BRPI9914393B1

BRPI9914393B1 - Método para a preparação de pro-ngf biologicamente ativo, bem como uso de pro-ngf recombinante

Info

Publication number: BRPI9914393B1
Application number: BRPI9914393-3A
Authority: BR
Inventors: Rainer Rudolph; Anke Rattenholl; Elisabeth Schwarz; Adelbert Grossmann
Original assignee: Wacker Chemie Ag
Priority date: 1998-10-09
Filing date: 1999-10-11
Publication date: 2021-06-22

Abstract

MÉTODO PARA A OBTENÇÃO DE BETA-NGF ATIVO. A invenção refere-se a um método para a produção de beta-NGF biologicamente ativo oriundo da pró-forma proNGF. Depois da expressão da pró-forma do beta-NGF em uma célula de hospedeiro procariótica, a proteína recombinante é isolada na forma de agregados insolúveis (corpos de inclusão). Depois da sua solubilização em um agente de desnaturação forte e a sua conversão subseqüente na conformação natural, que é determinada pelas pontes de dissulfeto presentes no beta-NGF natural, beta-NGF biologicamente ativo é obtido por liberação por ruptura subseqüente da pró-seqüência.

Description

A presente invenção se refere a um método para a preparação de beta-NGF por naturação de proNGF inativo desnaturado e clivagem da pro seqüência.

Fator de crescimento de nervo (beta-NGF) é um fator neurotrófico necessário para o crescimento e sobrevivência de neurônios (Levi-Montalcini, R., Science 237 (1987) 1154; Thoenen, H., e outros, Physiol. Ver. 60 (1980) 1284). Além disso, beta-NGF promove o crescimento, a diferenciação e a vitalidade de neurônios colinérgicos do sistema nervoso central (Hefti, F. J., J. Neurobiol. 25 (1994) 1418). Indicações terapêuticas possíveis para fator de crescimento de nervo de ser humano recombinante incluem neuropatias sensórias, por exemplo, associadas a diabetes ou como um efeito colateral possível em terapia de AIDS. Outras indicações para rh beta-NGF são neuropatias centrais, por exemplo, Doença de Alzheimer. Neste caso, a perda de memória é o resultado de uma perda de neurônios colinérgicos.

Beta-NGF de ser humano é traduzido como uma preproteína que consiste em 241 aminoácidos. O peptídeo (18 aminoácidos) é removido por clivagem durante o deslocamento para dentro de retículo endoplásmico (ER), enquanto a pró-proteína resultante é subseqüentemente processada em seu terminal N e C (remoção da pró-seqüência (103 aminoácidos) e pelo menos dois aminoácidos). Portanto, NGF de ser humano maduro contém 118 aminoácidos. Ele demonstra homologia para beta-NGF maduro e difere desta proteína apenas por trocas de 12 aminoácidos. Para a condução de estudos clínicos ou um possível uso como terapêutica, os beta-NGFs devem estar disponíveis em altas quantidades. Uma fonte natural de quantidades mais altas deste fator são as glândulas submaxilares em camundongos. Estas preparações, no entanto, são misturas heterogêneas de dímeros diferentes e são inadequadas para o uso terapêutico. Além disso, é desejável administrar a forma humana da proteína aos pacientes. Em tecido humano, no entanto, fatores neurotróficos estão presentes apenas em concentrações diminutas.

Portanto, usar beta-NGF como um agente íerápêuticô da prêpa*- * ração da proteína por meio de recombinação é a única possibilidade. Isto pode ser conseguido de duas maneiras: por uma expressão recombinante ou em culturas de célula ou em bactérias. Sistemas de expressão de célula eucariótica tendem a prover apenas quantidade muito pequena de proteína e são relativamente caros (Barnett, J., e outros, J. Neurochem. 57 (1991) 1052; Schmelzer, C. H. e outros, J. Neurochem. 59 (1992) 1675; patente U.S. N° 5.683.894).

Em contraste com isso, sistemas de expressão procarióticos provêem quantidades altas da proteína desejada. No entanto, em contraste com isso bactérias de sistemas de expressão eucarióticos são incapazes de processar proteínas precursoras de maneira correta. Como na expressão de muitos outros genes de mamíferos recombinantes, a produção de beta- NGFs recombinantes em bactérias resulta em um produto de tradução biologicamente inativo que é então acumulado na célula na forma de agregados (assim chamados corpos de inclusão (IBs)).

Naturação de beta-NGF maduro oriundo de tais corpos de inclusão, no entanto, é apenas possível no caso de concentrações de proteína muito baixas (abaixo de 10 μg/ml) e rendimentos muito baixos (até cerca de 10%). Tais métodos são, por exemplo, descritos na EP-A 0 544 293, na patente U.S. N° 5.606.031, na patente U.S. N° 5.235.043, bem como na WO 97/47735. A naturação via sulfitólise de fatores neurotróficos da família de NGF/BDNF é descrita na WO 95/30686.

Na WO 97/47735 é descrito um método aperfeiçoado para a naturação de proteínas. Neste método, a proteína inativa é dissolvida em uma solução de um agente de desnaturação tendo uma concentração de desnaturação na presença de uma substância de baixo peso molecular que contém grupos tiol. Mais tarde, a proteína dissolvida é transferida da solução de desnaturação forte para dentro de uma outra solução que não é ou é apenas fracamente desnaturante em que ela assume uma conformação bio-logicamente ativa em que as ligações de dissulfeto são abertas por meio do componente de tiol e subsequentemente são formadas recentemente na proteína de um modo que a proteína assume uma conformaçao^quê^temVti* * vidade biológica. Usando-se um método aperfeiçoado deste tipo, um rendimento de naturação de beta-NGF de cerca de 10% pode ser conseguido.

