KR102056075B1 - 목적 단백질의 생산을 향상시키기 위한 동물세포 배양용 배지 조성물 및 이를 이용한 목적 단백질 생산 방법 - Google Patents

목적 단백질의 생산을 향상시키기 위한 동물세포 배양용 배지 조성물 및 이를 이용한 목적 단백질 생산 방법 Download PDF

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Abstract

본 발명은 목적 단백질의 생산을 향상시키기 위한 동물세포 배양용 배지 조성물 및 이를 이용한 목적 단백질 생산 방법에 관한 것으로, 본 발명에 따른 동물세포 배양용 배지 조성물에 재조합 BMP-4 또는 BMP-7 단백질을 생산하는 CHO 세포를 배양하면, 상기 단백질들의 생산성이 증가하고, 상기 배지 조성물에 덱스트린 설페이트를 추가하는 경우 단백질의 생산량이 더욱 증가함으로써, 본 발명의 배지 조성물은 목적 단백질의 산업적 생산에 유용하게 사용될 수 있다.

Description

목적 단백질의 생산을 향상시키기 위한 동물세포 배양용 배지 조성물 및 이를 이용한 목적 단백질 생산 방법{Medium composition of animal cell culture for enhancing target protein production and method of producing target protein using the same}
본 발명은 목적 단백질의 생산을 향상시키기 위한 동물세포 배양용 배지 조성물 및 이를 이용한 목적 단백질 생산 방법에 관한 것이다.
생물학 또는 의학 분야에 있어 원하는 목적 단백질은 주로 형질전환된 세포주를 배양함으로써 얻어질 수 있으며, 이를 위하여 산업적으로 사용되는 방법으로는 디하이드로폴레이트 환원효소(dihydrofolate reductase, DHFR)가 결핍된 CHO(Chinese hamster ovary) (CHO dhfr(-)) 세포주, CHO-K1 (subclone from the parental CHO cell) 세포주, BHK(Baby Hamster Kidney fibroblasts) 세포주 및 NS0(murine myeloma) 세포주 등을 이용하는 방법이 있다. 이들 세포주 중에서 CHO dhfr(-) 세포주는 목적 단백질을 산업적으로 대량 생산하기 위하여 가장 널리 사용되고 있는 숙주세포주이다. CHO dhfr(-) 세포주가 산업적으로 가장 선호되는 이유는 하기와 같다.
(1) 단백질의 번역 후 수정과정(posttranslational modification), 즉 당쇄화(glycosylation) 과정 및 인산화(phosphorylation) 과정이 인간 세포와 유사하여 인체의 면역 반응을 최소화하며, 인체 내에서 효과가 높은 목적 단백질의 생산이 가능하다. (2) 부유배양이 가능하여 고농도 배양 및 대량 생산 공정에 적용하기 좋다. (3) 디하이드로폴레이트 환원효소/메토트렉세이트(DHFR/methotrexate, MTX) 유전자 증폭 시스템을 이용하여 목적 단백질의 대량 생산이 가능하다. (4) 오랜 연구를 통해 안전성이 검증되어 있기 때문에 FDA와 같은 감독기관으로부터 허가를 쉽게 받을 수 있다. 이러한 CHO dhfr(-) 세포주를 목적 단백질 유전자를 포함하는 벡터로 형질전환시킴으로써 목적 단백질을 생산하는 재조합 CHO 세포주가 제조된다.
CHO 세포를 이용한 목적 단백질의 수요가 크게 증가함에 따라, 목적 단백질의 생산성을 높이기 위한 다양한 연구가 수행되고 있으며, 특히 첨가물을 통해 단위세포당 목적 단백질의 생산을 증가시키는 방법은 가장 효율적인 방법 중의 하나이다.
