PT2310523E - Métodos para a produção melhorada de proteínas morfogenéticas ósseas - Google Patents

Métodos para a produção melhorada de proteínas morfogenéticas ósseas Download PDF

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Description

DESCRIÇÃO "MÉTODOS PARA A PRODUÇÃO MELHORADA DE PROTEÍNAS MORFOGENÉTICAS ÓSSEAS" A presente invenção refere-se ao campo da produção de proteínas recombinantes. Em particular, a presente invenção é dirigida a métodos de produção de fatores de crescimento peptídicos, incluindo proteínas morfogenéticas ósseas (BMPs).
Os membros da superfamília do fator de crescimento transformante beta (TGF-β) possuem propriedades de regulação do crescimento e morfogenéticas fisiologicamente importantes (Kingsley et ai., Genes Dev. 8:133-146 (1994);
Hoodless et ai., Curr. Topics Microbiol. Immunol. 228:235-272 (1998)). As proteínas morfogenéticas ósseas (BMPs) são membros da superfamília de TGF-β de fatores de crescimento e diferenciação (Rosen et ai., Principles of Bone Biology 2:919-928 (2002)). Algumas das primeiras evidências de que as BMPs existiam foi a capacidade do osso desmineralizado de induzir novo osso quando implantado em músculo (Urist et ai., Science 150:893-99 (1965)). Subsequentemente purificaram-se bioquimicamente BMPs a partir de osso desmineralizado (Wang et ai., PNAS 85: 9484-9488 (1988)) e clonaram-se através de hibridização de oligonucleótidos radiomarcados desenhados a partir de fragmentos peptídicos das proteínas purificadas (Wozney et ai., Science 242:1528-1534 (1988)) . As BMPs clonadas foram expressas por recombinação e mantêm a sua função. As BMPs produzem-se tipicamente por recombinação devido à dificuldade, falta de pureza e baixo rendimento associados com a purificação bioquímica a partir de fontes naturais tais como, por exemplo, osso.
Sabe-se que BMP-2 e as proteínas relacionadas BMP-4, BMP-5, BMP-6, BMP-7 (também conhecida como OP-1), BMP-8 (também conhecida como OP-2), BMP-9, e BMP-10 medeiam o crescimento e a reparação de tecido ósseo e cartilaginoso. A BMP-2 é atualmente utilizada clinicamente para tratar fraturas abertas e de não união, fusões espinais (como parte do dispositivo médico INFUSE™), e para indicações ortodônticas. A disponibilidade e o custo desta importante terapêutica são governados, em parte, pelo titulo das culturas de células de mamíferos utilizados na sua produção. No entanto, as condições de cultura que produzem títulos celulares adequados a uma "escala laboratorial" podem não estar à escala da grande escala de fabrico necessária para satisfazer a crescente exigência destas proteínas. Existe uma necessidade, portanto, para métodos de produção de proteínas recombinantes, tais como a BMP-2, aumentando os títulos celulares durante a produção e onde os métodos sejam adequados para utilização a uma escala de fabrico. A presente invenção proporciona métodos para produzir proteínas recombinantes a uma escala de fabrico suportando títulos de células hospedeiras elevados, resultando num aumento do rendimento de proteínas. A presente invenção baseia-se, em parte, na descoberta de que um meio de cultura definido suplementado com metais vestigiais suporta títulos de células de cultura mais elevados de células CHO cultivadas num sistema de biorreator através de um processo de realimentação por lotes a uma escala de fabrico. Sem o suplemento de metais, o mesmo meio sustentou o crescimento num biorreator pequeno (escala laboratorial) mas não conseguiu "chegar à escala" de um biorreator de escala de fabrico. A consistência dos títulos foi melhorada adicionalmente quando o piridoxal do meio foi substituído por piridoxina.
Assim, num aspeto, a presente invenção proporciona um método de expressão de proteínas recombinantes compreendendo as etapas de cultivar uma célula hospedeira adequada compreendendo um ácido nucleico codificando uma proteína de interesse num meio de cultura definido onde o ferro está presente numa concentração de pelo menos cerca de 2,25 μΜ e se o piridoxal está presente, constitui menos de cerca de 55% da concentração molar de vitamina B6 no meio e recuperar a proteína de interesse. Nalgumas formas de realização, o ferro está presente numa concentração de pelo menos cerca de 5 μΜ. 0 meio pode compreender adicionalmente cobre numa concentração de pelo menos cerca de 10 nM e zinco numa concentração de pelo menos cerca de 2 μΜ. Nalgumas formas de realização, se o piridoxal está presente no meio, está presente numa concentração de menos de cerca de 15 μΜ. Em formas de realização particulares, se o piridoxal está presente, está presente numa concentração de menos do que cerca de 15 μΜ e forma menos de cerca de 55% da concentração molar de vitamina B6 no meio. Nalgumas formas de realização, se o piridoxal está presente no meio, ou está presente numa concentração de menos de cerca de 15 μΜ ou forma menos de cerca de 55% da concentração molar de vitamina B6 no meio.
Nalgumas formas de realização, a célula hospedeira é uma célula de mamífero, por exemplo, uma célula CHO. Em determinadas formas de realização, a proteína de interesse é um membro da superfamília do TGF-β, por exemplo, uma BMP, por exemplo, uma BMP-2.
Em determinadas formas de realização, o meio contém vitamina B6 numa concentração total de pelo menos cerca de 15 μΜ. Nalgumas formas de realização, o piridoxal, se presente no meio de cultura, constitui não mais do que cerca de 55% da concentração molar total de vitamina B6 no meio. Em formas de realização mais específicas, a vitamina B6 tem uma razão entre piridoxal e piridoxina de menos de cerca de 1,2. Em formas de realização ainda mais particulares, o meio não contém qualquer piridoxal.
Numa forma de realização específica, a presente invenção proporciona um método de produção de BMP-2 que inclui as etapas de cultivar uma célula hospedeira adequada compreendendo uma molécula de ADN codificando uma proteína BMP-2 num meio de cultura compreendendo ferro numa concentração de pelo menos cerca de 2,5 μΜ e vitamina B6 numa concentração de pelo menos cerca de 15 μΜ, e onde se o piridoxal está presente, constitui menos de cerca de 55% da concentração molar de vitamina B6 no meio e então recuperar uma proteína BMP-2.
Nalgumas formas de realização, os meios podem também conter aminoácidos numa concentração total de pelo menos 20 μΜ. O meio pode conter L-cistina numa concentração de pelo menos 0,5 μΜ. Em formas de realização específicas, o meio também contém ácido-L-glutâmico numa concentração de não mais do que 0,3 μΜ.
Em determinadas formas de realização, o meio pode também conter um composto polianiónico, por exemplo, sulfato de dextrano, numa concentração de pelo menos 10 mg/1. Nalgumas formas de realização, o meio pode ter uma osmolaridade inicial de entre cerca de 260 e 380 mOsm.
Em determinadas formas de realização, os métodos da presente invenção são adequados para cultivar células cultivadas num processo de realimentação por lotes. Em formas de realização particulares, as células cultivam-se num biorreator de tanque com agitação com uma capacidade de pelo menos cerca de 3 1. Em formas de realização ainda mais particulares, a temperatura de cultura mantém-se essencialmente constante. Nalgumas formas de realização, os métodos da presente invenção utilizam meios de cultura que sustentam uma densidade celular de colheita de pelo menos cerca de 4,0xl06 células/ml.
