PT2139987E - Métodos para a produção de proteína usando compostos antisenescência - Google Patents

Description

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DESCRIÇÃO "MÉTODOS PARA A PRODUÇÃO DE PROTEÍNA USANDO COMPOSTOS ANTI- SENESCÊNCIA"

REFERÊNCIA CRUZADA DE PEDIDOS RELACIONADOS

Este pedido é copendente com, compartilha pelo menos, um inventor comum com, e reivindica a prioridade para o pedido de patente provisória dos Estados Unidos número 60/913.382, depositada em 23 de abril de 2007.

ANTECEDENTES DA INVENÇÃO

Esta divulgação refere-se, geralmente, à produção de proteínas em culturas de células de mamíferos.

Particularmente, esta divulgação refere-se a cultivar células de mamíferos na presença de um composto anti-senescência, por exemplo, carnosina, para manter a viabilidade e a aumentar a produtividade com qualidade superior. A cultura de células tem produzido muitos produtos à base de proteínas. Estes produtos, tais como anticorpos monoclonais produzidos em hibridomas, podem ser usados para fins terapêuticos, de investigação ou outras aplicações. Células de origem animal, nomeadamente células de mamíferos, são, muitas vezes, usadas para produzir proteínas. Infelizmente, a utilização de células de origem animal faz com que o processo de produção seja demorado e caro. A adição de um agente químico a um meio de cultura de células pode aumentar a produtividade celular induzindo as células a produzir um produto, aumentando assim a produtividade global. O melhor agente para utilização varia dependendo de um número de factores, incluindo o produto de proteína desejado e o tipo de célula. Factores semelhantes também afectam a quantidade do agente escolhido adicionado e quando o agente é adicionado ao meio de cultura de células. Exemplos de agentes são ácidos alcanóicos ou seus 2 sais, derivados de ureia, ou dimetilsulfóxido (DMSO). Os agentes químicos, tais como butirato de sódio, podem ter efeitos diversos na produção de proteínas. A adição de um agente pode aumentar a produtividade das células, mas também têm efeitos citotóxicos e pode inibir o crescimento e a viabilidade celular.

Na medida em que as células produzem uma proteína, geralmente, a proteína é segregada para o meio de cultura de células. A proteína específica, no entanto, não é a única matéria no meio, agregados de peso molecular elevado, espécies ácidas, e outros materiais também estão muitas vezes no meio, o que pode tornar o processo de purificação mais trabalhoso e dispendioso. Técnicas e métodos estão disponíveis para melhorar a qualidade do produto, o que permite purificação de proteínas mais eficiente, incluindo, entre outros, alterar as condições de biorreator ou usar uma linha de células diferente. No entanto, permanece a necessidade no campo de produção de proteínas, de técnicas e métodos que levem a processos de purificação melhorados.

É necessário, portanto, um agente químico que seja adicionado ao meio de cultura de células que possa melhorar a expressão de uma proteína de interesse, mantendo uma viabilidade celular elevada. 0 que é também necessário é um agente que aumente a qualidade do produto da proteína diminuindo a quantidade de agregados de peso molecular elevado e espécies ácidas em meio de cultura de células. SUMÁRIO DA INVENÇÃO

Em certas formas de realização, a presente invenção refere-se a um processo para a produção melhorada de um produto de proteína. Por exemplo, em certas formas de realização, a presente invenção fornece métodos de cultivar células hospedeiras que expressam uma proteína de interesse num meio que compreende um composto anti-senescência tal que a produção da proteína de interesse é melhorada. Em certas formas de realização, tal composto anti-senescência 3 compreende carnosina.

Em certas formas de realização, a presente invenção fornece composições que aumentam a produção de uma proteína de interesse. Qualquer de uma variedade de proteínas podem ser produzidas de acordo com os métodos e composições da presente invenção. Por exemplo, em certas formas de realização, os métodos e composições da presente invenção são usados para produzir um anticorpo. Em certas formas de realização, os métodos e composições da presente invenção são usados para produzir um receptor, opcionalmente, ligado a uma ou mais frações de proteínas adicionais, por exemplo, os métodos e composições da presente invenção podem ser usados para produzir uma proteína de fusão TNFR.

Em certas formas de realização, a presente invenção fornece um meio de cultura de células que compreende um composto anti-senescência que aumenta a produção de uma proteína de interesse expressa numa célula hospedeira em que o composto anti-senescência é seleccionado a partir do grupo que consiste em carnosina, acetilcarnosina, homocarnosina, anserina e betaalanina. Em certas formas de realização, tal composto anti-senescência compreende carnosina. Em certas formas de realização, células hospedeiras manipuladas geneticamente são combinadas com um meio de inoculo para formar um meio de cultura de células, que é cultivado num bioreator. Durante o ciclo de produção do produto de proteína desejado, as condições do biorreator podem ser alteradas e/ou suplementos podem ser adicionados com a finalidade de aumentar a produtividade e/ou manter a viabilidade. Os suplementos podem incluir um meio de alimentação e/ou um ou mais aditivos, tais como na presente invenção, carnosina e/ou outros compostos anti-senescência seleccionados a partir de acetilcarnosina, homocarnosina, anserina e betaalanina. Células hospedeiras de mamífero, por exemplo, células de ovário de hamster chinês (CHO), podem experimentar uma 4 redução da viabilidade próximo ao final de um ciclo de produção de um biorreator. Foi descoberto que a adição de um agente anti-senescência, tal como carnosina e análogos da mesma, a um meio de cultura de células ajuda a manter um maior número de células viáveis e a viabilidade celular até a proteína ser colhida.

Além disso, os métodos para aumentar a produtividade, tais como a alteração da temperatura após a fase de crescimento e/ou durante a fase de produção do ciclo de produção podem ser utilizados de acordo com a presente invenção. Só para dar um exemplo, durante a produção de um produto de proteína, especificamente o anticorpo para o factor de diferenciação do crescimento-8 (GDF-8) , a temperatura foi diminuída para ajudar a iniciar e aumentar a produtividade.

Em certas formas de realização, a adição de um composto anti-senescência, tal como carnosina ajuda a aumentar a produtividade da cultura de células. Em certas formas de realização, um composto anti-senescência seleccionado a partir do grupo que consiste em carnosina, acetilcarnosina, homocarnosina, anserina e betaalanina pode ser adicionado antes, durante e/ou após uma mudança de temperatura.

Também foi descoberto que a adição de um composto anti-senescência, tal como a carnosina a um meio de cultura de células aumenta a qualidade geral do produto de proteína. Durante a produção da proteína, agregados de alto peso molecular, juntamente com outras espécies indesejáveis, estão no meio de cultura de células. A adição de carnosina diminui a quantidade de agregados de alto peso molecular e aumenta a qualidade do produto. A concentração de compostos anti-senescência (p. ex., carnosina) adicionados ao meio de cultura de células pode variar dependendo de muitos factores do processo, incluindo, por exemplo, o tipo de célula, o produto 5 desejado, e as condições do biorreator, entre outros. Além disso, a carnosina pode ser substituída por seus análogos; acetil-carnosina, homocarnosina, anserina e beta-alanina. Em certas formas de realização, a carnosina é fornecida em combinação com um ou mais outros compostos anti-senescência. Em certas formas de realização, a concentração de agente anti-senescência (p. ex., carnosina) num meio de cultura de células é de cerca de 5 mM a cerca de 100 mM. Em certas formas de realização, a concentração é de cerca de 10 mM a cerca de 40 mM. Em certas formas de realização, a concentração é de cerca de 20 mM.

Quaisquer procedimentos de cultura adequados e meio de inoculo podem ser utilizados para a cultura das células no processo de produção de proteínas. Tanto meio com soro como meio sem soro podem ser usados. Além disso, podem ser utilizados métodos de cultura para a cultura das células como adequado para o tipo de célula específico e produto de proteína. Tais procedimentos são conhecidos e compreendidos por aqueles peritos ordinárias na especialidade de cultura celular.

Outras características e vantagens da divulgação será aparente a partir da seguite descrição, e das reivindicações.

BREVE DESCRIÇÃO DOS DESENHOS

Figura la. Efeito da Carnosina sobre picos de acidez de MYO-29.

Figura 1 b. Efeito de Carnosina sobre agregados de alto peso molecular.

Figura lc. Efeito de adições de carnosina em dias diferentes sobre picos de acidez.

Figura ld. Efeito de adições de carnosina em dias diferentes sobre agregados de alto peso molecular.

Figura 2a. Efeito de Carnosina sobre a densidade de células viáveis diariamente.

Figura 2b. Efeito de Carnosina sobre a viabilidade de 6 células diariamente.

Figura 2c. Efeito de Carnosina sobre a titulação diariamente.

Figura 2d. Efeito de Carnosina sobre produtividade celular especifica cumulativa. As barras nos dias 12 e 14 representam, da esquerda para a direita: Controlo A alimentação D10, 20 mM de Carnosina Alimentação D10 ,

Controlo B Alimentação D10, 20 mM de Carnosina (sem

Alimentação D10), e controlo C (sem Alimentação D10).

Figura 2e. Efeito de Carnosina sobre agregados de alto peso molecular. As barras nos dias 12 e 14 representam, da esquerda para a direita: Controlo A alimentação D10, 20 mM de Carnosina Alimentação D10 , Controlo B Alimentação D10, 20 mM de Carnosina (sem Alimentação D10), e controlo C (sem Alimentação D10).

Figura 3a. Efeito de diferentes concentrações de

Carnosina sobre a densidade de células viáveis.

Figura 3b. Efeito de diferentes concentrações de

Carnosina sobre a viabilidade de células diariamente.

Figura 3c. Efeito de diferentes concentrações de

Carnosina sobre a titulação diariamente.

Figura 3d. Efeito de diferentes concentrações de

Carnosina sobre a produtividade celular especifica cumulativa. As barras representam, da esquerda para a direita: Controlo P2, Controlo P5, 20 mM de Carnosina e 40 mM de Carnosina.

Figura 3e. Efeito de diferentes concentrações de

Carnosina sobre agregados de alto peso molecular. As barras representam, da esquerda para a direita: Controlo P2, Controlo P5, 20 mM de Carnosina e 40 mM de Carnosina.

Figura 4. Perfis de densidade de células viáveis de uma linha celular de Ovário hamster chinês (CHO) que produz proteína de fusão TNFR recombinante cultivada em meios com ou sem Carnosina. A condição de controlo é a média de 4 execuções de biorreatores de controlo. 7

Figura 5. Perfis de viabilidade celular de uma linha celular de Ovário hamster chinês (CHO) que produz proteina de fusão TNFR recombinante cultivada em meios com ou sem Carnosina. A condição de controlo é a média de 4 execuções de biorreatores de controlo.

Figura 6. Efeito de Carnosina sobre a percentagem de proteina de fusão TNFR agregada/com enrolamento incorreto. A condição de controlo é a média de 4 execuções de biorreatores de controlo.

Figura 7. Efeito de Carnosina sobre a percentagem de agregados alto peso molecular (HMW) produzidos por uma linha celular de Ovário hamster chinês (CHO) que produz proteina de fusão TNFR recombinante. A condição de controlo é a média de 4 execuções de biorreatores de controlo.

Figura 8. Perfis de titulação de produto de uma linha celular de Ovário hamster chinês (CHO) que produz proteina de fusão TNFR recombinante cultivada em meios com ou sem Carnosina. A condição de controlo é a média de 4 execuções de biorreatores de controlo.

Figura 9. Perfis de produtividade celular especifica de uma linha celular de Ovário hamster chinês (CHO) que produz proteina de fusão TNFR recombinante cultivada em meios com ou sem Carnosina. A condição de controlo é a média de 4 execuções de biorreatores de controlo.

Figura 10. Perfis de Sialilação Total, expressos como uma percentagem do Material de referência, de proteina de fusão TNFR recombinante produzida por uma linha de células de ovário de hamster chinês CHO) cultivadas em meios com ou sem Carnosina. A condição de controlo é a média de 4 execuções de biorreatores de controlo.

Figura 11. Distribuição de oligossacáridos N ligados sialilados, expressa como uma percentagem dos oligossacáridos N ligados total, de proteina de fusão TNFR recombinante produzida por uma linha de células de ovário de hamster chinês CHO) cultivadas em meios com ou sem 8

Carnosina. A condição de controlo é a média de 4 execuções de biorreatores de controlo.

