HUE027035T2 - Eljárások csont morfogenetikus fehérjék termelésének fokozására - Google Patents

Description

eljárásúk csont Mmmmsmmmm fehérjék termi lés ének: fokozására A találmány a YonatkazaL Közelebbről, a találmány tárgyat eljárások képezik pepiid növekedési faktorok, beleértve csont miuíögenctifcns pæteinek (BMP) előállítására. A transzformáló növekedést íakfordjéta jp(3ï-j|t: szupercsalád: fiziológiailag fontos novekedés-szabályozö és raörfogenetikusiul^doBsáptóaÉFg^eifezik ödagstey esöitsai, Genes Dev. 8:133-146 (3994}; Hoodless és mtsai., Carr. Topics MiembioL Immunoi. 221:235-272 (1991)}. Ä csont tnorfogenetlkus proteinek (BMP) a növekedést és difiereoeiácíós íaRtorísk TGF-ß szupercsaiádpaak a tagjai pose« és mtsai,,JMttoiptes of Bona Biology 2:919-928 (2ÖÖ2}k -Az első bizonyíték a BMP-k létezésére a demineralizaií csööt képességé volt öj csont tndukálására, amikor izomba beültették (Urát és misai., Science 150:893-99 ( 1965}). Ezt követően a BMP-ket biokémiai utón megtisztították demineralizáíí csontból (Wang és misai., PNAS 85: 9414-9488 (1981)} és a megtisztított fohé(jék tervezett radioaktív oligontAleotidokkai történő híhtídizá!á§sal megkiótKizták (Pozoey és íntsal·* Sekmce 242:1528-1534 (3988)}, Ä megkiönozott BMPAét rekodblnábá úton expresszáltatták és megtotfjÉÍ® fonkétöjökat. A BMF-ket tipikusan rekombináns áton állítják eló a teftbészstéS forrásokból, mint például esöníböl történő biokémiai tisztítással együtt járó nehézségek, tisztaság hiánya és alacsony kitermelés miatt. Á BMP*2 és rokon fehérjék, a BMP-4, BMP^S, BMP4i, BMP-? (más néven ÖP-Í),: BMP-8 (más néven OP-2), BMP-9, és BMP-16 ismert módon közvetítik á csont és porc szövet növekedését és javítását. A BMP-2 jelenleg klinikai alkalmazásban; áll nyílt és nem egyesült törések, gerincfoziók (az INFUSE™ -orvosi eszköz részeként), és fogsebészeti indikációk kezelésére. Ezen fontos terápiás szer elérhetősége és köksége az elöállltásáta részijén az áikajmazott emlős sejttenyészetek ikerétől függ. Azonban az alkalmas sejMítersk „laboratóriumi léptékben” történő előállítására szolgáló tenyésztési körülmények nem léptéknövelhetök a fehérjék íráatí megnövekédett igények kielégítéséhez szükséges nagy“ pari léptékre. Ennek megléteiden szükség van rekomhiösnts Msérjék, mint például BMP-2 előállítására szolgáló e|árásökm a tormeíés közbeni ssjtrtkerek növelésével, és ahol az eljárások: alkalmasak ipari léptékben történő alkalmazásra. A találmány tárgyát eljárások, képezik tekösaöfoáns fehétjék ipari léptékű előállítására magas gazdasejt-tlterek elősegítésével, ami a fehérje-kitermelés növekedését eredményezi. A találmány — részben — azon a felismerésen alapszik, hogy a fém nyomelemekkel kiegészített meghatározott tápközeg a biorcaktor rendszeriem tenyésztett CHO sejtek nagyobb aratási sejttiterét bíztosída ipari léptékben batch-ájratűpiáíásí eljárás aikabnazásával. A fémekkel váló kiegészítés nélkül ugyanaz a tapközeg elég volt a kisléptékű (laboralörimni lépték) növesztés támogatására, de nem lehetett „íépéknövelni” ipari léptékű bíoreakíorra. A titer konzisztencia tovább növekedett, amikor á iápköze^áen lévő pirtddkák belyettesítedSk piridoxinnal.

Ily módon egyik aspektusában a találmány íátgya eljárás rekombináns fehérje-expresszióra, amely eljárás magában tokaija jelentőséggel bíró fohérjét kódoló naklemsavat tartalmazó gazdasejt tenyésztését meghatározóit tenyésztő tápkőzeghen, ahol vas van jelen legalább körülbelül 2,25 pM koncentrációban, és ha píridoxál is jelen van, az kevesebb, mint körülbelül 55 fS-a aBŐ vitamin moláris és a jelentőséggel bíró fehérje visszanyerését. Bizonyos megvalósítási módok szerint a vas legalább körülbelül 5 μΜ^ ktmeenbékíisban van jelen. A közeg továbbá tartalmazhat rezet legalább körülbelül iö nM koneentrácsó-ban és cinket legalább körülbelül 2 μΜ koncentrációban. Bizonyos megvalósítási módok szerint, ha plrtdoxál vas jóless az kevesebb, mint körülbelül 15 pM kcmeenírációban van jelen, EíŐüyÖkmégvaiósitási módok szerint, ha piridoxál van jele«, az kevesebb, mint körülbelül 15 μΜ koncentrációban van jelen es kevesebb, mim körülbelül 55 %-a » Bó vitamin moláris koncemráclojának a tápközegben. Bizonyos megvalósitásl módok szeriét, ha piridoxál vart jelen & tápközegben, az vagy kevesebb, mint körülbelül 15 μΜ koneentrâcléban van jelen vagy kevesebb, mint körülbelül IS $ΝΙ a BŐ vhaÄ: ;äi tápközegbe·).

Bizonyos megvalósítási módöfc szerint a gazdásági éihlős sejk példáol <!5ÍrÍ<S sejt, Bizonyos megvaSósüás; módok szerint a jelentőséggel bíró fehérje a TGF-ji szupercsalád tagja, például BMP, például

Bizonyos megvalósítási módok szerint, a tápközeg lói vitaínint tartalmaz: legalább körülbelül 15 pM kónsfeniráe lóban. Bizonyos megvalósítási módok szerint, a piridoxál, ha jelen van a íápközegben, aznem több, mint körülbelül 55 %-át teszi ki: a Bő vitamin teljes moláris koneenfráeiójának a tápközegben. Előnyösebb megvalósítási módok szerint a Bó vitamin piridoxái-pirídoKin aránya kísebtg mint körülbelül 1,2, Még előnyösebb megvalósítási módok szerint a tápközeg nem tartalmaz pírtdoxálí.

Egy előnyős megvalósítási mód szerint a találmány tárpa é|;áíás l$!!j$P# eljárás SHtagábá» foglalja 8MP-&amp;Í kódoló öbiSőmöleknláí tartalmazó alkalmas gazdasejt tenyésztését olyan tenyésztő tápközegben, amely vasat tartalmaz, legalább körülbelül 2,5 μΜ koncentrációban és B6 vitamint tartalmaz legalább körülbelül 15 μΜ koncentrációban, es ahol piridoxál van jelen, az kevesebb, mint körülbelül 55 %-át teszik! átlő vitamin moláris koncentrációjának a tápközegbeü, ésiiázmán a BMP-2 fehérje visszanyerését

Bizonyos megvalósítási módok szerint a tápkőzeg iariabriäZÄ asninosavakat iá legalább körülbelül 20 bíM teljes köneenlTáeióbar;, A tápkőzeg L-cisztmt tartalmazhat, legalább körülbelül 0,5 mM kooeenlráei#8S, ElöbyöS megvalósítás! módok SZériót a tápkőzeg tartalmaz i-glutamínsavat is, nem több, mint körülbelül 0,3 mM koncentrációban.

Bizonyos megvalósítási toóáok szerint, a tápküzeg tarisbrmzhm: poliartionos vegyülnie! Is, példán! dextrán-sznifátot, legalább körülbeiü! 10 mgl konoemrásiöban.. Bizonyos megvalósítási módok szerint a tápközeg kezdett ozmolariíása körülbelül 260 és 3SÖ mOsm- közölt lehet

Bizonyos megvalósítási módok szerint a találmány szerinti eljárás- alkalmas baích-üjrmápláíásí felyamatban tenyésztett sejtek tenyésztésére, Előnyős megvalósítási módok szerint a sejtek körülbelül 3 liter kapacitást! kevert tank bloreaktorbap vannak tenyésztve. Még előnyösebb megvalósítási módok szerint a tenyészet hőmérséklete lényegében állandóan van tartva. Bizonyos megvalósítási ínód ok szerint a találmány szerinti eljárások olyan tápközeget alkalmaznak, amelyek legalább körülbelül 4,0x10* sejí/ml betakarítási sejtsörüséget tesz lehetővé.

