KR20110005874A

KR20110005874A - 골 형태발생 단백질의 개선된 생산 방법

Info

Publication number: KR20110005874A
Application number: KR20107025696A
Authority: KR
Inventors: 옌-퉁 루안; 웬지 왕; 그레그 나이버그; 조스 마누엘 고메스; 데니스 드라퓨; 테리 카도자
Original assignee: 와이어쓰 엘엘씨
Priority date: 2008-04-17
Filing date: 2009-04-16
Publication date: 2011-01-19
Also published as: IL208732A; AU2009236187A1; PT2310523E; IL208732A0; CL2009000912A1; JP2011518175A; US20090317867A1; SI2310523T1; JP5739324B2; CN107090481A; US8039231B2; AU2009236187B2; MX2010011356A; WO2009129379A1; HUE027035T2; CA2720980A1; CA2720980C; JP2015109854A; DK2310523T3; EP2310523B1

Abstract

본 발명은 개선된 재조합 단백질 생산 방법 및 공정에 관한 것이다. 본 발명의 방법은 성장 인자, 특히 BMP-2와 같은 골 형태발생 단백질(BMP)을 비롯한 TGF-β 상과의 성장 인자의 생산에 유용하다. 적합한 숙주 세포는, 철이 2.25μM 이상의 농도로 존재하고, 피리독살이 존재하는 경우, 피리독살이 배지중의 비타민 B6의 몰 농도의 55% 미만을 구성하는 배지에서 배양된다.

Description

골 형태발생 단백질의 개선된 생산 방법{METHODS FOR ENHANCED PRODUCTION OF BONE MORPHOGENETIC PROTEINS}

본원은 2008년 4월 17일자로 출원된 미국 가출원 제61/045,643호를 우선권 주장하고, 상기 가출원은 본원에 전체가 참고로 혼입되어 있다.

본 발명은 재조합 단백질 생산 분야에 관한 것이다. 특히 본 발명은 골 형태발생 단백질(BMP)을 비롯한 펩타이드 성장 인자를 생산하는 방법에 관한 것이다.

전환 성장 인자-베타(TGF-β) 상과의 일원은 생리학적으로 중요한 성장 조절 및 형태발생 성질을 갖는다([Kingsley et al., Genes Dev . 8:133-146 (1994)]; [Hoodless et al., Curr . Topics Microbiol . Immunol . 228:235-272 (1998)]). 골 형태발생 단백질(BMP)은 성장 및 분화 인자인 TGF-β 상과의 일원이다([Rosen et al., Principles of Bone Biology 2:919-928 (2002)]). BMP가 존재한다는 첫번째 증거중 일부는 근육에 이식되었을 때 새로운 뼈를 유발할 수 있는 무기질제거된 뼈의 능력이었다([Urist et al., Science 150:893-99 (1965)]). 후속적으로 무기질제거된 뼈로부터 BMP가 생화학적으로 정제되었고([Wang et al., PNAS 85: 9484-9488 (1988)]), 정제된 단백질의 펩타이드 절편으로부터 고안된 방사성표지된 올리고뉴클레오타이드의 하이브리드화에 의해 클로닝되었다([Wozney et al., Science 242:1528-1534 (1988)]). 클로닝된 BMP는 재조합 발현되고, 이들의 기능을 보유한다. BMP는 골(骨)과 같은 천연 공급원으로부터의 생화학적 정제와 관련된 어려움, 순도의 부족 및 낮은 수율로 인해 전형적으로 재조합 생산된다.

BMP-2 및 관련된 단백질인 BMP-4, BMP-5, BMP-6, BMP-7(OP-1로도 공지되어 있음), BMP-8(OP-2로도 공지되어 있음), BMP-9 및 BMP-10이 골 및 연골 조직의 성장 및 보수를 매개하는 것으로 공지되어 있다. BMP-2는 현재 개방성 및 불유합 골절, 척수 융합(INFUSE(상표명) 의학 디바이스의 일부로서)을 위해, 그리고 치열교정 용도를 위해 임상적으로 이용되고 있다. 이 중요한 치료제의 이용가능성 및 비용은 부분적으로는 이의 생산에 이용되는 포유동물 세포 배양물의 역가에 의해 지배된다. 그러나, "실험실 규모"로 적합한 세포 역가를 생성하는 배양 조건이 이들 단백질의 증가하는 요구를 만족시키는데 필요한 대규모의 제조 규모까지 확장되지 않을 수 있다. 따라서, 생산동안 세포 역가를 증가시킴으로써 BMP-2와 같은 재조합 단백질을 생산하고, 제조 규모로 사용하기에 적합한 방법에 대한 필요성이 존재한다.

본 발명은 높은 숙주 세포 역가를 유지시킴으로써 결과적으로 단백질 수율을 증가시키는, 재조합 단백질을 제조 규모로 생산하는 방법을 제공한다. 본 발명은 부분적으로는 흔적양의 금속이 보충된 한정된 배양 배지가 제조 규모에서 배치-재공급 과정에 의해 생물 반응기에서 배양되는 CHO 세포의 더 높은 수확 세포 역가를 지지한다는 발견에 근거한다. 금속이 보충되지 않으면 동일한 배지가 작은(실험실 규모) 생물 반응기에서의 성장을 유지하였지만, 제조 규모의 생물 반응기로의 "규모 확대"에는 실패하였다. 배지중의 피리독살을 피리독신으로 대체하였을 때 역가 일관성이 추가로 개선되었다.

따라서, 한 양태에서, 본 발명은 철이 약 2.25μM 이상의 농도로 존재하고, 피리독살이 존재하는 경우, 피리독살이 배지중의 비타민 B6의 몰 농도의 약 55% 미만을 구성하는 한정된 배양 배지에서 관심 단백질을 암호화하는 핵산을 포함하는 적합한 숙주 세포를 배양하는 단계 및 관심 단백질을 회수하는 단계를 포함하는 재조합 단백질의 발현 방법을 제공한다. 일부 실시양태에서는, 철이 약 5μM 이상의 농도로 존재한다. 배지는 약 10nM 이상의 농도의 구리 및 약 2μM 이상의 농도의 아연을 추가로 포함할 수 있다. 일부 실시양태에서는, 피리독살이 배지에 존재하면, 이는 약 15μM 미만의 농도로 존재한다. 특정한 실시양태에서는, 피리독살이 존재하면, 이는 약 15μM 미만의 농도로 존재하고, 배지중의 비타민 B6의 몰 농도의 약 55% 미만을 구성한다. 일부 실시양태에서는, 피리독살이 배지에 존재하는 경우, 이는 약 15μM 미만의 농도로 존재하거나, 또는 배지중의 비타민 B6의 몰 농도의 약 55% 미만을 구성한다.

일부 실시양태에서는, 숙주 세포가 포유동물 세포, 예를 들면 CHO 세포이다. 일부 실시양태에서는, 관심 단백질이 TGF-β 상과의 일원, 예를 들면 BMP, 예컨대 BMP-2이다.

일부 실시양태에서는, 배지는 약 15μM 이상의 총 농도로 비타민 B6을 함유한다. 일부 실시양태에서는, 피리독살이, 배양 배지에 존재하는 경우, 배지중의 비타민 B6의 총 몰 농도의 약 55% 이하를 구성한다. 보다 구체적인 실시양태에서, 비타민 B6은 약 1.2 미만의 피리독신에 대한 피리독살의 비를 갖는다. 보다 특정한 실시양태에서, 배지는 피리독살을 함유하지 않는다.

특정한 실시양태에서, 본 발명은 약 2.5μM 이상의 농도의 철 및 약 15μM 이상의 농도의 비타민 B6, 및, 존재하는 경우, 배지중의 비타민 B6의 몰 농도의 약 55% 미만을 구성하는 피리독살을 포함하는 배양 배지에서 BMP-2 단백질을 암호화하는 DNA 분자를 포함하는 적합한 숙주 세포를 배양하는 단계 및 그런 다음, BMP-2 단백질을 회수하는 단계를 포함하는 BMP-2 생산 방법을 제공한다.

일부 실시양태에서, 배지는 또한 약 20mM 이상의 총 농도의 아미노산을 함유할 수 있다. 배지는 약 0.5mM 이상의 농도의 L-시스테인을 함유할 수 있다. 특정한 실시양태에서, 배지는 또한 약 0.3mM 이하의 농도의 L-글루탐산을 함유한다.

일부 실시양태에서, 배지는 또한 약 10mg/L 이상의 농도의 다가음이온 화합물, 예를 들면 덱스트란 설페이트를 함유할 수 있다. 일부 실시양태에서, 배지는 약 260 내지 380 mOsm의 초기 삼투압 몰 농도(osmolarity)를 가질 수 있다.

