KR20100016271A - 항노화 화합물을 사용하는 단백질의 생산 방법 - Google Patents

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Abstract

본 발명은 항산화제 카르노신과 같은 항노화 화합물을 포함하는 세포 배양에서 단백질을 생성하는 방법을 제공한다. 본 발명의 교시내용에 따르면, 항노화 화합물을 포함하는 세포 배양 배지 중에 성장한 세포는 생존능력 및 생산성 증가를 나타낸다. 또한, 항노화 화합물의 존재하에 성장한 세포 배양물은 세포 배양 배지 중의 고분자량 응집체의 수준 감소를 나타낸다.

Description

항노화 화합물을 사용하는 단백질의 생산 방법{METHODS OF PROTEIN PRODUCTION USING ANTI-SENESCENCE COMPOUNDS}
관련 출원에 대한 상호 참증
본원은 2007년 4월 23일자에 출원된 미국 가출원 번호 제60/913,382호와 동시계류되어 있고, 1명 이상의 공통의 발명자를 공유하며, 이에 대해 우선권을 주장하고, 이의 내용은 이의 전체로 본원에 참조문헌으로 인용된다.
본 개시내용은 일반적으로 포유류 세포 배양에서 단백질의 생성에 관한 것이다. 특히 본 개시내용은 카르노신과 같은 항노화 화합물의 존재하에 포유류 세포를 배양하여, 생존능력을 유지시키고 더 우수한 품질로 생산성을 증가시키는 것에 관한 것이다. 세포 배양은 많은 단백질산물을 생성시킨다. 이러한 단백질산물, 예컨대 하이브리도마-생성된 단클론 항체는 치료, 연구 또는 다른 분야에서 사용할 수 있다. 동물 세포, 특히 포유류 세포는 단백질을 생성하기 위해 종종 사용된다. 불행하게도, 동물 세포를 사용하면 생성 과정이 시간 소모적이고 고비용이 되게 한다.
화학 제제를 세포 배양 배지에 첨가하면, 세포가 생산물을 생성하도록 유도함으로써 세포 생산성이 증가할 수 있고, 이로써 전체 수율이 증가될 수 있다. 사 용하기에 최적의 제제는 원하는 단백질산물 및 세포 유형을 비롯하여 수많은 인자에 따라 변한다. 제제가 세포 배양 배지에 첨가될 때 그 첨가되는 선택된 제제의 양에 유사한 인자가 또한 영향을 미친다. 제제의 예로는 알칸산, 알칸산 염, 우레아 유도체, 또는 디메틸설폭사이드(DMSO)가 있다. 부티르산 나트륨과 같은 화학 제제는 단백질 생성에 다양한 효과를 미칠 수 있다. 제제의 첨가는 세포의 특이적 생산성을 증가시킬 수 있지만, 또한 세포독성 효과를 갖고 세포 성장 및 생존능력을 억제할 수 있다.
세포가 단백질을 생성하면서, 통상적으로 단백질은 세포 배양 배지 내로 분비된다. 그러나, 특정 단백질은 배지 중의 유일한 물질이 아니고, 고분자량 응집체, 산성 종, 및 다른 물질도 또한 배지 중에 종종 존재하고, 이는 정제 과정을 보다 힘들고 비싸게 만들 수 있다. 무엇보다도, 생물반응장치의 조건을 변경하는 것 또는 상이한 세포주를 사용하는 것을 비롯하여, 보다 효율적인 단백질 정제를 가능하게 하는 기술 및 방법은 생산물 품질을 개선하기 위해 이용가능하다. 그러나, 그럼에도 불구하고 개선된 정제 과정을 이끄는 단백질 생성 기술 및 방법에 대한 필요성이 당해 분야에서 여전히 존재한다.
따라서, 필요한 것은 높은 세포 생존능력을 유지하면서 관심의 단백질의 발현을 향상시킬 수 있는 세포 배양 배지에 첨가되는 화학 제제이다. 추가로 필요한 것은 세포 배양 배지 중에 고분자량 응집체 및 산성 종의 양을 감소시킴으로써 단백질의 생산물 품질을 증가시키는 제제이다.
발명의 개요
특정한 실시양태에서, 본 개시내용은 향상된 단백질산물의 생산 방법에 관한 것이다. 예를 들면, 특정한 실시양태에서, 본 발명은 관심의 단백질의 전체 생성이 향상되도록 관심의 단백질을 발현하는 숙주 세포를 항노화 화합물을 포함하는 배지 중에서 배양하는 방법을 제공한다. 특정한 실시양태에서, 이러한 항노화 화합물은 카르노신을 포함한다.
특정한 실시양태에서, 본 발명은 관심의 단백질의 생성을 향상시키는 조성물을 제공한다. 다양한 단백질 중 임의의 단백질은 본 발명의 방법 및 조성물에 따라 생성될 수 있다. 예를 들면, 특정한 실시양태에서, 본 발명의 방법 및 조성물은 항체를 생성하도록 사용된다. 특정한 실시양태에서, 본 발명의 방법 및 조성물은 1 이상의 추가의 단백질 잔기에 임의로 연결된 수용체를 생성하도록 사용된다. 예를 들면, 본 발명의 방법 및 조성물은 TNFR 융합 단백질을 생성하도록 사용될 수 있다.
특정한 실시양태에서, 본 발명은 숙주 세포에서 발현된 관심의 단백질의 생성을 향상시키는 항노화 화합물을 포함하는 세포 배양 배지를 제공한다. 특정한 실시양태에서, 이러한 항노화 화합물은 카르노신을 포함한다. 특정한 실시양태에서, 유전 조작된 숙주 세포는 접종물 배지와 조합되어 생물반응장치 내에 성장하는 세포 배양 배지를 형성한다. 원하는 단백질산물의 생성 실행 동안, 생산성을 증가시키고/시키거나 생존능력을 유지시키기 위해 생물반응장치의 조건을 변경할 수 있고/있거나 보충물을 첨가할 수 있다. 보충물은 공급물 배지 및/또는 1 이상의 첨가제, 예컨대 본 개시내용에서, 카르노신 및/또는 다른 항노화 화합물을 포함할 수 있다.
포유류 숙주 세포, 예를 들면, 중국 햄스터 난소(CHO: Chinese hamster ovary) 세포는 생물반응장치에서 생성 실행의 종료에 임박하여 생존능력 감소를 경험할 수 있다. 카르노신 및 이의 유사체와 같은 항노화제를 세포 배양 배지에 첨가하면 단백질이 수확될 때까지 더 높은 생존 세포수 및 세포 생존능력을 유지하는 것을 돕는다는 것이 밝혀졌다.
또한, 생성 실행의 성장기 후에 및/또는 생산기 동안에 온도를 변경하는 것과 같은 생산성을 증가시키는 방법은 본 발명에 따라 사용할 수 있다. 단지 하나의 예를 들자면, 단백질산물, 구체적으로 성장 분화 인자-8(GDF-8)에 대한 항체의 생성 동안에, 온도는 생산성을 개시시키고 증가시키는 것을 돕도록 아래쪽으로 이동한다. 특정한 실시양태에서, 카르노신과 같은 항노화 화합물을 첨가하면 세포 배양의 생산성이 증가하는 것을 돕는다. 특정한 실시양태에서, 항노화 화합물은 이러한 온도 이동 전에, 동안에 및/또는 후에 첨가할 수 있다.
또한, 카르노신과 같은 항노화 화합물을 세포 배양 배지에 첨가하면 단백질산물의 전체 품질이 증가한다는 것이 밝혀졌다. 단백질의 생성 동안에, 고분자량 응집체는, 다른 원치않는 종과 함께, 세포 배양 배지 중에 존재한다. 카르노신을 첨가하면, 고분자 응집체의 양이 감소하고 생산물 품질이 증가한다. 특정한 실시양태에서, 카르노신 이외의 항노화 화합물을 첨가하면, 이러한 고분자량 응집체의 축적이 감소하고 생산물 품질이 개선된다. 특정한 실시양태에서, 카르노신은 1 이상의 추가의 항노화 화합물과 조합되어 첨가된다.
세포 배양 배지에 첨가되는 항노화 화합물(예, 카르노신)의 농도는 무엇보다도 예를 들면, 세포 유형, 원하는 생산물, 및 생물반응장치의 조건을 비롯하여 본 과정의 많은 인자에 따라 변할 수 있다. 또한, 카르노신은 이의 유사체; 아세틸-카르노신, 호모-카르노신, 안세린, 및 베타-알라닌으로 대체될 수 있다. 특정한 실시양태에서, 카르노신은 1 이상의 다른 항노화 화합물과 조합되어 제공된다. 특정한 실시양태에서, 세포 배양 배지 내의 항노화제(예, 카르노신)의 농도는 약 5 mM 내지 약 100 mM이다. 특정한 실시양태에서, 그 농도는 약 10 mM 내지 약 40 mM이다. 특정한 실시양태에서, 그 농도는 약 20 mM이다.
임의의 적합한 배양 절차 및 접종물 배지는 단백질 생성 과정에서 세포를 배양하기 위해 사용될 수 있다. 혈청 배지 및 혈청 비함유 배지 둘 다 사용될 수 있다. 또한, 배양 방법은 특정 세포 유형 및 단백질산물에 적절하게 세포를 배양하기 위해 사용될 수 있다. 이러한 절차는 세포 배양 분야의 숙련된 당업자에게 공지되어 있고 이해될 것이다.
본 개시내용의 다른 특징 및 이점은 하기의 상세한 설명, 및 청구항으로부터 명확할 것이다.
도면의 간단한 설명
도 1a는 MYO-29의 경우 산성 종 피크에 미치는 카르노신의 효과를 나타낸다.
도 1b는 고분자량 응집체에 미치는 카르노신의 효과를 나타낸다.
도 1c는 산성 종 피크에 미치는 여러 일자 카르노신 첨가의 효과를 나타낸다.
도 1d는 고분자량 응집체에 미치는 여러 일자 카르노신 첨가의 효과를 나타낸다.
도 2a는 매일의 생존 세포 밀도에 미치는 카르노신의 효과를 나타낸다.
도 2b는 매일의 세포 생존능력에 미치는 카르노신의 효과를 나타낸다.
도 2c는 매일의 역가에 미치는 카르노신의 효과를 나타낸다.
도 2d는 누적 특이적 세포 생산성에 미치는 카르노신의 효과를 나타낸다. 12일 및 14일에서의 막대는 왼쪽으로부터 오른쪽으로 대조군 A D10 공급물, 20 mM 카르노신 D10 공급물, 대조군 B D10 공급물, 20 mM 카르노신(D10 공급물 없음), 및 대조군 C(D10 공급물 없음)를 나타낸다.
도 2e는 고분자량 응집체에 미치는 카르노신의 효과를 나타낸다. 12일 및 14일에서의 막대는 왼쪽으로부터 오른쪽으로 대조군 A D10 공급물, 20 mM 카르노신 D10 공급물, 대조군 B D10 공급물, 20 mM 카르노신(D10 공급물 없음), 및 대조군 C(D10 공급물 없음)를 나타낸다.
도 3a는 생존 세포 밀도에 미치는 여러 농도의 카르노신의 효과를 나타낸다.
도 3b는 매일의 세포 생존능력에 미치는 여러 농도의 카르노신의 효과를 나타낸다.
도 3c는 매일의 역가에 미치는 여러 농도의 카르노신의 효과를 나타낸다.
도 3d는 누적 특이적 세포 생산성에 미치는 여러 농도의 카르노신의 효과를 나타낸다. 막대는 왼쪽으로부터 오른쪽으로 대조군 P2, 대조군 P5, 20 mM 카르노신, 및 40 mM 카르노신을 나타낸다.
도 3e는 고분자량 응집체에 미치는 여러 농도의 카르노신의 효과를 나타낸다. 막대는 왼쪽으로부터 오른쪽으로 대조군 P2, 대조군 P5, 20 mM 카르노신, 및 40 mM 카르노신을 나타낸다.
도 4는 카르노신 함유 배지 또는 카르노신 결핍 배지에서 성장한 재조합 TNFR 융합 단백질을 생성하는 중국 햄스터 난소(CHO) 세포주의 생존 세포 밀도 프로파일을 나타낸다. 대조군 조건은 4개의 대조군 생물반응장치 실행의 평균이다.
도 5는 카르노신 함유 배지 또는 카르노신 결핍 배지에서 성장한 재조합 TNFR 융합 단백질을 생성하는 중국 햄스터 난소(CHO) 세포주의 세포 생존능력 프로파일을 나타낸다. 대조군 조건은 4개의 대조군 생물반응장치 실행의 평균이다.
도 6은 응집된(aggregated)/미스폴딩된(misfolded) TNFR 융합 단백질의 백분율에 미치는 카르노신의 효과를 나타낸다. 대조군 조건은 4개의 대조군 생물반응장치 실행의 평균이다.
도 7은 재조합 TNFR 융합 단백질을 생성하는 중국 햄스터 난소(CHO) 세포주에 의해 생성된 고분자량(HMW) 응집체의 백분율에 미치는 카르노신의 효과를 나타낸다. 대조군 조건은 4개의 대조군 생물반응장치 실행의 평균이다.
도 8은 카르노신 함유 배지 또는 카르노신 결핍 배지에서 성장한 재조합 TNFR 융합 단백질을 생성하는 중국 햄스터 난소(CHO) 세포주의 생산물 역가 프로파일을 나타낸다. 대조군 조건은 4개의 대조군 생물반응장치 실행의 평균이다.
도 9는 카르노신 함유 배지 또는 카르노신 결핍 배지에서 성장한 재조합 TNFR 융합 단백질을 생성하는 중국 햄스터 난소(CHO) 세포주의 특이적 세포 생산성 프로파일을 나타낸다. 대조군 조건은 4개의 대조군 생물반응장치 실행의 평균이다.