Ennek megfelelően egy megvalósítási mód szerint a találmány tárgya eljárás BM'P-2 előállítására, amely eljárás magában lbgia|a BMP-2~t kódoló BöíSmmlekulit tartalmazó CMC sejt tenyésztését olyan tenyésztő tápközegben, amely tartalmaz vasat legalább körülbelül 2,5 μΜ koncentrációban, amínosavakat legalább kőrülbelii 20 mM teljes konee«Mek%as, Lfelszími legalább 8,5 mM koncentrációban, dextrán-mri&amp;foi legalább körülbelül 10 mg/1 koncentrációban és Bó vitamin} legalább körülbelül 15 μΜ koncentrációban, és áhöl piridoxál van jelen, az kevesebb, mim körülbelül 55 %-áf teszi ki a Bó vitamin moláris koncenüáélójáöák a lápközegben: és azulán a BMP-2 fehérje visszanyerését. Előnyös megvalósítási módok szerint a tápkőzeg továbbá rezet is tartalmazhat legalább körülbelül 10 nM koncentrációban. Még előnyösebb megvalósítási tnódok szerint a tápközeg továbbá cinkéi is tartalmazhat legalább körülbelül 0.,2 μΜ koncentrációban.

Bizonyos megvalósítási módok szerint a találmány tárgya eljárás BMB~2 előállítására, amely eljárás magiban ibgíalja BMF-2-î kódoló DídS-molekuláí tartalmazó alkalmas gszdassjt tenyésztésének lépését olyan tenyésztő tápközegben, amely vasat tartalmaz legalább körülbelül 2,5 pM koncentrációban '# Bő vitamint tartalmaz legalább körülbelül 15 pbl koncentrációban, és rémi piridoxái van jelén, az kevesebb, mint körülbelül 55 %r|ti teszt kl a BŐ vimmin moláris korseeníxációjának a tápközegben, és azután a ÖMF-2 fehérje visszanyerését.

Bizonyos megvalósítási módok szerint a találmány szerinti eljárások bármelyike továbbá: magában íbgialftatja a jeíentőségpl bíró Sdtérje* példáid BMBkl tisztításának vagy Izolálásának lépését Is, Bizonyos megvalósítási móéÉi «äSdÄ d#ästel vagy Izolált tóhérjé kiszerelhető, peleiéül gyógyászati szerként. Előnyös megvalósítási módok szerint a íisztíiás egy vagy több csziopkromátográBás: lépést íöglal magában,: például butil-Sepharosé dSZlőpiXtörténő tisztítást.

Egy másik aspektusában a találmány tárgya a bármelyik találmány szerinti eijánással előálltott termék: Bizonyos megvalósítást módok szerint a tennék kezelésre alkalmazható, vagy olyan páciens, példáid emlős, példán! ember kezelésére szolgáló termék előállítására van alkalmazva, aki csontszövet dé#fcíasáté3, sérülésétől, betegségétől vagy rendellenességétől szenved, például csőm növekedésének, kelçtimpsének, gyógyulásának vagy javításának elősegítésére.

Egy másik aspektusában a találmány tárgya lényegében a leírás szerinti sejttenyészaö tápkőzég. Előnyős megvalósítási módok szerint; a sejöeíiyésztd tápközeg lényegébe» hasonló a. 3, és 4. tábbsammt istneftetémÂ:

Az ábrák rövid ismertetése

Az I . ábm a sejtsüxűség idöiüggésénék ábrázolása batebrvisszmáplálási folyamatban; 3 literes és löQ literes bioreaktorban, A 2. ábra a. sejtsürüség idöiüggésénék ábrázolása bateb-visszstáplálási folyamatban íőÖ literes bioreäktorbas vassal és rézzel kiegészített vagy nem kiegészített tápközegben tenyésztett sejtek esetében. A 3. ábra az életképes sejtsürüség ídÓálggésének ábrázolása bateb-visszaíáplálásí folyamatban léi literes bioreaktorban vassal és rézzel kiegészített tápközegben tenyésztett sejtek esetében, Ä 4. ábra egy sorozat oszlopdiagraa, amelyek 3 különböző tápközegben ás különböző iémkönceníráeiőkmellett edényekben tenyésztett sej tek növekedési sebességét mutatja.

Az 5. ábra egy sorozat oszlopdiagram, amelyek a különböző tápközegben Is különböző vaskoneentfáelők mellett tenyésztői csészéken tenyésztett sejtek növekedési sebességét mutatja, A b. ábra a betakarítási sejtsürüség idöfoggésének ábrázolása bateh-visszatáplálási folyamatban 2500' literes bioreáktörókbáö találmány széf löt! elírásokkal tenyésztett sejtek esetében. A szaggatott vonal a korábbi eprások betakarítási sürílségétnek átlagát jelöli. A 7. ábra rbBMF-2 betakarítási titer ídötüggésánek ábrázolása a 6. ábrán benndaíöíí tenyészetek esetében. A szaggatott vonal 3 korábbi eljárások átlagos rliBME-2 normalizált betakarítási sűrűségeit jelöli.

Felismertük, hogy konzisztens, nagy^sűrüségü tenyészetekéi érhetünk ét ipari léptékben BMP-2-1 ékprésszáió sejtek tenyésztésével vassal, rézzel és cinkkel kiegészített tápkőzégbéni amely taóahnaz deatrán- sznlÉíot Is, aboi a BŐ vfcamis* legalább körülbelül 15 μ:Μ' kmcentrádéban van jele« a tápközegben, és a piridöxál piriáöxftthöz mért aránya a B6 vitaminban kisebb, mini 1,2. A. t&amp;ffîtaà&amp;f szerinti eljárásokban alkalmas tényésztő tápközeg tipikusan a tenyéSZtéit ij&amp;jíefc növekedését támogató tápanyagokat tartalmazhatja, beleértse vitaminokat, ásványi anyagokat, zsírsavakat, arninosavakat, szénfbrrásí (például öextrözt), és adott esetben növekedési íakinrokaí, beleértse jSéldáöl sa inzulint és írnnszférrlot, vagy aní|blotikt«nokat. Bizonyos megvalósítási módok .szerint » tenyésdő tápkőzeg alaptápkőzeget tartalmaa, mint például Dulhecco-íéíe Módosított Eagle íápközeget (DMF2M), Ham-féle E42-t, Roswell Park Memorial lostituteiRl’MI} tápközeget, vagy ezek kombinációját.

Bizonyos megvalósítási módok szerifit fi tenyésztő tápközeg kémiailag definiált tápközeg, azaz széruntmentes. Nyilvánvaló, bogy ebben a bejelentésben, hacsak másképpen nem jelezzük, egy komponens koncentrációja á íápközöghes a kiindulási kmrcentrádÖ, azaz a kömpOfiéös koncentrációja a friss : tápkőzsgben, mielőtt a tenyésztett Sejtékhez áípilő Amint az ismert a, srákíerö:Í«ten, egy adott komponens koncentrációja megyéltöidiai a s^ék ányagesem-iilyajnatai vagy spöntátv kémiai reakciók következtéén.

