JP5980772B2

JP5980772B2 - 改良型細胞培養培地

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Publication number: JP5980772B2
Application number: JP2013506611A
Authority: JP
Inventors: イー．ジョーステン，クリストフ; レイスト，クリスチャン; シュミト，ジョルグ
Original assignee: ノバルティスアーゲー
Priority date: 2010-04-26
Filing date: 2011-04-25
Publication date: 2016-08-31
Anticipated expiration: 2031-04-25
Also published as: PL2563906T3; CN107254499A; US20130130316A1; ES2870469T3; IL222454B; CN102858954A; KR101828624B1; KR20130094723A; BR112012027430A2; EP3330370B1; SG185014A1; MX2012012528A; US8765413B2; LT2563906T; BR112012027430B1; RU2012150283A; AU2011246502B2; ES2659117T3; IL222454A0; CA2795461A1

Description

本発明は、バイオテクノロジーの一般的な分野、特に産業規模でポリペプチドを産生するための細胞の培養およびそれらの使用に関する。

本発明は、少なくとも１つの温度変動および少なくとも１つのｐＨ変動によって特徴付けられる細胞培養法を提供する。これらの方法は、高い細胞生存性を有する細胞、好ましくはＣＨＯ細胞のような哺乳動物細胞の培養に適している。本発明による細胞培養法は、ポリペプチド産生、特に哺乳動物細胞培養系におけるポリペプチドの組換え発現による、特に産業規模におけるポリペプチド産生に使用される場合、高いポリペプチド生産性の獲得をさらに可能にする。

組換え技術を使用したポリペプチドの調製は、この数十年の間に標準的手順に発展している。各ポリペプチドをコードする遺伝子のクローニング、次に発現される遺伝子による適切な発現宿主の二次形質転換、および最終産生、および得られた組換えポリペプチド産物の精製による組換えポリペプチドへのアクセスは、全く新しいクラスの生物学的に設計および産生される治療剤へのアクセスをもたらしている。

医薬品産業界では、組換えＤＮＡ技術を使用し、次に生物工学の分野で開発された産生法を使用して調製される、医薬品活性がある化合物の数が増加し続けている。

このようなバイオ製品には、自己免疫疾患、炎症障害、免疫抑制、腫瘍学などを含めた様々な医療分野において、重要な治療選択肢に発展しているモノクローナル抗体が含まれる。

生物源のこのような治療剤の開発には、それによって多量の組換えポリペプチドへのアクセスをもたらす産業規模での生産が必要とされる。好ましい発現系は、昆虫細胞、酵母などに基づく大部分の他の真核生物発現系、または一層伝統的な原核生物発現系より優れた、哺乳動物細胞培養系である。

しかしながら、哺乳動物細胞培養には、特に産業規模で多大な課題がある。哺乳動物細胞培養のための生産施設は、多くの方法条件の完全な最適化を必要とする。

特に、哺乳動物細胞においてポリペプチドを産生するための細胞培養法は、最適な品質と併せて容量測定で高い製品収率を得るために、培養条件の連続的な最適化および特定細胞系または産物へのそれらの適合を必要とする。

多くの以前の尽力は、例えばイオン、アミノ酸、ビタミンまたは微量元素の種類および濃度、または培地のモル浸透圧濃度に関する、それらの組成を含めた細胞培養培地の基本パラメーターに集中している。研究の中心となっているさらなる重要なパラメーターは、例えば、最適な細胞増殖に到達するための供給組成または供給スケジュールである。

基本的生理パラメーターとしての温度およびｐＨも、哺乳動物細胞の培養に対して有意な影響があることが知られている。一般に温度は、細胞の増殖状態および生存性に相当影響を与える。しかしながら、これ以外に、それが改変、例えばグリコシル化によって、ポリペプチド産物およびその特徴により具体的に影響を与える可能性もある（ＵＳ２００３／０１９０７１０Ａ１、ＥＰ１３７３５４７Ａ１、ＵＳ２００４／０２１４２８９Ａ１）。

増殖培地および細胞が維持されるｐＨも、個々の細胞系および産物に応じて特異的な形式で、細胞増殖およびポリペプチド産生に影響を与え改変する可能性がある（Sauer et al. Biotechnology and Bioengineering 2000,Vol 67,pg.586-597; Yoon et al., Biotechnology and Bioengineering 2004,Vol 89,pg.346-356; Kuwae et al., Journal of Bioscience and Bioengineering 2005,Vol 100, pg.502-510）。

培養の経時変化中、細胞に必要な条件は変化する可能性がある。初期には、細胞増殖の向上に向けて条件を最適化することが有利であるが、後期段階では、高い産物力価を得ることにつながる高い細胞生存率および生存細胞密度の維持が重要になる。この観点で、細胞培養中の１つまたは複数の温度ステップの導入が示唆されている（Chen et al., J Biosci Bioeng.2004; 97(4):239-43）。このため、哺乳動物細胞は少なくとも２つの異なる温度で培養し、第一の、高い方の温度は細胞増殖に最適化させ、一方第二または第三の、低い方の温度は細胞の生産性を向上させるように選択する（例えば、Weidemann et al., Cytotechnology.1994; 15(1-3);111-6; ＷＯ００／３６０９２；ＥＰ０７６４７１９Ａ２、ＵＳ２００５／０１９８５９、ＥＰ１５７５９９８、ＵＳ２００８／０８１３５６）。他の文書は、他の特定培地の特徴と組み合わせた温度ステップの使用を記載する。例えばＥＰ１７５７７００Ａ２は、培地成分としての酪酸塩の存在と組み合わせた温度ステップを開示し、一方ＥＰ１７８９５７１Ａ１は、定義されるアミノ酸含有量と組み合わせた温度ステップを記載する。

他の細胞培養条件も変化している。ＵＳ５８５６１７９は、フェドバッチ細胞培養においてポリペプチドを産生するための方法を導入しており、培養中、培地のモル浸透圧濃度は主要増殖期中の約２８０〜３３０ｍＯｓｍから生産期中の約４００〜６００ｍＯｓｍに相当変化する。

ＷＯ０２／１０１０１９は、温度およびｐＨの変化を含めて、グルタミンおよびグルコース濃縮物などの多くの特定培地成分に焦点を当てている。しかしながら、高グルコース培地中のｐＨ変動は培養にマイナスの影響があること、および増殖または生産期中にｐＨを低下させることは勧められないことが分かった。

ＷＯ２００６／０２６４４５は、細胞培養条件を一組の培養条件から第二組に変化させ、この変化を特定アミノ酸の含有量に関する特定の培地の特徴と組み合わせる、ポリペプチドを産生するための方法を開示する。条件の変化は、温度の変動と具体的に関係がある。ｐＨまたはモル浸透圧濃度などの条件の他の変化は他の選択肢として一般に言及されるが、しかしながら、個々のパラメーター設定は指定されていない。

