CN102858954A - 改进的细胞培养方法 - Google Patents

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Abstract

本发明涉及用于在哺乳动物CHO细胞中产生多肽的细胞培养方法，其特征在于一次或多次温度变动和pH变动，就它们的时间选择和步长调整该变动，以减少细胞死亡、提高产物产率和改善产物质量。

Description

改进的细胞培养方法
技术领域
本发明涉及生物技术的一般领域，尤其涉及细胞的培养及其在以工业规模生产多肽中的用途。
本发明提供细胞培养方法，其特征在于至少一次温度变动和至少一次pH变动。这些方法适合用于培养具有高细胞存活率(viability)的细胞，优选如CHO细胞的哺乳动物细胞。在用于尤其是通过在哺乳动物细胞培养系统中重组表达多肽来尤其是以工业规模产生多肽时，本发明的细胞培养方法进一步允许获得高多肽生产力。
背景技术
在过去二十年中，用重组技术制备多肽已发展为标准方法。通过克隆编码各多肽的基因、然后用该待表达的基因转化适宜的表达宿主、最后产生和纯化所获得的重组多肽产物来获得重组多肽提供了一类全新的通过生物学设计和产生的药物。
在重组DNA技术后使用生物工程领域中发展的产生方法，制药产业中已制备了数目越来越多的药物活性化合物。
这类生物产物包括单克隆抗体，其已发展为包括自身免疫病、炎性障碍、免疫抑制、肿瘤学等的多种医学领域中重要的治疗选择。
这类生物来源药物的发展需要以工业规模生产，从而提供大量重组多肽。优选的表达系统是哺乳动物细胞培养物，其优于大多数其他基于昆虫细胞、酵母等的真核系统，或甚至传统的原核表达系统。
但是，尤其是在工业规模，哺乳动物细胞培养包括巨大的挑战。用于哺乳动物细胞培养的生产设施需要彻底优化许多方法条件。
具体而言，用于在哺乳动物细胞中产生多肽的细胞培养方法需要持续优化培养条件及其对具体细胞系或产物的适应，以达到与最佳产物质量组合的高容积产物产率。
之前的许多努力集中在细胞培养基的基本参数上，包括它们与例如离子、氨基酸、维生素或痕量元素的种类和浓度相关的组成，或培养基的重量摩尔渗透压浓度。处于研究焦点中的其他重要参数是例如达到最佳细胞生长的流加组合物或流加时间表。
还已知温度和pH作为基本生理学参数对哺乳动物细胞的培养具有显著影响。一般而言，温度显著影响细胞的生长状态和存活率。但是，除此之外，它还可以更明确地通过改变例如糖基化来影响多肽产物及其特征(US 2003/0190710A1；EP 1373547A1；US 2004/0214289A1)。
生长培养基和细胞所维持在的pH也可以以依赖于具体细胞系和产物的具体方式来影响和改变细胞生长和多肽产生(Sauer等Biotechnologyand Bioengineering 2000，67卷，586-597页；Yoon等，Biotechnology andBioengineering 2004，89卷，346-356页；Kuwae等，Journal of Bioscienceand Bioengineering 2005，100卷，502-510页)。
在培养时程中，细胞的需要可以改变。在开始时，针对改善的细胞生长优化条件是有利的，但在随后的阶段，与获得高产物效价相关的增强的细胞存活和活细胞密度的维持变得重要。在这方面，已提出在细胞培养过程中引入一个或多个温度梯度(Chen等，J Biosci Bioeng.2004；97(4)：239-43)。为此，至少在两个不同温度下培养培养哺乳动物细胞，其中针对细胞生长优化第一个较高的温度，而选择第二或第三个较低的温度来改善细胞的生产力(例如Weidemann等，Cytotechnology.1994；15(1-3)：111-6；WO 00/36092；EP 0 764 719 A2；US 2005/019859；EP 1 575 998；US 2008/081356)。其他文件描述了温度梯度与其他具体的培养基特征组合的用途。例如，EP 1 757 700 A2公开了温度梯度与丁酸盐作为培养基成分存在的组合，而EP 1 789 571 A1描述了温度梯度与确定的氨基酸含量组合。
还改变了其他细胞培养条件。US 5 856 179介绍了用于在补料分批细胞培养中产生多肽的方法，其中，在培养过程中，培养基的重量摩尔渗透压浓度从主生长期中的约280-330mOsm显著改变至生产期期间的约400-600mOsm。
WO 02/101019着眼于许多具体的培养基成分，如谷氨酰胺和葡萄糖浓度，包括温度和pH的改变。但是，发现高葡萄糖培养基中的pH变动对培养物具有负面影响，不建议在生长期或生产期期间降低pH。
WO2006/026445公开了用于产生多肽的方法，其中细胞培养条件从一组培养条件变为第二组培养条件，且其中此改变与具体的培养基特征组合，该培养基特征与具体氨基酸的含量相关。条件的改变明确涉及温度变动。诸如pH或重量摩尔渗透压浓度的其他条件改变一般作为附加选择提到，但是，未指出具体的参数设置。
鉴于以上挑战和现有不足，工业生物技术领域中存在对改进的培养方法的持续需要，该培养方法允许以甚至更高的产率(即改善的比生产力和总体生产力)和提高的产物质量以工业规模产生重组多肽。