한편, 골형성 단백질(Bone Morphogenetic Protein, BMP)은 형질전환 성장인자 베타(Transforming Growth Factor β, TGF-β) 수퍼패밀리(superfamily)에 속하는 펩티드 성장 인자이다. 이에 속하는 BMP-2부터 BMP-15까지 총 14 종류의 BMP는 조골세포 계통 분화 및 이후의 골 형성 조절에 중요한 역할을 한다고 알려져 있다(Rahman et al., Bone Research 3 (2015)). 재조합 형태의 BMP, 특히 BMP-2, BMP-4 및 BMP-7은 설치류, 개, 양 및 영장류에서 중대한 크기의 뼈 손상을 치료할 수 있는 능력을 가지고 있다고 보고되었다(Gautschi et al., ANZ J Surg. 77(8), 626-631 (2007)). 이와 같이 치료용 목적의 재조합 BMP와 관련된 많은 연구가 진행되고 있고, BMP-2 혹은 BMP-7을 이용한 제품들은 상용화되어 의료목적으로 사용되고 있으며, BMP-4를 비롯한 다른 BMP 패밀리 단백질들도 상용화를 위한 연구가 진행 중에 있다.
하지만 BMP를 포함한 TGF-β 패밀리에 속하는 단백질들은 다른 목적 단백질과는 달리 단백질 자체의 분해로 인해 안정성이 떨어지고, 단백질 자체가 신호전달 물질로서의 기능이 있기 때문에 세포 표면의 헤파란 설페이트(heparan sulfate) 등과 결합하여 세포 내로 대사됨에 따라 생산성이 낮다는 문제점이 있다.
이에, 본 발명자들은 BMP 단백질과 같은 사이토카인 단백질의 발현을 증가시킬 수 있는 배지 조성물을 연구하던 중, 세포막의 황산화 제공자(sulfation donor)의 경쟁적 억제제인 염소산나트륨(sodium chlorate, NaClO3), 또는 황산기를 가지는 덱스트란 설페이트(dextran sulfate) 또는 헤파린(heparin)을 배지에 첨가함으로써 목적 단백질(target protein)의 생산성이 증가됨을 확인함으로써, 본 발명을 완성하였다.
본 발명의 목적은 염소산나트륨을 포함하는 목적 단백질 생산성 향상을 위한 동물세포 배양용 배지 조성물 및 이를 이용한 목적 단백질 생산 방법을 제공하는 것이다.
상기 목적을 달성하기 위하여, 본 발명은 염소산나트륨을 포함하는 목적 단백질 생산성 향상을 위한 동물세포 배양용 배지 조성물을 제공한다.
또한, 본 발명은 상기 배지 조성물에 목적 단백질을 생산하는 동물세포를 배양하고 배양액을 수득하는 단계; 및 상기 수득한 배양액으로부터 목적 단백질을 분리하는 단계를 포함하는 목적 단백질 생산 방법을 제공한다.
본 발명에 따른 동물세포 배양용 배지 조성물에 재조합 BMP-4 또는 BMP-7 단백질을 생산하는 CHO 세포를 배양하면, 상기 단백질들의 생산성이 증가하고, 상기 배지 조성물에 덱스트린 설페이트를 추가하는 경우 단백질의 생산량이 더욱 증가함으로써, 본 발명의 배지 조성물은 목적 단백질의 산업적 생산에 유용하게 사용될 수 있다.
도 1은 염소산나트륨(NaClO3)을 농도별로 첨가한 배지에서 배양한 재조합 BMP-4 단백질(rhBMP4)을 생산하는 CHO 세포의 배양액 내 재조합 BMP-4 단백질의 농도를 나타내는 결과 그래프이다.
도 2는 10 mM의 염소산나트륨을 첨가한 배지에서 배양한 재조합 BMP-4 단백질을 생산하는 CHO 세포의 배양액 내 생존 세포 농도(A), 생존율(B) 및 재조합 BMP-4 단백질의 농도(C)를 나타내는 결과 그래프이다.
도 3은 20 mM의 염소산나트륨을 첨가한 배지에서 배양한 재조합 BMP-4 단백질을 생산하는 CHO 세포의 배양액 내 생존 세포 농도(선 그래프) 및 재조합 BMP-4 단백질의 농도(막대 그래프)를 나타내는 결과 그래프이다.