É um objetivo da presente invenção prover um método aperfeiçoado para a preparação de beta-NGF que é simples e provê NGF ativo em um alto rendimento.

Este objetivo foi resolvido por prover um método para a preparação de um beta-NGF biologicamente ativo por meio de naturação da pró- forma presente em sua forma inativa e tendo uma solubilidade muito pobre em que a pró-forma de preferência está disponível na forma de corpos de inclusão depois da preparação recombinante em procariótas, o dito método sendo caracterizado por dissolução de proNGF em sua forma inativa que tem uma solubilidade pobre em uma solução de um agente de desnaturação em uma concentração de desnaturação, transferência de proNGF para dentro de uma solução que não é ou é fracamente desnaturante mantendo-se a solubilidade aqui em que o proNGF desnaturado dissolvido assume uma conformação biologicamente ativa que é determinada pelas ligações de dis- sulfeto presentes no NGF nativo, e mais tarde remoção da pró-seqüência pelo que o NGF nativo é obtido o qual pode ser isolado.

Surpreendentemente, verificou-se que durante a naturação de"~ beta-NGF inativo in vitro a pró-seqüência tem um efeito positivo e essencial sobre o processo de naturação e de acordo com a presente invenção é pos- , sível realizar a renaturação do modo mais simples e desse modo conseguir l fornecimentos de beta-NGF ativo naturado que não era conhecido até agora J e não era considerado possível.

O termo "proNGF" significa beta-NGF que está ligado a sua pró- seqüência em seu terminal N. De acordo com a presente invenção, pode ser usado como a dita pró-seqüência ou a pró-seqüência inteira (a patente U.S. N° 5.683.984; Ullrich, A., e outros, Nature 303 (1983) 821; base de dados de seqüência de proteínas SWISS-PROT N° P01138) ou suas porções, de preferência domínios completos. Suter e outros, (EMBO J. 10, 2395 (1991)) realizaram um estudo detalhado da função in vivo do pró-peptídeo de beta-

NGF de camundongo com base na secreção correta em LHTT si§téma:d®*etíl-’ tura de célula COS-7. Para esta finalidade, a pró-seqüência foi dividida em cinco regiões. Mutantes foram preparados tendo deleções em uma ou mais destas seqüências. Verificou-se que as regiões de sequência contendo ami- noácidos -52 a -26 ("domínio I") bem como -6 a -1 ("domínio II") são essenciais para a expressão, e a secreção de beta-NGF biologicamente ativo. O domínio I é essencial para a expressão enquanto o domínio II é necessário para corrigir processamento proteolítico. Supreendentemente, verificou- se que proNGF tem uma atividade in vivo análoga a beta-NGF. Portanto, proNGF pode também ser usado como uma terapêutica. proNGF inativo que mostra um solubilidade pobre é formado durante a ultra-expressão da proteína no citosol de procariótas. Neste caso, proNGF preparado por recombinação permanece no citoplasma em uma forma insolúvel ou agregada. Estes agregados de proteína, o seu isolamento bem como sua purificação são descritos, por exemplo, em Marston, F. A., Biochem. J. 240 (1986). Para isolar estes agregados de proteína inativa, (corpos de inclusão) as células procarióticas são rompidas após a fermentação. v Rompimento de célula pode ser realizado por métodos conven- cionais, por exemplo, por meio de sonicação, dispersão de alta pressão ou lisozima (Rudolph, R., e outros (1997); Folding proteins. In: Creighton, T. E. (ed.): Protein Functional: A Praticai Approach. Oxford University Press, páginas. 57-99). Ele é de preferência realizado em uma solução de tampão adequada para ajustar um valor de pH neutro para fracamente ácido e que serve como um meio de suspensão, tal como 0,1 mol/l de Tris/HCI. Depois do rompimento de célula, os componentes insolúveis (corpos de inclusão) são removidos de qualquer modo adequado, de preferência por centrifugação ou filtração depois de uma ou mais etapas de lavagem com agentes que deixam IBs intactos mas possivelmente dissolvem proteínas celulares estranhas, por exemplo, em tampão de água ou de fosfato, opcionalmente com detergentes suaves adicionados tal como Brij®. Mais tarde a fração insolúvel <;(pélete}é submetida-ao. método de acordo com a presente invenção para solubilização e naturação.

Quan^o^ agente de desnaturação é convenientemente usado um agente de desnaturação é usualmente empregado na solubilização de proteínas de corpo de inclusão. Cloridrato de guanidínio e outros sais de guanidínio, tais como o tiocianato bem como uréia e seus derivados são de preferência usados. Além disso, misturas deste^agentes de desnaturaçao podem ser usadas.

A concentração do agente de desnaturação é dependente do tipo de agente de desnaturação e pode ser determinada facilmente pelo técnico versado. A concentração do agente de desnaturação (concentração de desnaturação) é suficiente se solubilização completa da proteína desnaturada tendo uma solubilidade pobre possa ser conseguida. Para cloridrato de guanidínio, estas concentrações usualmente estão na faixa de 3 a 8 moles/l, de preferência de 5 a 7 moles/l. Urnç solução de desnaturação fraca é uma —— . ... ——V solução que contém um agente de desnaturação em uma concentração que possibilita a formação das ligações de dissulfeto corretas na proteína e desse modo a formação de estrutura terciária nativa da proteína. De preferência, soluções de desnaturação fortes e fracas diferem em suas concentrações por um fator de 100 ou mais.

