CN104878064A - 糖蛋白的产生 - Google Patents

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Abstract

提供了用于在细胞培养物中大规模产生糖蛋白的改进系统。根据本发明，表达糖蛋白的细胞生长在含有约10到600nM浓度的锰的培养基中。此类系统的使用允许产生糖蛋白，该糖蛋白具有增加的糖基化模式和/或更准确反映了天然存在的糖蛋白的糖基化模式。根据本发明表达的糖蛋白可以有利地用于制备药物组合物。

Description

糖蛋白的产生
本申请是申请日为2007年7月11日、发明名称为“糖蛋白的产生”的中国专利申请200780033112.5(国际申请号PCT/US2007/015767)的分案申请。
本发明涉及在包含锰的细胞培养基中产生糖蛋白的方法，和用于这种方法的细胞培养基。
相关申请的参考
本申请是2006年7月13日提交的美国临时专利申请号60/830,658的共同待决申请，并且与其有至少一个共同发明人并且要求该美国临时专利申请的优先权，将该美国临时专利申请的内容完整引入本文作为参考。
发明背景
蛋白质和多肽已经成为越来越重要的治疗剂。在多数情况下，这些蛋白质和多肽在细胞培养物中从细胞产生，所述细胞已经被人工改造和/或选择以产生不寻常的高水平的特定目的蛋白质或多肽。细胞培养条件的控制和优化对于蛋白质和多肽的成功的商业化生产是尤其重要的。
细胞培养物中产生的许多蛋白质和多肽是糖蛋白，其含有共价连接的糖类结构，包括寡糖链。这些寡糖链在内质网和高尔基体中通过N-连接或O-连接连接到蛋白质。寡糖链可以占糖蛋白质量的大部分。认为寡糖链在糖蛋白的功能中起重要作用，包括促进糖蛋白的正确折叠、介导蛋白质－蛋白质相互作用、赋予稳定性、赋予有利的药物动力学和/或药物代谢动力学性质、抑制蛋白酶解消化、将糖蛋白靶向正确的分泌途径和将糖蛋白靶向一个或多个特定器官。
通常，在内质网腔中，N-连接的寡糖链加入新生的转运蛋白(见Alberts等人,Molecular Biology of the Cell,1994，引入本文作为参考)。寡糖被加入目标共有序列Asn-X-Ser/Thr内所含的天冬酰胺残基侧链上的氨基上，其中X可以是除了脯氨酸之外的任何氨基酸。最初的寡糖链通常在内质网中被特定糖苷酶修剪，得到由两个N-乙酰葡糖胺和三个甘露糖残基组成的短的分枝的核心寡糖。
糖蛋白在内质网中的最初处理后，通过小泡穿梭到高尔基体中，在那里寡糖链经历进一步的加工后被分泌到细胞表面。经修剪的N-连接的寡糖链可以通过加入几个甘露糖残基修饰，得到高甘露糖寡糖。备选地，N-乙酰葡糖胺的一个或多个单糖单位可以加入核心甘露糖亚基形成复杂的寡糖。半乳糖可被加入N-乙酰葡糖胺亚基，唾液酸亚基可被加入半乳糖亚基，得到以唾液酸、半乳糖或N-乙酰葡糖胺残基的任一个结束的链。此外，岩藻糖残基可以加入核心寡糖的N-乙酰葡糖胺残基。这些加入的每一种通过特定糖基转移酶催化。
除了通过N-连接的糖基化途径修饰外，糖蛋白也可通过向特定丝氨酸或苏氨酸残基加入O-连接的寡糖链被修饰，如它们在高尔基体中被处理那样。O-连接的寡糖的残基每次加入一个并且每个残基的加入通过特定酶催化。O-连接的糖基化的共有氨基酸序列不如N-连接的糖基化意义明确。
蛋白质糖基化的最终质量和程度受到细胞培养条件的显著影响。例如，常规的分批和补料分批培养方法集中于所产生的肽的最终水平并且通常导致产生这样的糖蛋白，所述糖蛋白具有较不广泛的糖基化模式和/或这样的糖基化模式，其寡糖链的糖残基没有足够地反映存在于天然发生形式的糖蛋白中的糖残基。增加糖基化程度和/或调节糖残基的组成到更接近地反映存在于天然形式糖蛋白中的糖基化水平和组成可以潜在地导致这样的治疗性糖蛋白物质，其具有更高的功效、改进的药物代谢动力学和/或药物动力学性质和更少的副作用。尽管在提高细胞培养物中产生的糖蛋白的糖基化的质量和数量方面做出了一定的努力，但是仍然需要额外的进步。尤其需要开发通过在确定成分培养基中培养细胞产生具有改进的糖基化模式的糖蛋白的系统。
发明概述
本发明的方法和组合物提供了用于用细胞培养大规模产生具有改进的糖基化模式的糖蛋白的改进系统。例如，在一些实施方案中，本发明提供了商业规模(例如，500L或更多)培养方法，其利用含有约10到600nM之间的锰的摩尔累积浓度的培养基。在一些实施方案中，培养基中的摩尔累积谷氨酰胺浓度小于约8mM。在一些实施方案中，培养基中的摩尔累积谷氨酰胺浓度小于约4mM。将理解如上面使用的“累积”指在细胞培养过程中加入的具体一种或多种组分的总量，包括培养开始时加入的组分和随后加入的组分。在本发明的一些实施方案中，希望随时间减小培养的“进料”，因此希望最初存在的量最大。当然，如果那些组分在不同时间加入(例如，最初存在的所有组分对通过进料加入的一些组分)，那么培养基组分在培养期间被代谢使得具有相同累积量的给定组分的培养物将具有不同的绝对水平。
根据本发明，此类培养基的使用允许产生含有希望的糖基化模式的糖蛋白。在一些实施方案中，糖蛋白可以具有更广泛的糖基化模式和/或可以具有更类似于天然宿主细胞应用于该糖蛋白的寡糖链分布的寡糖链分布。在一些实施方案中，本发明系统的使用可以导致产生这样的糖蛋白，其糖基化模式与该糖蛋白在内源人细胞中表达时将存在的糖基化模式相似或相同。
本领域技术人员将理解本发明的培养基制剂包括确定成分培养基和复杂的培养基。在一些实施方案中，培养基是确定成分培养基，其中培养基的组成是已知的和受控的。
在一些实施方案中，细胞在美国临时专利申请序号60/605,097(引入本文作为参考)中所述的一个或多种条件下生长。在一些实施方案中，细胞在美国临时专利申请序号11/213,308(引入本文作为参考)中所述的一个或多种条件下生长。
本发明的细胞培养物可以任选补充营养物和/或其他培养基组分，包括激素和/或其他生长因子、特定离子(如钠、氯化物、钙、镁和磷酸盐)、缓冲剂、维生素、核苷或核苷酸、微量元素(通常以极低终浓度存在的无机化合物)、氨基酸、脂类或葡萄糖或其他能源。在一些实施方案中，对培养基补充化学诱导物如六亚甲基二(乙酰胺)(“HMBA”)和丁酸钠(“NaB”)可以是有益的。此类任选的补充物可以在培养开始时加入或者可以在以后的时间点加入以便补充耗尽的营养物或者为了另一原因。通常，希望选择最初的培养基组成以便减小根据本发明的补充。
附图简述
图1显示了UF/DF存留物质中糖苷活性的研究。对于每个实验，代表多种K4和K4’种类的条形从左到右为：K4(Fuc-GlcNAc-Gal-SA)、K4’(Fuc-GlcNAc-Gal)、K4’(Fuc-GlcNAc)和K4’(Fuc)。
图2显示了在摇瓶培养中产生的rFIX中K4种类分布。对于每个实验，代表多种K4和K4’种类的条形从左到右为：K4(Fuc-GlcNAc-Gal-SA)、K4’(Fuc-GlcNAc-Gal)、K4’(Fuc-GlcNAc)和K4’(Fuc)。
图3显示了来自使用多种培养基添加剂的摇瓶培养物的K4种类分布。对于每个实验，代表多种K4和K4’种类的条形从左到右为：K4(Fuc-GlcNAc-Gal-SA)、K4’(Fuc-GlcNAc-Gal)、K4’(Fuc-GlcNAc)和K4’(Fuc)。
图4显示了使用补充培养基的摇瓶培养物的K4种类分布。对于每个实验，代表多种K4和K4’种类的条形从左到右为：K4(Fuc-GlcNAc-Gal-SA)、K4’(Fuc-GlcNAc-Gal)、K4’(Fuc-GlcNAc)和K4’(Fuc)。
图5显示了来自使用多种培养基添加剂的摇瓶培养物的K4种类分布。对于每个实验，代表多种K4和K4’种类的条形从左到右为：K4(Fuc-GlcNAc-Gal-SA)、K4’(Fuc-GlcNAc-Gal)、K4’(Fuc-GlcNAc)和K4’(Fuc)。
图6显示了来自不同锰水平下的摇瓶培养物的K4种类分布。对于每个实验，代表多种K4和K4’种类的条形从左到右为：K4(Fuc-GlcNAc-Gal-SA)、K4’(Fuc-GlcNAc-Gal)、K4’(Fuc-GlcNAc)和K4’(Fuc)。
图7显示了G0、G1和G2HPAEC-PED峰的总峰面积百分数的图形比较。对于每个实验，代表复杂N-连接的双触角聚糖的条形从左到右为：G0、G1和G2。
图8显示了G0、G1和G2HPAEC-PED峰的总峰面积百分数的图形比较。对于每个实验，代表复杂N-连接的双触角聚糖的条形从左到右为：G0、G1和G2。
定义
“氨基酸”：如本文所用的术语“氨基酸”指通常用于形成多肽的20种天然存在的氨基酸的任一种，或者那些氨基酸的类似物或衍生物或任一种非天然存在的氨基酸。本发明的氨基酸在培养基中提供给细胞培养物。培养基中提供的氨基酸可以作为盐或者以水合物形式提供。
“抗体”：如本文所用的术语“抗体”指免疫球蛋白分子或者免疫球蛋白分子的免疫学活性部分，即，含有特异结合抗原的抗原结合部位的分子，如Fab或F(ab')2片段。在一些实施方案中，抗体是本领域技术人员已知的典型的天然抗体，如包含四条多肽链：两条重链和两条轻链的糖蛋白。在一些实施方案中，抗体是单链抗体。例如，在一些实施方案中，单链抗体包含典型的天然抗体的变体，其中重链和/或轻链的两个或多个成员已经例如通过肽键共价连接。在一些实施方案中，单链抗体是具有由重链和轻链组成的两条多肽链结构的蛋白质，所述链例如通过链间肽接头稳定化，所述蛋白质具有特异结合抗原的能力。在一些实施方案中，抗体是仅由重链组成的抗体，例如，在驼科(Camelidae)，包括羊驼和骆驼的成员中天然发现的那些(见例如，Casterman等人的美国专利号6,765,087，Casterman等人的美国专利号6,015,695和Casterman等人的美国专利号6,005,079，将它们各自完整引入本文作为参考)。如本文所用的术语“单克隆抗体”和“单克隆抗体组合物”指含有仅仅一个种类的抗原结合部位并且因此通常仅与单个表位或特定抗原相互作用的一群抗体分子。单克隆抗体组合物从而通常显示出它们与之免疫反应的特定表位的单一结合亲和力。术语“多克隆抗体”和“多克隆抗体组合物”指含有与特定抗原相互作用的多个种类的抗原结合部位的抗体分子群体。
“分批培养”：如本文所用的术语“分批培养”指培养细胞的方法，其中在培养过程开始时提供将最终用于培养细胞的所有组分，包括培养基(见下面“培养基”的定义)以及细胞自身。分批培养通常在某个点停止并且收获并任选纯化培养基中的细胞和/或组分。
“生物反应器”：如本文所用的术语“生物反应器”指用于哺乳动物细胞培养物生长的任何容器。生物反应器可以为任何大小，只要它用于培养哺乳动物细胞。通常，此类生物反应器将为至少1升并且可以为10、100、250、500、1000、2500、5000、8000、10,000、12,000升或以上，或者之间的任何体积。在培养期间通常控制生物反应器的内部条件，包括但不限于，pH、溶解氧和温度。生物反应器可以由适于在本发明的培养条件下容纳悬浮在培养基中的哺乳动物细胞培养物的任何材料(包括玻璃、塑料或金属)组成。如本文所用的术语“生产生物反应器”指用于生产目的糖蛋白的最终生物反应器。生产生物反应器的体积通常为至少500升并且可以为1000、2500、5000、8000、10,000、12,000升或以上，或之间的任何体积。本领域技术人员将知道并且将能够选择用于实施本发明的合适的生物反应器。
“细胞密度”：如本文所用的术语“细胞密度”指在给定体积的培养基中存在的细胞数目。
“细胞生存力”：如本文所用的术语“细胞生存力”指培养的细胞在给定的一组培养条件或者实验变化下存活的能力。如本文所用的该术语也指特定时间存活的细胞相对于在该时间时培养物中活细胞和死细胞总数的部分。
“复杂培养基”：如本文所用的术语“复杂培养基”指含有身份或量未知或不受控制的至少一种组分的培养基。
“培养物”、“细胞培养物”：如本文所用的这些术语指在适于细胞群体存活和/或生长的条件下悬浮在培养基(见下面“培养基”的定义)中的该细胞群体。如本领域技术人员清楚的，在一些实施方案中，如本文所用的这些术语指包含细胞群体和其中悬浮该群体的培养基的组合。在一些实施方案中，细胞培养物的细胞包含哺乳动物细胞。
“确定成分培养基”：如本文所用的术语“确定成分培养基”指这样的培养基，其中培养基的组成是已知的和受控的。
“补料分批培养”：如本文所用的术语“补料分批培养”指培养细胞的方法，其中在培养过程开始后一次或多次向培养物提供额外的组分。如此提供的组分通常包含在培养过程期间被消耗的细胞的营养组分。额外或备选地，此类额外的组分可以包括补充组分(见下面“补充组分”的定义)。在一些实施方案中，在补料培养基中提供额外的组分(见下面的“补料培养基”)。补料分批培养通常在某点停止并且收获并任选纯化培养基中的细胞和/或组分。
“补料培养基”：如本文所用的术语“补料培养基”指在细胞培养开始后加入的溶液，其含有为哺乳动物细胞生长提供营养的营养物。补料培养基可以含有与最初的细胞培养基中提供的组分相同的组分。备选地，补料培养基可以含有除了最初的细胞培养基中提供的组分之外的一种或多种额外组分。额外或备选地，补料培养基可以缺少在最初的细胞培养基中提供的一种或多种组分。在一些实施方案中，补料培养基的一种或多种组分以与最初的细胞培养基中提供的那些组分的浓度或水平相同或相似的浓度或水平提供。在一些实施方案中，补料培养基的一种或多种组分以与最初的细胞培养基中提供的那些组分的浓度或水平不同的浓度或水平提供。示例性补料培养基在表2显示，尽管本发明不限于使用这些培养基。本领域技术人员将认识到可以使用备选的补料培养基和/或可以对表2中所列的示例性补料培养基的组分进行某些改变。在一些实施方案中，补料培养基含有补充组分(见下面“补充组分”的定义)。
