ES2315019T3 - Metodos para conversion de isoformas de interferon y productos de las mismas. - Google Patents
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Abstract
Un método para aumentar el rendimiento de una composición de interferón alfa, que comprende convertir una isoforma adjunta de piruvato de interferón alfa en interferón alfa, mediante exposición de dicha isoforma adjunta de piruvato de interferón alfa a una solución que tiene un pH de aproximadamente 5,5.
Description
Métodos para conversión de isoformas de
interferón y productos de las mismas.
Por toda esta descripción, se hace referencia a
diversas publicaciones, patentes y solicitudes de patente.
La presente invención se refiere al aislamiento
y purificación de proteínas. En particular, la presente invención
se refiere al aislamiento de proteínas, aislamiento de isoformas de
proteínas y conversión de isoformas en las proteínas deseadas.
Se usan ampliamente proteínas de origen natural
para fines de investigación y clínicos. Aunque dichas proteínas se
pueden obtener de su fuente natural, las técnicas recombinantes
pueden permitir la producción de estas proteínas a partir de
fuentes no naturales. Por ejemplo, la fermentación de
microorganismos generados mediante tecnología recombinante, tales
como bacterias transformadas, produce grandes cantidades de
interferón humano a un coste sustancialmente menor que el que es
posible al utilizar fuentes naturales. Dichas técnicas de ADN
recombinante también se han utilizado para producir otras proteínas
importantes, tales como insulina y activador del plasminógeno
tisular.
El documento EP 0 679 718 A se refiere a un
proceso de extracción para extraer interferón alfa de cuerpos de
exclusión, que se lleva a cabo a pH 3,0. El documento EP 0 553 494
se refiere al replegamiento de interferón alfa usando cisteína y
cistina.
El documento EP 0 203 382 se refiere a la
purificación de interferón alfa.
Las bacterias modificadas por técnicas
recombinantes, sin embargo, también producen contaminantes e
isoformas estructurales de la proteína que se desea producir. Estos
contaminantes e isoformas incluyen proteínas oligoméricas e
isoformas de proteínas reducidas (véase la Patente de Estados
Unidos Nº 4.765.903 para D'Andrea et al.), residuos
celulares y virus (véase la Patente de Estados Unidos Nº 4.732.683
para Georgiadis et al.) e isoformas ligadas a piruvato
(véase Rose et al., J. Biol. Chem. 287: 19101 (1992); Prome
et al., J. Biol. Chem. 266: 13050 (1991); Stevens et
al., J. Biol. Chem. 252:2998 (1977); y Shapiro et al., J.
Biol. Chem. 255:3120 (1980)). Es deseable eliminar estos
contaminantes durante la purificación de la proteína.
Claramente, estas isoformas de proteínas reducen
la pureza de la proteína deseada y los procesos para eliminar las
isoformas reducen el rendimiento global. Sin embargo, si las
isoformas de proteínas se pueden convertir en la proteína deseada,
su eliminación es innecesaria y los rendimientos de proteína
globales se aumentarían considerablemente. Lo que se necesita es
una manera de identificar isoformas de proteínas no deseadas y
convertirlas en la proteína deseada. La presente invención aborda a
dichas necesidades.
La presente invención se refiere a métodos para
preparar proteínas altamente purificadas en altos rendimientos
mediante aislamiento de isoformas adjuntas y conversión de las
mismas en una proteína funcional deseada. En una realización, la
presente invención proporciona un método para aumentar el
rendimiento de una composición de interferón alfa, que comprende
convertir una isoforma adjunta de piruvato de interferón alfa en
interferón alfa, mediante exposición de dicha isoforma adjunta de
piruvato de interferón alfa en una solución que tiene un pH de
aproximadamente 5,5. Aunque la presente invención no se limita a un
interferón alfa particular, en una realización preferida el
interferón alfa es interferón alfa2b.
La presente invención se refiere a métodos para
convertir una isoforma adjunta producida recombinantemente en la
proteína deseada, que comprende eliminar químicamente un grupo
escindible de la isoforma adjunta.
En la presente invención, el grupo escindible
comprende piruvato.
En cuanto al método de eliminación químicamente
del grupo escindible, en la invención, el método comprende exponer
la isoforma adjunta a una solución ácida, y la solución ácida está
aproximadamente a pH 5,5. En una realización de este tipo, se
prefiere además que la solución ácida esté a
34-40ºC. También se describen en este documento
métodos en los que la isoforma adjunta se expone a una solución de
cinc. En un ejemplo preferido, la solución de cinc está a pH 7,8
hasta pH 8,6. En un ejemplo preferido adicional, la solución de cinc
está a 30-38ºC.