Além disso, para monomerização completa das proteínas de corpo de inclusão é vantajoso também adicionar durante a solubilização um < agente de redução tal como ditiotreitol (DTT), ditioeritritol (DTE) ou 2- mercaptoetanol em uma concentração de 10-400 mM e particularmente preferida em uma concentração de 20-100 mM.

Após a solubilização um^diáHs^é realizada, de preferência contra uma solução que contém um agente de desnaturação em uma concentração de desnaturação a Jim de remover o agente de reduçãq que pode opcionalmente estar presente. Convenientemente, a solução contra a qual é realizada diálise contém o agente de desnaturação na mesma concentração que presente na solução de desnaturação.

Naturação subsequente de acordo com o método da presente invenção é realizada em um^pH na faixa neutra até alcalin^, de preferência entre pH 7 e 10; particularmente preferida em uma;fabca dê‘pl-^entre* •?, 5’e* 9,5. Como as soluções de tampão, qualquer tampão convencional pode ser usado. De preferência, tampões conhecidos por aqueles versados na técnica tal como tampões de Tris ou de fosfato são usados como os agentes de ^desnaturação Para transferir a proteína desnaturada para dentro do tampão de renaturação, a proteína solubilizada ou é diluída no tampão de renatura- ção ou é dialisada contra tampão de renaturação. Desse modo, a concentração do agente de desnaturação é também diluída (solução de desnaturação fraca) de modo que nenhuma desnaturação ulterior da proteína ocorre. Já durante a redução inicial da concentração do agente de desnaturação um processo de renaturação pode ocorrer. As condições para transfêrencia da proteína para dentro da solução que não é ou é apenas fracamente desnatu- rante deve ser adequadamente selecionada para assegurar que a proteína substancialmente permaneça na solução. Convenientemente, isto pode ser conseguido por umavçliluição contínua lenta ou uma diluição por etapas.È preferido diluir o agente de desnaturação de um modo que a naturação da proteína seja tão completa quanto possível ou o agente de desnaturação seja quase totalmente removido, por exemplo, por diálise.

De preferência, naturação é realizada na presença de agentes auxiliares de baixo peso molecular tendo um efeito positivo sobre oTendr mento após a naturação. Tais agentes auxilaires são, por exemplo, descritos na patenté<U^S. N° 5.593.865^ Particularmente preferido como o agente auxiliar de baixo peso molecular durante a naturação é arginina, convenientemente em uma concentração de 0,2 a 1,5 M.

De acordo com o método da presente invenção, naturação é de preferência realizada por adição de uqTcomponente de tiopem sua forma reduzida ou oxidada. Componentes de tiol preferidos incluem glutationa na forma reduzida (GSH) e oxidada (GSSG), cisteamina e cistamina, cisteína e cistina ou 2-mecaptoetanol e 2-hidróxi etildissulfeto. Por adição destes reagentes de tiol em forma reduzida ou oxidada é possível conseguir a formação de ligações de dissulfeto dentro da cadeia de polipeptídeo de dobra- mento durante a renaturação bem como "rearranjamento" de ligações de dissulfeto erradas dentro ou entre as cadeias de polipepiídeôxlê^Dbrâmento*’’ (Rudolph e outros, 1997, loc. cit).

Convenientemente, o método de acordo com a presente invenção é realizado durante a naturação em baixas temperaturas (de preferência a cerca de 10°C). No curso do método de acordo com a presente invenção a renaturação é realizada por um período de 0,5 a 5 horas, de preferência de 1 a duas horas.

Para prevenir oxidação do agente de redução por oxigênio presente no ar e para proteger grupos SH livres é conveniente adicionar um agente de complexaçã^tal como EDTAyde preferência em uma quantidade de 1-20 mM, particularmente preferida a cerca de 10 mM.

O termo "atividade de beta-NGF" significa a atividade biológica de beta-NGF.ybeta-NGF biologicamente ativo existe na forma de umdímerojj A atividade pode ser determinada de acordo com o ensaio de DRG (ensaio de gânglio de raiz dorsal), Levi-Montalcini, R., e outros, Câncer Res. 14 (1954) 49, e Varon, S. e outros, Meth. em Neurochemistry 3 (9172) 203. Neste ensaio a estimulação e sobrevivência de neurônios sensórios oriundos de gânglios de raiz dorsal de embriões de pinto são monitoradas por meio de formação de neurito.

A pró-seqüência é um domínio separado da proteína madura. Entre estes dois domínios há um sítio de clivagem de protease exposto. Estes sítios de divagem podem ser especificamente processados por proteases adequadas. Por exemploí^tnpsin^ cliva depois de aminoácidos básicos tal como lisina ou arginina. Se a razão de proNGF para tripsina é apropria-) damente ajustada, a proteína madura, corretamente dobrada não será cliva- / da por esta protease. Em contraste com isso, proteínas desnaturadas bem ' como intermediários de dobramento expõem seqüências que são suscetíveis a um ataque pela protease. Proteases tendo uma especificidade de subs-"7 trato de tipo tripsina são preferidas para o processamento de proNGF. Estas proteases clivam a proteína sem digestão da porção ativa da molécula de proteína. Como as proteases de tipo tripsina, várias proteases de serina (por exemplo, a própria tripsina ou y-NGF) são consideradas. Tripsina é de prefe- rência usada. Para proteólise limitada, a proteína é iempregadá’ém cirhara-*’ zão de massa de 1:40 a 1:2500 (razão de tripsina:proNGF), de preferência em uma faixa de 1:40 a 1:250. A protggjjse é realizada usando-se um tempo de incubação de 1 m a 24 horas, de preferência de 1 a 60 minutos, em uma temperatura de 0°C a 37°C, de preferência de 0°C a 20°C. Uma vez que os tampões são usados tampões que não inibem a atividade da protease. Tampão de fosfato e de Tris em uma faixa de concentração de 10-100 mM são preferidos. A proteólise limitada é realizada na ótima faixa de pH da protease; um meio de pH 7-8 é preferido. Depois da conclusão do tempo de incubação a proteólise é parada ou por adição de um inibidor específico, de preferência PMSF a 1 a 5 mM (fluoreto de fenilmetilsulfonila) ou por inibidor de tripsina de soja, de preferência 1 mg por 0,1 a 5 mg de tripsina, ou por redução do pH para 2-3 por adição de um ácido, de preferência HCI (Rudolph, R., e outros (1997); Folding proteins. In; Creighton, T. E. (ed.): Protein Function: A Practical Approach. Oxford University Press, páginas. 57-99; a patente U.S. N° 5.683.894).