“片段”：如本文所用的术语“片段”指被定义为给定多肽的任何离散部分的多肽，所述离散部分是所述给定多肽独特或特征性的。例如，如本文所用的该术语指给定多肽的任一部分，其包括在全长多肽中发现的至少一个确定的序列元件。在一些片段中，序列元件跨越全长多肽的至少4-5、10、15、20、25、30、35、40、45、50或以上的氨基酸。备选或额外地，如本文所用的该术语指给定多肽的保留全长多肽的至少一种活性的至少一部分的任何离散部分。在一些实施方案中，所保留的活性的部分为全长多肽活性的至少10％。在一些实施方案中，所保留的活性的部分为全长多肽活性的至少20％、30％、40％、50％、60％、70％、80％或90％。在一些实施方案中，所保留的活性的部分为全长多肽活性的至少95％、96％、97％、98％或99％。在一些实施方案中，所述片段保留全长多肽活性的100％或以上。在一些实施方案中，本发明的片段含有作为糖基化位点的肽序列。在一些实施方案中，本发明的片段含有糖基化位点的部分，使得当连接到含有糖基化位点的另一部分的另一片段时，重构了功能糖基化位点。
“基因”：如本文所用的术语“基因”指任何核苷酸序列、DNA或RNA，其至少部分编码离散的终产物，通常是但不限于多肽，其在细胞代谢或发育的某方面发挥功能。任选地，基因不仅包含编码多肽或其他离散终产物的编码序列，而且包含编码区之前和/或之后的调节基础表达水平的区域(见下面的“遗传控制元件”的定义)，和/或各编码区段(“外显子”)之间的间插序列(“内含子”)。
“遗传控制元件”：如本文所用的术语“遗传控制元件”指任一序列元件，其调节它有效连接的基因的表达。遗传控制元件可以通过提高或降低表达水平发挥功能并且可以位于编码序列之前、之内或之后。遗传控制元件可以在基因表达的任一阶段通过调节例如转录的起始、延长或终止、mRNA剪接、mRNA编辑、mRNA稳定性、mRNA在细胞内的定位、翻译的起始、延长或终止或者基因表达的任一其他阶段起作用。遗传控制元件可以单独或者相互组合发挥功能。
“糖蛋白”：如本文所用的术语“糖蛋白”指含有一个或多个共价连接的寡糖链的蛋白质或多肽。寡糖链可以由单一糖残基、糖残基的单一不分枝的链组成或者可以由分枝一次或多次的糖残基链组成。在一些实施方案中，寡糖链是N-连接的。在一些实施方案中，寡糖链是O-连接的。
“糖基化模式”：术语“糖基化模式”指给定的一种或多种糖蛋白的所观察到的糖基化。在寡糖链中具有较大数目的共价连接的糖残基的糖蛋白被说成是具有增加的或者更广泛的糖基化模式。相反地，在寡糖链中具有较少的共价连接的糖残基的糖蛋白被说成是具有减少的或者较不广泛的糖基化模式。如本文所有的术语“糖基化模式”也指根据本发明的教导表达的个体糖蛋白上的一些不同的糖基化模式的特征性分布。在该意义上，增加的糖基化模式指所表达的糖蛋白的糖基化模式的特征性分布的增加。
“宿主细胞”：如本文所用的术语“宿主细胞”指根据本发明操作以产生如本文所述的具有希望的糖基化模式的糖蛋白的细胞。在一些实施方案中，宿主细胞是哺乳动物细胞。
“杂交瘤”：如本文所用的术语“杂交瘤”指永生化细胞和产生抗体的细胞融合得到的细胞或细胞后代。这种得到的杂交瘤是产生抗体的永生化细胞。用于产生杂交瘤的个体细胞可以来自任何哺乳动物来源，包括但不限于，大鼠、猪、兔、绵羊、猪、山羊和人。在一些实施方案中，杂交瘤是三瘤细胞系，当人细胞和小鼠杂交瘤细胞系融合产物——异杂交骨髓瘤融合后代随后与浆细胞融合时得到三瘤细胞系。在一些实施方案中，杂交瘤是产生抗体的任何永生化的杂交细胞系，如四瘤(quadromas)(见例如，Milstein等人,Nature,537:3053,1983)。
“培养基”、“细胞培养基”、“培养基”：如本文使用的这些术语指为生长的哺乳动物细胞提供营养的含有营养物的溶液。通常，此类溶液提供细胞的基本生长和/或存活所需的必需和非必需氨基酸、维生素、能源、脂类和微量元素。此类溶液也可以含有在最小程度之上增强生长和/或存活的补充组分(见下面“补充组分”的定义)，包括但不限于，激素和/或其他生长因子、特定离子(如钠、氯化物、钙、镁和磷酸盐)、缓冲剂、维生素、核苷或核苷酸、微量元素(通常以极低终浓度存在的无机化合物)、氨基酸、脂类和/或葡萄糖或其他能源。在一些实施方案中，有利地将培养基配制成对于细胞存活和增殖最优的pH和盐浓度。示例性培养基在表1中显示，然而本发明不限于使用这些培养基。本领域技术人员将认识到可以使用备选培养基和/或可以对表1中所列的示例性培养基的组成进行某些改变。在一些实施方案中，培养基是在细胞培养开始后加入的补料培养基(见上面的“补料培养基”的定义)。
“多肽”：如本文使用的术语“多肽”指通过肽键连接在一起的氨基酸的顺序链。该术语用于指任何长度的氨基酸链，但是本领域技术人员将理解该术语不限于长链并且可以指包含通过肽键连接在一起的两个氨基酸的最小链。如本领域技术人员所知，可以处理和/或修饰多肽。例如，可以糖基化多肽(见上面“糖蛋白”的定义)。
“蛋白质”：如本文使用的术语“蛋白质”指作为离散单位发挥功能的一种或多种多肽。如果单个多肽是离散的功能单位并且不需要与其他多肽永久或暂时物理结合以便形成离散的功能单位，那么术语“多肽”和“蛋白质”可以互换使用。如果离散的功能单位由物理上相互结合的一种以上的多肽组成，那么术语“蛋白质”指物理上偶联并且一起作为离散单位发挥功能的多个多肽。
“重组表达的糖蛋白”和“重组糖蛋白”：如本文使用的这些术语指从宿主细胞表达的糖蛋白，所述宿主细胞已经通过人的手操作而表达该糖蛋白。在一些实施方案中，宿主细胞是哺乳动物细胞。在一些实施方案中，此类操作包含一个或多个遗传修饰。例如，通过导入一个或多个编码待表达糖蛋白的异源基因可以遗传修饰哺乳动物宿主细胞。异源重组表达的糖蛋白可以与在哺乳动物宿主细胞中正常表达的糖蛋白相同或相似。异源重组表达的糖蛋白也可以是宿主细胞外源的，即，与在哺乳动物宿主细胞中正常表达的糖蛋白是异源的。在一些实施方案中，异源重组表达的糖蛋白是嵌合的，因为该糖蛋白的部分含有与在哺乳动物宿主细胞中正常表达的糖蛋白相同或相似的氨基酸序列，而其他部分是宿主细胞外源的。备选地，通过活化或上调一种或多种内源基因可以遗传修饰哺乳动物宿主细胞。
“补充组分”：如本文使用的术语“补充组分”指增强生长和/存活高于最小程度的组分，包括但不限于，激素和/或其他生长因子、特定离子(如钠、氯化物、钙、镁和磷酸盐)、缓冲剂、维生素、核苷或核苷酸、微量元素(通常以极低终浓度存在的无机化合物)、氨基酸、脂类和/或葡萄糖或其他能源。在一些实施方案中，可以将补充组分加入最初的细胞培养物中。在一些实施方案中，可以在细胞培养开始后加入补充组分。
“效价”：如本文使用的术语“效价”指在给定量的培养基体积中哺乳动物细胞培养物产生的重组表达的糖蛋白的总量。效价通常以毫克糖蛋白/毫升培养基的单位表示。
一些实施方案的详细描述
本发明提供了用于在细胞培养物中产生糖蛋白的改进系统。具体地，提供了导致产生含有希望的糖基化模式的糖蛋白的系统。例如，糖蛋白可以具有更广泛的糖基化模式和/或可以具有更类似于天然宿主细胞应用于糖蛋白的寡糖链分布的寡糖链分布。在一些实施方案中，本发明系统的使用可以导致产生这样的糖蛋白，其糖基化模式与该糖蛋白在内源人细胞中表达时将存在的糖基化模式相似或相同。在下面详细讨论本发明的一些实施方案。然而，本领域技术人员将理解这些实施方案的多种修饰在所附权利要求的范围内。权利要求和其等同方案限定了本发明的范围，其不会且不应该局限于某些实施方案的描述或受到某些实施方案的描述的限制。
培养基组成
多种哺乳动物生长培养基可以用于本发明。在一些实施方案中，细胞可以生长于多种化学上确定成分培养基的一种中，其中培养基的成分是已知和受控的。在一些实施方案中，细胞可以生长在复杂培养基中，其中不是培养基的所有组分都是已知和/或受控的。
在过去几十年内已经广泛开发和公开了用于哺乳动物细胞培养的化学上确定成分培养基。确定成分培养基的所有组分被良好表征，并且该确定成分培养基不含有复杂的添加剂，如血清或水解物。开发了早期的培养基制剂以允许细胞生长和生存力的维持，而对于蛋白质产生关心很少或者不关心。最近，开发的培养基制剂具有维持产生高水平生产性重组蛋白和/或糖蛋白的细胞培养物的表达目的。
确定成分培养基通常由水中的已知浓度的基本上50种化学实体组成。它们的多数也含有一种或多种良好表征的蛋白质，如胰岛素、IGF-1、转铁蛋白或BSA，但是其他的不需要蛋白质组分并且因此被称作无蛋白质的确定成分培养基。培养基的化学组分落入五个大类：氨基酸、维生素、无机盐、微量元素和难以良好归类的杂类。
微量元素由以微摩尔或更低水平被包括的多种无机盐组成。存在于几乎所有确定成分培养基中的四种最通常被包括的微量元素是铁、锌、硒和铜。铁(二价或三价盐)和锌通常以微摩尔浓度加入，而其他的通常以纳摩尔浓度加入。多数较不常见的微量元素通常以纳摩尔浓度加入。
锰通常作为二价阳离子(MnCl2或MnSO4)被包括在微量元素中。在早期形式的确定成分培养基中，它被省略或者以1μM级的高浓度包括(见例如，Barnes和Sato,1980[培养基DMEM/F12]和Kitos等人,1962[培养基MD 705/1])。在最近开发的确定成分培养基中，锰常常被包括在内，但是以低得多的浓度，如1-5nM范围的浓度包括在内(见例如，Hamilton和Ham,1977[培养基MCDB 301]和Cleveland和Erlanger,1988[未命名的培养基])。
本发明包括如下发现：在含有这些极限浓度之间的锰浓度的确定成分培养基中生长的细胞的培养物产生的糖蛋白比在常规培养基(如上述的那些培养基)中生长的细胞产生的糖蛋白含有更广泛的糖基化模式。在一些实施方案中，锰以约10到600nM的浓度在培养基中提供。在一些实施方案中，锰以约20到100nM的浓度在培养基中提供。在一些实施方案中，锰以约10、15、20、25、30、35、40、45、50、55、60、65、70、75、80、85、90、95、100、110、120、130、140、150、160、170、180、190、200、210、220、230、240、250、260、270、280、290、300、310、320、330、340、350、360、370、380、390、400、410、420、430、440、450、460、470、480、490、500、510、520、530、540、550、560、570、580、590或600nM的浓度或者这些浓度内的任何范围的浓度在培养基中提供。
本发明也包括如下发现：在含有相对低水平的谷氨酰胺的确定成分培养基中生长的细胞培养物产生的糖蛋白比在含有较高水平谷氨酰胺的常规培养基中生长的细胞产生的糖蛋白含有更广泛的糖基化模式。在一些实施方案中，培养基中谷氨酰胺的最初水平小于或等于约8mM。在一些实施方案中，培养基中谷氨酰胺的最初水平小于或等于约4mM。
本领域普通技术人员将能够基于他或她的实验设计的具体属性选择这些发明性范围内的确切的锰浓度，所述属性包括表达糖蛋白的细胞的特性、待产生的糖蛋白的特性，和用于培养细胞的培养基中其他组分的存在或缺失。例如，每个这些大类中N-连接的和O-连接的结构之间的差异、或具体寡糖结构之间的差异可以需要生长培养基中不同的锰浓度以便产生更广泛和/或更天然的寡糖链。
糖蛋白
根据本教导可以产生能够在宿主细胞中表达的任何糖蛋白。糖蛋白可以从宿主细胞的内源基因表达，或者从导入宿主细胞的异源基因表达。糖蛋白可以是在自然界中存在的糖蛋白，或者可以备选地具有通过人的手改造或选择的序列。待产生的糖蛋白可以从在自然界单独发生的多肽片段装配，至少一个片段含有作为糖基化位点的肽序列。备选地，每个多肽片段可以仅仅具有糖基化位点的一部分，当多肽片段装配时重构该糖基化位点。额外或备选地，改造的糖蛋白可以包括非天然存在的一个或多个片段，只要该改造的糖蛋白含有作为糖基化位点的至少一个肽序列。
可以希望根据本发明表达的糖蛋白将通常基于有趣或有用的生物或化学活性选择。例如，本发明可以用于表达任一种药学或商业上相关的酶、受体、抗体、激素、调节因子、抗原、结合剂等等。可以根据本发明产生的下面糖蛋白的列表仅仅是示例性的，并且不意在作为限制性引用。本领域技术人员将理解任何糖蛋白可以根据本发明表达并且将能够基于他或她的具体需要选择待产生的具体糖蛋白。
凝血因子
已经表明凝血因子作为药学和/或商业活性剂是有效的。考虑到重组凝血因子在治疗诸如血友病的疾病中的重要性，根据本发明优化重组产生的凝血因子的糖基化模式是尤其重要的。例如，凝血因子Ⅸ(因子IX或“FIX”)是单链糖蛋白，其缺乏导致B型血友病，其是患者的血液不能凝固的一种疾病。从而，任何导致出血的小创伤都是潜在威胁生命的事件。