多肽产生方法的具体技术目标是通过优化总体细胞培养方法的参数来维持高细胞存活率并最大化多肽的最终产率。
发明概述
本发明涉及在用于产生重组多肽的方法中组合温度变动和pH变动。适应重组细胞，尤其是CHO细胞的需要，这两个参数的具体组合导致提高细胞的生产力以及改善重组产生的多肽的产物质量。具体而言，本发明发现了基于一次或多次温度变动和pH变动的具体时间选择和安排的绝对和相对而言以及与该变动的具体量级有关的积极作用。
根据本发明的一个方面，公开了用于产生重组多肽的方法，其包括在培养基中培养CHO细胞并表达该重组多肽，其中在该过程中改变温度和pH。
具体而言，本发明的方法涉及至少一次温度变动和至少一次pH变动。在本发明的一个实施方案中，首先在第一温度下培养和维持细胞至少3天、备选地至少4天或至少5天，然后实施从第一个较高的温度至第二个较低的温度的变动。第二个较低的温度比第一温度低约1℃至约8℃。在本发明的另一备选实施方案中，温度变动在例如约2℃和约5℃之间，尤其是约4℃或约3.5℃。然后维持第二温度至少2天。可以维持第二温度直至收获。
根据本发明的一个方面，第一温度优选在约33℃和约38℃之间的范围内，第二个温度优选在约30℃和约37℃之间的范围内。
除温度变动外，pH也从第一pH变至第二pH。因此，本发明的方法包括至少一次pH变动。具体而言，在第一pH值下培养细胞至少2天，然后使pH变动至第二pH值，该第二pH值比第一pH低约0.05至约1个pH单位，在该第二pH下培养细胞至少1天、备选地至少2天。在一些实施方案中，将维持该第二pH直至收获。
第一pH值优选在约pH 6.8和约pH 7.5之间的范围内。第二pH值优选在约pH 6.0和约pH 7.1之间的范围内。
因此，本发明的一个实施方案是用于产生重组多肽的方法，其包括在包含至少一次温度变动和至少一次pH变动的条件下在培养基中培养CHO细胞，并表达该重组多肽
其中
-在第一温度下培养细胞至少3天，然后使温度变动至第二温度，该第二温度比第一温度低约1℃至约8℃，在该第二温度下维持细胞至少另外2天的时间；
-在第一pH值下培养细胞至少2天，然后使pH变动至第二pH值，该第二pH值比第一pH低约0.05至约1个pH单位，在该第二pH下培养细胞至少1天。
本发明的方法可以可选地包括第二pH变动，其在至少1天后跟随第一pH变动。如果在第一pH变动后至少1天跟随第二pH变动，则第三pH值比第二pH值高约0.05个pH单位至约1个pH单位。可以维持第三pH值直至收获。
本发明的细胞培养方法包括主动和/或被动的pH变动，即，通过将pH设定点改变为新值来“主动地”改变pH，和/或通过允许由代谢产物的累积引起的培养基pH变化来“被动地”改变pH，从而遵循预定pH范围内的细胞培养物特异性代谢pH谱。在本发明的优选实施方案中，通过加入技术人员已知的一种或多种pH改变和调节剂来诱导该主动变动，如酸(例如HCl)或碱(例如NaOH)。在该方法的另一优选实施方案中，这通过定义一个pH设定点和死区(允许pH在其中改变)来达到。与主动变动不同，pH的被动变动或改变不是通过加入一种或多种pH改变剂诱导的。
在另一方面，用无蛋白质且无血清的培养基来实施本发明的方法。优选地，该培养基的特征在于总氨基酸含量在约40mM和约100mM之间，备选地在约50mM和约100mM之间。
以包括流加至少两种向培养物中加入的营养物溶液的补料分批方式进行上文定义的优选方法。在这种方法中，例如，向培养基中加入的流加溶液之一是包含二肽半胱氨酸和氨基酸酪氨酸的流加物。进一步优选，该流加物在高于10的碱性pH的水溶液中包含各自的浓度在约6.5g/l至约8.0g/l的范围内和约9g/l至约11g/l的范围内的二肽半胱氨酸和氨基酸酪氨酸。具体而言，半胱氨酸的浓度可以是约7.25g/l，酪氨酸的浓度可以是约10.06g/l。在优选实施方案中，按每天为初始培养基重量的约0.2wt％至约0.8wt％或备选地每天为初始细胞培养基重量的约0.4wt％向培养基中加入包含半胱氨酸和酪氨酸的流加溶液。
本发明的方法优选用于产生糖基化的重组多肽。根据具体实施方案，该多肽是抗体或抗体片段。
附图简述
可以通过参考以下实例和附图来更好地理解本发明。但是，实例并非旨在限制本发明的范围。
图1显示从pH 7.00变动至pH 6.80的主动pH变动的阶跃变化实施。
图2A显示通过被动pH变动实施获得的pH谱。通过将设定点设置为6.90并定义0.10的死区来在生产用生物反应器中达到从7.00至6.80的pH变动。至6.80的第一pH变动后，主动维持pH在6.80，直至培养结束。
图2B显示具有第二pH变动的pH谱。在此实例中，未达到pH上限(之前的pH)。
图2C显示具有第二pH变动的pH谱，但此处pH再次达到pH上限，并维持在该pH。
图3作为培养时间的函数显示恒定温度对温度变动对于摇瓶培养物中产生mAb1的CHO细胞克隆的活细胞密度的作用(见实施例1)。
图4显示恒定温度对温度变动对于产生mAb1的CHO细胞克隆的存活率的作用(见实施例1)。
图5作为培养时间的函数显示产生mAb1的CHO细胞克隆的有温度变动和无温度变动的摇瓶培养物的产物效价(见实施例1)。