La presente descripción tampoco se limita al
tipo de solución ácida o de cinc utilizada. En realizaciones
preferidas, la solución ácida (que se usa en esta invención) o
solución de cinc (como se describe en este documento) comprenden un
antioxidante. En realizaciones particularmente preferidas, el
antioxidante comprende metionina. En una realización de este tipo,
la concentración preferida de metionina es de 5-40
mM.
Como se usa en este documento, la expresión
"proteína deseada" significa una proteína de interés que se
desea purificar. Por supuesto, la identificación de la proteína
deseada está sujeta al objetivo final del procedimiento de
purificación. Por ejemplo, durante un procedimiento de purificación
puede ser deseable obtener un grupo o grupos proteicos, incluyendo
contaminantes, en una etapa intermedia del proceso de purificación.
Independientemente del interés en obtener un grupo proteico
intermedio, el grupo proteico que es el objetivo final del proceso
de purificación se considera la deseada proteína.
Como se usa en este documento, la expresión
"isoforma adjunta" se refiere a una isoforma de proteína que
tiene características estructurales y/o funcionales similares a las
de una proteína deseada, en la que se puede eliminar de la proteína
un grupo escindible para producir la proteína deseada. Un "grupo
escindible" se entiende que significa un grupo químico unido a
una proteína deseada que se puede eliminar químicamente. Las
expresiones "eliminación química" o "eliminado
químicamente", como se usan en este documento, se entiende que
indican que un grupo químico se ha separado de una proteína
mediante medios químicos, que incluyen, pero sin limitación,
soluciones ácidas, soluciones básicas, catálisis por iones
metálicos, etc.
Si el grupo escindible puede identificarse
químicamente, puede hacerse referencia a la isoforma adjunta como
un tipo específico de isoforma adjunta. Por ejemplo, una "isoforma
adjunta de piruvato" es una proteína deseada que tiene un grupo
escindible unido que se puede identificar como piruvato.
Como se usa en este documento, la expresión
"reacción de oxidación" significa una reacción destinada a
provocar que los grupos sulfhidrilo de dos aminoácidos de cisteína
formen enlaces disulfuro.
Como se usa en este documento, la expresión
"interferón alfa" se refiere a una familia de proteínas
secretadas inducibles que confieren resistencia a virus en células
diana, inhiben la proliferación celular y regulan la expresión de
antígenos de MHC de clase I. Esta familia incluye, pero sin
limitación, interferón alfa 2a (Roferon, Hoffman
La-Roche, Nutley, NJ), interferón alfa 2b (Intron,
Schering-Plough, Madison, NJ), interferón alfa 2c
(Berofor Alpha, Boehringer Ingelheim, Ingelheim, Alemania) o
interferón de consenso, como se define por determinación de una
secuencia de consenso de interferones alfa de origen natural
(Infergen, Amgen, Thousand Oaks, CA).
La presente invención se refiere al aislamiento
y purificación de proteínas. Se describe en este documento la
identificación y purificación de isoformas adjuntas. En otra
realización, la presente invención se refiere a métodos para
producir una proteína deseada a partir de isoformas adjuntas.
También se describe en este documento una proteína deseada
altamente purificada mediante la co-purificación de
la proteína deseada junto con isoformas adjuntas y la posterior
conversión de las isoformas adjuntas en la proteína deseada. De esta
manera, se reduce la cantidad de la isoforma adjunta y se aumenta
el rendimiento global de la proteína deseada y/o se purifica mucho
más ampliamente de lo que podría lograrse previamente. El
rendimiento de la proteína deseada se puede aumentar en tanto como
diez veces el rendimiento que se obtiene sin convertir isoformas
adjuntas.
Aunque la presente invención no se limita por la
fuente de la proteína deseada o las isoformas adjuntas, en una
realización, la fuente son microorganismos generados mediante
técnicas recombinantes. Existen muchas técnicas de este tipo
conocidas por los especialistas en la técnica. Tales microorganismos
transformados pueden ser células eucariotas o procariotas,
bacterias, células de mamífero, etc. Por ejemplo, se puede producir
interferón alfa en bacterias siguiendo las enseñanzas de la patente
de Estados Unidos Nº 4.530.901 para Weissman o por las técnicas que
se describen en la publicación de solicitud de patente europea
número EP032.134.