FIX作为单链酶原合成，其通过活性肽的释放而被活化成两条链的丝氨酸蛋白酶(因子IXa)。因子IXa的催化结构域位于重链中(见Chang等人,J.Clin.Invest.,100:4,1997,引入本文作为参考)。FIX有多个糖基化位点，包括N-连接的和O－连接的糖类二者。曾经认为丝氨酸61处的一种具体的O-连接的结构Sia-α2,3-Gal-β1,4-GlcNAc-β1,3-Fuc-α1-O-Ser)是FIX特有的但是其后来在包括哺乳动物和果蝇中的Notch蛋白质的一些其他分子上被发现(Maloney等人,Journal of Biol.Chem.,275(13),2000)。细胞培养中中国仓鼠卵巢(“CHO”)细胞产生的FIX在丝氨酸61寡糖链中显示出一定的变异性。这些不同的糖形和其他潜在的糖形当施用于人或动物时可以具有不同的诱导凝血的能力和/或在血液中具有不同的稳定性，导致效率较低的凝血。
A型血友病在临床上与B型血友病不能区分，由人类凝血因子VIII中的缺陷引起，人类凝血因子VIII是另一种糖蛋白，其作为单链酶原合成然后被加工成两条链的活性形式。本发明也可以用于控制或改变凝血因子VIII的糖基化模式以便调节它的凝血活性。根据本发明可以产生并且可以控制或改变其糖基化模式的其他糖蛋白凝血因子包括例如，但不限于，组织因子和冯维勒布兰德(von Willebrands)因子。
抗体
抗体是能够特异结合特定抗原的蛋白质。考虑到当前使用或研究中的许多抗体作为药学或其他商业活性剂，根据本发明产生具有希望的糖基化模式的抗体是尤其重要的。此外，具有不同的糖基化模式的抗体较不可能在施用它们的个体中引起免疫应答，导致更有效的治疗方案。额外或备选地，在它们的恒定区中具有不同糖基化模式的抗体可以显示出改进的药物代谢动力学或药物动力学效应功能。额外或备选地，具有不同糖基化模式的抗体可以在产生它们的细胞培养条件中更稳定，例如，通过更抗细胞培养物中的蛋白酶或其他组分，使得产生更高最终效价的抗体。
根据本公开的教导可以使用可以在宿主细胞中表达的任何抗体。在一些实施方案中，待表达的抗体是单克隆抗体。在一些实施方案中，单克隆抗体是嵌合抗体。嵌合抗体含有来自一种以上生物的氨基酸片段。嵌合抗体分子可以包括例如，来自小鼠、大鼠或其他物种的抗原结合结构域与人恒定区。已经描述了多种制备嵌合抗体的方法(见例如，Morrison等人,Proc.Natl.Acad.Sci.U.S.A.81,6851,1985；Takeda等人,Nature 314,452,1985,Cabilly等人,美国专利号4,816,567；Boss等人,美国专利号4,816,397；Tanaguchi等人,欧洲专利公布EP171496；欧洲专利公布0173494,英国专利GB 2177096B,将它们各自引入本文作为参考)。
在一些实施方案中，单克隆抗体是人源化抗体。人源化抗体是嵌合抗体，其中多数氨基酸残基来自人抗体，从而使得递送到人类受试者时减小任何潜在的免疫反应。在人源化抗体中，高变区中的氨基酸残基被来自非人物种的赋予所希望的抗原特异性或亲和性的残基替换。在一些实施方案中，人源化抗体具有与人抗体有百分之80、85、90、91、92、93、94、95、96、97、98、99或更高同一性的氨基酸序列。在一些实施方案中，通过引入保守替代、共有序列替代、种系替代和/或回复突变优化人源化抗体。此类改变的免疫球蛋白分子可以通过本领域已知的几种技术的任一种制备(例如，Teng等人,Proc.Natl.Acad.Sci.U.S.A.,80,7308-7312,1983；Kozbor等人,Immunology Today,4,7279,1983；Olsson等人,Meth.Enzymol.,92,3-16.1982,各自引入本文作为参考)。在一些实施方案中，根据PCT公布WO92/06193或EP 0239400(各自完整引入本文作为参考)的教导制备改变的免疫球蛋白分子。
在一些实施方案中，根据本公开的教导产生的抗体可以含有显示出改进的糖基化模式的免疫球蛋白恒定区或Fc区。例如，根据本文教导产生的抗体可以更强烈结合效应分子或对效应分子有更高特异性，所述效应分子如补体和/或Fc受体，可以控制抗体的几种免疫功能，如效应细胞活性、裂解、补体介导的活性、抗体清除、和抗体半寿期。结合抗体(如IgG抗体)的Fc区的典型的Fc受体包括，但不限于，FcγRI、FcγRII和FcγRIII和FcRn亚类的受体，包括这些受体的等位变体和选择性剪接的形式。Fc受体在Ravetch和Kinet,Annu.Rev.Immunol 9:457-92,1991；Capel等人,Immunomethods 4:25-34,1994；和de Haas等人,J.Lab.Clin.Med.126:330-41,1995中回顾，将这些文献各自完整引入本文作为参考。
仅作为一个非限制性实例，可以根据本教导产生的抗体是抗ABeta抗体。抗ABeta抗体是阿尔茨海默氏病的治疗中尤其有希望的潜在治疗途径。阿尔茨海默氏病(AD)是导致老年性痴呆的进行性疾病(一般见：Selkoe,TINS 16:403,1993；Hardy等人,WO 92/13069；Selkoe,J.Neuropathol.Exp.Neurol.53:438,1994；Duff等人,Nature 373:476,1995；Games等人,Nature 373:523,1995,各自引入本文作为参考)。一般地说，该疾病落入两个类别：迟发型，其发生在老年(65岁以上)，和早发型，其发生在老年期之前，即，35到60岁之间。在两种类型的疾病中，病理是相同的但是在较早年龄开始的病例中，异常倾向于更严重和广泛。该疾病的特征是脑中至少两种类型的病变：神经原纤维缠结和衰老斑。神经原纤维缠结是与tau蛋白相关的微管的细胞内沉积，由成对的相互缠绕的两条丝组成。衰老斑(即，淀粉状蛋白斑)是直径长达150μm的紊乱的神经毡区域，在中心具有细胞外淀粉状蛋白沉积物，通过脑组织切片的显微镜分析可以看到所述区域。脑中淀粉状蛋白斑的积累也与唐氏综合征和其他认知病症有关。
所述斑的主要成分是称作ABeta或β－淀粉状蛋白肽的肽。ABeta肽是称作淀粉状蛋白前体蛋白(APP)的较大的跨膜糖蛋白的39-43个氨基酸的4-kDa内部片段。作为不同的分泌酶对APP的蛋白酶解加工的结果，ABeta主要以长40个氨基酸的短形式和长42-43个氨基酸的长形式被发现。APP的疏水跨膜结构域的部分被发现于ABeta的羧基末端，并且可以是ABeta聚集成斑块的原因，尤其对于长形式的情况。脑中淀粉状蛋白斑的积累最终导致神经元细胞死亡。与该类型的神经衰退相关的身体症状是阿尔茨海默氏病的特征。
APP蛋白内的一些突变与阿尔茨海默氏病的存在相关(见例如，Goate等人,Nature 349:704,1991(缬氨酸717突变成异亮氨酸)；Chartier Harlan等人Nature 353:844,1991(缬氨酸717突变成甘氨酸)；Murrell等人,Science 254:97,1991(缬氨酸717突变成苯丙氨酸)；Mullan等人,NatureGenet.1:345,1992(双突变，将赖氨酸595-甲硫氨酸596改变成天冬酰胺595－亮氨酸596)，将这些文献各自完整引入本文作为参考)。认为此类突变通过APP向ABeta的增加或改变的加工，尤其APP向增加量的长形式ABeta(即，ABeta1-42和ABeta143)的加工而引起阿尔茨海默氏病。认为其他基因如衰老蛋白基因PS1和PS2中的突变间接影响APP的加工而产生增加量的长形式ABeta(见Hardy,TINS 20:154,1997,将其完整引入本文作为参考)。
已经成功地用小鼠模型确定淀粉状蛋白斑在阿尔茨海默氏病中的重要性(Games等人,同上；Johnson-Wood等人,Proc.Natl.Acad.Sci.USA94:1550,1997,将其完整引入本文作为参考)。具体地，当用长形式ABeta注射PDAPP转基因小鼠(其表达突变形式的人APP并且在幼年发生阿尔茨海默氏病)时，它们显示出阿尔茨海默氏病进展的减慢和抗ABeta肽的抗体效价的升高(Schenk等人,Nature 400,173,1999,将其完整引入本文作为参考)。上面讨论的观察表明ABeta，尤其其长形式是阿尔茨海默氏病的成因。
ABeta肽可以存在于溶液中并且可以在CNS(例如，CSF)和血浆中检测到。在一些条件下，可溶性ABeta被转化为在AD患者的神经突斑块和脑血管中发现的纤丝状毒性β折叠形式。已经研究了涉及用抗ABeta的单克隆抗体进行免疫的治疗。已经在AD的小鼠模型中测试了主动和被动免疫。主动免疫导致脑中斑块负荷的一定减少，但是仅仅通过经鼻施用进行了主动免疫。也已经研究了PDAPP转基因小鼠的被动免疫(Bard,等人,Nat.Med.6:916-19,2000,将其完整引入本文作为参考)。发现识别ABeta的氨基末端和中心结构域的抗体刺激ABeta沉积物的吞噬作用，而抗羧基末端结构域附近结构域的抗体不刺激ABeta沉积物的吞噬作用。
被动或主动免疫后ABeta的清除机理正在持续的研究中。已经为有效清除提出了两种机理，即中枢降解和外周降解。中枢降解机理依赖于能够穿过血脑屏障、结合斑块并诱导现有斑块清除的抗体。已经表明通过Fc－受体介导的吞噬作用促进清除(Bard,等人,同上)。ABeta清除的外周降解机理依赖于施用抗体时脑、CSF和血浆之间ABeta的动态平衡的破坏，导致ABeta从一个隔室转移到另一隔室。中枢来源的ABeta被转运到CSF和血浆，在这里它被降解。最近的研究已经断定可溶性和未结合的ABeta涉及与AD相关的记忆缺陷，甚至脑中淀粉状蛋白沉积没有减少。需要进一步的研究来确定用于ABeta清除的这些途径的作用和/或相互影响(Dodel,等人,The Lancet Vol.2:215,2003,将其完整引入本文作为参考)。
抗ABeta抗体是AD治疗的潜在有希望的途径，因为它们可以结合并清除ABeta或包含淀粉状蛋白斑的其他组分。根据本公开的教导产生的抗ABeta可以用于更好地治疗阿尔茨海默氏病或其他相关疾病，例如，通过更有效地结合并清除淀粉状蛋白斑的组分，通过以更少或更低的严重副作用清除淀粉状蛋白斑，或者通过防止淀粉状蛋白斑的形成或积累实现所述治疗。在一些实施方案中，根据本教导产生的抗ABeta抗体是单克隆抗体。
在一些实施方案中，根据本教导产生的抗ABeta抗体特异结合ABeta的聚集形式而不结合可溶形式。在一些实施方案中，根据本教导产生的抗ABeta抗体在它们不结合聚集形式的条件下特异结合抗ABeta的可溶形式。在一些实施方案中，根据本教导产生的抗ABeta抗体结合聚集和可溶形式两者。在一些实施方案中，根据本教导产生的抗ABeta抗体结合斑块中的ABeta。在一些实施方案中，根据本教导产生的抗ABeta抗体穿过血脑屏障。在一些实施方案中，根据本教导产生的抗ABeta抗体减轻受试者中的淀粉状蛋白负担。在一些实施方案中，根据本教导产生的抗ABeta抗体减轻受试者中的神经突营养不良。在一些实施方案中，抗ABeta抗体可以保持突触结构体系(例如，突触泡蛋白)。
根据一些实施方案，根据本教导产生的抗ABeta抗体结合ABeta的残基13-28内的表位(天然ABeta的第一个N-末端残基标为1)。在一些实施方案中，根据本教导产生的抗ABeta抗体结合ABeta的残基19-22内的表位。在一些实施方案中，使用对不同的抗ABeta表位具有结合特异性的多种单克隆抗体。例如，在一些实施方案中，对ABeta的残基19-22内的表位特异的抗体与对ABeta的残基19-22外的表位特异的抗体共同施用。此类抗体可以顺序或同时施用。也可以施用抗除了ABeta之外的淀粉状蛋白组分的抗体(例如，施用或共同施用)。
在一些实施方案中，根据本教导产生的抗ABeta抗体比其他方式产生的抗ABeta抗体更强烈或者以更高特异性结合到ABeta表位。通过已知的技术，例如，通过形成噬菌体展示文库可以确定抗体的表位特异性，在噬菌体展示文库中，不同的成员展示ABeta的不同的子序列。然后选择噬菌体展示文库中特异结合所测试抗体的成员。分离序列家族。典型地，此类家族含有共同的核心序列，和不同成员中不同长度的侧翼序列。显示出对抗体特异结合的最短的核心序列通常确定了抗体结合的表位。备选或额外地，可以在竞争性测定法中用已经确定了表位特异性的抗体测试抗体的表位特异性。例如，认为与15C11抗体竞争结合ABeta的抗体与15C11结合相同或相似的表位，即在残基ABeta 19-22内。在一些实施方案中，筛选抗体的表位特异性是治疗功效的有用的预测子。例如，根据本发明的方法学，被确定结合ABeta的残基13-28内的表位(例如，结合到Aβ19-22)的抗体可能在预防和治疗阿尔茨海默氏病中是有效的。
特异结合ABeta的优选区段而不结合ABeta的其他区域的抗体相对于结合其他区域的单克隆抗体或相对于结合完整ABeta的多克隆血清有许多优点。其中，对于相等的质量剂量，特异结合优选区段的抗体的剂量含有更高摩尔剂量的有效清除淀粉状蛋白斑的抗体。而且，特异结合优选区段的抗体可以诱导针对淀粉状蛋白沉积物的清除应答而不诱导针对完整APP多肽的清除应答，从而降低潜在的副作用。
在一些实施方案中，上述单克隆抗体、嵌合抗体、单链抗体或人源化抗体可以含有不天然存在于自然界中任何物种中任何抗体内的氨基酸残基。此类外源残基可以用于例如赋予单克隆抗体、嵌合抗体、单链抗体或人源化抗体新的或改良的特异性、亲和力或效应子功能。