DEFINIÇÕES

Seguindo a convenção consagrada, os termos "um" e "uma" significam "um(a) ou mais" quando é usado nesta invenção, incluindo as reivindicações. Embora a invenção tenha sido descrita com um certo grau de particularidade, é evidente que muitas alternativas, modificações e variações serão aparentes para os peritos na especialidade à luz da divulgação. Por conseguinte, o que se pretende é que todas essas alternativas, modificações e variações, que se enquadram dentro do espirito e âmbito da invenção, sejam abrangidas pelas reivindicações definidas. 0 termo "composto anti-senescência", tal como é utilizado no presente documento refere-se a um composto seleccionado a partir do grupo que consiste em carnosina, acetilcarnosina, homocarnosina, anserina e betaalanina que, quando são adicionados a uma cultura de células, promove sua viabilidade; crescimento e/ou duração de uma célula cultivada nela. Em certas formas de realização, a utilização de um composto anti-senescência em cultura de células resulta numa titulação aumentada, produtividade de células especifica aumentada, diminuição da acumulação de agregados de alto peso molecular e/ou diminuição da acumulação de espécies ácidas que o que seria observado sob condições de cultura idênticas condições não têm o composto anti-senescência. Em certas formas de realização, de dois ou mais compostos anti-senescência podem ser utilizados de acordo com composições e métodos da presente invenção. A expressão "célula hospedeira" refere-se às células que são capazes de serem manipuladas geneticamente e/ou são capazes de crescimento e de sobrevivência num meio de cultura de células. Normalmente, as células podem expressar uma grande quantidade de uma proteína endógena ou heteróloga de interesse e pode, reter as proteínas ou 9 segregá-las no meio de cultura de células Células hospedeiras são tipicamente "células de mamíferos", que compreendem os exemplos não limitantes de células de vertebrados, incluindo células de rim de hamster bebé (BHK), ovário de hamster chinês (CHO) , rim humano (293), diplóide de rhesus fetal normal (FRhL-2), e mieloma murino (p. ex., SP2/0 e NSO) . Um perito na especialidade será consciente de outras células hospedeiras que podem ser utilizadas de acordo com os métodos e composições da presente invenção. Células estaminais embrionárias humanas são excluídas da presente invenção. 0 termo "meio de cultura de células" refere-se a uma solução que contém nutrientes para suportar a sobrevivência celular em condições em que as células podem crescer e produzir a proteína desejada. As frases "meio de inoculação" ou "meio de inoculo" referem-se a uma solução ou substância que contém nutrientes em que uma cultura de células é iniciada. Em certas formas de realização um "meio de alimentação" contém nutrientes semelhantes ao meio de inoculação, mas é uma solução ou substância com a qual as células são alimentadas após o inicio da cultura. Em certas formas de realização, um meio de alimentação contém um ou mais componentes não presentes num meio de inoculação. Em certas formas de realização, um meio de alimentação não possui um ou mais elementos presentes no meio de inoculação. Um perito ordinário na especialidade de cultura de células saberá sem experimentação indevida quais componentes compões os meios de inoculação e alimentação. Geralmente, essas soluções fornecem aminoácidos essenciais e não-essenciais, vitaminas, fontes de energia, lipidos, e oligoelementos necessários por uma célula para o crescimento e sobrevivência. Em certas formas de realização, o meio de inoculação, um meio de alimentação ou ambos compreendem um composto anti-senescência. 0 termo "caracteristica de cultura de células", tal 10 como é utilizado no presente documento refere-se a uma caracteristica observável e/ou mensurável de uma cultura de células. Métodos e composições da presente invenção são vantajosamente utilizados para melhorar uma ou mais caracteristicas de culturas de células. Em certas formas de realização, a melhoria de uma caracteristica de cultura celular compreende o aumento da magnitude de uma caracteristica de cultura de células. Em certas formas de realização, a melhoria de uma caracteristica de cultura celular compreende a diminuição da magnitude de uma caracteristica de cultura de células. Como exemplos não-limitantes, uma caracteristica de cultura de células pode ser titulação, produtividade especifica celular, viabilidade celular, densidade de células viáveis integrada, acumulação de agregados de alto peso molecular e/ou acumulação de espécies ácidas. Um perito na especialidade será consciente de outras caracteristicas de cultura de células que podem ser melhoradas usando os métodos e composições da presente invenção. O termo "meio definido" como é usado no presente documento refere-se a um meio em que a composição do meio é conhecida e controlada. O meio definido não contém aditivo complexos, tais como soro ou hidrolisados que contêm componentes desconhecidos e/ou não controlados. O termo "meio complexo" como é usado no presente documento refere-se a um meio que contém pelo menos um componente cuja identidade ou a quantidade ou é desconhecida ou não controlada. A expressão "linha de células" refere-se a, de um modo geral, células hospedeiras primárias que expressam uma proteína de interesse. Em alguns formas de realização, as células foram transfectadas com ADN exógeno que codifica uma proteína desejada e/ou que contém sequências de controlo que ativam a expressão de sequências ligadas, seja endógena ou heteróloga. Em certas formas de realização, as 11 células derivadas de tais células geneticamente modificadas formam uma linha de células e são colocadas num meio de cultura de células para crescer e produzir o produto de proteina. Em certas formas de realização, uma linha de células compreende células hospedeiras primárias que não foram transfectadas com ADN exógeno e expressam uma proteina endógena de interesse. A "fase de crescimento" de um meio de cultura de células refere-se ao período quando as células são sujeitos a uma rápida divisão e crescem de forma exponencial, ou fecham de forma exponencial. Geralmente, as células são cultivadas em condições otimizadas para o crescimento celular, geralmente de 1-4 dias. As condições da fase de crescimento podem incluir uma temperatura a cerca de 35 °C a 42 °C, geralmente cerca de 37 °C. A duração da fase de crescimento e as condições de cultura na fase de crescimento pode variar, mas geralmente são conhecidas por uma perito ordinário na especialidade de cultura de células. Em certas formas de realização, um meio de cultura de células em fase de crescimento é complementado com um meio de alimentação. A "fase de transição" ocorre durante o período quando o meio de cultura de células está sendo mudado de condições compatíveis com a fase de crescimento para condições compatíveis com a fase de produção. Durante a fase de transição, factores como temperatura, entre outros, são frequentemente alterados. Em certas formas de realização, um meio de cultura de células em fase de de transição é complementado com um meio de alimentação. A "fase de produção" ocorre após a fase de crescimento e a fase de transição. 0 crescimento exponencial das células terminou e a produção de proteínas é o principal objectivo. 0 meio de cultura de células pode ser suplementado para iniciar a produção. Em certas formas de realização, um meio de cultura de células em fase de 12 produção é complementado com um meio de alimentação. Além disso, a temperatura do meio de cultura de células durante a fase de produção pode ser mais baixa, em geral, que durante a fase de crescimento, o que normalmente favorece a produção. A fase de produção continua até que uma meta desejada seja alcançado. A expressão "densidade de células viáveis" refere-se ao número total de células que sobrevivem no meio da cultura de células num volume particular, geralmente por ml. A frase "viabilidade celular" refere-se ao número de células que estão vivas em comparação com o número total de células, tanto mortas como vivas, expressa em percentagem.

Densidade de células viáveis integrada", "IVCD": Os termos "densidade de células viáveis integrada" ou "IVCS" tal como é utilizado no presente documento referem-se à densidade média de células viáveis ao longo do curso da cultura multiplicada pela quantidade de tempo que a cultura foi executada. Quando a quantidade de proteína produzida é proporcional ao número de células viáveis presentes ao longo do curso da cultura, a densidade de células viáveis integrada é uma ferramenta útil para estimar a quantidade de proteína produzida ao longo do curdo da cultura. 0 termo "agregados de alto peso molecular" refere-se geralmente a proteínas mal-dobrada ou uma associação indevida de, pelo menos, dois polipéptidos. A associação pode surgir por qualquer método, inclusive mas não limitado a, ligação covalente, não covalente, bissulfureto, ou reticulação não reduzível. Em certas formas de realização, métodos e composições da presente invenção são vantajosamente utilizados para reduzir a acumulação de agregados de alto peso molecular. A frase "antioxidante" refere-se a um composto que pode evitar dano oxidativo de lípidos, proteínas, ADN e outras macromoléculas essenciais, bloqueando os radicais livres. 13 "Proteína terapêutica": Uma "proteína terapêutica" é uma proteína ou péptido que tem um efeito biológico numa região do corpo em que atua ou numa região do corpo em que ele atua remotamente via intermediários. Uma proteína terapêutica pode ser, por exemplo, uma proteína segregada, tal como, um anticorpo, um fragmento de antigénio-anticorpo de um anticorpo, um receptor solúvel, uma fusão de receptor, uma citocina, um factor de crescimento, uma enzima ou um factor de coagulação, como descrito em mais detalhes adiante. A lista acima de proteínas é apenas de natureza exemplar, e não se destina a ser recitação limitante. Um perito na especialidade vai entender que qualquer proteína pode ser utilizada de acordo com a presente invenção e serão capazes de seleccionar as proteínas a serem produzidas com base conforme necessário.

Como usado na especificação, os termos polipéptidos, proteínas e péptidos são sinónimos e são usados de forma intercambiável. Por conseguinte, como é usado no presente documento, o tamanho de uma proteína, péptido ou polipéptido, geralmente compreende mais de 2 aminoácidos. Por exemplo, uma proteína, péptido ou polipéptido pode compreender desde cerca de 2 até cerca de 20 aminoácidos, desde cerca de 20 até cerca de 40 aminoácidos, desde cerca de 40 até cerca de 100 aminoácidos, desde cerca de 100 aminoácidos até de cerca de 200 aminoácidos,desde cerca de 200 aminoácidos até cerca de 300 aminoácidos, e assim por diante.

Como é usado no presente documento, um aminoácido refere-se a qualquer aminoácido de ocorrência natural, qualquer derivado de aminoácido ou qualquer mimético de aminoácido conhecido na especialidade. Em certas formas de realização, os resíduos da proteína ou péptido são sequenciais, sem qualquer não-aminoácido interrompendo a sequência de resíduos de aminoácidos. Em outras formas de realização, a sequência pode compreender por uma ou mais 14 frações de não aminoácidos. Em formas de realização particulares, a sequência de residuos da proteína ou péptido pode ser interrompida por uma ou mais frações de não aminoácidos. "Anticorpo": 0 termo "anticorpos" é usado para se referir a qualquer molécula semelhante a anticorpo que tem uma região de ligação de antigénio, e inclui fragmentos de anticorpos, tais como Fab', Fab, F(ab') .sub.2, anticorpos de domínio único (dabs), Fv, scFv (Fv de cadeia simples), e similares. As técnicas para a preparação e utilização de diferentes construções baseadas em anticorpos e fragmentos são conhecidas na especialidade. Meios para a preparação e caracterização dos anticorpos são também bem conhecidos na especialidade (Veja-se, por ex., Harlow e Lane, Antibodies: A Laboratory Manual, Cold Spring Harbor Laboratory, 1988;)· Por exemplo, um anticorpo pode incluir pelo menos uma, e de preferência duas cadeias pesadas de comprimento total, e pelo menos uma e de preferência duas cadeias leves. 0 termo "anticorpo", conforme é usado no presente documento inclui um fragmento de anticorpo ou uma molécula variante tais como um fragmento de ligação de antigénio (por ex., um Fab, F(ab')2, Fv, um fragmento de cadeia única Fv, um fragmento de cadeia pesada (por ex., VHH de camélido) e uma fusão de domínio de ligação de imunoglobulina (por exemplo, SMIP™). 0 anticorpo pode ser um anticorpo monoclonal ou um anticorpo especificidade de única. 0 anticorpo pode também ser um humano, humanizado, quimérico, CDR-enxertada, ou anticorpo gerado in vitro. Ainda em outras formas de realização, o anticorpo tem uma região constante de cadeia pesada escolhida a partir de, por exemplo, IgGl, IgG2, IgG3 ou IgG4. Em outra forma de realização, o anticorpo tem uma cadeia leve escolhida a partir de, por exemplo, kappa ou lambda, uma personificação, a região constante é alterada, por ex., mutada, para modificar as propriedades de anticorpo (p. ex., para aumentar ou diminuir uma ou mais 15 de : ligação de receptor de Fc, glicosilação de anticorpo, o número de residuos de cisteina, função de células efetoras, ou função complementar). Normalmente, o anticorpo especificamente liga-se à um predeterminado antigénio,por ex., um antigénio associado a um distúrbio,por ex., distúrbio degenerativo, metabólico, inflamatório, auto-imunes e/ou de uma doença maligna.