Os seguintes exemplos, publicações e figuras ulteriormente ilustram a presente invenção o escopo do qual é óbvio a partir das reivindicações anexas. Os processos descritos destinam-se a exemplificar e descrever o objetivo da presente invenção também após a modificação. A Figura 1 mostra o construto de plasmídio de proNGF pET11a- proNGF para a expressão de proNGF humano recombinante. A Figura 2 mostra uma cepa Coomassie de um gel de SDS PAGE (15%) de extratos brutos de cepa de E. coli BL21 (DE3) pET11a- proNGF/pUBS520 antes da e depois da indução, respectivamente, bem como de uma preparação de IB (SDS PAGE de acordo com Laemmli, RU, Nature 227 (1970) 680). U: extrato bruto antes da indução, I: extrato bruto depois de incubação de quatro horas, P: pélete de IB, S: sobrenadante solúvel. A Figura 2a mostra o efeito do valor de pH sobre o dobramento de rh proNGF a 10°C em Tris/HCI a 100 mM, L-arginina a 1 M, GSH a 5 mM, GSSG a 1 mM, EDTA a 5 mM. A concentração de proteína foi de 5 μg/ml, o período de dobramento foi de 3 horas. Os valores rrfédiós*cfe*duás series* de’ medição são mostrados. A Figura 2b representa o efeito de concentrações diferentes de L-arginina sobre o dobramento de rh proNGF. Renaturação ocorre em um pH de 9,5, as outras condições foram idênticas àquelas usadas em variação de pH. Os valores médios de duas séries de medição são mostrados. A Figura 2c mostra o efeito de diferentes concentrações de GSH sobre o dobramento de rh proNGF. A concentração de GSSG foi de 1 mM, a concentração de L-arginina 1 M. Os outros parâmetros de renaturação eram idênticos àqueles usados em variação de arginina. Os valores médios de duas séries de medição são mostrados. A Figura 2d mostra o efeito de diferentes concentração,,de GSSG sobre o dobramento de rh proNGF. A concentração de GSSG foi de 5 mM. Os outros parâmetros de renaturação eram idênticos àqueles usados em variação de GSH. Os valores médios de duas séries de medição são mostrados. A Figura 2e mostra o efeito de quantidades diferentes de GdmCI no rendimento de rh proNGF nativo. A quantidade de GSH e GSSG foi de 5 mM e 0,5 mM, respectivamente. As outras condições de renaturação eram idênticas àquelas usadas na variação de GSSG. Os valores médios de duas séries de medição são mostrados. A Figura 2f mostra o efeito de diferentes concentrações de proteína sobre o rendimento de dobramento de rh proNGF. Em todas as amostras, a concentração de GdmCI foi de 200 mM. Todos os outros parâmetros de dobramento eram idênticos àqueles usados na variação de GdmCI. Uma única série de medição é mostrada. A Figura 3 mostra o perfil de eluição da purificação de rh proNGF por meio de cromatografia de troca de cátions em Poros 20 HS (Perseptive Biosystems, volume de coluna de 1,7 ml). A Figura 4 mostra um gel de SDS PAGE (15%, cepa de prata de acordo com Nesterenko, M. V., e outros, J. Biochem. Biophys. Methods 28 (1994) 239) da purificação de rh proNGF em Poros 20 HS (1: proNGF rena- turado quando carregado para a coluna; 2: lacuna; 3 fráção’4 (6éO mí);’-' 4; fração 5 (69 a 72 ml); 5: fração 6 (72 a 75 ml); 6: fração 7 (75 a 78 ml); 7: fração 8 (78 a 81 ml); 8: fração 9 (81 a 84 ml); 9: fração 10 (84 a 87 ml)). A Figura 5 mostra o espectro de UV de rh proNGF. A Figura 6 mostra um diagrama de eluição de IEX-HPLC de rh proNGF (material de coluna: Poros 20 HS, coluna de 100 mm x 4,6 mm, Perseptive Biosystems company). A Figura 7 mostra um diagrama de eluição de RP-HPLC de rh proNGF (material de coluna: Poros 10 R1, coluna de 100 mm x 4,6 mm, Perseptive Biosystems company). A Figura 8 mostra um gel de SDS (15% de cepa Coomassie) da proteólise limitada de rh proNGF com tripsina (M: marcador de 10 kDA, 1: padrão de rh proNGF; 2: padrão de rh proNGF □□1:40, 4: 1:100, 5: 6: 1:500, 7: 1:1000, 8: 1:2000, 9: 1:2500, 10: controle sem tripsina, com STI). SEQ ID NOs: 1 e 2 mostram oligonucleotídeos para a construção de pET 11 a-proNGF. SEQ ID NO: 3 mostra a seqüência de nucleotídeos do cDNA de proNGF humano bem como a seqüência de aminoácidos do produto de tradução. SEQ ID NO: 4 mostra a seqüência de aminoácidos do produto de tradução. Exemplo 1

Clonagem do cDNA que codifica proNGF em um vetor de expressão de E. coli

Para a clonagem do construto de proNGF o sistema de expressão de T7 da Novagen foi escolhido (Studier, F. U., e outros, J. Mol. Biol. 189 (1986) 113). A seqüência de DNA que codifica proNGF está sob o controle do sinal de transcrição de T7 forte. Como a cepa de hospedeiro, BL21 de E. coli (DE3) é usada. O cromossoma contém o gene para polimerase de RNA de T7. Expressão desta polimerase de RNA e desse modo do proNGF ^ejnduzidapor(PTG^iéopropil-beta-D-tiogalactosídeo).