酶
已经表明有效作为药学和/或商业活性剂的另一类糖蛋白包括酶。酶可以是糖蛋白，其糖基化模式影响酶活性。从而，根据本发明产生具有希望的糖基化模式的酶也是尤其重要的。
仅仅作为非限制性实例，葡糖脑苷脂酶(GCR)的缺乏导致称作戈谢病的状况，其由某些细胞的溶酶体中葡糖脑苷脂酶的积累引起。患有戈谢病的受试者显示出一系列症状，包括脾肿大、肝肿大、骨骼病症、血小板减少症和贫血。Friedman和Hayes表明在一级氨基酸序列中含有单个替代的重组CR(rGCR)与天然存在的GCR相比显示出改变的糖基化模式，特别是岩藻糖和N-乙酰葡糖胺残基的增加(见美国专利号5,549,892)。
Friedman和Hayes还表明该rGCR与天然存在的rGCR相比显示出改善的药物代谢动力学性质。例如，比天然存在的GCR高约两倍的rGCR靶向肝脏肝巨噬细胞。尽管这两种蛋白质的一级氨基酸序列仅在一个残基处不同，但是Friedman和Hayes假定rGCR的改变的糖基化模式也影响向肝巨噬细胞的靶向。
本领域技术人员将知道由于糖基化模式的改变而显示出改变的酶学、药物代谢动力学和/或药物动力学性质的酶的其他已知的实例。
生长因子和其他信号分子
已经表明有效作为药学和/或商业活性剂的另一类糖蛋白包括生长因子和其他信号分子。从而，根据本发明产生具有希望的糖基化模式的受体也是尤其重要的。生长因子通常是糖蛋白，其被细胞分泌并结合和活化其他细胞上的受体，启动受体细胞中的代谢或发育改变。
哺乳动物生长因子和其他信号分子的非限制性实例包括细胞因子；表皮生长因子(EGF)；血小板衍生生长因子(PDGF)；成纤维细胞生长因子(FGFs)如FGF-5；胰岛素样生长因子-I和-II(IGF-I和IGF-II)；des(1-3)-IGF-I(脑IGF-I),胰岛素样生长因子结合蛋白；CD蛋白，如CD-3,CD-4,CD-8,和CD-19；红细胞生成素；骨诱导因子；免疫毒素；骨形态发生蛋白(BMPs)；干扰素，如α、β和γ干扰素；集落刺激因子(CSFs),例如，M-CSF,GM-CSF和G-CSF；多数白介素；肿瘤坏死因子(TNF)β；促卵泡激素；降钙素；黄体生成素；抗凝血因子，如蛋白C；心房钠尿肽；肺表面活性物质；纤溶酶原激活物,如尿激酶或人尿或组织型纤溶酶原激活物(t-PA)；造血生长因子；和脑啡肽酶。本领域技术人员将知道可以根据本发明表达的其他生长因子或信号分子。
生长因子或其他信号分子的糖基化模式的特定改变已经表明对它们的治疗性质具有显著影响。仅作为非限制性实例，治疗患有慢性贫血的患者的一种常见方法是为他们提供经常注射重组人红细胞生成素(rHuEPO)以便加强他们的红细胞产生。已经开发了rHuEPO的类似物促红血球生成素(darbepoetin)α其在身体中比正常rHuEPO有更长的持续时间。促红血球生成素α和rHuEPO之间的主要差别是存在两个额外的含有唾液酸的N-连接的寡糖链。使用体外糖工程已经完成了促红血球生成素α的产生(见Elliott等人,Nature Biotechnology 21(4):414-21,2003)。Elliott等人使用体外诱变向rHuEPO多肽主链中导入额外的糖基化位点，导致促红血球生成素α类似物的表达。该额外的寡糖链位于EPO受体结合位点远端并且表面上不干扰受体结合。然而，促红血球生成素α的半寿期比rHuEPO高达3倍，导致更有效的治疗剂。
该实例阐明生长因子或其他信号分子的糖基化模式的改变可以对治疗性糖蛋白的体内稳定性和/或活性具有显著影响。从而，根据本发明的目的生长因子或其他信号分子的表达可以导致所表达的生长因子或信号分子具有改进的糖基化模式和改进的治疗性质。
受体
已经表明有效作为药学和/或商业活性剂的另一类糖蛋白是受体。从而，根据本发明产生具有希望的糖基化模式的受体也是尤其重要的。受体通常是跨膜糖蛋白，其通过识别细胞外信号配体而发挥功能。除了识别配体的结构域之外，受体通常还具有蛋白激酶结构域，其通过结合配体时磷酸化目标细胞内分子而启动信号途径，导致细胞内发育或代谢改变。
在一些实施方案中，将根据本发明产生的糖蛋白受体是受体酪氨酸激酶(RTK)。RTK家族包括对于多种细胞类型的多种功能关键的受体(见例如，Yarden和Ullrich,Ann.Rev.Biochem.57:433-478,1988；Ullrich和Schlessinger,Cell 61:243-254,1990,引入本文作为参考)。RTK的非限制性实例包括成纤维细胞生长因子(FGF)受体家族成员、表皮生长因子(EGF)受体家族成员、血小板衍生生长因子(PDGF)受体、具有免疫球蛋白和EGF同源性结构域－1的酪氨酸激酶(TIE-1)和TIE-2受体(Sato等人,Nature376(6535):70-74,1995)和c-Met受体，其一些已经被提出直接或间接促进血管发生(Mustonen和Alitalo,J.Cell Biol.129:895-898,1995)。RTK的其他非限制性实例包括胎儿肝脏激酶1(FLK-1)(有时称作含有激酶插入结构域的受体(KDR)(Terman等人,Oncogene 6:1677-83,1991)或血管内皮细胞生长因子受体2(VEGFR-2))、fms样酪氨酸激酶－1(Flt-1)(DeVries等人Science 255；989-991,1992；Shibuya等人,Oncogene 5:519-524,1990),有时被称作血管内皮细胞生长因子受体1(VEGFR-1)、神经毡蛋白－1、内皮糖蛋白、内皮唾液酸蛋白和Axl。在一些实施方案中，根据本发明表达肿瘤坏死因子α和β受体(TNFR-1；1991年3月20日公布的EP 417,563；和TNFR-2,1991年3月20日公布的EP 417,014)(回顾见Naismith和Sprang,J Inflamm.47(1-2):1-7,1995-96,引入本文作为参考)。
在一些实施方案中，待根据本发明产生的糖蛋白受体是G-蛋白偶联受体(GPCR)。GPCR是具有7跨膜结构域的糖蛋白。当配体结合到GPCR时，在细胞内转导信号，其导致细胞的生物学或生理学性质改变。GPCR是药物作用和开发的主要靶标。实际上，受体已经导致半数以上的当前已知的药物(Drews,Nature Biotechnology,14:1516,1996)并且GPCR代表治疗干预的最重要的靶标，30％的临床处方药拮抗或者激动GPCR(Milligan,G.和Rees,S.,TIPS,20:118-124,1999)。因为此类受体具有作为治疗靶标的确立的被证明的历史，所以根据本发明产生具有希望的糖基化模式的GPCR也是尤其重要的。例如，根据本发明表达的具有希望的糖基化模式的GPCR的细胞外结构域可以通过滴定或者螯合配体而作为重要的治疗剂，其中所述配体对内源GPCR的结合是有害的。
GPCR，以及G蛋白和效应子(受G蛋白调节的细胞内酶和通道)是调节信号系统的组分，所述系统连接细胞内第二信使的状态与细胞外输入。此类基因和基因产物是疾病的潜在病因。
GPCR蛋白质超家族现在含有250种以上类型的种内同源物，其代表基因复制(或其他加工)产生的变体，与直向同源物相反，其中直向同源物是来自不同物种的相同受体。该超家族可以分成5个家族：家族I:以视紫红质和β2－肾上腺素能受体为代表的受体并且当前通过200种以上的独特成员代表；家族II:最近表征的甲状旁腺激素/降钙素/分泌素受体家族；家族III：哺乳动物中的代谢型谷氨酸受体家族；家族IV：cAMP受体家族，在盘基网柄菌(D.discoideum)的趋化性和发育中是重要的；和家族V：真菌交配信息素受体如STE2。
GPCR包括生物胺类、炎症的脂类介体、肽激素和感觉信号介体的受体。GPCR当结合到它的细胞外配体时被活化。配体－受体相互作用导致的GPCR的构象改变影响G蛋白与GPCR细胞内结构域的结合亲和力。这使得GTP能够以增强的亲和力结合G蛋白。
GTP对G蛋白的活化导致G蛋白α亚基与腺苷酸环化酶或者其他第二信使分子产生者的相互作用。该相互作用调节腺苷酸环化酶的活性从而调节第二信使分子cAMP的产生。cAMP调节其他细胞内蛋白质的磷酸化和活化。备选地，GPCR的活性可以上调或者下调其他第二信使分子如cGMP或eicosinoids的细胞水平。G蛋白α亚基通过GTP酶对GTP的水解失活，并且α、Bετ和γ亚基再结合。异三聚体G蛋白然后与腺苷酸环化酶或其他第二信使分子产生者解离。GPCR的活性也可以通过细胞内和细胞外结构域或环的磷酸化调节。
谷氨酸受体形成在神经传递中重要的一组GPCR。谷氨酸是CNS中的主要神经递质并且被认为在神经元可塑性、认知、记忆、学习和一些神经性障碍如癫痫、中风和神经变性中起重要作用(Watson,S.和S.Arkinstall,1994)The G-Protein Linked Receptor Facts Book,Academic Press,SanDiego CA,pp.130-132)。谷氨酸的这些效应通过称作离子型和代谢型受体的两个不同类别的受体介导。离子型受体含有内在的阳离子通道并且介导谷氨酸的快速兴奋作用。代谢型受体是调节性的，通过抑制依赖钙的钾电导和抑制和加强离子型受体的兴奋传导而增加神经元的膜兴奋性。代谢型受体基于激动剂药理学和信号转导途径被分成5个亚类并且在脑组织中广泛分布。已经表明N-连接的糖基化在人1型α代谢型谷氨酸(mGlu1α)受体的功能中是重要的(Mody等人,Neuropharmacology 38(10):1485-92,1999)。mGlu1α通常至少部分作为由约145和160KDa的单体组成的二聚体表达。通过用N-连接的糖基化的有效抑制剂衣霉素处理mGlu1α，Mody等人阐明尽管细胞表面表达不受影响，但是仅仅表达一种肽，其通过其一级氨基酸序列预测具有约130kDa的质量。在功能上，用衣霉素处理与未处理的细胞群体相比，激动剂刺激的磷酸次黄苷酸水解降低了约50％。从而，根据本发明调节所表达的GPCR的糖基化模式可用于调节所表达的GPCR的信号功能并且潜在控制或影响所表达的GPCR的药学或其他性质。
血管活性肠肽(VIP)家族是一组相关的多肽，其作用也通过GPCR介导。该家族的关键成员是VIP自身、促胰液素和生长激素释放因子(GRF)。VIP具有宽的生理作用谱，包括平滑肌的松弛、多种组织中分泌的刺激或抑制、多种免疫细胞活性的调节，和CNS中多种兴奋性和抑制性活性。促胰液素刺激胰腺和肠中酶和离子的分泌并且也以少量存在于脑中。已经表明VIP受体的糖基化对其同族VIP的结合具有重要影响(Chochola等人,J.Biol.Chem.268:2312-2318,1993)。通过用麦胚凝集素处理VIP受体立体地阻断寡糖链以依赖剂量的方式显著抑制VIP结合并且减小了VIP刺激的cAMP应答。此外，VIP受体中特定N-连接的糖基化位点的突变导致内质网中受体的滞留，表明正确的糖基化对于向细胞表面的递送是关键的(Couvineau等人,Biochemistry 35(6):1745-52,1996)。从而，调节根据本发明表达的GPCR的糖基化模式可以用于调节(例如，增加或减少)所表达的GPCR与其同族配体的结合和潜在控制或影响所表达的GPCR的药学性质或其他性质。
通常，本发明的实践者将选择目的糖蛋白，并且将知道它的精确氨基酸序列。本发明的技术已经成功应用于O-连接的(实施例1和2)和N-连接的(实施例3和4)糖蛋白，表明本发明将可应用于一般的糖蛋白表达。将根据本发明表达的任何给定的糖蛋白可以具有其自身的具体特征并且可以影响所培养细胞的细胞密度和生存力，可以比在相同培养条件下生长的另一糖蛋白以更低水平表达，并且可以取决于确切的培养条件和进行的步骤在一个或多个位点被不同地糖基化。本领域技术人员将能够适当修饰用于根据本发明教导产生具体糖蛋白的步骤和组合物以便优化细胞生长和任何给定表达的糖蛋白产生和/或糖基化模式。
在一些实施方案中，根据本发明的系统和方法表达肿瘤坏死因子α和β受体形式的肿瘤坏死因子抑制剂(TNFR-1；1991年3月20日公布的EP417,563；和TNFR-2,1991年3月20日公布的EP 417,014,各自完整引入本文作为参考)(回顾见Naismith和Sprang,J Inflamm.47(1-2):1-7,1995-96,完整引入本文作为参考)。根据一些实施方案，肿瘤坏死因子抑制剂包含可溶性TNF受体。在一些实施方案中，肿瘤坏死因子抑制剂包含可溶性TNFR-Ig。在一些实施方案中，本发明的TNF抑制剂是可溶形式的TNFRI和TNFRII。在一些实施方案中，本发明的TNF抑制剂是可溶性TNF结合蛋白。在一些实施方案中，本发明的TNF抑制剂是TNFR-Ig融合蛋白，例如，TNFR-Fc或etanercept。如本文所用，"etanercept"指TNFR-Fc，其是p75TNF-α受体的细胞外部分的两个分子的二聚体，每个分子由人IgG1的235个氨基酸的Fc部分组成。
向宿主细胞中导入用于表达糖蛋白的基因
通常，导入细胞中的核酸分子编码希望根据本发明表达的糖蛋白。备选地，核酸分子可以编码基因产物，其诱导细胞表达希望的糖蛋白。例如，导入的遗传物质可以编码活化内源或异源糖蛋白转录的转录因子。备选或额外地，导入的核酸分子可以增加细胞表达的糖蛋白的翻译或稳定性。