Bizonyos megvalósítási módok szerint a tenyésztő tápkőzeg vasat tartalmaz legalább körülbelül 2,25, 5, 5,5, fi, 10, 12, 14, 15, 20, 25, 30 pM, vagy nagyobb koncentrációban, Előnyösebb megvalósítási módok szerint a vas körtiíheiül 5 μΜ koncentrációban van jelen. Még előnyösebb megvalósítási módok szerint a vas körülbelül 5,5 μΜ koncentrációban van jelen. Bizonyos megvalósítási módók szedőt a vas körülbelül 5,5 és 15 μΜ közötti koneenttáciőbao van jeien. nyilvánvaló, hogy az e bejelentésben a paramétereket leíró minden számszerű határérték, példán! „legalább*’, ,,kevesebb minf* vagy „több mint” esetébe»: » Hü szibégszerilfcB: teliár bárroilyen rátlómán^ amelyek ezek közé a® értékek közé esnek, A tenyésztő tápközsg: t^afeazkfit más fémeket is, beleértve rezet és cinket. A réz legalább körülbelül 5, 10, 12, 15, 30, 50, 75, 100, 150, 200, 250 nM vagy nagyobb koncentrációban lehet jelen, Előnyösebb megvalósítási módok szerint a réz léplább körülbelül .10 nM koncentrációban van jelen. Még előnyösebb megvalósítási módok szedni a réz kÖrüibelM 74 μΜ köneendáoiöhan van jelen. A tenyésztő tápközeg tartalmazhat cinket is legalább kötülbelöí 0,1, Ő,2, 0,5, 1,0, 2,0, 3,0, 4,0, 4,2, 4,5, 4,§, 5,0 μΜ vagy nagyobb koncenü-áelóhan. Előnyös ráégvMosltási tnóőok szerint a cink köröihétó 4,2 μΜ koneentráeióban vmr jelen. Bizonyos megvalósítási rnődök szedni á tenyésztő tápközeg kását és rezét tartalmaz amint lent ismertetjük, példáuí a vas legalább körülbelül 2,25, 5, 5,5, 8, 10, 12, 14,: 15, 20, 25, 30 μΜ koncemrádóban van jelen: és a ráz legalább körülbelül 5, 10» 12. 15, 30, 50, 75, 100, 150, 200, 250 nM koneentráeióban van jelen. Bizonyos megvalósítási módok szerint a tenyésztő tápközég vasat, rézét és emket tartalmaz, amint fent ismertetjük. Ennek megfelelően bizonyos megvalósítási módok szériát a tenyésztő tápközeg tartalmaz vasat körülbelül 2,5 μΜ és 15 jiM közötti ikoneeníráelóban, rezet körülbelül: iö nM és ISO nM közötti koncentrációban, és cinket körülbelül 2,1 μΜ: és 8,4 μΜ kő/őttt koncentrációban. Előnyösebb megvalósítási módok szerint &amp; tenyésztő tápkőzeg íarráhnaz vasat legalább körülbelül I μΜ koncentrációban, rezet iepläbbÄÜlbelüi W nM koncentrádóban, és mámSegalább körüibeiüí 2 μΜ koncentrációban. A találmány szerinti e|árásökhan történő alkabüazásra szolgáló tenyésztő tápközeg támogatja a konzisztens: Magas betafcaritssr sejtsüriságet, például baích-ájratáplálasi tcnyészeíbat. Bizonyos megvalósítási módok szerint a találmány szermit eljárásokban történő alkalmazásra szolgáló tdryésziŐ tápkőzeg legalább körülbelül MkiO6, 1,5x10®, S.Oxi.Ö*, 2,5x10s, 3,0x10*, 3,5xtÖ4, 4,0x10®, 4,1x10", 4,2V:iif, 4?lxMs, 4,5x10s, 4,8x10*, 5,0x1#, 5,5x10s, 6,(5¾ 1D6, 6,5x1#, 7,0x10*, 7,5x10s, 8,0x10e, 8,5x10s, 9,0x10s, 9,5x1# sejt/mí vagy hágyóbri betakarítási srilsőriiséget iâmopi. Előnyösebb megvalósítási módok szerit« a tenyésztő tápközeg köriilbelül 4,Öxí# - 7,0x1# sejbml beiákarMsi s#dköséget támogat. Bizonyos megvalósítási módok szerint «se» betakarítási sejtsüriiségek: eléréséhez a sejtek kevesebb, mint körülbelül :0,039x10s, 0,075x1#, 0,15x1#, 0,3x10-, 0,0x10s ]:,2xl#,: vagy 2^x1# sejt/mi vagy nagyobb sűrűségben vannak leoltva, Bfönyős rétég valósítási módok szerint a sejtek kÖrüilfeM 0,6x10S: sej#«] .$ü^gbea-g|M^ieiD^».

Bizonyos «fegveíósllári módok szerint a tenyészet BŐ vitamint tartalmaz, amely ismert módon a sejtteiiyészet számára alkalmas számos formában fordulhat elő, beleértve pirídoxin, piridoxái, piridoxamin, pirídoxin SMoszfát, píridöXÉ :#:-#sz:ÍI, piridosaotin 5’ríoszífe, és ezek kombinációi. Bizonyos megvalósítási módok szerint a tenyészd legalább egy Bá vitamint fârtÂaz a pirídoxin, píridoxamm, piridoxín 5"-foszfái, piridoxamin 5-fosidtt, és ezek fe)!dbii#e#i közül kiválasztva. Bizonyos megMösilási módok szerint a Bó vitamin legalább fcörüilhéiül 5;, 10, 15, 20, 25, 30, 35, 4Ô, 45, 50 μΜ vagy nagyol# teljes koneeníráetóban van jelen a tenyésztő tápközegbén. Előnyös megvalósítási módok szerint a Bő vitamin legalább körülbelül 10 μΜ koncentrációban van jelen. Még előnyösebb megvalósítási módok szerint &amp; Bő vitamin körülbelül 30 pM koneesíráeióban van jelen, Bizonyos megvalósítást módok szerint, a piridoxái, ha jelen van a lágközeghen, az nem több, mint körülbelül 55, 50,4¾ 30,20, 10, 5,1, 0,1 %-Ü teszi ki a Bő Etamin tnoiáris konsenír%iójáítak a tápkőzegben. Bizonyos megvalósítási módok szerint, ha jelen van a tápkőzegben, a piridoxái kevesebb, mini körülbelül 21), 15, 10, 8, 6, 5, 4, 3, 2, 1 μΜ koncentrációban van jelen. Bizonyos ntegvsdôsMsi módok szerim a tenyésztő lápkőzeg piridoxái piridoxínhoz viszonyított aránya 0 és 1,2 közötti. Elónyösehb megvalósítási módok szerint a piridoxái piridoxínhoz viszonyított aránya kisebb, mint 1,2, például kisebb, mint körülbelül 1,1, 1,6, 0,9, 0,7,0,5, 8,4, 0(3 vagy 0,1., Még előnyösebb megvalósítási módok szerint a Mpkőzeg lényegében: sem tartalmaz piridoxált, A találmány Szerinti eljárásokban történő alkalmazásra szolgáló tenyésztő tápközeg ttptkpsás amlnosavakat biztosit a feftyéákfeií #Jfek hővekedésésefc támogatására és » jelentőséggel bíró fehérje előállítására. Bizonyos mégóálösliásl thödbk szerint az amínosakák megbatározott arányokban lehetnek jelen a tenyésztő lápkőzegben, amint például a 3, vagy 4. táblázni ban ismerteti ük. Amiül az ismert a szakterületen, a fehérje-preparátumok hídroiízátutnai (például pepton, bakíopepton, tripton, kazein hidroiizáíum, vagy szojton szója hidrolizátam) alkalmazhatók aminosavsk looésaként. Bizonyos megvalósítási módok szerint; az Mtlnósavák meghatározóit arányát tartalmazó tápközeg kiegészíthető nfegbátárözatísft fehérje kidről izáiumokkal. Más megoldásképpen, bizonyos megvalósítási módok szerint meghatározatlan lldroljzibjbtók szolgálnák az jmihmsávak elsődleges forrásaként, Előnyös tnegvalósítási módok szerint, ahol hiiróllzáíumók az t»MipdiÉő4tMÍWlópá :föriááii a tápkőzeg szükség szerint kiegészíthető egy vagy több adott ammosavva], Bizonyos me-gválösitáSi módok Szerint a tenyésztő tápközeg teljes ámlnösav-koneeíttráeiója fegáifis kÖrilibölül 15, 20, 21, 30, 35,40 MM, vagy nagyobb. Előnyös megvalósítási módok szerint a tápkőzeg feles pmínoSáv tartalma legalább körűikéi# 20 inM. Még előnyösebb megvalósítási módok a teljes amlnosav jariSlöri]: légálább körülbelül 30 n;M. Αχ afelnosav^aráttyokat és az egyes aminosayak koncentráólóíát beállíthatjuk a gazdasejt ofeíafeolikus igényeinek ígyelembe vételévek például függően a sejtek növekedési sebességétől, a sejtek metabolite proiiljátók az aminosavak arányától a termelt rekombináns fehérjében, vagy a termeit rekombináns fehérje minőségének növelésére. Példán! a CHO sejtekben előállítóit, dísszociálhalő dimer vagy szabad szuliltidríi dimer tonnájában lévő ïfcBMP-2 részleteit befelyásolja a tápközegben lévő L-cisztm és L-glutamínsav könsenMeió, amint azt példád ax ÜS 500¾ 1 számá amerikai égésűit államokbeli szabadalmi irat feltárja. BmïeSt megfelelően biAnyös megvalósítási mödők szietínt è tenyésztő tápkőzeg L-císzint tartalmaz legalább Mbdül 0,2, 0,3,0,4, 0,5, 0,6, 0,7, 0,8, 0,9, 1,0, 1,05, 1,1, 1,2, 1,3, 1,4, 1,5, 2,0, 2,5, 3,0, 3,5, 4,0 mM vagy nagyobb feoaeenOáe iában. Például előnyős megvalósítási mődbk szerint a tapközeg L-eisztim fertaimaz körülbelül 0^2-4,0 mM keneeottációban. Előnyösebb megyalösíiasi módok szerint a tápközeg L-eisztM tartalmaz körülbelül 0,5-4,0 mM koncentrációban. Még előnyösebb megvalósítási módok szerint a tápközeg totóját tartalmaz körülbelül 0,7^3,0 mM koncentrációba«. Bizonyos megvalósítási módok Mérlnt L-glutaminsav van jelen a tenyésztő tápközegben legalább körülbelül 0,023,0,05,0,1,0,2,0,3,0,4. 0,5, 1,0,1,5, 2.0, 2,5, 3,0, 3,5, 4,0 mM, vagy ttagyöbfe tecenMelóbas). Előnyös megvalósítási módok szerint a tenyésztő tápközeg L-eisztint tartalmaz legalábbMrüibélií i,2, 0,3,0,4, 0,5, 0,6,0,7,0,8, 0,9, 1,0. 1,05, 1,1, 1^, 1,3, 1,4, 1.5.2.0, 2,5, Ijös 3,5, 4,0 mM vagÿ nagyobb könéetsö'ációban és L-gíuíafemsayat legfeljebb körülbelül ÖJ§, 0,1, öj2, öj, Od, Old, 1,0, Î&amp; :¾ .:¾ I,# iÂ^oriéébtrâciÔbàK, Előnyösebb megvalósítási triódák szerint az L-ciszíin legalább körülbelül 0,5 mM koncentrációban van jelen a tenyésztő tápközegben ás az L-gbitamímay legfeljebb körülbelül 0,3 mM ktíneentradőban van jelen a tenyésztő tápközegben, Még előnyösebb itfegvalósítási módok szentit:.ááítfeísziin legalább körülbelül 0,7-3,0 mM kopeőtríráeiőb'an van jelen a tenyésztő tápközegben és az L-glüfeinmsav iégfeíjebh 0,2 mM ktmcenlráclőban van Jete a tenyésztő tápközegben. A tenyésztő tápközeg továbbá peltájsíonoa szert is tarfebnazhai. Elméletileg, bar nem támaszkodva erre, a pöiíanionns széfek versengenek a sejtek sejtfetszínén levő moíekníafeszeklfel a székrfeáb r^ombináns f&amp;iíériiáls íieip@ri«rtöi^fefet^ döfeéüjémek kötéséért, példáid az érett (proteoiítikusan elhasüotí) hBMP-2 monomer vagy díhfer M-ísöwinálisáért. Amikor egy szekretáh fehétje kötődik a sejt felszínére, a fehérje kiíedfiéiésé M öídatban csökken. A sejtfeiszfeen lévő özén elemekkel versengve a pobaninnos szerek növelik a szabad (Mm sejthez kötött) fehérje iknneentráeícpt a tenyésztő tápközegben. A. pöíímnmms szerek példái közé tartozik a heparin, hepafínHszultát, pentözán-szulfet, dextrán, dextrán-szaMat, híaluronsav, kondroitín, köndroílm-szulfáí, dermatán-szutfák keratán-sznlfet, hexuronál-hezózammogiikán-szulfát, inozitoi-bexaszuifát és szaeharóz-okíaszulilt, Bizonyos megvalósítási módok szerint a pplignlonos szer nnkromoiáris vagy nanomoláris affinitással képes az: érett iüMP~2 monomer N-íennipállsának kötésére. Bizonyos msgyalöslíM módok szedni a poliantpnos S2er Sáültbrtáll iefefeszetes polimer, például jpkózammogíikáo: fíiMí) vagy származéka, ahol a polimer legalább körülbelüli 1%, 5%, 10%, 12%, 15%, 33%, 20%. 25%, 30%^ 50% vagy nagytfeb mértekben szulfenáit. Bizonyos megvalósítási mádok szerint a imllantönös szer fegállbb körülbelül 1, 5,10,20, 50, 75,106,200,400, ŐOO, 800, 1000 mg/i vagy nagyobb koncentrációban van jelen.