도 10은 카르노신 함유 배지 또는 카르노신 결핍 배지에서 성장한 중국 햄스터 난소(CHO) 세포주에 의해 생성된 재조합 TNFR 융합 단백질의, 표준 물질의 백분율로서 표현된, 총 시알릴화(sialylation) 프로파일을 나타낸다. 대조군 조건은 4개의 대조군 생물반응장치 실행의 평균이다.
도 11은 카르노신 함유 배지 또는 카르노신 결핍 배지에서 성장한 중국 햄스터 난소(CHO) 세포주에 의해 생성된 재조합 TNFR 융합 단백질의, 총 N-연결 올리고사카라이드의 백분율로서 표현된, 시알릴화된 N-연결 올리고사카라이드의 분포를 나타낸다. 대조군 조건은 4개의 대조군 생물반응장치 실행의 평균이다.
정의
오래된 관례에 따라, 단수의 용어는 청구항을 비롯하여 본원에서 사용될 때 "1 이상"을 의미한다. 본 발명이 어느 정도의 독자성으로 기재되어 있더라도, 많은 대안, 변형, 및 변경은 본 개시내용의 견지에서 당해 분야의 숙련된 당업자에게 명확할 것이다. 따라서, 본 발명의 사상 및 범위 내에 있는 모든 이러한 대안, 변형, 및 변경은 한정된 청구항에 의해 포함되는 것으로 의도된다.
본원에서 사용되는 용어 "항노화 화합물"은, 세포 배양에 첨가될 때, 이 세포 배양에서 성장한 세포의 생존능력, 성장, 및/또는 수명을 향상시키는 임의의 제제 또는 화합물을 의미한다. 특정한 실시양태에서, 세포 배양에서 이러한 항노화 화합물을 사용하면 결과적으로 항노화 화합물이 결핍된 다른 점에서는 동일한 배양 조건하에 관찰되는 것보다 역가 증가, 세포 특이적 생산성 증가, 세포 생존능력 증가, 통합 생존 세포 밀도 증가, 고분자량 응집체의 축적 감소, 및/또는 산성 종의 축적 감소가 유발된다. 본 발명의 방법 및 조성물에 따라 사용할 수 있는 항노화 화합물의 비제한적인 예는 카르노신, 아세틸-카르노신, 호모-카르노신, 안세린, 및 베타-알라닌을 포함한다. 특정한 실시양태에서, 2 이상의 항노화 화합물을 본 발명의 조성물 및 방법에 따라 사용할 수 있다.
문구 "숙주 세포"는 유전 조작될 수 있고/있거나 세포 배양 배지 중에서 성장 및 생존할 수 있는 세포를 의미한다. 통상적으로, 이 숙주 세포는 다량의 관심의 내생 또는 이종성 단백질을 발현할 수 있고, 이 단백질을 보유할 수 있거나, 이 단백질을 세포 배양 배지 내로 분비시킬 수 있다.
숙주 세포는 통상적으로 어린 햄스터 신장(BHK), 중국 햄스터 난소(CHO), 인간 신장(293), 정상 태아 붉은털원숭이 이배체(FRhL-2), 및 쥐과 골수종(예, SP2/0 및 NSO) 세포를 비롯하여 척추동물 세포의 비제한적인 예를 포함하는 "포유류 세포"이다. 당해 분야의 숙련된 당업자는 본 발명의 방법 및 조성물에 따라 사용할 수 있는 다른 숙주 세포를 알 수 있을 것이다.
용어 "세포 배양 배지"는 세포가 성장하여 원하는 단백질을 생성할 수 있는 조건하에 세포 생존을 유지시키도록 영양물을 함유하는 용액을 의미한다. 문구 "접종 배지" 또는 "접종물 배지"는 세포 배양이 개시되는 영양물을 함유하는 용액 또는 물질을 의미한다. 특정한 실시양태에서, "공급물 배지"는 접종 배지와 유사한 영양물을 함유하지만, 세포가 배양 개시 후에 공급되는 용액 또는 물질이다. 특정한 실시양태에서, 공급물 배지는 접종 배지에는 존재하지 않는 1 이상의 성분을 함유한다. 특정한 실시양태에서, 공급물 배지는 접종 배지에 존재하는 1 이상의 성분이 결핍되어 있다. 세포 배양 분야의 숙련된 당업자는 어떠한 성분이 접종 배지 및 공급물 배지를 구성하는지를 과도한 실험 없이 알 수 있을 것이다. 통상적으로, 이러한 용액은 세포가 성장 및 생존에 필요로 하는 필수 아미노산, 비필수 아미노산, 비타민, 에너지원, 지질, 및 미량 원소를 제공한다. 특정한 실시양태에서, 접종 배지, 공급물 배지 또는 둘 다는 항노화 화합물을 포함한다.
본원에서 사용되는 용어 "세포 배양 특성"은 세포 배양의 관찰가능한 및/또는 측정가능한 특성을 의미한다. 본 발명의 방법 및 조성물은 유리하게는 1 이상의 세포 배양 특성을 개선하기 위해 사용한다. 특정한 실시양태에서, 세포 배양 특성의 개선은 세포 배양 특성의 크기를 증가시키는 것을 포함한다. 특정한 실시양태에서, 세포 배양 특성의 개선은 세포 배양 특성의 크기를 감소시키는 것을 포함한다. 비제한적인 예로서, 세포 배양 특성은 역가, 세포 특이적 생산성, 세포 생존능력, 통합 생존 세포 밀도, 고분자량 응집체의 축적, 및/또는 산성 종의 축적일 수 있다. 당해 분야의 숙련된 당업자는 본 발명의 방법 및 조성물을 사용하여 개선될 수 있는 다른 세포 배양 특성을 알 수 있을 것이다.
본원에서 사용되는 용어 "규명 배지"는 배지의 조성이 알려져 있고 제어되는 배지를 의미한다. 규명 배지는 알려져 있지 않고/않거나 제어되지 않는 성분을 함유하는 혈청 또는 가수분해물과 같은 복잡한 첨가제를 함유하지 않는다.
본원에서 사용되는 용어 "복합 배지"는 정체 또는 분량이 알려져 있지 않거나 또는 제어되지 않는 1 이상의 성분을 함유하는 배지를 의미한다.
문구 "세포주"는 일반적으로 관심의 단백질을 발현하는 1차 숙주 세포를 의미한다. 일부 실시양태에서, 이 1차 숙주 세포는, 내생 또는 이종성이던 간에, 원하는 단백질을 암호화하고/하거나 연결된 서열의 발현을 활성화하는 조절 서열을 함유하는 외생 DNA에 의해 형질감염된다. 특정한 실시양태에서, 이러한 유전 형질전환된 세포로부터 유도된 세포는 세포주를 형성하고 세포 배양 배지 중에 위치하여, 성장하여 단백질산물을 생성한다. 특정한 실시양태에서, 세포주는 외생 DNA에 의해 형질감염되지 않고 관심의 내생 단백질을 발현하는 1차 숙주 세포를 포함한다.
세포 배양 배지의 "성장기"는 세포가 급속히 분열하여 기하급수적으로 또는 거의 기하급수적으로 성장을 하는 기간을 의미한다. 통상적으로, 세포는 일반적으로 1일 내지 4일 동안 세포 성장에 최적화된 조건에서 배양된다. 성장기 조건은 약 35℃ 내지 42℃, 일반적으로 약 37℃에서의 온도를 포함할 수 있다. 성장기의 기간 및 성장기에서의 배양 조건은 변할 수 있지만, 이들은 일반적으로 세포 배양 분야의 숙련된 당업자에게 공지되어 있다. 특정한 실시양태에서, 성장기에서의 세포 배양 배지에는 공급물 배지가 보충된다.
"전이기"는 세포 배양 배지가 성장기와 일치하는 조건으로부터 생산기와 일치하는 조건으로 이동하는 기간 동안 일어난다. 전이기 동안, 무엇보다도 온도와 같은 인자는 종종 변한다. 특정한 실시양태에서, 전이기에서의 세포 배양 배지에는 공급물 배지가 보충된다.
"생산기"는 성장기 및 전이기 둘 다 후에 일어난다. 세포의 지수 성장은 종료되고 단백질 생성이 주목적이다. 세포 배양 배지가 보충되어 생성을 개시시킬 수 있다. 특정한 실시양태에서, 생산기에서의 세포 배양 배지에는 공급물 배지가 보충된다. 또한, 생산기 동안의 세포 배양 배지의 온도는 성장기 동안의 세포 배양 배지의 온도보다 일반적으로 더 낮을 수 있고, 이는 통상적으로 생성을 촉진한다. 원하는 종료점이 달성될 때까지 생산기는 계속된다.
문구 "생존 세포 밀도"는 특정 부피 내에서, 일반적으로 ml당 세포 배양 배지 중에 생존하는 세포의 총 수를 의미한다. 문구 "세포 생존능력"은 백분율로서 표현되는, 세포(죽은 세포 및 살아 있는 세포 둘 다)의 총 수와 비교하여 살아 있는 세포의 수를 의미한다.
"통합 생존 세포 밀도", "IVCD(Integrated Viable Cell Density)": 본원에서 사용되는 용어 "통합 생존 세포 밀도" 또는 "IVCD"는 배양이 실행되는 시간으로 곱한 배양 과정에 걸친 생존 세포의 평균 밀도를 의미한다. 생성된 단백질의 양이 배양 과정에 걸쳐 존재하는 생존 세포의 수에 비례할 때, 통합 생존 세포 밀도는 배양 과정에 걸쳐 생성된 단백질의 양을 예상하는데 유용한 도구이다.
용어 "고분자량 응집체"는 일반적으로 미스폴딩된 단백질 또는 2 이상의 폴리펩타이드의 부적합한 회합을 의미한다. 회합은 공유, 비공유, 이황화, 또는 비환원성 가교 결합(이들에 국한되지는 않음)을 비롯한 임의의 방법에 의해 일어날 수 있다. 특정한 실시양태에서, 본 발명의 방법 및 조성물은 유리하게는 고분자량 응집체의 축적을 감소시키기 위해 사용된다.
문구 "항산화제"는 자유 라디칼을 차단함으로써 지질, 단백질, DNA 및 다른 필수 거대분자에 대한 산화 손상을 방지할 수 있는 화합물을 의미한다.
"치료용 단백질": "치료용 단백질"은 이것이 작용하는 신체 부분에 또는 이것이 중간체를 통해 간접적으로 작용하는 신체 부분에 생물학적 효과를 미치는 단백질 또는 펩타이드이다. 치료용 단백질은 예를 들면 항체, 항체의 항원 결합 단편, 수용성 수용체, 수용체 융합, 사이토킨, 성장 인자, 효소, 또는 응고 인자와 같은 분비된 단백질일 수 있고, 이들은 본원에서 하기에 더 자세히 기재되어 있다. 상기 목록의 단백질은 전적으로 단지 예시적이고, 제한적인 열거인 것으로 의도되지 않는다. 당해 분야의 숙련된 당업자는 임의의 단백질을 본 발명에 따라 사용할 수 있다는 것을 알 수 있을 것이고, 필요한 바에 기초하여 생성하고자 하는 특정한 단백질을 선택할 수 있을 것이다.
명세서에서 사용되는 용어 폴리펩타이드, 단백질 및 펩타이드는 동의어이고 상호교환되어 사용된다. 따라서, 본원에서 사용되는 단백질, 펩타이드 또는 폴리펩타이드의 크기는 일반적으로 2 이상의 아미노산을 포함한다. 예를 들면, 단백질, 펩타이드 또는 폴리펩타이드는 약 2 내지 약 20의 아미노산, 약 20 내지 약 40의 아미노산, 약 40 내지 약 100의 아미노산, 약 100의 아미노산 내지 약 200의 아미노산, 약 200의 아미노산 내지 약 300의 아미노산 및 기타 등등을 포함할 수 있다.
본원에서 사용되는 아미노산은 당해 분야에 공지된 임의의 천연 아미노산, 임의의 아미노산 유도체 또는 임의의 아미노산 모방제를 의미한다. 특정한 실시양태에서, 단백질 또는 펩타이드의 잔기는 아미노산 잔기의 서열을 차단하는 어떠한 비아미노산도 갖지 않으면서 서열화되어 있다. 다른 실시양태에서, 서열은 1 이상의 비아미노산 잔기를 포함할 수 있다. 특정한 실시양태에서, 단백질 또는 펩타이드의 잔기의 서열은 1 이상의 비아미노산 잔기에 의해 차단될 수 있다.
"항체": 용어 "항체"는 항원 결합 구역을 갖고 항체 단편, 예컨대 Fab', Fab, F(ab')2, 단일 도메인 항체(DAB), Fv, scFv(단쇄 Fv) 등을 포함하는 임의의 항체형 분자를 의미하도록 사용된다. 다양한 항체 기반 구성물 및 단편을 제조하고 사용하는 기술은 당해 분야에 널리 공지되어 있다. 항체를 제조하고 특성분석하는 방법은 또한 당해 분야에 널리 공지되어 있다(예를 들면, 문헌[Harlow and Lane, Antibodies: A Laboratory Manual, Cold Spring Harbor Laboratory, 1988] 참조; 본원에 참조문헌으로 인용됨). 예를 들면, 항체는 1 이상, 바람직하게는 2의 전장 중쇄, 및 1 이상, 바람직하게는 2의 경쇄를 포함할 수 있다. 본원에서 사용되는 용어 "항체"는 항체 단편 또는 변체 분자, 예컨대 항원 결합 단편(예, Fab, F(ab')2, Fv, 단쇄 Fv 단편, 중쇄 단편(예를 들면, 카멜리드 VHH) 및 결합 도메인-면역글로불린 융합(예, SMIP™))을 포함한다.