일부 실시양태에서, 본 발명의 방법은 배치 재공급 방법으로 성장된 배양 세포에 적합하다. 특정한 실시양태에서, 세포는 약 3L 이상의 용량을 갖는 교반되는 탱크식 생물 반응기에서 성장된다. 보다 더 특정한 실시양태에서, 배양 온도는 본질적으로 일정하게 유지된다. 일부 실시양태에서, 본 발명의 방법은 약 4.0x10⁶세포/mL 이상의 수확 세포 밀도를 유지하는 배양 배지를 이용한다.

따라서, 한 양태에서, 본 발명은 약 2.5μM 이상의 농도의 철, 약 20mM 이상의 총 농도의 아미노산, 약 0.5mM 이상의 농도의 L-시스틴, 약 10mg/L 이상의 농도의 덱스트란 설페이트, 및 약 15μM 이상의 농도의 비타민 B6, 및, 존재하는 경우, 배지중의 비타민 B6의 몰 농도의 약 55% 미만을 구성하는 피리독살을 포함하는 배양 배지에서 BMP-2 단백질을 암호화하는 DNA 분자를 포함하는 CHO 세포를 배양하는 단계 및 그런 다음, BMP-2 단백질을 회수하는 단계를 포함하는 BMP-2 생산 방법또는 공정을 제공한다. 특정한 실시양태에서, 배지는 약 10nM 이상의 농도의 구리를 추가로 포함할 수 있다. 보다 더 특정한 실시양태에서, 배지는 약 0.2μM 이상의 농도의 아연을 추가로 포함할 수 있다.

일부 실시양태에서, 본 발명은 약 2.5μM 이상의 농도의 철, 약 15μM 이상의 농도의 비타민 B6, 및, 존재하는 경우, 배지중의 비타민 B6의 몰 농도의 약 55% 미만을 구성하는 피리독살을 포함하는 배양 배지에서 BMP-2 단백질을 암호화하는 DNA 분자를 포함하는 적합한 숙주 세포를 배양하는 단계 및 그런 다음, BMP-2 단백질을 회수하는 단계를 포함하는 BMP-2 생산 방법을 제공한다.

일부 실시양태에서, 본 발명은 관심 단백질, 예를 들면 BMP-2를 정제하거나 단리하는 단계를 추가로 포함할 수 있다. 일부 실시양태에서, 정제되거나 단리된 단백질은 예를 들면 약제로서 배합될 수 있다. 특정한 실시양태에서, 정제는 하나 이상의 컬럼 크로마토그래피 정제, 예를 들면 뷰틸 세파로스 컬럼 정제를 포함한다.

다른 양태에서, 본 발명은 본 발명의 임의의 방법에 의해 생산된 생성물을 제공한다. 일부 실시양태에서, 생성물은 예를 들면 골 성장, 생성, 치료 또는 보수를 촉진시킴으로써 골 조직의 결손, 손상, 질병 또는 질환을 갖는 환자, 예를 들면 포유동물, 예컨대 인간을 치료하는데 이용되거나, 또는 이들을 치료하는 약제를 제조하는데 이용될 수 있다.

다른 양태에서, 본 발명은 본원에 실질적으로 개시된 세포 배양 배지를 제공한다. 특정한 실시양태에서, 세포 배양 배지는 실질적으로 표 3 및 4에 개시된 바와 유사하다.

도 1은 3L 및 160L 생물 반응기에서 배치 재공급 방법을 이용하였을 때 시간에 따른 세포 밀도의 플롯을 나타낸다.
도 2는 철 및 구리가 보충되거나 보충되지 않은 배지에서 성장된 세포에 대한 160L 생물 반응기에서 배치 재공급 방법을 이용하였을 때 시간에 따른 세포 밀도의 플롯을 나타낸다.
도 3은 철 및 구리가 보충되거나 보충되지 않은 배지에서 성장된 세포에 대한 160L 생물 반응기에서 배치 재공급 방법을 이용하였을 때 시간에 따른 살아있는 세포 밀도의 플롯을 나타낸다.
도 4는 서로 다른 배지 및 서로 다른 철 농도를 이용하여 플라스크에서 성장시킨 세포의 성장 속도를 나타내는 일련의 막대 그래프이다.
도 5는 서로 다른 배지 및 서로 다른 금속 농도를 이용하여 배양 접시에서 성장시킨 세포의 성장 속도를 나타내는 일련의 막대 그래프이다.
도 6은 본 발명의 방법에 따라 2500L 생물 반응기의 세포를 배치 재공급 방식으로 성장시켰을 때 시간에 따른 수확 세포 밀도의 플롯을 나타낸다. 점선은 종래 방법의 평균적인 수확 밀도를 나타낸다.
도 7은 도 6에 개시된 배양물의 시간에 따른 rhBMP-2 수확 역가의 플롯을 나타낸다. 점선은 종래 방법의 평균적인 rhBMP-2 정상화된 수확 역가를 나타낸다.

철, 구리 및 아연으로 보충되고 또한 덱스트란 설페이트를 함유하며, 비타민 B6이 15μM 이상의 농도로 배지에 존재하고 비타민 B6 중의 피리독신에 대한 피리독살의 비가 1.2 미만인 배지에서 BMP-2 발현 세포를 배양함으로써, 일정한 고밀도 배양을 제조 규모로 달성할 수 있는 것으로 발견되었다.

배지

본 발명의 방법에 이용하기에 적합한 배양 배지는 비타민, 무기질, 지방산, 아미노산, 탄소 공급원(예를 들면 덱스트로스), 및 선택적으로 예를 들면 인슐린 및 트랜스페린을 비롯한 성장 인자, 또는 항생제를 비롯하여 배양 세포의 성장을 유지시키는데 필요한 영양분을 함유할 것이다. 일부 실시양태에서, 배양 배지는 기초 배지, 예를 들면 둘베코의 개질된 이글 배지(DMEM), 햄스(Ham's) F-12, 로스웰 파크 메모리얼 인스티튜트(RPMI: Roswell Park Memorial Institute) 배지 또는 이의 조합을 포함한다.

일부 실시양태에서, 배양 배지는 화학적으로 한정된 배지이고, 즉 혈청이 없다. 본원에서는 달리 언급되지 않는 한, 배지중의 성분의 농도가 출발 농도, 즉 배양된 세포에 적용되기 전의 신선한 배지 중의 성분의 농도임을 이해해야만 한다. 당 분야에 공지되어 있는 바와 같이, 특정한 성분의 농도는 세포가 물질대사 과정 또는 자연적인 화학 반응을 겪음에 따라 변화할 것이다.

일부 실시양태에서, 배양 배지는 2.25, 5, 5.5, 8, 10, 12, 14, 15, 20, 25, 30μM 또는 그 이상의 농도의 철을 포함한다. 보다 특정한 실시양태에서, 철은 약 5μM의 농도로 존재한다. 보다 더 특정한 실시양태에서, 철은 약 5.5μM의 농도로 존재한다. 일부 실시양태에서, 철은 약 5.5 내지 15μM의 농도로 존재한다. 본원에서 일부 변수를 개시하는데 모든 수치 경계, 예를 들면 "이상", "미만", "초과"의 경우, 개시 내용은 또한 반드시 언급된 값에 의해 한정되는 임의의 범위를 개시한다.

배양 배지는 구리 및 아연을 비롯한 다른 금속을 함유할 수 있다. 구리는 약 5, 10, 12, 15, 30, 50, 75, 100, 150, 200, 250nM 이상 또는 그 이상의 농도로 존재할 수 있다. 특정한 실시양태에서, 구리는 약 10nM 의 농도로 존재한다. 보다 특정한 실시양태에서, 구리는 약 74μM의 농도로 존재한다. 배양 배지는 또한 약 0.1, 0.2, 0.5, 1.0, 2.0, 3.0, 4.0, 4.2, 4.5, 4.8, 5.0μM 이상 또는 그 이상의 농도의 아연을 함유할 수 있다. 특정한 실시양태에서, 아연은 약 4.2μM의 농도로 존재한다. 일부 실시양태에서, 배양 배지는 상기 개시된 바와 같은 철과 구리를 함유하고, 예를 들면 철은 약 2.25, 5, 5.5, 8, 10, 12, 14, 15, 20, 25, 30μM 이상의 농도로 존재하고, 구리는 약 5, 10, 12, 15, 30, 50, 75, 100, 150, 200, 250 nM 이상의 농도로 존재한다. 일부 실시양태에서, 배양 배지는 상기 개시된 바와 같은 철, 구리 및 아연을 함유한다. 따라서, 일부 실시양태에서, 배양 배지는 약 2.5μM 내지 15μM의 농도의 철, 약 10nM 내지 150nM의 농도의 구리, 및 약 2.1μM 내지 8.4μM의 농도의 아연을 포함한다. 보다 특정한 실시양태에서, 배양 배지는 약 5μM 이상의 농도의 철, 약 10nM 이상의 농도의 구리, 및 약 2μM 이상의 농도의 아연을 포함한다.