O cDNA para proNGF humano foi obtido por ampliação de PCR a partir de vetor pMGL-SIG-proNGF da Boehringer Mannheim-N* *190*5).’ ' Na extremidade 5’ da seqüência de DNA que codifica proNGF um sítio de restrição de Ndel e na extremidade 3’ um sítio de restrição de BamHI foram introduzidas usando-se iniciadores de mutagênese. 0 produto de PCR foi inserido no sítio de restrição de Ndel/BamHI da região de clonagem múltipla de vetor pET 11 a (Novagen) (Figura 1).

Os seguintes iniciadores foram usados no PCR: Iniciador de Avanço "FwProNGF" 5’-CG GAA TTC CA | T ATG GAA CCA CAC TCA GAG AGC-3’ (SEQ ID NO: 1) Met Glu Pro His Ser Glu Ser Iniciador Reverso "RevNGF" 5’-CC G | GA TCC TTA TCA TCT CAC AGC CTT TCT AGA-3’ (SEQ ID NO: 2) stopstopArg Vai Ala Lys Arg Ser

Depois da clonagem no vetor, a seqüência de nucleotídeos foi verificada por meio da seqüênciação de DNA. Exemplo 2 a) Expressão de proNGF humano em E. coli

Para o cultivo da cepa bacteriana recombinante uma cultura de um dia para o outro foi preparada. Para esta finalidade um volume adequado de meio de LB foi adicionado com 100 μg/ml de ampicilina e 50 μg/ml de ca- namicina.

Meio de LB (1 I): 10 g de tripton g de extrato de levedura g de NaCI O meio foi inoculado com uma colônia única e foi agitado de um dia para o outro a 37°C.

Na manhã seguinte, o volume desejado de meio 2 x YT conten- do 100 μg/ml de ampicilina e 50 μg/ml de canamicina foi ínç^ltiado com a cultura de um dia para o outro em uma razão de 1:100 (v/v). A cultura foi agitada a 37°C e 200-250 rpm até que ODeoo de 0,5-0,8 fosse alcançado. Mais tarde, a expressão de proNGF foi induzida por IPTG a 3 mM por 4 horas na mesma temperatura. Subsequentemente, as células foram coletadas por centrifugação e ou imediatamente rompidas ou armazenacfae*coh§ela«-’ das a -70°C.

Meio de 2xYT (1 I): 17 g de tripton g de extrato de levedura g de NaCI b) Isolamento de IBs

Nas células bacterianas a proteína recombinante está presente na forma de agregados. A preparação destes "corpos de inclusão" foi realizada de acordo com Rudolph, R., e outros, (1987); Folding proteins. In: Creighton, T. E. (ed.): Protein Function: A Praticai Approach. Oxford University Press, páginas. 57-99.

Para o rompimento de célula, 5 g do pélete de célula foram res- suspensos em 25 ml de Tris/HCI pH 7,0; EDTA a 1 mM. Mais tarde, 1,5 mg de lisozima foi adicionado por g de massa de célula úmida, foram incubados por 30 minutos a 4°C, e subseqüentemente as células foram rompidas usando-se um rompedor celular Gaulin. Então, 3 mM de MgCh bem como 10 μg/ml de Dnase foram adicionados ao homogenato bruto e foram incubados por 30 mins, a 35°C. Depois da digestão de Dnase os componentes celulares insolúveis foram solubilizados pela adição de 0,5 volume de EDTA a 60 mM, Triton X-100 a 6%, NaCI a 1,5 M pH 7,0 seguido por incubação por 30 minutos a 4°C. Os IBs foram coletados por centrifugação por 10 mins, a 13.000 rpm. Mais tarde, eles foram lavados quatro vezes cada um com 100 ml de Tris/HCI a 100 mM pH 7,0; EDTA a 20 mM e foram armazenados a -20°C.

Deste modo, cerca de 4 g de pelota de IB poderiam ser reprodu- tivelmente obtidos a partir de 10 I de cultura de E. coli (cerca de 44 g de peso de célula úmida). As preparações já continham cerca de 90-95% de rh proNGF (Figura 2). Exemplo 3 a) Solubilização de IBs 400 mg de pelota de IB foram suspensos em 2 ml de tampão de solubilização (Tris/HCI a 100 mM pH 8,Q;xGdmCI ^ 6 mM; DTT a 100 mM;

EDTA a 10 mM), foram incubados por duas horas a^5°C e‘foram cénWftb-’ *•’ gados por 30 minutos a 13.000 rpm na câmara fria. Mais tarde, o sobrena- dante foi removido e foi ajustado para pH 3-4 com HCI a 1 M. O material so- lubilizado foi dialisado três vezes cada um contra 300 ml de GdmCI a 6 M pH 4,0, EDTA a 10 mM, isto é, duas vezes por duas horas cada a 25°C e uma vez de um dia para o outro na câmara fria (12°C, 16-18 horas). A concentração de proteína foi então determinada usando-se o método de Bradford (Bradford, M. M., Anal. Biochem. 72 (1976) 248). A concentração de rh proNGF era entre 40 e 50 mg/ml. b) Otimização de renaturação de rh proNGF

