NO329483B1 - Fremgangsmate for okning av utbyttet av et interferon alfa-preparat. - Google Patents
Fremgangsmate for okning av utbyttet av et interferon alfa-preparat. Download PDFInfo
- Publication number
- NO329483B1 NO329483B1 NO20012327A NO20012327A NO329483B1 NO 329483 B1 NO329483 B1 NO 329483B1 NO 20012327 A NO20012327 A NO 20012327A NO 20012327 A NO20012327 A NO 20012327A NO 329483 B1 NO329483 B1 NO 329483B1
- Authority
- NO
- Norway
- Prior art keywords
- protein
- pyruvate
- isoform
- supplement
- interferon alpha
- Prior art date
Links
- 238000000034 method Methods 0.000 title claims description 40
- 108010047761 Interferon-alpha Proteins 0.000 title claims description 20
- 102000006992 Interferon-alpha Human genes 0.000 title claims description 20
- 238000002360 preparation method Methods 0.000 title claims description 12
- 230000001965 increasing effect Effects 0.000 title claims description 7
- 102000001708 Protein Isoforms Human genes 0.000 claims description 75
- 108010029485 Protein Isoforms Proteins 0.000 claims description 75
- LCTONWCANYUPML-UHFFFAOYSA-M Pyruvate Chemical compound CC(=O)C([O-])=O LCTONWCANYUPML-UHFFFAOYSA-M 0.000 claims description 56
- 239000013589 supplement Substances 0.000 claims description 39
- FFEARJCKVFRZRR-BYPYZUCNSA-N L-methionine Chemical compound CSCC[C@H](N)C(O)=O FFEARJCKVFRZRR-BYPYZUCNSA-N 0.000 claims description 7
- 229930182817 methionine Natural products 0.000 claims description 7
- 239000003963 antioxidant agent Substances 0.000 claims description 5
- 108010078049 Interferon alpha-2 Proteins 0.000 claims description 4
- 230000003078 antioxidant effect Effects 0.000 claims description 4
- 229950000038 interferon alfa Drugs 0.000 claims description 3
- 229960003507 interferon alfa-2b Drugs 0.000 claims description 3
- MIXCUJKCXRNYFM-UHFFFAOYSA-M sodium;diiodomethanesulfonate;n-propyl-n-[2-(2,4,6-trichlorophenoxy)ethyl]imidazole-1-carboxamide Chemical compound [Na+].[O-]S(=O)(=O)C(I)I.C1=CN=CN1C(=O)N(CCC)CCOC1=C(Cl)C=C(Cl)C=C1Cl MIXCUJKCXRNYFM-UHFFFAOYSA-M 0.000 claims description 3
- 102000004169 proteins and genes Human genes 0.000 description 77
- 108090000623 proteins and genes Proteins 0.000 description 77
- 235000018102 proteins Nutrition 0.000 description 76
- 238000006243 chemical reaction Methods 0.000 description 35
- 238000007254 oxidation reaction Methods 0.000 description 20
- 230000007062 hydrolysis Effects 0.000 description 17
- 238000006460 hydrolysis reaction Methods 0.000 description 17
- 230000003647 oxidation Effects 0.000 description 17
- 229940116540 protein supplement Drugs 0.000 description 14
- 235000005974 protein supplement Nutrition 0.000 description 13
- 239000000243 solution Substances 0.000 description 12
- 238000003776 cleavage reaction Methods 0.000 description 11
- 238000012216 screening Methods 0.000 description 11
- 230000007017 scission Effects 0.000 description 10
- 238000011534 incubation Methods 0.000 description 9
- 239000000126 substance Substances 0.000 description 9
- HORQAOAYAYGIBM-UHFFFAOYSA-N 2,4-dinitrophenylhydrazine Chemical compound NNC1=CC=C([N+]([O-])=O)C=C1[N+]([O-])=O HORQAOAYAYGIBM-UHFFFAOYSA-N 0.000 description 7
- 150000001768 cations Chemical class 0.000 description 7
- 239000000203 mixture Substances 0.000 description 7
- 238000004007 reversed phase HPLC Methods 0.000 description 7
- FAPWRFPIFSIZLT-UHFFFAOYSA-M Sodium chloride Chemical compound [Na+].[Cl-] FAPWRFPIFSIZLT-UHFFFAOYSA-M 0.000 description 6
- 230000015572 biosynthetic process Effects 0.000 description 6
- 239000000356 contaminant Substances 0.000 description 6
- 239000000843 powder Substances 0.000 description 6
- 239000002253 acid Substances 0.000 description 5
- 229910052751 metal Inorganic materials 0.000 description 5
- 239000002184 metal Substances 0.000 description 5
- 238000000746 purification Methods 0.000 description 5
- 241000894006 Bacteria Species 0.000 description 4
- 230000002378 acidificating effect Effects 0.000 description 4
- 239000002775 capsule Substances 0.000 description 4
- 210000004027 cell Anatomy 0.000 description 4
- 238000001212 derivatisation Methods 0.000 description 4
- 239000007788 liquid Substances 0.000 description 4
- 239000007787 solid Substances 0.000 description 4
- 125000003396 thiol group Chemical group [H]S* 0.000 description 4
- 102000014150 Interferons Human genes 0.000 description 3
- 108010050904 Interferons Proteins 0.000 description 3
- HEMHJVSKTPXQMS-UHFFFAOYSA-M Sodium hydroxide Chemical compound [OH-].[Na+] HEMHJVSKTPXQMS-UHFFFAOYSA-M 0.000 description 3
- QVGXLLKOCUKJST-UHFFFAOYSA-N atomic oxygen Chemical compound [O] QVGXLLKOCUKJST-UHFFFAOYSA-N 0.000 description 3
- 230000000295 complement effect Effects 0.000 description 3
- 239000000839 emulsion Substances 0.000 description 3
- 229940079322 interferon Drugs 0.000 description 3
- 229910021645 metal ion Inorganic materials 0.000 description 3
- 125000001360 methionine group Chemical group N[C@@H](CCSC)C(=O)* 0.000 description 3
- 244000005700 microbiome Species 0.000 description 3
- 239000001301 oxygen Substances 0.000 description 3
- 229910052760 oxygen Inorganic materials 0.000 description 3
- 238000010188 recombinant method Methods 0.000 description 3
- 239000011780 sodium chloride Substances 0.000 description 3
- 239000003826 tablet Substances 0.000 description 3
- QTBSBXVTEAMEQO-UHFFFAOYSA-M Acetate Chemical compound CC([O-])=O QTBSBXVTEAMEQO-UHFFFAOYSA-M 0.000 description 2
- 241000700605 Viruses Species 0.000 description 2
- 238000009825 accumulation Methods 0.000 description 2
- 239000000443 aerosol Substances 0.000 description 2
- 238000006664 bond formation reaction Methods 0.000 description 2
- 125000003636 chemical group Chemical group 0.000 description 2
- 238000004587 chromatography analysis Methods 0.000 description 2
- 150000001875 compounds Chemical class 0.000 description 2
- 239000007857 degradation product Substances 0.000 description 2
- 239000003937 drug carrier Substances 0.000 description 2
- 230000000694 effects Effects 0.000 description 2
- 238000002474 experimental method Methods 0.000 description 2