본 발명의 방법에 이용되는 배양 배지는 예를 들면 배치 재공급 배양동안 일관된 높은 수확 세포 밀도를 유지시킨다. 일부 실시양태에서, 본 발명의 방법에 이용되는 배양 배지는 약 1.0x10⁶, 1.5x10⁶, 2.0x10⁶, 2.5x10⁶, 3.0x10⁶, 3.5x10⁶, 4.0x10⁶, 4.1x10⁶, 4.2x10⁶, 4.3x10⁶, 4.5x10⁶, 4.8x10⁶, 5.0x10⁶, 5.5x10⁶, 6.0x10⁶, 6.5x10⁶, 7.0x10⁶, 7.5x10⁶, 8.0x10⁶, 8.5x10⁶, 9.0x10⁶, 9.5x10⁶세포/ml 이상 또는 그 이상의 수확 밀도를 유지시킨다. 보다 특정한 실시양태에서, 배양 배지는 약 4.0x10⁶ 내지 7.0x10⁶ 세포/ml의 수확 밀도를 유지시킨다. 일부 실시양태에서, 이들 수확 밀도를 달성하기 위해서, 세포를 약 0.037x10⁶, 0.075x10⁶, 0.15x10⁶, 0.3x10⁶, 0.6x10⁶, 1.2x10⁶, 또는 2.4x10⁶ 세포/mL 또는 그 이상보다 낮은 밀도로 시딩한다. 특정한 실시양태에서, 세포는 약 0.6x10⁶세포/mL의 밀도로 시딩된다.

일부 실시양태에서, 배양 배지는 피리독신, 피리독살, 피리독사민, 피리독신 5'-포스페이트, 피리독살 5'-포스페이트, 피리독사민 5'-포스페이트 및 이의 조합을 비롯하여, 세포 배양에 이용하기 적합한 여러 형태로 존재하는 것으로 공지된 비타민 B6를 포함한다. 일부 실시양태에서, 배양 배지는 피리독신, 피리독사민, 피리독신 5'-포스페이트, 피리독사민 5'-포스페이트 및 이의 조합에서 선택되는 하나 이상의 비타민 B6를 함유한다. 일부 실시양태에서, 비타민 B6는 약 5, 10, 15, 20, 25, 30, 35, 40, 45, 50μM 이상 또는 그 이상의 총 농도로 배양 배지에 존재한다. 특정한 실시양태에서, 비타민 B6는 약 10μM 이상의 농도로 존재한다. 보다 더 특정한 실시양태에서, 비타민 B6는 약 30μM의 농도로 존재한다. 일부 실시양태에서, 피리독살은 존재하는 경우 배양 배지중의 비타민 B6의 몰 농도의 약 55, 50, 40, 30, 20, 10, 5, 1, 0.1　% 이하를 구성한다. 일부 실시양태에서, 배양배지에 존재하는 경우, 피리독살은 약 20, 15, 10, 8, 6, 5, 4, 3, 2, 1μM 미만의 농도로 존재한다. 일부 실시양태에서, 배양 배지는 0 내지 1.2의 피리독신에 대한 피리독살의 비를 갖는다. 보다 특정한 실시양태에서, 배양 배지 중의 피리독신에 대한 피리독살의 비는 1.2 미만, 예를 들면 약 1.1, 1.0, 0.9, 0.7, 0.5, 0.4, 0.3, 또는 0.1 미만이다. 보다 더 특정한 실시양태에서, 배지는 본질적으로 피리독살을 함유하지 않는다.

본 발명의 방법에 이용되는 배양 배지는 전형적으로 배양 세포의 성장 및 관심 단백질의 생산을 유지하기 위해 아미노산을 제공할 것이다. 일부 실시양태에서, 아미노산은 한정된 비율로, 예를 들면 표 3 또는 4에 개시된 바와 같이 배양 배지에 존재할 수 있다. 당분야에 공지되어 있는 바와 같이, 단백질 제조물의 가수분해물(예를 들면 펩톤, 박토펩톤, 트립톤, 카제인 가수분해물 또는 소이톤 대두 가수분해물)이 아미노산의 공급원으로서 사용될 수 있다. 일부 실시양태에서, 한정된 비율의 아미노산을 함유한 배지에 비한정된 단백질 가수분해물이 보충될 수 있다. 다르게는, 일부 실시양태에서는, 비한정된 가수분해물이 아미노산의 일차 공급원으로 작용한다. 가수분해물이 아미노산의 일차 공급원인 특정한 실시양태에서, 배지에는 필요에 따라 하나 이상의 특정한 아미노산이 보충될 수 있다. 일부 실시양태에서, 배양 배지는 약 15, 20, 25, 30, 35, 40mM 이상 또는 그 이상의 총 아미노산 농도를 갖는다. 특정한 실시양태에서, 배지의 총 아미노산 함량은 약 20mM 이상이다. 보다 더 특정한 실시양태에서, 총 아미노산 농도는 약 30mM이다.

예를 들면 세포의 성장 속도, 세포의 물질대사 프로필, 생산되는 재조합 단백질에서 아미노산의 비율에 따라 숙주 세포의 물질대사 필요성에 순응하기 위해, 또는 생산되는 재조합 단백질의 질을 개선시키기 위해, 아미노산 비율 및 개별적인 아미노산 농도가 조절될 수 있다. 예를 들면 시스테인화된 설프하이드릴 이량체 또는 유리 설프하이드릴 이량체와의 분리될 수 있는 이량체 형태인 CHO 세포에서 생산되는 rhBMP-2의 비율은 예를 들면 미국 특허 제5,830,761호에 개시된 바와 같이 배지 중의 L-시스틴 및 L-글루탐산의 농도에 의해 영향을 받는다. 따라서, 일부 실시양태에서, 배양 배지는 약 0.2, 0.3, 0.4, 0.5, 0.6, 0.7, 0.8, 0.9, 1.0, 1.05, 1.1, 1.2, 1.3, 1.4, 1.5, 2.0, 2.5, 3.0, 3.5, 4.0 mM 이상 또는 그 이상의 농도의 L-시스틴을 포함한다. 예를 들면, 특정한 실시양태에서, 배지는 약 0.2 내지 4.0mM의 농도의 L-시스틴을 포함한다. 보다 특정한 실시양태에서, 배지는 약 0.5 내지 4.0mM의 농도의 L-시스틴을 포함한다. 보다 더 특정한 실시양태에서, 배지는 약 0.7 내지 3.0mM의 농도의 L-시스틴을 포함한다. 일부 실시양태에서, L-글루탐산은 약 0.023, 0.05, 0.1, 0.2, 0.3, 0.4, 0.5, 1.0, 1.5, 2.0, 2.5, 3.0, 3.5, 4.0 이상 또는 그 이상의 농도로 존재한다. 특정한 실시양태에서, 배양 배지는 약 0.2, 0.3, 0.4, 0.5, 0.6, 0.7, 0.8, 0.9, 1.0, 1.05, 1.1, 1.2, 1.3, 1.4, 1.5, 2.0, 2.5, 3.0, 3.5, 4.0mM 이상 또는 그 이상의 농도의 L-시스틴, 및 약 0.023, 0.05, 0.1, 0.2, 0.3, 0.4, 0.5, 1.0, 1.5, 2.0, 2.5, 3.0mM 이하의 농도의 L-글루탐산을 포함한다. 보다 특정한 실시양태에서, L-시스틴은 약 0.5mM 이상의 농도로 배양 배지에 존재하고, L-글루탐산은 약 0.3mM 이하의 농도로 배양 배지에 존재한다. 보다 더 특정한 실시양태에서, L-시스틴은 약 0.7 내지 3.0mM의 농도로 배양 배지에 존재하고, L-글루탐산은 약 0.2mM 이하의 농도로 배양 배지에 존재한다.