Asimismo, la presente invención no se limita a
ningún método particular de extracción de la isoforma adjunta de la
célula que la produce. Cuando la proteína deseada es interferón
alfa, por ejemplo, son adecuados los métodos que se describen en
las patentes de Estados Unidos Nº 4.315.852 y 4.364.863 para
Leibowitz et al.
Asimismo, la presente invención no se limita por
las técnicas de purificación particulares que se emplean para
aislar la isoforma adjunta o la proteína deseada. Se conocen muchas
técnicas de cromatografía y otras técnicas de separación por los
especialistas en la técnica y son aplicables en este documento.
Aunque la presente invención no se limita por el
método de identificación de las isoformas adjuntas, se puede llevar
a cabo la identificación de isoformas adjuntas mediante el estudio
de los pesos moleculares de la proteína deseada y de cualquier
contaminante que tenga un peso molecular superior al de la proteína
deseada. Un método de este tipo se describe en Rose et al.,
J. Biol. Chem. 267: 19101 (1992). Se pueden exponer los
contaminantes que tengan un peso molecular superior al de la
proteína deseada a condiciones de degradación (por ejemplo, pH
extremadamente ácido o extremadamente básico) y analizarse para
productos de degradación. Si uno de estos productos de degradación
tiene la misma masa y/o características estructurales que la
proteína deseada, entonces el contaminante se puede considerar una
isoforma adjunta que tiene un grupo escindible.
En relación con métodos para convertir isoformas
adjuntas en la proteína deseada, como también se describen en este
documento, un proceso de exploración puede determinar las
condiciones apropiadas de conversión. Por ejemplo, un proceso
implica un ajuste progresivo del pH de la solución de reacción hasta
el punto en el que el grupo escindible se elimina de la isoforma
adjunta, pero da como resultado una proteína deseada funcional o
desnaturalizada no irreversiblemente.
En relación con método de eliminación química de
un grupo escindible. En la invención, el grupo se elimina o se
escinde mediante exposición de la isoforma adjunta a condiciones
ácidas (por ejemplo, usando ácido acético), como se define en las
reivindicaciones adjuntas. En un ejemplo alternativo que se describe
en este documento, la isoforma adjunta se expone a cinc.
La presente invención tampoco se limita por la
temperatura a la que se desarrolla la reacción de escisión. En
general, sin embargo, cuanto mayor la temperatura, más rápidamente
se convertirá la isoforma adjunta en la proteína deseada.
Aunque la eliminación química de un grupo
escindible puede producir una proteína con las mismas
características estructurales que la proteína deseada, a veces es
necesario oxidar grupos sulfhidrilo reducidos en enlaces disulfuro.
Esto permite a la proteína conseguir plegarse apropiadamente y
transformarse en una proteína funcional. Se conocen en la técnica
métodos de oxidación de grupos sulfhidrilo y la presente invención
no se limita por ningún método particular de oxidación.
En una realización, la presente invención
contempla la protección de grupos de metionina durante la oxidación
para prevenir la formación de sulfóxido de metionina. Se conocen en
la técnica métodos para proteger grupos de metionina, y la presente
invención no se limita por métodos particulares para proteger grupos
de metionina. Sin embargo, los métodos incluyen el uso de
antioxidantes como se describe en Lam, et al., J. Pharm. Sci.
86: 1250 (1997) y en la patente de Estados Unidos Nº 5.272.135 para
Takruri.
La presente invención tampoco se limita por el
método de ejecución de una reacción de oxidación. Por ejemplo, en
una realización, la presente invención contempla la eliminación de
un grupo escindible seguida de la oxidación de grupos sulfhidrilo.
En otra realización, la presente invención contempla la eliminación
de grupos escindibles y la oxidación de grupos sulfhidrilo en las
mismas condiciones de reacción.
Asimismo, se pueden realizar en la misma
reacción la eliminación química del grupo escindible y la oxidación
de la proteína.
Como se describe en este documento, se realiza
un proceso de exploración para determinar las mejores condiciones
para la eliminación química del grupo escindible. Por ejemplo, se
pueden emprender experimentos usando un intervalo de condiciones de
pH y se puede medir la cantidad de proteína deseada resultante que
tiene una integridad estructural adecuada (por ejemplo,
desnaturalizada no irreversiblemente) y/o la cantidad de grupo
escindible. Una representación de la cantidad de la proteína
deseada que tiene una integridad estructural adecuada frente al pH
de reacción dará como resultado generalmente una curva de campana,
representando el punto más alto de la curva el pH ideal para la
eliminación química del grupo escindible. Se puede emprender una
exploración similar para la reacción de oxidación. Si las curvas de
campana de la reacción de eliminación química y la reacción de
oxidación se cortan, el punto de intersección revela las mejores
condiciones de pH para eliminar el grupo escindible y oxidar los
grupos sulfhidrilo en la misma reacción. Para la eliminación química
y la oxidación de una isoforma adjunta de piruvato de interferón
alfa, las dos curvas se cortan a un pH de aproximadamente 5,
revelando el mejor pH al que realizar una reacción de combinación.
