JP7469593B2 - 抗体依存性細胞傷害活性が向上した抗体を製造する方法 - Google Patents
抗体依存性細胞傷害活性が向上した抗体を製造する方法 Download PDFInfo
- Publication number
- JP7469593B2 JP7469593B2 JP2019224246A JP2019224246A JP7469593B2 JP 7469593 B2 JP7469593 B2 JP 7469593B2 JP 2019224246 A JP2019224246 A JP 2019224246A JP 2019224246 A JP2019224246 A JP 2019224246A JP 7469593 B2 JP7469593 B2 JP 7469593B2
- Authority
- JP
- Japan
- Prior art keywords
- antibody
- cells
- human
- culture
- manganese ions
- Prior art date
- Legal status (The legal status is an assumption and is not a legal conclusion. Google has not performed a legal analysis and makes no representation as to the accuracy of the status listed.)
- Active
Links
- 230000010056 antibody-dependent cellular cytotoxicity Effects 0.000 title claims description 41
- 238000004519 manufacturing process Methods 0.000 title claims description 26
- 229910001437 manganese ion Inorganic materials 0.000 claims description 83
- 210000004962 mammalian cell Anatomy 0.000 claims description 44
- 238000000034 method Methods 0.000 claims description 39
- 101000917858 Homo sapiens Low affinity immunoglobulin gamma Fc region receptor III-A Proteins 0.000 claims description 23
- 238000000926 separation method Methods 0.000 claims description 18
- 238000012258 culturing Methods 0.000 claims description 14
- 239000003795 chemical substances by application Substances 0.000 claims description 11
- 239000012533 medium component Substances 0.000 claims description 7
- 108020003175 receptors Proteins 0.000 claims description 6
- 102000005962 receptors Human genes 0.000 claims description 6
- 229940100601 interleukin-6 Drugs 0.000 claims description 3
- 238000012544 monitoring process Methods 0.000 claims description 2
- 210000004027 cell Anatomy 0.000 description 95
- 239000002609 medium Substances 0.000 description 60
- 230000000694 effects Effects 0.000 description 39
- 108090000623 proteins and genes Proteins 0.000 description 32
- 239000013612 plasmid Substances 0.000 description 27
- 108091008146 restriction endonucleases Proteins 0.000 description 24
- 238000004458 analytical method Methods 0.000 description 23
- 230000000052 comparative effect Effects 0.000 description 20
- 238000006243 chemical reaction Methods 0.000 description 19
- 239000000243 solution Substances 0.000 description 17
- 230000012010 growth Effects 0.000 description 16
- 239000000047 product Substances 0.000 description 14
- CURLTUGMZLYLDI-UHFFFAOYSA-N Carbon dioxide Chemical compound O=C=O CURLTUGMZLYLDI-UHFFFAOYSA-N 0.000 description 12
- 241000588724 Escherichia coli Species 0.000 description 12
- 150000001413 amino acids Chemical group 0.000 description 12
- UYTPUPDQBNUYGX-UHFFFAOYSA-N guanine Chemical compound O=C1NC(N)=NC2=C1N=CN2 UYTPUPDQBNUYGX-UHFFFAOYSA-N 0.000 description 12
- WAEMQWOKJMHJLA-UHFFFAOYSA-N Manganese(2+) Chemical compound [Mn+2] WAEMQWOKJMHJLA-UHFFFAOYSA-N 0.000 description 11
- 108091033319 polynucleotide Proteins 0.000 description 11
- 239000002157 polynucleotide Substances 0.000 description 11
- 102000040430 polynucleotide Human genes 0.000 description 11