Para preparar rh proNGF biologicamente ativo a partir dos materiais solubilizados preparados no exemplo 3a) estes foram diluídos em diferentes tampões de renaturação. Para se determinar as ótimas condições, os seguintes parâmetros foram variados na ordem listada: a) temperatura e tempo b) pH c) concentração de arginina d) concentação de GSH/GSSG e) concentração de GdmCI f) concentração de proteína

Os resultados são apresentados nas tabelas 1 e 2 bem como nas Figuras de 2a-f. A quantidade de proNGF renaturado nas amostras de dobramento foi determinada por RP-HPLC. Para esta finalidade, 925 μl de cada uma das amostras de dobramento foram removidos em pontos de tempo predeterminados e foram tratados com 75 μl de HCI a 32% para parar a reação de dobramento. Para analítica de RP-HPLC uma coluna de HPLC Poros 10 R1 e o sistema de HPLC de Beckman Gold com módulo de solvente 125 NM, detector 168, auto-amostrador 507, e programa de análise "Gold V 8.10" foram usados. Os picos de eluição obtidos foram ajustados usando-se a versão de programa "de ajuste de pico" 2.01. Para a determinação quantitativa dos rendimentos, um gráfico padrão foi construído usando- se rh proNGF nativo purificado. Uma vez que o rh proNGF IBs eram muito puros, a quantidade total de proteína empregada nas:amòstrás‘cléreríaWra^ ção foi igualada com a quantidade de rh proNGF para a análise quantitativa. Os resultados de medição mostrados são valores médios de duas medições cada. Tabela 1

Determinação da ótima temperatura e do tempo durante o do-bramento de rh proNGF. A concentração de proteína em cada uma das amostras de renaturação foi de 50 μg/ml. O dobramento de tampão de do-bramento consistia de

Tris/HCI a 100 mM pH 9,5 L-arginina a 1 M GSH a 5 mM GSSG a 1 mM EDTA a 5 mM As séries de medição foram realizadas várias vezes e foram ajustadas uma função exponencial. Os valores médios de duas medições são mostrados

Tabela 2

Esta tabela mostra o efeito de diferentes concentrações de GSH/GSSG (GSH = glutationa reduzida; GSSG = glutationa oxidada) sobre o dobramento de rh proNGF. O tampão de renaturação usado foi Tris/HCI a 100 mM pH 9,5 L-arginina a 1 M EDTA a 5 mM 0 tempo de dobramento foi de 3 horas a 1Ô°C.’ Nà’tabela;*as’ ’•* amostras de dobramento individuais são apresentadas na ordem de diminuição de rendimento. Os rendimentos médios de duas série de medições são mostrados.

5 c) Renaturação de rh proNGF na escala preparativa rn proNGF foi renaturado por diluição em tampão de dobramento (Tris/HCI a 100 mM pH 9,5; L-arginina a 1 M; GSH a 5 mM; GSSG a 0,5 mM; EDTA a 5 mM). O dobramento foi realizado em uma concentração de proteína de 50 μg/ml. A amostra de renaturação foi incubada por 3 hs a 10°C. 10 d) Purificação por meio de cromatografia de troca de íons O material renaturado foi dialisado contra 10 I de Na-fosfato a 50 mM pH 7,0; EDTA a 1 mM (tampão A de IEX) e foi centrifugado por 30 minutos a 20.000 rpm. O sobrenadante foi carregado sobre uma coluna de Poros 20 HS e foi eluído usando-se um gradiente de sal (tampão B de IEX: Na- 15 fosfato a 50 mM pH 7,0, NaCI a 1 M, EDTA a 1 mM). A proteína eluída a NaCI a 980 mm (Figura 3). rh proNGF não reativo pode apenas ser removido da coluna usando-se condições de desnaturação. Exemplo 4 Caracterização de rh proNGF a) Determinação da concentração e o peso molecular por meio de espec- trometria de UV Para determinar a concentração de rh proNGF nas amostras purificadas, um espectro de UV de 240 a 340 nm foi tomado das amostras dialisadas contra Na-fosfato a 50 mM pH 7,0, EDTA a 1 mM (Figura 5; o espectro foi obtido usando-se um espectrofotòmetro de Beckman DU 640). A concentração de rh proNGF na amostra foi determinada por meio de absorção a 280 nm. A avaliação era com base em um coeficiente de extinção molar teórica de 25.680 l/(mol x cm) (calculada de acordo com Gill, S. C., e outros, Anal. Biochem. 182 (1989) 319) e um peso molecular de 24.869 Da por monômero (calculado por meio do program ExPASy "pl/Pm" e corrigido para três ligações de dissulfeto). Os valores obtidos usando-se o espectro eram em correlação próxima com as concentrações determinadas por meio do método de Bradford. Determinação de peso molecular foi feito usando-se espectrometria de massa de spray de elétron. A massa teórica de proNGF recombinante é de 24.869 Da. Experimentalmente determinadas foram de 24.871 Da. b) Análise da pureza e da determinação do peso molecular usando-se eletroforese de gel de poliacrilamida de SDS 15% de géis de poliacrilamida foram usados. Cada amostra continha 1% (v/v) de 2-mercaptoetanol. No gel de SDS, o proNGF humano recombinante mostra um peso molecular aparente levemente mais alto do que esperado: cerca de 30 kDa (ao invés de 24,8 kDa) (Figura 2). c) Análise da pureza por meio de IEX-HPLC 24 μg (50 μl de uma amostra contendo de 0,48 mg/ml de rh proNGF) da proteína foram carregados sobre uma coluna Poros 20 HS (125 x 4 mm) equilibrado com Na-fosfato a 50 mM pH 7,0; EDTA a 1 mM, e foram eluídos em uma taxa de fluxo de 5 ml/minutos com um gradiente linear de 0 a 100% de B (B = Na-fosfato a 50 mM pH 7,0; NaCI 2 M; EDTA a 1 mM) em um período de 10 minutos (Figura 6). A absorção a 280 nm foi usada para a detecção (sistema de HPLC Gyncotek com programa âe ánátise^CfVorôeTéofl* versão 3.14). d) Análise da pureza usando-se HPLC de RP C4 3,1 μg de rh proNGF (15 μl rh proNGF em uma concentração de 0,21 mg/ml) foram carregados sobre uma coluna Poros 10 R1 (100 mm x 4 mm; Perseptive Biosystems) foram equilibrados com 0,13% de TFA. A pro-teína foi eluída em uma taxa de fluxo de 0,8 ml/minuto com um gradiente não linear (0-4 minutos: 6% de B; 4-9 minutos: 6-30% de B; 9-24 minutos: 30-69% de B; 24-25 minutos: 69-100% de B; 25-30 minutos: 100% de B)) em um período de 33 minutos. Como o eluente B foi usado 0,1% (v/v) de TFA em 80% (v/v) de acetonitrila. A absorção a 220 nm foi usada para a detecção (sistema de HPLC de Beckman "Gold" com programa de análise "Gold V 8.10"). rh proNGF ativo eluído em um pico único em um tempo de retenção de 14,28 minutos (Figura 7). e) Análise da seqüència de Terminal N Para a análise da seqüència de Terminal N os IBs solubilizados foram usados que tinha sido grosseiramente purificados por meio de RP HPLC. A seqüència de Terminal N foi determinada usando-se um dispositivo de seqüenciação de proteína Applied Biosystems 476A. A seguinte seqüên- cia de aminoácidos foi obtida: H2N-Met-Glu-Pro-His-Ser-Glu-Ser-Asn-Val f) Atividade biológica do proNGF humano recombinante