Small Modular ImmunoPharmaceuticals (SMIP™) fornecem um exemplo de uma molécula variante que compreende um polipéptido de domínio de ligação. SMIP e seus usos e aplicações são divulgados, por exemplo, Nos pedidod de patente publicados de E.U.A. N° 2003/0118592, 2003/0133939, 2004/0058445, 2005/0136049, 2005/0175614, 2005/0180970, 2005/0186216, 2005/0202012, 2005/0202023, 2005/0202028, 2005/0202534, e 2005/0238646, e membros da família de patentes relacionadas.

Anticorpos de domínio único podem incluir anticorpos cuja regiões de determinação complementares são parte de um polipéptido de domínio único. Os exemplos incluem, mas não estão limitados a, anticorpos de cadeia pesada, anticorpos naturalmente desprovido de cadeias leves, anticorpos de domínio único derivados de anticorpos convencional 4-cadeias, anticorpos modificados por engenharia e estruturas de domínio único diferentes dos derivados de anticorpos. Os anticorpos de domínio único podem ser qualquer um da arte, ou de qualquer outros futuros anticorpos de domínio único. Os anticorpos de domínio único podem ser derivados de qualquer espécie, incluindo, mas não limitado a ratinho, humano, camelo, lhama, cabra, coelho, bovinos. De acordo com um aspecto da invenção, um anticorpo de domínio único como é usado no presente documento é um anticorpo de domínio único de ocorrência natural conhecido como anticorpo de cadeia pesada desprovido de cadeias leves, tais anticorpos de domínio único são divulgadas no 16 documento WO 9404678 por exemplo. Por razões de clareza, este domínio variável derivado de um anticorpos cadeia pesada naturalmente desprovido de cadeia leve é conhecido aqui como VHH ou nano-corpo para a distinguir da VH convencional de imunoglobulinas de quatro cadeias. Tal molécula VHH pode ser derivada de anticorpos criados em espécies de camelídeos, por exemplo, camelo, lhama, dromedário, alpaca e guanaco. Outras espécies além camelídeos podem produzir anticorpos de cadeia pesada naturalmente desprovido de cadeia leve; tais VHHs estão dentro do âmbito da invenção.

Exemplos de fragmentos de ligação englobados no termo "fragmento de ligação a antigénio" de um anticorpo incluem: (i) um fragmento Fab, um fragmento monovalente que consiste em domínios VL, VH, CL e CHI; (ii) um fragmento F(ab') 2, um fragmento bivalente que compreende dois fragmentos Fab ligados por uma ponte de bissulfeto na região da dobradiça; (iii) um fragmento Fd que consiste em domínios VH e CHI; (iv) um fragmento Fv que consiste em domínios VL e VH de um único braço de um anticorpo, (v) um fragmento dab, que consiste num domínio VH; (vi) um domínio variável camelizado ou de camélido, por exemplo, um domínio VHH; (vii) um Fv de cadeia única (scFv) ; (viii) um anticorpo biespecífico; e (ix) um ou mais fragmentos de uma molécula de imunoglobulina fundida a uma região Fc. Além disso, embora os dois domínios do fragmento Fv, VL e VH, sejam codificadas por diferentes genes, podem ser unidos, usando métodos recombinantes, por um ligante sintético que permite-lhes que sejam feitas numa cadeia de proteína única em que o par de regiões de VL e VH formam moléculas monovalentes (conhecidas como Fv de cadeia única (scFv); ver, por exemplo, Bird et al. (1988) Science 242:423-26; Huston et al. (1988) Proc. Natl. Acad. Sei. U.S.A. 85:5879-83). P anticorpos de cadeia única também são destinados a ser abrangidos no termo "fragmento de ligação 17 aantigénio" de um anticorpo. Esses fragmentos de anticorpos são obtidos usando as técnicas convencionais conhecidas para os qualificados na arte, e os fragmentos são avaliados para a função da mesma forma que são os anticorpos intactos.

Diferente de anticorpos "biespecificos" ou "bifuncionais", um anticorpo é entendido que tem cada um dos seus sitios de ligação idênticos. Um anticorpo "biespecifico" ou "bifuncional" é um anticorpo híbrido artificial de dois pares de cadeia pesada/leve e dois sítios de ligação diferentes. Anticorpos biespecificos podem ser produzidos por uma variedade de métodos, incluindo fusão de hibridomas ou ligação da fragmentos Fab". Ver, por ex., Songsivilai & Lachmann, Clin. Exp. Immunol. 79:315-321 (1990); Kostelny et al., J. Immunol. 148, 1547-1553 (1992). A frase "biorreator" refere-se a um vaso em que o meio de cultura de células podem ser contido e cujas condições internas podem ser controladas durante o período de cultura, p. ex., pH e temperatura.

Uma "cultura de alimentação descontínua" refere-se a um método de cultura de células em que as células são primeiro inoculadas num bioreator com um meio de inoculação. O meio de cultura de células é então suplementado num ou mais pontos ao longo de todo o ciclo de produção com um meio contendo os componentes nutricionais e/ou outros suplementos.

Uma "cultura em batelada" refere-se a um método de cultura de células em que as células são inoculadas num bioreator com todos os nutrientes necessários e suplementos para a totalidade da produção. Nenhuma adição de nutriente é feita ao meio de cultura de células ao longo do período de duração da produção.

Uma "cultura de perfusão" refere-se a um método de cultura de células que é diferente de um método de cultura 18 de alimentação descontínua ou em batelada, em que a cultura não é terminada, ou não é necessariamente terminada, antes de isolar e/ou purificar uma proteína expressa de interesse, e em que novos nutrientes e outros componentes são periodicamente ou continuamente adicionados à cultura, durante a qual a proteína expressa é periodicamente ou permanentemente colhidas. A composição dos nutrientes adicionados podem ser alteradas durante o curso da cultura de células, dependendo das necessidades das células, os requisitos para obter a melhor produção de proteínas, e/ou qualquer de uma variedade de outros factores conhecidos para aqueles de habilidades comuns na arte. A frase "expressão" refere-se a transcrição e a tradução que ocorre dentro de uma célula hospedeira. 0 nível da expressão refere-se, em geral, a quantidade da proteína a ser produzida pela célula hospedeira. "Produtividade específica de célula", e similares, refere-se a taxa de expressão de produto específica, como em por célula. A produtividade específica celular é geralmente medida em microgramas de proteínas produzidas por 10 6 células por dia ou em picogramas de proteína produzida por 10 6 células por dia. O termo "titulação", tal como é utilizado neste documento refere-se à quantidade total de proteína expressa de forma recombinante produzida por uma cultura de células numa determinada quantidade de titulação de volume de meio é normalmente expressa em unidades de miligramas ou microgramas de proteínas por mililitro de meio.

Um perito na especialidade, reconhecerá que os métodos divulgados no presente documento podem ser usados para a cultura de muitas células de mamíferos bem conhecidas utilizadas rotineiramente e cultivadas na arte, ou seja, os métodos divulgados no presente documento não são limitados ao uso apenas com a presente divulgação.

DESCRIÇÃO DETALHADA DE CERTAS FORMAS DE REALIZAÇÃO DA 19

INVENÇÃO

Foi descoberto que a utilização de um composto anti-senescência tal como a carnosina modifica a viabilidade e a produtividade de uma cultura de células. Por exemplo, a adição de carnosina mantém viabilidade celular e melhora a produtividade das células e melhora a qualidade do produto do produto de proteina desejado. A carnosina é um antioxidante e um composto anti-senescência que também é um dipé'ptido de ocorrência natural presente em niveis elevados (até 20 mM) no músculo e tecidos nervosos em animais. Ao ser um anti-oxidante, a carnosina também é um sequestrante de radicais livres e inibidor de glicação . Em geral, a carnosina transforma espécies reativas em espécies não reativas e, assim, protege as proteínas, ADN, e outras macromoléculas essenciais. Como um anti-senescência composto, carnosina pode prolongar a vida útil de fibroblastos diplóides humanos humanos e pulmonar fetal (célula primária linhas) a uma concentração de 20 mm em meios de cultura. A presente invenção abrange a surpreendente descoberta de que é vantajoso utilizar um composto anti-senescência na cultura de células para produzir uma proteína de interesse. Em certas formas de realização, por meio de um composto de senescência anti-cultura de células para produzir uma proteína de interesse resulta numa ou mais características melhoradas de cultura de células incluindo, mas não limitado a, maior titulação, maior produtividade celular, diminuição da acumulação de agregados de altopeso molecular, e/ou diminuição da acumulação de espécies ácidas.

Tem sido demonstrado que é a carnosina é citotóxica para células humanos ou de roedores transformadas e neoplásicas em Meio mínimo essencial (MEM, Sigma), que tem menores níveis de glicose, mas não em Meio de Eagle modificado por Dulbecco (DMEM, Sigma), que contém 1 mM de piruvato. (Holliday et al, Biochemistry (Moscovo), 65: 843- 20 848.846). Além disso, soro fetal bovino dialisado com compostos de baixo peso molecular retirou os aumentados efeitos citotóxicos de carnosina. Id. Também foi determinado que o 1 mM oxaloacetato e 1 mM de a-cetoglutarato tiveramefeitos comparáveis, como piruvato, nenhum dos quais são os componentes do inoculo ou meios de alimentação utilizados com os exemplos de carnosina. Id. Piruvato de sódio, no entanto, é um componente original no meio de inoculo na concentração de 0,5 mM, não para adições de carnosina mas para melhor simular as condições in vivo num sistema de biorreator e como uma potencial fonte de energia alternativa. O meio de inoculo é também sem soro, o que implicaria que a carnosina teria efeitos citotóxicos. De acordo com a referência, a adição de carnosina a um meio de cultura de células que têm semelhantes efeitos citotóxicos, como visto no meio MEM, Holliday, utilizando métodos e/ou composições da presente invenção, tal citotoxicidade é reduzida ou eliminada e a viabilidade celular e produção de proteínas são melhoradas.

Em certas formas de realização, a carnosina é fornecida num meio de cultura de células numa concentração entre cerca de 5 mM e cerca de 100 mM. Em certas formas de realização, a carnosina é fornecida num meio de cultura de células numa concentração de cerca de 10 mM a cerca de 40 mM, por exemplo, uma concentração de cerca de 20 mM. Em certas formas de realização, a carnosina é fornecida num meio de cultura de células a uma concentração de cerca de 5, 6, 7, , 8, 9, 10, 11, 12, 13, 14, 15, 16, 17, 18, 19, 20, 21, 22, 23, 24, 25, 26, 27, 28, 29, 30, 31, 32, 33, 34, 35, 36, 37, 38, 39, 40, 41, 42, 43, 44, 45, 46, 47, 48, 49, 50, 55, 60, 65, 70, 75, 80, 85, 90, 95, 100 mM, ou superior . Em

certas formas de realização,tais concentrações de carnosina são conseguidas em cultura de células pela adição de carnosina várias vezes durante o processo de cultura celular, por exemplo, num ou mais meios de alimentação. A 21 concentração de carnosina utilizada depende do meio de cultura de células e a linha de células a ser utilizada, entre outros factores, incluindo os efeitos desejados que se procura na linha de células ou produto. Análogos de carnosina, p. ex. acetil-carnosina, homo-carnosina, anserina, e beta-alanina, pode também ser fornecidos num meio de cultura de células para um efeito semelhante. Um ou mais destes análogos podem ser fornecidos num meio de cultura de células. Em determinadas formas de realização, tais análogos são fornecidos num meio de cultura de células que não tem carnosina. Em determinados formas de realização, tais análogos são fornecidos num meio de cultura de células em combinação com carnosina. Em certas formas de realização, tais análogos são fornecidos a uma concentração de cerca de 5, 6, 7, 8, 9, 10, 11, 12, 13, 14, 15, 16, 17, 18, 19, 20, 21, 22, 23. 24, 25, 26, 27, 28, 29, 30, 31, 32, 33, 34, 35, 36, 37, 38, 39, 40, 41, 42, 43, 44, 45, 46, 47, 48, 49, 50, 55, 60, 65, 70, 75, 80, 85, 90, 95, 100 mM, ou superior

Em certas formas de realização, com a finalidade de produzir uma proteína de interesse, inicialmente, células hospedeiras são transfectadas ou transformado com ADN exógeno que codifica uma proteína para fornecer células transformadas, que constitutivamente produzem a proteína desejada. Em certas formas de realização, uma molécula de ácido nucléico introduzida na célula codifica a proteína desejada para ser expressa de acordo com a presente invenção. Em certas formas de realização, uma molécula de ácido nucléico contém uma sequência regulatória ou codifica um produto génico que induz ou aumenta a expressão da proteína desejada pela célula. Como um não-limitante, tal gene pode ser um factor de transcrição que aumenta a expressão de proteínas de interesse.