Otras condiciones de reacción que se pueden evaluar incluyen, pero
sin limitación, concentración de sal, temperatura, etc.
Después de la conversión de las isoformas
adjuntas en la proteína deseada, pueden ser necesarias etapas de
cromatografía adicionales para purificar de contaminantes las
proteínas deseadas.
Después de que la proteína deseada se purifique
convenientemente, se puede poner en una forma adecuada para uso
terapéutico si se desea. La proteína deseada en esta invención es
interferón alfa y, por tanto, son adecuadas formulaciones que se
describen en las patentes de Estados Unidos Nº 4.847.079 y 4.496.537
para Kwan y la patente de Estados Unidos Nº 5.766.582 para Yuen
et al. Como alternativa, otros vehículos inertes
farmacéuticamente aceptables pueden ser sólidos o líquidos. Las
preparaciones de forma sólida incluyen polvos, comprimidos,
gránulos dispersables, cápsulas, obleas y supositorios. Los polvos y
comprimidos pueden comprender de aproximadamente el 5 a
aproximadamente el 95 por ciento de proteína deseada. Se conocen en
la técnica vehículos sólidos adecuados, por ejemplo, carbonato de
magnesio, estearato de magnesio, talco, azúcar o lactosa. Se pueden
usar comprimidos, polvos, obleas y cápsulas como formas de
dosificación sólidas adecuadas para administración oral.
Para preparar supositorios, se funde primero una
cera de bajo punto de fusión, tal como una mezcla de glicéridos de
ácidos grasos (por ejemplo, manteca de cacao), y el ingrediente
activo se dispersa homogéneamente en la misma mediante agitación.
La mezcla fundida homogénea se vierte entonces en moldes de tamaño
apropiado, se deja enfriar y, por tanto, solidificar.
Las preparaciones de forma líquida incluyen
soluciones, suspensiones y emulsiones. Por ejemplo, soluciones de
agua o de propilenglicol en agua para inyección parenteral o adición
de edulcorantes y opacificantes para soluciones, suspensiones y
emulsiones orales. Las preparaciones de forma líquida también pueden
incluir soluciones para administración intranasal.
Las preparaciones en aerosol adecuadas para
inhalación pueden incluir soluciones y sólidos en forma de polvo,
que pueden estar en combinación con un vehículo farmacéuticamente
aceptable, tal como un gas comprimido inerte.
Los compuestos de la presente invención también
pueden suministrarse por vía transdérmica. Las composiciones
transdérmicas pueden adoptar la forma de cremas, lociones, aerosoles
y/o emulsiones y se pueden incluir en un parche transdérmico del
tipo matriz o depósito, como es convencional en la técnica para este
propósito.
La cantidad de compuesto activo en una dosis
unitaria de preparación se puede ajustar de aproximadamente 0,01 mg
a aproximadamente 1000 mg, y preferiblemente de aproximadamente 0,01
mg a aproximadamente 750 mg. Como alternativa, el compuesto activo
se puede preparar en unidades internacionales, siendo las
dosificaciones preferidas de entre 3 millones y 50 millones de
unidades internacionales. En una realización de este tipo, se
contemplan formas de dosificación de 3 millones, 5 millones, 18
millones, 25 millones y 50 millones de unidades.
También se incluyen formas sólidas que están
destinadas a convertirse, inmediatamente antes del uso, en
preparaciones de forma líquida para administraciones orales,
tópicas o parenterales.
Los siguientes ejemplos sirven para ilustrar
ciertas realizaciones preferidas y aspectos de la presente invención
y no deben interpretarse como limitantes del alcance de la
misma.
\vskip1.000000\baselineskip
Ejemplo
1
Se pueden formar isoformas adjuntas de piruvato
dentro de células, en las que el grupo alfa-amino
del resto aminoacídico N-terminal de una proteína
se condensa con el grupo carbonilo de piruvato. Si el piruvato
interfiere con la conformación de la proteína, entonces sólo cuando
se hidroliza dicha isoforma adjunta de
piruvato-proteína (se escinde piruvato de una
proteína) la proteína puede replegarse libremente en su forma
deseada por cambio a la conformación termodinámicamente favorable.