A atividade fisiológica de rh proNGF foi determinada usando-se o ensaio de DRG (= ensaio de gânglio de raiz dorsal) (Levi-Montalcini, R., e outros, Cancer Res. 14 (1954) 49; Varon, S., e outros, Meth, in Neurochemistry 3 (9172) 203). Neste ensaio a estimulação e a sobrevivência de . neurônios sensórios oriundos de gânglios de raiz dorsal dissociados de embriões de pinto de 7-8 dias de idade são determinados por meio de formação de neurito. A amostra de rh proNGF foi ajustada para concentração de 0,019 a 20,00 ng/ml usando-se meio de cultura. Por amostra de teste 15.000 neurônios foram empregados. Depois da incubação por 48 horas a 37°C o número de células sobreviventes foi determinado. Uma solução de rh beta-

NGF de concentração conhecida foi usada como a amosfra*de•referência. •A’ ’ avaliação quantitativa é com base no valor de EC50 assim chamado, isto é, a concentração de NGF que promove sobrevivência de metade dos neurônios. Para rh proNGF um valor de EC50 de 0,369 ng/ml foi obtido. Em comparação, o valor de EC50 obtido para o padrão de rh beta-NGF foi de 0,106 ng/ml. Consideração do peso molecular diferente de rh beta-NGF e de rh proNGF, a atividade biológica de rh beta-NGF maduro é cerca de duas vezes tão alta^ quanto aquela de rh proNGF. Exemplo 5 a) Preparação de rh beta-NGF maduro biologicamente ativo por proteólise limitada de rh proNGF r jsroNGF humano contém um resíduo de arginina como o último ; xaminoácido da pró-seaüência^Portanto, a partir deste precursor o rh beta- NGF maduro pode ser obtido in vitro por proteólise limitada usando-se proteoses de especificidade de substrato adequado tal como tripsina. 500 μl de um rh proNGF purificado foram dialisados contra Tris/HCI a 50 mM. Depois da diálise, uma concentração de proteína de 0,49 mg/ml foi medida por funcionamento do espectro de UV. Por amostra de digestão, 20 μg de proNGF foram empregados. Depois de proteólise, 3 μg (correspondendo a 6 μl) desta amostra foram analisados por meio de SDS PAGE. Como a solução de estoque de tripsina de 0,1 μg/ml ou de 0,01 μg/ml, respectivamente foi usada. A concentração de jnibidor de tripsina de soja (STI) foi deJLlDg/.rpU Ambas as proteínas foram providas na forma de pós liofilizados (fabricante: Boehringer Mannheim e Sigma, respectivamente) e foram dissolvidas no tampão mencionado acima.

Diferentes razões de massa de tripsina/rh proNGF foram usadas na proteólise limitada (ver a tabela 3). Depois de uma incubação por trinta minutos sobre gelo cada reação foi parada pop5 μg de STT/Para as finalidades de controle de rh proNGF sem protease ádícionãdá foi também incubada sobre gelo, seguido por adição de STI.

q) Análise dos produtos de clivagem pro seqüenciação de Terminal N As amostras de digestão com uma razão de massa de tripsi- na:proNGF de a) 1:40; b) 1:100, e c) 1:250 foram submetidas a uma análise mais detalhada por seqüenciação de Terminal N. Uma tira de 13 kDa continha várias espécies (Figura 8): terminal N 1: Met’104 terminal N 2: Vai’35 terminal N 3: Ser1... (rh beta-NGF maduro); terminal N 4: Gly10

Estes peptídeos estavam presentes nas amostras diferentes em quantidades diferentes.