도 4는 덱스트란 설페이트(dextran sulfate, DS)를 0.5(T1), 1.0(T2) 또는 1.5(T5) g/L로 첨가한 배지에서 배양한 재조합 BMP-4 단백질을 생산하는 CHO 세포의 배양액 내 생존 세포 농도(A), 생존율(B) 및 재조합 BMP-4 단백질의 농도(C)를 나타내는 결과 그래프이다.
도 5는 헤파린(heparin, H)을 100(T3), 200(T4) 또는 300(T6) ㎍/mL로 첨가한 배지에서 배양한 재조합 BMP-4 단백질을 생산하는 CHO 세포의 배양액 내 생존 세포 농도(A), 생존율(B) 및 재조합 BMP-4 단백질의 농도(C)를 나타내는 결과 그래프이다.
도 6은 덱스트란 설페이트를 첨가한 배지(T1-DS), 덱스트란 설페이트 및 염소산나트륨을 첨가한 배지(T2-DS/NaClO3), 또는 음성 대조군(C)에서 배양한 재조합 BMP-4 단백질을 생산하는 CHO 세포의 배양액 내 재조합 BMP-4 단백질의 농도를 나타내는 결과 그래프이다.
도 7은 20 mM의 염소산나트륨을 첨가한 배지에서 배양한 재조합 BMP-7 단백질을 생산하는 CHO 세포의 배양액 내 생존 세포 농도(A), 생존율(B) 및 재조합 BMP-7 단백질의 농도(C)를 나타내는 결과 그래프이다.
이하 본 발명을 상세히 설명한다.
본 발명은 염소산나트륨(NaClO3)을 포함하는 목적 단백질 생산성 향상을 위한 동물세포 배양용 배지 조성물을 제공한다.
본 명세서에서 사용된 용어, "목적 단백질"은 당업자가 대량으로 생산하고자 하는 단백질을 의미한다. 상기 목적 단백질은 재조합 발현 벡터에 상기 단백질을 암호화하는 폴리뉴클레오티드를 삽입하여 숙주세포에서 발현이 가능한 모든 단백질을 포함할 수 있다.
본 발명의 배지 조성물에 포함되는 염소산나트륨은 5 내지 50 mM, 5 내지 40 mM, 5 내지 30 mM, 10 내지 50 mM, 10 내지 40 mM, 10 내지 30 mM, 20 내지 50 mM, 20 내지 40 mM 또는 20 내지 30 mM의 농도일 수 있다. 또한, 상기 배지 조성물은 목적 단백질의 생산성을 향상시키는 것으로 공지된 물질을 추가로 포함할 수 있으며, 예를 들면, 상기 물질은 덱스트란 설페이트 및 헤파린 등을 포함할 수 있다.
상기 목적 단백질은 사이토카인일 수 있고, 구체적으로 TGF-β 패밀리에 포함되는 사이토카인일 수 있으며, 보다 구체적으로 BMP일 수 있고, 보다 구체적으로 BMP-2, BMP-3, BMP-4, BMP-5, BMP-6, BMP-7, BMP-8, BMP-9, BMP-10, BMP-11, BMP-12, BMP-13, BMP-14 또는 BMP-15일 수 있다.
상기 배지 조성물은 기본 배지를 더 포함하는 것일 수 있다. 상기 기본 배지는 동물세포 배양용 배지 또는 이들의 변형된 배지로부터 사용되는 공지된 배지를 의미하며 이는 당업자가 적절히 선택할 수 있다. 구체적으로, 상기 기본 배지는 시판 중인 무혈청 배지, 무단백 배지 및 화학 정의 배지(chemically defined media) 등을 포함할 수 있다.