前述の課題および既存の欠点を考慮すると、バイオテクノロジー産業の分野において、さらに高い収率、すなわち改善された特異的および全体的生産性、および高い品質で、組換えポリペプチドの産生を産業規模で可能にする、改善された培養法が絶えず必要とされる。

ポリペプチド産生法の具体的な技術目標は、高い細胞生存性を維持すること、および全細胞培養法のパラメーターを最適化することによりポリペプチドの最終収率を最大にすることである。

本発明は、組換えポリペプチドを産生するための方法において、温度変動とｐＨ変動を組み合わせることに関する。組換え細胞、特にＣＨＯ細胞の必要性に適合させると、これら２つのパラメーターの特定の組合せは、細胞の高い生産性、および組換えにより産生したポリペプチドの改善された品質をもたらした。特に本発明は、絶対的および相対的数値ならびに個々の変動程度に関して（１つまたは複数の）温度およびｐＨ変動の個々のタイミングおよびスケジュールに基づく、プラスの影響を見出している。

本発明の一態様によれば、培地中でＣＨＯ細胞を培養すること、および組換えポリペプチドを発現させることを含み、温度およびｐＨを方法中に変える、組換えポリペプチドを産生するための方法を開示する。

特に、本発明による方法は、少なくとも１つの温度変動および少なくとも１つのｐＨ変動を含む。本発明の一実施形態では、第一の高い方の温度から第二の低い方の温度への変動は、細胞を最初に増殖させ、第一の温度で少なくとも３日間、あるいは少なくとも４日間、または少なくとも５日間維持した後に実施する。第二の低い方の温度は、第一の温度より約１℃〜約８℃低い。本発明の別の他の実施形態では、温度の変動は、例えば約２℃と約５℃の間、特に約４℃または約３．５℃である。次いで第二の温度を少なくとも２日間維持する。第二の温度は採取まで維持することができる。

本発明の一実施形態によれば、第一の温度は約３３℃と約３８℃の間の範囲内にあることが好ましく、第二の温度は約３０℃と約３７℃の間の範囲内にあることが好ましい。

温度の変動以外に、ｐＨも第一のｐＨから第二のｐＨに変化させる。したがって、本発明による方法は少なくとも１つのｐＨ変動を含む。特に、細胞は第一のｐＨ値で少なくとも２日間増殖させ、次いで、第一のｐＨより約０．０５〜約１ｐＨ単位低い第二のｐＨ値にｐＨを変動させ、細胞を前記第二のｐＨで少なくとも１日間、あるいは少なくとも２日間増殖させる。いくつかの実施形態では、第二のｐＨは採取まで維持する。

第一のｐＨ値は、約ｐＨ６．８と約ｐＨ７．５の間の範囲内にあることが好ましい。第二のｐＨ値は、約ｐＨ６．０と約ｐＨ７．１の間の範囲内にあることが好ましい。

したがって、本発明の一実施形態は、組換えポリペプチドを産生するための方法であって、少なくとも１つの温度変動および少なくとも１つのｐＨ変動を含む条件下において培地中でＣＨＯ細胞を培養すること、および組換えポリペプチドを発現させることを含み、
細胞を第一の温度で少なくとも３日間増殖させ、次いで、第一の温度より約１℃〜約８℃低い第二の温度に温度を変動させ、細胞を前記第二の温度で少なくともさらに２日の間維持し、
細胞を第一のｐＨ値で少なくとも２日間増殖させ、次いで、第一のｐＨより約０．０５〜約１ｐＨ単位低い第二のｐＨ値にｐＨを変動させ、細胞を前記第二のｐＨで少なくとも１日間増殖させる方法である。

本発明による方法は、第一のｐＨ変動の少なくとも１日後に続く第二のｐＨ変動を、場合によっては含むことができる。第一のｐＨ変動の少なくとも１日後に第二のｐＨ変動が続く場合、第三のｐＨ値は第二のｐＨ値より約０．０５ｐＨ単位〜約１ｐＨ単位高い。第三のｐＨ値は採取まで維持することができる。

本発明による細胞培養法は、能動的および／または受動的ｐＨ変動を含む。すなわち、新たな値へのｐＨの目標値の変化によって「能動的に」、および／または代謝産物の蓄積により培地のｐＨを変化させ、細胞培養特異的代謝ｐＨプロファイルを予め定義したｐＨ範囲内にすることによって「受動的に」ｐＨを改変させる。本発明の好ましい実施形態では、能動的変動は、酸、例えばＨＣｌ、または塩基、例えばＮａＯＨなどの、当業者に知られているそれぞれ（１つまたは複数の）ｐＨ改変剤および調整剤を加えることによって誘導する。方法のさらなる好ましい実施形態では、１つのｐＨ目標値および不動帯を定義することによってこれを実施し、ｐＨを変化させることが可能である。能動的変動とは対照的に、ｐＨの受動的変動または変化は、それぞれ（１つまたは複数の）ｐＨ改変剤を加えることによって誘導されない。

さらなる態様では、本発明による方法は、無タンパク質および無血清である培地を使用して実施する。培地は、約４０ｍＭと約１００ｍＭの間、あるいは約５０ｍＭと約１００ｍＭの間の全アミノ酸含有量によって特徴付けられることが好ましい。

前に定義した好ましい方法は、培養物に加える少なくとも２つの栄養液の供給を含むフェドバッチ形式で行う。このような方法では、例えば、培養培地に加える供給液の１つが、ジペプチドシスチンおよびアミノ酸チロシンを含む供給物である。供給物は、１０を超える塩基性ｐＨにおいて水溶液中に約６．５ｇ／ｌと約８．０ｇ／ｌの範囲内および約９ｇ／ｌと約１１ｇ／ｌの範囲内の各濃度で、ジペプチドシスチンおよびアミノ酸チロシンを含むことがさらに好ましい。特に、濃度はシスチンに関して約７．２５ｇ／ｌおよびチロシンに関して約１０．０６ｇ／ｌであってよい。好ましい実施形態では、シスチンおよびチロシンを含む供給液は１日当たり初代培養培地重量の約０．２重量％と約０．８重量％、またはあるいは１日当たり初代細胞培養培地重量の約０．４重量％の範囲内の量で培養培地に加えられる。