图6显示产生mAb2的克隆中乳酸浓度随培养时间的变化(见实施例2)。
图7作为培养时间的函数显示具有CHO细胞克隆的300L生物反应器中的活细胞密度。培养条件包括温度梯度(第5天)及用设定点和死区调节pH引起的两次pH变动(也见实施例2)。
图8作为培养时间的函数显示具有CHO细胞克隆的300L生物反应器中的产物效价。该方法将温度变动与pH变动组合(也见图7和实施例2)。
图9作为活细胞积分的函数显示通过具有培养在玻璃生物反应器中的CHO细胞培养物的补料分批方法获得的三个独立实验的mAb3浓度。培养条件包括三个实验中都相同的温度变动及仅一个实验中的附加pH变动。
发明详述
根据本发明，用于制备重组多肽的方法包括培养CHO细胞并表达该重组多肽，其中，在该方法中改变温度和pH。本发明试图通过在整个培养时程中动态改变细胞培养条件(包括温度变动和pH变动)来改进在CHO细胞培养物中大规模生产多肽的方法。
术语多肽的“大规模生产”涉及用于制备治疗活性生物药物的重组多肽的工业生产通常所需的量。具有至少500L体积、或至少1000L、或备选地至少5000L或甚至更高体积的细胞培养基的细胞培养通常代表大规模生产应用。
本文所用的术语“细胞培养基”指营养物的水溶液，其可以用来培养细胞延长的时间。通常，细胞培养基包含以下成分：能量来源，其通常将是糖类化合物，优选葡萄糖；氨基酸，优选碱性组的氨基酸，包括所有必需氨基酸；维生素和/或以低浓度需要的其他有机化合物；游离脂肪酸；无机化合物，包括痕量元素，无机盐；缓冲化合物；及核苷和碱基。
由于安全性和污染问题，细胞培养基在制药工业领域中，例如在产生治疗活性重组多肽中的用途一般不允许使用任何生物来源的材料。因此，本发明的细胞培养基优选是无血清和/或无蛋白质培养基。术语“无血清和/或无蛋白质培养基”代表化学成分完全确知的培养基，其不包含来自动物来源的添加剂，如组织水解物，例如胎牛血清等。此外，还优选不向本发明的细胞培养物中加入蛋白质，尤其是生长因子，如胰岛素、转铁蛋白等。优选地，本发明的细胞培养基也不补充水解蛋白质来源，如大豆、小麦或水稻蛋白胨或酵母水解物等。
本文所用的术语“温度变动”指通过主动将温度设定点变为更低的值来改变生物反应器/培养瓶中的培养物的温度。首先将温度控制和稳定在确定的温度一段时间，然后在改变设定点后使温度稳定在另一确定的温度一段时间。温度梯度不是指培养物中小的自发性温度波动。
本文所用的术语“pH变动”指通过主动将pH设定点变为更低或更高的值或通过允许在pH上限和下限之间发生pH变动来改变生物反应器/培养瓶中的培养物的pH。
取决于培养瓶/生物反应的大小和培养体积，在培养基中测量的各参数的变动可以耗时几分钟至几小时。
pH可以通过下文更详细描述的主动途径和/或被动途径以两种不同的方式变动。
通过pH设定点变为新值来定义术语pH的“主动变动”。在本发明的一个优选实施方案中，通过加入技术人员已知的一种或多种pH改变和调节剂来诱导主动变动。
术语“被动变动”是指，在pH被动变动的过程中，允许细胞自身通过代谢产物的累积来改变培养基的pH，从而遵循预定pH范围内的细胞培养物特异性代谢pH谱。在该方法的一个实施方案中，这通过定义一个pH设定点和死区(允许pH在其中改变)来达到。与主动变动不同，pH的被动变动或改变不是通过加入一种或多种pH改变剂诱导的。
为了将pH维持在具体的设定点或在pH变动过程中改变pH，向培养物中加入pH调节剂。用于细胞培养目的的典型pH调节剂包括液体碱溶液或酸溶液，如NaOH或HCl。向培养瓶/生物反应器中的培养基加入那些pH调节剂。备选地，可以用CO2通气细胞培养基来调节pH。
根据本发明的第一方面，公开了用于制备重组多肽的方法，其包括培养CHO细胞并表达该重组多肽，其中，在该方法过程中改变温度和pH。更具体而言，在第一温度下培养和维持细胞至少3天、备选地至少4天或至少5天后，发生从第一个较高的温度至第二个较低的温度的变动。此第二个较低的温度比第一温度低约1℃至约8℃。在本发明的另一实施方案中，温度变动可以在约2℃和约5℃之间，在一些实施中，它是约4℃或约3.5℃。然后维持此第二温度至少2天。除温度变动外，pH也从第一pH变至第二pH。
根据细胞系的需要预先确定并调整关于温度变动和pH变动的具体参数，该细胞系已用编码所产生的各多肽的一个或多个具体的基因构建体转染。备选地，可以根据用于在生物反应器中大规模生产的培养期间测定的代谢参数来确定需要。
从较高温度至较低温度的温度变动是有用的，因为第一温度对细胞生长最适，而第二温度降低细胞死亡的速率。因此，降低的温度将允许更长时间维持高活细胞密度。相对于初始温度，此降低的温度下目的多肽的细胞比生产力通常未显著降低，细胞比生产力有时可以相同，或者有时甚至更优。更长时间维持高活细胞密度可以额外提供最小化劣质产物形成的优势。这些因素的组合使得能够在收获时获得高容积生产力，并达到高效价的优质目的产物。在一个实施方案中，第一温度在约33℃和约38℃之间的范围内。在另一实例中，第一温度在约36℃至约38℃之间。温度变动后达到的第二温度可以在约30℃至约37℃之间、或约32℃至约34℃之间、或备选地约30℃至约32℃之间的范围内。