Assim, num aspecto, a presente invenção proporciona um processo ou método para a produção de BMP-2, que inclui as etapas de cultivar uma célula CHO contendo uma molécula de ADN codificando uma proteína BMP-2 num meio de cultura compreendendo ferro numa concentração de pelo menos cerca de 2,5 μΜ, aminoácidos numa concertação total de pelo menos 20 mM, L-cisteína numa concentração de pelo menos 0,5 mM, sulfato de dextrano numa concentração de pelo menos cerca de 10 mg/1, e vitamina B6 numa concentração de pelo menos cerca de 15 μΜ e onde se o piridoxal está presente, constitui menos de cerca de 55% da concentração molar de vitamina B6 no meio; e então recuperar uma proteína BMP-2. Em formas de realização particulares, o meio pode compreender adicionalmente cobre numa concentração de pelo menos cerca de 10 nM. Em formas de realização ainda mais particulares, o meio pode compreender adicionalmente zinco numa concentração de pelo menos cerca de 0,2 μΜ.
Nalgumas formas de realização, a presente invenção proporciona um método de produzir BMP-2 que inclui a etapa de cultivar uma célula hospedeira adequada compreendendo uma molécula de ADN codificando uma proteína BMP-2 num meio de cultura compreendendo ferro numa concentração de pelo menos cerca de 2,5 μΜ e vitamina B6 numa concentração de pelo menos cerca de 15 μΜ, e onde se o piridoxal está presente, constitui menos de cerca de 55% da concentração molar de vitamina B6 no meio, e então recuperar uma proteína BMP-2.
Nalgumas formas de realização, qualquer dos métodos da presente invenção pode compreender adicionalmente a etapa de purificar ou isolar a proteína de interesse, por exemplo, BMP-2. Nalgumas formas de realização, a proteína purificada ou isolada pode ser formulada, por exemplo, como um produto farmacêutico. Em formas de realização particulares, a purificação compreende uma ou mais purificações por cromatografia em coluna, por exemplo, uma purificação por coluna de butil sefarose.
Noutro aspeto, a presente invenção proporciona um produto produzido por qualquer dos métodos da presente invenção. Nalgumas formas de realização, o produto pode ser utilizado para tratar, ou utilizado para preparar um medicamento para tratar um paciente, por exemplo, um mamífero, por exemplo, um ser humano, tendo um defeito, lesão, doença, ou distúrbio do tecido ósseo através, por exemplo, da promoção do crescimento, geração, cura, ou reparação ósseos.
Noutro aspeto, a presente invenção proporciona meio de cultura celular substancialmente conforme descrito no presente documento. Em formas de realização particulares o meio de cultura celular é substancialmente semelhante àqueles descritos nos Quadros 3 e 4.
BREVE DESCRIÇÃO DOS DESENHOS A Figura 1 é um gráfico da densidade celular ao longo do tempo num processo de realimentação por lotes em biorreatores de 3 1 e 160 1. A Figura 2 é um gráfico da densidade celular ao longo do tempo num processo de realimentação por lotes num biorreator de 160 1 para células cultivadas em meios com e sem ferro e cobre suplementares. A Figura 3 é um gráfico da densidade celular viável ao longo do tempo num processo de realimentação por lotes num biorreator de 160 1 para células cultivadas em meio suplementado com ferro e cobre. A Figura 4 é uma série de gráficos de barras mostrando a taxa de crescimento de células cultivadas em frascos com diferentes meios e diferentes concentrações de metais. A Figura 5 é uma série de gráficos de barras mostrando a taxa de crescimento de células cultivadas em placas de cultura com diferentes meios e diferentes concentrações de ferro. A Figura 6 é um gráfico da densidade de células de cultura ao longo do tempo num processo de realimentação por lotes em biorreatores de 2500 1 de células cultivadas de acordo com os métodos da presente invenção. A linha tracejada indica as densidades de cultura médias de processos anteriores. A Figura 7 é um gráfico do titulo de colheita de rhBMP-2 ao longo do tempo para as culturas descritas na Figura 6. A linha tracejada indica os títulos de colheita normalizados de rhBMP-2 de processos anteriores.
FORMAS DE REALIZAÇÃO EXEMPLARES
Descobriu-se que se podem alcançar culturas de alta densidade e consistentes a uma escala de fabrico cultivando células que expressam BMP-2 em meios suplementados com ferro, cobre, zinco, contendo também sulfato de dextrano, em que a vitamina B6 está presente no meio numa concentração de pelo menos cerca de 15 μΜ, e a razão entre piridoxal e piridoxina na vitamina B6 é menor do que 1,2. Meios 0 meio de cultura adequado para utilização nos métodos da presente invenção conterá tipicamente os nutrientes necessários para suportar o crescimento das células cultivadas, incluindo vitaminas, minerais, ácidos gordos, aminoácidos, uma fonte de carbono (por exemplo dextrose), e opcionalmente fatores de crescimento, incluindo, por exemplo, insulina e transferrina, ou antibióticos. Nalgumas formas de realização, o meio de cultura compreende um meio basal, tal como, por exemplo, meio de Eagle modificado por Dulbecco (DMEM) , F-12 de Ham, um meio do Roswell Park Memorial Institute (RPMI), ou combinações dos mesmos.
Em determinadas formas de realização, o meio de cultura é um meio quimicamente definido, isto é, é isento de soro. Deve entender-se que no presente pedido, a menos que seja indicado de outra forma, uma concentração de um componente no meio é uma concentração inicial, isto é, a concentração do dito componente em meio fresco, antes de ser aplicado às células cultivadas. Como é conhecido na técnica, as concentrações de componentes particulares alterar-se-ão à medida que as células se submetam a processos metabólicos ou através de reações químicas espontâneas .
Nalgumas formas de realização, o meio de cultura compreende ferro numa concentração de pelo menos cerca de 2,25, 5, 5,5, 8, 10, 12, 14, 15, 20, 25, 30 μΜ, ou superior. Em formas de realização mais particulares, o ferro está presente numa concentração de cerca de 5 μΜ. Em formas de realização ainda mais particulares, o ferro está presente numa concentração de cerca de 5,5 μΜ. Nalgumas formas de realização, o ferro está presente numa concentração de entre cerca de 5,5 e 15 μΜ. Deve entender-se que para todos os limites numéricos que descrevem algum parâmetro no presente pedido, por exemplo, "pelo menos", "menor que", ou "superior a", a descrição também descreve necessariamente qualquer intervalo limitado pelos valores enumerados. O meio de cultura pode conter outros metais incluindo cobre e zinco. O cobre pode estar presente numa concentração de pelo menos 5, 10, 12, 15, 30, 50, 75, 100, 150, 200, 250 nM, ou superior. Em formas de realização particulares, o cobre está presente numa concentração de pelo menos cerca de 10 nM. Em formas de realização ainda mais particulares, o cobre está presente numa concentração de cerca de 74 μΜ. O meio de cultura pode também conter zinco numa concentração de pelo menos cerca de 0,1, 0,2, 0,5, 1,0, 2,0, 3,0, 4,0, 4,2, 4,5, 4,8, 5,0 μΜ, ou superior. Em formas de realização específicas, o zinco está presente numa concentração de cerca de 4,2 μΜ. Nalgumas formas de realização, o meio de cultura contém ferro e cobre conforme descrito acima, por exemplo, o ferro está presente numa concentração de pelo menos cerca de 2,25, 5, 5,5, 8, 10, 12, 14, 15, 20, 25, 30 μΜ e o cobre numa concentração de pelo menos cerca de 5, 10, 12, 15, 30, 50, 75, 100, 150, 200, 250 nM. Em determinadas formas de realização, o meio de cultura contém ferro, cobre e zinco conforme descrito acima. Consequentemente, nalgumas formas de realização, o meio de cultura compreende ferro numa concentração de entre cerca de 2,5 μΜ e 15 μΜ, cobre numa concentração de entre cerca de 10 nM e 150 nM, e zinco numa concentração de entre cerca de 2,1 μΜ e 8,4 μΜ. Em formas de realização mais particulares, o meio de cultura compreende ferro numa concentração de pelo menos cerca de 5 μΜ, cobre numa concentração de pelo menos cerca de 10 nM, e zinco numa concentração de pelo menos cerca de 2 μΜ.