- NOESYZHRGYRDHS-UHFFFAOYSA-N insulin Chemical compound N1C(=O)C(NC(=O)C(CCC(N)=O)NC(=O)C(CCC(O)=O)NC(=O)C(C(C)C)NC(=O)C(NC(=O)CN)C(C)CC)CSSCC(C(NC(CO)C(=O)NC(CC(C)C)C(=O)NC(CC=2C=CC(O)=CC=2)C(=O)NC(CCC(N)=O)C(=O)NC(CC(C)C)C(=O)NC(CCC(O)=O)C(=O)NC(CC(N)=O)C(=O)NC(CC=2C=CC(O)=CC=2)C(=O)NC(CSSCC(NC(=O)C(C(C)C)NC(=O)C(CC(C)C)NC(=O)C(CC=2C=CC(O)=CC=2)NC(=O)C(CC(C)C)NC(=O)C(C)NC(=O)C(CCC(O)=O)NC(=O)C(C(C)C)NC(=O)C(CC(C)C)NC(=O)C(CC=2NC=NC=2)NC(=O)C(CO)NC(=O)CNC2=O)C(=O)NCC(=O)NC(CCC(O)=O)C(=O)NC(CCCNC(N)=N)C(=O)NCC(=O)NC(CC=3C=CC=CC=3)C(=O)NC(CC=3C=CC=CC=3)C(=O)NC(CC=3C=CC(O)=CC=3)C(=O)NC(C(C)O)C(=O)N3C(CCC3)C(=O)NC(CCCCN)C(=O)NC(C)C(O)=O)C(=O)NC(CC(N)=O)C(O)=O)=O)NC(=O)C(C(C)CC)NC(=O)C(CO)NC(=O)C(C(C)O)NC(=O)C1CSSCC2NC(=O)C(CC(C)C)NC(=O)C(NC(=O)C(CCC(N)=O)NC(=O)C(CC(N)=O)NC(=O)C(NC(=O)C(N)CC=1C=CC=CC=1)C(C)C)CC1=CN=CN1 NOESYZHRGYRDHS-UHFFFAOYSA-N 0.000 description 2
- 230000003993 interaction Effects 0.000 description 2
- 108010055511 interferon alfa-2c Proteins 0.000 description 2
- HQKMJHAJHXVSDF-UHFFFAOYSA-L magnesium stearate Chemical compound [Mg+2].CCCCCCCCCCCCCCCCCC([O-])=O.CCCCCCCCCCCCCCCCCC([O-])=O HQKMJHAJHXVSDF-UHFFFAOYSA-L 0.000 description 2
- 238000004519 manufacturing process Methods 0.000 description 2
- 238000005259 measurement Methods 0.000 description 2
- 239000012528 membrane Substances 0.000 description 2
- 238000012544 monitoring process Methods 0.000 description 2
- 239000007800 oxidant agent Substances 0.000 description 2
- 238000003756 stirring Methods 0.000 description 2
- 239000000829 suppository Substances 0.000 description 2
- 239000000725 suspension Substances 0.000 description 2
- 238000012360 testing method Methods 0.000 description 2
- 238000012546 transfer Methods 0.000 description 2
- 238000000108 ultra-filtration Methods 0.000 description 2
- 239000011701 zinc Substances 0.000 description 2
- 108091035707 Consensus sequence Proteins 0.000 description 1
- 102000004190 Enzymes Human genes 0.000 description 1
- 108090000790 Enzymes Proteins 0.000 description 1
- CWYNVVGOOAEACU-UHFFFAOYSA-N Fe2+ Chemical compound [Fe+2] CWYNVVGOOAEACU-UHFFFAOYSA-N 0.000 description 1
- VTLYFUHAOXGGBS-UHFFFAOYSA-N Fe3+ Chemical compound [Fe+3] VTLYFUHAOXGGBS-UHFFFAOYSA-N 0.000 description 1
- 108010053070 Glutathione Disulfide Proteins 0.000 description 1
- 102000004877 Insulin Human genes 0.000 description 1
- 108090001061 Insulin Proteins 0.000 description 1
- 102100040018 Interferon alpha-2 Human genes 0.000 description 1
- 108010079944 Interferon-alpha2b Proteins 0.000 description 1
- XUJNEKJLAYXESH-REOHCLBHSA-N L-Cysteine Chemical compound SC[C@H](N)C(O)=O XUJNEKJLAYXESH-REOHCLBHSA-N 0.000 description 1
- LEVWYRKDKASIDU-IMJSIDKUSA-N L-cystine Chemical compound [O-]C(=O)[C@@H]([NH3+])CSSC[C@H]([NH3+])C([O-])=O LEVWYRKDKASIDU-IMJSIDKUSA-N 0.000 description 1
- 102000003855 L-lactate dehydrogenase Human genes 0.000 description 1
- 108700023483 L-lactate dehydrogenases Proteins 0.000 description 1
- QEFRNWWLZKMPFJ-ZXPFJRLXSA-N L-methionine (R)-S-oxide Chemical compound C[S@@](=O)CC[C@H]([NH3+])C([O-])=O QEFRNWWLZKMPFJ-ZXPFJRLXSA-N 0.000 description 1
- QEFRNWWLZKMPFJ-UHFFFAOYSA-N L-methionine sulphoxide Natural products CS(=O)CCC(N)C(O)=O QEFRNWWLZKMPFJ-UHFFFAOYSA-N 0.000 description 1
- GUBGYTABKSRVRQ-QKKXKWKRSA-N Lactose Natural products OC[C@H]1O[C@@H](O[C@H]2[C@H](O)[C@@H](O)C(O)O[C@@H]2CO)[C@H](O)[C@@H](O)[C@H]1O GUBGYTABKSRVRQ-QKKXKWKRSA-N 0.000 description 1
- 102000043129 MHC class I family Human genes 0.000 description 1
- 108091054437 MHC class I family Proteins 0.000 description 1
- 125000000729 N-terminal amino-acid group Chemical group 0.000 description 1
- 241000276498 Pollachius virens Species 0.000 description 1
- LCTONWCANYUPML-UHFFFAOYSA-N Pyruvic acid Chemical group CC(=O)C(O)=O LCTONWCANYUPML-UHFFFAOYSA-N 0.000 description 1
- 108020004511 Recombinant DNA Proteins 0.000 description 1
- 102000003978 Tissue Plasminogen Activator Human genes 0.000 description 1
- 108090000373 Tissue Plasminogen Activator Proteins 0.000 description 1
- HCHKCACWOHOZIP-UHFFFAOYSA-N Zinc Chemical compound [Zn] HCHKCACWOHOZIP-UHFFFAOYSA-N 0.000 description 1
- 238000002835 absorbance Methods 0.000 description 1
- 239000004480 active ingredient Substances 0.000 description 1
- 238000013019 agitation Methods 0.000 description 1
- 239000000427 antigen Substances 0.000 description 1
- 102000036639 antigens Human genes 0.000 description 1
- 108091007433 antigens Proteins 0.000 description 1
- 238000003556 assay Methods 0.000 description 1
- 230000000975 bioactive effect Effects 0.000 description 1
- 239000000872 buffer Substances 0.000 description 1
- 125000002915 carbonyl group Chemical group [*:2]C([*:1])=O 0.000 description 1
- 239000000969 carrier Substances 0.000 description 1
- 230000015556 catabolic process Effects 0.000 description 1
- 238000006555 catalytic reaction Methods 0.000 description 1
- 230000004663 cell proliferation Effects 0.000 description 1
- 238000007385 chemical modification Methods 0.000 description 1
- 238000011210 chromatographic step Methods 0.000 description 1
- 229940110456 cocoa butter Drugs 0.000 description 1
- 235000019868 cocoa butter Nutrition 0.000 description 1
- 229910052802 copper Inorganic materials 0.000 description 1
- 239000006071 cream Substances 0.000 description 1
- XUJNEKJLAYXESH-UHFFFAOYSA-N cysteine Natural products SCC(N)C(O)=O XUJNEKJLAYXESH-UHFFFAOYSA-N 0.000 description 1
- 235000018417 cysteine Nutrition 0.000 description 1
- 229960003067 cystine Drugs 0.000 description 1
- 238000006731 degradation reaction Methods 0.000 description 1
- 230000001419 dependent effect Effects 0.000 description 1
- 235000014113 dietary fatty acids Nutrition 0.000 description 1
- 230000008034 disappearance Effects 0.000 description 1
- 238000005516 engineering process Methods 0.000 description 1
- 238000006911 enzymatic reaction Methods 0.000 description 1
- 210000003527 eukaryotic cell Anatomy 0.000 description 1
- 238000011156 evaluation Methods 0.000 description 1
- 239000000194 fatty acid Substances 0.000 description 1
- 229930195729 fatty acid Natural products 0.000 description 1
- 230000002349 favourable effect Effects 0.000 description 1
- 238000000855 fermentation Methods 0.000 description 1
- 230000004151 fermentation Effects 0.000 description 1
- 239000000706 filtrate Substances 0.000 description 1
- 235000003599 food sweetener Nutrition 0.000 description 1
- 238000009472 formulation Methods 0.000 description 1
- 239000007789 gas Substances 0.000 description 1
- YPZRWBKMTBYPTK-BJDJZHNGSA-N glutathione disulfide Chemical compound OC(=O)[C@@H](N)CCC(=O)N[C@H](C(=O)NCC(O)=O)CSSC[C@@H](C(=O)NCC(O)=O)NC(=O)CC[C@H](N)C(O)=O YPZRWBKMTBYPTK-BJDJZHNGSA-N 0.000 description 1
- 239000008187 granular material Substances 0.000 description 1
- 239000008240 homogeneous mixture Substances 0.000 description 1
- 125000002887 hydroxy group Chemical group [H]O* 0.000 description 1