Em certas formas de realização, um ácido nucléico que direciona a expressão de uma proteína é estavelmente 22 introduzido na célula do hospedeiro. Em certas formas de realização, um ácido nucleico que direciona a expressão de uma proteina é transitoriamente introduzido na célula do hospedeiro. Um perito na especialidade será capaz de escolher se introduzir de forma estável ou ou transitória o ácido nucleico na célula com base nas necessidades experimentais, comerciais ou outras necessidades. 0 gene que codifica uma proteina de interesse pode, opcionalmente, ser ligado a um ou mais elementos de controlo regulatórios genético. Em algumas formas de realização, um elemento de controlo genético direciona a expressão constitutiva da proteina. Em algumas formas de realização, pode ser usado um elemento de controlo genético que fornece expressão induzivel de um gene que codifica a proteina de interesse. A utilização de um elemento de controlo genético induzivel (p. ex., um promotor induzivel) permite a modulação da produção de proteínas da célula. Exemplos não-limitantes de elementos de controlo genético induzíveis potencialmente úteis para utilização em células eucarióticas incluem elementos regulados por hormona (veja-se, por exemplo, Mader, S. e Branco, J. H. , Proc. Natl. Acad. Sei. USA 90:5603-5607, 1993), elementos regulados por ligandos sintéticos (veja-se, p. ex., Spencer, D. M. et al., Science 262:1019-1024, 1993) e elementos regulados por radiação ionizante (veja-se, por exemplo, Ma-nome, Y. et al., Biochemistry 32:10607-10613, 1993; Datta, R. et al., Proc. Natl. Acad. Sei. USA 89: 10149-10153, 1992). Sistemas específicos de células adicionais ou outros sistemas reguladores conhecidos na arte podem ser utilizados de acordo com os métodos e composições descritos no presente documento.

Qualquer célula hospedeira suscetível a cultura de células, e a expressão de proteínas, pode ser utilizada de acordo com a presente invenção. As células hospedeiras são, em geral, células de mamíferos, mais particularmente as 23 células animais, tais como células de ovário de hamster chinês CHO. Outros exemplos não-limitantes são células de mamíferos que podem ser utilizadas de acordo com a presente invenção linha de incluem mieloma múltiplo de ratinho BALB/c (NSO/I, ECACC: 85110503); retinoblastos humanos (PER.C6 (CruCell, Leiden, Paises Baixos); linha de rim de macaco CV1 transformada por SV40 (COS-7, ATCC CRL 1651); linha de rim embrionário humano (células 293 ou 293 subclonadas para o crescimento em cultura em suspensão, Graham et al., J. Gen virol., 36:59 (1977); células de rim de hamster bebé (BHK, ATCC CCL 10); células de ovário de hamster chinês + / - (CHO DHFR, Urlaub e Chasin, Proc.

Natl. Acad. Sei. EUA, 77:4216 (1980); células de sertoli de ratinho (TM4, Mather, Biol. Reprod., 23:243-251 (1980); células de rim de macaco (CV1 ATCC CCL 70) ; células de rim de macaco verde Africano (VERO -76, ATCC CRL-1 587); células de carcinoma cervical humano (HeLa, ATCC CCL 2) ; células de rim canino (MDCK, ATCC CCL 34) ; células de figado de rato buffalo (BRL 3A, ATCC CRL 1442); células de pulmão humano (W138, ATCC CCL 75); células de figado humano (Hep G2 HB 8065); tumor mamário de ratinho (MMT 060562, ATCC CCL51); células TRI (Mather et al., Anais N. Y. Acad. Sei., 383:44-68 (1982); células MRC 5; células FS4; e linha de hepatoma humano (Hep G2).

Polipéptidos

Qualquer polipéptido que pode ser expresso numa célula hospedeira pode ser produzido em conformidade com a presente invenção. O polipéptido pode ser expresso a partir de um gene que é endógeno à célula hospedeira, ou a partir de um gene heterólogo que é introduzido na célula hospedeira. O polipéptido pode ser um que ocorre na natureza, ou poderá, em alternativa, ter uma sequência que foi modificada ou seleccionada pela mão do homem. Um polipéptido a ser produzido de acordo com a presente invenção pode ser montado a partir de fragmentos de 24 polipéptidos que individualmente ocorrem na natureza. Além disso ou, como alternativa, um polipéptido modificado pode incluir um ou mais fragmentos que não são de ocorrência natural. As proteínas ou péptidos podem ser feitos por qualquer técnica conhecida para os peritos na especialidade, incluindo a expressão de proteínas, péptidos ou polipéptidos através de técnicas de biologia molecular padrão, o isolamento de proteínas ou péptidos provenientes de fontes naturais, ou a sintese quimica de proteínas ou péptidos. As regiões codificadoras para genes conhecidos podem ser amplificados e/ou expressos utilizando as técnicas divulgadas no presente documento ou como seria conhecido para aqueles peritos na especialidade. Em alternativa, várias preparações comerciais de proteínas, péptidos e polipéptidos são conhecidas para aqueles peritos na especialidade.

Proteínas terapêuticas que podem ser desejavelmente expressas de acordo com a presente invenção são, frequentemente, seleccionadas com base numa actividade química ou biológica interessante ou útil. Por exemplo, a presente invenção pode ser utilizada para expressar qualquer enzima, factor de coagulação, receptor, anticorpos, hormona, factor regulador, antigénio, agente de ligação, etc farmaceuticamente ou comercialmente relevantes. A lista a seguir de proteínas terapêuticas que podem ser produzidas de acordo com a presente invenção é meramente simbólica, e não se destina a ser uma recitação limitante. Um perito na especialidade é capaz de entender que qualquer polipéptido pode ser expresso de acordo com a presente invenção e serão capazes de seleccionar o polipéptido particular a ser produzido com base em suas necessidades específicas.

Proteínas de Fusão

As proteínas de fusão geralmente têm todas ou uma porção substancial de um péptido de direcionamento, 25 relacionado com a terminação N ou C, para todos ou uma porção de um segundo polipéptido ou proteína. Por exemplo, as fusões podem empregar sequências líder de outras espécies para permitir a expressão recombinante da proteína num hospedeiro heterólogo. Outra fusão útil inclui a adição de um domínio imunologicamente ativo, tais como um epítopo de anticorpo, para facilitar a purificação da proteína de fusão. A proteína de fusão pode incluir uma fracção de direccionamento, por ex., um fragmento de receptor solúvel ou um ligando, e uma cadeia de imunoglobulina, um fragmento Fc, uma região constante de cadeia pesada de diferentes isotipos, incluindo, por exemplo: IgGl, IgG2, IgG3, IgG4, IgM, IgAl, IgA2, IgD, e IgE. Por exemplo, a proteína de fusão pode incluir o domínio extracelular de um receptor, e, por exemplo, fusão a, uma cadeia de Fc de imunoglobulina humana (p. ex., IgGl humana ou IgG4 humana, ou uma forma mutada das mesmas). numa forma de realização, a sequência de Fc humana foi mutada num ou mais aminoácidos, por exemplo, mutações nos resíduos 254 e 257 da sequência de tipo selvagem para reduzir ligação de receptor Fc. As proteínas de fusão podem, adicionalmente, incluir uma sequência de ligante que une a primeira fracção à segunda fracção, por exemplo, o fragmento de imunoglobulina. Por exemplo, a proteína de fusão pode incluir um ligante de péptido, por exemplo, um ligante de péptido de cerca de 4 a 20, mais preferencialmente, de 5 a 10, aminoácidos de comprimento; em certas formas de realização, o ligante de péptido é de 8 aminoácidos de comprimento. Por exemplo, a proteína de fusão pode incluir um ligante de péptido tendo a fórmula (Ser-Gly-Gly-Gly-Gly) y onde y é 1, 2, 3, 4, 5, 6, 7, ou 8. Em outras formas de realização, sequências de aminoácidos adicionais pode ser adicionadas à terminação C da proteína de fusão para facilitar a expressão, flexibilidade estéricao, detecção e/ou isolamento ou purificação. 26 A inclusão de um sitio de clivagem em ou perto da junção de fusão irá facilitar a remoção de polipéptidos estranhos depois da purificação. Outras fusões úteis incluem ligações de dominios funcionais, tais como, sitios ativos de enzimas, dominios de glicosilação, sinais de direcionamento celular ou regiões trans-membrana. Exemplos de proteínas ou péptidos que podem ser incorporados a uma proteina de fusão incluem proteínas citostáticas, proteínas citocidas, agentes pró-apoptose, agentes anti-angiogénicos, hormonas, citocinas, factores de crescimento e fármacos peptidicos, anticorpos, anticorpos, anticorpos de fragmentos Fab, antigénios, proteínas receptoras, enzimas, lectinas, proteínas MHC, proteínas de adesão celular e proteínas de ligação. Métodos para a geração de proteínas de fusão são bem conhecidos pelos peritos na especialidade. Essas proteínas podem ser produzidas, por exemplo, por ligação química usando reagentes reticulantes bifuncionais, por síntese de novo da proteína de fusão completa, ou pela união de uma sequência de ADN que codifica o péptido alvo à sequência de ADN que codifica o segundo péptido ou proteína, seguido pela expressão da proteína de fusão intacta.

Anticorpos

Anticorpos são proteínas que têm a capacidade de se ligar especificamente a um determinado antigénio. Dado o grande número de anticorpos atualmente em uso ou sob investigação, como produtos farmacêuticos ou outros agentes comerciais, a produção de anticorpos de acordo com a presente invenção é de especial interesse. Por exemplo, a presente invenção pode ser usada na produção de anticorpos numa cultura de células em que o mal dobramento e/ou agregação dos anticorpos produzidos são reduzidos.

Em certas formas de realização, métodos e/ou composições da presente invenção são empregues para produzir um anticorpo contra o factor de diferenciação do 27 crescimento-8 (GDF-8). Exemplos não limitantes de anticorpos GDF-8 incluem Myo29, Myo28 e Myo22. Em certas formas de realização, anticorpos GDF-8 produzidos de acordo com os presente ensinamentos são produzidos na forma de isotipos de IgG humana. Em certas formas de realização, métodos e/ou composições da presente invenção são utilizados para produzir um anticorpo MY029, como descrito no pedido de patente internacional com número de publicação WO 2004/037861, intitulado "Anticorpos neutralizantes contra GDF-8 e usos do mesmo, incorporada no presente documento por referência na integra.

Outras proteínas terapêuticas disponíveis

comercialmente que podem ser produzidas, de acordo com a presente invenção incluem, por exemplo, AVASTIN [Bevacizumab], CAMPATH [Alemtuzumab], ERBITUX [Cetuximab], HERCEPTIN [TRASTUZUMAB], HUMIRA [Adalimumab], LUCENTIS [Ranibizumab], MYLOTARG [gemtuzumab ozogamicin], MYCSCINT [Imicromab Penetate], PROSTASCINT [Capromab Pendetide], RAPTIVA [Efalizumab], REMICADE [Infliximab], REO-PRO [Abciximab], RITUXAN [Rituximab], SIMULECST [Basilximab], SOLIRIS [Eculizumab], SYNAGIS [Palivizumab], TYSABRI [Natalizumab] , VECTIBIX [Panitumumab] , VERLUMA

[Nofetumomab] , XOLAIR [Omalizum-ab] , ZANAPAX [Daclizumab], ZEVALIN [Ibritumomab Tiuxetan], etc

Em certas formas de realização, os anticorpos monoclonais, quiméricos, ou humanizados descritos acima contêm resíduos de aminoácidos que não ocorrem naturalmente em qualquer anticorpo em qualquer espécie na natureza. Estes resíduos estranhos podem ser utilizados, por exemplo, para conferir especificidade nova ou modificada, afinidade ou função efetora do anticorpo monoclonal quimérico ou humanizado.