배양 배지는 다가음이온 시약을 추가로 포함할 수 있다. 다가음이온 시약이 성숙한(단백질가수분해 분해된) hBMP-2 단량체 또는 이량체의 N-말단과 같은 분비된 재조합 단백질 상의 헤파린-분자류 결합 도메인에 대해 세포의 세포 표면 상의 잔기와 경쟁한다고 이론을 세울 수도 있지만, 이에 의존하지는 않는다. 분비된 단백질이 세포 표면에 결합되어 있는 경우, 용액중의 단백질의 수율이 감소된다. 세포 표면 상의 이들 요소와 경쟁함으로써, 다가음이온 시약은 배양 배지 중의 유리(세포-결합되지 않은) 단백질의 농도를 증가시킨다. 다가양이온 시약의 예는 헤파린, 헤파린 설페이트, 펜토산 설페이트, 덱스트란, 덱스트란 설페이트, 히알루론산, 콘드로이틴, 콘드로이틴 설페이트, 더마탄 설페이트, 케라탄 설페이트, 헥수론알-헥소스아미노글리칸 설페이트, 이노시톨 헥사설페이트 및 슈크로스 옥타설페이트를 포함한다. 일부 실시양태에서, 다가음이온 시약은 마이크로몰 또는 나노몰 단위의 친화성으로 성숙한 hBMP-2 단량체의 N-말단에 결합할 수 있다. 일부 실시양태에서, 다가음이온 시약은 중합체가 약 1%, 5%, 10%, 12%, 15%, 18%, 20%, 25%, 30%, 50% 이상 또는 그 이상 설폰화되어 있는 설폰화된 천연 중합체, 예를 들면 글리코사미노글리칸(GAG) 또는 이의 유도체이다. 일부 실시양태에서, 다가음이온 시약은 약 1, 5, 10, 20, 50, 75, 100, 200, 400, 600, 800, 1,000 mg/L 이상 또는 그 이상의 농도로 존재한다.

특정한 실시양태에서, 다가음이온 시약은 덱스트란 설페이트이다. 보다 특정한 실시양태에서, 덱스트란 설페이트는 약 5,000 내지 500,000g/몰의 분자량을 갖는다. 보다 더 특정한 실시양태에서, 덱스트란 설페이트는 약 7,000g/몰의 분자량을 갖는다. 일부 실시양태에서, 덱스트란 설페이트는 약 10mg/L 이상의 농도로 존재한다. 보다 특정한 실시양태에서, 덱스트란 설페이트는 약 400mg/L의 농도로 존재한다. rhBMP-2를 생산하기 위한 배양 배지 중에서의 덱스트란 설페이트의 이용은 미국 특허 제5,318,898호 및 제5,516,654호에 추가로 개시되어 있다.

배양 배지는 배지의 일부 변수, 예를 들면 pH, 용존 O₂ 또는 삼투압 몰 농도를 유지하기 위해 조작될 수 있다. 일부 실시양태에서, 배양 배지는 특정한 삼투압 몰 농도 범위로 유지된다. 다른 실시양태에서, 배양 배지는 특정한 출발 삼투압 몰 농도로 조절된다. 특정한 실시양태에서, 배양액의 출발 삼투압 몰 농도는 약 260 내지 380 mOsm이다. 보다 특정한 실시양태에서, 출발 삼투압 몰 농도는 약 280 내지 360mOsm의 범위이다.

일부 실시양태에서, 배양 배지는 약 2.5μM 이상의 농도의 철, 약 10nM 이상의 농도의 구리, 약 20mM 이상의 총 농도의 아미노산, 약 10mg/L 이상의 농도의 덱스트란 설페이트, 및 약 15μM 이상의 농도의 비타민 B6을 포함하고, 여기서 비타민 B6은 약 1.2 미만의 피리독신에 대한 피리독살의 비를 갖는다. 보다 특정한 실시양태에서, 배양 배지는 약 0.2μM 이상의 농도의 아연을 추가로 포함한다. 매우 특정한 실시양태에서, 본 발명에서 사용하기 위한 배양 배지는 표 3 및 표 4에 개시되어 있고, 즉 배지 A1, A2, B1 또는 B2이다. 또다른 특정한 실시양태에서, 배지는 B2이다. 일부 실시양태에서, 배지는 실질적으로 B2와 유사하다. "실질적으로 유사"란 표 4의 배지 B2에 비해 약 0.1, 0.2, 0.5, 1.0, 1.5, 2.0, 2.5, 또는 3.0배 이상 상이한(즉, 증가 또는 감소된) 농도로 존재하는 배지의 구성 성분이 없음을 의미한다.

일부 실시양태에서, 비한정된 구성성분을 이용하는 것이 허용가능할 수 있고, 배지는 약 0.1, 0.5, 1, 5, 10% 이하 또는 그 이상까지의 우태 혈청(FBS)으로 보충될 수 있다. 그러나, 혈청이 포유동물 세포의 배양에 널리 이용된다 하더라도, [Freshney Culture of Animal Cells, John Wiley & Sons, New York, 91-99 (1994)]에 논의된 바와 같이 이의 이용과 관련된 여러 문제점들이 있다. 예를 들면, 혈청은 많은 확인되지 않은 성분을 함유하고 있고, 따라서 화학적으로 한정되지 않는다. 실제로, 혈청의 조성은 롯트마다 다양하여 표준화를 어렵게 한다. 또한, 혈청은 성장 억제 인자를 함유할 수 있어, 결과적으로는 최적보다 낮은 성장을 야기한다. 최종적으로, 혈청은 바이러스 또는 다른 병원균을 함유하여 생산 및 규제 승인 둘 모두를 보다 어렵게 한다. 따라서, 무혈청 배지가 본 발명의 방법에 이용되기에 바람직하다.

단백질

본 발명에 의해 제공된 방법은 다양한 단백질을 생산하는데 이용될 수 있다. 일부 실시양태에서는, 단백질이 성장 인자이다. 특정한 실시양태에서는, 성장 인자가 TGF-β 상과의 일원이다. 보다 특정한 실시양태에서는 TGF-β 상과의 일원이 골 형태발생 단백질(BMP)이다.

BMP는 매우 상동성인 단백질 부류이고, 보다 더 높은 수준의 상동성에 근거한 하위 그룹으로 분리된다. 일부 중요한 하위 그룹은 BMP-2 및 BMP-4; BMP-5, BMP-6 및 BMP-7; 및 BMP-12, BMP-13 및 MP-52를 포함한다. 특히, BMP는 BMP 활성에 필요한 단백질의 카복시 말단 영역에서 시스테인 잔기의 확인 패턴을 공유한다. 일부 실시양태에서, 본 발명의 방법에 의해 제조되는 단백질은 BMP-2, BMP-4, BMP-5, BMP-6, BMP-7, BMP-8, BMP-9, BMP-10, BMP-11, BMP-12, BMP-13, BMP-14, BMP-15, BMP-16, BMP-17, BMP-18, 및 MP-52, 및 이의 조합 및 이종이량체에서 선택된 BMP이다. 전형적으로 BMP는 다이설파이드 연결된 이량체 분자를 의미한다. 일부 실시양태에서, BMP는 단량체일 수 있다. 일부 실시양태에서, BMP란 공지된 BMP의 성숙한(프로도메인이 없는) 영역의 서열에 대해 아미노산 수준에서 약 70%, 80%, 90%, 95%, 96%, 97%, 98%, 99%, 99.9% 이상 또는 그 이상 동일한 서열을 포함하고, 생물학적 활성(예를 들면 골, 연골 또는 인대/힘줄류 조직 형성 활성)을 갖는 것을 포함한다. 일부 실시양태에서, BMP는 공지된 BMP 서열에 대해 1, 2, 3, 4, 5, 6, 7, 8, 9, 10, 15, 20, 25개 또는 그 이상의 아미노산 치환을 포함할 수 있다. BMP는 당 분야에서 공지되어 있고, 인간, 고양이, 닭, 침팬지, 소, 개, 염소, 말, 짧은꼬리원숭이, 마우스, 돼지, 토끼, 래트 및 양과 같은 포유동물을 비롯한 다양한 종에서 확인되었다. 예를 들면 단백질 및 핵산 서열 및 생산 방법을 비롯한 BMP에 대한 개시 내용을 하기의 문헌으로부터 발견할 수 있다: BMP-2, BMP-3, BMP-4, BMP-5, BMP-6, 및 BMP-7(예를 들면 미국 특허 제5,013,649호; 제5,116,738호; 제5,106,748호; 제5,187,076호; 및 제5,141,905호에 개시됨), BMP-8(PCT 공개 공보 제WO 91/18098호에 개시됨), BMP-9(PCT 공개 공보 제WO 93/00432호에 개시됨), BMP-10(PCT 공개 공보 제WO 94/26893호에 개시됨), BMP-11(PCT 공개 공보 제WO 94/26892호에 개시됨), BMP-12 및 BMP-13(PCT 공개 공보 제WO 95/16035호에 개시됨), BMP-15(미국 특허 제5,635,372호에 개시됨), BMP-16(미국 특허 제6,331,612호에 개시됨), MP-52(PCT 공개 공보 제WO 93/16099호에 개시됨), 및 BMP-17 및 BMP-18(미국 특허 제6,027,917호에 개시됨). 이들 단백질에 대한 언급은 변이체, 대립유전자 변이체, 이의 절편, 및 결실 돌연변이, 삽입 돌연변이 및 치환 돌연변이를 포함하지만 이로 한정되지는 않는 돌연변이 BMP를 포함하는 것으로 이해되어야만 한다. 특히 임의의 특정한 BMP에 대한 언급은 1, 3, 5, 7, 9, 10, 11, 12, 13, 15, 18, 20, 22, 25, 30, 35개 이상 또는 그 이상의 잔기가 성숙한 단백질의 N 말단으로부터 제거되는 N-말단 절단된 절편을 포함하는 것으로 이해되어야만 한다.