Os meios de cultura para utilização nos métodos da presente invenção suportam densidades de células de cultura consistentes e elevadas durante, por exemplo, cultura de realimentação por lotes. Nalgumas formas de realização, os meios de cultura para utilização no método da presente invenção suportam uma densidade de colheita de pelo menos cerca de Ι,ΟχΙΟ6, l,5xl06, 2,0xl06, 2,5xl06, 3,0xl06, 3,5x106, 4 , OxlO6, 4 , lxl O6, 4,2xl06, 4,3xl06, 4,5xl06, 4, 8x106, 5, OxlO6, 5,5x106, 6, OxlO6, 6,5xl06, 7, OxlO6, 7,5x106, 8, OxlO6, 8,5x106, 9, OxlO6, 9,5xl06 células/ml, ou superior. Em formas de realização mais particulares, os meios de cultura suportam uma densidade de colheita de cerca de 4,OxlO6 até 7,OxlO6 células/ml. Em determinadas formas de realização, para alcançar estas densidades de colheita, as células semeiam-se numa densidade de menos de cerca de 0,037xl06, 0,075xl06, 0,15xl06, 0,3xl06, Ο,βχΙΟ6, l,2xl06 ou 2,4xl06 células/ml, ou superior. Em formas de realização particulares, as células semeiam-se numa densidade de cerca de Ο,βχΙΟ6 células/ml.
Nalgumas formas de realização, o meio de cultura inclui vitamina B6, da gual se conhece a sua ocorrência em várias formas adeguadas para utilização em cultura celular, incluindo piridoxina, piridoxal, piridoxamina, piridoxina 5'-fosfato, piridoxal 5'-fosfato, piridoxamina 5-fosfato, e combinações das mesmas. Nalgumas formas de realização, o meio de cultura contém pelo menos uma vitamina B6 selecionada a partir da piridoxina, piridoxamina, piridoxina 5'-fosfato, piridoxamina 5'-fosfato, e combinações das mesmas. Nalgumas formas de realização, a vitamina B6 está presente no meio de cultura numa concentração total de pelo menos cerca de 5, 10, 15, 20, 25, 30, 35, 40, 45, 50 μΜ, ou superior. Em formas de realização particulares, a vitamina B6 está presem-te numa concentração de pelo menos cerca de 10 μΜ. Em formas de realização ainda mais particulares, a vitamina B6 está presente numa concentração de cerca de 30 μΜ. Em determinadas formas de realização, o piridoxal, se presente, constitui não mais de cerca de 55, 50, 40, 30, 20, 10, 5, 1, 0,1% da concentração molar de vitamina B6 no meio de cultura. Nalgumas formas de realização, se presente no meio de cultura, o piridoxal está presente numa concentração de menos de cerca de 20, 15, 10, 8, 6, 5, 4, 3, 2, 1 μΜ. Nalgumas formas de realização o meio de cultura tem uma razão entre piridoxal e piridoxina de cerca de 0 e 1.2. Em formas de realização mais particulares, a razão entre piridoxal e piridoxina no meio de cultura é menor que 1.2, por exemplo, menor que 1,1, 1,0, 0,9, 0,7, 0,5, 0,4, 0,3, ou 0,1. Em formas de realização ainda mais particulares, o meio não contém essencialmente qualquer piridoxal.
Os meios de cultura para utilização nos métodos da presente invenção proporcionarão tipicamente aminoácidos para sustentar o crescimento das células cultivadas e a produção da proteína de interesse. Nalgumas formas de realização, os aminoácidos podem estar presentes no meio de cultura em proporções definidas, por exemplo, conforme descrito nos Quadros 3 ou 4. Como é conhecido na técnica, os hidrolisados de preparações proteicas (por exemplo, peptona, bactopeptona, triptona, hidrolisado de caseína, ou hidrolisado de soja soytone) podem ser utilizados como fontes de aminoácidos. Nalgumas formas de realização, um meio contendo proporções definidas de aminoácidos pode suplementar-se com hidrolisados proteicos indefinidos. Alternativamente, nalgumas formas de realização, os hidrolisados indefinidos servem como fonte primária se aminoácidos. Em formas de realização particulares onde os hidrolisados são a fonte primária de aminoácidos, o meio pode suplementar-se com um ou mais aminoácidos particulares conforme necessário. Nalgumas formas de realização, o meio de cultura tem uma concentração de aminoácidos total de pelo menos cerca de 15, 20, 25, 30, 35, 40 mM, ou superior. Em formas de realização particulares, o teor total de aminoácidos do meio é pelo menos cerca de 20 mM. Em formas de realização ainda mais particulares, a concentração de aminoácidos total é cerca de 30 mM.