상기 무혈청 배지는 재조합 의약품을 생산하는데 널리 이용되고 있는 숙주세포를 배양하는데 사용되는 배지로 SFM4CHO 배지(HyClone), Iscove's 배지, Ultra-CHO-배지(BioWhittaker) 또는 EX-Cell(JHR Bioscience)일 수 있다. 또한, 상기 배지는 첨가제로서 인슐린형 성장인자 Ⅰ(Insulin like growth factor Ⅰ, IGF-Ⅰ), 변형 표피 성장인자(Long epidermal growth factor, Long EGF), 소듐 셀레니트(Sodium selenite), 퓨트레신(Putrescine), 에탈올아민(Ethanolamine), 글루타치온(Glutathione), 레티노익산(Retinoic acid), 전환성장인자 β1(Human transforming growth factor β1, hTGF-β1), 페릭 클로라이드(Ferric chloride) 및 플루로닉 F68(Pluronic F68)로 이루어진 군에서 선택되는 어느 하나 이상을 포함할 수 있다.
한편, 상기 무단백 배지는 동물 유래 혈청을 포함하지 않는 무혈청 배지에서 특히 분자량 10 kDa 이상의 단백질이 전혀 첨가되지 않은 배양 배지로, ProCHO5 배지일 수 있다.
또한, 상기 화학 정의 배지는 동물 유래의 성분이 없고, 배지를 구성하는 모든 구성 성분이 화학적으로 규명된 동물세포 배양용 배지로서, CDM4CHO(Hyclone), PowerCHO 2CD(Lonza) 및 CD-OptiCHO(Invitrogen) 등일 수 있다.
상기 동물세포는 CHO, VERO, BHK, HeLa, NiH 3T3, MDCK, WI38, HEK, hybridoma 및 NSO 세포로 구성된 군으로부터 선택되는 것일 수 있고, 상기 CHO 세포는 CHO-K1 또는 CHO dhfr(-) 세포일 수 있다.
본 발명의 구체적인 실시예에서, 본 발명자들은 동물세포 배양 시 배지에 염소산나트륨을 첨가하면, 세포 생장에 영향이 없거나, 배양 기간이 길어짐에 따라 세포 농도가 다소 감소되면서, 재조합 BMP-4 단백질의 최대 생산성이 증가함을 확인하였다(도 1 내지 3 참조).
또한, 배지에 덱스트란 설페이트 또는 헤파린을 첨가하면, 세포 생장에 영향 없이, 재조합 BMP-4 단백질의 생산성을 증가시켰다(도 4 및 5 참조).
나아가, 덱스트린 설페이트가 포함된 배지에 염소산나트륨을 추가로 첨가함으로써 재조합 BMP-4 단백질의 생산성이 더욱 증가하였다(도 6 참조).
또한, 재조합 BMP-7 단백질도 동일하게 염소산나트륨이 첨가된 배지에서 최대 생산성이 증가하였다(도 7 참조).
따라서, 본 발명의 염소산나트륨을 포함하는 배지 조성물은 동물세포로부터 목적 단백질을 대량으로 수득하는데 유용하게 사용될 수 있다.
또한, 본 발명은,
1) 본 발명에 따른 배지 조성물에 목적 단백질을 생산하는 동물세포를 배양하고 배양액을 수득하는 단계; 및 2) 상기 단계 1)의 배양액으로부터 목적 단백질을 분리하는 단계를 포함하는 목적 단백질 생산 방법을 제공한다.
상기 배지 조성물은 상기 서술한 바와 같이 염소산나트륨을 포함할 수 있다.
상기 목적 단백질은 사이토카인일 수 있고, 구체적으로 TGF-β 패밀리에 포함되는 사이토카인일 수 있으며, 보다 구체적으로 BMP일 수 있다.
상기 동물세포는 CHO, VERO, BHK, HeLa, NiH 3T3, MDCK, WI38, HEK, hybridoma 및 NSO 세포로 구성된 군으로부터 선택되는 것일 수 있고, 상기 CHO 세포는 CHO-K1 또는 CHO dhfr(-) 세포일 수 있다.