Factores de Coagulação

Os factores de coagulação têm se mostrado eficazes como agentes farmacêuticos e/ou comerciais. A hemofilia B é 28 uma distúrbio no qual o sangue do doente é incapaz de coagular. Sendo assim, qualquer pequena ferida que resulta em sangramento é, potencialmente, um evento com risco de vida. Tendo em conta a importância dos factores de coagulação recombinante no tratamento de doenças tal como a hemofilia, a produção de factores de coagulação de acordo com a presente invenção é de especial interesse. Em certas formas de realização, a presente invenção pode ser usada para produzir factores de coagulação numa cultura de células onde o mal dobramento e/ou agregação de factores de coagulação produzidos são reduzidos.

Por exemplo, o factor de coagulação IX (factor IX ou "FIX") é uma glicoproteína de cadeia única cuja deficiência resulta em Hemofilia B. FIX é sintetizado como uma zimogénio cadeia única que pode ser activado numa serina protease de duas cadeias (factor IXa) pela libertação de um péptido de ativação. 0 dominio catalítico do factor IXa está localizado na cadeia pesada (ver Chang et al., J. Clin. Invest., 100:4, 1997, incorporado no presente documento por referência em sua totalidade). Outros factores da coagulação que podem ser produzidos de acordo com a presente invenção incluem factor tecidual, e factor von Willebrands e/ou factores de coagulação sanguínea comercialmente disponíveis. Os factores de coagulação sanguínea comercialmente disponíveis representativos que pode ser produzidos de acordo com a presente invenção incluem, por exemplo, AL-TEPLASE [ativador de plasminogênio tecidual; t-PA], BENE-FIX [factor IX], HEMOFIL [Factor anti-hemofílico; factor XIII], RECOMBINATE (factor anti-hemofílico recombinante), etc.

Enzimas

Outra classe de polipéptidos que têm se mostrado muito eficaz como produtos farmacêuticos e/ou agentes comerciais e que pode ser produzida desejavelmente de acordo com os ensinamentos da presente invenção inclui enzimas. Dada a 29 importância das enzimas recombinante no tratamento de doenças e outros usos comerciais e farmacêuticos, a produção de enzimas de acordo com a presente invenção é de especial interesse. Por exemplo, a presente invenção pode ser usada na produção de enzimas numa cultura de células em que o mal dobramento e/ou a agregação das enzimas produzidas são reduzidos. Enzimas comercialmente disponíveis representativas que podem ser produzidas de acordo com a presente invenção incluem , por exemplo, ACTIVASE [alteplase recombinante], CEREDASE [Alglucerase], CEREZYME [Im-iglucerase], PULMOZYME [DNase], etc.

Factores de crescimento e outras moléculas de sinalização

Outra classe de polipéptidos que têm se mostrado muito eficaz como produtos farmacêuticos e/ou agentes comerciais e que pode ser produzida desejavelmente de acordo com os ensinamentos da presente invenção inclui factores de crescimento e outras moléculas de sinalização, factores de crescimento são geralmente glicoproteínas que são segregadas por células e se ligam a e activam receptores em outras células, iniciando uma mudança metabólica ou em desenvolvimento na célula receptora. Dada a importância biológica dos factores de crescimento e outras moléculas de sinalização e sua importância como potenciais agentes terapêuticos, a produção dessas moléculas de acordo com a presente invenção é de especial interesse. Por exemplo, a presente invenção pode ser usada para produzir factores de crescimento ou outras moléculas de sinalização numa cultura de células em que o mal dobramento e/ou a agregação de factores de crescimento ou outras moléculas de sinalização produzidos são reduzidos.

Exemplos não-limitantes de factores de crescimento de mamíferos e outras moléculas de sinalização incluem citocinas, factor de crescimento epidérmico (EGF), factor de crescimento derivado de plaquetas (PDGF), factores de crescimento fibroblástico (FGFs) , tais como aFGF e bFGF; 30 factores de crescimento transformantes (TGFs), tais como TGF-alfa e TGF-beta, incluindo TGF-beta 1, TGF-beta 2, TGF-beta 3, TGF-beta 4, ou TGF-beta 5; factor de crescimento semelhante a insulina I e II (IGF-I e IGF-II), des (1-3) - IGF-I (IGF-1 cerebral), proteínas de ligação de factor de crescimento semelhante à insulina; proteínas CD tais como CD-3, CD-4, CD-8, CD-19; eritropoetina (eritropoetina comercialmente disponíveis representativas incluem, por exemplo, ARA-NESEP [darbepoetina] ; CEA-SCAN [Arcitumomab], EPO-GEN [epoetina alfa]; PROCRIT [epoetina alfa])), etc. ); factores osteoindutores; imunotoxinas; uma proteína morfogenética óssea (BMP); um interferão, tal como o interferão-alfa, beta e gama (interferões disponíveis comercialmente representativos incluem, por exemplo, ACTIMUNNE [interferão gama-lb], AVONEX [interferão beta-la], REBIF [interferão beta-la], BETASERON [interferão-beta-lb] ), etc.); factores estimuladores de colónias (QCA), por exemplo, M-CSF, GM-CSF, G-CSF (outros factores estimuladores de colónias disponíveis comercialmente representativos incluem, por exemplo, GRANUCYTE, Lenograstim, LEUKINE [Sar-gramostim]), etc.); interleucinas (TLS), como, por exemplo, IL-1 e IL-10; factor de necrose tumoral (TNF) alfa e beta; cadeia A de insulina; cadeia B de insulina; proinsulina; Hormona folículo-estimulante; calcitonina; Hormona luteinizante; glucagon; factores de coagulação tais como factor VIIIC, factor IX, factor tecidual, e factor von Willebrands; factores anti-coagulantes, tais como proteína C; factor natriurético atrial; surfactante pulmonar; um ativador de plasminogénio, tal como uroquinase ou urina humana ou o ativador de plasminogénio de tipo tecidual (t-PA); bombesina; trombina, factor de crescimento hemopoiético enkephalinase; RANTES (Célula T regulada na activação normalmente expressa e segregada); proteína inflamatória de macrófago humana (MIP-1-alfa); substância inibidora mulleriana, cadeia de 31 relaxina A; cadeia de relaxina B; prorelaxina; péptido associado a gonadotrofina de ratinho; factores neurotróficos tais como factor neurotróficos derivado de osso (BDNF), Neurotrofina 3, 4, 5, ou 6 (NT-3, NT-4, NT-5, ou NT-6) , ou um factor de crescimento do nervo, tal como NGF-beta. Um perito na especialidade será consciente de outros factores de crescimento e moléculas de sinalização que podem ser expressos de acordo com os métodos e composições da presente invenção.

Receptores

Outra classe de polipéptidos que têm se mostrado muito eficaz como produtos farmacêuticos e/ou agentes comerciais e que pode ser produzida desejavelmente de acordo com os ensinamentos da presente invenção inclui receptores. Dada a importância biológica dos receptores e sua importância como potenciais agentes terapêuticos, a produção dessas moléculas de acordo com a presente invenção é de especial interesse. Por exemplo, a presente invenção pode ser usada na produção de receptores numa cultura de células em que o mal dobramento e/ou a agregação das enzimas produzidas são reduzidos.

Os receptores são tipicamente glico-proteinas transmembrana que funcionam pelo reconhecimento de um ligando de sinalização extra-celular. Receptores têm frequentemente um domínio de proteína cinase além do domínio de reconhecimento de ligando. Este domínio de proteína cinase inicia uma via de sinalização pela fosforilação de moléculas-alvo intracelulares após ligação do ligando, o que leva a alterações de desenvolvimento ou metabólicas dentro da célula. Em determinadas formas de realização, um domínio extracelular de um receptor transmembrana é produzido de acordo com métodos e sistemas divulgados no presnete documento. Em certas formas de realização, um domínio intracelular de um receptor transmembrana é produzido de acordo com métodos e sistemas 32 divulgados no presente documento.

Em certas formas de realização, os inibidores de factor de necrose tumoral, sob a forma de receptores do factor de necrose tumoral alfa e beta (TNFR-1; documento EP 417.563 publicado em 20 de março de 1991; e TNFR-2, documento EP 417.014 publicado em 20 de março de 1991) são expressos de acordo com os sistemas e métodos da presente invenção (para revisão, veja-se Nai-smith and Sprang, J Inflamm. 47(1-2):1-7, 1995-96). Segundo algumas formas de realização, um inibidor do factor de necrose tumoral compreende um receptor de TNF solúvel. Em certas formas de realização, um inibidor de factor de necrose tumoral compreende TNFR solúvel fundido a gualquer porção de uma proteína imunoglobulina, incluindo a região Fc de uma imunoglobulina. Em certas formas de realização, os inibidores de TNF da presente invenção, são formas solúveis de TNFR I e TNFR II. Em certas formas de realização, os inibidores de TNF a presente invenção são proteínas de ligação de TNF solúveis. Em certas formas de realização, os inibidores de TNF da presente invenção são TNFR-Fc, por exemplo, etanercept. Tal como é utilizado neste documento, "etanercept," refere-se a um TNFR-Fc, que é um dímero de duas moléculas da porção extracelular do receptor de TNF-a p75, cada molécula consistindo numa porção de Fc de 235 aminoácidos de IgGl humana. De acordo com a invenção, um composto anti-senescência, tais como carnosina, é utilizado para diminuir a quantidade de proteínas com enrolamento incorreto e/ou agregadas durante a produção do TNFR-Fc.

Em alguns formas de realização, os receptores a ser produzidos de acordo com a presente invenção são receptores tirosina cinases (RTKs). A família RTK inclui os receptores que são cruciais para uma variedade de funções de numerosos tipos de células (ver, p. ex., Yarden e Ullnch, Ann. Rev Biochem. 57:433-478, 1988; Ullrich and Schlessing-er, Cell 61.243-254, 1990). Exemplos não-limitantes de RTKs incluem 33 receptores de factor de necrose tumoral-alfa e beta, membros da família de receptores do factor de crescimento de fibroblastos (FGF), os membros da família do receptor do factor de crescimento epidérmico (EGF), receptor do factor de crescimento derivado das plaquetas (PDGF), receptores de tirosina cinase com domínios de homologia imunoglobulina e EGF 1 (TIE-1) e TIE-2 (Sato et al., Nature 376 (8535) : 70-74, 1995) e receptor de c-Met, alguns dos quais têm sido sugeridos que promovem a angiogênese, directa ou indirectamente (Mustonen e Alitalo, J. Cell Biol. 129:895-899, 1995). Outros exemplos não-limitantes de RTK, que incluem de cinase fígado fetal 1 (FLK-1) (às vezes referida como receptor contendo domínio de inserção cinase (KDR) (Terman et al., Oncogene β: 16T7-83, 1991) ou receptor do factor de crescimento endotelial vascular 2, VEGFR-2), tirosina cinase semelhante a fms 1 (Flt-1) (DeVries et al. Science 255, 989-991, 992; Shibuya et al., Oncogene 5:519-524, 1990), por vezes referida como receptor do factor de crescimento de células endoteliais vasculares 1 (VEG-FR-1), neuropilina-1, endoglina, endosialina, e Axl. Um perito na especialidade será consciente de outros receptores que podem ser expressas de acordo com a presente invenção.

Em certas formas de realização, o receptor a ser produzido de acordo com a presente invenção é um receptor acoplado a proteína G (GPCR) . GPCR são um dos principais alvos de acção e desenvolvimento de fármaco. De facto, os receptores têm levado a mais da metade dos fármacos actualmente conhecidos (Drews, Nature Biotechnology, 14:1516, 1996) e GPCR representam o mais importante alvo de intervenção terapêutica com 30% de fármacos clinicamente prescritos ou antagonistas ou agonistas de um GPCR (Milligan, G. and Rees, S., TIPS, 20:118-124, 1999). Uma vez que estes receptores têm um histórico comprovado e estabelecido, como alvos terapêuticos, a produção de GPCR, de acordo com a presente invenção é também de especial 34 interesse .

Em geral, os profissionais da presente invenção, seleccionarão suas proteínas ou polipeptidios de interesse, e conhecerão a sua sequência de aminoácidos exacta. Qualquer polipéptido que é para ser expresso, de acordo com a presente invenção, tem suas próprias caracteristicas particulares e que pode influenciar a densidade das células ou a viabilidade das células cultivadas, e pode ser expresso em niveis mais baixos que outro polipéptido ou proteínas cultivadas sob as mesmas condições de cultura. Um perito na especialidade será capaz de adequadamente modificar meios e métodos inventivos descritos no presente documento, com a finalidade de otimizar o crescimento celular, titulação, dobramento ou qualquer outra propriedade de um polipéptido ou proteína expressos.