Si una proteína deseada tiene un enlace o enlaces disulfuro, una
isoforma reducida resultante de la escisión de piruvato debería
oxidarse como parte del replegamiento en una forma deseada.
El siguiente procedimiento ilustra cómo
determinar las condiciones óptimas para convertir isoforma adjunta
de piruvato-proteína en su forma deseada. Como se ha
analizado previamente, si una proteína deseada no tiene un enlace o
enlaces disulfuro, debe llevarse a cabo una exploración simplemente
para maximizar la escisión de piruvato (hidrólisis). Si una
proteína deseada tiene un enlace o enlaces disulfuro, debe llevarse
a cabo una exploración no sólo para maximizar la escisión de
piruvato (hidrólisis) sino también la formación de enlaces
disulfuro (oxidación).
Se necesita un ensayo de piruvato para controlar
el grado de hidrólisis para entender la cinética de la escisión de
piruvato. Por ejemplo, se puede ensayar cuantitativamente piruvato
"libre" mediante un método de modificación química o un método
enzimático. Se puede usar 2,4-dinitrofenilhidracina
(DNPH) para derivatizar piruvato. Se debería ultrafiltrar una
muestra de ensayo para eliminar una isoforma adjunta de
piruvato-proteína usando una membrana MWCO
apropiada, por ejemplo, una membrana de 10 K. Se incuba un filtrado
a pH ácido con DNPH que reacciona con el piruvato "libre". Se
pueden analizar fácilmente piruvato derivatizado con DNPH,
2,4-dinitrofenilhidracina, en
RP-HPLC usando una columna C8 tal como una columna
Nucleosil C8 (5 \mum).
Puesto que la reacción de derivatización es
estequiométrica, también es posible una medición cuantitativa del
piruvato. También se puede usar un kit enzimático (por ejemplo,
lactato deshidrogenasa/NADH) para medir el piruvato. Este método no
requiere la ultrafiltración de la muestra puesto que sus condiciones
suaves no escinden el piruvato de una isoforma adjunta de
piruvato-proteína durante la incubación.
Para medir la cantidad combinada de piruvato
libre unido a una proteína, todo el piruvato unido se debería
escindir antes de la derivatización. Puesto que el método de
derivatización con DNPH requiere un pH muy ácido y un tiempo de
incubación relativamente largo, el piruvato puede escindirse y
posteriormente derivatizarse con DNPH durante la incubación. Por
tanto, se debería usar una muestra sin ultrafiltrar en el método de
derivatización con DNPH para medir una cantidad combinada de
piruvato libre y piruvato unido en la muestra.
Existen al menos tres isoformas para proteínas
con enlaces disulfuro y existen dos isoformas para proteínas sin
enlaces disulfuro. Hablando en general, una proteína deseada y su
forma reducida se pueden resolver fácilmente mediante
RP-HPLC.
En el caso de una proteína que tiene un enlace o
enlaces disulfuro, la exploración será muy eficaz si se pueden
analizar cuantitativamente tres isoformas (isoforma adjunta,
proteína reducida y proteína deseada) en RP-HPLC.
No habrá necesidad en absoluto del ensayo de piruvato y es posible
identificar qué etapa es limitante de la velocidad, si alguna lo
es. Sin embargo, habitualmente es difícil resolver una isoforma
adjunta de piruvato-proteína de una forma reducida.
En este caso, un ensayo de piruvato es imprescindible para optimizar
cada etapa de conversión.
Cuando una forma deseada no tiene un enlace o
enlaces disulfuro, la composición de isoforma se puede determinar
sin dificultad, puesto que una isoforma adjunta de
piruvato-proteína se puede resolver fácilmente a
partir de una forma deseada en RP-HPLC.
Cuando la forma deseada tiene un enlace o
enlaces disulfuro y una isoforma adjunta de proteína no es separable
de su forma reducida, se debería medir el piruvato unido a una
proteína para determinar la composición de la isoforma. La cantidad
molar de piruvato unido a una proteína, que es la cantidad de una
isoforma adjunta de proteína, es la cantidad combinada de piruvato
libre y unido menos la cantidad de piruvato libre. Esto se puede
medir usando una muestra con y sin ultrafiltración en el método de
DNPH. Entonces, la cantidad de una forma reducida es la diferencia
entre la cantidad combinada de una isoforma adjunta de proteína y
una forma reducida medida mediante RP-HPLC y la
cantidad de piruvato unido a una proteína determinada mediante
ensayo de piruvato. Entonces, se puede calcular la composición de la
isoforma.