- 239000012535 impurity Substances 0.000 description 1
- 230000001939 inductive effect Effects 0.000 description 1
- 229940090438 infergen Drugs 0.000 description 1
- 230000036512 infertility Effects 0.000 description 1
- 238000002347 injection Methods 0.000 description 1
- 239000007924 injection Substances 0.000 description 1
- 229940125396 insulin Drugs 0.000 description 1
- 229960003521 interferon alfa-2a Drugs 0.000 description 1
- 108010010648 interferon alfacon-1 Proteins 0.000 description 1
- 230000002427 irreversible effect Effects 0.000 description 1
- 238000002955 isolation Methods 0.000 description 1
- 239000008101 lactose Substances 0.000 description 1
- 239000006210 lotion Substances 0.000 description 1
- 229910052749 magnesium Inorganic materials 0.000 description 1
- 239000011777 magnesium Substances 0.000 description 1
- ZLNQQNXFFQJAID-UHFFFAOYSA-L magnesium carbonate Chemical compound [Mg+2].[O-]C([O-])=O ZLNQQNXFFQJAID-UHFFFAOYSA-L 0.000 description 1
- 239000001095 magnesium carbonate Substances 0.000 description 1
- 229910000021 magnesium carbonate Inorganic materials 0.000 description 1
- 235000019359 magnesium stearate Nutrition 0.000 description 1
- 210000004962 mammalian cell Anatomy 0.000 description 1
- 239000011159 matrix material Substances 0.000 description 1
- 238000002844 melting Methods 0.000 description 1
- 229930027945 nicotinamide-adenine dinucleotide Natural products 0.000 description 1
- BOPGDPNILDQYTO-NNYOXOHSSA-N nicotinamide-adenine dinucleotide Chemical compound C1=CCC(C(=O)N)=CN1[C@H]1[C@H](O)[C@H](O)[C@@H](COP(O)(=O)OP(O)(=O)OC[C@@H]2[C@H]([C@@H](O)[C@@H](O2)N2C3=NC=NC(N)=C3N=C2)O)O1 BOPGDPNILDQYTO-NNYOXOHSSA-N 0.000 description 1
- 238000005457 optimization Methods 0.000 description 1
- 230000001590 oxidative effect Effects 0.000 description 1
- YPZRWBKMTBYPTK-UHFFFAOYSA-N oxidized gamma-L-glutamyl-L-cysteinylglycine Natural products OC(=O)C(N)CCC(=O)NC(C(=O)NCC(O)=O)CSSCC(C(=O)NCC(O)=O)NC(=O)CCC(N)C(O)=O YPZRWBKMTBYPTK-UHFFFAOYSA-N 0.000 description 1
- 238000007911 parenteral administration Methods 0.000 description 1
- 239000002244 precipitate Substances 0.000 description 1
- 238000001556 precipitation Methods 0.000 description 1
- 210000001236 prokaryotic cell Anatomy 0.000 description 1
- ALDITMKAAPLVJK-UHFFFAOYSA-N prop-1-ene;hydrate Chemical group O.CC=C ALDITMKAAPLVJK-UHFFFAOYSA-N 0.000 description 1
- DNIAPMSPPWPWGF-UHFFFAOYSA-N propylene glycol Substances CC(O)CO DNIAPMSPPWPWGF-UHFFFAOYSA-N 0.000 description 1
- 238000000164 protein isolation Methods 0.000 description 1
- 238000009790 rate-determining step (RDS) Methods 0.000 description 1
- 239000011541 reaction mixture Substances 0.000 description 1
- 238000011160 research Methods 0.000 description 1
- 150000003839 salts Chemical class 0.000 description 1
- 238000000926 separation method Methods 0.000 description 1
- 239000007909 solid dosage form Substances 0.000 description 1
- 239000011343 solid material Substances 0.000 description 1
- 239000011550 stock solution Substances 0.000 description 1
- 239000003765 sweetening agent Substances 0.000 description 1
- 239000000454 talc Substances 0.000 description 1
- 229910052623 talc Inorganic materials 0.000 description 1
- 230000001225 therapeutic effect Effects 0.000 description 1
- 239000002562 thickening agent Substances 0.000 description 1
- 229960000187 tissue plasminogen activator Drugs 0.000 description 1
- 238000011200 topical administration Methods 0.000 description 1
- 230000000699 topical effect Effects 0.000 description 1
- XLYOFNOQVPJJNP-UHFFFAOYSA-N water Substances O XLYOFNOQVPJJNP-UHFFFAOYSA-N 0.000 description 1
- 229910052725 zinc Inorganic materials 0.000 description 1
Classifications
-
- C—CHEMISTRY; METALLURGY
- C07—ORGANIC CHEMISTRY
- C07K—PEPTIDES
- C07K14/00—Peptides having more than 20 amino acids; Gastrins; Somatostatins; Melanotropins; Derivatives thereof
- C07K14/435—Peptides having more than 20 amino acids; Gastrins; Somatostatins; Melanotropins; Derivatives thereof from animals; from humans
- C07K14/52—Cytokines; Lymphokines; Interferons
- C07K14/555—Interferons [IFN]
- C07K14/56—IFN-alpha
-
- A—HUMAN NECESSITIES
- A61—MEDICAL OR VETERINARY SCIENCE; HYGIENE
- A61K—PREPARATIONS FOR MEDICAL, DENTAL OR TOILETRY PURPOSES
- A61K38/00—Medicinal preparations containing peptides
Landscapes
- Chemical & Material Sciences (AREA)
- Health & Medical Sciences (AREA)
- Life Sciences & Earth Sciences (AREA)
- Organic Chemistry (AREA)
- General Health & Medical Sciences (AREA)
- Gastroenterology & Hepatology (AREA)
- Biochemistry (AREA)
- Biophysics (AREA)
- Zoology (AREA)
- Genetics & Genomics (AREA)
- Medicinal Chemistry (AREA)
- Molecular Biology (AREA)
- Proteomics, Peptides & Aminoacids (AREA)
- Toxicology (AREA)
- Peptides Or Proteins (AREA)
- Medicines That Contain Protein Lipid Enzymes And Other Medicines (AREA)
- Preparation Of Compounds By Using Micro-Organisms (AREA)
Description
Område for oppfinnelsen
Foreliggende oppfinnelse angår en fremgangsmåte for økning av utbyttet av et interferon alfa-preparat.
Bakgrunn
Naturlig forekommende proteiner er vidt anvendt for forskning og kliniske formål. Selv om slike proteiner kan erholdes fra deres naturlige kilde, kan rekombinante teknikker muliggjøre produksjon av disse proteiner fra ikke-naturlige kilder. Eksempelvis gir fermentering av mikroorganismer konstruert via rekombinant teknologi, slik som transformerte bakterier, store mengder humant interferon til en betydelig lavere pris enn hva som er mulig under anvendelse av naturlige kilder. Slike rekombinante DNA-teknikker er også blitt anvendt for å produsere andre viktige proteiner slik som insulin og vevsplasminogenaktivator.
Fra EP 0553494 Al er det kjent å refolde interferon alfa ved å anvende cystein og cystin.
Bakterier forandret ved rekombinante teknikker, produserer imidlertid også forurensninger og strukturelle isoformer av det protein som er beregnet på å bli produsert. Disse forurensninger og isoformer innbefatter oligomere proteiner og reduserte proteinisoformer (se US patentskrift nr. 4 765 903, D'Andrea et al.), cellerester og virus (se US patentskrift nr. 4 732 683, Georgiadis et al.) og pyruvatkjedede isoformer (se Rose et al., J. Biol. Chem. 287:19101 (1992); Prome et al., J. Biol. Chem. 255:13050 (1991); Stevens et al., J. Biol. Chem. 252:2998
(1977); og Shapiro et al., J. Biol. Chem. 255:3120 (1980)). Det er ønskelig å fjerne disse forurensninger under rensing av proteinet.