本発明による方法は、グリコシル化状態である組換えポリペプチドの産生に使用することが好ましい。具体的な実施形態によれば、ポリペプチドは抗体または抗体断片である。

本発明は、以下の実施例および図面を参照することによってさらによく理解される。しかしながら実施例は、本発明の範囲を制限することを目的とするものではない。

ｐＨ７．００〜６．８０の変動での段階的変化による能動的ｐＨ変動の実施を示す図である。受動的ｐＨ変動実施によって得られたｐＨプロファイルを示す図である。６．９０への目標値を設定し０．１０の不動帯を定義することによって、生産用バイオリアクター中での７．００〜６．８０のｐＨ変動に達した。６．８０への第一のｐＨ変動後、培養の最後までｐＨを６．８０に能動的に維持する。第二のｐＨ変動でのｐＨプロファイルを示す図である。この実施例では、（前の）上限ｐＨに到達しない。第二のｐＨ変動でのｐＨプロファイルを示す図である。ただし、ここではｐＨは上限ｐＨに再度適合し、そこで維持される。振とうフラスコ培養中の培養時間の関数として、ｍＡｂ１産生ＣＨＯ細胞クローンの生存細胞密度に対する一定温度および温度変動の影響を示す図である（実施例１参照）。ｍＡｂ１産生ＣＨＯ細胞クローンの生存性に対する一定温度および温度変動の影響を示す図である（実施例１参照）。温度変動有りまたは無しで、ｍＡｂ１産生ＣＨＯ細胞クローンの振とうフラスコ培養に関する培養時間の関数として、産物力価を示す図である（実施例１参照）。ｍＡｂ２産生クローンにおける培養時間中のラクテート濃度を示す図である（実施例２参照）。ＣＨＯ細胞クローンを含む３００Ｌバイオリアクター中での培養時間の関数として、生存細胞密度を示す図である。培養条件は、温度ステップ（第５日）、および目標値および不動帯でのｐＨ制御による２つのｐＨ変動を含んでいた（これも実施例２参照）。ＣＨＯ細胞クローンを含む３００Ｌバイオリアクター中での培養時間の関数として、産物力価を示す図である。方法は温度およびｐＨ変動と組み合わせた（図７および実施例２も参照）。３回の独立した実験、生存細胞の積分関数として、ガラス製バイオリアクター中で培養したＣＨＯ細胞培養物を用いたフェドバッチ法によって得たｍＡｂ３濃度を示す図である。培養条件は、全３回の実験に関して同一の温度変動、および１回の実験のみ追加的ｐＨ変動を含んでいた。

本発明によれば、組換えポリペプチドを調製するための方法は、ＣＨＯ細胞を培養すること、および組換えポリペプチドを発現させることを含み、温度およびｐＨを方法中に変える。本発明は、温度およびｐＨ変動を含めた培養の経時変化中に細胞培養条件を動的に適合させることにより、ＣＨＯ細胞培養におけるポリペプチドの大規模生産の方法を改善しようと努めている。

用語ポリペプチドの「大規模生産」は、治療活性がある生物製剤の調製に使用される組換えポリペプチドの、工業生産に典型的に必要とされる量に関する。少なくとも５００Ｌの体積、または少なくとも１０００Ｌ、またはあるいは少なくとも５０００Ｌ、またはさらに高体積の細胞培養培地を用いた細胞培養は、典型的には大規模生産用途となる。

本明細書で使用する用語「細胞培養培地」は、長時間にわたり細胞を増殖するのに使用することができる栄養素の水溶液を指す。典型的には、細胞培養培地は以下の成分を含む。通常、炭水化物化合物、好ましくはグルコース、アミノ酸、好ましくは全必須アミノ酸を含めたアミノ酸の基底集合、ビタミン、および／または低濃度で必要とされる他の有機化合物、遊離脂肪酸、および微量元素、無機塩を含めた無機化合物、緩衝化合物およびヌクレオシドおよび塩基であるエネルギー源。

例えば治療活性がある組換えポリペプチドを産生するための、製薬産業の分野における細胞培養培地の使用は、安全性および汚染の問題のため、生物起源の任意の物質の使用を一般に可能にしない。したがって、本発明による細胞培養培地は、無血清および／または無タンパク質培地であることが好ましい。用語「無血清および／または無タンパク質培地」は、組織加水分解物のような動物源由来の添加剤、例えばウシ胎児血清などを含有しない、化学的に完全に定義された培地を表す。さらに、タンパク質、特にインスリン、トランスフェリンなどのような成長因子も、本発明による細胞培養に加えないことが好ましい。さらに、本発明による細胞培養培地は、大豆、小麦または米ペプトンまたは酵母加水分解物などのような、加水分解タンパク質源を補充しないことが好ましい。

本明細書で使用する用語「温度変動」は、低い値に温度の目標値を能動的に改変することによる、バイオリアクター／培養容器中での培養温度の変化を指す。最初に温度を制御し、一定時間定義した温度で安定状態にし、目標値の変化後、次いで一定時間別の定義した温度で安定状態にする。温度ステップは、培養中のわずかな温度の自発的変動は指さない。

本明細書で使用する用語「ｐＨ変動」は、低い値または高い値にｐＨの目標値を能動的に改変すること、または上限ｐＨと下限ｐＨの間でｐＨ変動を引き起こすことによる、バイオリアクター／培養容器中での培養物のｐＨの変化を指す。

培養容器／バイオリアクターの大きさおよび培養体積に応じて、培地中で測定する各パラメーターの変動は、数分間から数時間に及ぶ可能性がある。

以下でより詳細に記載するように能動的および／または受動的手法によって、２つの異なる方法でｐＨを変動することができる。

用語ｐＨの「能動的変動」は、新たな値へのｐＨの目標値の変化によって定義する。本発明の好ましい実施形態では、当業者に知られているそれぞれ（１つまたは複数の）ｐＨ改変剤および調整剤を加えることによって、能動的変動を誘導する。

用語「受動的変動」は、ｐＨの受動的変動中に、細胞自体が代謝産物の蓄積により培地のｐＨを変化させ、したがって細胞培養特異的代謝ｐＨプロファイルを予め定義したｐＨ範囲内にすることができることを示す。方法の一実施形態では、１つのｐＨ目標値および不動帯を定義することによってこれを実施し、ｐＨを変化させることが可能である。能動的変動とは対照的に、ｐＨの受動的変動または変化は、それぞれ（１つまたは複数の）ｐＨ改変剤を加えることによって誘導されない。

ｐＨ調整剤を培養物に加えて、特定目標値にｐＨを維持する、またはｐＨ変動中にｐＨを変化させる。細胞培養目的に使用するのに典型的なｐＨ調整剤には、ＮａＯＨまたはＨＣｌなどの塩基性または酸性溶液がある。これらのｐＨ調整剤を、培養容器／バイオリアクター中の培地に加える。あるいは、細胞培養培地をＣＯ_２でガス処理してｐＨを調節することができる。

本発明の第一の態様によれば、ＣＨＯ細胞を培養すること、および組換えポリペプチドを発現させることを含み、温度およびｐＨを方法中に変える、組換えポリペプチドを調製するための方法を開示する。さらにより詳細には、第一の高い方の温度から第二の低い方の温度への変動は、細胞を最初に増殖させ、第一の温度で少なくとも３日間、あるいは少なくとも４日間、または少なくとも５日間維持した後に実施する。この第二の低い方の温度は、第一の温度より約１℃〜約８℃低い。本発明の別の実施形態では、温度の変動は約２℃と約５℃の間であってよく、いくつかの実施形態では約４℃または約３．５℃である。次いでこの第二の温度を少なくとも２日間維持する。温度変動以外に、ｐＨも第一のｐＨから第二のｐＨに変わる。