Tanto si una forma deseada tiene un enlace o
enlaces disulfuro como si no, el criterio de exploración debería
ser el mismo para maximizar la velocidad específica de la conversión
de la isoforma adjunta en una forma deseada.
En este caso, se forma una proteína deseada a
medida que se escinde el piruvato de una isoforma adjunta de
piruvato-proteína. La escisión de piruvato no
necesita controlarse mediante ensayo de piruvato en este caso, ya
que sólo hay una etapa, de hidrólisis, involucrada en la conversión
de la isoforma adjunta en una forma deseada. Por ejemplo, es
suficiente controlar tanto la desaparición de la isoforma adjunta
como la formación de una forma deseada en RP-HPLC.
Es necesario encontrar las condiciones de incubación para maximizar
la conversión de una isoforma adjunta en una proteína deseada.
La primera etapa es investigar la cinética de
reacción con respecto a un intervalo de trabajo de la concentración
de isoforma adjunta de proteína a emplear en la exploración. Si la
cinética es de primer orden con respecto a la concentración de
isoformas adjuntas, la concentración de la muestra no afecta a la
cinética y se puede emplear cualquier concentración durante la
exploración o la evaluación de parámetros. De otro modo, la
concentración debería mantenerse constante durante la
exploración.
Puede haber muchos parámetros que afecten a la
etapa de hidrólisis. Los más importantes podrían ser pH,
temperatura, iones metálicos (tales como cinc, férrico, ferroso,
Cu, Mg, etc.), conductividad, tampones, luz y agitación. Cada
parámetro se puede optimizar mediante medición del efecto de un
parámetro de incubación en la conversión de una isoforma adjunta en
una forma deseada. Por ejemplo, varias alícuotas de una muestra que
contiene una isoforma adjunta de piruvato-proteína
se incuban en un intervalo suficiente de pH diferentes con todos los
demás parámetros en sus mejores valores predichos respectivos. La
reacción de conversión en cada alícuota se mide después de un
cierto período de incubación (por ejemplo, durante una noche). El pH
al que se obtiene la mayor conversión se determina como pH óptimo.
Se repite un experimento de este tipo para optimizar otros
parámetros, utilizando los valores óptimos de los parámetros
optimizados en lugar de sus mejores valores predichos anteriores.
Esta es una técnica de optimización típica.
El pH de incubación afecta a la velocidad de
hidrólisis. Generalmente, un pH menor conduce a más hidrólisis. Una
temperatura más alta también aumenta la hidrólisis. Sin embargo, la
hidrólisis a un pH muy ácido, tal como pH 2, puede no funcionar
cuando existe una precipitación irreversible de una isoforma adjunta
o una proteína deseada, o si la proteína se desnaturaliza
irreversiblemente. La presencia de algunos cationes metálicos puede
catalizar la hidrólisis. Aunque un catión metálico catalice la
escisión de piruvato, dicha catálisis puede ser muy dependiente de
la concentración de catión metálico. Por tanto, se debe emplear un
intervalo muy amplio de concentración de catión metálico cuando se
exploren cationes metálicos.
También puede haber interacciones entre
parámetros. Por ejemplo, puede ser posible que haya diferentes pH
óptimos dependiendo de si algún ión metálico está presente o no,
cuando dicho catión tiene un impacto sobre la conversión. En el
caso de una isoforma adjunta de piruvato, la presencia de catión de
Zn da como resultado un pH óptimo diferente para la escisión de
piruvato (pH 7,8-8,6). Por tanto, es necesario
variar al mismo tiempo no sólo un parámetro nuevo a optimizar sino
también otros parámetros importantes para optimizarla realmente.
En un proceso de conversión de dos etapas, una
forma reducida se escinde de la isoforma adjunta mediante hidrólisis
y se convierte posteriormente en una forma deseada mediante
oxidación.
Idealmente hablando, una isoforma adjunta de
proteína y una forma reducida se aíslan y el procedimiento, que se
ha descrito anteriormente para el caso de una proteína sin un enlace
o enlaces disulfuro, se aplica a cada una de la isoforma adjunta y
la forma reducida para optimizar cada etapa. Una diferencia muy
importante es que la transferencia de oxígeno y algunos oxidantes
como glutatión oxidado (GS-SG), además de los
parámetros enumerados anteriormente se pueden optimizar para la
etapa de oxidación. Si el GS-SG oxida sólo una forma
reducida, potenciará mucho la etapa de oxidación o formación de
enlaces disulfuro. Sin embargo, es probable que haya un rendimiento
o una conversión reducida si el GS-SG también oxida
la isoforma adjunta y la isoforma adjunta oxidada no se hidroliza
fácilmente.