Selvsagt reduserer disse proteinisoformer renheten av det ønskede protein, og fremgangsmåter for fjerning av isoformene reduserer det totale utbytte. Hvis imidlertid proteinisoformene kan omdannes til det ønskede protein, er deres fjerning unød-vendig, og det totale proteinutbytte vil bli signifikant forøkt. Hva som trengs, er en måte for å kunne identifisere uønskede proteinisoformer og omdanne disse til det ønskede protein. Foreliggende oppfinnelse dreier seg om slike behov.
Oppsummering av oppfinnelsen
Foreliggende oppfinnelse tilveiebringer en fremgangsmåte for økning av utbyttet av et interferon alfa-preparat. Fremgangsmåten er kjennetegnet ved at en pyruvatsupplementisoform av interferon alfa omdannes til interferon alfa ved eksponering av angitte pyruvatsupplementisoform av interferon alfa overfor en løsning som har en pH fra 5,2 til 5,6. Selv om foreliggende oppfinnelse ikke er begrenset til et bestemt interferon alfa, er interferon alfa i en foretrukket utførelsesform interferon alfa-2b.
Det foretrekkes at syreløsningen er ved pH 5,5. I en slik utførelsesform er det enn videre foretrukket at syreløsningen er ved 34-40 °C.
Foreliggende oppfinnelse er ikke begrenset av den type av syre som anvendes. I foretrukne utførelsesformer omfatter syreløsningen en antioksidant. I særlig foretrukne utførelses-former omfatter antioksidanten metionin. I en slik utførelses-form er den foretrukne konsentrasjon av metionin 5-40 mM.
Definisjoner
Som anvendt her, betyr uttrykket "supplementisoform" en proteinisoform som har strukturelle og/eller funksjonelle karakteristika lik et ønsket protein, hvori en spaltbar gruppe kan fjernes fra proteinet for å gi det ønskede protein. En "spaltbar gruppe" skal forstås å bety en kjemisk gruppe bundet til et ønsket protein som kan fjernes kjemisk. "Kjemisk fjerning" eller "fjernes kjemisk" som anvendt her, skal forstås å angi at en kjemisk gruppe er blitt separert fra et protein på kjemisk måte, innbefattende syreløsning.
Selv om det ikke er nødvendig å utøve foreliggende oppfinnelse, hvis den spaltbare gruppe kan identifiseres kjemisk, kan supplementisoformen refereres til som en spesifikk type av supplementisoform. Eksempelvis er en "pyruvatsupplementisoform" et ønsket protein som har en spaltbar gruppe bundet dertil som er identifiserbar som pyruvat.
Som anvendt her, refererer uttrykket "interferon alfa" til en familie av fremkallbare utskilte proteiner som tilveiebringer motstand overfor virus på målceller, inhiberer celleproliferer-ing og regulerer ekspresjon av MHC klasse I-antigener. Denne familie innbefatter, men er ikke begrenset til, interferon alfa-2a ("Roferon", Hoffman La-Roche, Nutley, NJ), interferon alfa-2b ("Intron", Schering-Plough, Madison, NJ), interferon alfa-2c
("Berofor Alpha", Boehringer Ingelheim, Ingelheim, Tyskland)
eller konsensusinterferon som definert ved bestemmelse av en konsensussekvens av naturlig forekommende interferon alfaer ("Infergen", Amgen, Thousand Oaks, CA).
Detaljert beskrivelse av oppfinnelsen
Foreliggende oppfinnelse angår isolering og rensing av proteiner. I én utførelsesform tilveiebringer foreliggende oppfinnelse identifisering og rensing av supplementisoformer. I en annen utførelsesform tilveiebringer foreliggende oppfinnelse metoder for fremstilling av et ønsket protein fra supplementisoformer. I en ytterligere utførelsesform tilveiebringer foreliggende oppfinnelse et høyrenset, ønsket protein ved korensing av det ønskede protein sammen med supplementisoformer og etterfølgende omdannelse av supplementisoformene til det ønskede protein. På denne måten reduseres mengden av supplementisoform, og det totale utbytte av det ønskede protein økes og/eller er mer høyrenset enn hva som tidligere kunne oppnås. Utbyttet av det ønskede protein kan økes så mye som ti ganger utbyttet som erholdt uten omdannelse av supplementisoformer.
Selv om foreliggende oppfinnelse ikke er begrenset av kilden til det ønskede protein eller supplementisoformene, er kilden, i én utførelsesform, mikroorganismer konstruert via rekombinante teknikker. Det er mange slike teknikker kjent innen faget. Slike transformerte mikroorganismer kan være eukaryotiske eller prokaryotiske celler, bakterier, pattedyrceller, etc. Eksempelvis kan interferon alfa produseres i bakterier ved å følge læren i US patentskrift 4 530 901 tilhørende Weissman, eller ved teknikkene beskrevet i europeisk patentsøknad, publi-kasjonsnr. EP032 134.
Likeledes er foreliggende oppfinnelse ikke begrenset til noen spesiell metode for ekstrahering av pyruvatsupplement-isof ormen fra den produserende celle. Når det ønskede protein er interferon alfa, er f.eks. metodene beskrevet i US patentskrifter nr. 4 315 852 og 4 364 863, Leibowitz et al., egnet.
Likeledes er foreliggende oppfinnelse ikke begrenset av de spesielle renseteknikker som anvendes for å isolere supplement-isof ormen fra det ønskede protein. Mange kromatografi- og andre separeringsteknikker er kjent innen faget og er anvendbare her.
Selv om foreliggende oppfinnelse ikke er begrenset ved metoden for identifisering av supplementisoformen, kan identifisering av supplementisoformer utføres ved studering av molekylvekten av det ønskede protein og enhver forurensning som har en molkylvekt høyere enn det ønskede protein. Én slik metode er beskrevet i Rose et al., J. Biol. Chem. 267:19101 (1992). Forurensninger som har en molekylvekt høyere enn det ønskede protein, kan eksponseres overfor degraderingsbetingelser (f.eks. ekstremt sur eller ekstremt basisk pH) og analyseres med hensyn til nedbrytningsprodukter. Hvis ett av disse nedbrytningsprodukter har den samme masse og/eller de strukturelle karakteristika som det ønskede protein, kan forurensningen betraktes som en supplementisoform som har en spaltbar gruppe.
Foreliggende oppfinnelse er heller ikke begrenset av temperaturen ved hvilken spaltningsreaksjonen utføres. Jo høyere temperaturen er, jo hurtigere vil imidlertid supplementisoformen bli omdannet til det ønskede protein.
Selv om kjemisk fjerning av en spaltbar gruppe kan produsere et protein med samme strukturelle karakteristika som det ønskede protein, er det enkelte ganger nødvendig å oksidere reduserte sulfhydrylgrupper til disulfidbindinger. Dette muliggjør at proteinet antar riktig folding og blir et funksjonelt protein. Metoder for oksidering av sulfhydrylgrupper er kjent innen faget, og foreliggende oppfinnelse er ikke begrenset ved noen bestemt oksidasjonsmetode.
I én utførelsesform tar foreliggende oppfinnelse i betraktning beskyttelse av metioningrupper under oksidasjon for å forhindre dannelse av metioninsulfoksid. Metoder for beskyttelse av metioningrupper er kjent innen faget, og foreliggende oppfinnelse er ikke begrenset av bestemte metoder for beskyttelse av metioningrupper. Metoder innbefatter imidlertid anvendelse av antioksidanter som beskrevet av Lam et al., J. Pharm. Sei. 86:1250 (1997) og US patentskrift nr. 5 272 135, Takruri.
Foreliggende oppfinnelse er heller ikke begrenset av metoden for implementering av en oksidasjonsreaksjon. I én utførelsesform tar f.eks. foreliggende oppfinnelse i betraktning fjerning av en spaltbar gruppe etterfulgt av oksidasjon av sulfhydrylgrupper. I en annen utførelsesform tar foreliggende oppfinnelse i betraktning fjerning av spaltbare grupper og oksidering av sulfhydrylgrupper under de samme reaksjonsbetingelser.