温度およびｐＨの変動に関する正確なパラメーターは事前に決定し、産生される各ポリペプチドをコードする１つまたは複数の特定遺伝子構築物でトランスフェクトした細胞系の必要性に基づいて適合させる。あるいは、バイオリアクター中での大規模生産培養中に決定される代謝パラメーターに応じて必要性が生じ得る。

高い方の温度から低い方の温度への温度変動は有用である。第一の温度は細胞増殖に最適であり、一方で低い方の温度は細胞死の割合を低減するからである。したがって、低減された温度は高い生存細胞密度の長期の維持を可能にする。この低減された温度での対象のポリペプチドの細胞特異的生産性は、通常最初の温度と比較して劇的に低減するわけではなく、時には細胞特異的生産性は同等であり、または時には一層優れている可能性がある。高い生存細胞密度の長期の維持は、不適切な性質の産物の形成を最小にする利点をさらにもたらすことができる。これらの要因の組合せは、採取時に、容量測定で高い生産性、および適切な性質である対象の産物の高力価の獲得を可能にする。一実施形態では、第一の温度は約３３℃と約３８℃の間の範囲内にある。別の実施形態では、第一の温度は約３６℃と約３８℃の間である。温度変動が約３０℃と約３７℃の間、または約３２℃と約３４℃の間、またはあるいは約３０℃と約３２℃の間の範囲内になり得る後に第二の温度に達する。

温度変動のタイミングは生産性を最大にするのに重要である。温度変動を時期尚早に実施する場合、高い細胞密度に到達せず、または到達するのに長時間を要する。温度変動を実施するのが遅すぎる場合、生存細胞密度の低下を効率よく妨げることはできない。温度変動のタイミングは、組換えポリペプチドの大規模生産に使用するバイオリアクターの接種後、数日中に定義することが好ましい。本発明の別の実施形態では、大規模生産用バイオリアクター中で到達する細胞密度によってタイミングを定義することができる。例えば、細胞の直線的または対数増殖期中に、または４０〜９０％の最大細胞密度に達したときに温度変動を開始する。細胞密度依存性目標値は、相対的数値（到達し得る最大細胞密度の％）または絶対的数値（生存細胞／ｍｌ）で表すことができる。一具体例では、６０〜９０％である細胞密度を選択する。

バイオリアクター／増殖用容器の接種と温度変動の間のタイミングは、使用する具体的なバイオリアクター／増殖用容器および細胞系に応じて、約３日と約１４日の間の範囲であってよい。あるいは、第３日と第８日の間に変動を行う。前述の単一基準の代替として、時間および／または細胞密度に関して選択する条件が必ず適合するように、前述した変数の２つを組み合わせることにより二重基準を設定することもできる。

最適な増殖および産生に必要な場合、２つ以上の温度ステップ、例えば、それぞれ少なくとも約１℃、あるいは少なくとも約２℃の温度変化からなり、それぞれの温度を少なくとも１日間維持する、少なくとも２ステップを使用することもできる。したがって、温度はより一層低減することができ、より複雑な温度プロファイルを続けることができる。

本発明によれば、少なくとも２日間、あるいは少なくとも３日間、例えば少なくとも４日間またはさらに少なくとも５日間、ｐＨ変動前に第一のｐＨ値で細胞を増殖させる。培養開始後最初の数日間のｐＨは、バイオリアクター中での細胞密度の急速な増大に好ましいように選択する。この時間中、細胞増殖に最適である特定目標値に、バイオリアクターのｐＨを制御する。特定細胞密度に達した後、培養のｐＨを改変することが有利である。ｐＨは、この第一の期間後、第一のｐＨより約０．０５〜１ｐＨ単位低い第二のｐＨ値に変動する。細胞は前記第二のｐＨで少なくとも２日間増殖させる。本発明のいくつかの実施形態では、第二のｐＨ値は、第一のｐＨより約０．１５〜約１ｐＨ単位低くてよい。このｐＨ変動は、バイオリアクター／培養容器のｐＨ目標値を変えることによって通常到達する。第二のｐＨ値は、細胞死（例えばアポトーシス）を低減し、適切な品質のポリペプチドの高い細胞特異的産生率の維持を可能にするように選択する。したがって、第一の実施形態では、ｐＨ変動のタイミングは、組換えポリペプチドの大規模生産に使用するバイオリアクターの接種後、数日中に定義する。第二の実施形態では、大規模生産用バイオリアクター中で到達する細胞密度によってタイミングを定義することができる。さらなる代替によれば、細胞培養培地での培養中に測定される特異的代謝パラメーターに応じてタイミングを決定することもできる。非制限的一例では、これはラクテート濃度であってよい。例えば、高いｐＨ目標値にｐＨを維持するための必要用量のＣＯ_２または時間当たりの酸の調節、または低いｐＨ目標値にｐＨを保つための必要用量のＮａＯＨもしくは腐食剤の調節などの、培養物の代謝状態を反映する間接的パラメーターを使用することもできる。ｐＨ変動に関する１つの基準のみを使用する代わりに、あるいは、例えば接種後日数および細胞密度などのパラメーターを組み合わせることによって、組合せ基準を設定することができる。

ｐＨ変動戦略の利点は、培養過程中に溶存二酸化炭素レベルおよび塩基の添加を低減することができ、したがってそれらのマイナスの影響を回避するという事実も含む。培養の初期では、培養容器またはバイオリアクター中で高いｐＨ値（例えば７．０）を有することが有利である。低いｐＨ値（例えば６．８）は、ｐＨを維持するために高レベルの二酸化炭素を必要とし得るからである。しかしながら、これらの高レベルの二酸化炭素は細胞に対してマイナスの影響を有し、増殖率を低減する可能性がある。対照的に、培養の後期段階では、高いｐＨ（例えば７．０）の維持は低いｐＨ（例えば６．８）の維持より多くの塩基の添加を必要とする。これは乳酸が形成されるためであり、生じる酸性は塩基の添加によって補われるはずである。ｐＨ目標値が高くなるほど、必要とされる塩基の量は多くなる。塩基の添加は培養物のモル浸透圧濃度を増大させ、これは増殖および高い生存細胞密度の維持に好ましくない可能性がある。

ｐＨ変動戦略の考えられる利点は、乳酸形成を最小にする観点から記載することもできる。ＣＨＯ細胞は一般に、高い値（例えば７．０）より少量の乳酸を低いｐＨ値（例えば６．８）で産生する。産生する乳酸が少ないとより少量の塩基を加える結果となり、これは前に記載したように有益である。

一実施形態では、第一のｐＨは、ｐＨ６．８とｐＨ７．５の間の範囲内に存在するように選択する。別の実施形態では、第一のｐＨは、ｐＨ６．８とｐＨ７．２の間の範囲内に存在するように選択する。さらなる実施形態では、第一のｐＨは、最大ｐＨ７、またはあるいはｐＨ７未満であるように選択する。ｐＨ変動後に到達する第二のｐＨ値は、ｐＨ６．０とｐＨ７．５の間、またはｐＨ６．５とｐＨ６．８の間の範囲内にある。