항체는 단클론 또는 단일-특이성 항체일 수 있다. 항체는 또한 인간, 인간화, 키메라, CDR-이식, 또는 시험관내 생성된 항체일 수 있다. 보다 다른 실시양태에서, 항체는 예를 들면, IgG1, IgG2, IgG3, 또는 IgG4로부터 선택된 중쇄 불변 부위를 갖는다. 또 다른 실시양태에서, 항체는 예를 들면 카파 또는 람다로부터 선택된 경쇄를 갖는다. 하나의 실시양태에서, 불변 부위는 항체의 특성을 개질하기 위해(예를 들면, Fc 수용체 결합, 항체 글리코실화, 시스테인 잔기의 수, 작동 세포 기능, 또는 보체 기능 중 1 이상을 증가 또는 감소시키기 위해) 변경, 예를 들면 돌연변이된다. 통상적으로, 항체는 소정의 항원, 예를 들면 신경퇴행, 대사, 염증, 자동면역 및/또는 악성 장애와 같은 장애와 관련된 항원에 특이적으로 결합한다.
Small Modular ImmunoPharmaceuticlas(SMIP™)는 결합 도메인 폴리펩타이드를 포함하는 변체 분자의 하나의 예를 제공한다. SMIP 및 이의 용도 및 이용분야는 예를 들면, 미국 공개특허공보 제2003/0118592호, 제2003/0133939호, 제2004/0058445호, 제2005/0136049호, 제2005/0175614호, 제2005/0180970호, 제2005/0186216호, 제2005/0202012호, 제2005/0202023호, 제2005/0202028호, 제2005/0202534호, 및 제2005/0238646호, 및 이들의 관련 특허 일군(이들 모두는 이의 전체로 본원에 참조문헌으로 인용됨)에 개시되어 있다.
단일 도메인 항체는 상보성 결정 구역이 단일 도메인 폴리펩타이드의 일부인 항체를 포함할 수 있다. 예로는 항체로부터 유도된 것 이외에 중쇄 항체, 천연적으로 경쇄를 갖지 않는 항체, 통상적인 4-쇄 항체로부터 유도된 단일 도메인 항체, 엔지니어드 항체(engineered antibody) 및 단일 도메인 골격을 포함하지만, 이들에 국한되지는 않는다. 단일 도메인 항체는 당해 분야의 임의의 단일 도메인 항체, 또는 임의의 미래의 단일 도메인 항체일 수 있다. 단일 도메인 항체는 마우스, 인간, 낙타, 라마, 염소, 래빗, 소(이들에 국한되지는 않음)를 비롯한 임의의 종으로부터 유도될 수 있다. 본 발명의 하나의 양태에 따르면, 본원에서 사용되는 단일 도메인 항체는 경쇄를 갖지 않는 중쇄 항체로서 공지된 천연 단일 도메인 항체이다. 이러한 단일 도메인 항체는 예를 들면 WO 제9404678호에 개시되어 있다. 명확성의 이유로, 천연적으로 경쇄를 갖지 않는 중쇄 항체로부터 유도된 이러한 가변 도메인은 이를 4-쇄 면역글로불린의 통상적인 VH와 구별하기 위해 본원에서 VHH 또는 나노바디(nanobody)로서 알려져 있다. 이러한 VHH 분자는 낙타과 종에서, 예를 들면 낙타, 라마, 단봉 낙타, 알파카 및 구아나코에서 길러진 항체로부터 유도될 수 있다. 낙타과 이외의 다른 종은 천연적으로 경쇄를 갖지 않는 중쇄 항체를 생성할 수 있다; 이러한 VHH는 본 발명의 범위 내에 있다.
용어 항체의 "항원 결합 단편"에 포함되는 결합 단편의 예로는 (i) VL, VH, CL 및 CH1 도메인으로 구성되는 1가 단편인, Fab 단편; (ii) 경첩 부위에서 이황화 브릿지에 의해 연결된 2개의 Fab 단편을 포함하는 2가 단편인, F(ab')2 단편; (iii) VH 및 CH1 도메인으로 구성되는 Fd 단편; (iv) 항체의 단일 암(arm)의 VL 및 VH 도메인으로 구성되는 Fv 단편, (v) VH 도메인으로 구성되는 dAb 단편; (vi) 카멜리드 또는 낙타화(camelized) 가변 도메인, 예를 들면, VHH 도메인; (vii) 단쇄 Fv(scFv); (viii) 이중특이성 항체; 및 (ix) Fc 구역에 융합된 면역글로불린 분자의 1 이상의 단편을 포함한다. 또한, Fv 단편의 2개의 도메인인, VL 및 VH가 별개의 유전자에 의해 암호화되더라도, 이들은 재조합 방법을 이용하여 합성 링커에 의해 연결될 수 있고, 이 합성 링커는 VL 및 VH가 단일 단백질 쇄로서 제조되게 하고, 이 단일 단백질 쇄에서 VL 구역과 VH 구역은 쌍을 이뤄 1가 분자(단쇄 Fv(scFv)로서 공지됨)를 형성한다(예를 들면, 문헌[Bird et al. (1988) Science 242:423-26; Huston et al. (1988) Proc. Natl. Acad. Sci. U.S.A. 85:5879-83] 참조). 이러한 단쇄 항체는 또한 용어 항체의 "항원 결합 단편"에 포함되도록 의도된다. 이러한 항체 단편은 당해 분야의 숙련된 당업자에게 공지된 통상적인 기술을 이용하여 수득하고, 이러한 항체 단편은 원형 항체에 대한 기능 평가와 동일한 방식으로 기능 평가한다.
"이중특이성" 또는 "이작용성" 항체 이외에, 항체는 각각의 이의 동일한 결합 자리를 갖는 것으로 이해된다. "이중특이성" 또는 "이작용성 항체"는 2개의 상이한 중쇄/경쇄 쌍 및 2개의 상이한 결합 자리를 갖는 인공 하이브리드(hybrid) 항체이다. 이중특이성 항체는 하이브리도마의 융합 또는 Fab' 단편의 연결을 비롯한 다양한 방법에 의해 생성될 수 있다. 예를 들면, 문헌[Songsivilai & Lachmann, Clin. Exp. Immunol. 79:315-321 (1990); Kostelny et al., J. Immunol. 148, 1547-1553 (1992)]을 참조할 수 있다.
문구 "생물반응장치"는 세포 배양 배지가 함유될 수 있는 용기 및 pH 및 온도와 같은 배양 기간 동안 제어될 수 있는 내부 조건을 의미한다.
"유가 배양(fed batch culture)"은 세포를 우선 접종물 배지가 구비된 생물반응장치에서 접종하는 세포 배양 방법을 의미한다. 이어서, 세포 배양 배지에 영양 성분 및/또는 다른 보충물을 함유하는 공급물 배지가 생성 실행 전체에 걸쳐 1 이상의 시점에서 보충된다.
"회분 배양(batch culture)"은 세포를 생성 실행의 전체 동안 모든 필수 영양물 및 보충물이 구비된 생물반응장치에서 접종하는 세포 배양 방법을 의미한다. 영양물 추가는 생성 기간 전체에 걸쳐 세포 배양 배지에 이루어지지 않는다.
"관류 배양(perfusion culture)"은 회분 배양 방법 또는 유가 배양 방법과 상이한 세포 배양 방법으로서, 이 배양은 발현된 관심의 단백질을 분리하고/하거나 정제하기 전에 종료되지 않고, 또는 반드시 종료되는 것은 아니고, 새로운 영양물 및 다른 성분은 배양에 주기적으로 또는 연속적으로 첨가되고, 이 배양 동안에 발현된 단백질은 주기적으로 또는 연속적으로 수확되는 세포 배양 방법을 의미한다. 첨가된 영양물의 조성은 세포의 요구, 최적 단백질 생성에 대한 요건, 및/또는 당해 분야의 숙련된 당업자에게 공지된 임의의 다양한 다른 인자에 따라 세포 배양 과정 동안에 변할 수 있다.
문구 "발현"은 숙주 세포 내에 일어나는 전사 및 번역을 의미한다. 발현의 수준은 일반적으로 숙주 세포에 의해 생성된 단백질의 양과 관련된다.
"세포 특이적 생산성" 등은 특이적, 세포마다에서의, 생산물 발현 속도를 의미한다. 세포 특이적 생산성은 일반적으로 매일 106개 세포당 생성된 단백질의 마이크로그람으로 또는 매일 106개 세포당 생성된 단백질의 피코그람으로 측정된다.
본원에서 사용되는 용어 "역가"는 소정의 양의 배지 부피 내에서 세포 배양에 의해 생성된 재조합으로 발현된 단백질의 총 양을 의미한다. 역가는 통상적으로 배지의 밀리리터당 단백질의 밀리그램 또는 마이크로그램의 단위로 표현된다.
당해 분야의 숙련된 당업자는 본원에 개시된 방법이 당해 분야에서 일상적으로 사용되고 배양되는 널리 공지된 많은 포유류 세포를 배양하기 위해 사용될 수 있는 것을 이해할 것이다. 즉, 본원에 개시된 방법은 본 개시내용만으로 사용하는 것으로 제한되지 않는다.
발명의 특정한 실시양태의 상세한 설명
카르노신과 같은 항노화 화합물을 사용하면 세포 배양의 생존능력 및 생산성이 개질된다는 것이 밝혀졌다. 예를 들면, 카르노신의 첨가는 세포 생존능력을 유지시키고, 세포의 생산성을 개선시키고, 원하는 단백질산물의 생산물 품질을 개선시킨다. 카르노신은 또한 동물에서 근육 및 신경 조직에 높은 수준(20 mM 까지)으로 존재하는 천연 디펩타이드인 항산화제 및 항노화 화합물이다. 항산화제인, 카르노신은 또한 자유 라디칼 소거제 및 당화 억제제이다. 일반적으로, 카르노신은 반응성 종을 비반응성 종으로 변형시킴으로써 단백질, DNA, 및 다른 필수 거대분자를 보호한다. 항노화 화합물로서, 카르노신은 배양 배지 중에서 20 mM의 농도에서 인간 이배체 섬유아세포 및 인간 태아 폐(1차 세포주)의 수명을 연장시킬 수 있다. 본 발명은 관심의 단백질을 생성하기 위해 세포 배양에서 (카르노신(이에 국한되지는 않음)을 비롯하여) 항노화 화합물을 사용하는 것이 유리하다는 놀라운 발견을 포함한다. 특정한 실시양태에서, 관심의 단백질을 생성하기 위해 세포 배양에서 이러한 항노화 화합물을 사용하면 결과적으로 역가 증가, 세포 특이적 생산성 증가, 세포 생존능력 증가, 통합 생존 세포 밀도 증가, 고분자량 응집체의 축적 감소, 및/또는 산성 종의 축적 감소(이들에 국한되는 것은 아님)을 비롯하여 1 이상의 개선된 세포 배양 특성이 유발된다.
카르노신은 더 낮은 포도당 수준을 갖는 최소 필수 배지(MEM, Sigma)에서는 인간 또는 설치류 형질전환된 신생 세포에 세포독성이지만, 1 mM 피루베이트를 함유하는 둘베코 변형 이글 배지(DMEM, Sigma)에서는 세포독성이 아니라는 것이 증명되었다(Holliday et al, Biochemistry (Moscow), 65:843-848,846). 또한, 저분자량 화합물이 제거되어 있는 투석된 우 태아 혈청(fetal calf serum)은 카르노신의 세포독성 효과를 증가시킨다. Id . 또한, 1 mM 옥살로아세테이트 및 1 mM α-케토글루타레이트는 피루베이트와 필적하는 효과를 갖고, 이들 중 어느 것도 카르노신 실시예에서 사용되는 접종물 또는 공급물 배지의 성분이 아닌 것으로 밝혀졌다. Id . 그러나, 피루브산 나트륨은, 카르노신 첨가를 위해서가 아니라, 오히려 생물반응장치 시스템에서 생체내 상태를 더 잘 모방하기 위한 그리고 잠재적인 대안 에너지원으로서, 0.5 mM의 농도의 접종물 배지 중의 원래 성분이다. 접종물 배지는 또한 혈청 비함유이고, 이는 카르노신이 세포독성 효과를 갖지 않는다는 사실을 내포한다. 참조문헌에 따르면, 세포 배양 배지에 카르노신을 첨가하면 상기 홀리데이(Holliday)의 문헌에서 MEM 배지에서 관찰되는 것과 유사한 세포독성 효과를 갖는다. 본 발명의 방법 및/또는 조성물을 사용함으로써, 이러한 세포독성은 감소 또는 제거되고, 세포 생존능력 및 단백질 생성은 개선된다.
특정한 실시양태에서, 카르노신은 약 5 mM 내지 약 100 mM의 농도로 세포 배양 배지 중에 제공된다. 특정한 실시양태에서, 카르노신은 약 10 mM 내지 약 40 mM의 농도로, 예를 들면 약 20 mM의 농도로 세포 배양 배지 중에 제공된다. 특정한 실시양태에서, 카르노신은 약 5, 6, 7, 8, 9, 10, 11, 12, 13, 14, 15, 16, 17, 18, 19, 20, 21, 22, 23, 24, 25, 26, 27, 28, 29, 30, 31, 32, 33, 34, 35, 36, 37, 38, 39, 40, 41, 42, 43, 44, 45, 46, 47, 48, 49, 50, 55, 60, 65, 70, 75, 80, 85, 90, 95, 100 mM, 또는 그 이상의 농도로 세포 배양 배지 중에 제공된다. 특정한 실시양태에서, 이러한 카르노신의 농도는, 예를 들면, 1 이상의 공급물 배지 중에서 카르노신을 세포 배양 과정 동안에 여러 시점에서 첨가함으로써 세포 배양에서 달성한다. 사용된 카르노신의 농도는 다른 인자들 중에서도 세포주 또는 생산물에서 구하고자 하는 원하는 효과를 비롯하여 사용된 세포 배양 배지 및 세포주에 의존한다. 카르노신의 유사체, 예를 들면 아세틸-카르노신, 호모-카르노신, 안세린, 및 베타-알라닌은 또한 유사한 효과를 위해 세포 배양 배지 중에 제공될 수 있다. 이러한 유사체 중 1 이상은 세포 배양 배지 중에 제공될 수 있다. 특정한 실시양태에서, 이러한 유사체는 카르노신이 결핍된 세포 배양 배지 중에 제공된다. 특정한 실시양태에서, 이러한 유사체는 카르노신과 조합되어 세포 배양 배지 중에 제공된다. 특정한 실시양태에서, 이러한 유사체는 약 5, 6, 7, 8, 9, 10, 11, 12, 13, 14, 15, 16, 17, 18, 19, 20, 21, 22, 23, 24, 25, 26, 27, 28, 29, 30, 31, 32, 33, 34, 35, 36, 37, 38, 39, 40, 41, 42, 43, 44, 45, 46, 47, 48, 49, 50, 55, 60, 65, 70, 75, 80, 85, 90, 95, 100 mM, 또는 그 이상의 농도에서 제공된다.