Előnyös megvalósítást módók szerint a poiíaoionos szer desírámszsdfet Előnyösebb Megvalósítási módok szerint a dekírámszulfet nmfektdatömege körülbelül 5000 és 500000 g/möl közötti. Még előnyösebb megvalósítási módok szerint a destrán-szulíit molekulatömege körülbelül 7000 gőnök BiMhyos megvalósítási módök szerint a dextrán-szuíiai legalább körülbelül 30 mg/i köncenfefeíőban van jelen- Előnyösebb megvalósítási módok szerint a dextrán-szniát legalább klkÄeiöl 400 mgd kfmeeatfeeióbffi van jelen. A dexOdn-szulfát tenyésztő tápközegben történő alkalmazását rhBMP-2 előállítására tovább Ismerteti az US 531M9I és 5316654 számú amerikai egyesült államok-heii szabadalmi irat. A tenyésztő tápközeg manipulálható, hogy fenntartsa a tápkőzeg bizm^ms pamméfemit, példán! pll, oldott Ojj vagy eznmMtás. Bizonyos megvalósítási módok szedőt a tenyésző iápközeg adott oamölaritási tartományban vas tartva. Más megvMósltásí módok szedőt a tenyésztő tápközeg adott kiindulási ozmolaritásra van beáSíívá, Előnyös mepalósfíást módok szerint a kiindulást ozmoiaritás körülheittl 299-380 mösmközött van. ElőnyösebbmégvaíősMsi módok sprint a kiindulási tmnolariiás körülbelül 289 és #69 tnösm között van.

Bizonyos megvalósitM módok szerint a tenyésztő tápközeg tartalmaz vasak legalább kötőibelü! 2,5 pM kósteenbációhan, rezet legalább kőrülbeiö! 19 Ä koncentrációban, áminosáVákaí, 29 mM te||es kmteenträetöbanv dextrán-szulfátot legalább körülbelül 19 mg/i koncerrbáciobao, és M vitamint legalább körülbelül 15 gM koncerttrácíőban, ahol a Bó vitamin piridoxábpiridoxm atánya kisebb, mint körülbelül 1,2. Előnyösebb megvalósítási tnódok szerint a tenyésztő tápközeg továbbá tartalmaz cinket is, legalább körülbélöl 9.2 μΜ koncentrációban. fagyon előnyős megvaiősitásí módok szerint a találmány szerinti alkalmazásra szolgáló tenyésztő tápközegek: a 3, és 4. táblázatban ismertetettek, azaz az Ai, A2, Bl vagy B2 tápMzeg. Még előnyösebb megvalósítási módok szerint a tápközeg a B2. Bizonyos megvalósítási módok szerint a tágközég lértyéiébén hasonló a B2-höz. A „lényegében hasonló” kifejezés alatt azt értjük, Itogy a tápközeg kööSfxuiense sitiéi Jélert&amp;b,. miM körülbelül ö, 1, 9,2, 9,5, 1,0, 1,5,2,0,2,5 vagy 3,0-szoros

Mlönbsé^l jélén (azaz növelve vagy esökkentvéj, mint a 4. táblázatbeli Ö2 tápközegben.

Bizonyos megvalősfíási mődók szerint egy defimáiatlan komponens alkalmazása elfogadható és a tápközeg ktegészifoeíö maximum körüfcíüi 9,1, 0^,5, 1, 5, 10% vagy több magzati horjöszérummaí (EBS). Azonban, még ha a szérum széles körben el is terjedt emlős sejtek tenyésztésére, számos problémával jár az alkalmazása, amint azt a Erestmey Calure of Und Cells, Mhn Wiley &amp; Sons, Hew York, 91-99 (1994) irodalmi helyen tárgyaljig. Például a szérum számos azöaositatlan komponenst tartalmaz és ezért kémiailag bem definiált Sőt, a. szérűm összetétele tétéből tételre változik, ami a símtdárillzáoiót sebészé teszi. Ezéhíelöí a szérum növekedést gátló ktkíorökaí tartalmazhat, ami szuboptimális növekedést eredményezhet Vépzétül &amp; szénán vírusokat és {pás patogéneket tartalmazhat, amik nehezebbé teszik a gyártást és az engedélyezést 1&amp; Ennek megleielőeü a szérynnnesyes tápközegek előnyösek a Máímány szerinti eljárásokban történő alkalmazásra.