Når den kjemiske fjerning av den spaltbare gruppe og oksidasjon av proteinet utføres i samme reaksjon, er foreliggende oppfinnelse likeledes ikke begrenset ved noen bestemt metode for fjerning av spaltbare grupper fra en supplementisoform og oksidering. I én utførelsesform utføres imidlertid en skreeningsprosess for å bestemme de beste betingelser for kjemisk fjerning av den spaltbare gruppe. Eksempelvis kan forsøk under anvendelse av et område av pH-betingelser foretas, og mengden av resulterende ønsket protein med riktig strukturell integritet (dvs. ikke irreversibelt denaturert) og/eller mengden av spaltbar gruppe kan måles. En nedtegning av mengden av ønsket protein som har riktig strukturell integritet mot reaksjons-pH, vil generelt resultere i en klokkekurve hvor det høyeste punktet av kurven representerer den ideelle pH for kjemisk fjerning av den spaltbare gruppe. I en slik utførelsesform kan en lignende skreening foretas for oksidasjonsreaksjonen. Hvis klokkekurvene for den kjemiske fjerningsreaksjon og oksidasjonsreaksjonen krysser hverandre, angir krysningspunktet de beste pH-betingelser for fjerning av den spaltbare gruppe og oksidering av hydroksyl-gruppene i samme reaksjon. For kjemisk fjerning og oksidasjon av en pyruvatsupplementisoform av interferon alfa, krysser de to kurver rundt pH 5, hvilket angir den beste pH ved hvilken en kombinasjonsreaksjon skal utføres. Andre reaksjonsbetingelser som kan evalueres, innbefatter, men er ikke begrenset til, saltkonsentrasjon, temperatur, etc.
Etter omdannelse av supplementisoformen til det ønskede protein kan ytterligere kromatografitrinn være nødvendig for å rense de ønskede proteiner fra forurensninger.
Etter at det ønskede protein er hensiktsmessig renset, kan det anbringes i en form egnet for terapeutisk bruk om ønsket. Når det ønskede protein er interferon alfa, er f.eks. formuler-ingene beskrevet i US patentskrifter nr. 4 847 079 og 4 496 537, Kwan, og US patentskrift nr. 5 766 582, Yuen et al., egnet. Alternativt kan andre inerte, farmasøytisk akseptable bærere enten være faste eller væskeformige. Preparater i fast form innbefatter pulvere, tabletter, dispergerbare granuler, kapsler, pulverkapsler og stikkpiller. Pulvrene og tablettene kan være omfattet av fra ca. 5 til ca. 95% ønsket protein. Egnede faste bærere er kjent innen faget, f.eks. magnesiumkarbonat, magnes-iumstearat, talkum, sukker eller laktose. Tabletter, pulvere, pulverkapsler og kapsler kan anvendes som faste doseringsformer egnet for oral administrering.
For fremstilling av stikkpiller smeltes først et lavtsmelt-ende voks, slik som en blanding av fettsyreglyserider (f.eks. kakaosmør), og den aktive bestanddel dispergeres homogent deri ved omrøring. Den smeltede, homogene blanding helles deretter over i støpeformer av egnet størrelse, tillates å avkjøles og derved stivne.
Væskeformige preparater innbefatter løsninger, suspensjoner og emulsjoner. Eksempelvis kan vann eller vann-propylenglykol-løsninger for parenteral injeksjon anvendes, eller tilsetning av søtningsmidler og blakkgjøringsmidler for orale løsninger, suspensjoner og emulsjoner. Væskeformige preparater kan også innbefatte løsninger for intranasal administrering.
Aerosolpreparater egnet for inhalering, kan innbefatte løs-ninger og faste materialer i pulverform som kan være i kombina-sjon med en farmasøytisk akseptabel bærer slik som en inert, komprimert gass.
Interferon alfa-preparatet fremstilt ved fremgangsmåten
ifølge oppfinnelsen kan også avgis transdermalt. De transdermale preparater kan anta form av kremer, lotions, aerosoler og/eller emulsjoner og kan være innbefattet i et transdermalt plaster av matriks- eller reservoartypen som hensiktsmessig innen faget for dette formål.
Mengden av aktiv forbindelse i en enhetsdose av preparat kan justeres fra ca. 0,01 mg til ca. 1 000 mg, og fortrinnsvis fra ca. 0,01 mg til ca. 750 mg. Alternativt kan den aktive forbindelse fremstilles ved internasjonale enheter hvor de foretrukne doser er mellom 3 millioner og 50 millioner internasjonale enheter. I en slik utførelsesform er 3 millioner, 5 millioner, 18 millioner, 25 millioner og 50 millioner enhets-doser tatt i betraktning.
Det kan også fremstilles faste former som er beregnet på å bli omdannet, kort før bruk, til væskeformige preparater for enten oral, topisk eller parenteral administrering.
De etterfølgende eksempler tjener til å illustrere visse foretrukne utførelsesformer og aspekter ved foreliggende oppfinnelse .
Eksempel 1: Skreeningsprosess for omdannelse av pyruvat-supplementisof ormer
Pyruvatsupplementisoformer kan dannes på innsiden av celler, hvori alfa-aminogruppen av den N-terminale aminosyrerest av et protein kondenseres med karbonylgruppen av pyruvat. Hvis pyruvatet interfererer med proteinstrukturen, er det bare når en slik pyruvat-proteinsupplementisoform hydrolyseres (pyruvat spaltes fra et protein) at proteinet fritt kan foldes igjen i dets ønskede form via termodynamisk fordelaktig strukturfor-andring. Hvis et ønsket protein har disulfidbindinger, skal en redusert isoform resulterende fra pyruvatspaltningen, oksideres som en del av refoldingen inn i den ønskede form.
Den etterfølgende prosedyre illustrerer hvordan de optimale betingelser kan bestemmes for å omdanne pyruvat-proteinsupplementisoform over i dens ønskede form. Hvis et ønsket protein ikke har disulfidbindinger, må, som diskutert tidligere, skreening utføres for enkelt å maksimere pyruvatspaltningen (hydrolyse) . Hvis et ønsket protein har disulfidbindinger, må skreening utføres for å maksimere ikke bare pyruvatspaltning (hydrolyse) , men også disulfidbindingsdannelse (oksidasjon).
1) Pyruvatutprøvning:
En pyruvatutprøvning er nødvendig for å overvåke graden av hydrolyse for å forstå pyruvat-spaltningskinetikken. Eksempelvis kan "fritt" pyruvat kvantitativt bestemmes ved en kjemisk modi-fiseringsmetode eller en enzymatisk metode. 2,4-dinitrofenyl-hydrazin (DNPH) kan anvendes for å derivatisere pyruvat. En forsøksprøve skal ultrafiltreres for å eliminere en pyruvat-proteinsupplementisoform under anvendelse av en korrekt MWCO-membran, f.eks. en lOK-membran. Et filtrat inkuberes ved sur pH med DNPH som reagerer med "fritt" pyruvat. DNPH-derivatisert pyruvat, 2,4-dinitrofenylhydrazon, kan lett analyseres på RP-HPLC under anvendelse av en C8-kolonne slik som en "Nucleosil C8"- (5 um) kolonne.
Da derivatiseringsreaksjonen er støkiometrisk, er en kvantitativ måling av pyruvat også mulig. Et enzymsett (f.eks. laktatdehydrogenase/NADH) kan også anvendes for å måle pyruvat. Denne metode krever ikke prøveultrafiltrering da dens milde betingelser ikke spalter pyruvat fra en pyruvat-proteinsupplementisoform under inkubering.
For å måle den kombinerte mengde fritt pyruvat og pyruvat bundet til et protein, skal alt bundet pyruvat spaltes fra før derivatiseringen. Da DNPH-derivatiseringsmetoden krever meget sur pH og relativt lang inkuberingstid, kan pyruvat spaltes fra og deretter derivatiseres med DNPH under inkuberingen. En prøve skal derfor anvendes uten å bli ultrafiltrert i DNPH-derivatiseringsmetoden for å måle en kombinert mengde av fritt og bundet pyruvat i prøven.