As proporções de aminoácidos e as concentrações de aminoácidos individuais podem ser ajustadas para acomodar as necessidades metabólicas da célula hospedeira dependendo, por exemplo, da taxa de crescimento das células, do perfil metabólico da célula, das proporções dos aminoácidos na proteína recombinante a ser produzida, ou para melhorar a qualidade da proteína recombinante produzida. Por exemplo, as porções de rhBMP-2 produzida em células CHO que estão num dímero dissociável com dímeros de sulfidrilo cisteinilados ou livres são afetadas pelas concentrações de L-cistina e ácido L-glutâmico no meio, conforme divulgado, por exemplo, no documento de patente U.S. N.° 5.830.761. Consequentemente, nalgumas formas de realização, o meio de cultura compreende L-cistina numa concentração de pelo menos cerca de 0,2, 0,3, 0,4, 0,5, 0,6, 0,7, 0,8, 0,9, 1,0, 1,05, 1,1, 1,2, 1,3, 1,4, 1,5, 2,0, 2,5, 3,0, 3,5, 4,0 mM ou superior. Por exemplo, em formas de realização particulares, o meio compreende L-cistina numa concentração de cerca de 0,2-4,0 mM. Em formas de realização mais particulares, o meio compreende L-cistina numa concentração de cerca de 0,5-4,0 mM. Em formas de realização ainda mais particulares, o meio compreende L- cistina numa concentração de cerca de 0,7-3,0 μΜ. Nalgumas formas de realização, o ácido L-glutâmico está presente no meio de cultura numa concentração de pelo menos cerca de 0,023, 0,05, 0, 1, 0,2, 0,3, 0,4, 0,5, 1, 0, 1,5, 2,0, 2,5, 3.0, 3,5, 4,0 mM, ou superior. Em formas de realização particulares, o meio de cultura compreende L-cistina numa concentração de pelo menos cerca de 0,2, 0,3, 0,4, 0,5, 0,6, 0,7, 0,8, 0,9, 1,0, 1,05, 1,1, 1,2, 1,3, 1,4, 1,5, 2.0, 2,5, 3,0, 3,5, 4,0 mM ou superior e ácido L-glutâmico numa concentração de no máximo cerca de 0,023, 0,05, 0,1, 0,2, 0,3, 0,4, 0,5, 1,0, 1,5, 2,0, 2,5, 3,0 mM. Em formas de realização mais particulares, a L-cistina está presente no meio de cultura numa concentração de pelo menos cerca de 0,5 mM e o ácido L-glutâmico está presente no meio de cultura numa concentração de no máximo cerca de 0,3 mM. Em formas de realização ainda mais particulares, a L-cistina está presente no meio de cultura numa concentração de cerca de 0,7-3,0 mM e o ácido L-glutâmico está presente no meio de cultura numa concentração de no máximo cerca de 0,2 mM. O meio de cultura pode adicionalmente compreender um agente polianiónico. Teoriza-se, mas não é fiável, que os agentes polianiónicos competem com frações na superfície celular das células para ligação a domínios de ligação semelhantes a moléculas de heparina em proteínas recombinantes secretadas, por exemplo, a extremidade N-terminal de um monómero ou dímero de hBMP-2 maduro (crivado proteoliticamente). Quando uma proteína secretada se liga à superfície de uma célula, o rendimento da proteína em solução diminui. Ao competir com estes elementos na superfície de uma célula, os agentes polianiónicos aumentam a concentração da proteína livre (não associada a células) no meio de cultura. Exemplos de agentes polianiónicos incluem heparina, sulfato de heparina, sulfato de pentosano, dextrano, sulfato de dextrano, ácido hialurónico, condroitina, sulfato de condroitina, sulfato de dermatano, sulfato de queratano, sulfato de hexuronal-hexosaminoglicano, hexassulfato de inositol, e octassulfato de sacarose. Em determinadas formas de realização, o agente polianiónico é capaz de ligar-se à extremidade N-terminal de um monómero de hBMP-2 maduro com afinidade micromolar ou nanomolar. Nalgumas formas de realização, o agente polianiónico é um polímero natural sulfonado, por exemplo, glucosaminoglicano (GAG), ou um derivado do mesmo, onde o polímero está pelo menos cerca de 1%, 5%, 10%, 12%, 15%, 18%, 20%, 25%, 30%, 50%, ou mais, sulfonado. Nalgumas formas de realização o agente polianiónico está presente numa concentração de pelo menos cerca de 1, 5, 10, 20, 50, 75, 100, 200, 400, 600, 800, 1.000 mg/1, ou superior.
Em formas de realização particulares, o agente polianiónico é o sulfato de dextrano. Em formas de realização mais particulares, o sulfato de dextrano tem uma massa molecular de entre cerca de 5.000 e 500.000 g/mol. Em formas de realização ainda mais particulares, o sulfato de dextrano tem uma massa molecular de cerca de 7.000 g/mol. Nalgumas formas de realização, o sulfato de dextrano está presente numa concentração de pelo menos cerca de 10 mg/1. Em formas de realização mais particulares, o sulfato de dextrano está presente numa concentração de cerca de 400 mg/1. A utilização de sulfato de dextrano num meio de cultura para produzir rhBMP-2 descreve-se adicionalmente nos documentos de patente U.S. N.°s 5.318.898 e 5.516.654. O meio de cultura pode ser manipulado para manter determinados parâmetros do meio, por exemplo, pH, O2 dissolvido ou osmolaridade. Nalgumas formas de realização, o meio de cultura mantém-se num intervalo de osmolaridade particular. Noutras formas de realização, o meio de cultura ajusta-se a uma osmolaridade inicial particular. Em formas de realização particulares, a osmolaridade inicial da cultura está entre cerca de 260-380 mOsm. Em formas de realização mais particulares a osmolaridade inicial está entre cerca de 280 e 360 mOsm.
Em determinadas formas de realização, o meio de cultura compreende ferro numa concentração de pelo menos cerca de 2,5 μΜ, cobre numa concentração de pelo menos cerca de 10 nM, aminoácidos numa concentração total de pelo menos cerca de 20 mM, sulfato de dextrano numa concentração de pelo menos cerca de 10 mg/1, e vitamina B6 numa concentração de pelo menos cerca de 15 μΜ, onde a vitamina B6 tem uma razão entre piridoxal e piridoxina de menos de cerca de 1,2. Em formas de realização mais particulares, o meio de cultura compreende adicionalmente zinco numa concentração de pelo menos cerca de 0,2 μΜ. Em formas de realização muito particulares, descrevem-se meios de cultura para utilização na presente invenção no Quadro 3 e Quadro 4, isto é, meio Al, A2, Bl ou B2. Em formas de realização ainda mais particulares, o meio é B2. Em determinadas formas de realização o meio é substancialmente semelhante a B2. Por "substancialmente semelhante", quer-se dizer que nenhum componente do meio está presente numa concentração de mais de cerca de 0,1, 0,2, 0,5, 1,0, 1,5, 2,0, 2,5, ou 3,0 vezes diferente (isto é, aumento ou diminuição) à do meio B2 no Quadro 4.
Nalgumas formas de realização, a utilização de um componente indefinido pode ser aceitável e o meio pode ser suplementado com soro bovino fetal (FBS) a até 0,1, 0,5, 1, 5, 10%, ou mais. No entanto, embora se utilize amplamente o soro para culturas de células de mamíferos, existem vários problemas associados com a sua utilização, conforme discutido em Freshney Culture of Animal Cells, John Wiley & Sons, Nova Iorque, 91-99 (1994) . Por exemplo, o soro contém vários componentes não identificados e como tal não está quimicamente definido. De facto, a composição do soro varia entre lotes, tornando a padronização difícil. Adicionalmente, o soro pode conter fatores inibidores do crescimento, resultando num crescimento subótimo.
Finalmente, o soro pode conter vírus ou outros agentes patogénicos, tornando tanto a produção como a aprovação regulamentar mais difíceis. Consequentemente, preferem-se meios isentos de soro, para a utilização nos métodos da presente invenção.
Proteínas
Os métodos proporcionados pela presente invenção podem ser utilizados para produzir uma variedade de proteínas. Em determinadas formas de realização, a proteína é um fator de crescimento. Em formas de realização particulares o fator de crescimento é um membro da superfamília do TGF-β. Em formas de realização mais particulares, o membro da família do TGF-β é uma proteína morfogenética óssea (BMP).