Fehérjék A találmány szerinti eljárások különféle fehérjék előállítására aikdimazhaték. Bizonyos megvaiősitásí módok szerint a febérje növekedési faktor. Előnyös megyalósttási módok szerint a növekedési faktor a TOF-jl szupercsaíád tagja,: Előnyösebb megvalósítási módok szerint a TQF-| esaládtag csont ntorfogenedkws protein (BMP). A BMíbk; a ifehérjók erősen homológ emládlá,: Ős külthíböző alésoportoMta vánnak osztva a még nagyobb színtő homolőgítíjuk alapján. Bizonyos fontos alcsoportok közé tartozik a: BMB-2 és BMP-4; BMP-5, RMP~ó, és RMP-7( é$ BMP-12. BMP-13. és MP-52. közelebbről a BMP-k a: lévő; éiâ®tiÈÉ»^9ldaJîà«ïÂ' «asmósítő minláxatáí tartalmazzák* amelyek szükségesek a BMP #t|yttasboz. Bizonyos megvalósítási módok szerint a találmány szerinti eljárással előállított Mérje légy BMP, a kővetkezők közül kiválasztva: BMP-2, BMP-4, BMP-5. BMP-ö, BMP-7, BMP-8, BMP-9, BMP-10, BMP· ! 1, BMP-12, BMP-13, BMP-Í4,; BMP-15, BMP-16, BMP-17, RMP-18 és MP-52, beleértve a kombinációkat és heterodimerokek fipiköstát a BMP alatt diszulfiddal kapcsolt dimer molekulát értünk. Bizonyos tnegvalósítási titódök szerint egy BW monomer is lehet. Bizonyos megvalósítási módok szerint a BMP-re való hivatkozás magábatí foglal olyan szekvenciákat, amelyek legalább körülbelül 70%, §0%, 90%, 95%, 9ő%, 97%, 9¾%¾ 99%, 99,9% Vágy nagyobb mértékben azramssk ámibosav-SKioíé» iámért BMF éreti íprradomént nem tartalmazó) régiöjávalí és amelyek megêmk a biológiái aktivitásukat (például csont-,: pőre-, (mszórti szövetek kialakítására való aktivitás}. Bizonyos megvalósítási módok szerint égy BMP 1, % IQ, 15, 20, 25, vagy több ámioosav- szuhsztítúciót: tártálmtizhat ismeri BMP szekvenciájához viszonyítva. A BMP~k ismertek a szakterületen és azonosították azökát ferlönféle fajokból; beleértve emlősöket, mint péidéíii ember, macska, csirke, csimpánz, szarvasmarha, kutya, kecske, ló, otakákó, egér; sertés, nyűi, patkány és juh. A BMF-k ismertetése, beleértve a például a fehérje és rmkleorid-szekvenelájukaí és eljárásokat az előállításukra, megtalálhatók a kővetkező irodalmi helyeken: BMP-2, BMP-3, BMP-4, BMP-ő, BMP-ő és BMP-7 (feltárva például az: US 5013649; 5Iíő?38l 5106743: S18707ő;:és; 5M19Ö5: számú amerikai égycaött áiláinökheli szabadalmi ítatokbaii}, BMP-8 (föltárva a PC'T WO 91/18098 ssámú 'i^petkö®! jt$&amp;an), BMP-9 (fehárva a PCÏ WO 93/00431

Számd nemzetközi közzéiételí: iratban}, BMF-lö (feltárva a PCI' WO 94/26893 számú nemzetközi közzétételi Iratban) BMP-! Î (feltárva a PöT WÖ 94/26892 számú némzé&amp;Özi közzétételi iratban), BMP-1:2 és BMP-13· (föltárva a PCI WO 95/16035 számú nemzetközi közzétételi nathan), BMP-15 (feltárva az US 5635.172 száma amerikai egycsölt àliamok-beti szabadalmi iratban), BMP-16 (feltárva az US 6331612 számú amerikai egyesült állámökheit szabadalmi iratban), MF 5? (feltárva &amp; PCTf Wö 93/16099 számú nemzetközi közzétételi iratban), és S MP4 7 és BMP-IS (feltárva az US 0027917számíi amerikai egyesült államok-beli szabadalmi iratban). Az ezen föhéfjékre való hivatkozás nyilvánvalóan magján /foglalja a variánsokat, allélífcas variánsokat, frirgmenseket és mutáns BMB-ket. nem korlátozó jïékiaként a deléeiós mutánsokat, mszerdős mutánsokat és szubsztrtúeíős mutánsokat. Közelebbről egy adóit BMB-re való hivatkozás alatt értendők: az N-terminális csonkolt fragmensék, öböl legalább 1, 3, 5, 7,9, 10,11,12,13, 15, 18,20,22,25,3Ö, 35, vagy több uldailáne el lett távolítva az érett fehérje ^-terminálisáról. A találmány előnyéé ipegyaMsitásí módjai szerint a BMP BMP-2. Bizonyos megvalósítási mödpk szerint a BMP-2 humán BMP4 φΒΜΡ-2)> Még előnyösebb mégvalóshasi módok szerint a hBMP-2 érett hBMP-2 (azaz a MP ..ÖÖliBl NCBÍ laiatromszám Q283-R396 része) és rendelkezik csont és/vagy porc kialakító: aktivitássai^ Előnyős megvalósítási módok a hBMP-2 legalább körülbelül 88, 89, 90. 02, 94, 95, 96, 98, 99, azőhösságú áraraösav-Szidtén az éred bfíMF-2-vel (a bíp OOi 191 NCBl lajsiromszátn Q283-R39Ő része). Braiékmegíéteiöési bizonyos megvaldsftási módok iszerbt az érett hBMP-2 1,2,3.4, s,ő,7.8, 9, ló, 11, (2, 13, 14, vágy 15 ámioósav-szuhsztituciót tartalmazhat. Bizonyos megvalósítási módúk szerint az előállított BMP-2 ámer. Bizonyos Megvalósítási módok szerint áz eSMlitotí BMP-2 monomer, Bizonyos megvalósítási módok szerint a BMP-2 N-terminálisa legalább 1, 3, 5, 7, 9, Η), 1 Î, 12, 13 vagy több oldailánenyi csonkolást tartalmaz á dímer föhérje legalább egyik alegységének N'-termmáiísán. A BMP-2 aktivitás mérésére szolgáló vizsgálati eljárások ismertek a szakterületen, és azokat feltárja például az US 5013649 számú amerikai egyesSh áll&amp;mok-beli szabadâkm ira·:. A BMf-2-î számos fajban azonosították. Lásd például az í, táblázatot, amely felsorolja a National Centér for Biotechnology Information (NCBi) Entrez (ienéíB számokat számos fájből származó :ÜMjP-2 esetébeoc Ezek a GeaelD azonosítók alkalmazhatók a nyilvánosán hozzáférhető armotatált m.RNS vagy fehérje szekvenciák beszerzésére, példán! az NCBI világháló portáláról, amely megtalálható a kővetkező IML-en: lmp:Úwww.ricbr.nlm,nib.gov/sites/entrez?db^:gene. Szemléltetésként a humán SMB-2 GenelÖ szonösióját alkabnazliatí uk a következő referencia-szekvencia beszerzésére: NMA)öl2hÖ.2 lm RNS) és NPőO 1191.1 (protein j. Hasonlóképpen az egér esetében a beszerezhető BMF4 referenda-szekvenéíák közé tartozik az MM,..007553.2 (mRMS) és MP 03 ! 579.2 (protein). L Táblázat

Amint a saakitódálörtífeap ismén. a. csont morfogeaetikps fehérjék, mint például a BMP-2 hasznosak fohéije-alapu terápiás szerként Ennek megfelelően a találmány szerinti eljárások továbbá tartalínazkatják a tenyészetből visszanyert fehérje tisztításának vagy Izolálásának g lépését ils, A BMB-2 a szakterületen ismert különféle módokon tisztíiMé meg, Előnyös megvalósítási;: tnódöfe szerint: a tisztítás egy vagy több öszlopkrontatográiláS lépést foglal magábafe példán! htthl-Sepbarose gyantán történő: tisztítást. Előnyösebb megvalósítási módok sáriin a huiil-Sephsrose oszlop CNBr-aMváfi Sepharose-hoz, például Sepharose 4B*feez kapcsolt butilamin gyantát tartalmaz. Bizonyos megvalósítási módok szerint a tisztítás «teában feglalh^ továbbá oszlopkromatográiás lépést hépario-szerö gyantán ís^, például GELLUFIME™ szülét gyantán. Például a tenyésztett sejtekről származó komik; irmait tápközeget ------- arnely tartalmazza a BMP#4— vihetünk tél heparín-szeru gyantát tartalmazó oszlopra, a BMP-2-f tártahnázé eluátómot nyerhetünk m oszlopról és azután azt felvihetjük egy íöásödik Oszlopra, mint például btóí«§é|tebsé- Äfepk- További ttszÉítás lehetséges, amint aátisinertetsk példáéi a WO 99/31120számü nemzetközi köágStéíeli tíáÉáít, különösen amtak 3-7. oldalán. fia egyszer mégtiszíttotiuk, a találmány szerinti eljárások termékei tovább feszémiheíök, például gyógyászati készííniéőyekb«:.: Á BMB-k gyógyászati hordozóinak: általános összefoglalásáért lásd például a Seeherman and Woznéÿ Óytokme Growth Factor ifey, 16(3):329-45 (2603) irodalmi helyet vagy az TÍS 5385887 számú amerikai egyesült államok-beli szabadalmi iratot, A találmány szerinti eljárások terméket kezelésre alkákoázkáiók, vagy csontszövet defektusa, Sérülése, betegségé Vagy rendellenessége kezelésére szolgáló tennék előállítására alkalmazhatók, példáid csont: növekedésének, kéletkezéfeoek, gyógyulásának vagy javításának elősegítésére.