A partir de cada condición óptima, se pueden
estimar las condiciones óptimas para la conversión de la isoforma
adjunta en una forma deseada. Si están razonablemente próximas las
condiciones intermedias se establecen como condiciones óptimas.
Teóricamente hablando, puede haber diferentes condiciones óptimas
dependiendo de la proporción inicial de isoforma adjunta de
piruvato-proteína respecto a una forma reducida en
una muestra. Por ejemplo, las condiciones óptimas deberían ser
diferentes cuando la isoforma adjunta es la mayoría absoluta que
cuando una forma reducida es la mayoría absoluta. Por tanto, se
debe reconocer que la composición de la muestra debería tenerse en
cuenta cuando se estiman las condiciones óptimas a partir de las
condiciones óptimas individuales para la hidrólisis y la
oxidación.
Por último, las condiciones óptimas de
conversión se confirman experimentalmente. Esto es útil a menudo en
la puesta a punto de las condiciones de conversión óptimas para
identificar, si existe, una etapa limitante de la velocidad. La
acumulación continua de forma reducida en tiempo de incubación
indica que la etapa de oxidación es limitante de la velocidad.
Cuando se produce acumulación, deben aplicarse las condiciones más
favorables para la oxidación, tales como más oxígeno, pH más elevado
y temperatura más elevada para maximizar la formación de la forma
deseada. Si siempre hay un nivel bajo de proteína reducida a pesar
de una velocidad de formación significativa de una forma deseada,
la etapa de escisión es limitante de la velocidad. Cuando esto
ocurre, pueden cambiarse las condiciones de incubación para que
puedan mejorar la etapa de escisión, que llevará a la maximización
de la formación de la forma deseada.
Si las condiciones óptimas para la eliminación
química de un grupo escindible y la oxidación de la proteína están
muy distanciadas, se pueden aplicar progresivamente. Por ejemplo,
las condiciones óptimas para la etapa de hidrólisis se aplican
primero y las condiciones óptimas para la etapa de oxidación se
aplican cuando la hidrólisis es casi completa.
Cuando no es factible aislar cada isoforma, el
ensayo de piruvato pasa a ser indispensable, especialmente cuando
las dos isoformas no se pueden resolver en RP-HPLC.
Mediante el control de la liberación de piruvato controlada, la
etapa de hidrólisis se puede optimizar primero. La segunda etapa se
optimiza cuando la primera etapa casi ha terminado o es muy lenta.
A partir de estas condiciones óptimas, las condiciones óptimas de
conversión global se estiman y se confirman experimentalmente. Un
enfoque alternativo es que la conversión global se optimiza después
de que se optimice la etapa de hidrólisis. Este enfoque puede ser
más práctico especialmente cuando es difícil optimizar la segunda
etapa debido a la interferencia generada por una hidrólisis
significativa y continua de isoforma adjunta. Como se ha mencionado
anteriormente, son parámetros importantes a optimizar el pH,
temperatura, transferencia de oxígeno, cationes metálicos y
oxidantes.
Las interacciones entre parámetros se hacen más
importantes para el proceso de conversión de dos etapas que lo son
para el proceso de conversión de una etapa.
Para confirmar si no hay impacto de dichos
parámetros de condición óptima sobre una forma deseada, se debería
purificar una forma deseada y sus propiedades, incluyendo actividad
específica biológica y pureza, deberían comprobarse con todo
detalle.
\vskip1.000000\baselineskip
Ejemplo
2
La escisión de piruvato y la formación de
enlaces disulfuro se lleva a cabo a una temperatura elevada
(30-37ºC) y a un pH de reacción de
5,2-5,6. Estas condiciones de reacción son únicas en
el sentido de que ambas reacciones ocurren secuencialmente en las
mismas condiciones de reacción y que se recupera proteína
bioactiva.
Las fracciones que contienen el pico de
absorbancia UV de proteína que se eluye de la cromatografía de
aislamiento de proteína se combinan entre sí y se filtran a 0,45
\muM para esterilidad.