As BMPs são uma família de proteínas altamente homóloga, e separam-se em subgrupos com base em níveis ainda mais elevados de homologia. Alguns subgrupos importantes incluem: BMP-2 e BMP-4; BMP-5, BMP-6, e BMP-7; e BMP-12, BMP-13, e MP-52. Em particular, as BMPs partilham um padrão de identificação de resíduos de cisteína na região carboxi-terminal da proteína, que são necessários para a atividade das BMP. Em determinadas formas de realização, a proteína fabricada através dos métodos da presente invenção é uma BMP selecionada a partir de BMP-2, BMP-4, BMP-5, BMP-6, BMP-7, BMP-8, BMP-9, BMP-10, BMP-11, BMP-12, BMP-13, BMP-14, BMP-15, BMP-16, BMP-17, BMP-18, e MP-52, incluindo combinações e heterodímeros das mesmas. Tipicamente, BMP refere-se a uma molécula dimérica ligada por dissulfeto. Em determinadas formas de realização, uma BMP pode ser monomérica. Nalgumas formas de realização, a referência a uma BMP inclui sequências pelo menos cerca de 70%, 80%, 90%, 95%, 96%, 97%, 98%, 99%, 99,9% ou mais idênticas a nível de aminoácidos à sequência da região madura (sem um pro-domínio) de uma BMP conhecida e que retém atividade biológica (por exemplo, atividade de formação de osso, cartilagem, ou tecidos semelhantes a ligamentos/tendões). Nalgumas formas de realização, uma BMP pode compreender 1, 2, 3, 4, 5, 6, 7, 8, 9, 10, 15, 20, 25, ou mais substituições de aminoácidos numa sequência de BMP conhecida. As BMPs são conhecidas na técnica e identificaram-se a partir de uma variedade de espécies incluindo mamíferos, tais como seres humanos, gatos, galinhas, chimpanzés, vacas, cães, cabras, cavalos, macacos, ratinhos, porcos, coelhos, ratos e ovelhas. Podem encontrar-se descrições de BMPs, incluindo, por exemplo, sequências proteicas e de ácidos nucleicos e métodos de produção, nas seguintes publicações: BMP-2, BMP-3, BMP-4, BMP-6, BMP-6, e BMP-7 (divulgado, por exemplo, nos documentos de patente U.S. N.°s 5.013.649; 5.116.738; 5.106.748; 5.187.076; e 5.141.905), BMP-8 (divulgado no documento PCT WO 91/18098), BMP-9 (divulgado no documento PCT WO 93/00432), BMP-10 (divulgado no documento PCT WO 94/26893) BMP-11 (divulgado no documento PGT WO 94/26892), BMP-12 e BMP-13 (divulgado no documento WO 95/16035), BMP-15 (divulgado no documento de patente U.S. N.° 5.635.372), BMP-16 (divulgado no documento de patente U.S. N.° 6.331.612), MP-52 (divulgado no documento WO 93/16099), e BMP-17 e BMP-18 (divulgado no documento de patente N.° 6.027.917). Deve entender-se que uma referência a estas proteínas inclui variantes, variantes alélicas, fragmentos das mesmas, e BMPs mutantes, incluindo mas não limitadas a mutantes por deleção, mutantes por inserção, e mutantes por substituição. Em particular, deve-se entender que a referência a qualquer BMP particular inclui fragmentos de truncamento das extremidades N-terminais onde pelo menos 1, 3, 5, 7, 9, 10, 11, 12, 13, 15, 18, 20, 22, 25, 30, 35, ou mais resíduos foram removidos do terminal N da proteína madura.
Em formas de realização particulares da presente invenção, a BMP é uma BMP-2. Nalgumas formas de realização, a BMP-2 é BMP-2 humana (hBMP-2). Em formas de realização ainda mais particulares, a hBMP-2 é hBMP-2 madura (isto é, Q283-R396 do número de registo NCBI NP_001191) e possui atividade de formação de osso e/ou de cartilagem. Em formas de realização particulares, a hBMP-2 é pelo menos cerca de 88, 89, 90, 92, 94, 95, 96, 98, 99, 99,9% idêntica a nivel de aminoácidos à hBMP-2 madura (Q283-R396 do número de registo NCBI NP_001191). Consequentemente, nalgumas formas de realização, a hBMP-2 madura pode conter 1, 2, 3, 4, 5, 6, 7, 8, 9, 10, 11, 12, 13, 14, ou 15 substituições de aminoácidos. Nalgumas formas de realização, a BMP-2 produzida é dimérica. Nalgumas formas de realização, a BMP-2 produzida é monomérica. Em determinadas formas de realização, uma BMP-2 tem um truncamento da extremidade N-terminal de pelo menos 1, 3, 5, 7, 9, 10, 11, 12, 13, ou mais resíduos do terminal N de pelo menos uma subunidade da proteína dimérica. Os ensaios para a atividade da BMP-2 são conhecidos na técnica e divulgam-se, por exemplo, no documento de patente U.S. N.° 5.013.649.
Identificou-se BMP-2 em várias espécies. Veja-se, por exemplo, o Quadro 1, que enumera o Entrez GenelD do National Center for Biotechnology Information (NCBI) para BMP-2 de várias espécies. Estes GenelDs podem ser utilizados para obter sequências de ARNm ou proteicas anotadas publicamente disponíveis, por exemplo, no portal web mundial do NCBI, que pode ser encontrado no seguinte localizador-padrão de recursos (URL): http://www.ncbi.nlm.nih.gov/sites/entrez?db=gene. A modo de ilustração, o GenelD para a BMP-2 humana pode ser utilizada para obter as seguintes sequências de referência: NM_001200.2 (ARNm) e NP_001191.1 (proteína). De forma semelhante para ratinhos, as sequências de referência da BMP-2 que se podem obter incluem NM_007553.2 (ARNm) e NP_031579.2 (proteína).
Quadro 1
Isolamento e utilizações
Como é sabido na técnica, as proteínas morfogenéticas ósseas tais com a BMP-2 são úteis como terapêuticos à base de proteínas. Consequentemente, os métodos da invenção podem compreender adicionalmente a etapa de purificação e isolamento da proteína obtida a partir da cultura. A BMP-2 pode ser purificada através de uma variedade de métodos conhecidos na técnica. Em formas de realização particulares, a purificação compreende uma ou mais purificações por cromatografia de coluna, por exemplo, uma purificação por resina de butil sefarose. Em formas de realização mais particulares a coluna de butil sefarose compreende uma resina de butilamina unida a sefarose ativada por CNBr, por exemplo, sefarose 4B. Nalgumas formas de realização, a purificação pode adicionalmente compreender uma etapa de purificação por coluna numa resina semelhante a heparina, por exemplo, uma resina de sulfato CELLUFINE™. Por exemplo, pode aplicar-se meio condicionado a partir das células cultivadas que contém a BMP-2 a uma coluna contendo resina semelhante a heparina, obtém-se um eluato contendo a BMP-2 a partir da coluna, e então é aplicado a uma segunda coluna, tal como uma coluna de butil sefarose. É possível purificação adicional, conforme descrito, por exemplo, no documento de Publicação Internacional N.° WO 99/31120, particularmente nas páginas 3-7 do mesmo.
Uma vez purificados, os produtos dos métodos da presente invenção podem ser adicionalmente formulados, por exemplo, como produtos farmacêuticos. Para uma análise geral de portadores farmacêuticos para BMPs, veja-se, por exemplo, Seeherman and Wozney Cytokine Growth Factor Rev. 16(3):329-45 (2005) ou o documento de patente U.S. N.° 5.385.887. Os produtos dos métodos da presente invenção podem ser utilizados para tratar, ou utilizados para preparar um medicamento para tratar, um defeito, lesão, doença, ou distúrbio do tecido ósseo, por exemplo, promovendo o crescimento, geração, cura ou reparação ósseos. Células
Pode utilizar-se uma ampla variedade de células para produzir uma proteina recombinante através dos métodos proporcionados pela presente invenção. Qualquer célula que possa ser transformada com ADN recombinante para expressar uma proteina de interesse, por exemplo, uma BMP, pode ser utilizada nos métodos da presente invenção. As células podem ser procedente de uma variedade de espécies, incluindo de uma fonte de nemátodos, anelídeos, insetos, anfíbios ou mamíferos, por exemplo, seres humanos, primatas, ovinos, bovinos, suínos, equinos, felinos, caninos ou roedores. Em formas de realização particulares, as células são humanas ou de roedor. Em formas de realização mais particulares, as células são de hámster.