Seltek

Sejtek széles köre alkalmazható rekömbioáns fehérje előállítására a találmány szerinti eljárásokkal. Bármely olyan sejt, amely tmoszfermóihatö tekombínáns BMSvsei egy jefemÖséggéí bitó fehérje, például BMP expresszáltáíáSárn, alkalmazható a találmány szerinti: eljárásokban. A sejtek különfefe fajokból származhatnak, beleértve ienptvsfereg, forog, rovar, kéiéitö, vagy emlős, például humán, főemlős, juh v szarvasmarha-, sertés-, 16-, macska-, kutya-fele, vagy rágcsáló forrásokat. Előnyős megvalósítási módok snerint a sejtek humán vagy rágcsáló eredetiek. Előnyösebb megvalósítási módok szerint a sejtek höresőghői: sSÉtütSznáíL A-találmány szerinti eprásokbanalkalmazható ssjvöíiaíak jól ismerték á szaktérüfeisn és széles körben

AtmäMsmkk. Sei alkalmas sejtvonai beszerezhető a létéi szervek!#!,: mißt például as American Type tCalípe&amp;S&amp;pá§Ság,. VA. A találmány szerhdf alkalmas sejtvonalak közé tartozik a COS sejt, CHO sejt, BHK sejt, Balbfc 3T3 sejt, Ä-2 sejt, SP2/0 sejt, » sejt, Im sejt, CV1 sejt, MDCK sejt, BRI, $ψ, Verö-M 8¾¾ íléLa sejl MD®k sejk ?4epG2 ssjk vagy 293 sejt. Előnyös megvalósítási módok szerint a sejt ÖDS sejk ssjg BMíC sejt, Baïfefe 3T3 sejt, vagy 293 sejt. Előnyösebb megvalósítási módok sîsim a sejt Cm se|t. A <m sejt módosítva lehet a sejt-íiter és/Vagy fehérje -kitermelés növelésére. Bizonyos m^valósttM mődok smsátó. a GBÖ sejtnek csökkentett vagy hiányzó lehet a dihidrofijlát-mdaktáz gén missziója PBF£; egér CleneíB: 13M\% példán! a CBO sejt heteíözigóia vagy homozlgM Mfet a DHF&amp; hipotnorf {csökkent fenkeio), mii (nem-feókdmtáiisk vagy demmáns-negatív {null és gátoljs m enzim Mkeíonálls formált) alléíjére, és a jelepÄggel felró Mérje együtt trasszfektáiható fenkcipnális BHFfe gént tartalmazó konstrukcióban. k találmány szerinti epr^kfems alkalmadmtó sejtek a szakterületen ismert bármilyen körühnények kizötí fenyészthetőfc, péidátd: amint azt a Wamock and Al-Rubel Biotech. Appi. Bíoehem. 45:M2. (2006) irodalmi helyen tárgyaIák, Tipilnsan a sejtek bioreakíorban vannak tenyésztve. A hioreaktorok feánnílyen: tbéredfek lehelnek. Bizonyos tnegvdősMsl módok szerint a Momaktor legalább körülbelül I L; 3' B; 2(11,: 40 L; mu m L; m u ?» U 2$m lg mm t; 2Ö00Ö U 4O0ÖÖ L, vagy nagyobb. A bíoreaktor képes támogatm a sejtek szaszpenzióban (azaz borgpny-íőggetlen növekedés) vagy szafesztraton való növekedéséi Ä hargöny-· független tenyésztés magában foglalhatja mikrofeordozók alkalmazását, példán! nagy felület-térfogat arány biztosítására, A találmány előnyős megvalósítási módjai szerint ä Sejtek szuszpejtzíóbán vannak tenyésztve; azaz horgonyzó felszín nélkül. À feorgtmy-fllggeticn tenyésztés métíozaíai jói iâtnMèk a szakterületen és közéjük tartoznak példán! a keveríAank öiöfeakíerok és légemeléses hlofeaktorok, Blötryös megvalósítási módok szerint a bioreakíór kéyéB-tank:: feioreaklói: Az egy adott bioreakíotbatt tenyésztett sejtek különféle, a szakterületeit ismert eprásökkál tenyészthetők, beleértve a bateb-ájmtaplálási (amint alább részletesebben ismertetjük, lásd még Drapeau Is snBak* Eyloisefenölogy 15(1-3)::103-9 (1904)), betáplált-hatefe (lásd példáid az US 5672502; 6924124; vagy 33:32303 szánó amerikai egyesült államokbeli: szabadalmi iratokat), vagy perlnziös (amely sejünegtanő eszközt alkalmaz, hogy a hulladék eltávolítható legyen a bioreakiorból amikor irisa tápközeget adagolnak, lásd péidáttí az IIS 481:4278. vagy 6607910 számit amerikai egyesült államok-beli szabadalmi itatokat) tenyésztési «látásokat, Bizonyos előnyős megvalósítási módok szerint a sejtek batefe-íiratáplálásl eljárással véansÉ tenyésztve. Előnyösebb megvalósítási módok szerint a. sejtek lényegében állandó hőmérsékletén: Vannak tenyésztve. Bizonyos megvalósítási módok szerint az alkalmas tenyésztési hőmérséklet a körüifeeiüi ti, 32, 33, 34, 35, 36, 3?, 38, 39, 40, 41 vagy 42¾ közül választható. Bizonyos megvÄMsi módok szerint a lényegeben állandó hőmérséklet hőmérsékletetek szók tartománya lehet, mint példán! 35-39¾ vagy 36-3S°C. Előnyösebb megvalósítást módok szerint a sejtek lényegében körülbelül 37°C állandó hőmérsékleten vannak tenyésztve. A bioreaktorok a tenyésztő tápközeg számos fiziológiás paraméferéí képesek fenntMám, belééttvéág oxigénezettséget (oldott (¾ pH, ozmolamás, hőmérséklet. fény, és adóit tápanyagok kóneenttáeiöját (például glükóz vagy amiposavak), Bizonyos megvalósítási módokban a bioreaktor monitorozza és lénnlartja a hőmérsékletet,; pl 1A, és oldott 0> tartalmat. Bizonyos megvalósítási módok szerint a glükóz batch-ekben van adagolva. Például r sejtek báíefoójratápláiással vadnak tenyésztve: a bioreaktorba«. Előnyös: pegvaiosttasi mődok szerint a íeps tenyészet (ém. a sejtek Is tdpözeg): egy rkm időszakosan el van távoiítva (például be van gyűjtve) és helyettesítve van friss tápközeggei Bizonyos megvalósítási módok szerint á teljes tenyészet legalább körülbelül f Ö, 25, 58* 7Ó, 80, 83, 90, 99%-a vagy több van eltavolítva Időszakosan és va» helyettesítve friss- tápfcőzaggel liayösebb mepalMásl módok szerint a teljes tenyészet: legalább körülbelül 75^~a van eltávoiitva és helyettesítve:. Előnyös ntégváfósdásí módok szerint a sejtíenyészét :égy íésze körűibe»! 0. 12, JS, 24, 3Ö, 36. 42 vagy 48 óránként vagy: 1, 2, 3, 4, 5. 6, 7, 8, 9, 10 vagy több naponta va» eltávoiitva. Előnyösebb megvalósítási módok szerint a sejfíenyészeí egy része 3 naponta m Mmlm és helyettesivé, Más megvalósítási mádófc szériát s teljes tenyészet egy része teülbelü! 1, 2, 3, 4, 5, tg % 8, 9, 10 vagy több sejtosztódási eikiïsoaként Váö eltávoiitva és helyettesivé. A „sejtosztódási ciblas* aîstît a tenyésztett sejtek átlagos megdupiázödási idejét: értjük az expneneiálls növekedési fázis: alatt, azaz gazdag tenyésztő tápkőzegbetg például kö»tefebgállás hiányában.