温度变动的时间选择对最大化生产力很重要。如果太早进行温度变动，则将达不到高细胞密度，或耗费长时间来达到高细胞密度。如果太晚进行温度变动，则不可以有效阻止活细胞密度的下降。优选地，以接种用于大规模生产重组多肽的生物反应器后的天数来定义温度变动的时间选择。在本发明的另一实施方案中，可以通过在大规模生产生物反应器中达到的细胞密度来定义该时间选择。例如，在细胞的线性或对数生长期期间，或在达到最大细胞密度的40％至90％时起始温度变动。依赖于细胞密度的设定点可以以相对值(可以达到的最大细胞密度的百分比)或绝对值(活细胞/毫升)表示。在一个具体实例中，选择细胞密度在60％至90％之间。
取决于所使用的具体生物反应器/生长瓶和细胞系，接种生物反应器/生长瓶和温度变动之间的时间选择可以在约3天和约14天之间。备选地，该变动可以发生在第3天至第8天之间。作为上述单一标准之外的备选，还可以通过组合上述变量中的两个来设置双标准，使得所选择的关于时间和/或细胞密度的条件必须得到满足。
如果为最佳生长和产生所必需，还可以使用一个以上的温度梯度，例如至少2个梯度，其各由至少约1℃、备选地至少约2℃的温度改变组成，其中维持各温度至少1天。因此，温度甚至可以进一步降低，且可以遵循更复杂的温度谱。
根据本发明，pH变动前在第一pH值下培养细胞至少2天、备选地至少3天，例如至少4天或甚至至少5天。选择起始培养后前几天的pH有利于生物反应器中细胞密度的快速扩大。在这段时间内，将生物反应器的pH控制在最适于细胞生长的某个设定点。一旦达到某个细胞密度，则改变培养物的pH是有利的。此第一时期之后，使pH变动至第二pH值，该第二pH值比第一pH低约0.05-1个pH单位。在该第二pH下培养细胞至少2天。在本发明的一些实施方案中，第二pH值可以比第一pH低约0.15至约1个pH单位。通常通过改变生物反应器/培养瓶的pH设定点来达到此pH变动。选择第二pH值来减少细胞死亡(例如凋亡)，并允许维持优质多肽的高细胞比产生速率。结果，在第一实施方案中，以接种用于大规模生产重组多肽的生物反应器后的天数来定义pH变动的时间选择。在第二实施方案中，可以通过在大规模生物反应器中达到的细胞密度来定义该时间选择。根据另一备选，可以根据在细胞培养基中培养期间测量的具体代谢参数来确定该时间选择。在一个非限制性实例中，这可以是乳酸浓度。还可以使用反映培养物代谢状态的非直接参数，例如每个时间单位所需加入的用于将pH维持在高(upper)pH设定点的CO2或控制酸，或将pH保持在下pH设定点所需加入的NaOH或控制苛性剂。备选地，可以通过组合诸如接种后的天数和细胞密度的参数来设置组合标准，而不是仅使用一个pH变动标准。
pH变动策略的益处还涉及以下事实，可以在培养过程中降低溶解的二氧化碳水平及碱的加入，从而避免它们的负面作用。在开始培养时，培养瓶或生物反应器中具有较高的pH值(例如7.0)是有利的，因为较低的pH值(例如6.8)将需要较高水平的二氧化碳来维持pH。但是，这些高水平的二氧化碳可以对细胞具有负面作用，并降低生长速率。相反，在培养的后期，维持高pH(例如7.0)比维持低pH(例如6.8)需要更多的碱加入。这是因为形成了乳酸，必须通过加入碱来补偿所产生的酸度。pH设定点越高，所需加入的碱的量越高。碱加入提高了培养物的重量摩尔渗透压浓度，其可以对生长和高活细胞密度的维持不利。
还可以从最小化乳酸形成的角度描述pH变动策略的潜在益处。CHO细胞在较低pH值(例如6.8)下产生的乳酸一般比在较高pH值(例如7.0)下产生的乳酸少。产生较少的乳酸导致加入较少的碱，如上文所述，这是有益的。
在一个实施方案中，选择第一pH在pH 6.8和7.5之间的范围内。在另一实施方案中，选择第一pH在pH 6.8和7.2之间的范围内。在另一实施方案中，选择第一pH为至多pH 7，或备选地低于pH 7。pH变动后达到的第二pH值在pH 6.0和pH 7.5之间或pH 6.5和pH 6.8之间的范围内。
选择温度变动和pH变动的相对时间选择来达到最佳结果。以具体方法为基础选择温度变动和pH变动的最佳时间选择，并使其依赖于培养物的生长状态或代谢状态。温度变动基本上可以在独立于pH变动的时间选择的培养时间点实施。在本发明的一个实施方案中，温度变动可以发生在pH变动之前或与pH变动同时发生。在本发明的一个实施方案中，温度变动发生在pH变动之前。例如，可以在发生pH变动前1-5天之间起始温度变动。在本发明的另一第二实施方案中，与pH变动同时起始温度变动。术语“同时”在此指两个参数都从第一值向第二值变动。在已改变温度的设定点和pH的设定点，且两个参数都尚未达到它们的第二稳定值时，可以发生这类同时变动。备选地，在被动pH改变期间改变温度设定点时，可以发生这种情况。这在通过定义pH上限和下限的设定点和死区来调节pH的情况下发生(还见下文)。在本发明的另一实施方案中，温度变动可以发生在pH变动之后。例如，可以在pH变动后1至5天之间起始温度变动。
在本发明的另一方面，在该第一pH值至该第二pH值之间主动或被动改变地pH。存在控制培养物pH和实施pH变动的许多可能的方式。在本发明的一个方面，通过将pH控制器的pH设定点(无死区)变为新值来使pH主动地从第一pH值变动至第二pH值。