温度とｐＨ変動の相対的タイミングを選択して最適な結果を得る。温度とｐＨ変動の最適なタイミングは方法特異的な形式で選択し、培養物の増殖状態または代謝状態に依存し得る。原則として温度の変動は、ｐＨ変動のタイミングとは無関係に一定の培養時間地点で実施することができる。本発明の一実施形態では、温度変動は、ｐＨ変動前またはそれと同時に行うことができる。本発明の一実施形態では、温度変動はｐＨ変動前に行う。例えば温度変動は、ｐＨ変動を行う１〜５日前に開始することができる。本発明の別の第二の実施形態では、温度変動はｐＨ変動と同時に開始する。本明細書中の用語「同時」は、第一の値から第二の値への両方の各パラメーターの進行中の変動を指す。温度の目標値とｐＨの目標値が変化しているとき、および両方のパラメーターがその第二の安定値に依然達していないときに、このような同時変動を行うことができる。あるいは、受動的ｐＨ変化期中に温度の目標値が変化したときに、このようなシナリオが生じ得る。上限および下限ｐＨを定義する目標値および不動帯によるｐＨ調整の場合これが生じる（以下をさらに参照）。本発明のさらなる実施形態では、温度変動はｐＨ変動後に行うことができる。例えば温度変動は、ｐＨ変動後１〜５日で開始することができる。

本発明のさらなる態様では、前記第一のｐＨ値と前記第二のｐＨ値の間でｐＨを能動的または受動的に変化させる。培養物のｐＨを制御するため、およびｐＨ変動を実施するための、いくつかの考えられる方法が存在する。本発明の一態様では、ｐＨ制御剤のｐＨ目標値（不動帯なし）を新たな値に変えることによって、第一のｐＨ値から第二のｐＨ値にｐＨを能動的に変動させる。

結果として、第一のｐＨ値から第二のｐＨ値への変化は培養中準直接的（段階的変化）である。図１は、この特定実施例における、ｐＨ７．００〜６．８０の変動での、このような段階的変化によるｐＨ変動の実施を示す。本発明のこの実施形態では、然るべくｐＨ調整剤（例えば、ＣＯ_２またはＮａＯＨ）を投与することによって高いｐＨ値に最初にｐＨを維持し、次いで目標値（不動帯なし）を能動的に変えることによって低い値に変える。低い目標値のｐＨには、培養物に酸性化剤を能動的に投与／添加し急速な変化をもたらすこと、またはより塩基性である第一のｐＨにｐＨを維持する作用物質を除去することのいずれかによって達することができる。バイオリアクターの大きさおよびｐＨに影響を与える前述の方法に基づいて、ｐＨ変化は数分間から最大２４時間以内に終了することができる。

本発明のさらなる態様では、ｐＨは上限および下限ｐＨに相当する第一のｐＨ値から第二のｐＨ値へ受動的に変動（移動）させることができ、したがって細胞培養特異的代謝プロファイルに従う。結果として、第一のｐＨ値から第二のｐＨ値への変化は段階的である。細胞培養培地のｐＨを制御しｐＨ変動を実施するこの代替法には、目標値および不動帯でバイオリアクターのｐＨ制御剤をプログラムすることによって達する。これは、ｐＨ制御剤が作用しない、方法に許容可能なｐＨ範囲を定義する。例えば、６．９０の目標値ｐＨおよび０．１０ｐＨ単位の不動帯は、上限ｐＨとしてｐＨ７．００および下限ｐＨとしてｐＨ６．８０を定義する。細胞培養産生バイオリアクター中では、培養の初期（最初の数日間）においてｐＨは典型的には上限であり、この場合培養物に二酸化炭素を投与することにより、制御剤はｐＨが上昇するのを妨げる。細胞によって産生される乳酸の累進的蓄積のため、典型的には数時間以内に、最終的にｐＨは例えば７．００から６．８０に連続的に低下する。例えば６．８０の下限ｐＨに達した後、培養物に塩基性溶液を投与することにより、制御剤はｐＨがこのｐＨ未満に低下するのを妨げる。バイオリアクターの大きさ、具体的な細胞系、細胞密度または培地条件に基づいて、段階的なｐＨ変化が数時間以内に起こる可能性があり、または最大１日を要する可能性がある。

本発明のさらなる態様では、第二のｐＨでのｐＨ変動後、採取まで培養時間の残りの間、培養物の第二のｐＨを能動的に維持する。これは、ｐＨ目標値を前記第二のｐＨ値に変えること、および然るべくｐＨ調整剤を投与することによって実施される。

本発明のさらなる態様では、第一のｐＨ変動に第二の変動が続く。第二のｐＨ変動は最初の変動後少なくとも１日で行い、到達する第三のｐＨ値は第二のｐＨより少なくとも０．０５ｐＨ単位高い。

本発明のさらなる態様では、第二のｐＨ変動は能動的または受動的に実施され、前記第三のｐＨ値に到達することもできる。第一の実施形態では、第一のｐＨ変動に関して前述したように（前参照）ｐＨ目標値を能動的に変化させることによって、これを行うことができる。第二のｐＨ変動のタイミングは第一のｐＨ変動後数日以内に定義することができ、および／または再度例えばラクテート濃度などの代謝パラメーターに依存した状態になり得る。このような変動は、第一のｐＨ変動後１日〜１０日で典型的には実施することができる。能動的変動は、培養のｐＨ目標値を変えることによって開始する。ｐＨ調整剤は然るべく投与する。

第二の実施形態では、ｐＨは受動的に変化させられ、その代謝ｐＨプロファイルをたどらせることも可能である。例えば既に前述したように下限ｐＨおよび上限ｐＨを定義することによって、これを実施することができる。この場合の上限ｐＨは、第一のｐＨ変動に関して定義したのと同じ上限ｐＨに相当する可能性があり、またはそれは新たな低い値もしくは高い値に改変することができる。このような下限ｐＨおよび上限ｐＨは、目標値および不動帯でバイオリアクターのｐＨ制御剤をプログラムすることによって達成可能であることが好ましい。このようなｐＨの受動的変化は細胞による培養後期の乳酸の再代謝によって起こる可能性があり、これが前記ｐＨ範囲の下限を超える値にｐＨを再度増大させる。いくつかの場合、ｐＨは範囲の上限に再度到達すると考えられ、他の場合、ｐＨはその限界未満に留まる可能性もある。第二のｐＨ変動の程度は、０．０５と１ｐＨ単位の間の値を含み得る。変動／変化の割合は細胞による乳酸の代謝活性および再代謝に依存するので、このような受動的ｐＨ変動の時間は正確には定義されない。典型的には上限ｐＨに到達するのに０．５〜２日を要し得るが、受動的変化の場合、ｐＨが培養の最後まで定義した上部閾値未満に留まる可能性もある。