适于向哺乳动物细胞中导入足够实现目的糖蛋白表达的核酸的方法是本领域已知的。见例如，Gething等人,Nature,293:620-625,1981；Mantei等人,Nature,281:40-46,1979；Levinson等人EP 117,060；和EP 117,058,将它们各自引入本文作为参考。对于哺乳动物细胞，将遗传物质导入哺乳动物细胞的常规方法包括Graham和van der Erb(Virology,52:456-457,1978)的磷酸钙沉淀方法或lipofectamineTM(Gibco BRL)Method ofHawley-Nelson(Focus 15:73,1993)。哺乳动物宿主系统转化的一般方面已经由Axel在1983年8月16日公布的美国专利号4,399,216描述。对于向哺乳动物细胞导入遗传物质的多种技术，见Keown等人,Methods inEnzymology,1989,Keown等人,Methods in Enzymology,185:527-537,1990,和Mansour等人,Nature,336:348-352,1988。
在一些实施方案中，待导入的核酸是裸核酸分子的形式。例如，待导入细胞的核酸分子可以仅由编码糖蛋白的核酸和必要的遗传控制元件组成。备选地，编码糖蛋白的核酸(包括必要的调节元件)可以包含在质粒载体中。用于在哺乳动物细胞中表达糖蛋白的合适载体的非限制性代表性实例包括pCDNA1；pCD,见Okayama,等人Mol.Cell Biol.5:1136-1142,1985；pMClneo Poly-A,见Thomas,等人Cell 51:503-512,1987；杆状病毒载体，如pAC 373或pAC 610；CDM8,见Seed,B.Nature 329:840,1987；和pMT2PC,见Kaufman,等人EMBO J.6:187-195,1987，将它们各自完整引入本文作为参考。在一些实施方案中，待导入细胞的核酸分子包含在病毒载体中。例如，可以将编码糖蛋白的核酸插入病毒基因组(或者部分病毒基因组)。指导糖蛋白表达的调节元件可以与插入病毒基因组的核酸一起被包括(即，连接到待插入病毒基因组的基因)或者可以由病毒基因组自身提供。
提供形成含有DNA和磷酸钙的沉淀可以将裸DNA导入细胞中。备选地，也可以通过形成DNA与DEAE-葡聚糖的混合物并将该混合物与细胞温育或者通过将细胞与DNA一起在合适的缓冲液中温育并将细胞进行高电压电脉冲(例如，通过电穿孔)将裸DNA导入细胞中。向细胞导入裸DNA的另一方法是通过将DNA与含有阳离子脂类的脂质体悬浮液混合。然后将DNA/脂质体复合物与细胞温育。也可以通过例如显微注射将裸DNA直接注射到细胞中。
备选地，通过将裸DNA与偶联到细胞表面受体配体的阳离子如聚赖氨酸络合将裸DNA导入细胞(见例如，Wu,G.和Wu,C.H.J.Biol.Chem.263:14621,1988；Wilson等人J.Biol.Chem.267:963-967,1992；和美国专利号5,166,320,各自完整引入本文作为参考)。DNA-配体复合体与受体的结合通过受体介导的内吞作用促进了对DNA的摄入。
使用含有具体核酸序列，如编码糖蛋白的cDNA的病毒载体是将核酸序列导入细胞的常用方法。用病毒载体感染细胞具有大比例的细胞接受该核酸的优点，其可以避免对已经接受该核酸的细胞进行选择的需要。此外，病毒载体内编码的分子(如通过病毒载体所含的cDNA编码的分子)通常在已经摄入病毒载体核酸的细胞中有效表达。
缺陷逆转录病毒已经被良好表征用于基因治疗目的的基因转移(回顾见Miller,A.D.Blood 76:271,1990)。可以构建重组逆转录病毒，其具有插入到逆转录病毒基因组中的编码目的糖蛋白的核酸。此外，可以除去逆转录病毒基因组的部分以使得逆转录病毒复制缺陷。这种复制缺陷逆转录病毒然后包装成病毒体，其可以通过标准技术通过辅助病毒用于感染靶细胞。
可以操作腺病毒的基因组使得它编码并表达目的糖蛋白但是在正常的裂解病毒生命周期中复制的能力被失活。见例如，Berkner等人BioTechniques 6:616,1988；Rosenfeld等人Science 252:431-434,1991；和Rosenfeld等人Cell 68:143-155,1992。衍生自腺病毒毒株Ad型5dl324或腺病毒的其他毒株(例如，Ad2,Ad3,Ad7等等)的合适的腺病毒载体是本领域技术人员已知的。重组腺病毒是有利的，因为它们不需要分裂细胞为有效的基因递送载体并且可以用于感染多种细胞类型，包括呼吸道上皮(Rosenfeld等人,1992,如上引用),内皮细胞(Lemarchand等人,Proc.Natl.Acad.Sci.USA 89:6482-6486,1992),肝细胞(Herz和Gerard,Proc.Natl.Acad.Sci.USA 90:2812-2816,1993)和肌细胞(Quantin等人,Proc.Natl.Acad.Sci.USA 89:2581-2584,1992)。此外，所导入的腺病毒DNA(和其中含有的外源DNA)不整合到宿主细胞的基因组中而是保持附加型，从而避免了由于导入的DNA变得整合到宿主基因组中(例如，逆转录病毒DNA)的情况下发生插入诱变而引起的潜在问题。此外，腺病毒基因组对于外源DNA的携带能力相对于其他基因递送载体是强的(高达8千碱基)(Berkner等人，上文引用；Haj-Ahmand和Graham,J.Virol.57:267,1986)。当前使用的多数复制缺陷腺病毒载体对于病毒E1和E3基因的所有或者部分是缺失的但是保留高达80％的腺病毒遗传物质。
腺伴随病毒(AAV)是天然存在的缺陷病毒，其需要另一病毒，如腺病毒或疱疹病毒，作为有效复制和生产性生命周期的辅助病毒(回顾见Muzyczka等人Curr.Topics in Micro.and Immunol.,158:97-129,1992)。它也是可以将其DNA整合到非分裂的细胞并显示出高频率的稳定整合的少数几种病毒之一(见例如，Flotte等人,Am.J.Respir.Cell.Mol.Biol.7:349-356,1992；Samulski等人,J.Virol.63:3822-3828,1989；和McLaughlin等人,J.Virol.62:1963-1973,1989)。含有AAV的少至300碱基对的载体可以包装并整合。外源DNA的空间局限于约4.5kb。诸如Tratschin等人(Mol.Cell.Biol.5:3251-3260,1985)中描述的AAV载体可以用于向细胞导入DNA。使用AAV载体已经向不同的细胞类型中导入了多种核酸(见例如，Hermonat等人,Proc.Natl.Acad.Sci.USA 81:6466-6470,1984；Tratschin等人,Mol.Cell.Biol.4:2072-2081,1985；Wondisford等人,Mol.Endocrinol.2:32-39,1988；Tratschin等人,J.Virol.51:611-619,1984；和Flotte等人,J.Biol.Chem.268:3781-3790,1993)。
当用于向细胞群体导入核酸分子的方法导致大比例的细胞修饰和细胞有效表达糖蛋白时，可以使用修饰的细胞群体而不用进一步分离或亚克隆该群体内的个体细胞。即，通过细胞群体可以产生足够的糖蛋白使得不需要进一步分离细胞并且该群体可以立即用于接种细胞培养物用于产生糖蛋白。备选地，可以希望从有效产生所述糖蛋白的一些细胞或单个细胞分离和扩增同质细胞群体。
作为向细胞导入编码目的糖蛋白的核酸分子的替代，所导入的核酸可以编码另一多肽或蛋白，其诱导或提高细胞内源产生的糖蛋白的表达水平。例如，细胞可以能够表达特定糖蛋白但是不进行细胞的额外处理时不能表达该糖蛋白。类似地，为了所希望的目的，细胞可以表达不足量的目的糖蛋白。从而，刺激目的糖蛋白表达的试剂可以用于诱导或增加细胞对该糖蛋白的表达。例如，所导入的核酸分子可以编码转录因子，该转录因子活化或上调目的糖蛋白的转录。此类转录因子的表达又导致目的糖蛋白的表达或者更稳健的表达。
在一些实施方案中，指导糖蛋白表达的核酸稳定整合到宿主细胞。在一些实施方案中，指导糖蛋白表达的核酸被暂时导入宿主细胞。本领域技术人员将能够基于他或她的实验需要选择向细胞中稳定还是暂时导入核酸。
编码目的糖蛋白的基因可以任选连接到一个或多个调节性遗传控制元件。在一些实施方案中，遗传控制元件指导糖蛋白的组成型表达。在一些实施方案中，可以使用提供编码目的糖蛋白的基因的诱导型表达的遗传控制元件。诱导型遗传控制元件(例如，诱导型启动子)的使用允许调节细胞中糖蛋白的产生。用于真核细胞的潜在有用的诱导型遗传控制元件的非限制性实例包括激素调节的元件(例如见Mader,S.和White,J.H.,Proc.Natl.Acad.Sci.USA 90:5603-5607,1993),合成的配体调节的元件(见例如，Spencer,D.M.等人,Science 262:1019-1024,1993)和电离辐射调节的元件(例如见，Manome,Y.等人,Biochemistry 32:10607-10613,1993；Datta,R.等人,Proc.Natl.Acad.Sci.USA 89:10149-10153,1992)。根据本发明可以使用本领域已知的额外的细胞特异性或其他调节系统。
本领域技术人员根据本发明的教导将能够选择和任选地，合适地修饰导入基因的方法，所述基因引起细胞表达目的糖蛋白。
细胞
根据本发明可以利用易于进行细胞培养和表达糖蛋白的任何宿主细胞。在一些实施方案中，宿主细胞是哺乳动物。可以根据本发明使用的哺乳动物细胞的非限制性实例包括BALB/c小鼠骨髓瘤系(NSO/l,ECACCNo:85110503)；人成视网膜细胞(PER.C6(CruCell,Leiden,荷兰))；用SV40转化的猴肾CV1系(COS-7,ATCC CRL 1651)；人胚肾系(经亚克隆用于悬浮培养生长的293或293细胞,Graham等人,J.Gen Virol.,36:59,1977)；仓鼠婴肾细胞(BHK,ATCC CCL 10)；中国仓鼠卵巢细胞+/-DHFR(CHO,Urlaub和Chasin,Proc.Natl.Acad.Sci.USA,77:4216,1980)；小鼠支持细胞(TM4,Mather,Biol.Reprod.,23:243-251,1980)；猴肾细胞(CV1ATCC CCL 70)；非洲绿猴肾细胞(VERO-76,ATCC CRL-1587)；人宫颈癌细胞(HeLa,ATCC CCL 2)；犬肾细胞(MDCK,ATCCCCL 34)；水牛鼠肝细胞(BRL 3A,ATCC CRL 1442)；人肺细胞(W138,ATCC CCL 75)；人肝细胞(Hep G2,HB 8065)；小鼠乳腺肿瘤(MMT060562,ATCC CCL51)；TRI细胞(Mather等人,Annals N.Y.Acad.Sci.,383:44-68,1982)；MRC 5细胞；FS4细胞；和人肝癌系(Hep G2)。
此外，根据本发明可以利用表达糖蛋白的任何数目的商业和非商业途径可得到的杂交瘤细胞系。本领域技术人员将理解杂交瘤细胞系可以具有不同的营养需求和/或可能需要不同的培养条件以优化生长和糖蛋白表达，并且如需要将能够修改条件。
如上指出，在许多情况下，将选择或改造细胞以产生高水平糖蛋白。通常，通过人手操作细胞以产生高水平的糖蛋白，例如，通过导入编码目的糖蛋白的基因和/或通过导入调节该基因表达的遗传控制元件(无论内源的或导入的)。
本领域技术人员将理解在不同细胞类型中产生的糖蛋白可以含有不同的所得的糖基化模式。例如，Przybylo等人阐明钙黏着蛋白当在非恶性上皮输尿管细胞、v-raf转染的HCV29细胞和膀胱的移行细胞癌中表达时具有不同的糖基化模式(见Przybylo等人,Cancer Cell International,2(1):6,2002)。Lifely等人阐明人源化的IgG抗体当在CHO、Y0骨髓瘤和NS0骨髓瘤细胞系中表达时的糖基化模式和生物活性不同(见Lifely等人,Glycobiology.5(8):813-22,1995)。本领域普通技术人员将不用过度实验就能够选择合适的细胞系用于产生具体的糖蛋白。不管最终选择的细胞系如何，都可以根据本发明表达糖蛋白，得到更广泛的糖基化模式。
某些糖蛋白对细胞生长、细胞生存力或细胞的一些其他特征具有有害影响，其最终以某种方式限制了目的糖蛋白的产量。甚至在被改造为表达特定糖蛋白的一种具体类型的细胞群体中，在该细胞群体中也存在差异使得某些个体细胞将生长的更好，产生更多目的糖蛋白，产生具有更广泛的糖基化模式的糖蛋白，或者产生这样的糖蛋白，其糖基化模式更准确地反映了天然存在的糖蛋白的糖基化模式。在一些实施方案中，为培养细胞所选的具体条件下，由实践者根据经验选择细胞系的稳健生长。在一些实施方案中，基于细胞生长、最终细胞密度、细胞存活百分比、所表达的糖蛋白的效价、寡糖侧链的程度和组成或者实践者认为重要的这些或任何其他条件的任一组合选择经改造以表达具体糖蛋白的个体细胞用于大规模生产。
培养细胞
本发明可以使用适于表达糖蛋白的任何细胞培养方法。例如，细胞可以分批或补料分批培养生长，其中在糖蛋白的足够表达后终止培养，之后收获所表达的糖蛋白。备选地，细胞可以灌注培养生长，其中培养不终止并且将新的营养物和其他组分周期性或连续加入培养物中，在此期间周期性或连续地收获表达的糖蛋白。