특정한 실시양태에서, 관심의 단백질을 생성하기 위해, 초기에, 숙주 세포는 단백질을 암호화하는 외생 DNA에 의해 형질감염되거나 또는 형질전환되어, 원하는 단백질산물을 구성적으로 생성하는 형질전환된 세포를 제공한다. 특정한 실시양태에서, 세포 내로 도입된 핵산 분자는 본 발명에 따라 발현하고자 원하는 단백질을 암호화한다. 특정한 실시양태에서, 핵산 분자는 조절 서열을 함유하거나 세포에 의한 원하는 단백질의 발현을 유도하거나 향상시키는 유전자 생산물을 암호화한다. 비제한적인 예로서, 이러한 유전자 생산물은 관심의 단백질의 발현을 증가시키는 전사 인자일 수 있다.
특정한 실시양태에서, 단백질의 발현을 지시하는 핵산은 영구적으로 숙주 세포 내로 도입된다. 특정한 실시양태에서, 단백질의 발현을 지시하는 핵산은 일시적으로 숙주 세포 내로 도입된다. 당해 분야의 숙련된 당업자는 실험용, 상업용 또는 다른 필요에 기초하여 핵산을 영구적으로 또는 일시적으로 세포 내로 도입할지를 결정할 수 있을 것이다.
관심의 단백질을 암호화하는 유전자는 1 이상의 조절적인 유전자 제어 요소에 임의로 연결될 수 있다. 일부 실시양태에서, 유전자 제어 요소는 단백질의 구성적 발현을 지시한다. 일부 실시양태에서, 관심의 단백질을 암호화하는 유전자의 유도성 발현을 제공하는 유전자 제어 요소를 사용할 수 있다. 유도성 유전자 제어 요소(예, 유도성 프로모터)를 사용하면, 세포에서 단백질 생성의 조정이 가능하다. 진핵 세포에서 사용하기 위한 잠재적으로 유용한 유도성 유전자 제어 요소의 비제한적인 예로는 호르몬-조절 요소(예를 들면, 문헌[Mader, S. and White, J.H., Proc. Natl. Acad. Sci. USA 90:5603-5607, 1993] 참조), 합성 리간드-조절 요소(예를 들면, 문헌[Spencer, D.M. et al., Science 262:1019-1024, 1993] 참조) 및 이온화 방사선-조절 요소(예를 들면, 문헌[Manome, Y. et al., Biochemistry 32:10607-10613, 1993; Datta, R. et al., Proc. Natl. Acad. Sci. USA 89:10149-10153, 1992] 참조)를 포함한다. 당해 분야에 공지된 추가의 세포-특이적 또는 다른 조절 시스템은 본원에 기재된 방법 및 조성물에 따라 사용할 수 있다.
세포 배양되기 쉽고, 단백질 발현되기 쉬운 임의의 숙주 세포를 본 발명에 따라 사용할 수 있다. 숙주 세포는 일반적으로 포유류 세포, 보다 특히 동물 세포, 예컨대 중국 햄스터 난소(CHO) 세포이다. 본 발명에 따라 사용할 수 있는 포유류 세포의 다른 비제한적인 예로는 BALB/c 마우스 골수종 세포주(NSO/l, ECACC 85110503호); 인간 망막아세포(PER.C6(CruCell, 네덜란드 라이덴 소재)); SV40에 의해 형질전환된 원숭이 신장 CV1 세포주(COS-7, ATCC CRL 1651); 인간 태아 신장 세포주(현탁 배양에서 성장하도록 서브클로닝된 293 또는 293 세포, Graham et al., J. Gen Virol., 36:59 (1977)); 어린 햄스터 신장 세포(BHK, ATCC CCL 10); 중국 햄스터 난소 세포 +/- DHFR(CHO, Urlaub and Chasin, Proc. Natl. Acad. Sci. USA, 77:4216 (1980)); 마우스 세르톨리 세포(TM4, Mather, Biol. Reprod., 23:243-251 (1980)); 원숭이 신장 세포(CV1 ATCC CCL 70); 아프리카 녹색 원숭이 신장 세포(VERO-76, ATCC CRL-1 587); 인간 자궁경부암 세포(HeLa, ATCC CCL 2); 개과 신장 세포(MDCK, ATCC CCL 34); 버팔로 랫트 간 세포(BRL 3A, ATCC CRL 1442); 인간 폐 세포(W138, ATCC CCL 75); 인간 간 세포(Hep G2, HB 8065); 마우스 유방암(MMT 060562, ATCC CCL51); TRI 세포(Mather et al., Annals N.Y. Acad. Sci., 383:44-68 (1982)); MRC 5 세포; FS4 세포; 및 인간 간암 세포주(Hep G2)를 포함한다.
폴리펩타이드
숙주 세포에서 발현가능한 임의의 폴리펩타이드는 본 발명에 따라 생성될 수 있다. 폴리펩타이드는 숙주 세포에 외생인 유전자로부터, 또는 숙주 세포 내로 도입된 이종성 유전자로부터 발현될 수 있다. 폴리펩타이드는 자연에 존재하는 폴리펩타이드일 수 있거나, 또는 대안적으로 인간 손에 의해 엔지니어링된 또는 선택된 서열을 가질 수 있다. 본 발명에 따라 생성하고자 하는 폴리펩타이드는 각각 자연에 존재하는 폴리펩타이드 단편으로부터 어셈블링될 수 있다. 추가로 또는 대안적으로, 엔지니어드 폴리펩타이드(engineered polypeptide)는 자연에 존재하지 않는 1 이상의 단편을 포함할 수 있다. 단백질 또는 펩타이드는 표준 분자 생물 기술을 통한 단백질, 폴리펩타이드 또는 펩타이드의 발현, 자연 공급원으로부터 단백질 또는 펩타이드의 분리, 또는 단백질 또는 펩타이드의 화학 합성을 비롯하여 당해 분야의 숙련된 당업자에게 공지된 임의의 기술에 의해 제조될 수 있다. 공지된 유전자에 대한 암호화 구역은 본원에 개시된 기술을 사용하여 또는 당해 분야의 숙련된 당업자에게 공지된 바대로 증폭되고/되거나 발현될 수 있다. 대안적으로, 단백질, 폴리펩타이드 및 펩타이드의 다양한 상업용 제법은 당해 분야의 숙련된 당업자에게 공지되어 있다.
본 발명에 따라 바람직하게 발현될 수 있는 치료용 단백질은 종종 흥미있는 또는 유용한 생물 또는 화학 활성에 기초하여 선택된다. 예를 들면, 본 발명은 임의의 약학적으로 또는 상업적으로 관련된 효소, 응고 인자, 수용체, 항체, 호르몬, 조절 인자, 항원, 결합제 등을 발현하도록 사용할 수 있다. 본 발명에 따라 생성될 수 있는 하기의 치료용 단백질의 목록은 전적으로 단지 예시적이고, 제한적인 열거인 것으로 의도되지 않는다. 당해 분야의 숙련된 당업자는 임의의 폴리펩타이드가 본 발명에 따라 발현될 수 있다는 것을 이해할 것이고, 이 당업자의 특정한 필요에 기초하여 생성하고자 하는 특정한 폴리펩타이드를 선택할 수 있을 것이다.
융합 단백질
융합 단백질은 일반적으로, 제2 폴리펩타이드 또는 단백질의 전부 또는 일부에, N- 또는 C-말단에서 연결된, 표적 펩타이드의 전부 또는 실질적인 일부를 갖는다. 예를 들면, 융합은 다른 종으로부터의 선도 서열을 이용하여 이종성 숙주에서 단백질의 재조합 발현을 허용할 수 있다. 또 다른 유용한 융합은 융합 단백질의 정제를 수월하게 하기 위해 항체 항원결정기와 같은 면역 활성 도메인의 첨가를 포함한다. 융합 단백질은 표적 잔기, 예를 들면, 수용성 수용체 단편 또는 리간드, 및 면역글로불린 쇄, Fc 단편, 예를 들면 IgG1, IgG2, IgG3, IgG4, IgM, IgA1, IgA2, IgD, 및 IgE를 비롯하여 다양한 아형의 중쇄 불변 부위를 포함할 수 있다. 예를 들면, 융합 단백질은 수용체의 세포외 도메인을 포함할 수 있고, 예를 들면 인간 면역글로불린 Fc 쇄(예, 인간 IgG1 또는 인간 IgG4, 또는 이의 돌연변이형)에 융합될 수 있다. 하나의 실시양태에서, 인간 Fc 서열은 Fc 수용체 결합을 감소시키기 위해 1 이상의 아미노산에서 돌연변이되고, 예를 들면 야생형 서열로부터 254번 잔기 및 257번 잔기에서 돌연변이된다. 융합 단백질은 제1 부분을 제2 부분, 예를 들면, 면역글로불린 단편에 연결시키는 링커 서열을 추가로 포함할 수 있다. 예를 들면, 융합 단백질은 펩타이드 링커, 예를 들면, 약 4 내지 20, 더 바람직하게는 5 내지 10의 아미노산 길이의 펩타이드 링커를 포함할 수 있고, 특정한 실시양태에서, 펩타이드 링커는 8의 아미노산 길이이다. 예를 들면, 융합 단백질은 화학식 (Ser-Gly-Gly-Gly-Gly)y(여기서, y는 1, 2, 3, 4, 5, 6, 7, 또는 8임)을 갖는 펩타이드 링커를 포함할 수 있다. 다른 실시양태에서, 추가의 아미노산 서열은 발현, 입체 유연성, 검출 및/또는 분리 또는 정제를 수월하게 하기 위해 융합 단백질의 N- 또는 C-말단에 첨가될 수 있다.
융합 접합부에서 또는 그 근처에서 절단 자리의 포함은 정제 후에 외생 폴리펩타이드의 제거를 수월하게 한다. 다른 유용한 융합은 기능성 도메인, 예컨대 효소로부터의 활성 자리, 글리코실화 도메인, 세포 표적 신호 또는 막관통 부위의 연결을 포함한다. 융합 단백질 내로 혼입될 수 있는 단백질 또는 펩타이드의 예로는 정세포 단백질, 살세포 단백질, 아폽토시스 촉진제(proapoptosis agent), 항혈관신생제, 호르몬, 사이토킨, 성장 인자, 펩타이드 약물, 항체, Fab 단편 항체, 항원, 수용체 단백질, 효소, 렉틴, MHC 단백질, 세포 접착 단백질 및 결합 단백질을 포함한다. 융합 단백질의 생산 방법은 당해 분야의 숙련된 당업자에게 널리 공지되어 있다. 이러한 단백질은 예를 들면, 2작용성 가교결합 시약을 사용하는 화학 부착에 의해, 완전 융합 단백질의 신생(de novo) 합성에 의해, 또는 표적 펩타이드를 암호화하는 DNA 서열의 제2 펩타이드 또는 단백질을 암호화하는 DNA 서열로의 부착에 이은 원형 융합 단백질의 발현에 의해 생성할 수 있다.
항체
항체는 특정한 항원에 특이적으로 결합하는 능력을 갖는 단백질이다. 약학 또는 다른 상업용 제제로서 현재 사용 또는 연구 중에 있는 수많은 항체를 고려하면, 본 발명에 따른 항체의 생성은 특히 중요하다. 예를 들면, 본 발명은 생성된 항체의 미스폴딩 및/또는 응집이 감소되는 세포 배양에서 항체를 생성하도록 사용할 수 있다.
특정한 실시양태에서, 본 발명의 방법 및/또는 조성물은 성장 분화 인자-8(GDF-8)에 대한 항체를 생성하도록 사용된다. GDF-8 항체의 비제한적인 예로는 Myo29, Myo28, 및 Myo22를 포함한다. 특정한 실시양태에서, 본 교시내용에 따라 생성된 GDF-8 항체는 인간 IgG 아형 형태로 생성된다. 특정한 실시양태에서, 본 발명의 방법 및/또는 조성물은 MYO29 항체, 예컨대 국제 특허 출원, 공개번호 WO 제2004/037861호(발명의 명칭: Neutralizing Antibodies Against GDF-8 and Use Thereof, 이의 전체로 본원에 참조문헌으로 인용됨)에 기재된 항체를 생성하도록 사용된다.
본 발명에 따라 생성될 수 있는 다른 대표적인 상업적으로 구입가능한 치료용 단백질은 예를 들면 AVASTIN [베바시주맙], CAMPATH [알렘투주맙], ERBITUX [세툭시맙], HERCEPTIN [트라스투주맙], HUMIRA [아달리무맙], LUCENTIS [라니비주맙], MYLOTARG [젬투주맙 오조가미신], MYCSCINT [이미크로맙 페네테이트], PROSTASCINT [카프로맙 펜데타이드], RAPTIVA [에팔리주맙], REMICADE [인플릭시맙], REOPRO [압식시맙], RITUXAN [리툭시맙], SIMULECST [바실시맙], SOLIRIS [에쿨리주맙], SYNAGIS [팔리비주맙], TYSABRI [나탈리주맙], VECTIBIX [파니투무맙], VERLUMA [노페투모맙], XOLAIR [오말리주맙], ZANAPAX [다클리주맙], ZEVALIN [이브리투모맙 튜세탄] 등을 포함한다.