実施戦略の選択は、ＣＯ_２に対する細胞の感受性および産物形成に最適なｐＨなどの、多数の要因に依存する。異なるｐＨプロファイルは、培養の行程にわたり２つ以上の具体的な目標値を定義すること、または（培養中に場合によっては変わる可能性もある）目標値および不動帯を単に定義することによって得ることができる。目標値および不動帯の設定により入手可能である異なるｐＨプロファイルを、実施例値としてｐＨ６．９０の目標値および０．１０の不動帯に関して図２中に示す。

本発明のさらなる態様では、温度および１つまたは複数のｐＨ変動を含む方法によって産生されるポリペプチドの合計量は、温度変動と１つまたは複数のｐＨ変動の組合せなしより多い。特定トランスフェクト細胞系の必要性に対してタイミングおよびステップサイズの点で適合する、少なくとも１つの温度変動と少なくとも１つのｐＨ変動の組合せは、より良い産物収率をもたらした。

本発明の他のさらなる態様では、温度および１つまたは複数のｐＨ変動を含む方法には、温度変動と１つまたは複数のｐＨ変動の組合せなしで得られる性質と比較して、改善された性質の産物をもたらす可能性がある。培養中の生産期における低いｐＨ値へのｐＨ変動の有益な影響に関して、１つの考えられる理由は以下の通りであり得る。アンモニアは典型的には培養時間で細胞培養培地中に蓄積し、産物のグリコシル化におそらく影響を与えることが知られており、考えられる結果は低下した品質である。アンモニアはＮＨ_３の形で細胞に入ると考えられ、そこでアンモニアは、Ｈ_３０^＋イオンを捕捉することによって細胞内ｐＨに影響を与える可能性がある。結果として生じる細胞内ｐＨの増大は、グリコシル化に影響を与える可能性がある。低い値への培養物のｐＨの変動は、細胞不浸透性であるＮＨ_４ ^＋へのＮＨ_３のプロトン化の増大によって細胞外ＮＨ_３の濃度を低下させる。

本発明による温度および１つまたは複数のｐＨ変動を含む細胞培養法は、様々な細胞培養培地を使用して実施することができる。使用可能であり一般に使用される細胞培養培地は、例えばＤ−ＭＥＭ（ダルベッコ改変イーグル培地）、Ｄ−ＭＥＭ／Ｆ−１２、ΜΕΜα、フィッシャー培地、ＲＰＭＩ１６４０ＢＭＥ、ＢＧＪｂであるが、これらの例に限られない。これらの培地には、例えば栄養素、ビタミン、または炭水化物などの、他の成分をさらに補充することができる。

主に細胞増殖用に最適化するのに適した培地は、以下の範囲に従う初期アミノ酸濃度を含有することが好ましい。

前の表中に定義したようにアミノ酸を含有する培地は、本発明による改良型細胞培養法中で使用可能であることが好ましい。

本発明のさらなる態様は、組換えポリペプチドの大規模生産用に設計した生産培地の使用を含む。これらの生産培地は、多量の成分、例えばアミノ酸を場合によっては含有することができる。本発明の好ましい実施形態では、約４０ｍＭと約１００ｍＭの間、あるいは約５０ｍｍｏｌ／Ｌと約１００ｍｍｏｌ／Ｌの間の範囲の初期アミノ酸含有量を、これらの培地中で使用する。本発明の他の実施形態では、このような生産培地は、以下の範囲に従う初期アミノ酸濃度を含有する。

前の表中に定義したようにアミノ酸を含有する生産培地は、本発明による改良型細胞培養法中で使用可能であることが好ましい。

細胞の培養は、接着培養、例えば単層培養、または好ましくは浮遊培養で実施することができる。

例えばバイオテクノロジー産業において確立した様々な発酵プロセスによって、細胞の大規模培養を使用することができる。本発明による細胞培養培地を使用して、連続および不連続な細胞培養プロセスを利用することができる。他の知られているリアクター技術、例えば灌流技術なども利用することができる。バッチプロセスは好ましい一実施形態である。

バッチ細胞培養は、フェドバッチ培養または単純バッチ培養を含む。フェドバッチ細胞培養は、哺乳動物細胞および細胞培養培地を最初に培養容器に供給し、他の培養栄養素を、培養の停止前に定期的な細胞および／または産物採取有りまたは無しで培養プロセス中に、培養物に連続的または不連続な増加で供給する、細胞培養を指す。単純バッチ培養は、哺乳動物細胞および細胞培養培地を含めた細胞培養に関する全ての成分を、培養プロセスの開始時に培養容器に供給する手順に関する。

本発明のさらなる態様では、培養物の供給は、培養物に加える２つの栄養液からなる供給物を用いてフェドバッチ法で行う。２つの栄養液は、特定細胞系および産物に関して決定した所定のスケジュールに基づくか、または例えば培養容器中のグルコースもしくはアミノ酸の消費の測定により決定する代謝に関する必要性に従うかのいずれかで、培養容器に加える。２つの栄養液は、大量供給としてまたは連続的のいずれかで、独立して加えることができる。典型的には、栄養供給液は、アミノ酸、エネルギー源として少なくとも１つの炭水化物、微量元素、ビタミンまたは特定イオンを含む。濃縮供給液を使用して、多量体積増大および産物の希釈を回避することが特に有利である。いくつかの実施形態では、少なくとも２つの異なる供給液を有することが有用である可能性もある。これは細胞への２つ以上の異なる群の栄養素と成分の独立した投与、したがって特定栄養素の最適な供給に関する供給条件のより良い調節を可能にする。

本発明のさらなる実施形態では、細胞培養培地に加える２つの供給液の１つは、１０を超える塩基性ｐＨにおいて水溶液中に約６．５ｇ／ｌと約８．０ｇ／ｌの範囲内および約９ｇ／ｌと約１１ｇ／ｌの範囲内の各濃度で、ジペプチドシスチンおよびアミノ酸チロシンを含む濃縮供給物である。特定の実施形態では、濃縮供給物は、１０を超えるｐＨにおいて１０．０６ｇ／ｌのＬ−チロシンおよび７．２５ｇ／ｌのシスチンの各濃度で、ジペプチドシスチンおよびアミノ酸チロシンを含む。

前に記載したようなシスチンおよびチロシンを含む供給培地は、測定した各アミノ酸の消費に基づくか、または例えば、１日当たり初代細胞培養培地重量の約０．２重量％〜約０．８重量％、もしくは１日当たり初代細胞培養培地重量の約０．４重量％での固定スケジュールに従うかのいずれかで、加えることができる。

いくつかの例では、他の供給液は、チロシンおよびシスチン以外の、塩基性培地中にも存在する全ての他のアミノ酸を含有する。いくつかの例では、この追加的供給液は、例えばアミノ酸または炭水化物などの、特定の選択した成分からなってよい。本発明のさらなる実施形態では、この濃縮供給培地は、以下の濃度範囲に従う選択したアミノ酸を含有することが好ましい。

グルコースなどの炭水化物も、この濃縮供給培地に加えることが好ましく、好ましい濃度は約１２００ｍｍｏｌ／ｌと約１４００ｍｍｏｌ／ｌの間、またはあるいは約１３００ｍｍｏｌ／ｌと約１３９５ｍｍｏｌ／ｌの間である。