Bizotsyös tOégválMlM módok szedni a sejMiter és/vagy töbérje-kitermeiés fokozható a sejtek ΙδΜόΕ termelésének lorláfozásával vagy szabályozásával. A laktát-ísrraetes a tenyésztett sejteknek a glükóz korlátozott adagolásával :|teort^o^|s|yal szabályozható, amint azt például az US 2005/0070013 számú amerikai egyesüli államok··!»^ szab&amp;dái:toí: béieisíiíé&amp; feltárja, publikálva 2001 március 3 Irén (lásd még az IS 7429491sztei pterikai egyesüli államök-bell szabadalmi iratot). Aböl ellentmondás van a hivatkozott dokumentum és a jelest bsjeleítiés között, éza bejelentés donoriéi. L példa: Lénfékuővelési problémák az rbBMF-2-teemeléS folyamén A BMP-2 előállítás! folyamat fejlesztése folyamán lépíéknövelést problémát figyeltünk meg CHÖ sejtek nágysőrüségü tenyészeteivel! amelyek együtt expressteliák az rhiBMP-2 és a dihidrofoíatefeduMázt (DífTR) (a 'leírás szériát: EME^OS tejtek) 1906-títeres bioreakiorbaxi. Nagy ssjtsürőségü tenyészeteket oltottunk lé O^ÖkiÖ6 séjit/ml koncentrációval o-napos: bateh-feez, vagy? 0,30x10- sejtórd-t 4-napos batcfehez. A batefe-ájrataplálási folyatnat első passzálása folyamán a végsó ssjtsőfeség általában elérte a 3,0x1# saji&amp;nM, de a következő passzázsok végső síftsÜrásége progresszlven csökkent. Például három passzálás rendre 3,0x10^ káxltfés 1,0x10" sejífod betakarítási siriséget eredményezőit, Az ilyen csökkenő növekedési sebességek alacsonyabb BMF-2 ptofot» rnenrsyisépt eredményeztek a tenyésztő tápközegben, és m általános fétmélékenység alacsonyabb veit &amp; Mvánatosnát, A csökkenő növekedési sebességek nem voltak reprodukálhatók a 3-líteres léptékben. Egy iőí)4iteres bforeaktort alkalmaztunk a probléma vizsgálatának modellezésére. A csökkenő betakarítási s&amp;őséget láttuk a 160 literes htoreakiorban, amint az 1. ábrán bemutatjuk.

További kísértetek ugyanezt a nehézséget tmüatíák. Egy próbálkozás során m alsó nágysnrüségü passzálás 2,99x1# végső seftsíMséget ért el, míg a második passzálás csak 2,28x 106 sejÄl-t ért él. A reaktort ismét beoltották: kontroll körülmények között egy passzálás előtti mintává!, mintán: az első és második nagysfeiiségS passzálás rendre 2,05x18°“ és 1,44x10* sejfon~t ért el. MWkét köntröd ktséiM i^éknővelésl probisbaát demonstrált, amelybe» az első nagyÄltegö passzálás magas végső stteáségméfí; e|, de a kővetkező: , pásszálás oövékédésí Sebessége szignifikánsan csökkent,; A BMP-2 titer és specifikus termelékenységi adatok hasonló trendet mutattak. A D jelö nyomelemek („Trace Ds’) hozzáadása a tenyésztési tápkózeghez megszüntette a léptéknővefési problémát a tényésztő tápkozegbeo. A fbeé O 3 gM vasat 3 μΜ cinket és 0,03 pM rezet tartalmaz. A Trace B-vei a magas leoltású bateh-ek Retapas és. 4-napos) konzisztensén 3,Úxlö6 sejtből vagy nagyobb betakarítási sejtsörűséget áléit él A tfovekédlsl sebesség és a specifikus termelékenység is magas más-a<lt> Eg arra utak bogy a Trace P pölrátivím befolyásolta: a sejtnövekedési jellegzetességeket. Egy olyas ímiíaíjuk be M 2, ábOltg ámelyhén á sejteket hozzáadott vasat és rezet tartalmazó vagy nem tartalmazó tápközegbeb tenyésztettük.

Almák folfedózésének megkíséiléséíé., hogy &amp; Trace D melyik komponense a legfontosabb, csak rézzel kiegészített íápköáájfokst teszteltünk (adäfokät Bém köziünk). Miután az első magas-leoltäs« batch 3,0x10* sejt/'rnl-f ért el, a küvótoáö kél; háteh csökken# növekedési sebességet mutatott, basosíóan a kontroli batéb-ek (Trace D nélkül) viseiífoöéséhéz. Á bárom nagy-íéoltású passzálás csökkenő növekedési sebessége azt mulatja, bogy a réz önmagában nem yölt hatásos a léptéknö vetési probléma jttvitására. A. nyomelemek ezen vizsgálata folyamán egy abnormális vállat figyeltünk meg a méretkizárásps teomatográfta (Size Exclusion chrosnategram, €EX) második esáesán a korábbi nagysünlségü tenyészetekben előállított rhBMP-2-vel, Azt találtuk, bogy dextrán-szuMí alacsony :szm$e (II) mg/1 a 200 mg# boly éti) a tápközeghen a váil-esöes sokkal nagyobb százalékát eredményezte foszfáttal való mkobáils titán (megközelítőleg 12%, elleniéiben megközelítőleg 4%-ai). Egy dextrán-szullatos dózis-válasz kísérlet azt. mutálta, hogy a dextrán-szulfáí magasabb szintje a sejttenyészíő tápközegben dózísfttggó módon csökkentette a mégigyelt váll -csúcs mennyiségét. A dextran-szulíátról korábban kimutatták, hogy növeli a fdiérje-kitennelést a BMP-2dermeiés folyamán, TáS# fAtÉíöí St8 3318398 és 55 Ϊ ö6l>4 számd amerikai -egyesöi: álfottfok-he!i szabadalmi iratokat, 3«LMlfe.CsöMenőgMt^

Amikór ä vas és réz ióneériMciót dúsítottuk a tenyésztő tápkőzegben, alkalmanként megfigyeltük, bogy g sígnövekédés nem volt stabil, még laboratóriumi léptéká bimoaktoreddtan: sem. Lásd a % ábrát. Azt hlgötétizáltuk, hogy a hozzáadott femek kölcsönhatásba lépnek más tápkóz®g~kömponetisekkel és Instabil tenyészet-növekedést eredményeznek.

Szövettejiyesziö iakkákban végzett előkisérteiekben (4. ábra), a sejteket 0,08x10* sejEmi sűrűségben oltottuk le és négy napos kersssáül teayesztettök. Az önmagával rézzel vagy cinkkel kiegészíted Al (14Ô) táphőzeg a kiegészítés nélkülihez hasonló módón támogatta a növekedési sebességeket, míg a Traue P-kiegészítés (hozzáadott vas, réz és eísM) alacsonyabb növekedési sebességeid eredményezett, A sejtek növekedési sebessége dóxlsíüggő esöfoísöést Is omtatoít, amikor az Ai tápkozeget önmagában vassal egészftettüfe ki A .81 (248) lápközégösn tesyfozteít sejtek csökkentéit rmvekeöési sebességeket mutattak a vassal kiegészített A1 tápközegen tenyés^öó s^tekí^z bíföbölódi, 3.2. néida: A i?írídoxiVi-vas kölcsönhatás csökkentett növekedési sebességet eredményez

Egy további vizsgálatban A! tápközegét — amely növekedési-sebesség: blbát váltott ki - -kasonfoommk össze; A3 tápközeggel, amely nem váltott ki növekedési sebesség hibát. Megfigyeltük, hogy az A1 tápközeg lényedben pírkioxált tartalmaz, míg az A3 tápközeg csak pírídpxfot tásíajfoaa BMP-2 EME <M sejteké tenyésztettünk Aï tápközege?í és A3 tápközegen kölöphözö yaskonc#Meíöfc mellett ás plridoxájlal és anélkül. Az Ai és A3 iâpifâzég vas- és Bb-vitamm-tariaimát a 2. táblázatban foglaljuk Össze. 2. Táblázat

Sejteket tenyésztettütÉ szövétteayáiziö csészéké» 37 ^«én tartott inkubátorban 7% üö^y&amp;í, 3 sfepott kemszíül A sejteket 0,15x10* ss^tÉni: mennyiségben ököttuk: fe és begyöjtettük &amp; 3. nap végén; À 3i< napi sejt^; iesáÉbláiíak CAS¥ su$miáiőn a végső stgísörüség megállapításához (10* scjt/ml, egységben), .Azután kiszámítottuk a növekedési sebességét 8 következő: egyesülettel; növekedési sebesség (a) ^ 1« (végső s«j:tsörtis% /kezded sejtsürüség) / tenyésztési idő {óra). Az eredményeket az 5. ábrán mutáljuk bet

Ifelismertűk, hogy a piridoxáí, és nem a piridoxin véli az a komponens* amely kölcsönhatásba lépd a vassal: és inkonzisztens tenyésztési téljesiiméöyl okozott, A pMdoxin a piridoxál prskurzora. Azok feteserélhetök, mint B6 vitamin a sejttenyésztő iápközegbeo és kofektorként kainak a traßszaiRtsiäeiöSan, dekártoííáeióban és dezamiöáeíőban. A legtöbb ^tenyésztési folyatnatban nincs különbség, hä ä tágközég piridöxml, piridoxák, vagy nundkettSt tartalmaz. ásÉÉan a piridoxál bizonyos koneemrácíőban kölcsönhatásba lép a megnövekedőit mennyiségiül vassal és negatívan befolyásolja az rhlMP*2 előállítást folyamatot. Amint az 5. ábrán bemutatlak, az AI tápkőzeg növekedési sebesség defektust niuiat az: A2 tápközeghez viszonyítva, amely növelhető hozzáadott vassal. Amikor piridoxállai egésatpk ki, az M tápkőzeg növekedési-sebesség defektust mutat vas dózisíüggő módon. Ily módon a magasabb vasköneémráeíő es à gíridoxál magasabb koueentráeíöja vagy aránya a tenyésztő tápközegben instabil és sznboptimálts tenyészet·· sövekedésí eredményez,