结果，培养物中从第一pH值至第二pH值的改变是半直接的(quasi-immediate)(阶跃变化)。图1显示pH变动的这种阶跃变化实施，在此具体实例中，从pH 7.00变动至pH 6.80。在本发明的此实施中，首先通过相应地加入pH调节剂(例如CO2或NaOH)来将pH维持在高pH值，然后通过主动改变设定点(无死区)来变至较低的值。可以通过主动向培养物中加入/添加酸化剂(产生快速变化)或通过省却将pH保持在更碱的第一pH的物质来达到较低设定点的pH。根据生物反应器的大小及上述影响pH的方法，pH改变可以在几分钟至24小时内完成。
在本发明的另一方面，允许pH从第一pH值被动变动(漂变)至第二pH值(对应于pH的上限和下限)，从而遵循细胞培养物特异的代谢谱。结果，从第一pH值至第二pH值的改变是逐渐的。通过用设定点和死区编程生物反应器的pH控制器来达到控制细胞培养基pH和实施pH变动的这种备选方式。这定义了该方法可允许的pH范围，在该范围内，pH控制器不采取行动。例如，死区为0.10个pH单位的6.90的设定点pH将pH 7.00定义为pH上限，将pH 6.80定义为pH下限。在细胞培养生产生物反应器中，在开始培养时(前几天)，pH通常将在高限，其中控制器通过向培养物中加入二氧化碳来阻止pH升高。由于细胞产生的乳酸逐渐累积，pH最终通常将在几小时内例如从7.00持续降低至6.80。一旦达到例如6.80的pH下限，则控制器通过向培养物中加入碱溶液来阻止pH下降超出此pH。根据生物反应器的大小、具体细胞系、细胞密度或培养基条件，pH渐变可以在几小时内发生或耗费至多一天。
在本发明的另一方面，pH变动后，在剩余培养时间内将培养物的第二pH主动维持在第二pH，直至收获。这通过将pH设定点改变为该第二pH值并相应地加入pH调节剂来达到。
在本发明的另一方面，在第一pH变动后跟随第二变动。第二pH变动发生在第一pH变动后至少1天，所达到的第三pH值比第二pH高至少0.05个pH单位。
在本发明的另一方面，第二pH变动也可以主动或被动地发生，以达到该第三pH值。在第一实施方案中，这可以通过主动改变已针对第一pH变动描述的pH设定点(见上文)来进行。第二pH变动的时间选择可以以第一pH变动后的天数定义，和/或同样根据诸如乳酸浓度的代谢参数来确定。这种变动通常可以发生在第一pH变动后1至10天之间。通过改变培养物的pH设定点来起始主动变动。将相应地加入pH调节剂。
在第二实施方案中，还可以允许pH被动改变，并遵循它的代谢pH谱。这可以例如通过定义上文已述的pH下限和上限来实施。在这种情况下，pH上限可以对应于与针对第一pH变动定义的pH上限相同的pH上限，或者它可以改变为新的较低值或较高值。优选地，可以通过用设定点和死区编程生物反应器的pH控制器来达到这种pH下限和上限。这种pH的被动改变可以由于细胞在培养晚期重新代谢乳酸而发生，其导致pH再次提高至高于该pH范围的下限的值。在一些情况下，pH可能再次达到该范围的上限，在其他情况下，它还可以停留在该上限以下。第二pH变动的量级可以包括0.05至1个pH单位之间的值。不对这种被动pH变动的持续时间作精确定义，因为变动/改变的速率取决于代谢活性及细胞对乳酸的重新代谢。通常耗费0.5至2天来达到pH上限，但在被动改变的情况下，pH也可以停留在所定义的阈值上限以下，直至培养结束。
实施策略的选择将取决于多种因素，如细胞对CO2的敏感性和产物形成的最适pH。可以通过在培养过程中定义两个或多个具体设定点或简单地通过定义设定点和死区(其还可以可选地在培养期间改变)来获得不同的pH谱。图2中显示可以通过设置设定点和死区来获得的不同pH谱，以具有0.10的死区的pH 6.90的设定点作为示例值。
在本发明的另一方面，通过包括温度变动和一次或多次pH变动的方法产生的多肽的总量高于未将温度变动与一次或多次pH变动组合的方法。将至少一次温度变动与至少一次pH变动(其针对具体转染细胞系的需要，就时间选择和步长进行修改)组合已导致更好的产物产率。
还在本发明的另一方面，与在未将温度变动与一次或多次pH变动组合的情况下获得的质量相比，包括温度变动和一次或多次pH变动的方法具有产生具有改善的质量的产物的潜能。生产期期间培养物中的pH变动至较低pH值的有益作用的一个可能的原因可以是以下：氨通常随培养时间累积在细胞培养基中，且已知其可能影响产物糖基化，可能的结果是降低产物质量。假定氨以的NH3的形式进入细胞，在细胞中，它可以通过捕获H3O+离子来影响胞内pH。产生的胞内pH的提高可以影响糖基化。培养物pH变动至较低的值将通过NH3质子化为NH4 +的增加来降低胞外NH3的浓度，而细胞对NH4 +是不通透的。
可以用多种细胞培养基来实施本发明的包括温度变动和一次或多次pH变动的细胞培养方法。可以使用的常用细胞培养基是例如D-MEM(Dulbecco’s Modified Eagle Medium)、D-MEM/F-12、MEMα、Fischer′s培养基、RPMl 1640BME、BGJb，但不限于这些实例。这些培养基可以进一步补充附加成分，例如营养物、维生素或糖类。