Amostra a): terminal N 2: terminal N 3: terminal N 4 = 4:5:2.

Amostra b): terminal N 2: terminal 3 = 1:1; terminal N 4 em quantidades em traço.

Amostra c) foi analisada além disso por meio de HPLC de RP C3 (coluna: Nucleosil 500-5 C3-PPN; 125 mm x 4 mm). Dois picos foram obtidos: pico 1 (12,32 minutos): terminal N 1; pico 2 (14,88 minutos): terminal N 2 e terminal N 3 em uma razão de 2:3.

Para se obter rh beta-NGF maduro oriundo de rh proNGF sobre uma escala preparativa de 1,3 mg de rh proNGF (em Tris/HCI a 50 mM pH 8,0; concentração de 0,46 mg/ml) foram adicionados com tripsina em uma

razão de massa de 1:250 (tripsina:rh proNGF). A arrfostfe fóriríowbaââ^er 30 mins. sobre gelo. Mais tarde, a protease foi inativada por um excesso de 40 vezes com base na massa de inibidor de tripsina de soja. A amostra de clivagem foi dialisada contra fosfato de sódio a 50 mM pH 7,0, EDTA a 1 mM 5 e então foi aplicada a um coluna de troca de cátions (1,7 ml de Poros 20 HS;

Perseptive Biosystems). Em um gradiente de sal linear de NaCI a 0 a 2 M o produto de clivagem eluído em um pico único. A eluição em uma concentração de sal de cerca de NaCI a 840 mM correspondia àquela do rh beta-NGF maduro em uma experiência de controle. O rendimento de produto de cliva- 10 gem purificado foi de 17%.

A atividade biológica do produto de clivagem purificado foi testado por meio do ensaio de DRG. Ela correspondia à atividade de rh beta-NGF maduro (tabela 4).

Referências Barnett, J., et al., J. Neurochem. 57 (1991) 1052 Bradford, M. M., Anal. Biochem. 72 (1976) 248 EP-A 0 544 293 Hefti, F. J., J. Neurobiol. 25 (1994) 1418 Hill, S. C. et al., Anal. Biochen. 182 (1989) 319 Laemmli, U. K., Nature 227 (1970) 680 Levi-Montalcini, R. et al., Cancer Res. 14 (1954) 49 Levi-Montalcini, R., Science 237 (1987) 1154 Marston, F.A., Biochem. J. 240 (1986) 1 Nesterenko, M. V. et al., J. Biochem. Biophys. Methods 28 (1994) 239 Rudolph. R. etal. (1997): Folding Proteins. In: Creighton, T.E. (ed.): Protein function: A Practical Approach, pp. 57-99 Schmelzer, C. H. et al., J. Neurochem. 59 (1992) 1675 Studier, F.W. etal., J. Mol. Biol. 189 (1986) 113 Suter, U. et al., EMBO J. 10 (1991) 2395 SWISS-PROT Protein Sequence Database N° P01138 Thoenen, H. etal., Physiol. Rev. 60 (1980) 1284 Ullrich, A. et al., Nature 303 (1983) 821 US patent 5.235.043 US patent 5.593.856 US patent 5.606.031 US patent 5.683.894 Varon, S. et al., Meth, in Neurochemistry 3 (1972) 203 WO 97/47735 Yankner, B. A. et al.. Annu. Rev. Biochem. 51 (1982) 845 PCT/EP 99/07613 Requerente: RUDOLPH, Rainer e outros.

Claims

1. Método para preparação de pro-NGF biologicamente ativo, caracterizado pelo fato de que, na primeira etapa, pro-NGF contendo sua pró-sequência completa é obtido na forma biologicamente inativa de corpos de inclusão após sua preparação recombinante em procariotos, e em que o dito pro-NGF contendo sua pro-sequência completa na forma biologicamente inativa de corpos de inclusão, é solubilizado em uma solução de agente desnaturante, com a finalidade de obter uma proteína solubilizada que é subsequentemente diluída ou dializada em um tampão de renaturação com pH entre 7 e 10, de modo a diluir a concentração do agente de desnaturação no meio por um fator de 100 ou mais, desse modo mantendo a solubilidade da proteína, em que no tampão de renaturação o pro-NGF desnaturado é convertido à sua conformação biologicamente ativa com as mesmas ligações de dissulfeto presentes no beta-NGF nativo, e subsequentemente a pro-sequência é removida por clivagem, assim, o beta-NGF ativo é obtido.

2. Método de acordo com a reivindicação 1, caracterizado pelo fato de que o tampão de renaturação contém arginina.

3. Método de acordo com a reivindicação 2, caracterizado pelo fato de que a concentração de arginina é de 0,2 a 1,5 mol/L.

4. Método de acordo com qualquer uma das reivindicações 1 a 3, caracterizado pelo fato de que a renaturação é realizada na presença de um componente de tiol em sua forma reduzida ou oxidada.

5. Método de acordo com qualquer uma das reivindicações 1 a 4, caracterizado pelo fato de que a remoção por clivagem da pró-sequência é realizada por meio de uma protease com uma especificidade de substrato para a clivagem depois do aminoácido arginina.

6. Método de acordo com a reivindicação 5, caracterizado pelo fato de que a tripsina é usada como a protease.

7. Método de acordo com qualquer uma das reivindicações 1 a 6, caracterizado pelo fato de que o cloridrato de guanidínio ou uréia é usado como o agente de desnaturação.