JP2020188737A - 抗体依存性細胞傷害活性が向上した抗体の製造方法 - Google Patents
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Abstract
Description
胞が発現した抗体を回収することで、前記抗体を製造する際、前記哺乳動物細胞の培養条
件を変化させると、前記抗体のFc領域に付加するN型糖鎖の構造が変化することが知ら
れている(特許文献1)。しかしながら、実際に抗体のFc領域へ付加する糖鎖は不均一
であり、前記糖鎖の構造とADCC活性との関係を完全に結び付けることは難しい。従っ
て、糖鎖構造を制御してADCC活性の高い抗体を製造する条件、特に前記抗体を発現可
能な哺乳動物細胞を培養する条件の構築は困難であった。
前記培養工程を0.2mMから4mMのグルタミンを含有する培地で行なうことで、抗体依存性細胞傷害活性が向上した抗体を製造する方法。
本発明の製造方法で使用する哺乳動物細胞は、製造対象抗体を発現可能な細胞であれば特に制限はない。一例を示すと、CHO細胞(CHO−K1、CHO−S、CHO−DG44およびCHO−DXB11)、マウス骨髄腫由来細胞(SP2/0、NS0)、ヒト胎児腎臓由来細胞(HEK細胞)、ヒト白血病細胞由来細胞(HL−60細胞)、ヒト子宮頸癌由来細胞(HeLa細胞)およびアフリカミドリザルの腎細胞由来細胞(COS細胞)があげられる。中でも組換え抗体製造に汎用されるCHO細胞の使用が好ましい。
前述した濃度のL‐グルタミンを添加した培地を入れたフラスコに、抗体を発現可能な哺乳動物細胞を接種後、当該フラスコを振盪させて培養してもよく、
バイオリアクターで、前述した濃度範囲になるようL‐グルタミン濃度を制御しながら、回分培養、半回分培養(流加培養ともいう)、潅流培養またはそれらの組合せにより培養してもよい。
哺乳動物細胞がCHO細胞の場合、5%から8%のCO2存在下、温度30℃から37℃、pH6.8から7.4で培養すると好ましい。
(A)ヒトFcγRIIIa(UniProt No.P08637)のアミノ酸配列のうち17番目のグリシンから192番目のグルタミンまでのアミノ酸残基を少なくとも含む、Fc結合性タンパク質、または
(B)ヒトFcγRIIIa(UniProt No.P08637)のアミノ酸配列のうち17番目のグリシンから192番目のグルタミンまでのアミノ酸残基を少なくとも含み、ただし当該17番目から192番目までのアミノ酸残基において、1以上のアミノ酸残基が欠失、他のアミノ酸残基に置換、または付加されたポリペプチドを含む、Fc結合性タンパク質、のことを意味する。また前記(B)の好ましい態様として、
特開2015−086216号公報で開示のFc結合性タンパク質、
特開2016−169197号公報で開示のFc結合性タンパク質、
特開2017−118871号公報で開示のFc結合性タンパク質、
WO2018/150973号で開示のFc結合性タンパク質、
があげられる。
(1)以下の方法で抗IL−6R抗体を哺乳動物細胞で発現可能なベクターを構築した。
(1−1)配列番号1に記載のジヒドロ葉酸レダクターゼ(dihydrofolate reductase、dhfr)およびSV40のPolyAをコードする遺伝子に制限酵素SacII認識配列(CCGCGG)を5’末端および3’末端の両方に付加した遺伝子を全合成し(Integrated DNA Technologies社に委託)プラスミドにクローニングした。
(1−2)(1−1)で作製したプラスミドで大腸菌JM109株を形質転換した。得られた形質転換体を培養し、プラスミドを抽出したのち、制限酵素SacIIで消化することで、dhfr−SV40PolyAをコードする遺伝子を調製しdhfr−P1と命名した。