상기 동물세포의 배양은 당업계에 널리 알려져 있는 방법을 이용하여 수행할 수 있다. 구체적으로, 공지된 회분식 배양(batch culture), 연속식 배양, 유가식 배양(fed-batch culture) 등에 의해 수행될 수 있다.
본 명세서에서 사용된 용어, "회분식 배양"은 처음 공급한 원료기질이 모두 소비될 때까지 배양을 계속하는 방법으로 기질의 농도, 대사생산물의 농도, 세포의 농도 등이 시간에 따라 계속 변화하는 배양법을 의미한다.
본 명세서에서 사용된 용어, "유가식 배양"은 배지를 간헐적으로 공급하는 배양법으로, 배양액 중의 기질이 적당한 속도로 첨가되며 유출이 없기 때문에 공급되는 기질의 양을 자유롭게 제어할 수 있는 배양법을 의미한다.
상기 배양액으로부터 목적 단백질을 분리하는 방법은 당업계에 공지된 적합한 방법으로 수행될 수 있다. 예를 들어, 원심분리, 여과, 추출, 분무, 건조, 증방, 침전, 결정화, 전기영동, 분별용해, 크로마토그래피 등의 방법을 사용할 수 있다. 또한, 상기 크로마토그래피는 이온교환, 친수성, 소수성 또는 크기배제 등 방식의 크로마토그래피일 수 있다.
이하, 본 발명을 실시예에 의해 상세히 설명한다.
단, 하기 실시예는 본 발명을 예시하는 것일 뿐, 본 발명의 내용이 하기 실시예에 의해서 한정되는 것은 아니다.
실시예 1. 재조합 BMP-4 단백질을 생산하는 CHO 세포의 제작
CHO 숙주 세포주(DG44)에 DHFR과 hBMP-4(human BMP-4) 유전자가 포함된 벡터를 리포펙타민(lipofectamine) 2000을 이용하여 접종한 후, MTX 저항 세포 선별 및 MTX 농도 증폭을 진행하여 재조합 hBMP-4 단백질을 생산하는 재조합 CHO 세포주를 제작하였다. MTX의 농도를 0.01 μM 부터 1.0 μM까지 단계적으로 올려 증폭을 하였으며, 증폭이 완료된 세포주는 화학정의 배지에 부유배양 적응을 거쳐 최종 생산 세포주로 사용하였다.
실시예 2. 재조합 BMP-4 단백질을 생산하는 CHO 세포의 부유배양 (1)
상기 실시예 1에서 제작한 재조합 BMP-4(recombinant human BMP-4, rhBMP-4) 단백질을 생산하는 CHO 세포를 화학 정의 배지와 125 mL 플라스크(Corning)를 사용하여 다양한 농도의 염소산나트륨이 첨가된 배지에서 부유배양하였다. 구체적으로, 상기 재조합 CHO 세포는 1 μM MTX 및 8 mM 글루타민(glutamine)이 첨가된 30 mL의 화학 정의 배지 CD-OptiCHO(Invitrogen)를 사용하여 회분식으로 배양하였다. 이 때, 교반기(Adolf Kuhner AG)의 속도는 110 rpm이었으며, 초기 세포 농도는 5.0 × 105 cells/mL로 접종하였다. 세포 배양 2일째에 10, 20 또는 30 mM의 염소산나트륨을 첨가하고, 분석을 위하여 배양 5일째까지 매일 1 mL의 배양액을 회수하였다.
실험예 1. 염소산나트륨의 처리 농도에 따른 재조합 BMP-4 단백질의 생산성 증가 효과 확인
염소산나트륨의 처리 농도에 따른 재조합 BMP-4 단백질의 생산성 증가 효과를 확인하기 위하여, 상기 실시예 2에서 회수한 배양액 내 재조합 BMP-4 단백질의 농도를 효소결합면역흡수법(enzyme-linked immunosorbent assay, ELISA)으로 키트(DuoSet BMP-4 ELISA kit, R&D Systems)를 이용하여 측정하였다.
그 결과, 재조합 BMP-4 단백질의 최대 생산성이 염소산나트륨 10, 20 또는 30 mM 처리에 의해 대조군 대비 약 125 ~ 145% 향상되었다(도 1).