특정한 실시양태에서, 상기 기재된 단클론, 키메라, 또는 인간화 항체는 전적으로 임의의 종에서의 임의의 항체에서 자연에 존재하지 않는 아미노산 잔기를 함유한다. 이러한 외부 잔기는 예를 들면 단클론, 키메라 또는 인간화 항체에 대해 새로운 또는 개질된 특이성, 친화도 또는 작동자 기능을 부여하도록 사용할 수 있다.
응고 인자
응고 인자는 약학 및/또는 상업용 제제로서 효과적인 것으로 밝혀졌다. 혈우병 B는 환자의 혈액이 응고될 수 없는 장애이다. 따라서, 출혈을 유발하는 어떠한 작은 상처라도 잠재적으로 생명을 위협하는 사건이다. 혈우병과 같은 질병의 치료에서 재조합 응고 인자의 중요성을 고려하면, 본 발명에 따른 응고 인자의 생성은 특히 중요하다. 특정한 실시양태에서, 본 발명은 생성된 응고 인자의 미스폴딩 및/또는 응집이 감소되는 세포 배양에서 응고 인자를 생성하도록 사용할 수 있다.
예를 들면, 응고인자 IX(IX 인자 또는 "FIX")는 결핍시 혈우병 B을 야기하는 단쇄 당단백질이다. FIX는 활성화 펩타이드의 방출에 의해 2-쇄 세린 프로테아제(IXa 인자)로 활성화될 수 있는 단쇄 효소원으로서 합성된다. IXa 인자의 촉매 도메인은 중쇄 내에 위치한다(문헌[Chang et al., J. Clin. Invest., 100:4, 1997] 참조; 이의 전체로 본원에 참조문헌으로 인용됨). 본 발명에 따라 생성될 수 있는 다른 응고 인자는 조직 인자, 및 폰 빌레브란트(von Willebrand) 인자 및/또는 상업적으로 구입가능한 혈액-응고 인자를 포함한다. 본 발명에 따라 생성될 수 있는 대표적인 상업적으로 구입가능한 혈액-응고 인자는 예를 들면 ALTEPLASE [조직 플라즈미노젠 활성인자; t-PA], BENEFIX [IX 인자], HEMOFIL [항혈우병 인자; XIII 인자], RECOMBINATE (재조합 항혈우병 인자) 등을 포함한다.
효소
본 발명의 교시내용에 따라 바람직하게 생성될 수 있는 약학 및/또는 상업용 제제로서 효과적인 것으로 밝혀진 폴리펩타이드의 또 다른 부류는 효소를 포함한다. 질병의 치료 및 다른 상업용 및 약학 용도에서 재조합 효소의 중요성을 고려하면, 본 발명에 따른 효소의 생성은 특히 중요하다. 예를 들면, 본 발명은 생성된 효소의 미스폴딩 및/또는 응집이 감소되는 세포 배양에서 효소를 생성하도록 사용할 수 있다. 본 발명에 따라 생성될 수 있는 대표적인 상업적으로 구입가능한 효소로는 예를 들면, ACTIVASE [재조합 알테프라제], CEREDASE [알글루세라제], CEREZYME [이미글루세라제], PULMOZYME [DNase] 등을 포함한다.
성장 인자 및 다른 신호전달 분자
본 발명의 교시내용에 따라 바람직하게 생성될 수 있는 약학 및/또는 상업용 제제로서 효과적인 것으로 밝혀진 폴리펩타이드의 또 다른 부류는 성장 인자 및 다른 신호전달 분자를 포함한다. 성장 인자는 종종 세포에 의해 분비되고 다른 세포 상의 수용체에 결합하여 이를 활성화시킴으로써 수용체 세포에서의 대사 또는 발달 변화를 개시시키는 당단백질이다. 성장 인자 및 다른 신호전달 분자의 생물학적 중요성 및 이의 잠재적 치료제로서의 중요성을 고려하면, 본 발명에 따른 이러한 분자의 생성은 특히 중요하다. 예를 들면, 본 발명은 생성된 성장 인자 또는 다른 신호전달 분자의 미스폴딩 및/또는 응집이 감소되는 세포 배양에서 성장 인자 또는 다른 신호전달 분자를 생성하도록 사용할 수 있다.
포유류 성장 인자 및 다른 신호전달 분자의 비제한적인 예로는 사이토킨; 상피 성장 인자(EGF); 혈소판 유도 성장 인자(PDGF); 섬유아세포 성장 인자(FGF), 예컨대 aFGF 및 bFGF; 변형 성장 인자(TGF), 예컨대 TGF-알파 및 TGF-베타(TGF-베타 1, TGF-베타 2, TGF-베타 3, TGF-베타 4, 또는 TGF-베타 5 포함); 인슐린양 성장 인자-I 및 인슐린양 성장 인자-II(IGF-I 및 IGF-II); des(1-3)-IGF-I(brain IGF-I), 인슐린양 성장 인자 결합 단백질; CD 단백질, 예컨대 CD-3, CD-4, CD-8, 및 CD-19; 에리쓰로포이에틴(대표적인 상업적으로 구입가능한 에리쓰로포이에틴으로는 예를 들면 ARANESEP [다베포이에틴]; CEA-SCAN [아르시투모맙], EPOGEN [에포에틴 알파]; PROCRIT [에포에틴 알파] 등을 포함함); 골유도 인자; 면역독소; 골 형성 단백질(BMP); 인터페론, 예컨대 인터페론-알파, 인터페론-베타, 및 인터페론-감마(대표적인 상업적으로 구입가능한 인터페론으로는 예를 들면 ACTIMUNNE [인터페론 감마-1b], AVONEX [인터페론 베타-1a], REBIF [인터페론 베타-1a], BETASERON [인터페론 베타-1b] 등을 포함함); 군체 자극 인자(CSF), 예를 들면, M-CSF, GM-CSF, 및 G-CSF(다른 대표적인 상업적으로 구입가능한 군체 자극 인자로는 예를 들면 GRANUCYTE [레노그라스팀], LEUKINE [살그라모스팀] 등을 포함함); 인터류킨(TL), 예를 들면, IL-1 내지 IL-10; 종양 괴사 인자(TNF) 알파 및 베타; 인슐린 A-쇄; 인슐린 B-쇄; 프로인슐린; 여포 자극 호르몬; 칼시토닌; 황체형성 호르몬; 글루카곤; 응고 인자, 예컨대 VIIIC 인자, IX 인자, 조직 인자, 및 폰 빌레브란트 인자; 항응고 인자, 예컨대 단백질 C; 심방성 나트륨 이뇨인자; 폐 계면 활성제; 플라스미노겐 활성자, 예컨대 유로키나제 또는 인간 소변 또는 조직형 플라스미노겐 활성인자(t-PA); 봄베신; 트롬빈, 조혈 성장 인자; 엔케팔리나제; RANTES(regulated on activation, normally T-cell expressed and secreted); 인간 대식세포 염증 단백질(MIP-1-알파); 뮐러-억제 물질; 렐락신 A-쇄; 렐락신 B-쇄; 프로렐락신; 마우스 가나도트로핀 관련 펩타이드; 신경성장 인자, 예컨대 골 유도 신경성장 인자(BDNF), 뉴로트로핀-3, 뉴로트로핀-4, 뉴로트로핀-5, 또는 뉴로트로핀-6(NT-3, NT-4, NT-5, 또는 NT-6), 또는 신경 성장 인자, 예컨대 NGF-베타를 포함한다. 당해 분야의 숙련된 당업자는 본 발명의 방법 및 조성물에 따라 발현될 수 있는 다른 성장 인자 또는 신호전달 분자를 알 수 있을 것이다.
수용체
본 발명의 교시내용에 따라 바람직하게 생성될 수 있는 약학 및/또는 상업용 제제로서 효과적인 것으로 밝혀진 폴리펩타이드의 또 다른 부류는 수용체를 포함한다. 수용체의 생물학적 중요성 및 이의 잠재적 치료제로서의 중요성을 고려하면, 본 발명에 따른 이러한 분자의 생성은 특히 중요하다. 예를 들면, 본 발명은 생성된 수용체의 미스폴딩 및/또는 응집이 감소되는 세포 배양에서 수용체를 생성하도록 사용할 수 있다.
수용체는 통상적으로 세포외 신호전달 리간드를 인지함으로써 기능하는 막관통 당단백질이다. 수용체는 종종 리간드 인지 도메인 이외에 단백질 키나아제 도메인을 갖는다. 이 단백질 키나아제 도메인은 리간드에 결합시 표적 세포내 분자를 인산화하여 신호전달 경로를 개시시켜, 세포 내에서 발달 또는 대사 변화를 발생시킨다. 특정한 실시양태에서, 막관통 수용체의 세포외 도메인은 본원에 개시된 방법 및 시스템에 따라 생성된다. 특정한 실시양태에서, 막관통 수용체의 세포내 도메인은 본원에 개시된 방법 및 시스템에 따라 생성된다.
특정한 실시양태에서, 종양 괴사 인자 알파 및 베타 수용체(TNFR-1; 1991년 3월 20일자에 공개된 EP 제417,563호; 및 TNFR-2, 1991년 3월 20일자에 공개된 EP 제417,014호, 이들 각각은 이의 전체로 본원에 참조문헌으로 인용됨) 형태의 종양 괴사 인자 억제제는 본 발명의 시스템 및 방법에 따라 발현된다(검토를 위해, 문헌[Naismith and Sprang, J Inflamm. 47(1-2): 1-7, 1995-96] 참조; 이 문헌은 이의 전체로 본원에 참조문헌으로 인용됨). 일부 실시양태에 따르면, 종양 괴사 인자 억제제는 수용성 TNF 수용체를 포함한다. 특정한 실시양태에서, 종양 괴사 인자 억제제는 면역글로불린의 Fc 구역을 비롯하여 면역글로불린 단백질의 임의의 부분에 융합된 수용성 TNFR을 포함한다. 특정한 실시양태에서, 본 발명의 TNF 억제제는 TNFR I 및 TNFR II의 수용성 형태이다. 특정한 실시양태에서, 본 발명의 TNF 억제제는 수용성 TNF 결합 단백질이다. 특정한 실시양태에서, 본 발명의 TNF 억제제는 TNFR-Fc, 예를 들면, 에타네르셉트(etanercept)이다. 본원에서 사용되는 "에타네르셉트"는 p75 TNF-α 수용체의 세포외 부분의 2개의 분자(각각의 분자는 인간 IgG1의 235개의 아미노산 Fc 부분으로 구성됨)의 이합체인 TNFR-Fc를 의미한다. 본 발명에 따르면, 카르노신과 같은 항노화 화합물은 TNFR-Fc의 생성 동안 미스폴딩된 및/또는 응집된 단백질의 양을 감소시키기 위해 사용한다.
일부 실시양태에서, 본 발명에 따라 생성하고자 하는 수용체는 수용체 티로신 키나아제(RTK)이다. RTK 부류는 여러 세포 유형의 다양한 기능에 중요한 수용체를 포함한다(예를 들면 문헌[Yarden and Ullrich, Ann. Rev. Biochem. 57:433-478, 1988; Ullrich and Schlessinger, Cell 61:243-254, 1990] 참조; 이들 각각은 이의 전체로 본원에 참조문헌으로 인용됨). RTK의 비제한적인 예로는 종양 괴사 인자 알파 및 베타 수용체, 섬유아세포 성장 인자(FGF) 수용체 부류의 구성원, 상피 성장 인자 수용체(EGF) 부류의 구성원, 혈소판 유도 성장 인자(PDGF) 수용체, 면역글로불린 및 EGF 상동성 도메인-1(TIE-1)을 갖는 티로신 키나아제 및 TIE-2 수용체(문헌[Sato et al., Nature 376(6535):70-74, 1995]; 이의 전체로 본원에 참조문헌으로 인용됨) 및 c-Met 수용체를 포함하고, 이들 중 일부는 직접적으로 또는 간접적으로 혈관신생을 촉진하는 것으로 제시되어 있다(Mustonen and Alitalo, J. Cell Biol. 129:895-898, 1995). RTK의 다른 비제한적인 예로는 태아 간 키나아제 1(FLK-1)(때때로 키나아제 삽입 도메인 함유 수용체(KDR)(Terman et al., Oncogene 6:1677-83, 1991) 또는 혈관 내피 세포 성장 인자 수용체 2(VEGFR-2)라 칭함), fms형 티로신 키나아제-1(Flt-1)(DeVries et al. Science 255;989-991, 1992; Shibuya et al., Oncogene 5:519-524, 1990)(때때로 혈관 내피 세포 성장 인자 수용체 1(VEGFR-1)라 칭함), 뉴로필린-1, 엔도글린, 엔도시알린, 및 Axl을 포함한다. 당해 분야의 숙련된 당업자는 본 발명에 따라 발현될 수 있는 다른 수용체를 알 수 있을 것이다.
특정한 실시양태에서, 본 발명에 따라 생성하고자 하는 수용체는 G-단백질 결합 수용체(GPCR)이다. GPCR은 약물 작용 및 발달에 대한 중요한 표적이다. 사실, 수용체는 현재 공지된 약물 중 절반 이상을 이끌고 있으며(Drews, Nature Biotechnology, 14:1516, 1996), GPCR은 GPCR을 길항 또는 작동시키는 임상적으로 처방된 약물 중 30%로 치료적 중재에 가장 중요한 표적을 나타낸다(Milligan, G. and Rees, S., TIPS, 20:118-124, 1999). 이러한 수용체는 치료 표적으로서 입증되고 증명된 내력을 가지므로, 본 발명에 따른 GPCR의 생성은 또한 특히 중요하다.