Um perito na especialidade será consciente de outras proteínas úteis e/ou desejáveis que podem ser expressas de acordo com os métodos e composições da presente invenção.

Linhas de células podem ser cultivadas usando uma variedade de técnicas para produzir a proteína desejada. A cultura de células pode ser feita em pequena ou grande escala, dependendo da finalidade do meio de cultura de células ou a utilização do produto. Por exemplo, as células podem ser crescidas num bioreator. Em certas formas de realização, o volume do biorreator é, pelo menos, 1 litro e pode ser de 10, 100, 250, 500, 1.000 , 2.500 , 5.000 , 8.000 , 10.000 e 12.000 litros, ou mais, ou em qualquer volume entre estes. Além disso, os biorreatores que podem ser utilizados incluem, mas não estão limitados a, um biorreator de tanque agitado , reator de leito fluidificado, biorreator de fibra oca ou frascos cilnindricos. Os sistemas podem operar também num modo em batelada, alimentação descontínua ou contínuo/perfusão. O bioreator e o modo em que controlar e monitorizar o meio de cultura de células será conhecido por um perito ordinário 35 na especialidade de cultura de células. No presente exemplo, o sistema utilizado é um biorreator de tanque agitado operado no modo de alimentação descontinua. 0 biorreator é geralmente semeado com um meio de inoculação e uma linha celular escolhida, por exemplo, uma linha de células de proteina de fusão TNFR, que pode ser transfectada estavelmente para expressar e produzir a proteina desejada. Meios comercialmente disponíveis, como meio minimo essencial (MEM Médio, Sigma), Ham's FIO (Sigma), ou meio de Eagle modificado por Dulbecco (DMEM, Sigma) podem ser utilizados como meio base. Estes meios podem ser suplementados com aminoácidos, vitaminas, oligoelementos, e/ou outros componentes para produzir os meios de inoculo ou alimentação utilizados durante o ciclo de produção. Em certas formas de realização, um meio base é alterado para permitir o crescimento robusto das células, a fim de aumentar a viabilidade celular, aumentar a produtividade celular, para aumentar densidade de células viáveis integradas e/ou para melhorar a qualidade da proteina produzida na presença de carnosina. Por exemplo, uma meio de base pode ser suplementado com piruvato, oxaloacetato e/ou α-cetoglutarato. Um perito na especialidade será capaz de alterar o meio base para utilização com métodos e composições da presente invenção sem experimentação indevida.

Em certas formas de realização, as células são cultivadas em qualquer de uma variedade de meios quimicamente definidos contendo um composto anti-senescência, no qual os componentes dos meios são conhecidos e controlados. Por exemplo, meios definidos normalmente não contêm aditivos complexos, tais como soro ou hidrolisados. Em certas formas de realização, as células são cultivadas em qualquer um de vários meios complexos contendo um composto anti-senescência, em que nem todos os componentes do meio são conhecidos e/ou controlados. Em 36 certas formas de realização, tal composto anti-senescência compreende carnosina.

As condições do biorreator são controladas normalmente, com o pH ajustado entre cerca de 6,5 e cerca de 7,5. 0 pH é ajustado usando um ácido, geralmente CO 2, ou uma base, tal como bicarbonato de sódio. 0 oxigénio dissolvido é controlado entre cerca de 5 e 90% da saturação do ar e a temperatura é mantida entre 30 °C e 42 °C, durante a fase de crescimento. Umpnerito na especialidade de cultura de células pode modificar as condições do bioreator com base na linha de células e métodos que estão a ser utilizados para alcançar os resultados desejados sem experimentação indevida.

Composições e métodos da presente invenção podem ser usados com qualquer método ou sistema de cultura de células que seja propicio para a expressão de proteínas. Por exemplo, células que expressam a proteína de interesse pode ser cultivada em culturas em batelada ou alimentação descontínua, onde a cultura é terminada após suficiente expressão da proteína, após o qual a proteína expressa é colhida e purificada, opcionalmente. Alternativamente, células que expressam a proteína de interesse pode ser cultivadas em culturas de perfusão, onde a cultura não é terminada e novos nutrientes e outros componentes são periodicamente ou continuamente adicionadas à cultura, durante a qual a proteína expressa é periodicamente ou permanentemente colhida.

Após as células serem semeadas, passam por uma fase de crescimento durante a qual o número de células geralmente aumenta exponencialmente. Durante a fase de crescimento, a temperatura ou intervalo de temperaturas da cultura de células será seleccionado com base, principalmente, nas temperaturas ou intervalo de temperaturas em que a cultura de células se mantém viável, em que um elevado nível de proteína é produzida, em que a produção ou acúmulo de 37 resíduos de produtos metabólicos é minimizada, e/ou qualquer combinação destes ou de outros factores considerados importantes pelo médico. Como um exemplo não-limitante, células CHO crescem bem e produzem níveis elevados de proteína a aproximadamente 37 °C. De um modo geral, a maioria das células de mamíferos crescem bem e/ou podem produzir níveis elevados de proteína dentro de um intervalo de cerca de 25 °C a 42 °C, embora os métodos ensinados pela presente divulgação não se limitam a estas temperaturas. Certas células de mamíferos crescem bem e/ou podem produzir altos níveis de proteína na intervalo de cerca de 35 °C a 40 °C. Em certas formas de realização, a cultura de células é cultivada a uma temperatura de 20, 21, 22, 23, 24, 25, 26, 27, 28, 29, 30, 31, 32, 33, 34, 35, 36, 37, 38, 39, 40, 41, 42, 43, 44 ou 45 °C, num ou mais momentos durante a fase de crescimento. Um perito na especialidade será capaz de seleccionar temperatura adequada ou intervalo de temperaturas na qual crescer as células, dependendo das necessidades das células e as condições de produção do médico.

Após a fase de crescimento é uma fase de transição durante a qual as células se adaptam a quaisquer mudanças que ocorram nos arredores, tais como uma mudança de temperatura. As mudanças que ocorrem são normalmente parâmetros para a fase de produção. Nos presentes exemplos, no dia 4, a temperatura diminuiu de cerca de 37 °C a 31 °C. A alteração de temperatura, no entanto, pode ocorrer mais de uma vez e não precisa necessariamente ir em sentido descendente. Além disso, a fase de transição e alteração da temperatura pode ocorrer em qualquer dia durante o ciclo de produção. Embora a maioria dos métodos de produção incluam processos multi-fase, a carnosina também podem ser utilizada num processo de fase única.

Quando se altera temperatura da cultura, a alteração de temperatura pode ser relativamente gradual. Por exemplo, 38 pode levar várias horas ou dias para completar a mudança de temperatura. Como alternativa, a alteração de temperatura pode ser relativamente abrupta. A temperatura pode ser continuamente aumentada ou diminuida durante o processo de cultura. Como alternativa, a temperatura pode ser aumentada ou diminuida em quantidades diferentes várias vezes durante o processo de cultura. A(s) temperatura(s) ou intervalo (s) de temperaturas subsequente (s) pode(m) ser inferior(es) ou superior (es) à temperatura (s) ou intervalo (s) de temperaturas inicial (is) ou anterior (es) . Um perito na especialidade vai entender que várias alterações de temperatura diferentes estão englobadas nas formas de realização. Por exemplo, a temperatura pode ser alterada uma vez (ou a uma maior ou menor temperatura ou intervalo de temperatura), as células mantidas nessa temperatura ou intervalo de temperatura durante um determinado período de tempo, após o qual a temperatura pode ser alterada novamente para uma nova temperatura ou intervalo de temperatura, que pode ser mais alta ou mais baixa que a temperatura ou intervalo de temperatura da temperatura ou intervalo de temperatura anterior. A temperatura da cultura após cada alteração diferente pode ser constante ou pode ser mantida dentro de um certo intervalo de temperaturas.

Finalmente, há a fase de produção em que o número de células não aumenta substancialmente, mas as células produzem a proteína desejada, um perito na especialidade , no entanto, compreenderá que, em certas formas de realização, as células podem continuar a crescer e aumentar em número durante a fase de produção. Durante esta fase, o ambiente do biorreator é controlado em condições em que as células são mais susceptíveis de serem mais produtivos. Por exemplo, a temperatura geralmente é mantida a uma temperatura diferente da fase de crescimento, que é propícia para a produção de uma proteína, por exemplo, 31 °C. Durante todo o ciclo de produção, as células podem ser 39 alimentadas comum meio de apresentação contendo nutrientes e suplementos que as células podem precisar. Por exemplo, em certos casos, pode ser benéfico ou necessário suplementar a cultura de células durante a subsequente fase de produção com nutrientes ou outros componentes do meio que foram esgotados ou metabolizados pelas células. Como exemplos não limitantes, pode ser benéfico ou necessário suplementar a cultura celular com hormonas e/ou outros factores de crescimento, iões particulares (tais como sódio, cloro, cálcio, magnésio e fosfato), tampões, vitaminas, nucleósidos, ou nucleótidos, elementos-traço (compostos inorgânicos presentes geralmente em concentrações finais muito baixas), aminoácidos, lípidos, glicose ou outra fonte de energia, e combinações dos mesmos. Esses componentes suplementares podem todos ser adicionados à cultura de células de uma só vez, ou podem ser fornecidos à cultura de células numa série de adições. Em certas formas de realização, um composto anti-senescência é fornecido num meio de alimentação numa ou mais vezes durante a fase de produção.

De acordo com determinadas formas de realização, a utilização de um composto anti-senescência, por exemplo carnosina, no meio de cultura de células durante a fase de produção, se fornecida num meio de inoculação ou meio de alimentação, aumenta a viabilidade celular e/ou a produção de proteínas específicas, melhorando assim o rendimento global de proteína.

Os aspectos de um processo produção de proteínas são determinados por um perito na especialidade de cultura de células. Os parâmetros, tais como a densidade de sementes, duração da cultura de produção, condições de operação durante a colheita, entre outros, incluindo os mencionados acima são funções da linha de células e do meio de cultura de células. Por conseguinte, os parâmetros podem ser determinados sem experimentação indevida por parte de uma 40 pessoa ordinária de especialidade em cultura de células.

Como com a temperatura ou intervalo de temperaturas durante a fase de crescimento, a temperatura ou intervalo de temperaturas da cultura de células durante a fase de produção será seleccionado com base principalmente na temperatura ou intervalo de temperatura em que a cultura de células se mantém viável, em que um alto nivel de proteina é produzida, em que a produção ou acúmulo de residuos de produtos metabólicos é minimizada, e/ou qualquer combinação destes ou de outros factores considerados importantes pelo médico. De um modo geral, a maioria das células de mamíferos permanecem viáveis e produzem niveis elevados de proteina dentro de um intervalo de cerca de 25 °C a 42 °C, embora os métodos ensinados pela presente divulgação não sejam limitados a estas temperaturas. E certas formas de realização, as células de mamíferos permanecem viáveis e produzem altos niveis de proteina no intervalo de cerca de 25°C a 35°C. Em certas formas de realização, a cultura de células é cultivada a uma temperatura de 20, 21, 22, 23, 24, 25, 26, 27, 28, 29, 30, 31, 32, 33, 34, 35, 36, 37, 38, 39, 40, 41, 42, 43, 44 ou 45 °C, num ou mais momentos durante a fase de produção. Um perito na especialidade será capaz de seleccionar temperatura adequada ou intervalo de temperaturas na qual crescer as células durante a fase de produção, dependendo das necessidades particulares das células e os requisitos particulares de produção do médico. As células podem ser cultivadas em qualquer periodo de tempo, de'pendendo das necessidades do praticante e os requerimentos das próprias células.

Em certas formas de realização, as culturas em batelada ou alimentação descontinua são terminadas quando a cultura atinge uma ou mais condições de cultura relevantes, como determinado pelas necessidades do praticante. Em certas formas de realização, as culturas em batelada ou alimentação descontinua são terminadas uma vez que a 41 proteína expressa atinge um nível suficientemente elevado, uma vez que a densidade celular atinge um nível suficientemente elevado, uma vez que a proteína expressa atinge uma densidade celular suficientemente elevada, e/ou para evitar produção ou acúmulo de resíduos de produtos metabólicos indesejáveis (por ex., lactato e/ou amónio). Um perito na especialidade será consciente de outras condições de cultura que podem ser utilizadas para determinar quando uma cultura em batelada ou alimentação descontínua deve ser terminada, com base em considerações experimentais, comerciais, e/ou outras considerações.