细胞可以以实践者所选的任何方便的体积生长。例如，细胞可以在体积为几毫升到几升的小规模反应容器中生长。备选地，细胞可以在约至少1升到10、100、250、500、1000、2500、5000、8000、10,000、12,000升或以上，或者之间的任何体积的大规模商业生物反应器中生长。
将主要基于细胞培养物保持存活的温度范围、产生高水平糖蛋白的范围和/或所表达的糖蛋白含有希望的糖基化模式的范围选择细胞培养的温度。例如，在约37℃下，CHO细胞生长良好并且可以以商业上足够的水平产生具有希望的糖基化模式的糖蛋白。通常，多数哺乳动物细胞在约25℃到42℃的范围内生长良好并且可以以商业上足够的水平产生具有希望的糖基化模式的糖蛋白，然而，本公开教导的方法不限于这些温度。某些哺乳动物细胞在约35℃到40℃的范围内生长良好并且可以以商业上足够的水平产生具有希望的糖基化模式的糖蛋白。在一些实施方案中，在细胞培养过程中，细胞培养物在20、21、22、23、24、25、26、27、28、29、30、31、32、33、34、35、36、37、38、39、40、41、42、43、44、45℃的温度下生长一次或多次。本领域技术人员将能够选择生长细胞的合适温度，这取决于细胞的具体需要和实践者的具体生产要求。
此外，培养物可以在培养过程中进行一次或多次温度转变。当转变培养温度时，温度转变可以是相对逐渐的。例如，可以需要几小时或几天来完成温度改变。备选地，温度转变可以是相对突然的。温度可以在培养过程中稳定升高或降低。备选地，温度可以在培养过程中以离散量多次升高或降低。随后的温度或温度范围可以低于或高于最初或以前的温度或温度范围。本领域技术人员将理解在该实施方案中包括多个离散的温度转变。例如，温度可以转变一次(到较高或较低温度或温度范围)，细胞在该温度或温度范围保持一段时间，之后温度可以再次转变到新的温度或温度范围，其可以高于或低于以前的温度或温度范围。每次离散转变后培养的温度可以是恒定的或者可以保持在一定的温度范围内。
关于最初的温度或温度范围，温度转变后细胞培养的温度或温度范围通常主要基于细胞培养物保持存活的温度、产生高水平糖蛋白的范围和/或所表达的糖蛋白含有所希望的糖基化模式的范围选择。通常，多数哺乳动物细胞在约25℃到42℃的范围内保持存活并且以商业上足够的水平表达具有希望的糖基化模式的糖蛋白，尽管本公开教导的方法不限于这些温度。在一些实施方案中，哺乳动物细胞在约25℃到35℃的范围内保持存活并且以商业上足够的水平表达具有希望的糖基化模式的糖蛋白。本领域技术人员将能够选择生长细胞的合适的温度或温度范围，这取决于细胞的具体需要和实践者的具体生产要求。取决于实践者的需要和细胞自身的需要，细胞可以生长任一时间量。
在一些实施方案中，一旦所表达的糖蛋白达到足够高的效价和/或一旦所表达的糖蛋白显示出希望的糖基化模式，就终止分批或补料分批反应，如通过实践者的需要确定。额外或备选地，一旦细胞达到足够高的密度就终止分批或补料分批反应，如通过实践者的需要确定。例如，一旦细胞达到最大存活细胞密度的百分之1、5、10、15、20、25、30、35、40、45、50、55、60、65、70、75、80、85、90、95或99就终止培养。额外或备选地，可以在代谢废产物如乳酸或者铵过量积累之前终止分批和补料分批反应。
在一些情况中，有益的是在随后的生产期向细胞培养物补充被细胞耗尽或者代谢的营养物或者其他培养基组分。作为非限制性实例，有益的是为细胞培养物补充激素和/或其他生长因子、无机离子(如钠、氯化物、钙、镁和磷酸盐)、缓冲剂、维生素、核苷或核苷酸、微量元素(通常以极低终浓度存在的无机化合物)、氨基酸、脂类或者葡萄糖或其他能源。此类补充组分可以一次都加入细胞培养物中，或者它们可以在一系列的添加中提供给细胞培养物。
在一些实施方案中，根据美国临时专利申请序号60/605,097(引入本文作为参考)描述的任一种细胞培养方法生长细胞。在一些实施方案中，在美国临时专利申请序号11/213,308(引入本文作为参考)中所述的一种或多种条件下生长细胞。
本领域技术人员将能够定制具体细胞生长条件以便优化细胞培养的一些特征，包括但不限于生长速率、细胞活力、细胞培养物的最终细胞密度、有害的代谢副产物如乳酸和铵的终浓度、所表达的糖蛋白的最终效价、寡糖侧链的程度和组成或者实践者认为重要的这些条件或其他条件的任一组合。
所表达糖蛋白的分离
通常，典型的是希望分离和/或纯化根据本发明表达的糖蛋白。在一些实施方案中，表达的糖蛋白分泌到培养基中从而可以如通过离心或过滤除去细胞和其他固体，作为纯化方法中的第一步。
备选地，所表达的糖蛋白可以结合到宿主细胞的表面。例如，可以除去培养基并裂解表达糖蛋白的宿主细胞作为纯化过程中的第一步。可以通过本领域技术人员公知的任一种方法实现哺乳动物宿主细胞的裂解，所述方法包括通过玻璃珠物理破碎和暴露于高pH条件。
可以通过标准方法分离和纯化表达的糖蛋白，所述方法包括但不限于，层析(例如，离子交换、亲和、大小排阻和羟基磷灰石层析)、凝胶过滤、离心、或差别溶解度、乙醇沉淀和/或通过用于纯化蛋白质的任何其他可用的技术(见例如，Scopes,Protein Purification Principles and Practice 2ndEdition,Springer-Verlag,New York,1987；Higgins,S.J.和Hames,B.D.(eds.),Protein Expression:A Practical Approach,Oxford Univ Press,1999；and Deutscher,M.P.,Simon,M.I.,Abelson,J.N.(eds.),Guide to ProteinPurification:Methods in Enzymology(Methods in Enzymology Series,Vol.182),Academic Press,1997,各自引入本文作为参考)。尤其对于免疫亲和层析，可以分离糖蛋白：将它结合到亲和柱，该亲和柱包含针对该糖蛋白产生并固定到固定支持体的抗体。备选地，可以通过标准重组技术将亲和标记如流感外壳序列、聚组氨酸或者谷胱甘肽S-转移酶连接到糖蛋白以允许通过穿过合适的亲和柱容易地纯化。蛋白质抑制剂，如苯甲基磺酰氟(PMSF)、抑酶醛肽、胃蛋白酶抑制剂或抑酶肽可以在任一或所有阶段加入以便减小或者消除纯化过程中糖蛋白的降解。当细胞必须被裂解以便分离和纯化表达的糖蛋白时，蛋白酶抑制剂是尤其有利的。额外或备选地，糖苷酶抑制剂可以在任一或所有阶段加入以便减小或者消除共价连接的寡糖链的酶促修整。
根据本发明表达的糖蛋白可以比在常规细胞培养条件下培养产生的糖蛋白具有更广泛的或者改变的糖基化模式。从而，可以在纯化步骤利用的本发明的一个实际益处是根据本发明的一些方法培养的糖蛋白上额外的和/或改变的糖残基可以赋予其不同的生物化学性质，其与根据更常规的方法生长的糖蛋白相比可以被实践者用于更容易地纯化糖蛋白，或纯化至更高的程度。
本领域技术人员将理解确切的纯化技术将取决于待纯化的糖蛋白的特征、用于表达糖蛋白的细胞的特征，和/或用于生长细胞的培养基的组成而变。
免疫原性组合物
根据本公开的教导产生的糖蛋白也可以用于免疫原性组合物如疫苗中。在一些实施方案中，通过根据本发明的某些方法产生糖蛋白实现的改善的糖基化模式可以导致更有效的免疫原性组合物。例如，含有所产生的糖蛋白的免疫原性组合物可以引发更有效的免疫应答，其中受试者的免疫系统产生更多数目的抗该糖蛋白的抗体和/或产生显示出对免疫原性糖蛋白的更高特异性的抗体。额外或备选地，此类糖蛋白可以引发具有更少和/或更小严重副作用的免疫应答。在一些实施方案中，本发明的免疫原性组合物包含一种或多种糖蛋白。额外或备选地，发明性免疫原性组合物包括一种或多种生理学上可接受的载体。
通常，发明性免疫原性组合物的组分的合适的“有效量”或剂量的选择基于多种因素，包括但不限于，使用的免疫原性组合物中所选糖蛋白的身份、糖蛋白的糖基化模式，和受试者的身体状况，最特别包括所免疫的受试者的一般健康、年龄和/或体重。如本领域已知的，具体施用方法和途径和免疫原性组合物中额外组分的存在也可以影响DNA质粒组合物的剂量和量。有效剂量的此类选择和向上或向下调节也在本领域技术范围之内。诱导免疫应答，包括但不限于保护性应答或者在患者中产生外源效应而无显著的不利副作用所需的免疫原性组合物的量取决于这些因素而变。本领域技术人员可容易地确定合适剂量。
本发明的某些免疫原性组合物可以含有佐剂。佐剂是当与免疫原或抗原一起施用时增强免疫应答的物质。已经表明许多细胞因子或淋巴因子具有免疫调节活性，从而可以用作佐剂，包括但不限于，白介素1-α、1-β、2、4、5、6、7、8、10、12(见例如，美国专利号5,723,127，完整引入本文作为参考)、13、14、15、16、17和18(和其突变形式)，α,β和γ干扰素、粒细胞-巨噬细胞集落刺激因子(见例如，美国专利号5,078,996,完整引入本文作为参考)、巨噬细胞集落刺激因子、粒细胞集落刺激因子、GSF和肿瘤坏死因子α和β。可用于本发明的其他佐剂包括趋化因子，包括但不限于，MCP-1、MIP-1α、MIP-1β和RANTES。黏着分子，如选择蛋白，如L-选择蛋白、P-选择蛋白和E-选择蛋白也可以用作佐剂。其他有用的佐剂包括，但不限于，黏蛋白样分子，如CD34、GlyCAM-1和MadCAM-1，整联蛋白家族成员，如LFA-1、VLA-1、Mac-1和p150.95，免疫球蛋白超家族成员，如PECAM、ICAMs，例如，ICAM-1、ICAM-2和ICAM-3、CD2和LFA-3，共刺激分子，如CD40和CD40L，生长因子，包括血管生长因子、神经生长因子、成纤维细胞生长因子、表皮生长因子、B7.2、PDGF、BL-1、和血管内皮生长因子、受体分子，包括Fas、TNF受体、Flt、Apo-1、p55、WSL-1、DR3、TRAMP、Apo-3、AIR、LARD、NGRF、DR4、DR5、KILLER、TRAIL-R2、TRICK2和DR6。再一种佐剂分子包括胱天蛋白酶(ICE)。也见国际专利公开号WO98/17799和WO99/43839，将其各自完整引入本文作为参考。
也可以用作佐剂的是霍乱毒素(CT)和其突变体，包括公开的国际专利申请号WO 00/18434中描述的那些(其中氨基酸位置29的谷氨酸被另一氨基酸(不同于天冬氨酸)代替，优选被组氨酸代替)。类似的CT或突变体描述于公开的国际专利申请号WO 02/098368中(其中氨基酸位置16的异亮氨酸被另一氨基酸单独代替或者与氨基酸位置68的丝氨酸被另一氨基酸代替相组合；和/或其中氨基酸位置72位的缬氨酸被另一氨基酸代替)。其他CT毒素描述于公开的国际专利申请号WO 02/098369(其中氨基酸位置25的精氨酸被另一氨基酸代替；和/或在氨基酸位置49插入氨基酸；和/或两个氨基酸插入氨基酸位置35和36)。将这些参考文献各自完整引入本文作为参考。
在一些实施方案中，通过多种途径对人或对非人脊椎动物施用本发明的免疫原性组合物，所述途径包括，但不限于，鼻内、经口、阴道、直肠、肠胃外、皮内、经皮(见例如，国际专利公布号WO 98/20734,将其完整引入本文作为参考)，肌内、腹膜内、皮下、静脉内和动脉内途径。可以根据使用的免疫原性组合物的性质、患者的年龄、体重、性别和一般健康的评估和免疫原性组合物中存在的抗原，和/或本领域技术人员已知的其他因素选择合适的途径。
在一些实施方案中，多次施用免疫原性组合物。本领域技术人员基于本领域技术人员已知的相关因素选择免疫原性组合物施用的顺序和各施用之间的时间期限，所述因素包括但不限于，宿主的身体特征和对方法应用的准确应答。
药物制剂
在一些实施方案中，产生的糖蛋白将具有药理学活性并且将可用于制备药物。上述发明组合物可以施用于受试者或者可以首先通过任何可利用的途径配制用于递送，所述途径包括但不限于肠胃外(例如，静脉内)、皮内、皮下、经口、经鼻、支气管、眼、经皮(局部)、经粘膜、直肠和阴道途径。本发明的药物组合物通常包括从哺乳动物细胞系表达的纯化的糖蛋白、递送试剂(例如，如上述的阳离子聚合物、肽分子转运蛋白、表面活性剂等等)与可药用载体的组合。如本文所用，术语“可药用载体”包括与药物施用相容的溶剂、分散介质、包衣、抗细菌和抗真菌剂、等渗和吸收延迟剂，等等。补充性活性化合物也可以掺入组合物中。例如，根据本发明产生的糖蛋白可以额外缀合到用于全身药物疗法的其他药物，如毒素、低分子量细胞毒性药物、生物学应答修饰剂，和放射性核素(见例如，Kunz等人,Calicheamicin derivative-carrier conjugates,US20040082764 A1)。
备选或额外地，根据本发明产生的蛋白质或多肽可以与一种或多种额外的药学活性剂(同时或者顺序)组合施用。这些药学活性剂的示例性列表可以见医师案头参考(Physicians’Desk Reference)第55版(MedicalEconomics Co.,Inc.,Montvale,NJ,2001出版，引入本文作为参考)。对于许多这些列出的活性剂，药物有效剂量和方案是本领域已知的；许多在医师案头参考中给出。