본 발명의 특정한 실시양태에서, BMP는 BMP-2이다. 일부 실시양태에서, BMP-2는 인간 BMP-2(hBMP-2)이다. 또다른 특정한 실시양태에서, hBMP-2는 성숙한 hBMP-2(즉, NCBI 수탁 번호 NP_001191의 Q283-R396)이고, 골 및/또는 연골 형성 활성을 갖는다. 특정한 실시양태에서, hBMP-2는 성숙한 hBMP-2(즉, NCBI 수탁 번호 NP_001191의 Q283-R396)에 대해 아미노산 수준에서 약 88, 89, 90, 92, 94, 95, 96, 98, 99, 99.9% 이상 동일하다. 따라서, 일부 실시양태에서, 성숙한 hBMP-2는 1, 2, 3, 4, 5, 6, 7, 8, 9, 10, 11, 12, 13, 14, 또는 15개의 아미노산 치환을 함유할 수 있다. 일부 실시양태에서, 생성된 BMP-2는 이량체이다. 일부 실시양태에서, 생성된 BMP-2는 단량체이다. 일부 실시양태에서, BMP-2는 이량체 단백질의 하나 이상의 아단위의 N-말단으로부터의 1, 3, 5, 7, 9, 10, 11, 12, 13개 이상 또는 그 이상의 잔기의 N-말단 절단부를 갖는다. BMP-2 활성 분석법은 당 분야에 공지되어 있고, 예를 들면 미국 특허 제 5,013,649호에 개시되어 있다.

BMP-2는 다수의 종에서 확인되어왔다. 예를 들면 여러 종에서 나온 BMP-2에 대한 국립 생물정보센터(NCBI) 엔트레즈 진아이디(Entrez GenelD)를 열거하고 있는 표 1을 참조할 수 있다. 이들 진아이디는 예를 들면 http://www.ncbi.nlm.nih.gov/sites/entrez?db=gene의 주소(URL)에서 발견될 수 있는 NCBI의 세계적 웹 포탈에서 공개적으로 이용가능한 주석이 달린 mRNA 또는 단백질 서열을 검색하는데 이용될 수 있다. 예시로서 인간 BMP-2에 대한 진아이디를 이용하여 하기의 참고 서열을 검색할 수 있다: NM_001200.2(mRNA) 및 NP_001191.1(단백질). 유사하게, 마우스의 경우, 검색될 수 있는 BMP-2 참고 서열은 NM_007553.2(mRNA) 및 NP_031579.2(단백질)을 포함한다. 본원에서 언급되는 진아이디와 관련된 모든 정보, 예를 들면 유전자 위치, 게놈 서열, 기능 주석, 대립유전자 변이체 및 참고 mRNA 및 단백질 서열을 비롯한 정보는 그 전체가 참고로 혼입되어 있다. mRNA의 엑손 경계 또는 단백질의 구조적 특징, 예를 들면 단백질의 성숙 영역을 한정하는 구조적 특징부를 비롯한 모든 참고 서열 또한 전체가 참고로 혼입되어 있다.

[표 1]

단리 및 용도

당 분야에 공지되어 있는 바와 같이, 골 형태발생 단백질, 예를 들면 BMP-2는 단백질에 근거한 치료제로서 유용하다. 따라서, 본 발명의 방법은 배양액으로부터 회수된 단백질을 정제 또는 단리하는 단계를 추가로 포함할 수 있다. BMP-2는 당 분야에 공지된 다양한 수단에 의해 정제될 수 있다. 특정한 실시양태에서, 정제는 하나 이상의 컬럼 크로마토그래피 정제, 예를 들면 뷰틸 세파로스 수지 정제를 포함한다. 보다 특정한 실시양태에서, 뷰틸 세파로스 컬럼은 세파로스 4B와 같은 CNBr-활성화된 세파로스에 커플링된 뷰틸아민의 수지를 포함한다. 일부 실시양태에서, 정제는 헤파린류 수지, 예를 들면 셀루파인(CELLUFINE)(상표명) 설페이트 수지 상에서의 컬럼 정제 단계를 추가로 포함할 수 있다. 예를 들면, BMP-2를 함유하는 배양된 세포로부터 컨디셔닝된 배지를 헤파린류 수지 함유 컬럼에 적용하고, BMP-2를 함유하는 용출액을 컬럼으로부터 수득한 후, 뷰틸 세파로스 컬럼과 같은 제 2 컬럼에 적용한다. 예를 들면, 본원에 참고로 혼입되어 있는 국제 특허 공개 공보 제WO99/31120호, 특히 제3 내지 7면에 개시되어 있는 바와 같이, 추가의 정제가 가능하다.

일단 정제되면, 본 발명의 방법의 생성물은 예를 들면 약제로서 추가로 배합될 수 있다. BMP를 위한 약학 담체에 대한 일반적인 리뷰는 예를 들면 [Seeherman and Wozney Cytokine Growth Factor Rev . 16(3):329-45 (2005)] 또는 미국 특허 제5,385,887호를 참고할 수 있다. 본 발명의 방법의 생성물은 예를 들면 골 성장, 생성, 치료 또는 보수를 촉진시킴으로써 골 조직의 결함, 손상, 질병 또는 질환을 치료하거나, 또는 이들을 치료하기 위한 약제의 제조에 이용될 수 있다.

세포

본 발명의 방법에 의해 재조합 단백질을 생산하는데 광범위한 세포를 이용할 수 있다. 관심 단백질, 예를 들면 BMP를 발현하도록 재조합 DNA로 형질전환될 수 있는 임의의 세포를 본 발명의 방법에 이용할 수 있다. 세포는 선충류, 벌레, 곤충, 양서류 또는 포유동물, 예를 들면 인간, 영장류, 양, 소, 돼지, 말, 개과 또는 설치류 공급원을 비롯한 다양한 종으로부터 유래할 수 있다. 특정한 실시양태에서, 세포는 인간 또는 설치류에서 유래한다. 보다 특정한 실시양태에서, 세포는 햄스터에서 유래한다.

본 발명의 방법에서 이용하기에 적합한 세포주는 당 분야에 잘 공지되어 있고, 널리 이용가능하다. 다수의 적합한 세포주를 버지니아주 매나사스 소재의 아메리칸 타입 컬쳐 콜렉션(ATCC)과 같은 기탁소로부터 수득할 수 있다. 적합한 세포주는 COS 세포, CHO 세포, BHK 세포, Balb/c 3T3 세포, FRhL-2 세포, SP2/0 세포, NSO 세포, TM4 세포, CV1 세포, MDCK 세포, BRL 세포, Vero-76 세포, HeLa 세포, MDCK 세포, HepG2 세포 또는 293 세포를 포함한다. 특정한 실시양태에서, 세포는 COS 세포, CHO 세포, BHK 세포, Balb/c 3T3 세포 또는 293 세포이다. 보다 특정한 실시양태에서, 세포는 CHO 세포이다. CHO 세포는 세포 역가 및/또는 단백질 수율을 증가시키도록 개질될 수 있다. 일부 실시양태에서, CHO 세포는 다이하이드로폴레이트 환원효소 유전자(DHFR; 마우스 진아이디 13361)의 발현이 감소되거나 발현되지 않을 수 있다. 예를 들면 CHO 세포는 DHFR의 저하된(기능 감소된), 0의(null)(기능 없음) 또는 음성 우세(0이고, 효소의 기능 형태를 억제한다) 대립 유전자에 대해 이형이거나 동형일 수 있고, 관심관심 기능성 DHRF 유전자를 함유하는 구조물에 동시감염(cotransfection)될 수 있다.