Linhas celulares adequadas para utilização nos métodos da presente invenção são bem conhecidas na técnica e estão amplamente disponíveis. Pode obter-se uma série de linhas celulares adequadas a partir de depósitos tais como o America Type Culture Collection (ATCC), Manassas, VA. Linhas celulares adequadas da presente invenção incluem uma célula COS, uma célula CHO, uma célula BHK, uma célula Balb/c 3T3, uma célula FRhL-2, uma célula SP2/0, uma célula NSO, uma célula TM4, uma célula CVl, uma célula MDCK, uma célula BRL, uma célula Vero-76, uma célula HeLa, uma célula MDCK, uma célula HepG2, ou uma célula 2 93. Em formas de realização particulares, a célula é uma célula COS, uma célula CHO, uma célula BHK, uma célula Balb/c 3T3, ou uma célula 293. Em formas de realização mais particulares, a célula é uma célula CHO. A célula CHO pode ser modificada para aumentar o título celular e/ou o rendimento proteico. Nalgumas formas de realização, a célula CHO pode ter expressão reduzida ou nula do gene da dihridrofolato redutase (DHFR; GenelD 13361 de ratinho), por exemplo, a célula CHO pode ser heterozigótica ou homozigótica para um alelo hipomórfico (função reduzida), nulo (não funcional), ou negativo dominante (nulo e inibe formas funcionais da enzima) de DHFR e a proteína de interesse pode ser cotransfetada numa construção contendo um gene DHFR funcional.
Biorreator e Condições
Podem cultivar-se células para utilização nos métodos da presente invenção através de qualquer método conhecido na técnica, por exemplo, conforme discutido em Warnock and Al-Rubei Biotech. Appl. Biochem. 45:1-12 (2006). Tipicamente, cultivam-se as células num biorreator. Os biorreatores podem ser de qualquer tamanho. Nalgumas formas de realização, o biorreator é de pelo menos cerca de 1 1; 3 1; 20 1; 40 1; 80 1; 100 1; 160 1; 1.900 1; 2.500 1; 12.000 1; 20.000 1; 40.000 1, ou mais. Um biorreator pode suportar o crescimento de células em suspensão (por exemplo, crescimento independente de fixação) ou fixas a um substrato. O crescimento dependente de fixação pode incluir a utilização de microportadores para, por exemplo, proporcionar uma extensa razão entre área de superfície e volume.
Em formas de realização particulares da presente invenção, as células cultivam-se em suspensão; isto é, sem uma superfície de fixação. As modalidades do crescimento independente de fixação são bem conhecidas na técnica e incluem crescimento em, por exemplo, biorreatores de tanque com agitação e biorreatores de agitação pneumática. Em formas de realização particulares, o biorreator é um biorreator de tanque com agitação. As células cultivadas num biorreator particular, por sua vez, podem ser cultivadas através de uma variedade de métodos conhecidos na técnica incluindo a realimentação por lotes (descrito mais abaixo no presente documento, ver também Drapeau et al., Cytotechnology 15(1-3):103-9 (1994)), lotes alimentados (veja-se, por exemplo, os documentos de patente U.S. N.°s 5.672.502; 6.924.124; ou 7.332.303), ou métodos de cultura por perfusão (empregando um dispositivo de retenção celular para que se possam remover os resíduos do biorreator quando se adiciona meio fresco, veja-se, por exemplo os documentos de patente U.S. N.°s 4.814.278 ou 6.607.910). Nalgumas formas de realização particulares, as células cultivam-se através de um processo de realimentação por lotes. Em formas de realização mais particulares as células cultivam-se a uma temperatura essencialmente constante. Nalgumas formas de realização, pode selecionar-se uma temperatura de cultura adequada a partir de cerca de 31, 32, 33, 34, 35, 36, 37, 38, 39, 40, 41 ou 42 °C. Nalgumas formas de realização, a temperatura essencialmente constante pode ser um intervalo pequeno de temperaturas, tais como 35-39 °C ou 36-38 °C. Em formas de realização mais particulares, as células cultivam-se a uma temperatura constante de cerca de 37 °C.
Os biorreatores podem manter vários parâmetros fisiológicos do meio de cultura incluindo, por exemplo, oxigenação (O2 dissolvido), pH, osmolaridade, temperatura, luz, e a concentração de nutrientes particulares (por exemplo, glucose ou aminoácidos). Em determinadas formas de realização, o biorreator monitoriza e mantém a temperatura, o pH e o teor de O2 dissolvido. Nalgumas formas de realização, a glucose administra-se por lotes. Por exemplo, as células cultivam-se num biorreator por realimentação por lotes. Em formas de realização particulares, remove-se periodicamente (por exemplo, colhida) uma porção da cultura total (isto é, células e meio) e é substituída com meio fresco. Nalgumas formas de realização, pelo menos cerca de 10, 25, 50, 75, 80, 85, 90, 95, 99%, ou mais da cultura total é removido periodicamente e substituído com meio fresco. Em formas de realização mais particulares, pelo menos cerca de 75% da cultura total é removido e substituído. Em formas de realização particulares, remove-se uma porção da cultura celular a cerca de cada 6, 12, 18, 24, 30, 36, 42, ou 48 horas, ou cada 1, 2, 3, 4, 5, 6, 7, 8, 9, 10, ou mais dias. Em formas de realização mais particulares, remove-se e substitui-se uma porção do meio de cultura cada 3 dias. Noutras formas de realização, remove-se e substitui-se uma porção da cultura total a cerca de cada 1, 2, 3, 4, 5, 6, 7, 8, 9, 10, ou mais ciclos de divisão celular. Por "ciclo de divisão celular", refere-se o tempo médio de duplicação das células cultivadas durante o crescimento exponencial, isto é, num meio de cultura rico, na ausência de, por exemplo, inibição por contacto.
Em determinadas formas de realização, o título celular e/ou o rendimento proteico podem ser potenciados limitando ou controlando a produção de lactato por parte das células. A produção de lactato pode ser controlada limitando a alimentação de glucose às células cultivadas de uma forma restringida, por exemplo, conforme divulgado no documento de Publicação de Patente U.S. N.° 2005/0070013, publicado a 31 de março de 2005 (veja-se também o documento de patente U.S. N.° 7.429.491). Onde exista qualquer conflito entre uma referência de um documento e o presente pedido, o presente pedido regerá.