主要针对细胞生长优化的适宜培养基优选包含以下范围的初始氨基酸浓度：
  氨基酸   浓度(mmol/L)
  精氨酸，游离碱   4.0-6.0，优选4.5-5.5
  天冬酰胺一水合物   3.0-6.0，优选4.0-5.5
  天冬氨酸   2.5-4.0，优选3.0-3.6
  甘氨酸   0.3-0.8，优选0.5-0.7
  组氨酸，HCl H2O   0.6-1.0，优选0.7-0.9
  异亮氨酸   2.0-5.0，优选3.0-4.0
  亮氨酸   3.0-7.0，优选3.5-6.0
  赖氨酸HCl   2.0-4.0，优选2.5-3.5
  甲硫氨酸   1.0-1.5，优选1.2-1.4
  苯丙氨酸   1.0-2.0，优选1.3-1.8
  脯氨酸   2.5-6.0，优选3.0-5.5
  丝氨酸   3.0-8.0，优选4.0-7.0
  苏氨酸   2.0-3.5，优选2.5-3.1
  色氨酸   0.4-1.0，优选0.5-0.8
  缬氨酸   2.5-5.0，优选3.0-4.5
  酪氨酸   1.0-2.0，优选1.2-1.8
  半胱氨酸   0.5-1.0，优选0.6-0.8
  谷氨酸   5.5-9.5，优选6.2-8.2
包含上表中定义的氨基酸的培养基可以有利地用于本发明的改进的细胞培养方法。
本发明的另一方面包括设计用于大规模生产重组多肽的生产培养基的用途。这些生产培养基可以可选地包含增加量的成分，例如氨基酸。在本发明的优选实施方案中，将约40mM和约100mM之间、备选地约50mmol/L和约100mmol/L之间的范围内的初始氨基酸含量用于这些培养基。在本发明的备选实施方案中，这种生产培养基包含以下范围的初始氨基酸浓度。
  氨基酸   浓度(mmol/L)
  精氨酸，游离碱   4.0-6.0，优选4.5-5.5
  天冬酰胺一水合物   9.0-11.0，优选9.5-10.5
  天冬氨酸   2.5-4.0，优选3.0-3.6
  甘氨酸   0.3-0.8，优选0.5-0.7
  组氨酸，HCl H2O   1.0-1.5，优选1.1-1.3
  异亮氨酸   5.5-7.0，优选6.0-6.8
  亮氨酸   8.0-10.0，优选9-9.2
  赖氨酸HCl   3.0-6.0，优选4.0-5.0
  甲硫氨酸   1.5-2.5，优选1.5-2.0
  苯丙氨酸   2.0-3.5，优选2.5-3.0
  脯氨酸   7.5-9.0，优选8.0-8.5
  丝氨酸   10.5-13.0，优选11.0-11.9
  苏氨酸   3.5-5.5，优选4.0-5.0
  色氨酸   0.9-2.0，优选1.0-1.4
  缬氨酸   5.5-7.5，优选6.0-6.8
  酪氨酸   1.0-3.0，优选2.0-2.5
  半胱氨酸   0.5-2.0，优选1.0-1.3
  谷氨酰胺   5.5-9.5，优选6.2-8.2
  谷氨酸   0.5-2.5，优选1.0-1.2
包含上表中定义的氨基酸的生产培养基可以有利地用于本发明的改进的细胞培养方法。
可以以贴壁培养，例如以单层培养，或优选以悬浮培养来进行细胞的培养。
可以例如通过工业生物技术中建立的多种发酵方法来使用细胞的大规模培养。使用本发明的细胞培养基，可以利用连续和不连续的细胞培养方法。还可以利用其他已知的反应器技术，例如灌流技术等。分批方法是一个优选的实施方案。
分批细胞培养包括补料分批培养或简单分批培养。补料分批细胞培养指这样的细胞培养，其中，最初在培养瓶中提供哺乳动物细胞和细胞培养基，并在培养过程中连续地或以离散增加的形式向培养物中流加附加的培养营养物，在培养结束前定期收集或不收集细胞和/或产物。简单分批培养涉及这样的方法，其中，在起始培养过程时在培养瓶中提供包括哺乳动物细胞和细胞培养基的所有用于细胞培养的成分。
在本发明的另一方面，在补料分批方法中进行培养物的流加，流加物由向培养物中加入的两种营养物溶液组成。根据针对具体细胞系和产物确定的预定时间表，或根据通过测量培养瓶中例如葡萄糖或氨基酸的消耗确定的代谢需要，向培养瓶中加入两种营养物溶液。两种营养物溶液可以独立地作为快速流加物加入或连续加入。通常，营养物流加溶液包含氨基酸、至少一种糖类作为能源、痕量元素、维生素或特定离子。为了避免大的体积增加和产物的稀释，使用浓缩流加溶液尤其有利。在一些实施方案中，具有至少两种不同的流加溶液也可以是有用的。这允许独立地向细胞加入两个或多个不同组的营养物和成分，从而更好地就某些营养物的最佳供给调节流加条件。
在本发明的另一实施方案中，向细胞培养基中加入的两种流加溶液之一是浓缩流加物，其在高于10的碱性pH的水溶液中包含各自的浓度在约6.5g/l至约8.0g/l的范围内和约9g/l至约11g/l的范围内的二肽半胱氨酸和氨基酸酪氨酸。在具体实施方案中，该浓缩流加物在高于10的pH下包含各自的浓度为10.06g/l L-酪氨酸和7.25g/l半胱氨酸的二肽半胱氨酸和氨基酸酪氨酸。
上述包含半胱氨酸和酪氨酸的流加培养基可以根据所测量的各氨基酸的消耗加入，或者根据固定的时间表，按例如每天为初始细胞培养基重量的约0.2wt％至约0.8wt％、优选每天为初始细胞培养基重量的约0.4wt％加入。