실시예 3. 재조합 BMP-4 단백질을 생산하는 CHO 세포의 부유배양 (2)
세포 배양 2일째에 10 또는 20 mM의 염소산나트륨을 첨가하고, 분석을 위하여 배양 7일째까지 매일 1 mL의 배양액을 회수한 것을 제외하고는, 상기 실시예 2와 동일한 방법으로 재조합 BMP-4 단백질을 생산하는 재조합 CHO 세포를 배양하였다.
실험예 2. 염소산나트륨의 처리에 의한 재조합 BMP-4 단백질의 생산성 증가 효과 확인
10 또는 20 mM의 염소산나트륨 처리에 의한 재조합 BMP-4 단백질의 생산성 증가를 상기 실시예 3에서 회수한 배양액을 이용하여 하기와 같은 방법으로 확인하였다.
2-1. 염소산나트륨의 처리에 의한 재조합 BMP-4 단백질을 생산하는 CHO 세포 생장에 대한 영향 확인
상기 실시예 3에서 회수한 배양액 내 세포 농도를 셀 카운터(CountessIIV R FL automated cell counter, Invitrogen)로 측정하였고, 상기 배양액 내 세포 생존율을 트리판 블루(trypan blue) 염색법으로 측정하였다.
그 결과, 10 mM의 염소산나트륨 처리군은 대조군에 비교하여도 세포의 농도 및 생존율에는 큰 차이가 없었으며(도 2A 및 2B), 20 mM의 염소산나트륨 처리군은 배양 기간이 길어짐에 따라 대조군에 비해 세포의 농도를 80 ~ 90% 감소시켰다(도 3).
2-2. 염소산나트륨의 처리에 의한 재조합 BMP-4 단백질의 생산성 증가 효과 확인
상기 실시예 3에서 회수한 배양액을 이용하여 상기 실험예 1에 기재한 것과 동일한 방법으로 재조합 BMP-4 단백질의 생산성을 측정한 결과, 재조합 BMP-4 단백질의 최대 생산성이 염소산나트륨 10 또는 20 mM 처리에 의해 대조군 대비 125 ~ 130% 향상되었다(도 2C 및 3).
실시예 4. 재조합 BMP-4 단백질을 생산하는 CHO 세포의 부유배양 (3)
50 mL의 화학 정의 배지 CD-OptiCHO를 사용하여 CHO 세포를 접종함과 동시에 0.5, 1.0 또는 1.5 g/L의 덱스트란 설페이트를 첨가하고, 분석을 위하여 배양 7일째까지 매일 1 mL의 배양액을 회수한 것을 제외하고는, 상기 실시예 2와 동일한 방법으로 재조합 BMP-4 단백질을 생산하는 재조합 CHO 세포를 배양하였다.
실험예 3. 덱스트란 설페이트의 처리에 의한 재조합 BMP-4 단백질을 생산하는 CHO 세포 생장에 대한 영향 및 재조합 BMP-4 단백질의 생산성 증가 효과 확인
덱스트란 설페이트 처리에 의한 재조합 BMP-4 단백질을 생산하는 CHO 세포 생장에 대한 영향 및 재조합 BMP-4 단백질의 생산성 증가를 상기 실시예 4에서 회수한 배양액을 이용하여 하기와 같은 방법으로 확인하였다.
상기 실험예 2-1에 기재된 것과 동일한 방법으로 CHO 세포의 농도 및 생존율을 측정한 결과, 0.5, 1.0 또는 1.5 g/L의 덱스트란 설페이트 처리군은 대조군에 비교하여도 세포의 농도 및 생존율에 영향을 미치지 않았다(도 4A 및 4B). 또한, 상기 실험예 1에 기재한 것과 동일한 방법으로 재조합 BMP-4 단백질의 생산성을 측정한 결과, 0.5, 1.0 또는 1.5 g/L의 덱스트란 설페이트 처리에 의해 재조합 BMP-4 단백질의 생산성이 대조군에 비하여 향상되었다(도 4C).