생물 반응기 및 조건

본 발명의 방법에 유용한 세포는 예를 들면 [Warnock and Al-Rubei Biotech . Appl. Biochem . 45:1-12 (2006)]에서 논의된 바와 같이 당분야에 공지된 임의의 수단에 의해 배양될 수 있다. 전형적으로, 세포는 생물 반응기에서 성장된다. 생물 반응기는 임의의 크기일 수 있다. 일부 실시양태에서, 생물 반응기는 약 1 L; 3 L; 20 L; 40 L; 80 L; 100 L; 160 L; 1,900 L; 2,500 L; 12,000 L; 20,000 L; 40,000 L 이상, 또는 그 이상이다. 생물 반응기는 현탁액(즉, 고정 독립적 성장) 중의 세포 또는 기판 상에 고정된 세포의 성장을 유지시킬 수 있다. 고정 독립적 성장은 예를 들면 큰 표면적 대 부피 비를 제공하기 위해 마이크로캐리어의 이용을 포함할 수 있다.

본 발명의 특정한 실시양태에서, 세포는 현탁액 중에서, 즉, 고정 표면없이 성장된다. 고정 독립적 성장의 양상은 당 분야에 잘 공지되어 있고, 예를 들면 교반 탱크 생물 반응기 및 공수(airlift) 생물 반응기에서의 성장을 포함한다. 특정한 실시양태에서, 생물 반응기는 교반되는 탱크 생물 반응기이다. 세포는 특정한 생물 반응기에서 성장하고, 또한 배치 재공급(추가로 하기 개시된 바와 같음, 또한 [Drapeau et al., Cytotechnology 15(1-3):103-9 (1994)] 참고), 공급 배치(예를 들면 미국 특허 제5,672,502호; 제6,924,124호; 또는 제7,332,303호 참조), 관류(신선한 배지가 첨가될 때 폐기물이 생물 반응기로부터 회수되도록 세포 보유 디바이스를 이용함, 예를 들면 미국 특허 제4,814,278호 또는 제6,607,910호 참조) 배양 방법을 포함한 당 분야에 공지된 다양한 방법에 의해 배양될 수 있다. 일부 특정한 실시양태에서, 세포는 배치 재공급 방식으로 배양된다. 보다 특정한 실시양태에서, 세포는 본질적으로 일정한 온도에서 배양된다. 일부 실시양태에서, 적합한 배양 온도는 약 31, 32, 33, 34, 35, 36, 37, 38, 39, 40, 41 또는 42℃에서 선택될 수 있다. 일부 실시양태에서, 본질적으로 일정한 온도는 좁은 온도 범위, 예를 들면 35 내지 39℃ 또는 36 내지 38℃일 수 있다. 보다 특정한 실시양태에서, 세포는 약 37℃의 일정한 온도에서 배양된다.

생물 반응기는 산소화(용존 O₂), pH, 삼투압 몰 농도, 온도, 빛 및 특정한 영양분(예를 들면 글루코스 또는 아미노산)의 농도를 비롯한 배양 배지의 다양한 생리학적 변수를 유지시킬 수 있다. 일부 실시양태에서, 생물 반응기는 온도, pH 및 용존 O₂ 함량을 모니터링하고 유지시킨다. 일부 실시양태에서, 글루코스는 배치식으로 공급된다. 예를 들면 세포는 배치 재공급에 의해 생물 반응기에서 성장된다. 특정한 실시양태에서, 총 배양액의 일부(즉, 세포 및 배지)는 주기적으로 회수되고(예를 들면 수확되고), 새로운 배지로 대체된다. 일부 실시양태에서, 총 배양액의 약 10, 25, 50, 75, 80, 85, 90, 95, 99% 이상, 또는 그 이상이 주기적으로 회수되어 신선한 배지로 대체된다. 보다 특정한 실시양태에서, 총 배양액의 약 75% 이상이 회수되어 대체된다. 특정한 실시양태에서, 세포 배양 배지의 일부는 6, 12, 18, 24, 30, 36, 42 또는 48 시간마다, 또는 1, 2, 3, 4, 5, 6, 7, 8, 9, 10일마다 또는 그 이상마다 회수된다. 보다 특정한 실시양태에서, 배양 배지의 일부는 3일마다 회수되고 대체된다. 다른 실시양태에서, 총 배양액의 일부는 1, 2, 3, 4, 5, 6, 7, 8, 9, 10일마다 또는 그 이상마다 회수되어 대체된다. "세포 분할 주기"란 기하급수적 성장동안, 즉 예를 들면 접촉 억제가 없는 풍부한 배양 배지에서, 배양된 세포가 2배가 되는 평균 시간을 의미한다.

일부 실시양태에서, 세포 역가 및/또는 단백질 수율은 세포에 의한 락테이트 생산을 제한 또는 제어함으로써 개선될 수 있다. 예를 들면 2005년 3월 31일자로 공개된 미국 특허 출원 공개 공보 제2005/0070013호(또한 미국 특허 제7,429,491호 참조)에 개시된 바와 같이, 제한된 방식으로 배양되는 세포로의 글루코스 공급을 제한함으로써 락테이트 생산이 제어될 수 있다.

본원에서 언급된 모든 특허, 특허 출원, 진아이디, 참고 서열 또는 다른 참고문헌의 경우, 언급된 목적뿐 아니라 모든 목적에 대해 그 전체가 본원에 참고로 인용되어 있는 것으로 이해되어야만 한다. 참고로 혼입된 문헌과 본원 사이에 임의의 상충되는 내용이 존재하는 경우, 본원이 우위를 차지할 것이다.

실시예

실시예 1: rhBMP -2 생산 동안의 규모 확대 문제

BMP-2 생산 과정의 개발동안, 1,900L 생물 반응기에서의 rhBMP-2와 다이하이드로폴레이트 환원효소(DHFR)을 동시발현하는 CHO 세포(본원에서는 EMC-G5 세포로 공지되어 있음)의 고밀도 배양과 관련된 규모 확대 문제가 관찰되었다. 고밀도 배양은 3일 배치의 경우 0.60x10⁶세포/ml, 4일 배치의 경우 0.30x10⁶ 세포/ml에서 접종되었다. 배치-재공급 공정의 첫번째 계대배양동안, 최종 세포 밀도는 흔히 3.0x10⁶ 세포/ml에 도달하지만, 후속적인 계대배양의 최종 세포 밀도는 점진적으로 감소된다. 예를 들면 3회의 계대 배양은 각각 3.0x10⁶, 1.6x10⁶ 및 1.0x10⁶세포/ml의 수확 세포 밀도를 생성할 것이다. 이런 감소되는 성장 속도는 배양 배지에서 BMP-2 단백질의 양을 더욱 감소시키고, 총 생산성이 바람직한 것보다 더 낮아지게 한다. 감소된 성장 속도는 3L 규모에서는 재현되지 않았다. 160L 생물반응기가 이 문제점을 조사하기 위한 모델로서 이용되었다. 도 1에 도시된 바와 같이, 160L 생물 반응기에서 수확 세포 밀도가 감소되었다.

추가의 실험은 동일한 어려움을 나타내었다. 한번의 시도에서, 첫번째 고밀도 계대배양이 2.99x10⁶의 최종 세포 밀도에 도달한 반면, 두번째 계대배양은 단지 2.28x10⁶세포/ml에 도달하였다. 계대배양전의 제어 조건 하에서 반응기에 다시 접종한 후, 첫번째 및 두번째 고밀도 계대배양은 각각 2.65x10⁶세포/ml 및 1.49x10⁶세포/ml의 최종 세포 밀도에 도달하였다. 양 제어 실험은 둘 모두 첫번째 고함량 시드 계대배양이 높은 최종 밀도에 도달하였지만, 후속적인 계대 배양의 성장 속도가 상당히 감소된다는 규모 확대 문제점을 나타내었다. BMP-2 역가 및 비생산성 자료는 유사한 경향을 나타내었다.

성장 배지에 흔적 요소 D("흔적 D")를 첨가하면 배양 배지에서 규모 확대 문제점이 없어졌다. 흔적 D는 3μM의 철, 3μM의 아연 및 0.03μM의 구리로 구성된다. 흔적 D를 이용하면, 고함량 시드 배치(3일 및 4일)가 일관성있게 3.0x10⁶세포/ml 또는 그 이상의 수확 밀도에 도달하였다. 성장 속도 및 비생산성 또한 높게 유지되었다. 이는 흔적 D가 세포 성장 특징에 긍정적인 영향을 미친다는 것을 나타낸다. 철 및 구리가 보충되거나 보충되지 않은 배지에서 세포를 성장시킨 실험의 결과를 도 2에 나타낸다.