在一些实例中，其他流加溶液包含除酪氨酸和半胱氨酸外的也存在于基础培养基中的所有其他氨基酸。在一些实例中，该其他流加溶液可以由具体的选定成分(例如氨基酸或糖类)组成。在本发明的另一实施方案中，此浓缩流加培养基优选包含以下浓度范围的选定氨基酸。
 氨基酸   流加培养基浓度(mmol/L)
 精氨酸，游离碱   12.0-17，优选13.5-16.0
 组氨酸，HCl H2O   5.5-7.5，优选5.9-7.0
 异亮氨酸   21-28.0，优选22.0-27
 亮氨酸   32-42，优选34.5-40.0
 赖氨酸HCl   17.0-22.0，优选17.5-21.5
 甲硫氨酸   5.5-8.0，优选6.0-7.5
 苯丙氨酸   8.5-12.0，优选9.0-10.5
 脯氨酸   18.0-24，优选18.5-22.0
 丝氨酸   39.0-49.0，优选39.5-46.5
 苏氨酸   14.5-19.0，优选15.0-18.5
 色氨酸   3.0-5.0，优选3.5-4.9
 缬氨酸   23.0-29.0，优选23.8-27.5
 谷氨酰胺   175.0-220.0，优选176.0-201
优选地，还向此浓缩流加培养基中加入诸如葡萄糖的糖类，优选的浓度在约1200mmol/l和约1400mmol/l之间，或备选地在约1300mmol/l和约1395mmol/l之间。
刚刚描述的优选包含诸如葡萄糖的糖类的流加培养基可以根据所测量的各氨基酸的消耗加入，或者根据固定的时间表，按例如每天为初始细胞培养基重量的约1wt％至约4wt％，例如每天为初始细胞培养基重量的约2wt％加入。
可以从细胞培养物和本发明的细胞培养基产生的多肽不受限制。多肽可以是重组的或不是重组的。多肽可以与宿主细胞同源，或优选地，可以具有外源来源。本文所用的术语多肽涵盖由通过肽键连接的超过两个氨基酸的链组成的分子；包含两条或多条这类链的分子；包含例如通过糖基化额外修饰的一条或多条这类链的分子。术语多肽旨在涵盖蛋白质。目的多肽可以具有任意来源。优选的目的多肽为人来源，更优选地，目的蛋白质是治疗性蛋白质。
通过细胞培养物和本发明的细胞培养基产生的优选多肽的种类是重组抗体。
术语“抗体”以最广泛的含义使用，且明确涵盖单克隆抗体(包括全长单克隆抗体)、多克隆抗体、多特异性抗体(例如双特异性抗体)、纳米抗体(nanobody)、修饰抗体、抗体的亚基、抗体衍生物、人工抗体、抗体与蛋白质的组合、及长度足以显示希望的生物学活性的抗体片段。本文使用的单克隆抗体可以是人抗体。
但是，也可以用细胞培养物和本发明的细胞培养基来产生抗体以外的多肽，例如多肽，如跨膜蛋白质、受体、激素、生长因子、蛋白酶、凝固和抗凝固蛋白质、抑制蛋白质、白细胞介素、转运因子、融合蛋白质等。
从这类细胞培养方法获得的产物可以用于制备药物制剂。此外，本发明的一种或多种蛋白质可以与生物活性剂的其他成分一起施用，如可药用表面活性剂、赋形剂、载体(carrier)、稀释剂和介质(vehicle)。
通过以下实施例来进一步说明本发明。
实施例
在下文所述的实施例中，使用化学成分确知的细胞培养基1和2，其具有以下表1中详述的组成。这些细胞培养基的单种成分可从标准商业来源获得。
表1
Figure BDA00002312170600181
Figure BDA00002312170600191
Figure BDA00002312170600201
以下表2显示包含L-酪氨酸和半胱氨酸的浓缩流加培养基的组成。该流加培养基可以根据所测量的各氨基酸的消耗加入，或者根据固定的时间表，按例如每天0.4％wt加入。
表2
  成分   流加培养基(g/l)
  NaOH 32％   18.7mL
  L-酪氨酸   10.06
  半胱氨酸   7.25
以下表3显示示例性浓缩流加培养基的组成。该流加培养基可以根据所测量的氨基酸的消耗加入，或者根据固定的时间表，按例如每天2％wt加入。
表3
  成分   流加培养基(g/l)
  L-精氨酸，游离碱   2.72
  L-组氨酸，HCl-H2O   1.44
  L-异亮氨酸   3.44
  L-亮氨酸   5.20
  L-赖氨酸，HCl   3.72
  L-甲硫氨酸   1.08
  L-苯丙氨酸   1.72
  L-脯氨酸   2.44
  L-丝氨酸   4.76
  L-苏氨酸   2.08
  L-色氨酸   0.88
  L-缬氨酸   3.16
  L-谷氨酰胺   29.23
  一水合D-葡萄糖   275.00
  25％HCL   8.25ml
  32％NaOH   5.6ml
对于实施例的实验，使用亲本CHO细胞系，其通过适应无血清、无蛋白质培养基条件衍生自dhfr(+)CHO-K1细胞系ATCC CCL-61(Kao等，Genetics，1967，55，513-524；Kao等，PNAS，1968，60，1275-1281；Puck等，J.Exp.Med.，1985，108，945-959)。分别转染此亲本细胞系的三个整份试样来表达三种不同的单克隆抗体mAB1、mAB2和mAB3。