일반적으로, 본 발명의 실행자는 이러한 단백질 또는 관심의 폴리펩타이드를 선택할 수 있을 것이고, 이의 정확한 아미노산 서열을 알 수 있을 것이다. 본 발명에 따라 발현하고자 하는 임의의 소정의 폴리펩타이드는 그 자체의 특정한 특성을 갖고, 배양된 세포의 세포 밀도 또는 생존능력에 영향을 미칠 수 있으며, 동일한 배양 조건하에 성장한 또 다른 폴리펩타이드 또는 단백질보다 더 낮은 수준으로 발현될 수 있다. 당해 분야의 숙련된 당업자는 소정의 발현된 폴리펩타이드 또는 단백질의 세포 성장, 역가, 폴딩 또는 임의의 다른 특성을 최적화하기 위해 본 발명의 배지를 및 본원에 기재된 방법을 적절하게 변경할 수 있을 것이다.
당해 분야의 숙련된 당업자는 본 발명의 방법 및 조성물에 따라 발현될 수 있는 다른 유용한 및/또는 바람직한 단백질을 알 수 있을 것이다.
세포주는 원하는 단백질산물을 생성하도록 다양한 기술을 이용하여 배양할 수 있다. 세포 배양은 세포 배양 배지의 목적 또는 생산물의 용도에 따라 소규모 또는 대규모로 이루어질 수 있다. 예를 들면, 세포는 생물반응장치에서 성장할 수 있다. 특정한 실시양태에서, 생물반응장치의 부피는 1 L 이상이고, 10, 100, 250, 500, 1,000, 2,500, 5,000, 8,000, 10,000, 12,000 L 또는 그 이상, 또는 이 부피들 사이의 임의의 부피일 수 있다. 또한, 사용될 수 있는 생물반응장치는 교반식 탱크 생물반응장치, 유동층 반응기, 실관 생물반응장치, 또는 롤러 유리용기를 포함할 수 있지만, 이들에 국한되지는 않는다. 시스템은 또한 회분, 유가, 또는 연속/관류 방식으로 조작될 수 있다. 생물반응장치 및 세포 배양 배지를 제어하고 모니터링하는 방식은 세포 배양 분야의 숙련된 당업자에게 공지되어 있다. 당해 실시예에서, 이용된 시스템은 교반식 탱크 생물반응장치이고, 유가 방식으로 조작된다.
생물반응장치는 일반적으로 접종물 배지 및 선택된 세포주, 예를 들면 TNFR 융합 단백질 세포주에 의해 시딩되고, 이 세포주는 원하는 단백질산물을 영구적으로 발현 및 생성하도록 형질감염될 수 있다. 상업적으로 구입가능한 배지, 예컨대 최소 필수 배지(MEM, Sigma), Ham's F10(Sigma), 또는 둘베코 변형 이글 배지(DMEM, Sigma)를 기본 배지로서 사용할 수 있다. 이어서, 이 기본 배지에 아미노산, 비타민, 미량 원소, 및/또는 다른 성분을 보충하여 생성 실행 동안에 사용되는 접종물 또는 공급물 배지를 생성할 수 있다. 특정한 실시양태에서, 기본 배지는 세포의 왕성한 성장을 허용하고/하거나, 세포 생존능력을 증가시키고/시키거나, 세포 생산성을 증가시키고/시키거나, 통합 생존 세포 밀도를 증가시키고/시키거나 카르노신의 존재하에 생성된 단백질의 품질을 개선시키기 위해 변경할 수 있다. 예를 들면, 기본 배지에 피루베이트, 옥살로아세테이트 및/또는 α-케토글루타레이트를 보충할 수 있다. 당해 분야의 숙련된 당업자는 과도한 실험 없이 본 발명의 방법 및 조성물로 사용하기 위한 기본 배지를 변경할 수 있을 것이다.
특정한 실시양태에서, 세포는 항노화 화합물을 함유하는 임의의 다양한 화학 규명 배지 중에서 배양되고, 여기서 배지의 성분은 알려져 있고 제어된다. 예를 들면, 규명 배지는 통상적으로 혈청 또는 가수분해물과 같은 복잡한 첨가제를 함유하지 않는다. 특정한 실시양태에서, 세포는 항노화 화합물을 함유하는 임의의 다양한 복합 배지 중에서 배양되고, 여기서 배지의 모든 성분은 알려져 있지 않고/않거나 제어되지 않는다. 특정한 실시양태에서, 이러한 항노화 화합물은 카르노신을 포함한다.
생물반응장치의 조건은, pH가 약 6.5 내지 약 7.5에서 설정된 채, 통상적으로 제어된다. pH는 산, 일반적으로 CO2, 또는 염기, 예컨대 중탄산나트륨을 사용하여 조정한다. 성장기 동안에, 용존 산소는 공기 포화의 약 5 내지 90%에서 제어되고, 온도는 30℃ 내지 42℃에서 유지된다. 세포 배양 분야의 숙련된 당업자는 과도한 실험 없이 원하는 결과를 달성하기 위해 이용되는 세포주 및 방법에 기초하여 생물반응장치의 조건을 변경할 수 있을 것이다.
본 발명의 조성물 및 방법은 단백질의 발현에 다뤄질 수 있는 임의의 세포 배양 방법 또는 시스템과 함께 사용할 수 있다. 예를 들면, 관심의 단백질을 발현하는 세포는 회분 또는 유가 배양에서 성장할 수 있고, 여기서 배양은 단백질의 충분한 발현 후에 종료되고, 이후에 발현된 단백질은 수확되고 임의로 정제된다. 대안적으로, 관심의 단백질을 발현하는 세포는 관류 배양에서 성장할 수 있고, 여기서 배양은 종료되지 않고 새로운 영양물 및 다른 성분이 배양에 주기적으로 또는 연속적으로 첨가되고, 이러한 첨가 동안에 발현된 단백질은 주기적으로 또는 연속적으로 수확된다.
세포가 시딩된 후에, 세포는 세포수가 일반적으로 지수로 증가하는 성장기를 거친다. 성장기 동안에, 세포 배양의 온도 또는 온도 범위는 세포 배양이 여전히 생존가능하고/하거나, 높은 수준의 단백질이 생성되고/되거나, 대사 노폐물의 생성 또는 축적이 최소화되고/되거나, 실행자가 중요하다고 생각하는 다른 인자 또는 이런 인자의 임의의 조합이 발생하는 온도 또는 온도 범위에 주로 기초하여 선택된다. 하나의 비제한적인 예로서, CHO 세포는 대략 37℃에서 잘 성장하고 높은 수준의 단백질을 생성한다. 일반적으로, 대부분의 포유류 세포는 약 25℃ 내지 42℃의 범위 내에서 잘 성장하고/하거나 높은 수준의 단백질을 생성할 수 있지만, 본 개시내용에 의해 교시된 방법은 이러한 온도로 제한되지 않는다. 특정한 포유류 세포는 약 35℃ 내지 40℃의 범위 내에서 잘 성장하고/하거나 높은 수준의 단백질을 생성할 수 있다. 특정한 실시양태에서, 세포 배양은 20, 21, 22, 23, 24, 25, 26, 27, 28, 29, 30, 31, 32, 33, 34, 35, 36, 37, 38, 39, 40, 41, 42, 43, 44, 또는 45℃의 온도에서 성장기 동안에 1 이상의 시점에서 성장한다. 당해 분야의 숙련된 당업자는 세포의 요구 및 실행자의 생성 요건에 따라 세포를 성장시키는 적절한 온도 또는 온도 범위를 선택할 수 있을 것이다.
성장기 이후는 세포가 온도 변화와 같은 주변에서 일어나는 임의의 변화에 적응하는 전이기이다. 일어나는 변화는 통상적으로 생산기에 대한 매개변수이다. 당해 실시예에서, 4일째에, 온도는 약 37℃로부터 약 31℃로 감소하였다. 그러나, 온도 이동은 1회 이상 일어날 수 있고 반드시 하향으로 진행될 필요는 없다. 또한, 전이기 및 온도 이동은 생성 실행 동안 어느 날짜에도 일어날 수 있다. 대부분의 생산 방법이 다단계 과정을 포함하지만, 카르노신은 또한 단일 단계 과정에서 사용될 수 있다.
배양의 온도가 이동할 때, 온도 이동은 비교적 점진적일 수 있다. 예를 들면, 온도 변화를 완료시키기 위해 몇 시간 또는 몇 일이 걸릴 수 있다. 대안적으로, 온도 이동은 비교적 갑작스러울 수 있다. 온도는 배양 과정 동안에 꾸준히 증가 또는 감소할 수 있다. 대안적으로, 온도는 배양 과정 동안에 여러 시점에서 뚜렷한 양만큼 증가 또는 감소할 수 있다. 후속적인 온도(들) 또는 온도 범위(들)는 초기 또는 이전의 온도(들) 또는 온도 범위(들)보다 더 낮거나 또는 더 높을 수 있다. 당해 분야의 숙련된 당업자는 복수의 뚜렷한 온도 이동이 본 실시양태에 포함된다는 것을 이해할 것이다. 예를 들면, 온도는 (더 높거나 또는 더 낮은 온도 또는 온도 범위로) 1회 이동할 수 있고, 세포는 특정한 시간 동안 이 온도 또는 온도 범위에서 유지되고, 이후에 온도는 이전의 온도 또는 온도 범위보다 더 높거나 또는 더 낮을 수 있는 새로운 온도 또는 온도 범위로 다시 이동할 수 있다. 각각의 뚜렷한 이동 후에 배양 온도는 일정할 수 있거나 또는 특정한 온도 범위 내에 유지될 수 있다.
마지막으로, 세포수가 실질적으로 증가하지 않지만, 오히려 세포가 원하는 단백질산물을 생성하는 생산기가 존재한다. 그러나, 당해 분야의 숙련된 당업자는, 특정한 실시양태에서, 세포는 생산기 동안에 계속해서 성장하고 세포수가 증가할 수 있다는 것을 이해할 것이다. 생산기 동안에 생물반응장치의 환경은 세포가 더 생산적일 것 같은 조건에서 제어된다. 예를 들면, 온도는 일반적으로 단백질산물의 생성에 기여하는 성장기의 온도와 상이한 온도, 예를 들면 31℃에서 유지된다. 생성 실행 전체에 걸쳐, 세포에 세포가 필요로 할 수 있는 영양물 및 보충물을 함유하는 공급물 배지가 공급될 수 있다. 예를 들면, 특정한 경우에, 후속적인 생산기 동안에 세포에 의해 고갈 또는 대사되는 영양물 또는 다른 배지 성분으로 세포 배양을 보충하는 것이 유리하거나 필요할 수 있다. 비제한적인 예로서, 호르몬 및/또는 다른 성장 인자, (나트륨, 클로라이드, 칼슘, 마그네슘, 및 포스페이트와 같은) 특정 이온, 완충제, 비타민, 뉴클레오시드 또는 뉴클레오티드, 미량 원소(보통 매우 낮은 최종 농도로 존재하는 무기 화합물), 아미노산, 지질, 또는 포도당 또는 다른 에너지원으로 세포 배양을 보충하는 것이 유리하거나 필요할 수 있다. 이러한 보충 성분은 모두 세포 배양에 한번에 첨가될 수 있거나, 또는 이러한 보충 성분은 연속의 첨가로 세포 배양에 제공될 수 있다. 특정한 실시양태에서, 항노화 화합물은 생산기 동안에 1 이상의 시점에서 공급물 배지 중에 제공된다.
특정한 실시양태에 따르면, 생산기 동안에, 접종 배지 또는 공급물 배지 중에서 제공되던 간에, 세포 배양 배지 중에서 카르노신과 같은 항노화 화합물의 사용은 세포 생존능력 및/또는 특정 단백질 생성을 증가시킴으로써, 생성된 단백질의 전체 수율을 개선시킨다.
단백질 생성 과정의 양태는 세포 배양 분야의 숙련된 당업자에 의해 결정된다. 상기 기재된 것을 비롯하여, 무엇보다도, 시드(seed) 밀도, 생성 배양의 기간, 수확 동안의 조작 조건과 같은 매개변수는 세포주 및 세포 배양 배지의 함수이다. 따라서, 매개변수는 세포 배양 분야의 숙련된 당업자에 의해 부당한 실험 없이 결정될 수 있다.
성장기 동안의 온도 또는 온도 범위에서와 같이, 생산기 동안의 세포 배양의 온도 또는 온도 범위는 세포 배양이 여전히 생존가능하고/하거나, 높은 수준의 단백질이 생성되고/되거나, 대사 노폐물의 생성 또는 축적이 최소화되고/되거나, 실행자가 중요하다고 생각하는 다른 인자 또는 이런 인자의 임의의 조합이 발생하는 온도 또는 온도 범위에 주로 기초하여 선택된다. 일반적으로, 대부분의 포유류 세포는 약 25℃ 내지 42℃의 범위 내에서 생존가능하게 남아 있고 높은 수준의 단백질을 생성하지만, 본 개시내용에 의해 교시된 방법은 이 온도로 제한되지 않는다. 특정한 실시양태에서, 포유류 세포는 약 25℃ 내지 35℃의 범위 내에서 생존가능하게 남아 있고 높은 수준의 단백질을 생성시킨다. 특정한 실시양태에서, 세포 배양은 20, 21, 22, 23, 24, 25, 26, 27, 28, 29, 30, 31, 32, 33, 34, 35, 36, 37, 38, 39, 40, 41, 42, 43, 44, 또는 45℃의 온도에서 생산기 동안에 1 이상의 시점에서 성장한다. 당해 분야의 숙련된 당업자는 세포의 특정한 요구 및 실행자의 특정한 생성 요건에 따라 생산기 동안 세포를 성장시키는 적절한 온도(들) 또는 온도 범위(들)를 선택할 수 있을 것이다. 세포는 실행자의 요구 및 세포 그 자체의 요건에 따라 임의의 양의 시간 동안 성장할 수 있다.