흔적 D의 어느 성분이 가장 중요한지를 밝혀내기 위해, 구리만으로 보충된 배지를 시험하였다(도시하지 않음). 첫번째 고함량 시딩 배치 후에는 3.0x10⁶세포/ml 이상에 도달하였으나, 후속적인 두번의 배치는 대조군 배치(흔적 D 없음)의 거동과 유사하게 감소된 성장 속도를 나타내었다. 3가지 고함량 시딩 계대배양의 감소된 성장 속도는 구리 만으로는 규모 확대 문제점을 개선시키는데 효과적이지 않다는 것을 보여준다.

실시예 2: 덱스트란 설페이트는 크로마토그래피 비정상성을 제거한다

이들 흔적 금속에 대한 평가동안, 이전의 고밀도 배양액에서 생성된 rhBMP-2에서 나온 크기 배제 크로마토그래피(CEX)의 두번째 피크 상에 비정상적인 어깨부가 관찰되었다. 배지 중의 낮은 수준의 덱스트란 설페이트(200mg/L 대신 10mg/L)가 포스페이트를 이용한 배양 후의 어깨부 피크의 비율(각각 약 4% 대 약 12%)을 훨씬 더 높인 것으로 발견되었다. 덱스트란 설페이트 투여량 반응 실험은 세포 배양 배지 중에서 더 높은 수준의 덱스트란 설페이트가 투여량 의존적 방식으로 관찰된 어깨부 피크의 양을 감소시킴을 나타내었다. 이전에 덱스트란 설페이트가 BMP-2 생산동안 단백질 수율을 증가시키는 것으로 나타났다. 예를 들면 미국 특허 제5,318,898호 및 제5,516,654호를 참고할 수 있다.

실시예 3.1: 금속 보충된 배지에서 세포 역가의 감소

철 및 구리 농도가 배양 배지에서 풍부하면, 심지어 실험실 규모 생물 반응기에서조차 세포 성장이 안정적이지 않은 것으로 종종 관찰되었다. 도 3을 참고할 수 있다. 추가의 금속이 다른 배지 성분과 상호작용하여 불안정한 배양 성장을 야기할 수 있다고 가정되었다.

조직 배양 플라스크 중에서의 예비 실험(도 4)에서, 세포를 0.08x10⁶세포/ml의 밀도에서 시딩하고 나흘동안 성장시켰다. 구리 또는 아연 하나만이 보충된 배지 A1(140)은 보충되지 않은 배지에 필적하는 성장 속도를 유지하였지만, 흔적 D-보충물(추가의 철, 구리 및 아연)은 더 낮은 성장 속도를 야기하였다. 세포는 또한 배지 A1이 철 만으로 보충되었을 때 성장 속도의 투여량 의존성 감소를 나타내었다. 배지 B1(248)에서 성장된 세포는 철로 보충된 배지 A1에서 성장된 세포와 유사한 감소된 성장 속도를 나타내었다.

실시예 3.2: 피리독살-철 상호작용은 성장 속도를 감소시킨다

추가의 연구에서, 성장 속도 결점을 야기하는 배지 A1을 성장 배지 결점을 야기하지 않은 배지 A2와 비교하였다. 배지 A1이 주로 피리독살을 함유하는 반면, 배지 A2가 피리독신만을 함유한다는 점에 유의해야한다. BMP-2 EMC G5 세포는 서로 다른 철 농도를 갖고 피리독살이 있고 없는 배지 A1 및 배지 A2에서 성장되었다. 배지 A1 및 A2의 철 및 비타민 B6 함량이 표 2에 요약되어 있다.

[표 2]

37℃에서 유지되고 7% CO₂를 갖는 배양기 중의 조직 배양 접시에서 3일동안 세포를 배양하였다. 세포를 0.15x10⁶ 세포/mL로 시딩하고 3일째 끝에서 수확하였다. 3일째에 세포를 CASY 계수기로 계수하여 최종 세포 밀도(10⁶ 세포/ml 단위)로 수득하였다. 그런 다음 하기 식으로 성장 속도를 계산하였다:

성장 속도(u) = ln(최종 세포 밀도/초기 세포 밀도)/배양 시간(시간)

결과를 도 5에 나타낸다.

피리독신이 아닌 피리독살이 철과 상호작용하는 성분이고 일치하지 않는 배양 성능을 야기하는 것으로 발견되었다. 피리독신은 피리독살의 전구체이다. 이들은 배양 배지에서 비타민 B6으로서 상호교환가능하고, 아민교환반응, 탈카복실화 및 탈아민화를 위한 보조인자로서 작용한다. 대부분의 세포 배양 과정의 경우, 배지가 피리독신, 피리독살 또는 둘 모두를 함유하는지에 따라 아무런 차이도 없다. 그러나, 일부 농도의 피리독살은 증가된 양의 철과 상호작용하여 rhBMP-2 생산 과정에 부정적인 영향을 미친다. 도 5에 도시된 바와 같이, 배지 A1은 배지 A2에 비해 성장 속도 결함을 야기하고, 이는 추가의 철에 의해 가속될 수 있다. 피리독살이 보충되면, 배지 A2는 철 투여량 의존적 방식으로 성장 속도 결함을 야기한다. 따라서, 배양 배지에서 더 높은 철 농도와 더 높은 농도 또는 비율의 피리독살의 조합으로 인해 불안정하고 최적양 이하의 배양 성장이 야기된다.

실시예 4: 세포 밀도와 단백질 역가의 강한 증가

배지로부터 피리독살을 제거한 추가의 배지 개질 후(배지 B2가 생성됨), 세포 성장 및 BMP-2 생산성은 일정하였고, 종래의 공정에 비해 상업적 규모 생물 반응기에서뿐 아니라 소규모 생물 반응기에서 생산성이 2배 증가된 것으로 나타났다. 도 6 및 도 7을 참고할 수 있다. 따라서 본원에 개시된 배양 배지에 대한 개질은 재조합 단백질 생산을 상업적인 규모로 확대하는 동안 발생하는 성장 결함을 제거하고, 결과적으로 고 품질의 재조합 단백질의 수율을 상당히 증가시킨다.

제조시 재조합 인간 골 형태발생 단백질-2(rhBMP-2)를 생산하는데 사용되는 세포주는 본원에서 EMC-G5로서 언급되는 BMP-2와 DHRF을 공동발현하는 차이니즈 햄스터 난소(CHO) 세포주였다. 세포를 0.6x10⁶ 세포/ml의 표적 세포 밀도에서 접종시킨 2,500리터 작업 체적 생물 반응기에서 배양시켰다. 세포를 배지 B2(표 4 참고)에서 배양하였다. 배양액의 온도를 37℃로 유지시켰다. 배양액의 pH를 첫번째 계대배양의 여러 시간에 걸쳐 7.10의 설정점까지 감소되게 두었고, 적정제를 첨가함으로써 7.10으로 유지시켰다. 배지 B2의 초기 pH는 약 7.30이었다. 배양액을 2회의 3일 계대배양 및 2회의 4일 계대배양에 대해 각각의 접종 세포 밀도에서 연속 계대배양하였다. 혈액-기체 분석기(BGA)로부터의 측정에 따라 pH 프로브를 온-라인 보정하였다. 현미경을 이용한 수동 계수 및 생활성을 측정하기 위한 트립판 블루 배제를 이용하여 세포 밀도 및 생활성을 측정하였다. 각각의 계대배양후 모든 배양액에서 나온 컨디셔닝된 배지를 원심분리에 의해 수확한 후 여과하였다.

표 3 및 4는 이들 연구에서 이용된 배지의 제형을 나타낸다.

[표 3]

[표 4a]

[표 4b]

본 발명의 다른 실시양태는 상세한 설명을 고려하고 본원에 개시된 발명의 실시로부터 당 분야의 숙련자들에게 명확할 것이다. 상세한 설명 및 실시예는 단지 예로서 간주되어야만 하고, 본원의 진정한 범위 및 진의는 하기의 특허청구범위의 의해 지시되고자 한다.