Se añaden 3 gramos de metionina por litro de
combinación de proteínas a la combinación de proteínas y se agita
hasta disolverse. El pH de la combinación se ajusta a
5,2-5,6 con hidróxido sódico diluido. La
concentración de cloruro sódico no se ajusta: está entre NaCl
150-200 mM.
Se añade una solución madre que consiste en
acetato 10 mM a pH 5,5, metionina 200 mM y NaCl 200 mM a la
combinación de proteínas hasta una concentración final de metionina
20 mM.
La combinación de proteínas se transfiere a un
recipiente de reacción y se aumenta la temperatura hasta 37ºC con
agitación continua. La combinación de proteínas se incuba a
36-38ºC durante 24-30 horas.
En el punto de tiempo de 24-30
horas, la mezcla de reacción se filtra a través de un filtro de
profundidad, seguido de un filtro de 0,45 \muM para retirar
precipitados. Después, la combinación entonces se concentra y se
diafiltra contra acetato 10 mM a pH 5,5 a
2-10ºC.
Este ejemplo está fuera del alcance de las
reivindicaciones adjuntas.
\vskip1.000000\baselineskip
Ejemplo
3
Se convierte isoforma adjunta de piruvato en
interferón alfa2b a 34ºC y pH 8,2 con cinc (1 M). La reacción de
solución se agita durante la reacción. Cuando la conversión es de
aproximadamente el 80%, se disminuye la temperatura de la solución
de reacción hasta 4ºC para detener la reacción.
Preparación de la solución: tampón Tris 1 M:
mantenido a 4ºC, Tris base 1 M + HCl a pH 8,3, solución de Zn 1 mM:
mantenida a 4ºC, ZnSO_{4}H_{2}O 1 mM + acetato sódico 10 mM +
NaCl 175 mM a pH 5,5.
Las fracciones que contienen el pico de
absorbancia UV que se eluye de la cromatografía de purificación de
proteína se combinan entre sí y se filtran a 0,2 \muM para
esterilidad. Aproximadamente 0,083 (V/V) del tampón Tris 1 M se
añaden lentamente a una combinación de proteínas (el pH de una
combinación típica de proteínas está en el intervalo de 5,2 a 5,5)
que se agita, hasta un pH de aproximadamente 8,2.
La solución de Zn 1 mM se añade lentamente en la
combinación de proteínas básicas mientras se agita para alcanzar
una proporción molar de 0,6 a 1,0 de catión Zn respecto a isoforma
adjunta de piruvato total, por ejemplo, si una concentración de
isoforma adjunta de piruvato es de 1,0 mg/ml, se necesitan 30 \muM
de Zn o 0,03 (V/V) de la solución de Zn 1 mM. Se usa solución de
catión de Zn recién preparada.
La solución de reacción se calienta hasta 34ºC
en un reactor mientras se agita. La temperatura de reacción se
controla a 34ºC durante toda la reacción. También se requiere una
agitación continua en un grado en el que la mezcla en la solución
de reacción sea suficiente pero no lo bastante violenta como para
generar burbujas. Se debería permitir algo de ventilación en el
reactor para la transferencia de oxígeno en la solución de reacción.
Por otro lado, si el reactor está aproximadamente medio lleno de la
solución de reacción, dicha ventilación no es necesaria. Durante la
reacción, se puede tomar una muestra de reacción para seguir la
conversión usando RP-HPLC. Cuando la reacción ha
terminado, la temperatura puede disminuirse hasta 4ºC para la
siguiente etapa de cromatografía.
A partir de lo anterior, está claro que la
presente invención proporciona métodos para identificar isoformas
de proteína no deseables y convertirlas en la proteína deseada, lo
que aumenta el rendimiento global y la pureza de la proteína
deseada.
Claims (7)
1. Un método para aumentar el rendimiento de una
composición de interferón alfa, que comprende convertir una
isoforma adjunta de piruvato de interferón alfa en interferón alfa,
mediante exposición de dicha isoforma adjunta de piruvato de
interferón alfa a una solución que tiene un pH de aproximadamente
5,5.
2. El método de la reivindicación 1, en el que
dicha solución tiene un pH de 5,2 a 5,6.
3. El método de la reivindicación 1, en el que
dicho interferón alfa es interferón alfa2b.
4. El método de la reivindicación 1, en el que
dicha solución está a 34-40ºC.
5. El método de la reivindicación 1, en el que
dicha solución comprende un antioxidante.
6. El método de la reivindicación 5, en el que
dicho antioxidante comprende metionina.
7. El método de la reivindicación 6, en el que
dicha metionina está a una concentración de 5-40
mM.
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