실시예 5. 재조합 BMP-4 단백질을 생산하는 CHO 세포의 부유배양 (4)
50 mL의 화학 정의 배지 CD-OptiCHO를 사용하여 CHO 세포를 접종함과 동시에 100, 200 또는 300 ㎍/mL의 헤파린을 첨가하고, 분석을 위하여 배양 7일째까지 매일 1 mL의 배양액을 회수한 것을 제외하고는, 상기 실시예 2와 동일한 방법으로 재조합 BMP-4 단백질을 생산하는 재조합 CHO 세포를 배양하였다.
실험예 4. 헤파린의 처리에 의한 재조합 BMP-4 단백질을 생산하는 CHO 세포 생장에 대한 영향 및 재조합 BMP-4 단백질의 생산성 증가 효과 확인
덱스트란 설페이트와 비슷한 구조를 가진 헤파린 처리에 의한 재조합 BMP-4 단백질의 생산성 증가를 상기 실시예 5에서 회수한 배양액을 이용하여 하기와 같은 방법으로 확인하였다.
상기 실험예 2-1에 기재된 것과 동일한 방법으로 CHO 세포의 농도 및 생존율을 측정한 결과, 100, 200 또는 300 ㎍/mL의 헤파린 처리군은 대조군에 비교하여도 세포의 농도 및 생존율에 영향을 미치지 않았다(도 5A 및 5B). 또한, 상기 실험예 1에 기재한 것과 동일한 방법으로 재조합 BMP-4 단백질의 생산성을 측정한 결과, 100, 200 또는 300 ㎍/mL의 헤파린 처리에 의해 재조합 BMP-4 단백질의 생산성이 대조군에 비하여 향상되었다(도 5C).
실시예 6. 재조합 BMP-4 단백질을 생산하는 CHO 세포의 유가식 부유배양 (5)
50 mL의 화학 정의 배지 CD-OptiCHO를 사용하여 CHO 세포를 접종함과 동시에 1.0 g/L의 덱스트란 설페이트를 첨가하고, 배양 2일째에 10 mM의 염소산나트륨을 첨가하였으며, 분석을 위하여 배양 7일째까지 매일 1 mL의 배양액을 회수한 것을 제외하고는, 상기 실시예 2와 동일한 방법으로 재조합 BMP-4 단백질을 생산하는 재조합 CHO 세포를 배양하였다.
실험예 5. 덱스트란 설페이트 및 염소산나트륨의 처리에 의한 재조합 BMP-4 단백질의 생산성 증가 효과 확인
덱스트란 설페이트 및 염소산나트륨의 처리에 의한 재조합 BMP-4 단백질의 생산성 증가를 상기 실시예 4 또는 6에서 회수한 배양액을 이용하여 상기 실험예 1에 기재한 것과 동일한 방법으로 확인하였다.
그 결과, 재조합 BMP-4 단백질의 생산성이 덱스트란 설페이트 단독 처리에 의해 향상되었으며, 덱스트란 설페이트 및 염소산나트륨 처리에 의해 더욱 향상되었다(도 6).
실시예 7. 재조합 BMP-7 단백질을 생산하는 CHO 세포의 제작
hBMP-4 대신 hBMP-7(human BMP-7) 유전자가 포함된 벡터를 사용한 것을 제외하고는 상기 실시예 1과 동일한 방법으로 재조합 BMP-7 단백질을 생산하는 CHO 세포를 제작하였다.
