 존재함.

샘플 c)를 RP C3 HPLC(컬럼: Nucleosil 500-5 C3-PPN; 125 ㎜ x 4 ㎜)에 의해 또한분석하였다. 2 개의 피이크가 얻어졌다: 피이크 1(12.32 분): N 말단 1; 피이크 2(14.88 분): N 말단 2 및 N 말단 3의 비는 2:3이었다.

예비 규모로 rh proNGF로부터 성숙한 rh β-NGF를 수득하기 위해서, rh proNGF(50 mM 트리스/HCl pH 8.0 중의 것; 농도 0.46 ㎎/㎖) 1.3 ㎎을 트립신과 함께 1:250(트립신:rh proNGF)의 질량비로 가하였다. 상기 샘플을 얼음 상에서 30 분간 배양시켰다. 그 후에, 프로테아제를 대두 트립신 억제제의 질량을 기준으로 40 배 과잉량으로 불활성화시켰다. 절단 샘플을 50 mM 나트륨 포스페이트 pH 7.0, 1 mM EDTA에 투석시키고 이어서 양이온 교환 컬럼(포로스 20 HS 1.7 ㎖; Perseptive Biosystems)에 걸었다. 0 내지 2 M NaCl의 선형 염 구배에서, 절단 생성물이 단일 구배로 용출되었다. 약 840 mM NaCl의 염 농도에서의 용출은 대조용 실험에서 성숙한 rh β-NGF에 상응하였다. 정제된 절단 생성물의 수율은 17%이었다.

정제된 절단 생성물의 생물 활성을 DRG 분석에 의해 시험하였다. 이는 성숙한 rh β-NGF의 활성에 상응하였다(표 4).

종들	EC₅₀값[pg/㎖]
rh β-NGF	110
rh proNGF의 제한된 단백질분해에 의해 제조된 rh β-NGF	171

참고 문헌

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WO 97/47735

Yankner, B.A. et al., Annu. Rev. Biochem. 51(1982) 845

Claims

원핵 세포에서 재조합 제조 후에 수득할 수 있는 불충분한 용해도를 갖는 불활성 프로 형태로부터 생물학적으로 활성인 β-NGF를 제조하는 방법으로, 상기 불충분한 용해도를 갖는 불활성 형태의 proNGF를 분리(denaturing) 농도의 분리제 용액에 용해시키고, 그 후에 분리시키지 않거나 약하게 분리시킴으로써 용해도를 유지시키며 상기 분리된 proNGF가 고유 β-NGF 중에 존재하는 디설파이드 결합에 의해 측정시 생물학적으로 활성인 형태를 취하는 용액으로 옮기고, 후속적으로 프로서열을 절단시킴으로써 단리될 수 있는 활성 β-NGF를 수득하는 방법.
제 1 항에 있어서, 분리시키지 않거나 약하게 분리시키는 용액이 아르기닌을 함유하는 방법.
제 2 항에 있어서, 아르기닌의 농도가 0.2 내지 1.5 몰/ℓ인 방법.
제 1 항 내지 제 3 항 중 어느 한 항에 있어서, 결합(naturation)을 환원 및 산화된 형태의 티올 성분의 존재 하에서 수행하는 방법.
제 1 항 내지 제 4 항 중 어느 한 항에 있어서, 프로서열의 절단을 아르기닌 아미노산의 뒤를 절단하는 기질 특이성을 갖는 프로테아제에 의해 수행하는 방법.
제 5 항에 있어서, 프로테아제로서 트립신을 사용하는 방법.
제 1 항 내지 제 6 항 중 어느 한 항에 있어서, 구아니디늄 하이드로클로라이드 또는 우레아를 분리제로서 사용하는 방법.