2) Isoformbestemmelse:
Minst tre isoformer eksisterer for proteiner med disulfidbindinger, og to isoformer eksisterer for proteiner uten disulfidbindinger. Generelt angitt, kan et ønsket protein og dets reduserte form lett oppløses med RP-HPLC.
I tilfellet av et protein med disulfidbindinger vil skreening være meget effektivt hvis tre isoformer (supplementisoform, redusert og ønsket protein) kan analyseres kvantitativt på RP-HPLC. Det vil ikke være noe absolutt behov for pyruvatbestemmelsen, og det er mulig å identifisere hvilket trinn som er hastighetsbegrensende hvis slikt er tilfelle. Imidlertid er det vanligvis vanskelig å oppløse en pyruvat-proteinsupplementisoform fra en redusert form. I dette tilfelle er en pyruvatbestemmelse nødvendig for å optimalisere hvert omdannelsestrinn.
3) Måling av isoformsammensetning:
Når en ønsket form ikke har disulfidbindinger, kan isoformsammensetningen bestemmes uten vanskelighet da en pyruvat-proteinsupplementisoform lett kan oppløses fra en ønsket form på
RP-HPLC.
Når den ønskede form har disulfidbindinger og en proteinsupplementisoform ikke er separerbar fra dens reduserte form, skal et pyruvat bundet til et protein, måles for å bestemme isoformsammensetningen. Den molare mengde pyruvat bundet til et protein, som er mengden av en proteinsupplementisoform, er den kombinerte mengde fritt og bundet pyruvat -s- mengden av fritt pyruvat. Dette kan måles under anvendelse av en prøve med og uten ultrafiltrering i DNPH-metoden. Mengden av en redusert form er da forskjellen mellom den kombinerte mengde av en protein-supplementisof orm og en redusert form målt med RP-HPLC og mengden av pyruvat bundet til et protein bestemt med en pyruvatbestemmelse. Isoformsammensetningen kan deretter beregnes.
4) Skreening av optimale betingelser:
Hvor vidt en ønsket form har disulfidbindinger eller ikke, skal skreeningskriteriene være de samme for å maksimere den spesifikke omdannelsesgrad av supplementisoformen til en ønsket form. 4.1) Når et ønsket protein ikke har noen disulfidbinding: I dette tilfelle spaltes en ønsket proteinform som pyruvat fra en pyruvat-proteinsupplementisoform. Pyruvatspaltning behøver ikke å overvåkes ved pyruvatbestemmelse i dette tilfelle, da det er bare ett trinn, hydrolyse, som er involvert i omdannelsen av supplementisoformen til en ønsket form. Overvåkning både av forsvinningen av supplementisoformen og dannelse av en ønsket form på RP-HPLC er f.eks. tilstrekkelig. Inkuberings-betingelser for å maksimere omdannelsen av en supplementisoform til et ønsket protein må finnes.
Det første trinn er å undersøke reaksjonskinetikken med hensyn til et arbeidsområde for den proteinsupplementisoform-konsentrasjon som skal anvendes i skreeningen. Hvis kinetikken er av første orden med hensyn til supplementisoformkonsentra-sjonen, har prøvekonsentrasjonen ingen innflytelse på kinetikken, og enhver konsentrasjon kan anvendes under skreeningen eller parameterevalueringen. Ellers bør konsentrasjonen holdes konstant under skreeningen.
Det kan være mange parametre som påvirker hydrolysetrinnet. Hovedparametrene kan være pH, temperatur, metallioner (slik som sink, jern(III), jern(II), Cu, Mg, etc), ledningsevne, buffere, lys og omrøring. Ved måling av effekten av en inkuberingsparameter på omdannelsen av en supplementisoform til en ønsket form kan hver parameter optimaliseres. Eksempelvis inkuberes flere aliquoter av en prøve inneholdende en pyruvat-proteinsupplementisoform ved et tilstrekkelig område av for-skjellige pH-verdier, hvor alle de andre parametre holdes ved deres respektive best anslåtte verdier. Omdannelsesreaksjonen i hver aliquot måles etter en bestemt inkuberingsperiode (f.eks. over natten. Den pH ved hvilken den høyeste omdannelse erholdes, bestemmes som den optimale pH. Et slikt forsøk gjentas for å optimalisere andre parametre med optimale verdier av de opti-maliserte parametrer anvendt istedenfor deres tidligere best antatte verdier. Dette er en typisk optimaliseringsteknikk.
Inkuberings-pH påvirker hydrolysegraden. Generelt fører lavere pH til mer hydrolyse. Høyere temperatur øker også hydrolyse. Hydrolyse ved en meget sur pH, slik som pH 2, kan imidlertid ikke fungere når det er en irreversibel utfelling av en supplementisoform eller et ønsket protein, eller hvis proteinet denatureres irreversibelt. Nærvær av enkelte metallkationer kan katalysere hydrolysen. Selv om et metallkation katalyserer pyruvatspaltningen, kan en slik katalyse være sterkt metallkationkonsentrasjonsavhengig. Et meget bredt område av metallionkonsentrasjon skal derfor anvendes når metallkationer skreenes.
Det kan også være interaksjoner blant parametrene. Det kan f.eks. være mulig at det er forskjellig optimal pH avhengig av hvorvidt et metallion er til stede eller ikke når et slikt kation har en innflytelse på omdannelsen. Når det gjelder en pyruvatsupplementisoform, resulterer nærvær av Zn-kation i en forskjellig optimal pH for pyruvatspaltning (pH 7,8-8,6). Det er derfor nødvendig å variere samtidig ikke bare en ny parameter som skal optimaliseres, men også andre viktige parametre for virkelig å optimalisere denne.
4.2) Når et ønsket protein har disulfidbindinger:
I en to-trinnsomdannelsesprosess spaltes en redusert form fra supplementisoformen via hydrolyse og omdannes deretter til en ønsket form via oksidasjon.
Ideelt sett isoleres en proteinsupplementisoform og en redusert form, og prosedyren som er beskrevet ovenfor for tilfellet av et protein uten disulfidbindinger, anvendes på hver av supplementisoformen og den reduserte form for å optimalisere hvert trinn. En hovedforskjell er at oksygenoverføring og enkelte oksidanter slik som oksidert glutation (GS-SG) i tillegg til parametrene angitt ovenfor, kan optimaliseres for oksidasjonstrinnet. Hvis GS-SG oksiderer bare en redusert form, vil den sterkt øke oksidasjonen av disulfidbindingsdannelsestrinnet. Imidlertid vil det sannsynligvis være et lavt utbytte eller omdannelse hvis GS-SG også oksiderer supplementisoformen og den oksiderte supplementisoform ikke lett hydrolyseres.
Fra hver optimal tilstand kan de optimale betingelser for omdannelsen av supplementisoformen til en ønsket form bestemmes. Hvis de er rimelig nær, innstilles de intermediære tilstander som optimale tilstander. Teoretisk angitt, kan det være for-skjellige optimale tilstander avhengig av begynnelsesforholdet mellom pyruvat-proteinsupplementisoformen og en redusert form i en prøve. Eksempelvis skal de optimale tilstander være for-skjellige når supplementisoformen utgjør den absolutte majoritet, når en redusert form er i absolutt majoritet. Det skal derfor tas i betraktning at prøvesammensetningen skal tas hensyn til når de optimale tilstander bestemmes fra de individuelle optimale tilstander for hydrolysen og oksidasjonen.
Sluttelig bekreftes de optimale tilstander for omdannelsen eksperimentelt. Det er ofte nyttig å fininnstille de optimale betingelser for omdannelsen for å identifisere et hastighetsbegrensende trinn hvis slikt eksisterer. Den stabile akkumulering av redusert form med inkuberingstiden indikerer at oksidasjonstrinnet er hastighetsbegrensende. Når akkumulering skjer, skal betingelser som er mer fordelaktige for oksidasjonen, slik som mer oksygen, høyere pH og høyere temperatur, anvendes for å maksimere dannelsen av den ønskede form. Hvis det alltid er et lavt nivå av redusert protein, men signifikant dannelsesgrad av en ønsket form, er spaltningstrinnet hastighetsbegrensende. Når dette skjer, kan inkuberingsbetingelsene forandres slik at de kan forbedre spaltningstrinnet, som vil lede til maksimering av dannelsen av den ønskede form.