실시예 8. 재조합 BMP-7 단백질을 생산하는 CHO 세포의 부유배양
상기 실시예 7에서 제작한 재조합 BMP-7(recombinant human BMP-7, rhBMP-7) 단백질을 생산하는 재조합 CHO 세포를 화학 정의 배지와 125 mL 플라스크(Corning)를 사용하여 염소산나트륨이 첨가된 배지에서 부유배양을 수행하였다. 구체적으로, 4 mM 글루타민이 첨가된 50 mL의 화학 정의 배지 PowerCHO 2CD(Lonza)를 사용하여 회분식으로 배양하였다. 이 때, 교반기(Adolf Kuhner AG)의 속도는 110 rpm이었으며, 초기 세포 농도는 2.0 × 105 cells/mL로 접종하였다. 세포 배양 2일째에 20 mM의 염소산나트륨을 첨가하고, 분석을 위하여 배양 3일째부터 9일째까지 매일 1 mL의 배양액을 회수하였다.
실험예 6. 염소산나트륨의 처리에 의한 재조합 BMP-7 단백질을 생산하는 CHO 세포 생장에 대한 영향 및 재조합 BMP-7 단백질의 생산성 증가 효과 확인
상기 실험예 1 내지 5에서 확인한 목적 단백질의 생산성 증가 효과가 재조합 BMP-4 단백질과 같은 BMP 패밀리에 속하는 재조합 BMP-7 단백질의 생산에도 적용될 수 있는지 여부를 상기 실시예 8에서 회수한 배양액을 이용하여 하기와 같은 방법으로 확인하였다.
상기 실험예 2에 기재된 것과 동일한 방법으로 CHO 세포의 농도 및 생존율을 측정한 결과, 20 mM의 염소산나트륨 처리군은 대조군에 비교하여도 세포생존율에는 영향을 미치지 않았으나, 배양 기간이 길어짐에 따라 세포의 농도를 다소 감소시켰다(도 7A 및 7B). 또한, 배양액 내 재조합 BMP-7 단백질의 농도를 효소결합면역흡수법으로 키트(DuoSet BMP-7 ELISA kit, R&D Systems)를 이용하여 측정한 결과, 재조합 BMP-7 단백질의 최대 생산성이 염소산나트륨 20 mM 처리에 의해 대조군 대비 120% 향상되었다(도 7C).
결론적으로, 본 발명에 따른 동물세포 배양용 배지 조성물에 재조합 BMP-4 또는 BMP-7 단백질을 생산하는 CHO 세포를 배양하면, 상기 단백질들의 생산성이 증가하고, 상기 배지 조성물에 덱스트린 설페이트를 추가하는 경우 단백질의 생산량이 더욱 증가함으로써, 본 발명의 배지 조성물은 목적 단백질의 산업적 생산에 유용하게 사용될 수 있다.

Claims (10)

  1. 염소산나트륨(NaClO3)을 10 내지 20 mM 농도로 포함하는, 골형성 단백질(Bone Morphogenetic Protein, BMP)인 BMP-4 및 BMP-7의 생산성 향상을 위한 동물세포 배양용 배지 조성물.
  2. 삭제
  3. 제1항에 있어서, 상기 배지 조성물은 덱스트란 설페이트 및 헤파린으로 구성된 군으로부터 선택되는 어느 하나 이상을 추가로 포함하는, 배지 조성물.
  4. 삭제
  5. 삭제
  6. 삭제
  7. 제1항에 있어서, 상기 배지 조성물은 기본 배지를 더 포함하는, 배지 조성물.
  8. 제7항에 있어서, 상기 기본 배지는 무혈청 배지, 무단백 배지 및 화학 정의 배지로 구성된 군으로부터 선택되는 어느 하나 이상인, 배지 조성물.
  9. 제1항에 있어서, 상기 동물세포는 CHO, VERO, BHK, HeLa, NiH 3T3, MDCK, WI38, HEK, hybridoma 및 NSO 세포로 구성된 군으로부터 선택되는, 배지 조성물.
  10. 1) 제1항의 배지 조성물에 골형성 단백질인 BMP-4 및 BMP-7을 생산하는 동물세포를 배양하고 배양액을 수득하는 단계; 및
    2) 상기 단계 1)의 배양액으로부터 골형성 단백질인 BMP-4 및 BMP-7을 분리하는 단계를 포함하는 골형성 단백질인 BMP-4 및 BMP-7 생산 방법.
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