グルコースなどの炭水化物を含むことが好ましい、直前に記載した供給培地は、測定した各アミノ酸の消費に基づくか、または１日当たり初代細胞培養培地重量の例えば約１重量％〜約４重量％、例えば、１日当たり初代細胞培養培地重量の約２重量％での固定スケジュールに従うかのいずれかで、加えることができる。

本発明による細胞培養および細胞培養培地から産生することができるポリペプチドは制限されない。ポリペプチドは組換え型または非組換え型であってよい。ポリペプチドは宿主細胞と相同的であってよく、または好ましくは外因性起源であってよい。本明細書で使用する用語ポリペプチドは、ペプチド結合により接合した３つ以上のアミノ酸の鎖で構成される分子、２本以上のこのような鎖を含有する分子、例えばグリコシル化によってさらに修飾された１本または複数本のこのような鎖を含む分子を包含する。用語ポリペプチドはタンパク質を包含するものとする。対象のポリペプチドは任意の起源であってよい。好ましい対象のポリペプチドはヒト起源であり、およびより好ましくは、対象のタンパク質は治療用タンパク質である。

本発明による細胞培養および細胞培養培地によって産生される好ましいクラスのポリペプチドは、組換え抗体である。

用語「抗体」は広義に使用し、（完全長モノクローナル抗体を含めた）モノクローナル抗体、ポリクローナル抗体、多重特異性抗体（例えば、二重特異性抗体）、ナノボディ、修飾抗体、抗体のサブユニット、抗体誘導体、人工抗体、抗体とタンパク質の組合せ、および望ましい生物活性を示すほど十分長い抗体断片を具体的には含む。本明細書で使用するモノクローナル抗体はヒト抗体であってよい。

しかしながら、抗体以外のポリペプチド、例えば、膜貫通タンパク質、受容体、ホルモン、増殖因子、プロテアーゼ、凝固および抗凝固タンパク質、阻害剤タンパク質、インターロイキン、輸送因子、融合タンパク質などのようなポリペプチドを、本発明による細胞培養および細胞培養培地を使用して産生することもできる。

このような細胞培養プロセスから得られる産物は、医薬調製物の調製に使用することができる。さらに、本発明による（１つまたは複数の）タンパク質は、薬学的に許容される界面活性剤、レシピエント、担体、希釈剤および賦形剤などの生物学的活性剤の他の成分と一緒に投与することができる。

本発明を、以下の実施例によりさらに例示する。

以下に記載する実施例中では、以下の表１中に詳述する組成を有する、化学的に定義された細胞培養培地１および２を使用する。これらの細胞培養培地の個々の成分は、標準的な市販品から入手可能である。

以下の表２は、Ｌ−チロシンおよびシスチンを含有する濃縮供給培地の組成を示す。供給培地は、測定した各アミノ酸の消費に基づくか、または１日当たり例えば０．４重量％での固定スケジュールに従うかのいずれかで、加えることができる。

以下の表３は、例示的な濃縮供給培地の組成を示す。供給培地は、測定したアミノ酸の消費に基づくか、または１日当たり例えば２重量％での固定スケジュールに従うかのいずれかで、加えることができる。

実施例の実験用に、無血清、無タンパク質培地条件に適合させることによって、ｄｈｆｒ（＋）ＣＨＯ−Ｋ１細胞系ＡＴＣＣＣＣＬ−６１に由来する親ＣＨＯ細胞系を使用する（Kao et.al., Genetics,1967,55,513-524; Kao et.al., PNAS,1968,60,1275-1281; Puck et.al., J.Exp.Med.,1958,108,945-959）。この親細胞系の３アリコートをトランスフェクトして、それぞれ３つの異なるモノクローナル抗体ｍＡＢ１、ｍＡＢ２、ｍＡＢ３を発現させる。

実施例１中では、培地１を含有する２つの振とうフラスコ培養物を、ｍＡｂ１産生ＣＨＯクローンと平行して接種する。振とうフラスコ培養物は、３７℃において二酸化炭素インキュベーター中でインキュベートする。第３日に、１つの振とうフラスコを３３℃に設定した二酸化炭素インキュベーターに移す。両方の振とうフラスコに、２つの供給液を同様に供給する。供給物には固定スケジュールに従い補充し、第５日に始めて１日当たり０．４％の第一の供給液（表２）および２％の第二の供給液（表３）を加え、培養の最後まで続けた。

３３℃への温度変動によって、実験の全期間３７℃に維持した培養物と比較して、経時的な培養物の生存細胞密度および生存率（図３および４）の長期の維持、および高い産物力価の獲得（図５）が可能になる。この実施例は、ＣＨＯ宿主細胞系ベースの細胞培養の生産プロセス中に３３℃への温度変動を実施する利点を例示する。

この実施例では、培地２を含有する３００ＬバイオリアクターにｍＡｂ２産生ＣＨＯクローンを接種する。第５日に、バイオリアクターの温度を３６．５℃から３３℃に変動させる。ｐＨ目標値は６．９０であり不動帯は０．１０である。結果として、培養はｐＨ７．００で始まり、ｐＨは第２日と第４日の間に６．８０まで移動し、細胞による乳酸消費のため次いで７．００に次第に戻る（図６）。ｐＨ６．８０への変動によって、一定ｐＨ７．００でのシナリオと比較して、塩基の添加を減らすことができる。ｐＨ７．００への回復によって、第一の変動後ｐＨを６．８０に放置するシナリオと比較して、培地内のＣＯ_２の濃度を低下させることが可能である。温度変動とｐＨ変動を組み合わせたこの方法では、高い生存細胞密度に達し、経時的な生存細胞密度の低下は最小であり（図７）、第１４日に適切な性質の産物の高力価に達することができる（図８）。供給は実施例１中と同様に施す。

この実施例では、３つの独立したフェドバッチ培養法を、ｍＡｂ３産生ＣＨＯ細胞クローンおよび培地２（表１参照）を使用して、ガラス製バイオリアクター中で実施する。実施例１の供給スキームを再度施用する。２つの独立した培養は追加的ｐＨ変動なしの温度変動を含む。すなわち、両細胞培養中のｐＨは培養の全期間にわたりｐＨ７．０の値に維持する。第三の培養実験は、培養の第３日に施すｐＨ７．０からｐＨ６．８への追加的ｐＨ変動によって、最初の２つの実験と異なる。全３回の実験中で実施した温度変動は、それぞれ４〜６×１０^６生存細胞／ｍｌの細胞密度で行った。図９中、対応するＣＨＯクローンからの発現産物として得たｍＡｂ３濃度を、１ミリリットル細胞培養液中の細胞濃度／ｍｌＶＣＤから計算した全生存細胞の積分である生存細胞の積分関数（ＩＶＣ）として示す。勾配ｙ／ｘは、単一生存細胞が１時間中に産生することができる組換えｍＡｂ３産物の量を示す、細胞特異的生産性ｑｐ［ｐｇ／ＶＣ／ｈ］である。したがって図９は、追加的ｐＨ変動を施したときの細胞培養における細胞特異的生産性の増大を例示する。追加的ｐＨ変動のため、細胞はゆっくりと増殖するが、増大した生産性を示す。