특정한 실시양태에서, 회분 또는 유가 배양은, 실행자의 요구에 의해 결정된 바대로, 일단 배양이 1 이상의 관련 배양 조건을 달성하면 종료된다. 특정한 실시양태에서, 회분 또는 유가 배양은, 일단 발현된 단백질이 충분히 높은 역가에 도달하면, 일단 세포 밀도가 충분히 높은 수준에 도달하면, 일단 발현된 단백질이 충분히 높은 세포 밀도에 도달하면, 그리고/또는 대사 노폐물(예, 락테이트 및/또는 암모늄)의 바람직하지 않은 생성 또는 축적을 방지하도록 완료된다. 당해 분야의 숙련된 당업자는 실험용, 상업용, 및/또는 다른 고려사항에 기초하여 회분 또는 유가 배양이 완료되어야 할 때를 결정하기 위해 사용될 수 있는 다른 관련 배양 조건을 알 수 있을 것이다.
특정한 실시양태에서, 생성 실행 이후에, 단백질산물은 세포 배양 배지로부터 회수되고 전통적인 분리 기술을 이용하여 추가로 분리된다. 예를 들면, 단백질은, 단백질 함유 상청액을 보유하면서, 초기에 원심분리에 의해 분리될 수 있다. 추가로 또는 대안적으로, 단백질산물은 숙주 세포의 표면에 결합될 수 있다. 이러한 실시양태에서, 배지는 제거되고 단백질을 발현하는 숙주 세포는 정제 과정에서 제1 단계로서 용해된다. 포유류 숙주 세포의 용해는 유리 비드에 의한 물리적 파열 및 높은 pH 조건에의 노출을 비롯하여 당해 분야의 숙련된 당업자에게 공지된 여러 수단에 의해 달성할 수 있다.
통상적인 단백질 정제 방법을 이용하여, 단백질은 추가로 분리될 수 있다. 원하는 단백질산물을 분리 및 정제하는 방법은 세포 배양 분야에서 공지되어 있다. 구체적인 방법은 사용된 세포주 및 구하고자 하는 생산물에 의존한다.
카르노신과 같은 항노화 화합물은 특정한 세포 배양 과정에 최적인 시간에 배양 배지에 첨가할 수 있다. 당해 실시예의 경우, 카르노신의 첨가는 성장기가 실질적으로 완료된 후에 발생하고 전이기에 있다. 첨가 동안에, 세포 배양 배지는 온도 이동으로부터 발생하는 새로운 온도에 적응한다. 전이기는 일반적으로 생산기를 개시하도록 돕기 위해 제제가 첨가되는 때이다. 그러나, 카르노신은 성장기 및 생산기를 비롯하여 최적 결과를 생성시키는 생성 실행 동안의 어느 지점에서도 첨가할 수 있다. 카르노신은 또한 다른 성분, 예컨대 공급물 배지와 조합되어 첨가될 수 있다. 특정한 실시양태에서, 항노화 화합물은 접종 배지 중에 제공되고 전체 세포 배양 과정 동안에 세포 배양에 존재한다. 특정한 실시양태에서, 2 이상의 항노화 화합물이 세포 배양 배지 중에 제공된다. 특정한 실시양태에서, 2 이상의 항노화 화합물이 접종 배지 중에 제공되고 전체 세포 배양 과정 동안에 세포 배양에 존재한다. 특정한 실시양태에서, 2 이상의 항노화 화합물이 제공되고, 한 항노화 화합물은 접종 배지 중에 제공되고 전체 세포 배양 과정 동안에 세포 배양에 존재하지만, 다른 항노화 화합물은 세포 배양이 시작한 후에 제공된다.
특정한 실시양태에서, 세포 배양에 존재하는 항노화 화합물의 농도는 여러 세포 유형 및 생산물에 대해 상이하다. 특정한 실시양태에서, 존재하는 카르노신의 농도는 여러 세포 유형 및 생산물에 대해 상이하다. 일반적으로, 그 농도는 독성 효과 없이 생산성 및 품질을 향상시키기에 충분하다. 당해 실시예의 경우, 그 범위는 5 mM 내지 100 mM을 포함하지만, 이들에 국한되지는 않는다. 사용된 카르노신의 농도는 세포 배양 배지에 따라 변할 수 있는 것으로 이해된다. 특정한 세포주에 대한 카르노신의 적절한 농도는 통상적인 방법을 이용하여 예를 들면, 2L 생물반응장치와 같은 일상적인 소규모 실험으로 결정할 필요가 있다. 당해 분야의 숙련된 당업자는 당해 분야에 공지된 세포 배양 기술 및 진단 방법을 이용하여 부당한 실험 없이 카르노신 또는 다른 항노화 화합물의 유리한 또는 최적 농도를 결정할 수 있을 것이다.
화학 제제 이외에 카르노신 또는 또 다른 항노화 화합물을 첨가하는 것의 하나의 이점은 생존능력에 대한 효과이다. 통상적으로, 부티르산 나트륨과 같은 화학 제제의 첨가에 따라 세포 성장은 멈추고 생존 세포수는 감소한다.(Kim et al. Biotechnol Bioeng, 71: 184-193,184). 그러나, 하기의 실시예는 세포 배양 배지에 카르노신을 첨가하면 수확시에 카르노신과 같은 항노화 화합물의 부재하에 성장된 세포 배양에서 관찰되는 것보다 더 높은 생존능력이 유발된다는 것을 증명한다. 또한, 이러한 카르노신 함유 세포 배양은 특이적 생산성의 증가를 나타낸다. 세포 생존능력 및 특이적 생산성에 대한 긍정적인 효과로, 전체 수율은 더 높다.
또 다른 이점은 카르노신과 같은 항노화 화합물이 고분자량 응집체의 양 및/또는 산성 종의 수를 감소시킨다는 것이다. 고분자량 응집체 및 산성 종의 양을 감소시키면 단백질산물의 정제가 단순화된다. 단백질이 보다 효율적으로 분리되도록 만들면 단백질산물의 생성 비용이 감소한다. 특정한 실시양태에서, 카르노신과 같은 항노화 화합물은 미스폴딩된 및/또는 응집된 단백질의 양을 감소시키도록 사용된다. 특정한 실시양태에서, 카르노신 이외의 항노화 화합물은 고분자량 응집체 및/또는 산성 종의 양을 감소시키도록 사용된다. 특정한 실시양태에서, 2 이상의 항노화 화합물은 고분자량 응집체 및/또는 산성 종의 양을 감소시키도록 사용된다.
특정한 실시양태에서, 세포는 미국 특허 출원 제11/213,308호, 제11/213,317호 및 제11/213,633호(이들 각각은 2005년 8월 25일자에 출원되었고, 이들 각각은 이의 전체로 본원에 참조문헌으로 인용됨)에 기재된 임의의 세포 배양 방법에 따라 성장한다. 예를 들면, 특정한 실시양태에서, 세포는 누적 아미노산 농도가 약 70 mM 초과인 배양 배지 중에서 성장할 수 있다. 특정한 실시양태에서, 세포는 누적 아스파라긴에 대한 누적 글루타민의 몰 비가 약 2 미만인 배양 배지 중에서 성장할 수 있다. 특정한 실시양태에서, 세포는 누적 총 아미노산에 대한 누적 글루타민의 몰 비가 약 0.2 미만인 배양 배지 중에서 성장할 수 있다. 특정한 실시양태에서, 세포는 누적 총 아미노산에 대한 누적 무기 이온의 몰 비가 약 0.4 내지 1인 배양 배지 중에서 성장할 수 있다. 특정한 실시양태에서, 세포는 누적 글루타민과 누적 아스파라긴의 합한 농도가 약 16 내지 36 mM인 배양 배지 중에서 성장할 수 있다. 특정한 실시양태에서, 세포는 이전의 배지 조건 중 2, 3, 4 또는 모든 5의 조건을 함유하는 배양 배지 중에서 성장할 수 있다. 이러한 배지를 사용하면 높은 수준의 단백질 생성이 가능하고 암모늄 및/또는 락테이트와 같은 특정한 바람직하지 않은 요소가 작아진다.
일부 실시양태에서, 세포는 미국 가출원 제60/830,658호(2006년 7월 13일자에 출원되었고, 이의 전체로서 본원에 참조문헌으로 인용됨)에 기재된 1 이상의 조건하에 성장한다. 예를 들면, 일부 실시양태에서, 세포는 대략 10 내지 600 nM의 농도에서 망간을 함유하는 배양 배지 중에서 성장한다. 일부 실시양태에서, 세포는 대략 20 내지 100 nM의 농도에서 망간을 함유하는 배양 배지 중에서 성장한다. 일부 실시양태에서, 세포는 대략 40 nM의 농도에서 망간을 함유하는 배양 배지 중에서 성장한다. 당단백질을 성장시키는데 이러한 배지를 사용하면, 결과적으로 개선된 글리코실화 패턴(예를 들면, 1 이상의 올리고사카라이드 쇄 내에 더 많은 수의 공유 결합 당 잔기)을 갖는 당단백질이 생성된다.
본 발명의 특정한 실시양태에서, 본 발명의 1 이상의 방법에 따라 생성된 단백질은 약리 활성을 갖고 의약품의 제법에 유용하다. 본 발명의 1 이상의 방법에 따라 생성된 단백질은 피험자에게 투여할 수 있거나 또는 우선 비경구(예, 정맥내), 피내, 피하, 경구, 비강, 기관지, 안내, 점막(국소), 경점막, 직장, 및 질내 경로(이들에 국한되지는 않음)를 비롯하여 임의의 이용가능한 경로에 의한 전달을 위해 제제화될 수 있다. 본 발명의 약학 조성물은 통상적으로 약학적으로 허용가능한 담체와 조합되어, 전달제(즉, 상기 기재된 바의 양이온성 중합체, 펩타이드 분자 운반체, 계면활성제 등)인, 포유류 세포주로부터 발현된 정제된 단백질을 포함한다. 본원에서 사용되는 언어 "약학적으로 허용가능한 담체"는 약학 투여에 적절한 용매, 분산매, 코팅, 항세균제, 항진균제, 등장화제 및 흡수 지연제 등을 포함한다. 보충적인 활성 화합물은 또한 조성물 내로 혼입될 수 있다.
약학 조성물은 이의 의도하는 투여 경로에 적절하도록 제제화된다. 이러한 제제화는 당해 분야의 숙련된 당업자에게 공지되어 있다. 특정한 실시양태에서, 본 발명에 따라 생성된 단백질은 경구 및/또는 비경구 형태로 제제화된다. 특정한 실시양태에서, 투여 용이성 및 투약량 균일성을 위해, 이러한 경구 및/또는 비경구 형태는 단위 제형(dosage form)으로서 제제화되고, 각각의 단위는 필요한 약학 담체와 회합되어 원하는 치료 효과를 생성하도록 계산된 선결정된 양의 활성 단백질을 함유한다. 당해 분야의 숙련된 당업자는 본 발명에 따라 생성된 단백질에 적절한 단위 제형을 알 수 있을 것이다.
특정한 실시양태 및 양태는 상기에 상세히 기재되어 있다. 본 개시내용은 하기의 비제한적인 실시예에 의해 추가로 기재되어 있다. 그러나, 당해 분야의 숙련된 당업자는 이러한 실시양태에 대한 다양한 변형이 첨부된 청구의 범위 내에 있다는 것을 이해할 것이다. 카르노신 및/또는 다른 항노화 화합물의 첨가는 다른 포유류 세포 배양 및 단백질산물에 동일하게 적용가능하다는 것을 알 수 있을 것이다. 본 발명의 범위를 한정하는 것은 청구항 및 이의 등가물이며, 본 발명의 범위는 특정한 실시양태의 상기 설명으로 또는 상기 설명에 의해 제한되지 않고 제한되어서는 안 된다.
실시예 1: 접시 규모 카르노신 실험
MYO-29 세포주를 1 L 워킹 부피로 생물반응장치 내에서 혈청 비함유 생성 배지 중에서 배양하였고, 4일째에 37℃로부터 31℃로 온도 이동하였다. 생물반응장치의 pH를 7.00에서 유지하였고, 용존 산소는 30% 공기 포화에 있었다. 이어서, 세포 배양 배지를 4일, 7일, 및 10일째에 생물반응장치로부터 꺼내고, 8 ml 워킹 부피로 배양 접시에 붓고, 31℃ 인큐베이터에 위치시키고, 이 인큐베이터에서 접시 배양물을 12일까지 배양하였다. 세포에 5일 및 7일째에 공급물 배지를 보충하였다. 5일째에 10%(v/v)의 공급물 배지를 세포 배양물에 첨가하고, 7일째에 5%(v/v)의 공급물 배지를 세포 배양물에 첨가하였다. 10 mM 카르노신을 4일, 7일, 및 10일째에 각각 접시에 첨가하고, 세포 배양 배지를 12일째에 수확하였다.
도 1a는 7일째에 배양에서 산성 종 피크의 양에 미치는 카르노신 첨가의 효과를 보여준다. 도 1b는 7일 배양에서 고분자량 응집체에 미치는 카르노신의 효과를 보여준다. 도 1c는 4일, 대 7일, 대 10일째에 산성 종 피크에 미치는 카르노신 첨가의 효과를 보여준다. 도 1d는 고분자량 응집체에 대한 것이라는 점을 제외하고는 동일한 실험 결과를 보여준다. 전체적으로, 카르노신은 배양된 접시에서 산성 종 피크 및 고분자량 응집체 둘 다를 감소시킴으로써 긍정적인 효과를 가졌다.
실시예 2: 세포 배양 배지에 카르노신 첨가의 효과
5개의 생물반응장치를 혈청 비함유 접종 배지 중에서 MYO-29 세포주의 1 L 워킹 부피로 0.9×106개 세포/ml로 접종하였다. 모든 생물반응장치에 14일 실행의 3일, 5일, 7일, 및 12일째에 5%(v/v)의 공급물 배지를 공급하였다. 5%(v/v)의 공급물 배지의 10일 공급물을 2개의 대조군 생물반응장치 및 카르노신 함유 생물반응장치에 첨가하였다. 생물반응장치의 조건은 37℃의 온도, 7.00의 pH, 및 30% 공기 포화에서의 용존 산소 수준에서 유지하였다. 교반 속도는 200 rpm이고, 살포 가스는 공기 및 7% 이산화탄소의 소모를 가졌다.