Em certas formas de realização, na sequência de um ciclo de produção, o produto de proteína é recuperado a partir do meio de cultura de células e isolado adicionado utilizando técnicas de separação tradicionais. Por exemplo, a proteína pode ser inicialmente separado por centrifugação, retendo o sobrenadante contendo a proteína. Além disso ou, em alternativa, o produto de proteína pode ser ligado à superfície da célula hospedeira. Em tais formas de realização, o meio é removido e as células hospedeiras que expressam a proteína são lisadas, como uma primeira etapa no processo de purificação. A lise das células hospedeiras mamífero pode ser alcançada através de qualquer número de meios conhecidos por um perito na especialidade, incluindo rompimento físico por esferas de vidro e exposição a condições de pH alto.

Utilizando métodos convencionais de purificação de proteínas, a proteína pode ser adicionalmente isolada. Métodos para isolar e purificar o produto de proteína desejado são conhecidos dentro da especialidade de cultura de células. Métodos específicos dependem da linha de células utilizada e o produto procurado. 0 composto anti-senescência, por exemplo, carnosina pode ser adicionado ao meio de cultura num momento ideal para o processo de cultura celular. Para os presentes 42 exemplos, a adição de carnosina ocorre após a fase de crescimento está substancialmente completa e estar em fase de transição. Durante a adição, o meio de cultura de células está se adaptando à nova temperatura resultante da alteração de temperatura. A fase de transição é geralmente quando os agentes são adicionados para ajudar a iniciar a fase de produção. A carnosina, no entanto, podem ser adicionadas a qualquer momento durante o ciclo de produção que gera ótimos resultados, incluindo a fase de crescimento e a fase de produção. A carnosina também pode ser adicionada em combinação com outros componentes, como um meio de alimentação. Em certas formas de realização, um composto anti-senescência é fornecido num meio de inoculação e está presente na cultura de células durante todo o processo de cultura celular. Em certas formas de realização, de dois ou mais compostos anti-senescência são fornecidos no meio de cultura de células. Em certas formas de realização, dois ou mais compostos anti-senescência é fornecido num meio de inoculação e estão presentes na cultura de células durante todo o processo de cultura celular. Em certas formas de realização, dois ou mais compostos anti-senescência, em que um composto anti-senescência é fornecido num meio de inoculação e está presente na cultura de células durante todo o processo de cultura de célula, enquanto o outro composto anti-senescência é fornecido após a cultura de células ter começado.

Em certas formas de realização, a concentração de um composto anti-senescência presente na cultura de células é diferente para os vários tipos de células e produtos. Em certas formas de realização, a concentração de carnosina presente é diferente para os diferentes tipos de células e produtos. Em geral, a concentração é suficiente para aumentar a produtividade e a qualidade sem efeitos tóxicos. Para os presentes exemplos, a intervalo inclui, mas não 43 está limitado a, de 5 mM a 100 mM. Será apreciado que a concentração de carnosina utilizada pode variar dependendo do meio de cultura de células. A concentração adequada de carnosina para uma determinada linha de células pode precisar ser determinada com experiências de rotina em pequena escala, tais como, por exemplo, um biorreator de 2 L, utilizando métodos convencionais. Um perito na especialidade será capaz de determinar uma concentração vantajosa ou ideal de carnosina ou outros compostos anti-senescência sem experimentação indevida usando técnicas de cultura celular e métodos de diaqnóstico que são conhecidos na especialidade.

Uma vantagem de adicionar carnosina ou outro composto anti-senescência, em vez de agentes químicos, é o efeito sobre a viabilidade. Em geral, o crescimento celular cessa e o número de células viáveis diminui com a adição de um agente químico, como butirato de sódio. (Kim et ai. Biotechnol Bioeng, 71: 184-193.184). Os exemplos abaixo, no entanto, demonstram que a adição de carnosina a um meio de cultura de células resulta em maior viabilidade no momento da colheita do que é observada numa cultura de células crescida na ausência de composto anti-senescência, tal como carnosina. Além disso, tais -culturas de células contendo carnosina apresentam um aumento na produtividade. Com os efeitos positivos sobre a viabilidade celular e produtividade específica, o rendimento global é maior.

Outra vantagem é que o composto anti-senescências, tal como a carnosina diminui a quantidade de agregados de alto peso molecular e/ou o número de espécies ácidas. Diminuir a quantidade de agregados de alto peso molecular e espécies ácidas simplifica a purificação do produto de proteína. Permitir que a proteína seja isolada de forma mais eficiente diminui o custo de produzir o produto de proteína. Em certas formas de realização, um composto anti-senescência, tal como carnosina, é utilizado para diminuir 44 a quantidade de proteínas com enrolamento incorreto e/ou agregadas. Em certas formas de realização, um composto anti-senescência diferente de carnosina é usado para diminuir a quantidade de agregados de alto peso molecular e/ou espécies ácidas. Em certas formas de realização, de dois ou mais compostos anti-senescência são utilizados para diminuir a quantidade de agregados de alto peso molecular e/ou espécies ácidas.

Em certas formas de realização, as células são cultivadas de acordo com qualquer um dos métodos de cultura de células descritos pedidos de patente dos Estados Unidos n° Série 11/213.308 /11, 213.317 /11 e 213.633 cada um dos quais foi depositado em 25 de Agosto de 2005. Por exemplo, em certas formas de realização, as células podem ser cultivadas num meio de cultura em que a concentração de aminoácido cumulativa é maior do que cerca de 7 0 mM. Em certas formas de realização, as células podem ser cultivadas num meio de cultura em que a rácio molar de glutamina cumulativa para asparagina cumulativa é inferior a cerca de 2. Em certas formas de realização, as células podem ser cultivadas num meio de cultura em que a rácio molar de glutamina cumulativa para aminoácido total cumulativa é inferior a cerca de 0,2. Em certas formas de realização, as células podem ser cultivadas num meio de cultura em que a rácio molar de ião inorgânico cumulativo para aminoácido total cumulativa é entre cerca de 0,4 a 1. Em certas formas de realização, as células podem ser cultivadas num meio de cultura em que a concentração combinada de glutamina cumulativa e asparagina cumulativa é entre cerca de 16 e 36. mM. Em certas formas de realização, as células podem ser cultivadas em meio de cultura que contém duas, três, quatro ou todas as cinco das condições de meio anteriores. Utilização de tais meios permite altos niveis de produção de proteinas e diminui acúmulo de certos factores indesejáveis, tais como de amónio e/ou lactato. 45

Em algumas formas de realização, as células são cultivadas numa ou mais das condições descritas nos pedido de patente Provisória dos Estados Unidos n° de Série 60/830.658, depositada em 13 de Julho de 2006. Por exemplo, em alguns formas de realização, as células são cultivadas num meio de cultura que contém manganês, numa concentração entre aproximadamente 10 e 600 nM. Por exemplo, em alguns formas de realização, as células são cultivadas num meio de cultura que contém manganês, numa concentração entre aproximadamente 20 e 100 nM. Por exemplo, em alguns formas de realização, as células são cultivadas num meio de cultura que contém manganês, numa concentração de aproximadamente 40 nM. A utilização de tais meios na cultura glicoproteínas resulta na produção de uma glicoproteina com um melhor padrão glicosilação (por exemplo, um número maior de residuos de açúcar ligados covalentemente numa ou mais cadeias oligossacarideos).

Em certas formas de realização de invenção, as proteínas produzidas de acordo com um ou mais métodos da presente invenção terão atividade farmacológica e serão úteis para a preparação de produtos farmacêuticos. As proteínas produzidas de acordo com um ou mais métodos da presente invenção pode ser administrados a um indivíduo ou pode primeiro ser formulado para administração por qualquer rota disponível incluindo, mas não limitado a rotas parentérica (intravenosa) , por exemplo, intradérmica, subcutânea, oral, nasal, brônquica, oftálmica, transdérmica (tópica), transmucosa, rectal e vaginal. As composições farmacêuticas inventivas geralmente incluem uma proteína purificada expressa a partir de uma linha de células de mamíferos, um agente de entrega (ou seja, um polímero catiónico, transportador molecular de péptido , tensioactivo, etc., conforme descrito acima) em combinação com um portador farmaceuticamente aceitável. Como é usado no presente documento a linguagem "portador 46 farmaceuticamente aceitável" inclui solventes, meios de dispersão, revestimentos, agentes antibacterianos e antifúngicos, agentes retardantes de absorção e isotônicos, e semelhantes, compatíveis com a administração farmacêutica. Compostos ativos complementares também podem ser incorporados nas composições.

Uma composição farmacêutica é formulada para ser compatível com a sua via de administração pretendida. Tais formulações serão conhecidas por aqueles de competência na arte. Em certas formas de realização, uma proteína produzida de acordo com a presente invenção é formulada em forma oral e/ou parentérica. Em certas formas de realização, para facilitar a administração e uniformidade de dosagem, tais formas orais e/ou parentéricas são formuladas, como forma farmacêutica unitária, em que cada unidade contém uma quantidade predeterminada de proteínas activas calculada para produzir o efeito terapêutico desejado em associação com o portador farmacêutico requerido. Um perito na especialidade será consciente das formulações de dosagem unitária adequadas para as proteínas produzidas de acordo com a presente invenção.

Certas formas de realização e aspectos são discutidos em detalhes acima. A presente divulgação é ainda ilustrada pelos seguintes exemplos não limitantes. Um perito na especialidade vai entender, no entanto, que diversas modificações a estas formas de realização estão dentro do âmbito das reivindicações anexas. É de notar que a adição de carnosina e/ou outros compostos anti-senescência é igualmente aplicável a outras culturas de células demamíferos e produtos de proteína. São as reivindicações e equivalentes das mesmas o que definem o âmbito da presente invenção, que não é, e não deve ser limitado a ou por esta descrição de certas formas de realização.

EXEMPLOS

Exemplo 1: Experimentos de carnosina em escala de placa 47

Uma linha de células MYO-29 foi cultivada num meio de produção sem soro num bioreator com um e volume de trabalho d 1 L e a temperatura foi mudade de 37 °C para 31 °C no dia 4. 0 pH do biorreator foi mantido em 7,00 e o oxigénio dissolvido foi a 30 % de saturação do ar. Meio de cultura de células foi então tomado do biorreator no dia 4, dia 7 e dia 10 e colocados em placas de cultura com um volume de trabalho de 8 ml e colocados numa incubadora a 31 °C, onde as culturas em placas foram cultivadas até dia 12. As células foram suplementadas com um meio de alimentação nos dias 5 e 7. No dia 5, 10% (v/v) do meio de alimentação foi adicionado às culturas de células e no dia 7, 5% (v/v) de meio de alimentação foi adicionado às culturas de células. 10 mM de carnosina foi adicionada no dia 4, dia 7 e dia 10, respectivamente, às placas e o meio de cultura de células foi colhido no dia 12. A Figura la mostra o efeito das adições de carnosina sobre a quantidade dos picos ácidos na cultura no dia 7. A figura 1 b mostra o efeito da carnosina nos agregados de alto peso molecular no dia 7 de cultura. A Figura lc ilustra o efeito das adições carnosina no dia 4, versus 7 dia, versus dia 10 sobre os picos ácidos. A Figura ld mostra os mesmos resultados de experimento, mas para agregados de alto peso molecular. Em geral, carnosina, teve um efeito positivo, reduzindo tanto os picos ácidos como os agregados de alto peso molecular em placas cultivadas. Exemplo 2: Efeitos da adição de carnosina ao meio de cultura de células

Cinco biorreatores foram inoculados com 0,9 xlO 6 células/ml, com volume de trabalho de 1 L de um linha de células MYO-29 num meio de inoculação sem soro. Todos os biorreatores foram alimentados com 5% (v/v) de um meio de alimentação nos dias 3, 5, 7, e 12 de um ciclo de 14 dias. Uma alimentação no dia 10 de 5% (v/v) do meio de alimentação foi adicionada a dois dos biorreatores de 48 controlo e um contendo carnosina. As condições dos biorreatores foram mantidas a uma temperatura de 37 °C, pH de 7,00, e um nivel de oxigénio dissolvido a 30% saturação do ar. A taxa de agitação foi de 200 rpm e o gás de pulverização tinha uma combinação de ar e 7% de dióxido de carbono.