Claims

組換えポリペプチドを産生するための方法であって、少なくとも１つの温度変動および少なくとも１つのｐＨ変動を含む条件下において、無タンパク質かつ無血清であり４０ｍＭ〜１００ｍＭの間の全アミノ酸含有量によって特徴付けられる培地中でＣＨＯ細胞を培養すること、および組換えポリペプチドを発現させることを含み、
細胞を第一の温度で少なくとも３日間増殖させ、次いで、第一の温度より１℃〜８℃低い第二の温度に温度を変動させ、細胞を前記第二の温度で少なくともさらに２日の間維持し、
細胞を第一のｐＨ値で少なくとも２日間増殖させ、次いで、第一のｐＨより０．０５〜１ｐＨ単位低い第二のｐＨ値にｐＨを変動させ、細胞を前記第二のｐＨで少なくとも１日間増殖させる方法であって、
前記培地が、以下の４組のうちのいずれかの初期アミノ酸濃度(単位：ｍＭ)を含有するものである、方法：
アルギニン遊離塩基：4.0〜6.0、
アスパラギン一水和物：3.0〜6.0、
アスパラギン酸：2.5〜4.0、
グリシン：0.3〜0.8、
ヒスチジンHCl H ₂ O：0.6〜1.0、
イソロイシン：2.0〜5.0、
ロイシン：3.0〜7.0、
リシンHCl：2.0〜4.0、
メチオニン：1.0〜1.5、
フェニルアラニン：1.0〜2.0、
プロリン：2.5〜6.0、
セリン：3.0〜8.0、
スレオニン：2.0〜3.5、
トリプトファン：0.4〜1.0、
バリン：2.5〜5.0、
チロシン：1.0〜2.0、
シスチン：0.5〜1.0および
グルタミン：5.5〜9.5、
または
アルギニン遊離塩基：4.5〜5.5、
アスパラギン一水和物：4.0〜5.5、
アスパラギン酸：3.0〜3.6、
グリシン：0.5〜0.7、
ヒスチジンHCl H ₂ O：0.7〜0.9、
イソロイシン：3.0〜4.0、
ロイシン：3.5〜6.0、
リシンHCl：2.5〜3.5、
メチオニン：1.2〜1.4、
フェニルアラニン：1.3〜1.8、
プロリン：3.0〜5.5、
セリン：4.0〜7.0、
スレオニン：2.5〜3.1、
トリプトファン：0.5〜0.8、
バリン：3.0〜4.5、
チロシン：1.2〜1.8、
シスチン：0.6〜0.8および
グルタミン：6.2〜8.2、
または
アルギニン遊離塩基：4.0〜6.0、
アスパラギン一水和物：9.0〜11.0、
アスパラギン酸：2.5〜4.0、
グリシン：0.3〜0.8、
ヒスチジンHCl H ₂ O：1.0〜1.5、
イソロイシン：5.5〜7.0、
ロイシン：8.0〜10.0、
リシンHCl：3.0〜6.0、
メチオニン：1.5〜2.5、
フェニルアラニン：2.0〜3.5、
プロリン：7.5〜9.0、
セリン：10.5〜13.0、
スレオニン：3.5〜5.5、
トリプトファン：0.9〜2.0、
バリン：5.5〜7.5、
チロシン：1.0〜3.0、
シスチン：0.5〜2.0、
グルタミン：5.5〜9.5および
グルタミン酸：0.5〜2.5、
または
アルギニン遊離塩基：4.5〜5.5、
アスパラギン一水和物：9.5〜10.5、
アスパラギン酸：3.0〜3.6、
グリシン：0.5〜0.7、
ヒスチジンHCl H ₂ O：1.1〜1.3、
イソロイシン：6.0〜6.8、
ロイシン：9〜9.2、
リシンHCl：4.0〜5.0、
メチオニン：1.5〜2.0、
フェニルアラニン：2.5〜3.0、
プロリン：8.0〜8.5、
セリン：11.0〜11.9、
スレオニン：4.0〜5.0、
トリプトファン：1.0〜1.4、
バリン：6.0〜6.8、
チロシン：2.0〜2.5、
シスチン：1.0〜1.3、
グルタミン：6.2〜8.2および
グルタミン酸：1.0〜1.2。
前記第一のｐＨ値と前記第二のｐＨ値の間でｐＨを能動的に変化させられる、請求項１に記載の方法。
前記第一のｐＨ値と前記第二のｐＨ値の間でｐＨを受動的に変化させられる、請求項１から２のいずれかに記載の方法。
第一の温度が３３℃と３８℃の間の範囲内にある、請求項１から３のいずれかに記載の方法。
第二の温度が３０℃と３７℃の間の範囲内にある、請求項１から４のいずれかに記載の方法。
第一のｐＨ値がｐＨ６．８とｐＨ７．５の間の範囲内にある、請求項１から５のいずれかに記載の方法。
第二のｐＨ値がｐＨ６．０とｐＨ７．１の間の範囲内にある、請求項１から６のいずれかに記載の方法。
前記第二のｐＨを培養の最後まで能動的に維持する、請求項１から７のいずれかに記載の方法。
第一のｐＨ変動の後、少なくとも１日後に第二のｐＨ変動が続き、第三のｐＨ値が第二のｐＨ値より０．０５ｐＨ単位〜１ｐＨ単位高い、請求項１から８のいずれかに記載の方法。
前記第二のｐＨ値から前記第三のｐＨ値にｐＨを能動的に変化させられる、請求項９に記載の方法。
前記第二のｐＨ値から前記第三のｐＨ値にｐＨを受動的に変化させられる、請求項９に記載の方法。
培養物に加える少なくとも２つの栄養液の供給を含むフェドバッチ形式で培養を実施する、請求項１から１１のいずれかに記載の方法。
培養培地に加える供給液の１つがジペプチドシスチンおよびアミノ酸チロシンを含む供給物である、請求項１２に記載の方法。
供給物が、１０を超える塩基性ｐＨにおいて水溶液中に６．５ｇ／ｌと８．０ｇ／ｌの範囲内および９ｇ／ｌと１１ｇ／ｌの範囲内の各濃度で、ジペプチドシスチンおよびアミノ酸チロシンを含む、請求項１３に記載の方法。
シスチンおよびチロシンを含む供給液は１日当たり初代培養培地重量の０．２重量％と０．８重量％の範囲内の量で培養培地に加えられる、請求項１３および１４のいずれかに記載の方法。
産生されるポリペプチドがグリコシル化されたものである、請求項１から１５のいずれかに記載の方法。
ポリペプチドが抗体または抗体断片である、請求項１から１６のいずれかに記載の方法。