Claims

i) 약 2.25μM 이상의 농도의 철, 다가음이온 화합물, 및, 존재하는 경우, 배양 배지중의 비타민 B6의 몰 농도의 약 55% 미만을 구성하는 피리독살을 포함하는 배양 배지에서 BMP-2를 암호화하는 DNA 분자를 포함하는 적합한 숙주 세포를 배양하는 단계 및
ii) 관심 단백질을 회수하는 단계
를 포함하며, 여기서 숙주 세포가 약 3L보다 큰 용량을 갖는 생물 반응기에서 배양되는
BMP-2의 생산 방법.
제 1 항에 있어서,
철의 농도가 약 5μM 이상인 방법.
제 1 항에 있어서,
배양 배지가 약 2x10⁶ 세포/ml 이상의 수확 밀도를 유지할 수 있는 방법.
제 1 항에 있어서,
배양 배지가 피리독신, 피리독사민, 피리독신 5'-포스페이트 및 피리독사민 5'-포스페이트로 구성된 군에서 선택되는 하나 이상의 비타민 B6를 추가로 포함하는 방법.
제 4 항에 있어서,
배양 배지가 약 15μM 이상의 총 비타민 B6 농도를 갖는 방법.
제 4 항에 있어서,
배양 배지가 1.2 미만의 피리독신에 대한 피리독살의 비를 갖는 방법.
제 6 항에 있어서,
피리독신에 대한 피리독살의 비가 0.4 미만인 방법.
제 1 항에 있어서,
배양 배지가 약 10nM 이상의 농도의 구리를 추가로 포함하는 방법.
제 1 항에 있어서,
배양 배지가 약 0.2μM 이상의 농도의 아연을 추가로 포함하는 방법.
제 1 항에 있어서,
다가음이온 화합물이 덱스트란 설페이트인 방법.
제 10 항에 있어서,
덱스트란 설페이트가 약 10mg/L 이상의 농도로 존재하는 방법.
제 10 항에 있어서,
덱스트란 설페이트가 약 100mg/L 이상의 농도로 존재하는 방법.
제 11 항에 있어서,
덱스트란 설페이트가 약 5,000 내지 500,000g/몰의 분자량을 갖는 방법.
제 13 항에 있어서,
덱스트란 설페이트가 약 7,000g/몰의 분자량을 갖는 방법.
제 1 항에 있어서,
배양 배지가 약 20mM 이상의 총 농도의 아미노산을 추가로 포함하는 방법.
제 15 항에 있어서,
배양 배지가 약 0.5mM 이상의 농도의 L-시스틴을 추가로 포함하는 방법.
제 16 항에 있어서,
배양 배지가 약 0.3mM 이하의 농도의 L-글루탐산을 포함하는 방법.
제 1 항에 있어서,
배양 배지가 약 260 내지 360 mOsm의 초기 삼투압 몰 농도를 갖는 방법.
제 1 항에 있어서,
BMP-2가 포유동물 BMP-2인 방법.
제 19 항에 있어서,
포유동물 BMP-2가 인간 BMP-2(hBMP-2)인 방법.
제 20 항에 있어서,
인간 BMP-2가 재조합 BMP-2(rhBMP-2)인 방법.
제 1 항에 있어서,
적합한 숙주 세포가 COS 세포, CHO 세포, BHK 세포, Balb/c 3T3 세포 및 293 세포로 구성된 군에서 선택되는 방법.
제 22 항에 있어서,
적합한 숙주 세포가 CHO 세포인 방법.
제 23 항에 있어서,
CHO 세포가 감소된 DHFR 유전자 발현을 갖는 방법.
제 1 항에 있어서,
적합한 숙주 세포가 약 160L 이상의 용량을 갖는 생물 반응기에서 배양되는 방법.
제 25 항에 있어서,
생물 반응기가 약 500L 이상의 용량을 갖는 방법.
제 26 항에 있어서,
생물 반응기가 약 2,500L 이상의 용량을 갖는 방법.
제 27 항에 있어서,
생물 반응기가 약 12,000L 이상의 용량을 갖는 방법.
제 27 항에 있어서,
숙주 세포가 배치 재공급, 공급 배치 또는 관류에 의해 배양되는 방법.
제 29 항에 있어서,
숙주 세포가 배치 재공급에 의해 배양되는 방법.
제 30 항에 있어서,
숙주 세포가 본질적으로 일정한 온도에서 배양되는 방법.
제 31 항에 있어서,
온도가 약 36 내지 38℃인 방법.
제 1 항에 있어서,
뷰틸 세파로스 수지 상에서 BMP-2를 정제하는 단계를 추가로 포함하는 방법.
제 33 항에 있어서,
정제가 BMP-2를 함유하는 컨디셔닝된 배양 배지를 헤파린류 수지에 적용하는 단계, BMP-2를 함유하는 용출액을 수득하는 단계, 및 용출액을 뷰틸 세파로스 수지에 적용하는 단계를 추가로 포함하는 방법.
i) 약 2.5μM 이상의 농도의 철, 다가음이온 화합물, 약 15μM 이상의 농도의 비타민 B6, 및, 존재하는 경우, 배양 배지중의 비타민 B6의 몰 농도의 약 55% 미만을 구성하는 피리독살을 포함하는 배양 배지에서 BMP-2 단백질을 암호화하는 DNA 분자를 포함하는 적합한 숙주 세포를 배양하는 단계; 및
ii) BMP-2 단백질을 회수하는 단계
를 포함하며, 여기서 숙주 세포가 약 3L보다 큰 용량을 갖는 생물 반응기에서 배양되는 BMP-2 생산 방법.
제 35 항에 있어서,
배양 배지가 약 10nM 이상의 농도의 구리를 추가로 포함하는 방법.
제 35 항에 있어서,
배양 배지가 약 0.2μM 이상의 농도의 아연을 추가로 포함하는 방법.
제 35 항에 있어서,
숙주 세포가 CHO 세포인 방법.
제 35 항에 있어서,
BMP-2가 rhBMP-2인 방법.
제 35 항에 있어서,
다가음이온 화합물이 약 10mg/L 이상의 농도의 덱스트란 설페이트인 방법.
제 35 항에 있어서,
배양 배지가 약 20mM 이상의 총 농도의 아미노산을 포함하는 방법.
제 41 항에 있어서,
배양 배지가 약 0.5mM 이상의 농도의 L-시스틴을 포함하는 방법.
제 42 항에 있어서,
배양 배지가 약 0.3mM 이하의 농도의 L-글루탐산을 추가로 포함하는 방법.
제 35 항에 있어서,
배양 배지가 약 260 내지 360mOsm의 초기 삼투압 몰 농도를 갖는 방법.
i) 약 2.5μM 이상의 농도의 철, 약 10nM 이상의 농도의 구리, 약 20mM 이상의 총 농도의 아미노산, 약 0.5mM 이상의 농도의 L-시스틴, 약 10mg/L 이상의 농도의 덱스트란 설페이트, 및 약 15μM 이상의 농도의 비타민 B6, 및, 존재하는 경우, 배양 배지중의 비타민 B6의 몰 농도의 약 55% 미만을 구성하는 피리독살을 포함하는 배양 배지에서 BMP-2 단백질을 암호화하는 DNA 분자를 포함하는 CHO 세포를 배치 재공급 공정으로 배양하는 단계; 및
ii) BMP-2 단백질을 회수하는 단계
를 포함하며, 여기서 숙주 세포가 약 160L 이상의 용량을 갖는 생물 반응기에서 배양되는 BMP-2 생산 방법.
제 45 항에 있어서,
배양 배지가 약 0.2μM 이상의 농도의 아연을 추가로 포함하는 방법.
i) 약 2.25μM 이상의 농도의 철, 다가음이온 화합물, 및, 존재하는 경우, 약 15μM 미만의 농도의 피리독살을 포함하는 배양 배지에서 BMP-2를 암호화하는 DNA 분자를 포함하는 적합한 숙주 세포를 배양하는 단계; 및
ii) 관심 단백질을 회수하는 단계
를 포함하며, 숙주 세포가 약 3L보다 큰 용량을 갖는 생물 반응기에서 배양되는, BMP-2 생산 방법.
제 1 항 내지 제 31 항 및 제 35 항 내지 제 47 항중 어느 한 항에 있어서,
BMP-2를 정제하는 단계를 추가로 포함하는 방법.
제 48 항에 있어서,
정제된 BMP-2를 약제로서 배합하는 단계를 추가로 포함하는 방법.
제 1 항 내지 제 49 항중 어느 한 항의 방법에 의해 생산되는 제품.
제 50 항의 제품을 포함하는 약학 제제.
골 조직의 결함, 손상, 질병 또는 질환을 갖는 환자를 치료하기 위한 약제의 제조에서의 제 50 항의 제품의 용도.