(1−3)pIRESベクター(Clontech社製)を鋳型として、配列番号2(5’−TCC[CCGCGG]GCGGGACTCTGGGGTTCGAAATGACCG−3’)および配列番号3(5’−TCC[CCGCGG]GGTGGCTCTAGCCTTAAGTTCGAGACTG−3’)に記載の配列からなるオリゴヌクレオチドプライマー(配列番号2および3中の角かっこは制限酵素SacII認識配列を示している)を用いてPCRを行なった。具体的には、表1に示す組成の反応液を調製し、当該反応液を98℃で30秒間熱処理後、98℃で10秒間の第1ステップ、55℃で5秒間の第2ステップ、72℃で5分間の第3ステップを1サイクルとする反応を25サイクル繰り返すことで実施した。このPCRにより、pIRESベクターのうちネオマイシン耐性遺伝子を除いた領域を増幅した。
(1)実施例1で作製したpFU−6RH−dhfrおよびpFU−6RL−dhfrを、CHO細胞(DG44株)にNeon Transfection System(Thermo Fisher Scientific社製)を用いて遺伝子導入した。その後、50μg/mLのカナマイシン、40mL/LのGlutaMAX(Thermo Fisher Scientific社製)を含んだCD OptiCHO Medium(Thermo Fisher Scientific社製)で形質転換細胞を培養し抗IL−6R抗体発現細胞を得た。その後、培地に50ng/mLのメトトレキサート(MTX)を添加することで遺伝子増幅を行なった。
(2−1)抗ヒトFab抗体(Bethyl社製)を、96穴マイクロプレートのウェルに1μg/wellで固定化した(4℃で一晩)。固定化終了後、2%(w/v)のSKIM MILK(Becton Dickinson社製)および150mM塩化ナトリウムを含んだ20mMのトリス塩酸緩衝液(pH7.4)によりブロッキングした。
(2−2)洗浄緩衝液(0.05%[w/v]のTween 20(商品名)と150mMのNaClとを含む20mM Tris−HCl緩衝液(pH8.0))で洗浄後、抗体を含んだ培養上清を添加し、抗体と固定化タンパク質とを反応させた(30℃で1時間)。
(2−3)反応終了後、前記洗浄緩衝液で洗浄し、100ng/mLに希釈したペルオキシターゼで標識された抗ヒトFc抗体(Bethyl社製)を100μL/wellで添加した。
(2−4)30℃で1時間反応し、前記洗浄緩衝液で洗浄した後、TMB Peroxidase Substrate(KPL社製)を50μL/wellで添加した。その後、1Mのリン酸を50μL/wellで添加することで発色を止め、マイクロプレートリーダー(テカン社製)を用いて450nmの吸光度を測定し、測定値の高い抗IL−6R抗体高生産細胞株を選択した。
(1)配列番号10に記載のアミノ酸配列からなる抗ヒトgp130受容体(gp130R)抗体の重鎖可変領域をコードする配列番号11に記載のポリヌクレオチドの5’末端に制限酵素EcoRI認識配列(GAATTC)とフレームシフト抑制のためのグアニン(G)を付加し、3’末端に制限酵素NheI認識配列(GCTAGC)を付加した遺伝子を全合成しプラスミドにクローニングした(FASMAC社に委託)。作製したプラスミドをpUC−VHgp130と命名した。また、配列番号12に記載のアミノ酸配列からなる抗ヒトgp130R抗体の軽鎖可変領域をコードする配列番号13に記載のポリヌクレオチドの5’末端に制限酵素EcoRI認識配列(GAATTC)とフレームシフト抑制のためのグアニン(G)を付加し、3’末端に制限酵素BsiWI認識配列(CGTACG)を付加した遺伝子を全合成しプラスミドにクローニングした(FASMAC社に委託)。作製したプラスミドをpUC−VLgp130と命名した。