EXEMPLOS
Exemplo 1: Problema de aumento de escala durante a produção de rhBMP-2
Durante o desenvolvimento de um processo de produção de BMP-2, observou-se um problema de aumento de escala com culturas de densidade celular elevada de células CHO que coexpressam rhBMP-2 e dihidrofolato redutase (DHFR) (referidas no presente documento como células EMC-G5) num biorreator de 1.900 litros. Inocularam-se culturas de alta densidade celular a 0,60xl06 células/ml para um lote de 3 dias, ou 0,30xl06 células/ml para um lote de 4 dias. Durante a primeira passagem do proceso de realimentação por lotes, a densidade celular final alcançou vulgarmente 3,0xl06 células/ml, mas a densidade celular final das seguintes passagens decresceu progressivamente. Por exemplo, três passagens resultariam em densidades celulares de colheita de 3,0xl06, Ι,βχΙΟ6, e Ι,ΟχΙΟ6 células/ml, respetivamente. Tais taxas de crescimento decrescentes resultaram em menores quantidades de proteína BMP-2 no meio de cultura e a produtividade global foi menor que o desejado. As taxas de crescimento em declínio não foram reproduzíveis à escala de 3 litros. Utilizou-se um biorreator de 160 litros como modelo para investigar este problema. Observou-se a densidade celular de colheita em declínio no biorreator de 160 1, conforme mostrado na Figura 1.
Experiências adicionais mostraram a mesma dificuldade. Num ensaio, a primeira passagem de alta densidade alcançou uma densidade celular final de 2,99xl06, ao passo que a segunda passagem só alcançou 2,28xl06 células/ml. O reator inoculou-se novamente sob condições de controlo com uma pré-passagem, e posteriormente a primeira e segunda passagens de alta densidade alcançaram densidades celulares finais de 2,65xl06 e l,49xl06 células/ml, respetivamente. Ambas as experiências de controlo demonstraram o problema de aumento de escala no qual a primeira passagem de alta inoculação alcança uma densidade final elevada mas a taxa de crescimento da passagem seguinte decresce de forma significativa. Os dados de titulo e de produtividade especifica de BMP-2 mostraram tendências semelhantes. A adição de elementos vestigiais D ("vestígio D") ao meio de crescimento eliminou os problemas de aumento de escala no meio de cultura. 0 vestígio D consiste em ferro a 3 μΜ, zinco a 3 μΜ, e cobre a 0,03 μΜ. Com o vestígio D, os lotes de alta inoculação (3 dias e 4 dias) alcançaram de forma consistente densidades de colheita de 3,0xl06 células/ml ou superiores. A taxa de crescimento e a produtividade específica também permaneceram elevadas. Isto indica que o vestígio D afetou positivamente as características do crescimento celular. Mostram-se os resultados de um ensaio no qual se cultivaram células em meios com e sem ferro e cobre suplementares na Figura 2.
Na tentativa de descobrir que componente do vestígio D é mais importante, testaram-se meios suplementados unicamente com cobre (não mostrado). Após o primeiro lote de alta inoculação ter alcançado mais de 3,0xl06 células/ml, os dois lotes seguintes mostraram taxas de crescimento decrescentes, semelhantes ao comportamento dos lotes de controlo (sem vestígio D). As taxas de crescimento decrescentes das três passagens de alta inoculação mostram que o cobre por si só não foi eficaz na melhoria do problema de aumento de escala.
Exemplo 2: O Sulfato de Dextrano Elimina Anormalidades em Cromatogramas
Durante estas avaliações com metais vestigiais, observou-se um pico secundário anormal no segundo pico do cromatograma de exclusão de tamanho (CEX) para rhBMP-2 produzida em culturas de alta densidade prévias. Encontrou-se que um baixo nível de sulfato de dextrano no meio (10 mg/1 em vez de 200 mg/1) resultou numa percentagem muito mais elevada de pico secundário após incubação com fosfato (aproximadamente 12%, frente a aproximadamente 4%, respetivamente). Uma experiência de resposta a dose de sulfato de dextrano mostrou que níveis mais elevados de sulfato de dextrano em meios de cultura celular reduziram a quantidade de picos secundários observados numa forma dependente da dose. Mostrou-se previamente que o sulfato de dextrano aumenta o rendimento proteico durante a produção de BMP-2. Veja-se, por exemplo, os documentos de patente U.S. N.°s 5.318.898 e 5.516.654.
Exemplo 3.1: Títulos Celulares Decrescentes em Meios Suplementados com Metais
Quando se enriqueceram as concentrações de ferro e cobre no meio de cultura, observou-se ocasionalmente que o crescimento celular não era estável, mesmo em biorreatores de escala laboratorial. Veja-se a Figura 3. Colocou-se a hipótese de que os metais adicionais podem interagir com outro (s) componente (s) do meio e resultar num crescimento instável das culturas.
Em experiências preliminares em frascos de cultura de tecidos (Figura 4), as células foram inoculadas a uma densidade de 0,08xl06 células/ml e cultivadas durante quatro dias. Os meios Al (140) suplementados somente com cobre ou zinco suportaram taxas de crescimento comparáveis aos meios não suplementados, ao passo que a suplementação com vestígio D (ferro, cobre e zinco adicionais) resultaram em taxas de crescimento inferiores. As células também exibiram um decréscimo dependente da dose na taxa de crescimento quando se suplementaram os meios Al somente com ferro. As células cultivadas em meios Bl (248) exibiram taxas de crescimento reduzidas semelhantes às células cultivadas em médios Al suplementados com ferro.
Exemplo 3.2: A Interação Piridoxal-Ferro Resulta numa Taxa de Crescimento Reduzida
Num estudo adicional, compararam-se meios Al, que suscitavam o défice na taxa de crescimento com meios A2, que não suscitavam o défice na taxa de crescimento.
Registou-se que o meio Al contém principalmente piridoxal, ao passo que o meio A2 contém somente piridoxina. Cultivaram-se células BMP-2 EMC G5 em meios Al e meios A2 a diferentes concentrações de ferro e em presença e ausência de piridoxal. 0 teor de ferro e de vitamina B6 dos meios Al e A2 estão resumidos no Quadro 2.
Quadro 2
Cultivaram-se células em placas de cultura de tecidos numa incubadora mantida a 37 °C com CO2 a 7% durante 3 dias. Inocularam-se as células a 0,15xl06 células/ml e foram colhidas ao final de 3 dias. Contaram-se as células do dia 3 num contador CASY para obter a densidade celular final (em unidades de 106 células/ml. Calculou-se então a taxa de crescimento através da seguinte equação: Taxa de crescimento (u) = ln (densidade celular final/densidade celular inicial)/ tempo de cultura (horas) . Os resultados mostram-se na Figura 5.
Descobriu-se que o piridoxal, mas não a piridoxina, era o componente que interagia com o ferro e provocava um desempenho de cultura inconsistente. A piridoxina é o precursor do piridoxal. São permutáveis como vitamina B6 em meio de cultura e atuam como cofatores para a transaminação, descarboxilação e desaminação. Na maioria dos processos de cultura celular, é indiferente se os meios contêm piridoxina, piridoxal, ou ambos. No entanto, o piridoxal, em determinadas concentrações, interage com a quantidade aumentada de ferro e afeta negativamente o processo de produção de rhBMP-2. Conforme mostrado na Figura 5, o meio Al suscita um défice na taxa de crescimento relativamente ao meio A2, que pode ser exacerbado por ferro adicional. Quando suplementado com piridoxal, o meio A2 suscita um défice na taxa de crescimento numa forma dependente de dose de ferro. Como tal, a combinação de concentrações mais elevadas de ferro e concentrações ou proporções mais elevadas de piridoxal no meio de cultura resultam num crescimento de cultura instável e subótimo.