实施例1
在实施例1中，用产生mAb1的CHO克隆平行接种包含培养基1的两个摇瓶培养物。摇瓶培养物在37℃的二氧化碳培养箱中孵育。在第3天，将一个摇瓶转移至设置在33℃的二氧化碳培养箱。两个摇瓶都用两种流加溶液类似地流加。根据固定时间表补充流加物，从第5天开始，每天加入0.4％的第一流加溶液(表2)和2％的第二流加物(表3)，并持续至培养结束。
与整个实验过程中维持在37℃的培养物相比，温度变动至33℃使得能够更长时间维持培养物的活细胞密度和存活率(图3和4)，并达到更高的产物效价(图5)。此实施例显示了在基于CHO宿主细胞系的细胞培养产生方法期间实施温度变动至33℃的益处。
实施例2
在此实施例中，用产生mAb2的CHO克隆接种包含培养基2的300L生物反应器。在第5天，将生物反应器的温度从36.5℃变动至33℃。pH设定点为6.90，死区为0.10。结果，在pH 7.00起始培养，pH在第2和第4天之间向下漂变至6.80，然后由于细胞对乳酸的消耗而逐渐回到7.00(图6)。与具有恒定的pH 7.00的情况相比，变动至pH 6.80使得能够减少碱的加入。与第一变动后使pH保持在6.80的情况相比，回到pH 7.00使得能够降低培养基中CO2的浓度。在组合了温度变动和pH变动的此方法中，达到了高活细胞密度，并最小化活细胞密度随时间的降低(图7)，允许在第14天达到高效价(图8)的优质产物。与实施例1中类似地应用流加。
实施例3
在此实施例中，用产生mAb3的CHO细胞克隆和培养基2(见表1)在玻璃生物反应器中实施三个独立的补料分批培养方法。再次应用实施例1的流加方案。两个独立培养包括温度变动而无附加的pH变动，即，整个培养过程中将两个细胞培养物中的pH都维持在pH 7.0的值。第三个培养实验与前两个实验的不同在于，在培养的第3天应用附加的从pH 7.0至pH 6.8的pH变动。在全部三个实验中实施的温度变动分别在细胞密度为4-6x 106活细胞/ml时发生。在图9中，作为活细胞积分(IVC)的函数描绘作为来自对应的CHO克隆的表达产物获得的mAb3浓度，活细胞积分是从每毫升细胞培养物中的细胞浓度/ml VCD计算的所有活细胞的积分。斜度y/x是细胞比生产力qp[pg/VC/h]，其表示单个活细胞在一个小时内可以产生的重组mAb3产物的量。结果，图9显示经受附加的pH变动时细胞培养物中细胞比生产力的提高。由于附加的pH变动，细胞更缓慢地生长，但显示提高的生产力。

Claims (18)

1.用于产生重组多肽的方法，其包括在包含至少一次温度变动和至少一次pH变动的条件下在培养基中培养CHO细胞，并表达所述重组多肽，其中
-在第一温度下培养细胞至少3天，然后使温度变动至第二温度，该第二温度比第一温度低约1℃至约8℃之间，在所述第二温度下维持细胞至少另外两天的时间；
-在第一pH值下培养细胞至少2天，然后使pH变动至第二pH值，该第二pH值比第一pH低约0.05至约1个pH单位之间，在所述第二pH下维持细胞至少1天。
2.权利要求1的方法，其中pH在所述第一pH值和所述第二pH值之间主动改变。
3.前述权利要求中任一项的方法，其中pH在所述第一pH值和所述第二pH值之间被动改变。
4.前述权利要中任一项的方法，其中所述第一温度在约33℃和约38℃之间的范围内。
5.前述权利要中任一项的方法，其中所述第二温度在约30℃和约37℃之间的范围内。
6.前述权利要中任一项的方法，其中所述第一pH值在约pH 6.8和约pH 7.5之间的范围内。
7.前述权利要中任一项的方法，其中所述第二pH值在约pH 6.0和约pH 7.1之间的范围内。
8.前述权利要中任一项的方法，其中主动维持所述第二pH至培养结束。
9.权利要求1至8中任一项的方法，其中所述第一pH变动后为第二pH变动，至少1天后进行第三pH值变动，所述第三pH值比第二pH值高约0.05个pH单位至约1个pH单位。
10.权利要求9的方法，其中pH从所述第二pH值主动改变至所述第三pH值。
11.权利要求9的方法，其中pH从所述第二pH值被动改变至所述第三pH值。
12.前述权利要求中任一项的方法，其中所述培养基无蛋白质且无血清，且其特征在于总氨基酸含量在约40mM和约100mM之间。
13.前述权利要求中任一项的方法，其中以补料分批方式进行培养，所述补料分批方式包括流加向培养物中加入的至少两种营养物溶液。
14.权利要求13的方法，其中向培养基中加入的流加溶液之一是包含二肽半胱氨酸和氨基酸酪氨酸的流加物。
15.权利要求14的方法，其中所述流加物在高于10的碱性pH的水溶液中包含各自的浓度在约6.5g/l至约8.0g/l的范围内和约9g/l至约11g/l的范围内的二肽半胱氨酸和氨基酸酪氨酸。
16.权利要求14和15中任一项的方法，其中向培养基中加入的包含半胱氨酸和酪氨酸的流加溶液的量为每天初始培养基重量的约0.2wt％至约0.8wt％的范围内。
17.前述权利要求中任一项的方法，其中所产生的多肽是糖基化的。
18.前述权利要求中任一项的方法，其中所述多肽是抗体或抗体片段。
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