(1)実施例2で得られた抗IL−6R抗体高発現細胞または実施例3で得られた抗ヒトgp130R抗体高発現細胞を、50μg/mLのカナマイシンおよび40mL/LのGlutaMAX(Thermo Fisher Scientific社製)を含むBalanCD CHO Growth A medium(Irvine Scientific社製)を入れた125mLの三角フラスコ(Corning社製)に接種し、130rpm、37℃、8%CO2の条件下で振盪培養した。
(8−1)FcR9_Fカラムを高速液体クロマトグラフィー装置(島津製作所社製)に接続し、カラムオーブンで前記カラムを25℃の恒温状態に維持した状態で、50mMのクエン酸緩衝液(pH6.5)を流速1.0mL/minで10分間流すことにより前記カラムを平衡化した。
(8−2)(7)で得た抗IL−6R抗体および抗ヒトgp130R抗体を(8−1)で用いた緩衝液で1.0mg/mLに希釈し、当該希釈抗体溶液を流速1.0mL/minにて10μL添加した。
(8−3)(8−1)で用いた緩衝液を流速1.0mL/minで2分間流した後、50mMのクエン酸緩衝液(pH4.5)によるpHグラジエント(18分間で50mMのクエン酸緩衝液(pH4.5)が100%となるグラジエント)でFcR9_Fカラムに吸着した抗体を溶出した。
細胞を実施例2で得られた抗IL−6R抗体高発現細胞とし、培養に用いた培地をCD Opti CHO Medium(Thermo Fisher Scientific社製)とし、添加するL‐グルタミンを終濃度0.5mM、1mM、2mM、4mM、8mMまたは10mMとし、培養期間を10日間にした以外は、実施例4と同様の方法で培養および分析を行なった。
(1)50μg/mLのカナマイシン、40mL/LのGlutaMAX(Thermo Fisher Scientific社製)を含む100mLのBalanCD CHO Growth A mediumを入れた500mLの三角フラスコ(Corning社製)に、実施例2で作製した抗IL−6R抗体高発現細胞を接種し、130rpm、37℃、8%CO2の条件下で振盪培養した。
細胞を実施例2で得られた抗IL−6R抗体高発現細胞とし、添加するL‐グルタミンを終濃度で0.5mM、2mMまたは8mMとし、硫酸マンガンを未添加または終濃度で1μM、5μMもしくは10μMとなるよう添加し、培養期間を10日間にした以外は実施例4と同様の方法で培養および分析を行なった。
Claims (6)
- 抗体を発現可能な哺乳動物細胞を培養する工程と、得られた培養物中に含まれる前記哺乳動物細胞が発現した抗体を回収する工程とを含む、抗体の製造方法において、
前記培養工程を0.2mMから4mMのL‐グルタミンを含有する培地で行なうことで、抗体依存性細胞傷害活性が向上した抗体を製造する方法。 - 抗体を発現可能な哺乳動物細胞を培養する工程を、0.2mMから4mMのL‐グルタミンおよび0.3μMから7μMのマンガンイオンを含有する培地で行なう、請求項1に記載の製造方法。
- 抗体がヒトFc領域を含む抗体である、請求項1または2に記載の製造方法。
- 請求項3に記載の製造方法で得られた抗体とヒトFcγRIIIaとの親和性を評価することで、請求項3に記載の製造方法における培養工程をモニタリングする方法。
- 請求項3に記載の製造方法で得られた抗体とヒトFcγRIIIaとの親和性を評価することで、請求項3に記載の製造方法における培地成分を評価する方法。
- 請求項3に記載の製造方法で得られた抗体とヒトFcγRIIIaとの親和性評価を、請求項3に記載の製造方法で得られた抗体とヒトFcγRIIIa固定化分離剤との結合力に基づき行なう、請求項4または5に記載の方法。
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WO2023092743A1 (zh) * | 2021-11-25 | 2023-06-01 | 佛山汉腾生物科技有限公司 | 用于调节重组蛋白羟基化的方法及其应用 |
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