Exemplo 4: Aumento Robusto da Densidade Celular e Titulo Proteico
Após uma modificação do meio adicional (resultando no meio B2), que eliminou o piridoxal do meio, o crescimento celular e a produtividade de BMP-2 foram constantes, e exibiram um aumento para o dobro da produtividade em biorreatores a pequena escala bem como em biorreatores de escala comercial relativamente aos processos anteriores. Veja-se a Figura 6 e Figura 7. Como tal, as modificações do meio de cultura descritas no presente pedido eliminam os défices de crescimento que ocorreram durante o aumento da escala de produção de proteína recombinante a uma escala comercial, resultando em aumentos substanciais do rendimento da proteína recombinante de alta qualidade. A linha celular utilizada para produzir proteína morfogenética óssea humana recombinante 2 (rhBMP-2) no fabrico foi uma linha de Ovário de Hámster Chinês (CHO) que coexpressa BMP-2 e DHFR, referida no presente documento como EMC-G5. As células cultivaram-se em biorreatores de volume funcional de 2.500 litros inoculadas em densidades celulares alvo de Ο,βχΙΟ6 células/ml. As células
cultivaram-se em meio B2 (veja-se o Quadro 4) . A temperatura das culturas manteve-se a 37 °C. Permitiu-se que o pH da cultura diminuísse durante as primeiras horas de uma passagem até um ponto definido de 7,10 e manteve-se assim através da adição de titulante. O pH inicial do meio B2 era de -7,30. Efetuaram-se passagens seriadas das culturas a cada densidade celular de inoculo para duas passagens de 3 dias e duas passagens de 4 dias. As sondas de pH foram calibradas em linha de acordo com as medições a partir de um analisador de gases sanguíneos (BGA). Determinaram-se as densidades e viabilidades celulares através de contagem manual utilizando um microscópio, utilizando a exclusão por azul de tripano para determinar a viabilidade. Colheu-se meio condicionado de todas as culturas após cada passagem por centrifugação e posterior filtração.
Os Quadros 3 e 4 mostram as formulações dos meios utilizados nos presentes estudos.
Quadro 3
(continuação)
Outras formas de realização da presente invenção serão aparentes para os peritos na especialidade pela consideração da memória descritiva e da prática da invenção divulgada no presente documento. Pretende-se que a especificação e os exemplos se considerem unicamente como exemplares.
DOCUMENTOS REFERIDOS NA DESCRIÇÃO
Esta lista de documentos referidos pelo autor do presente pedido de patente foi elaborada apenas para informação do leitor. Não é parte integrante do documento de patente europeia. Não obstante o cuidado na sua elaboração, o IEP não assume qualquer responsabilidade por eventuais erros ou omissões.
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Claims (22)

  1. REIVINDICAÇÕES 1. Um método de produção de BMP-2 compreendendo as etapas de: i) cultivar uma célula hospedeira adequada que compreende uma molécula de ADN que codifica uma BMP-2 num meio de cultura compreendendo ferro numa concentração de pelo menos 2,25 μΜ, um composto polianiónico, e se o piridoxal está presente, forma menos de 55% da concentração molar de vitamina B6 no meio de cultura; e ii) recuperar a proteína de interesse em que a célula hospedeira é cultivada num biorreator tendo uma capacidade de pelo menos 160 1, em que o meio de cultura compreende adicionalmente cobre numa concentração de pelo menos 10 nM; e em que a célula hospedeira adequada é uma célula CHO.
  2. 2. O método da reivindicação 1, em que o ferro está numa concentração de pelo menos 5 μΜ.
  3. 3. O método da reivindicação 1 ou 2, onde o meio de cultura compreende adicionalmente pelo menos uma vitamina B6 selecionada a partir do grupo que consiste em piridoxina, piridoxamina, piridoxina 5'-fosfato, piridoxamina 5'-fosfato.
  4. 4. O método da reivindicação 3, em que o meio de cultura tem uma concentração total de vitamina B6 de pelo 15 μΜ.
  5. 5. O método da reivindicação 3, em que o meio de cultura tem uma razão entre piridoxal e piridoxina de menos de 1,2.
  6. 6. O método de qualquer das reivindicações 1 a 5, em que o meio de cultura compreende adicionalmente zinco numa concentração de pelo menos 0,2 μΜ.
  7. 7. 0 método de qualquer das reivindicações 1 a 6, em que o composto polianiónico é o sulfato de dextrano.
  8. 8. 0 método da reivindicação 7, em que o sulfato de dextrano está presente numa concentração de pelo menos 10 mg/1.
  9. 9. O método da reivindicação 8, em que o sulfato de dextrano tem uma massa molecular de entre 5.000 e 500.000 g/mol.
  10. 10. O método de qualquer das reivindicações 1 a 9, em que o meio de cultura compreende adicionalmente aminoácidos numa concentração total de pelo menos 20 mM.
  11. 11. O método da reivindicação 10, em que o meio de cultura compreende L-cistina numa concentração de pelo menos 0,5 mM.
  12. 12. O método da reivindicação 11, em que o meio de cultura compreende ácido L-glutâmico numa concentração de no máximo 0,3 mM.
  13. 13. O método de qualquer das reivindicações 1 a 12, em que o meio de cultura tem uma osmolaridade inicial de entre 260 e 360 mOsm.
  14. 14. O método de qualquer das reivindicações 1 a 13, em que a BMP-2 é BMP-2 recombinante humana (rhBMP-2).
  15. 15. O método de qualquer das reivindicações 1 a 14, onde a célula hospedeira é cultivada por realimentação descontínua (batch).
  16. 16. O método de qualquer das reivindicações 1 a 15, onde a célula hospedeira é cultivada a uma temperatura de 36-38 °C.
  17. 17. 0 método de qualquer das reivindicações 1 a 16, que compreende adicionalmente a etapa de purificar a BMP-2 numa resina de butil sefarose.
  18. 18. 0 método da reivindicação 17, em que a purificação compreende adicionalmente as etapas de aplicar um meio de cultura condicionado contendo a BMP-2 a uma resina semelhante a heparina, obter um eluato contendo a BMP-2, e aplicar o eluato à resina de butil sefarose.
  19. 19. Um método de acordo com a reivindicação 1 que compreende as etapas de: i) cultivar uma célula CHO que compreende uma molécula de ADN que codifica uma proteína BMP2 num processo de realimentação descontínua em meio e cultura compreendendo ferro numa concentração de pelo menos 2,5 μΜ, cobre numa concentração de pelo menos 10 nM, aminoácidos numa concentração de pelo menos 20 mM, L-cistina numa concentração de pelo menos 0,5 mM, sulfato de dextrano numa concentração de pelo menos 10 mg/1, e vitamina B6 numa concentração de pelo menos 15 μΜ, e se o piridoxal está presente, constitui menos de 55% da concentração molar de vitamina B6 no meio de cultura; e ii) recuperar uma proteína BMP-2, em que a célula hospedeira é cultivada num biorreator tendo uma capacidade de pelo menos 160 1.
  20. 20. O método de qualquer uma das reivindicações 1 a 19 onde o meio de cultura compreende piridoxal a menos de 5 μΜ.
  21. 21. O método de qualquer uma das reivindicações 1 a 19 onde o meio de cultura compreende piridoxal a menos de 1 μΜ.
  22. 22. 0 método de qualquer uma das reivindicações 1 a 19 onde o meio de cultura não contém qualquer piridoxal.
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