可以有利地配制药物组合物与其预期的施用途径相容。用于肠胃外、皮内或皮下应用的溶液剂或混悬剂可以包括下面的组分：无菌稀释剂，如注射用水、盐水溶液、不挥发油、聚乙二醇、甘油、丙二醇或者其他合成的溶剂；抗细菌剂，如苯甲醇或者对羟基苯甲酸甲酯；抗氧化剂，如抗坏血酸或者亚硫酸氢钠；螯合剂，如乙二胺四乙酸；缓冲剂，如乙酸盐、柠檬酸盐或磷酸盐和用于调节张力的试剂，如氯化钠或葡萄糖。可以用酸或碱，如盐酸或者氢氧化钠调节pH。可以将肠胃外制剂封装在安瓿、一次性注射器或者由玻璃或者塑料制造的多剂量瓶中。
适于注射使用的药物组合物通常包括无菌水溶液(其中水可溶的)或者分散体和用于临时制备无菌注射液或分散体的无菌粉剂。对于静脉内施用，合适的载体包括生理盐水、抑菌水、Cremophor ELTM(BASF,Parsippany,NJ)或磷酸缓冲盐水(PBS)。在所有情况下，组合物将是无菌的并且应该是流动的，达到容易注射的程度。本发明的某些药物制剂在生产和保持条件下是稳定的并且必须保存以抗微生物如细菌和真菌的污染作用。通常，相关载体可以是溶剂或分散介质，含有例如，水、乙醇、多元醇(例如，甘油、丙二醇和液体聚乙二醇等等)，和其合适的混合物。例如，通过使用包衣如卵磷脂，对于分散体的情况通过保持所需的颗粒大小和通过使用表面活性剂可以保持适当的流动性。通过多种抗细菌和抗真菌剂可以实现防止微生物的作用，所述抗细菌和抗真菌剂为例如对羟基苯甲酸酯、氯代丁醇、苯酚、抗坏血酸、硫柳汞等等。在许多情况下，将有利地在组合物中包括等渗剂，如糖、多元醇，如甘露醇、山梨醇或者氯化钠。通过在组合物中包括延迟吸收的物质如单硬脂酸铝和明胶可以延长可注射组合物的吸收。
通过在合适的溶剂中以所需量掺入纯化的糖蛋白与(如果需要)上面列举的成分之一或者组合，接着通过过滤除菌，可以制备无菌注射溶液。通常，通过在含有基本分散介质的无菌载体中掺入从哺乳动物细胞系表达的纯化的糖蛋白和来自上面列举的那些的所需的其他成分可以制备分散体。对于用于制备无菌注射溶液的无菌粉剂的情况，制备方法包括，例如，真空干燥和冷冻干燥，其产生活性成分的粉末加上来自其以前无菌过滤溶液的任何额外的所希望成分。
经口组合物一般包括惰性稀释剂或者可食用的载体。对于经口治疗施用的目的，所纯化的糖蛋白可以掺入赋形剂并以片剂、含片、或胶囊剂，如明胶胶囊剂的形式使用。使用液体载体也可以制备用作漱口水的经口组合物。可以包括药学上相容的黏合剂和/或佐剂物质作为组合物的部分。片剂、丸剂、胶囊剂、含片等等可以含有任一种下面的成分，或者类似性质的化合物：黏合剂，如微晶纤维素、黄蓍树胶或明胶；赋形剂，如淀粉或乳糖，崩解剂，如藻酸、Primogel或者玉米淀粉；润滑剂，如硬脂酸镁或Sterotes；助流剂，如二氧化硅胶体；增甜剂，如蔗糖或糖精；或者调味剂，如薄荷油、水杨酸甲酯或者橙子调味剂。用于经口递送的制剂可以有利地掺入试剂以提高在胃肠道内的稳定性和/或增强吸收。
对于通过吸入施用，包含从哺乳动物细胞系表达的纯化的糖蛋白和递送剂的本发明组合物有利地以气雾剂喷雾的形式从加压的容器或分配器或喷雾器递送，所述容器或分配器含有合适的推进剂，例如，气体，如二氧化碳。本发明尤其设想使用经鼻喷雾、吸入器递送组合物或者直接递送到上和/或下呼吸道。已经表明抗流感病毒的DNA疫苗的鼻内施用诱导CD8T细胞应答，表明当通过该途径递送时，呼吸道中的至少一些细胞摄入DNA，并且本发明的递送剂将增强细胞摄入。根据一些实施方案，将包含从哺乳动物细胞系表达的纯化的糖蛋白和递送剂的组合物配制为用于气雾剂施用的大孔颗粒。
也可以通过经粘膜或者经皮方式进行全身施用。对于经粘膜或经皮施用，适于待穿透的屏障的穿透剂可以用于制剂中。此类穿透剂是本领域公知的，并且对于经粘膜施用，包括例如，去污剂、胆汁盐和梭链孢酸衍生物。通过使用经鼻喷雾或者栓剂也可以完成经粘膜施用。对于经皮施用，将纯化的糖蛋白和递送剂配制成如本领域公知的软膏剂、油膏剂、凝胶剂或者霜剂。
组合物也可以以栓剂(例如使用常规栓剂基质，如可可脂和其他甘油酯)或者保留灌肠剂的形式制备用于直肠递送。
在一些实施方案中，本发明的药物组合物含有任选的赋形剂，如局部麻醉药、肽、脂类，包括阳离子脂类、脂质体或者脂类颗粒，聚阳离子，如聚赖氨酸、分枝的三维聚阳离子，如树状聚体、糖类、阳离子两亲化合物、去污剂、苄基铵表面活性剂，或者促进多核苷酸转移到细胞的另一化合物。此类促进试剂包括局部麻醉药布比卡因或丁卡因(见例如，美国专利号5,593,972；5,817,637；5,380,876；5,981,505和6,383,512和国际专利公开号WO98/17799,将其各种完整引入本文作为参考)。
在一些实施方案中，用保护糖蛋白免于从身体快速清除的载体制备组合物，如控释制剂，包括植入物和微囊化的递送系统。可以使用生物可降解的生物相容性聚合物，如乙烯乙酸乙烯酯、聚酐、聚乙醇酸、胶原、聚原酸酯，和聚乳酸。制备此类制剂的方法将是本领域技术人员显而易见的。也可以从Alza Corporation和Nova Pharmaceuticals,Inc.通过商业途径得到材料。脂质体悬浮液(包括用抗病毒抗原的单克隆单体靶向受感染细胞的脂质体)也可以用作可药用载体。可以根据本领域技术人员已知的方法(如美国专利号4,522,811中所述，完整引入本文作为参考)制备此类悬浮液。
可以有利地以单位剂型配制经口或肠胃外组合物以容易施用和剂型的均一性。如本文所用的单位剂型指适合作为待治疗受试者的单一剂量的物理上分散的单位，每一单位含有预定量的活性糖蛋白，所述量经计算与所需的药物载体结合产生希望的治疗效果。
根据本发明表达的糖蛋白可以以所需的不同间隔和在不同时间期限内施用，如每周一次持续约1到10周、2到8周、约3到7周、约4、5或6周等等。技术人员将理解某些因素可以影响有效治疗受试者所需的剂量和时限，包括但不限于受试者的疾病或病症的严重性、以前的治疗、一般健康和/或年龄，和存在的其他疾病。通常，用如本文所述的糖蛋白对受试者的治疗可以包括单一治疗，或者在许多情况下，可以包括一系列治疗。将理解合适的剂量可以取决于糖蛋白的效力并且可以任选为具体接受者定制，例如，通过施用增加的剂量直到实现预先选择的所希望的应答。还将理解任一具体动物受试者的特定剂量水平可以取决于多种因素，包括使用的具体糖蛋白的活性、受试者的年龄、体重、一般健康、性别和饮食、施用时间、施用途径、排泄速率、任何药物组合，和/或被调节的表达或活性的程度。
本发明包括使用本发明组合物治疗非人动物。因此，可以根据兽医药理学和医学的已知的原理选择施用剂量和方法。教导可以见例如Adams,R.(ed.),Veterinary Pharmacology and Therapeutics,第八版,Iowa StateUniversity Press；ISBN:0813817439；2001。
本发明药物组合物可以与施用说明书一起包括在容器、包装或者分配器中。
将理解前面的描述仅仅是代表性的并且不意在进行限制。用于实现本发明和额外的应用的备选方法和材料是本领域技术人员显而易见的，并且意在包括在所附权利要求中。
实施例
实施例1:培养基制剂
本发明包括如下发现：通过在含有一种或多种本发明浓度的锰的培养基中培养细胞产生的糖蛋白比所述细胞在常规培养基中生长产生的糖蛋白具有更广泛的糖基化模式。可以将锰加入能够支持细胞生长的任何培养基中。可以加入任一本发明浓度内的锰的示例性培养基在表1中列出，然而本发明不限于利用这些培养基。如本领域技术人员将理解的，其他培养基可以用于生长细胞和/或可以对表1中所列的示例性培养基的组成做出一些改变。
表1.示例性培养基
在一些实施方案中，在最初的培养后为细胞补充一次或多次补料培养基。示例性补料培养基在表2中列出，然而，本发明不限于利用这些补料培养基。如本领域普通技术人员将理解的，其他补料培养基可以用于生长细胞和/或可以对表2中列出的示例性补料培养基的组成做出一些改变。例如，此类补料培养基的一种或多种组分的浓度可以升高或降低以实现此类组分的希望的浓度。在一些实施方案中，每种补料培养基组分的浓度升高或降低相同的因数。例如，每种补料培养基组分的浓度可以升高或降低1x、2x、3x、4x、5x、6x、7x、8x、9x、10x、11x、12x、13x、14x、15x、16x、17x、18x、19x、20x、25x、30x、35x、40x、45x、50x或更高。
表2.示例性补料培养基
实施例2:rFIX肽作图的小规模研究
引言:在重组人凝血因子IX(“rFIX”)原料药物(“BDS”)的生产期间，在肽图内K4肽的相对峰面积比(“RPAR”)中观察到批与批的差异。通过用来自Achromobacter lyticus的赖氨酰内肽酶(“AchroK”,Wako目录号129-02541)消化制备样品，并随后通过反相HPLC进行分辨。在某些批中K4肽的RPAR落入参考物质的对照样品的82％的下限以下并且达到对照样品的78％的最小值。在K4’峰中发现物质的平衡。两个峰之间的差异完全是由于Ser-61处糖基化的程度。K4种类具有连接到丝氨酸的Sia-α2,3-Gal-β1,4-GlcNAc-β1,3-Fuc-α1-O四糖，而成比例增加的K4’种类仅仅具有岩藻糖。
在当发生肽图差异的期间内进行完全规模细胞培养实验。细胞生长在分别补充FeSO4,CuSO4和氯化胆碱至2X,7X和2X的细胞培养基中。实验批次的小规模纯化产生的BDS表明提高的K4RPAR，但是以相同方式纯化的对照物质则否。BDS批通过了肽图要求(>82％的对照样品)，尽管它们没有达到参考物质中看到的水平。这表明在RPAR图中观察到的差异是细胞培养过程的结果并且可能与营养缺乏相关。
过程中的样品分析:通过微量过滤(“MF”)和超滤/渗滤(“UF/DF”)步骤从细胞培养基除去细胞，从各自的生物反应器得到可用于分析的相当纯的物质。
为了研究K4种类在从细胞分泌后是否被降解回K4’(仅仅岩藻糖)，对来自UF/DF存留物的过程中样品进行改进的分析。将存留物的大样品分成三个相等的等分试样。一个立即在小规模捕获柱上纯化；这用作阴性对照。另外两个各自在37℃过夜温育后以相似的方式纯化。向一个过夜等分试样加入唾液酸酶以从K4种类除去末端唾液酸以防唾液酸阻断一些其他糖苷酶的活性。小规模纯化后，如上分析所有三个样品的K4种类。图1表明除了唾液酸酶催化的降解外任一样品中没有降解。这强烈表明肽图问题是合成代谢的问题，意味着在Ser-61处“丢失”的糖残基从来没有加入新生链。尽管非常不可能，但是仍然保持可能的是，负责除去这些糖残基的糖苷活性通过MF和UF/DF步骤失活或者被去除。结果也阐明了利用小规模纯化步骤分析来自Q Sepharose步骤上游的样品。
小规模建模:生长在摇瓶中的小规模rFIX培养物用作模型来评估多种培养基和添加剂对K4种类的影响。在每种情况下，来自摇瓶的条件培养基在小规模捕获柱上直接(无UF/DF)使用基于体积的峰收集进行纯化，并测定样品中的K4分布。
使用与完整规模实验相同的添加剂阐明小规模模型的效用。也分析了锰添加，因为文献检索发现Mn++是果蝇酶的类似的糖基化活性所需的(见Moloney等人,J.Biol.Chem.275(13):9604-9611,2000；Bruckner等人,Nature 406:411-415,2000)。该比较在摇瓶中四个世代中进行，并且在图2中显示了结果。显示了每个样品的一式两份注射。“P#”指示每个条件的传代次数。对于P1-2，Mn的浓度为1nM；对于P3-4，为10nM。对照和补充的培养基K4种类分布之间的差异与在生产生物反应器中看到的差异相当。单次传代后表明了差异并且多次传代没有揭示任何倾向。
因为添加剂包括三种组分(FeSO4,CuSO4和氯化胆碱)，所以接下来的实验处理这些组分的哪一个负责改进的K4种类分布。向三个rFIX摇瓶培养物中加入三种组分。逐步加入这些组分以揭示任何协同作用。其他培养物包括阳性(所有三种组分)和阴性(无添加剂)对照。
图3表明FeSO4是负责帮助改善K4种类分布的添加剂。显示了每个样品的一式两份注射。在每个实验浓度进行添加。似乎在缺少FeSO4时，CuSO4和氯化胆碱的添加甚至使得分布更差。注意到由于未知的原因，K4’脱唾液酸形式在试样和测定参照中以更高的丰度显现。该趋势在图3中是显而易见的并且在随后的实验中持续存在。
培养基粉剂的铁含量的电感偶合等离子体光谱(“ICP”)分析表明在该粉剂中存在合适量的铁。这导致如下假说：来自所加入的FeSO4的益处实际上由该原料的微量污染物引起。通过ICP分析分析了最初培养基条件中使用的FeSO4批次，并且几种微量杂质出现的水平高于检测极限。通过去除已知的抑制剂和rFIX细胞培养基的组分，将列表限制为下面的九种潜在有益的元素：Sb、Bi、B、Co、Ge、Mn、Mo、Ni和V。
接着，进行小规模建模实验来研究可能补充最初的培养基添加剂的一些其他可能的添加剂。测试了额外的CuSO4、ZnSO4和MnSO4(至10nM)。包括了ZnSO4，因为锌可以竞争性抑制其他二价阳离子的吸收。由于未知的原因，对照和实验条件给出了非常相似的K4种类分布，其更像以前为对照条件观察到的(见图4，显示了每个样品的一式两份注射)。然而，向该实验条件加入MnSO4明显改善了K4种类分布。似乎所加入的ZnSO4恶化了K4种类分布，但是该差异的显著性不确定。