4, néki«: Erdteiles növekedés n seitsörOségben és fehérte-titerboB

További tápközeg mMosttás márt (ami a B2 tápközegei eredményezte), ami eliminálta a piridoxáit a tápközegböL a sejtnövekedés és a BbíP-2-ten».«iékenység konzisztens volt, és kétszeres növekedést mutatott a termelékenységben a korábbi folyamatokhoz kisléptékű biereaktorokban, valamint kereskedelmi léptékű bíoreakiorokban. Lásd a ö. ábrái: és a 7. ábrát. Ily módon a tenyésztő tápközeg; bejelentésben ismertetett módosításai megszüntetik a rekomblnáns fehérjetermelés kereskedelmi léptére történő teptékídtveteső során fellépő növekedési defektusokat, ami jelentős növekedést eredményez a jó minőségű fekombináns fehérje kitermelésében. A rekomöináns humán csont morfogenetite protein-2 (rhBMP-2} gyártásában alkalmazott szívónál fcinaí hörcsög petefészek pÜO) vonal volt, amely együk expresszálta a BMP-2-i és a DIIFR-t, és amelyet a leírásban EMC-S5~nek nevezőnk, A sejteket 25ÖÖ-ítferes numkatérfogatu öíöreakíorókban tertyészáettök* 0,6 x !ö6 -sejlátó' megcélzott oltási sejtsürüségekkel A sejteket B2 tápközegen (lásd » 4* táblázáíot) tenyészmttök. A tenyészetek hőmérsékletéi 37 °G-ör iattöttak. A tenyészet pll-ját hagytuk lecsökkenni a passzálás első néhány órájában 7, itt értékre. és ott tartottuk tttráos adagolásával. A 82. tápközeg Míndulási ρίί-ρ ~7.3t) vök, A tenyészeteket sorozatosan passzálínk mindegyik oltási sejtsümségnél két 3-mtpos és két 4-uapós passzálással A pH próbákat on-bne kalibráltuk vérgáz analizátorral (BOA) kapott méréseknek megfelelően. A sejisürüségeket és életképességeket manuális leszámiáiássaí határoztuk meg mikroszkóp alkalmazásával, trípánkék: kizárás alkalmazásával az éleíképesség meghatározására. Az egyes passzáíások utáni összes tenyészetből szármázó kondicionált lápközegeket: eenirifugáiással gyűjtöttük be és azutáp iekAMik, A 3. és 4 táblázát mutatja avizsgálatokban alkalmazott tápközegek kiszerelését, 3, Táblázta

4. Táblázat

Claims (13)

1. A tatálíáásy más megvakisítási módjai Ryiiváovalóak a szakember számára á. lakás feyefembevételéyei vagy a bemutatott találatáRy gyakorlatba vételéből, A leírás # a példák «sak saemiáiíetónek tskmteodök. Szabadalmj igénypontok i Eljárás ΒΜΡ*2 eiSáilbásfe, Sáíáíy etjásás magában foglalja a kővetkező lépésekéi: 1} B.MP~2*t kódöid öHSmíolwktííái tartalmazó alkalmas gazdasejt tenyésztését olya» tenyésztő tápközegbeo, amely tartalmaz vasat legalább :2j25 pM koncentrációban, pobaruonos vegydietet, ésba pliítdoáé! van jeiea, az kevesebb* mint 3 5 %»-át teszi ki a BŐ vitám® moláris kötícemraefójátsák a tápkbzegla;a:; és il) a jelentőséggel bíró fehérje visszanyerését ahol a gazdasejt legalább 166 Iber kapacitásit btensaÉtorban· vm tea vesztve, ahol a tenyésztő tápközeg továbbá íopiis btiáálibísá legalább 1Ö nM koncentrációban; és, áftöt az alkalmas gazdasejf Cf K3 sejt
2. 2. Az 1. igénypont szerinti eljárás, afeota vas legalább S μΜ koneentrMMhan van jelen.
3. 3. Az 1. vagy 2. igénypont szerinti eljárás, aboi a tenyésztő tápközeg továbbá tartalmaz legalább egy B6 vitamint a kővetkezők által alkotott csoportból kiválasztva:: piridökip, pirsdoxamtn, piridoxitt 3’-foszfát, piridoxamin 5’»fo$z:fá! 4. : A 3, igéoypőöí szét&amp;i «látás,: iáitól a tenyésztő tápközég teljes Bő vitamin koncén toációja legalább b5 μΜ, I, A 3, igénypont szerinti eljárás, ahol g tenyésztő tápkökégÖéö a pkidoxál piridexlnhoz viszonyított aránya kisebb, mint 1,2.
4. 6. Az. i4, igénypontok bármelyike szerinti eljárás,: áMl á tenyésztő tápközég továbbá cinket is tartalmaz legalább 0,2 μΜί köneeistrácKíban. f* M l-b, igénypontök MriPelyte szerinti eljárás, ahol a pdliatoPnos vegyidet dexMn-szuliat. 4'i -k % igénypont szerinti eljárás, aboi a dexírámszulíáí: legalább 10 rngii koneentráeiohtm van jelen. 9- Á 8, igénypont szerinti eljárás, aboi a óexíráft-szulíát molekulatömege S0Ö0 és SíMHM) g/mol közötti.

   0. Az 1-9. igénypontok bármelyike szerinti eljárás, aboi a tenyésztő tápközeg továbbá antinösavakíft is tartalmaz legalább 20 mM. teljes koncentrációban. I l.A iö. igénypont szerinti eljárás, aboi a tenyésztő lápközeg 1,-cisztint tartalmaz legalább 0,5 tsM koncentrációban. 12. A 11. igénypont szerinti eljárás, aboi a tenyésztő tápközeg L-gíntasInsáyM tartalmaz iegtefjébb 0,3 mM koncentrációban.
5. 13. Az M2, igénypotbok bármelyike szerlpít éprás, áböiáíenyés®Ítápkő^gkilndnMsi ozmolaritása 260 és 36(1 mOsm közötti.
6. 14. Az 1*13. igénypontok bármelyiké szeri tál eljárás, aboi a BMP-2 rekombínáns humán BMP-2 {rh8MF-2).
7. 15. Az 1-14. igénypontok bármelyiké szerinti eljárás, aböl ö gázdásejt btoéh-éjrtoápláiássai van tenyésztve.
8. 16. Az 1-15. igéayptoíok bármelyike szerinti eljárás, ahol a gazdasejt 36-38:>C-on van tenyésztve.
9. 17. Az M6. igénypontok bámtelyike szerinti eljárás, amely továbbá magában foglalja a BMP-2 tisztítását is butil-Sepharöse gyantán, 18. A 17. igénypont szerinti e§Ms, áttol a tisriMs továbbá toppban tog!á|á á kővetkező lépéseket is: BMP-2-t tartalmazó kondicionált tenyésztő topközeg felvitelét heparin-szérS gyantára, á BMP-2-ί tartalmazó eluátam nyerését, és az etoáíum felvitelét a bttof-Sepharose gyantára.
10. 19. Az i. igénypont szerinti eljárás, azzal jellemezve, hogy magában foglalja a kővetkező lépeseket: 1) BMP“iri kódoló DNS-raolektdát tartalmazó Cl 10 sejt tenyésztését batch-újratápláiási folyamatban olyan tenyészik topkőzegbett, amely tartalmaz vasat legalább 2,5 μΜ fceoemnrWÄan, rezet legalább lö nM koncentrációban, ammosavafcat legalább W mM teljes koaeesttoetóbatu j^eiszönt legalább 0,5 mM köRceptZfeiéMtn, des^äß^sßölfiliöi legalább 1Ô mg/|; köbeeniráeióbaö és BÖ vitamint legalább 15 μΜ koncentrációban, és ha piridoxâl van jelen, a?, kevesebb, mini körülbelül 55 %-át teszi ki a B6 vitami« moláris köBeeaíráeíójáa^t a tápkö2egl>eö; ös I) a BMF-2 Miéíje visszanyerését, ahol a gazdasejt legalább ISO liter kapacitású bsoreaktorban va» ténfisastm
11. 29. Az Í-I9. Igénypontok bát^lpke szedni! efárás,. almi a tenyésztő tápközeg kevesebb, mint 5 μΜ piridoxáit tartalmaz.
12. 21. Az í-li, igénypontok ÍM&amp;ndyike szerinti eljárás, ahol a tenyésztő íápközég kevesebb, mis* I aM piridoxáit tartalmaz.
13. 22. Az 1-19, igénypmdök báírnélyike szerinti eljárás, ábo! a tenyésztő tápközeg mm tartalmaz piridoxáit.