Todas as células foram cultivadas durante 4 dias em cujo ponto 20 mM de carnosina foi adicionado a dois dos biorreatores, os controlos não tinham carnosina adicionada, e a temperatura foi mudada para 31 °C em todos os biorreatores no dia 4 também. Os biorreatores foram colhidos no dia 14 do ciclo de produção. Amostras foram tomadas em todo o ciclo para monitorizar o progresso do meio de cultura de células. Os controlos foram realizados conforme o esperado. A Figura 2a mostra a densidade de células viáveis diariamente. A Figura 2b mostra que a viabilidade celular diária dos biorreatores com carnosina foi maior após a colheita quando comparado com dois biorreatores sem ela. A Figura 2c mostra a titulação diária dos biorreatores e que os dois biorreatores com carnosina presentes tiveram maior titulação no momento da colheita. As culturas com carnosina tiveram melhor produtividade celular especifica cumulativa mostrada na figura 2d. A Figura 2e mostra a quantidade de agregados de alto peso molecular e mostra uma diminuição dos agregados de alto peso molecular em biorreatores com carnosina presente.

Exemplo 3: Efeito de diferentes concentrações de adições de carnosina

Quatro biorreatores foram inoculados com 0,4 xlO 6 células/ml, com volume de trabalho de 1 L de uma linha de células MYO-29 num meio de inoculação sem soro. Todos os biorreatores foram todos alimentados com 5% (v/v) de um meio de alimentação no dia 7 do ciclo de 14 dias. As condições do biorreator foram mantidas a uma temperatura de 49 37 °C, pH de 7,00, e um nível de oxigénio dissolvido a 30% saturação do ar. A taxa de agitação foi de 200 rpm e o gás de pulverização tinha uma combinação de ar e 7% de dióxido de carbono.

Todas as células foram cultivadas durante um período de quatro dias em cujo ponto a temperatura foi alterada em todos os biorreatores a 31 °C. Também no dia 4, 20 mM de carnosina foi adicionado a um biorreator, um segundo tinha 40 mM de carnosina adicionado, e os controlos, não tiveram qualquer carnosina adicionada. Todos os biorreatores foram colhidas no dia 12 do ciclo de produção. Amostras foram tomadas em todo o ciclo para monitorizar o progresso do meio de cultura de células. Os controlos se comportaram em geral, como era esperado, com a exceção de um controlo que teve viabilidades diárias um pouco menores que o anteriormente visto. A Figura 3a mostra a densidade de células viáveis diárias, os diferentes bioreatores são bastante semelhantes, com a exceção do biorreator com 4 mM de carnosina. A Figura 3b mostra que a viabilidade celular diária dos biorreatores com carnosina tinha uma maior viabilidade após ser colhida em comparação com dois biorreatores de controlo sem ela. A Figura 3c mostra a titulação diária; os biorreatores com as adições de carnosina e um dos controlos foram semelhantes. O bio-reactor com 40 mM de carnosina teve maior produtividade celular específica cumulativa. (Figura 3d) . A Figura 3e mostra a quantidade de agregados de alto peso molecular; em geral, há uma diminuição de agregados de alto peso molecular com as adições de carnosina em comparação com os controlos.

Exemplo 4: Utilização de carnosina em cultura de células de mamíferos para melhorar as características do produto de uma proteína de fusão TNFR recombinante

Uma linha de células de proteína de fusão TNFR foi 50 cultivadas num meio de produção sem soro num biorreator com um volume de trabalho de 1 L. No dia 1, a temperatura foi alterada de 37 °C para 29,5 °C, butirato de sódio foi adicionado a uma concentração final de 1 mM, e HMBA foi adicionado a uma concentração final de 3 mM. O pH do biorreator foi mantido em 6,95 e o oxigénio dissolvido foi a 60% de saturação do ar. No dia 2, carnosina foi adicionada à cultura a uma concentração final de 20 mM. As células foram suplementados com 5% (v/v) de meio de alimentação nos dias 3, 6, 8, e 10. O meio de cultura de células foi colhido no dia 12. Quatro biorreatores de controlo separados foram executados em que células CHO expressando uma proteína de fusão TNFR recombinante foram cultivadas sob condições idênticas às descritas acima, exceto que a carnosina não foi adicionada no dia 2. Os dados de controlo nas Figuras 4-11 é a média dos quatro ciclos do biorreator de controlo.

Como pode ser visto nas figuras 4 e 5, o crescimento celular e a viabilidade celular não foram significativamente afectados pela adição de carnosina. A Figura 6 mostra que a quantidade de proteína de fusão TNFR com enrolamento incorreto e/ou agregada, tal como medido por cromatografia de interacção hidrofóbica (HIC), foi significativamente reduzida quando as células foram cultivadas em meio de cultura contendo carnosina. A Figura 7 mostra que a quantidade de agregados de alto peso molecular (HMW), tal como medido por cromatografia por exclusão de tamanho (SEC), também foi significativamente reduzida quando as células que expressam a proteína de fusão TNFR foram cultivadas em meio de cultura contendo carnosina. As Figuras 8 e 9 mostram que a titulação do produto e a produtividade celular específica, respectivamente, foram aumentadas quando as células que expressam a proteína de fusão TNFR foram cultivadas em meio de cultura contendo carnosina. Finalmente, as figuras 10 e 51 11 mostram que a glicosilação do proteína de fusão TNFR produzida não foi significativamente diferente quando as células foram cultivadas em meio de cultura contendo carnosina.

Embora a alguns formas de realização da divulgação tenham sido descritas no presente documento, a descrição acima é meramente ilustrativa. A modificação das formas de realização divulgadas no presente documento poderão ocorrer para os peritos na especialidade de cultura de células e todas essas modificações são consideradas no âmbito das formas de realização, como definido pelas reivindicações anexas. 52

DOCUMENTOS REFERIDOS NA DESCRIÇÃO

Esta lista de documentos referidos pelo autor do presente pedido de patente foi elaborada apenas para informação do leitor. Não é parte integrante do documento de patente europeia. Não obstante o cuidado na sua elaboração, o IEP não assume qualquer responsabilidade por eventuais erros ou omissões.

Documentos de patente referidos na descrição US 60913382 B [0001] US 20030118592 A [0058] US 20030133939 A [0058] US 20040058445 A [0058] US 20050136049 A [0058] US 20050175614 A [0058] US 20050180970 A [0058] US 20050186216 A [0058] US 20050202012 A [0058] US 20050202023 A [0058] US 20050202028 A [0058] US 20050202534 A [0058] WO 9404678 A [0059] WO 2004037861 A [0082] EP 417563 A [0092] EP 417014 A [0092] US 11213308 B [0116] US 11213317 B [0116] US 11213633 B [0116] US 60830658 B [0117] com patentes referida na relacionada

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Claims (23)

1 REIVINDICAÇÕES 1. Um método para produzir uma proteína de fusão TNFR em cultura de células que compreende as etapas de: cultivar células de mamíferos que contêm um gene que codifica a proteína de fusão TNFR, cujo gene é expresso em condições de cultura de células, num meio de cultura de células que compreende um composto anti-senescência, em que o composto anti-senescência é seleccionado a partir do grupo que consiste em carnosina, acetil-carnosina, homo-carnosina, anserina, e beta-alanina e combinações dos mesmos e em que o composto anti-senescência está presente no meio de cultura de células numa concentração entre cerca de 5 mM e cerca de 100 mM; e manter a cultura em condições e durante um tempo suficiente para permitir a expressão da proteína, em que a cultura de células exibe uma melhor característica de cultura de células que difere de uma característica de cultura de célula correspondente que seria observada sob condições idênticas num meio idêntico que não tem o composto anti-senescência, em que a melhor melhor característica de cultura é seleccionada a partir do grupo que consiste em: aumento do título, produtividade celular específica aumentada, acumulação diminuída de agregados de peso molecular elevado, acumulação diminuída de espécies ácidas e combinações dos mesmos.

2. O método de acordo com a reivindicação 1, em que o composto anti-senescência compreende carnosina.

3. O método de acordo com qualquer uma das reivindicações 1-2, em que a cultura de células é ainda fornecida com componentes suplementares.

4. O método de acordo com a reivindicação 3, em que os 2 componentes suplementares são fornecidos num meio de alimentação.

5. 0 método de acordo com a reivindicação 3 ou 4, em que os componentes suplementares são seleccionados a partir do grupo que consiste em hormonas e/ou outros factores de crescimento, iões particulares (tais como sódio, cloro, cálcio, magnésio e fosfato), tampões, vitaminas, nucleósidos, ou nucleótidos, elementos traço (compostos inorgânicos presentes geralmente em concentrações finais muito baixas), aminoácidos, lípidos, glicose ou outra fonte de energia, e combinações dos mesmos.

6. Um método para produzir uma proteína de fusão TNFR que compreende as etapas de: cultivar células de mamíferos que contêm um gene que codifica a proteína de fusão TNFR num meio de cultura de células, cujo gene é expresso em condições de cultura de células, a uma primeira temperatura ou intervalo de temperatura favorável para o crescimento celular durante a fase de crescimento; mudar a temperatura ou intervalo de temperatura do meio de cultura de células para uma segunda temperatura ou intervalo de temperatura favorável à produção de proteínas; cultivar as células hospedeiras em meio de cultura de células à segunda temperatura ou no intervalo de temperatura através de uma fase de transição até uma fase de produção, em que um composto anti-senescência é adicionado à cultura de células e tal que a cultura de células apresenta uma melhor característica de cultura de células que difere de uma característica de cultura de células correspondente que seria observada sob condições idênticas num meio idêntico que não tem composto anti-senescência, em que o composto anti-senescência é seleccionado a partir do grupo que consiste em carnosina, 3 acetil-carnosina, homo-carnosina, anserina, e beta-alanina e combinações dos mesmos, em que o composto anti-senescência está presente no meio de cultura de células a uma concentração entre cerca de 5 mM e cerca de 100 mM, e em que a melhor caracteristica de cultura de células é seleccionada a partir do grupo que consiste em: titulo aumentado, maior produtividade celular especifica, acumulação diminuida de agregados de peso molecular elevado, acumulação diminuida de espécies ácidas e combinações dos mesmos.

7. O método de acordo com a reivindicação 6, em que o composto anti-senescência é adicionado ao meio de cultura de células no inicio do processo de cultura celular.

8. O método de acordo com a reivindicação 6 ou 7, em que o composto anti-senescência é adicionado ao meio de cultura de células durante a fase de crescimento.

9. O método de acordo com a reivindicação 6, 7 ou 8, em que o composto anti-senescência é adicionado ao meio de cultura de células durante a fase de transição.

10. O método de acordo com a reivindicação 6 -9, em que o composto anti-senescência é adicionado ao meio de cultura de células durante a fase de produção.

11. O método de acordo com a reivindicação 6, em que o composto anti-senescência compreende carnosina.

12. O método de acordo com com a reivindicação 11, em que a cultura de células é ainda fornecida com componentes suplementares.

13. O método de acordo com a reivindicação 12, em que os 4 componentes suplementares são fornecidos num meio de alimentação.

14. 0 método de acordo com a reivindicação 12 ou 13, em que os componentes suplementares são seleccionados a partir do grupo que consiste em hormonas e/ou outros factores de crescimento, iões particulares (tais como sódio, cloro, cálcio, magnésio e fosfato), tampões, vitaminas, nucleósidos, ou nucleótidos, elementos traço (compostos inorgânicos presentes geralmente em concentrações finais muito baixas), aminoácidos, lípidos, glicose ou outra fonte de energia, e combinações dos mesmos.

15. 0 método de acordo com a reivindicação 12, 13 ou 14, em que os componentes complementares incluem um composto anti-senescência.

16. 0 método de qualquer uma das reivindicações anteriores, em que a proteína de fusão TNFR produzida é heteróloga em relação às células de mamíferos.

17. 0 método de acordo com qualquer uma das reivindicações anteriores, em que as células de mamíferos são células CHO.

18. 0 método de acordo com qualquer uma das reivindicações anteriores, em que a proteína de fusão TNFR compreende um TNFR-Fc.

19. 0 método de acordo com a reivindicação 18, em que o TNFR-Fc é etanercept.

20. Um método para a preparação de uma proteína de acordo com qualquer uma das reivindicações anteriores, que compreende ainda a etapa de isolar a proteína a partir do meio de cultura de células. 5

21. Um método de acordo com a reivindicação 20, em que a proteína é ainda purificada ou processada para formulação.

22. Um método de acordo com a reivindicação 21, em que a proteína é formulada numa composição farmacêutica.

23. Um método para a preparação de uma proteína de acordo com qualquer uma das reivindicações anteriores, em que os agregados de peso molecular elevado compreendem proteínas com enrolamento incorreto.