Hvis de optimale betingelser for kjemisk fjerning av en spaltbar gruppe og oksidasjon av proteinet er meget langt fra hverandre, kan de utføres trinnvis. Eksempelvis utføres de optimale betingelser for hydrolysetrinnet først, og de optimale betingelser for oksidasjonstrinnet anvendes når hydrolysen er praktisk talt fullført.
Når det ikke er enkelt å isolere hver isoform, blir pyruvatbestemmelsen nødvendig, spesielt når de to isoformer ikke kan oppløses på RP-HPLC. Ved overvåkning av pyruvatfrigivelse kan hydrolysetrinnet først optimaliseres. Det andre trinn optimaliseres når det første trinn er praktisk talt over eller meget langsomt. Fra disse optimale betingelser bestemmes de totale optimale omdannelsesbetingelser og bekreftes eksperimentelt. En alternativ løsning er at den totale omdannelse optimaliseres etter at hydrolysetrinnet er optimalisert. Denne løsning kan være mer praktisk når det er vanskelig å optimalisere det andre trinn på grunn av interferens forårsaket av signifikant og kontinuerlig supplementisoformhydrolyse. Som nevnt tidligere, er pH, temperatur, oksygenoverføring, metallkationer og oksidanter viktige parametre som må optimaliseres.
Interaksjoner mellom parametrene blir mer viktige for to-trinnsomdannelsesprosessen enn de er for en-trinnsomdannelses-prosessen.
For å bekrefte at det ikke er noen innvirkning av slike optimale tilstandsparametre på en ønsket form, skal en ønsket form renses, og dens egenskaper, innbefattende biologisk spesifikk aktivitet og renhet, skal full ut kontrolleres.
Eksempel 2: Omdannelse av pyruvatsupplementisoform til interferon alfa2b
Spaltningen av pyruvat og dannelsen av disulfidbindingene ble utført ved forhøyet temperatur (30-37 °C) og en reaksjons-pH på 5,2-5,6. Disse reaksjonsbetingelser er unike ved at begge reaksjoner finner sted sekvensvis under de samme reaksjonsbetingelser, og at bioaktivt protein gjenvinnes.
Fraksjonene inneholdende toppen av protein UV-absorbans som eluerte fra proteinisoleringskromatografien, ble samlet sammen og sterilitetsfiltrert ved 0,45 U.M. 3 g metionin pr. 1 proteinansamling ble tilsatt til proteinansamlingen og ble omrørt inntil oppløsning. pH på ansamlingen ble justert til 5,2-5,6 med fortynnet natrium-hydroksid. Natriumkloridkonsentrasjonen ble ikke justert: den var mellom 150-200 mM NaCl.
En lagerløsning bestående av 10 mM acetat, pH 5,5, 200 mM metionin og 200 mM NaCl, ble tilsatt til proteinansamlingen til en sluttkonsentrasjon på 20 mM metionin.
Proteinansamlingen ble overført til et reaksjonskar, og temperaturen ble hevet til 37 °C med jevn omrøring. Proteinansamlingen ble inkubert ved 36-38 °C i 24-30 timer.
Ved 24-30-timerstidspunktet ble reaksjonblandingen filtrert gjennom et dypfilter etterfulgt av et 0,45 uM filter for å fjerne utfellingen. Ansamlingen ble deretter konsentrert og diafiltrert mot 10 mM acetat, pH 5,5, ved 2-10 °C.
Claims (7)
1. Fremgangsmåte for økning av utbyttet av et interferon alfa-preparat,
karakterisert ved at en pyruvatsupplementisoform av interferon alfa omdannes til interferon alfa ved eksponering av angitte pyruvatsupplementisoform av interferon alfa overfor en løsning som har en pH fra 5,2 til 5,6.
2. Fremgangsmåte ifølge krav 1,
karakterisert ved at angitte løsning har en pH på 5,5.
3. Fremgangsmåte ifølge krav 1,
karakterisert ved at angitte interferon alfa er interferon alfa-2b.
4. Fremgangsmåte ifølge krav 1,
karakterisert ved at angitte løsning har en temperatur på 34-40 °C.
5. Fremgangsmåte ifølge krav 1,
karakterisert ved at angitte løsning omfatter en antioksidant.
6. Fremgangsmåte ifølge krav 5,
karakterisert ved at angitte antioksidant omfatter metionin.
7. Fremgangsmåte ifølge krav 6,
karakterisert ved at angitte metionin fore-ligger ved en konsentrasjon på 5-40 mM.
Applications Claiming Priority (2)
Application Number | Priority Date | Filing Date | Title |
---|---|---|---|
US19054298A | 1998-11-12 | 1998-11-12 | |
PCT/US1999/020900 WO2000029440A1 (en) | 1998-11-12 | 1999-10-05 | Methods of conversion of interferon isoforms and products thereof |
Publications (3)
Publication Number | Publication Date |
---|---|
NO20012327L NO20012327L (no) | 2001-05-11 |
NO20012327D0 NO20012327D0 (no) | 2001-05-11 |
NO329483B1 true NO329483B1 (no) | 2010-10-25 |
Family
ID=22701766
Family Applications (2)
Application Number | Title | Priority Date | Filing Date |
---|---|---|---|
NO20012327A NO329483B1 (no) | 1998-11-12 | 2001-05-11 | Fremgangsmate for okning av utbyttet av et interferon alfa-preparat. |
NO20100775A NO331699B1 (no) | 1998-11-12 | 2010-05-27 | Fremgangsmate for okning av utbyttet av et inerferon alfa-preparat |
Family Applications After (1)
Application Number | Title | Priority Date | Filing Date |
---|---|---|---|
NO20100775A NO331699B1 (no) | 1998-11-12 | 2010-05-27 | Fremgangsmate for okning av utbyttet av et inerferon alfa-preparat |
Country Status (27)
Country | Link |
---|---|
EP (2) | EP1894944B1 (no) |
JP (3) | JP4468585B2 (no) |
KR (1) | KR100922454B1 (no) |
CN (2) | CN100390197C (no) |
AR (1) | AR023906A1 (no) |
AT (2) | ATE409706T1 (no) |
AU (1) | AU766309B2 (no) |
BR (1) | BR9915257A (no) |
CA (1) | CA2348739C (no) |
CY (2) | CY1110444T1 (no) |
CZ (2) | CZ303110B6 (no) |
DE (2) | DE69939657D1 (no) |
DK (2) | DK1894944T3 (no) |
ES (2) | ES2315019T3 (no) |
HK (2) | HK1112746A1 (no) |
HU (1) | HU228265B1 (no) |
ID (1) | ID28552A (no) |
IL (2) | IL142546A0 (no) |
NO (2) | NO329483B1 (no) |
NZ (1) | NZ511074A (no) |
PL (2) | PL200274B1 (no) |
PT (2) | PT1129111E (no) |
SI (2) | SI1894944T1 (no) |
SK (2) | SK287564B6 (no) |
TW (1) | TW577894B (no) |
WO (1) | WO2000029440A1 (no) |
ZA (1) | ZA200103010B (no) |
Families Citing this family (2)
Publication number | Priority date | Publication date | Assignee | Title |
---|---|---|---|---|
JP4468585B2 (ja) * | 1998-11-12 | 2010-05-26 | シェーリング コーポレイション | インターフェロンアイソフォームおよびその産物の変換の方法 |
JP2012513200A (ja) * | 2008-12-23 | 2012-06-14 | シェーリング コーポレイション | 組換え製造インターフェロンの精製 |
Family Cites Families (14)
Publication number | Priority date | Publication date | Assignee | Title |
---|---|---|---|---|
US4530901A (en) | 1980-01-08 | 1985-07-23 | Biogen N.V. | Recombinant DNA molecules and their use in producing human interferon-like polypeptides |
IE54096B1 (en) | 1980-01-08 | 1989-06-21 | Biogen Nv | Dn sequences, recombinant dna molecules and processes for producing human interferon - like polypeptides |