모든 세포를 4일 동안 배양하였고, 이때에 20 mM 카르노신을 2개의 생물반응장치에 첨가하였고, 대조군에는 카르노신이 첨가되지 않았으며, 온도를 또한 4일째에 모든 생물반응장치에서 31℃로 이동시켰다. 생물반응장치를 생성 실행의 14일째에 수확하였다. 샘플을 세포 배양 배지의 진행을 모니터링하기 위해 실행 전체에 걸쳐 취하였다. 대조군은 예상된 바대로 수행되었다.
도 2a는 매일의 생존 세포 밀도를 보여준다. 도 2b는 카르노신을 갖는 생물반응장치의 매일의 세포 생존능력이 카르노신을 갖지 않는 2개의 생물반응장치에 비해 수확시에 더 높다는 것을 보여준다. 도 2c는 생물반응장치의 매일의 역가를 보여주고, 카르노신이 존재하는 2개의 생물반응장치가 수확 시간에 더 높은 역가를 갖는다는 것을 보여준다. 카르노신을 갖는 배양물은 도 2d에 도시된 누적 특이적 세포 생산성보다 더 우수하였다. 도 2e는 고분자량 응집체의 양을 보여주고 카르노신이 존재하는 생물반응장치에서 고분자량 응집체의 감소를 보여준다.
실시예 3: 여러 농도의 카르노신 첨가의 효과
4개의 생물반응장치를 혈청 비함유 접종 배지 중에서 MYO-29 세포주의 1 L 워킹 부피로 0.4×106개 세포/ml로 접종하였다. 모든 생물반응장치에 14일 실행의 7일째에 모두 5%(v/v)의 공급물 배지를 공급하였다. 생물반응장치의 조건은 37℃의 온도, 7.00의 pH, 및 30% 공기 포화에서의 용존 산소 수준에서 유지하였다. 교반 속도는 200 rpm이고, 살포 가스는 공기 및 7% 이산화탄소의 소모를 가졌다.
모든 세포를 4일 동안 배양하였고, 이때에 온도를 모든 생물반응장치에서 31℃로 이동시켰다. 또한, 4일째에, 20 mM 카르노신을 1개의 생물반응장치에 첨가하고, 2번째 생물반응장치에는 40 mM 카르노신이 첨가되었고, 대조군에는 어떠한 카르노신도 첨가되지 않았다. 모든 생물반응장치를 생성 실행의 12일째에 수확하였다. 샘플을 세포 배양 배지의 진행을 모니터링하기 위해 실행 전체에 걸쳐 취하였다. 대조군은 일반적으로 예상된 바대로 수행되었지만, 1개의 대조군은 전에 관찰 된 것보다 약간 더 낮은 매일의 생존능력을 가졌다.
도 3a는 매일의 생존 세포 밀도를 보여주고, 상이한 생물반응장치는 4 mM 카르노신을 갖는 생물반응장치를 제외하고는 꽤 유사하였다. 도 3b는 카르노신을 갖는 생물반응장치의 매일의 세포 생존능력은 카르노신을 갖지 않는 2개의 대조군 생물반응장치와 비교하여 수확시 더 높은 생존능력을 갖는다는 것을 보여준다. 도 3c는 매일의 역가를 보여주고, 카르노신이 첨가된 생물반응장치 및 대조군 중 하나는 유사하였다. 40 mM 카르노신을 갖는 생물반응장치는 더 높은 누적 특이적 세포 생산성을 가졌다(도 3d). 도 3e는 고분자량 응집체의 양을 보여주고, 전체적으로, 대조군과 비교하여 카르노신 첨가로 고분자량 응집체가 감소하였다.
실시예 4: 재조합 TNFR 융합 단백질의 생산물 특성을 개선시키기 위한 포유류 세포 배양에서 카르노신의 용도
TNFR 융합 단백질 세포주를 1 L 워킹 부피로 생물반응장치 내에서 혈청 비함유 생성 배지 중에서 배양하였다. 1일째에, 온도를 37℃로부터 29.5℃로 이동시켰고, 부티르산 나트륨을 1 mM의 최종 농도로 첨가하였고, HMBA를 3 mM의 최종 농도로 첨가하였다. 생물반응장치의 pH를 6.95에서 유지하였고, 용존 산소는 60% 공기 포화에 있었다. 2일째에, 카르노신을 20 mM의 최종 농도로 배양에 첨가하였다. 세포에 3일, 6일, 8일, 및 10일째에 5%(v/v)의 공급물 배지를 보충하였다. 세포 배양 배지를 12일째에 수확하였다. 재조합 TNFR 융합 단백질을 발현하는 CHO 세포가, 카르노신이 2일째에 첨가되지 않는다는 점을 제외하고는, 상기 기재된 것과 동일한 조건하에 성장하는 4개의 별개의 대조군 생물반응장치를 실행하였다. 도 4 내지 도 11에서의 대조군 데이터는 4개의 대조군 생물반응장치 실행의 평균이다.
도 4 및 도 5에서 볼 수 있는 것처럼, 세포 성장 및 세포 생존능력은 카르노신 첨가에 의해 상당히 영향을 받지 않았다. 도 6은 소수성 상호작용 크로마토그래피(HIC)에 의해 측정된 미스폴딩된 및/또는 응집된 TNFR 융합 단백질의 양은 세포가 카르노신 함유 배지 중에서 성장할 때 상당히 감소한다는 것을 보여준다. 도 7은 크기 배제 크로마토그래피(SEC)에 의해 측정된 고분자량(HMW) 응집체의 양도 또한 TNFR 융합 단백질을 발현하는 세포가 카르노신 함유 배지 중에서 성장할 때 상당히 감소한다는 것을 보여준다. 도 8 및 도 9는 생산물 역가 및 특이적 세포 생산성 각각은 TNFR 융합 단백질을 발현하는 세포가 카르노신 함유 배지 중에서 성장할 때 증가한다는 것을 보여준다. 마지막으로, 도 10 및 도 11은 생성된 TNFR 융합 단백질의 글리코실화는 세포가 카르노신 함유 배지 중에서 성장할 때 상당히 다르지 않다는 것을 보여준다.
본 개시내용의 몇몇 실시양태가 본원에 기재되어 있지만, 상기 설명은 단순히 예시적이다. 본원에 개시된 실시양태의 추가의 변형은 세포 배양 분야의 숙련된 당업자에게 일어날 수 있고, 모든 이러한 변형은 첨부된 청구항에 의해 한정되는 실시양태의 범위 내에 있는 것으로 간주된다.

Claims (30)

  1. 세포 배양에서 TNFR 융합 단백질의 생산 방법으로서,
    TNFR 융합 단백질을 암호화하는 유전자를 함유하는 포유류 세포를 항노화 화합물을 포함하는 세포 배양 배지 중에서 배양하는 단계로서, 유전자는 세포 배양의 조건하에 발현되는 것인 단계; 및
    단백질의 발현을 허용하기에 충분한 조건하에 그리고 시간 동안 배양을 유지시키는 단계
    를 포함하고, 세포 배양은 항노화 화합물이 결핍된 다른 점에서는 동일한 배지 중에서 다른 점에서는 동일한 조건하에 관찰되는 상응하는 세포 배양 특성과 상이한 개선된 세포 배양 특성을 나타내고, 개선된 배양 특성은 역가 증가, 세포 특이적 생산성 증가, 세포 생존능력 증가, 통합 생존 세포 밀도 증가, 고분자량 응집체의 축적 감소, 산성 종의 축적 감소, 및 이들의 조합으로 구성된 군으로부터 선택하는 것인 방법.
  2. 제1항에 있어서, 항노화 화합물은 카르노신, 아세틸-카르노신, 호모-카르노신, 안세린, 베타-알라닌 및 이들의 조합으로 구성된 군으로부터 선택하는 것인 방법.
  3. 제1항에 있어서, 항노화 화합물은 카르노신을 포함하는 것인 방법.
  4. 제1항, 제2항 또는 제3항에 있어서, 항노화 화합물은 약 5 mM 내지 약 100 mM의 농도로 세포 배양 배지 중에 존재하는 것인 방법.
  5. 제1항 내지 제4항 중 어느 한 항에 있어서, 세포 배양에는 보충 성분이 추가로 제공되는 것인 방법.
  6. 제5항에 있어서, 보충 성분은 공급물 배지 중에 제공하는 것인 방법.
  7. 제5항 또는 제6항에 있어서, 보충 성분은 호르몬 및/또는 다른 성장 인자, (나트륨, 클로라이드, 칼슘, 마그네슘, 및 포스페이트와 같은) 특정 이온, 완충제, 비타민, 뉴클레오시드 또는 뉴클레오티드, 미량 원소(보통 매우 낮은 최종 농도로 존재하는 무기 화합물), 아미노산, 지질, 포도당 또는 다른 에너지원, 및 이들의 조합으로 구성된 군으로부터 선택하는 것인 방법.
  8. 제5항, 제6항, 또는 제7항에 있어서, 보충 성분은 항노화 화합물을 포함하는 것인 방법.
  9. TNFR 융합 단백질의 생산 방법으로서,
    TNFR 융합 단백질을 암호화하는 유전자를 함유하는 포유류 세포를 세포 배양 배지 중에서 성장기 동안 세포 성장에 기여하는 제1 온도 또는 온도 범위에서 배양하는 단계로서, 유전자는 세포 배양의 조건하에 발현되는 것인 단계;
    세포 배양 배지의 온도 또는 온도 범위를 단백질 생성에 기여하는 제2 온도 또는 온도 범위로 이동시키는 단계; 및
    숙주 세포를 세포 배양 배지 중에서 전이기를 지나 생산기까지 제2 온도 또는 온도 범위에서 배양하는 단계
    를 포함하고, 항노화 화합물은 세포 배양이 항노화 화합물이 결핍된 다른 점에서는 동일한 배지 중에서 다른 점에서는 동일한 조건하에 관찰되는 상응하는 세포 배양 특성과 상이한 개선된 세포 배양 특성을 나타내도록 세포 배양에 첨가하고, 개선된 배양 특성은 역가 증가, 세포 특이적 생산성 증가, 세포 생존능력 증가, 통합 생존 세포 밀도 증가, 고분자량 응집체의 축적 감소, 산성 종의 축적 감소, 및 이들의 조합으로 구성된 군으로부터 선택하는 것인 방법.
  10. 제9항에 있어서, 항노화 화합물은 세포 배양 과정의 시작시에 세포 배양 배지에 첨가하는 것인 방법.
  11. 제9항 또는 제10항에 있어서, 항노화 화합물은 성장기 동안에 세포 배양 배지에 첨가하는 것인 방법.
  12. 제9항, 제10항 또는 제11항에 있어서, 항노화 화합물은 전이기 동안에 세포 배양 배지에 첨가하는 것인 방법.
  13. 제9항 내지 제12항 중 어느 한 항에 있어서, 항노화 화합물은 생산기 동안에 세포 배양 배지에 첨가하는 것인 방법.
  14. 제9항 내지 제13항 중 어느 한 항에 있어서, 항노화 화합물은 카르노신, 아세틸-카르노신, 호모-카르노신, 안세린, 베타-알라닌 및 이들의 조합으로 구성된 군으로부터 선택하는 것인 방법.
  15. 제9항에 있어서, 항노화 화합물은 카르노신을 포함하는 것인 방법.
  16. 제9항 내지 제15항 중 어느 한 항에 있어서, 항노화 화합물은 약 5 mM 내지 약 10O mM의 농도로 세포 배양 배지 중에 존재하는 것인 방법.
  17. 제16항에 있어서, 세포 배양에는 보충 성분이 추가로 제공되는 것인 방법.
  18. 제17항에 있어서, 보충 성분은 공급물 배지 중에 제공하는 것인 방법.
  19. 제17항 또는 제18항에 있어서, 보충 성분은 호르몬 및/또는 다른 성장 인자, (나트륨, 클로라이드, 칼슘, 마그네슘, 및 포스페이트와 같은) 특정 이온, 완충제, 비타민, 뉴클레오시드 또는 뉴클레오티드, 미량 원소(보통 매우 낮은 최종 농도로 존재하는 무기 화합물), 아미노산, 지질, 포도당 또는 다른 에너지원, 및 이들의 조합으로 구성된 군으로부터 선택하는 것인 방법.
  20. 제17항, 제18항 또는 제19항에 있어서, 보충 성분은 항노화 화합물을 포함하는 것인 방법.
  21. 제1항 내지 제20항 중 어느 한 항에 있어서, 생성된 TNFR 융합 단백질은 포유류 세포에 이종성인 것인 방법.
  22. 제1항 내지 제21항 중 어느 한 항에 있어서, 포유류 세포는 CHO 세포인 것인 방법.
  23. 제1항 내지 제22항 중 어느 한 항에 있어서, TNFR 융합 단백질은 TNFR-Fc를 포함하는 것인 방법.
  24. 제23항에 있어서, TNFR-Fc는 에타네르셉트(etanercept)인 것인 방법.
  25. 제1항 내지 제24항 중 어느 한 항에 따르는 방법에 의해 생성된 TNFR 융합 단백질.
  26. 제25항에 있어서, TNFR 융합 단백질은 TNFR-Fc를 포함하는 것인 단백질.
  27. 제1항 내지 제26항 중 어느 한 항에 따르는 단백질의 생산 방법으로서, 단백질을 세포 배양 배지로부터 분리시키는 단계를 추가로 포함하는 방법.
  28. 제27항에 있어서, 단백질은 제제화를 위해 추가로 정제하거나 또는 처리하는 것인 방법.
  29. 제28항에 있어서, 단백질은 약학 조성물로 제제화하는 것인 방법.
  30. 제1항 내지 제29항 중 어느 한 항에 따르는 단백질의 생산 방법으로서, 고분자량 응집체는 미스폴딩된(misfolded) 단백질을 포함하는 방법.
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