在上面提到在图3中观察到脱唾液酸化的K4’峰水平的升高。该现象在所述的小规模研究过程中持续并且倾向于增大。该趋势没有改变所给出的结果的解释。
结论:过程中和小规模捕获柱洗脱液的广泛测试已经提供了强烈证据表明培养基粉剂中的差异引起K4RPAR的偏移，其又导致多种肽图差异。因为向细胞培养基中加入某些组分部分逆转了该偏移，所以培养基粉剂中的差异可能是一种或多种组分偏向低水平。因为所发现的最有效的添加剂是FeSO4,并且ICP分析表明培养基粉剂含有合适量的Fe，所以假设FeSO4中的微量杂质是Ser-61处的正确糖基化所必须的。基于FeSO4的ICP分析，该微量杂质不是培养基粉剂的特定组分，而是以前一直存在于培养基中的偶然营养物。
实施例3:培养基添加剂对rFIX肽图影响的小规模研究
引言:实施例2阐明在多种rFIX批中观察到Ser-61处糖基化程度的批与批的差异，其被看作K4肽群体分布中的偏移。所有rFIX批具有在该位点以全长四糖(Sia-α2,3-Gal-β1,4-GlcNAc-β1,3-Fuc-α1)占优势的链长分布，但是一些批具有不同寻常的高比例的仅岩藻糖形式。
实施例2还表明在生物反应器中发生的K4分布的偏移与培养基粉剂的批改变紧密联系。实施例2的结果导致对如下假设的强烈支持：糖形分布的改变是合成代谢功能，而不是分解代谢功能。此外，这些实验表明补充的FeSO4可以部分逆转该偏移，但是ICP分析表明在培养基粉剂批次之间的FeSO4浓度没有显著差异。从而，假设对于不同的培养基粉剂以不同水平存在的FeSO4的另一种未鉴定的微量组分造成该偏移。
添加剂影响：如实施例2中讨论，ICP分析表明用于实验培养条件的FeSO4批中存在可测量量的九种微量元素。这些微量元素与公开的培养基制剂中的那些元素的比较消除了加入Sb或Bi的需要。基于培养基制剂和FeSO4的ICP分析，产生了加入rFIX培养物的五种化合物的混合物(给出了最终培养基浓度)：1nM(NH4)6Mo7O24,10nM CoCl2,5.5nM NH4VO3,1.5nM NiSO4,和20nM H3BO3。MnSO4单独加入，因为以前的文献综述指出锰可能对于糖基转移酶活性是重要的(见Breton和Imberty,Curr.Opinion in Structural Biol.9:563-571,1999；Bruckner等人,Nature 406:411-415,2000)。在相同的实验中，测试了额外的FeSO4(2X或4X)以确定它是否可以进一步增加四糖的相对量。在每种情况下，除了实施例2中所述的补充物外，还使用所述添加剂。
该添加实验的结果在图5中显示。测定种类分布并且所报告的值为四个K4峰的每一个与它们的总和的比例。该图也显示了参考材料、对照(无添加剂)和补充的(如实施例2中)培养物。显示了每个样品的一式两份注射。在每组列中，最左边的列对应于在Ser-61处具有四糖的分子级分，最右边的列是具有仅仅岩藻糖的级分。所观察到的在阳性和阴性对照培养物(分别补充和不补充)之间的差异比以前看到的更小。无论如何，图5清楚地表明微量元素混合物对于K4种类分布没有影响，而加入FeSO4和MnSO4改善了K4种类分布。当加入到补充物中时，15nM MnSO4与额外的12μMFeSO4对K4种类分布具有大约相同的效果。
对锰的强烈应答导致设计了实验来发现rFIX细胞培养基中锰的最优浓度。图6显示该实验给出了与图5中显示的结果相一致的结果，因为加入锰的所有培养物都比补充的或者对照培养物具有更少的仅岩藻糖K4。实际上，使用40nM或以上锰的培养物具有与测定参考物质相同量的仅岩藻糖K4。然而，100或500nM时比40nM锰时似乎出现更多的三糖。从而，确定了对于Ser-61处更广泛的FIX糖基化，40nM是出乎意料的有益的锰浓度。
小规模模型的效用：这些小规模实验和实施例2中给出的小规模实验的一个不寻常的特征是来自实验与实验之间的不同水平的三糖或者脱唾液酸化的种类。因为该种类与测定参考物相似地改变，所以认为它是单点消化方法的假象。因为使用相同的原材料同时消化给定实验的所有样品，所以认为该差异不影响该实施例或者实施例2中给出的分析。
结论：这些实验表明向rFIX细胞培养基中加入40nM MnSO4改善了K4种类分布。
实施例4:抗-ABeta培养基样品的N-连接的寡糖分析
引言：在四种培养基条件下研究了表达人源化的抗ABeta肽IgG1单克隆抗体的CHO细胞(“抗-ABeta细胞”)的N-连接的寡糖指纹。样品鉴定和相关信息在表3中列出。
表3.从多种培养条件收获的抗-ABeta样品
步骤:培养抗ABeta培养物1并用补料培养基周期性喂饲。在抗ABeta培养物2中，在开始时加入微量元素E。表4列出了微量元素E的组成。在与培养物2相同的条件下培养抗ABeta培养物3，只是最初的谷氨酰胺水平为4mM。在与培养物3相同的条件下培养抗ABeta培养物4，只是不加入微量元素并且补料培养基补充谷氨酸至2g/L。
通过PNGase F消化，接着通过高pH阴离子交换层析与脉冲电化学检测(HPAEC-PED)分析测定每个样品的糖形分布。简言之，使用AmiconUltra 30,000MWCO蛋白质浓缩器将样品缓冲液交换到在pH 7.3缓冲的50mM甲酸铵中。回收后，每个样品用5μL PNGase F(无甘油)消化并在37℃过夜温育。然后通过速度真空离心干燥样品并用纯化水重构。然后将样品转移到自动采样瓶中用于HPAEC-PED分析。HPAEC-PED系统装配Dionex CarboPac PA100保卫和分析柱(2x 250mm),和ED-40检测器。使用乙酸钠的线性梯度，其包括两种洗脱剂：由100mM NaOH组成的洗脱剂A和由100mM NaOH/500mM乙酸钠组成的洗脱剂B。
表4.微量元素E的组成
微量元素E μg/L nM
(NH4)6Mo7O24·4H2O 123.60 100.00
AlCl3·6H2O 0.48 2.00
H3BO3 6.18 100.00
CrCl3 7.92 50.00
CuSO4·5H2O 49.94 200.00
GeO2 0.21 2.00
KBr 0.24 2.00
KI 16.60 100.00
LiCl 0.08 2.00
MnSO4·H2O 16.90 100.00
Na2SiO3·9H2O 142.03 500.00
NaF 0.08 2.00
NH4VO3 1.17 10.00
NiSO4·6H2O 2.63 10.00
RbCl 0.24 2.00
SnCl2·2H2O 0.45 2.00
亚硒酸钠 34.58 200.00
数据分析:与抗ABeta抗体结合的三种类型的复杂的N-连接的双触角聚糖在它们的外部N-连接的双触角臂上含有0个(“G0”)、一个(“G1”)或两个(G2”)半乳糖残基。所有样品都显示存在代表G0、G1和G2糖形的三个峰。图7显示了每个样品的G0、G1和G2HPAEC-PED峰的总峰面积百分数的图形比较。在所有提交的样品图中观察到存在额外的小峰。所观察到的峰代表低水平的单和二唾液酸化的糖形。
讨论：这些实验测试了在多种实验条件下补充补料培养基的抗ABeta培养物的G0:G1:G2峰的相对分布。相对于缺少微量元素E的培养条件，其中加入微量元素E的培养物表明G0水平的下降，和G1和G2水平的对应升高(图7)。含有低谷氨酰胺的培养条件具有类似的效果，并且效果是累加的。其中加入微量元素E的低谷氨酰胺(4mM)培养物表明N-连接的糖形分布的显著偏移，具有几乎相等比例的G0和G1，G2占总峰面积的约10％(图7)。加入微量元素E的培养物含有浓度为156nM的锰。然而，应该注意到培养物也含有升高水平的其他金属。从而，可能的是，除了锰之外，其他培养条件也促进所观察到的改善的糖基化模式。
结论:在抗ABeta样品中观察到的糖基化分布的差异最可能是由于培养条件的各自改变。我们的数据强烈提示低谷氨酰胺(4mM)的存在和/或含有100mM MnSO4的微量元素E的加入导致抗ABeta中多种N-连接的糖形的百分比改变。这些效果似乎是独立的和累加的。
实施例5:抗ABeta锰研究样品的N-连接的寡糖分析
引言:实施例4表明通过向培养条件加入微量元素E和通过保持低谷氨酰胺水平可以得到抗ABeta样品的糖基化分布的改善。这里我们测试了在培养条件中仅仅加入锰是否可以实现糖基化分布的类似改善。
步骤:抗ABeta培养物生长于含有或缺少40mM锰的培养基中。用40％总体积的补料培养基喂饲培养物。收获样品并根据实施例4中描述的方法分析。
数据分析：按照峰存在和每个峰的总峰面积百分比比较所分析的样品。图8显示了每个样品的G0、G1和G2HPAEC-PED峰的总峰面积百分比的图形比较。
讨论：与抗ABeta抗体结合的三种类型的复杂N-连接的双触角聚糖是G0、G1和G2结构，其在它们的外部N-连接的双触角臂上分别含有0、1或2个半乳糖残基。从在缺少或含有40mM锰的培养基中生长的细胞收获的样品显示存在代表G0、G1和G2糖形的所有三个峰。G0峰从对照样品中68％的总峰面积降低到从含有加入锰的培养基收获的样品中的53％(见图8)。在从含有锰的培养基收获的样品中也看到总峰面积的G1和G2百分比的增加。总峰面积的G1百分比在对照样品中为26％，在加入锰的样品中为39％。总峰面积的G2百分比在对照样品中为6％，在加入锰的样品中为9％(图8)。
结论：这些数据表明向培养基中仅仅加入锰导致更广泛的糖基化模式，如通过这些样品中G0:G1:G2的百分比分布的偏移所阐明。

Claims (30)

1.在细胞培养物中产生糖蛋白的方法，其包括：
将含有编码目的糖蛋白的基因的哺乳动物细胞在包含约10nM到600nM锰的细胞培养基中培养，培养的条件和时间足够允许表达所述糖蛋白，其中所表达的糖蛋白的糖基化模式比在缺少锰的其他方面相同的培养基中在其他方面相同条件下观察到的糖基化模式更广泛。
2.权利要求1的方法，其包括步骤：
在包含约10nM到600nM锰的细胞培养基中培养含有编码目的糖蛋白的基因的哺乳动物细胞；
在第一个温度范围保持培养物第一个时间期限，所述第一个时间期限足够允许细胞再生至如果培养物保持在第一个温度范围时最大可能的活细胞密度的约20％-80％范围内的活细胞密度；
将培养物转换到第二个温度范围，其中第二个温度范围的至少一个温度低于第一个温度范围的最低温度；
在足够允许所述糖蛋白表达的条件和时间内保持培养物第二个时间期限，其中所表达的糖蛋白的糖基化模式比在缺少锰的其他方面相同的培养基中在其他方面相同条件下观察到的糖基化模式更广泛。
3.权利要求2的方法，其中第一个温度范围包含约30到42℃的温度范围。
4.权利要求3的方法，其中第一个温度范围包含约37℃的温度。
5.根据权利要求2到4任一项的方法，其中所述第二个温度范围包含约25到41℃的温度范围。
6.权利要求5的方法，其中所述第二个温度范围包含约31℃的温度。
7.根据权利要求2到6任一项的方法，其还包含第一个转换步骤后的第二个转换步骤，该第二个转换步骤包括将培养物转换到第三个温度或温度范围，其中第三个温度范围的至少一个温度低于第二个温度范围的最低温度。
8.权利要求7的方法，其中第三个温度范围包含约25到40℃的温度范围。
9.根据权利要求1到8任一项的方法，其中所述细胞培养基包含约20到200nM锰。
10.权利要求9的方法，其中所述细胞培养基包含约40nM锰。
11.根据权利要求1到10任一项的方法，其中细胞培养基包含最初浓度小于或等于约8mM的谷氨酰胺。
12.权利要求11的方法，其中所述细胞培养基的最初谷氨酰胺浓度小于或等于约4mM。
13.根据权利要求1到12任一项的方法，其中所述细胞培养物的体积为至少约500L。
14.根据权利要求1到13任一项的方法，其中最初的细胞培养开始后进一步为细胞培养物提供补料培养基。
15.根据权利要求1到14任一项的方法，其中进一步为细胞培养物提供补充组分。
16.权利要求15的方法，其中所述补充组分选自激素和/或其他生长因子、无机离子、缓冲剂、维生素、核苷或核苷酸、微量元素、氨基酸、脂类、葡萄糖或其他能源，和其组合。
17.权利要求16的方法，其中为所述细胞培养物补充约2克/升的葡萄糖。
18.根据权利要求1到17任一项的方法，其中所述细胞培养基是确定成分培养基。
19.根据权利要求1到18任一项的方法，其中目的糖蛋白包含凝血因子IX。
20.权利要求19的方法，其中凝血因子IX是重组人凝血因子IX。
21.根据权利要求1到18任一项的方法，其中目的糖蛋白包含抗ABeta抗体。
22.权利要求21的方法，其中抗ABeta抗体是单克隆抗体。
23.权利要求22的方法，其中抗ABeta抗体是人源化的抗ABeta肽IgG1单克隆抗体。
24.包含约10到600nM锰的细胞培养基。
25.权利要求24的细胞培养基，其包含约20到200nM锰。
26.权利要求25的细胞培养基，其包含约40nM锰。
27.根据权利要求24到26任一项的细胞培养基，其中细胞培养基包含最初浓度小于或等于约8mM的谷氨酰胺。
28.权利要求27的细胞培养基，其中最初的谷氨酰胺浓度小于或等于约4mM。
29.根据权利要求24到28任一项的细胞培养基，其中该培养基是确定成分培养基。
30.通过权利要求1到23任一项的方法得到的糖蛋白。
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