US4315852A (en) | 1980-11-26 | 1982-02-16 | Schering Corporation | Extraction of interferon from bacteria |
US4364863A (en) * | 1980-12-29 | 1982-12-21 | Schering Corporation | Extraction of interferon from bacteria |
EP0082481B2 (en) | 1981-12-23 | 1990-09-12 | Schering Corporation | Stabilised alpha-interferon formulations and their preparation |
DE3515336C2 (de) * | 1985-04-27 | 1994-01-20 | Boehringer Ingelheim Int | Verfahren zur Herstellung und Reinigung von â-Interferon |
US4847079A (en) | 1985-07-29 | 1989-07-11 | Schering Corporation | Biologically stable interferon compositions comprising thimerosal |
US4732683A (en) | 1986-12-02 | 1988-03-22 | Biospectrum, Inc. | Purification method for alpha interferon |
US4765903A (en) | 1987-10-06 | 1988-08-23 | Interferon Sciences, Inc. | Purification of monomeric interferon |
US5272135A (en) | 1991-03-01 | 1993-12-21 | Chiron Ophthalmics, Inc. | Method for the stabilization of methionine-containing polypeptides |
AU648214B2 (en) * | 1991-12-31 | 1994-04-14 | Lucky Limited | Recombinant gene coding for human alpha interferon and expression vector thereof, etc. |
ES2161793T3 (es) * | 1994-04-09 | 2001-12-16 | Hoffmann La Roche | Proceso para la produccion de alfa-interferona. |
US5766582A (en) | 1994-10-11 | 1998-06-16 | Schering Corporation | Stable, aqueous alfa interferon solution formulations |
JP4468585B2 (ja) * | 1998-11-12 | 2010-05-26 | シェーリング コーポレイション | インターフェロンアイソフォームおよびその産物の変換の方法 |
-
1999
- 1999-10-05 JP JP2000582425A patent/JP4468585B2/ja not_active Expired - Fee Related
- 1999-10-05 CN CNB998132136A patent/CN100390197C/zh not_active Expired - Fee Related
- 1999-10-05 EP EP07122953A patent/EP1894944B1/en not_active Expired - Lifetime
- 1999-10-05 ID IDW00200101043A patent/ID28552A/id unknown
- 1999-10-05 TW TW088117149A patent/TW577894B/zh not_active IP Right Cessation
- 1999-10-05 KR KR1020017005227A patent/KR100922454B1/ko not_active IP Right Cessation
- 1999-10-05 WO PCT/US1999/020900 patent/WO2000029440A1/en active Application Filing
- 1999-10-05 DK DK07122953.8T patent/DK1894944T3/da active
- 1999-10-05 DK DK99951431T patent/DK1129111T3/da active
- 1999-10-05 SK SK5003-2010A patent/SK287564B6/sk not_active IP Right Cessation
- 1999-10-05 AU AU63870/99A patent/AU766309B2/en not_active Ceased
- 1999-10-05 NZ NZ511074A patent/NZ511074A/en not_active IP Right Cessation
- 1999-10-05 CZ CZ20110011A patent/CZ303110B6/cs not_active IP Right Cessation
- 1999-10-05 HU HU0104113A patent/HU228265B1/hu unknown
- 1999-10-05 BR BR9915257-6A patent/BR9915257A/pt not_active Application Discontinuation
- 1999-10-05 CZ CZ20011303A patent/CZ302402B6/cs not_active IP Right Cessation
- 1999-10-05 IL IL14254699A patent/IL142546A0/xx unknown
- 1999-10-05 SI SI9931048T patent/SI1894944T1/sl unknown
- 1999-10-05 EP EP99951431A patent/EP1129111B1/en not_active Expired - Lifetime
- 1999-10-05 SI SI9931022T patent/SI1129111T1/sl unknown
- 1999-10-05 AT AT99951431T patent/ATE409706T1/de active
- 1999-10-05 ES ES99951431T patent/ES2315019T3/es not_active Expired - Lifetime
- 1999-10-05 PT PT99951431T patent/PT1129111E/pt unknown
- 1999-10-05 PT PT07122953T patent/PT1894944E/pt unknown
- 1999-10-05 DE DE69939657T patent/DE69939657D1/de not_active Expired - Lifetime
- 1999-10-05 CN CNA2008100866846A patent/CN101255188A/zh active Pending
- 1999-10-05 DE DE69942655T patent/DE69942655D1/de not_active Expired - Lifetime
- 1999-10-05 AR ARP990105037A patent/AR023906A1/es active IP Right Grant
- 1999-10-05 PL PL348162A patent/PL200274B1/pl not_active IP Right Cessation
- 1999-10-05 AT AT07122953T patent/ATE476445T1/de active
- 1999-10-05 SK SK617-2001A patent/SK287372B6/sk not_active IP Right Cessation
- 1999-10-05 CA CA2348739A patent/CA2348739C/en not_active Expired - Fee Related
- 1999-10-05 PL PL385501A patent/PL201341B1/pl not_active IP Right Cessation
- 1999-10-05 ES ES07122953T patent/ES2348104T3/es not_active Expired - Lifetime
-
2001
- 2001-04-11 ZA ZA200103010A patent/ZA200103010B/en unknown
- 2001-04-11 IL IL142546A patent/IL142546A/en not_active IP Right Cessation
- 2001-05-11 NO NO20012327A patent/NO329483B1/no not_active IP Right Cessation
- 2001-09-06 HK HK08107904.2A patent/HK1112746A1/xx not_active IP Right Cessation
- 2001-09-06 HK HK01106287.8A patent/HK1035544A1/xx not_active IP Right Cessation
-
2006
- 2006-10-03 JP JP2006272306A patent/JP2006348056A/ja not_active Withdrawn
-
2008
- 2008-12-16 CY CY20081101455T patent/CY1110444T1/el unknown
-
2010
- 2010-05-27 NO NO20100775A patent/NO331699B1/no not_active IP Right Cessation
- 2010-06-17 JP JP2010138760A patent/JP2010209117A/ja not_active Withdrawn
- 2010-09-16 CY CY20101100841T patent/CY1110794T1/el unknown
Also Published As
Similar Documents
Publication | Publication Date | Title |
---|---|---|
US6281337B1 (en) | Methods for conversion of protein isoforms | |
Pote et al. | Otoconin-22, the major protein of aragonitic frog otoconia, is a homolog of phospholipase A2 | |
US4771036A (en) | Method and ophthalmic composition for the prevention and reversal of cataracts | |
BRPI0709737A2 (pt) | processo para concentraÇço de um polipeptÍdeo | |
KR20010083900A (ko) | 활성 β-NGF의 제조방법 | |
NO331699B1 (no) | Fremgangsmate for okning av utbyttet av et inerferon alfa-preparat | |
Pascale et al. | Biosynthesis and oligosaccharide structure of human CD8 glycoprotein expressed in a rat epithelial cell line. | |
US6545140B1 (en) | DNA encoding an avian beta-defensin and uses thereof | |
JP2003245094A (ja) | 無細胞系タンパク質合成方法およびそのための抽出液 | |
EP0578472A2 (en) | A process for recovering peptides expressed as fusion proteins | |
Zheng et al. | Origin of the suppression of chloride ion sensitivity in human embryonic hemoglobin Gower II | |
Dunten et al. | Crystallization of 5-keto-4-deoxyuronate isomerase from Escherichia coli | |
JP2006006242A (ja) | アメロゲニン融合タンパク質 | |
EP0620278A1 (en) | Human transaldolase and DNA encoding therefor | |
JPH111499A (ja) | 肝実質細胞増殖因子 | |
JP2000116384A (ja) | 新規遺伝子及びそれにコ―ドされる蛋白質pgth | |
JPH09157298A (ja) | プロテアーゼインヒビター | |
JP2002291478A (ja) | 糖蛋白質の肝臓集積性を向上させる方法 |
Legal Events
Date | Code | Title | Description |
---|---|---|---|
CHAD | Change of the owner's name or address (par. 44 patent law, par. patentforskriften) |
Owner name: MERCK SHARP AND DOHME CORP Free format text: NEW ADDRESS: 126 EAST LINCOLN AVENUE, US-NJ07065 RAHWAY, US |
|
MM1K | Lapsed by not paying the annual fees |