- 101150074155 DHFR gene Proteins 0.000 description 9
- 239000013604 expression vector Substances 0.000 description 9
- 230000007704 transition Effects 0.000 description 9
- 108010008281 Recombinant Fusion Proteins Proteins 0.000 description 8
- 102000007056 Recombinant Fusion Proteins Human genes 0.000 description 8
- 239000001963 growth medium Substances 0.000 description 8
- 229930027917 kanamycin Natural products 0.000 description 8
- 229960000318 kanamycin Drugs 0.000 description 8
- SBUJHOSQTJFQJX-NOAMYHISSA-N kanamycin Chemical compound O[C@@H]1[C@@H](O)[C@H](O)[C@@H](CN)O[C@@H]1O[C@H]1[C@H](O)[C@@H](O[C@@H]2[C@@H]([C@@H](N)[C@H](O)[C@@H](CO)O2)O)[C@H](N)C[C@@H]1N SBUJHOSQTJFQJX-NOAMYHISSA-N 0.000 description 8
- 229930182823 kanamycin A Natural products 0.000 description 8
- HJCMDXDYPOUFDY-WHFBIAKZSA-N Ala-Gln Chemical compound C[C@H](N)C(=O)N[C@H](C(O)=O)CCC(N)=O HJCMDXDYPOUFDY-WHFBIAKZSA-N 0.000 description 7
- FBOZXECLQNJBKD-ZDUSSCGKSA-N L-methotrexate Chemical compound C=1N=C2N=C(N)N=C(N)C2=NC=1CN(C)C1=CC=C(C(=O)N[C@@H](CCC(O)=O)C(O)=O)C=C1 FBOZXECLQNJBKD-ZDUSSCGKSA-N 0.000 description 7
- 125000000539 amino acid group Chemical group 0.000 description 7
- 102000023732 binding proteins Human genes 0.000 description 7
- 108091008324 binding proteins Proteins 0.000 description 7
- 210000004978 chinese hamster ovary cell Anatomy 0.000 description 7
- 229960000485 methotrexate Drugs 0.000 description 7
- 230000008569 process Effects 0.000 description 7
- 238000000746 purification Methods 0.000 description 7
- 230000028327 secretion Effects 0.000 description 7
- 239000003155 DNA primer Substances 0.000 description 6
- FAPWRFPIFSIZLT-UHFFFAOYSA-M Sodium chloride Chemical compound [Na+].[Cl-] FAPWRFPIFSIZLT-UHFFFAOYSA-M 0.000 description 6
- 239000000872 buffer Substances 0.000 description 6
- 229910002092 carbon dioxide Inorganic materials 0.000 description 6
- SQQMAOCOWKFBNP-UHFFFAOYSA-L manganese(II) sulfate Chemical compound [Mn+2].[O-]S([O-])(=O)=O SQQMAOCOWKFBNP-UHFFFAOYSA-L 0.000 description 6
- 239000000203 mixture Substances 0.000 description 6
- 238000002965 ELISA Methods 0.000 description 5
- QVGXLLKOCUKJST-UHFFFAOYSA-N atomic oxygen Chemical compound [O] QVGXLLKOCUKJST-UHFFFAOYSA-N 0.000 description 5
- 229940099596 manganese sulfate Drugs 0.000 description 5
- 235000007079 manganese sulphate Nutrition 0.000 description 5
- 239000011702 manganese sulphate Substances 0.000 description 5
- 229910052760 oxygen Inorganic materials 0.000 description 5
- 239000001301 oxygen Substances 0.000 description 5
- QKNYBSVHEMOAJP-UHFFFAOYSA-N 2-amino-2-(hydroxymethyl)propane-1,3-diol;hydron;chloride Chemical compound Cl.OCC(N)(CO)CO QKNYBSVHEMOAJP-UHFFFAOYSA-N 0.000 description 4
- 230000004544 DNA amplification Effects 0.000 description 4
- 108010076504 Protein Sorting Signals Proteins 0.000 description 4
- UIIMBOGNXHQVGW-UHFFFAOYSA-M Sodium bicarbonate Chemical compound [Na+].OC([O-])=O UIIMBOGNXHQVGW-UHFFFAOYSA-M 0.000 description 4
- 239000007979 citrate buffer Substances 0.000 description 4
- 230000016784 immunoglobulin production Effects 0.000 description 4
- SXTAYKAGBXMACB-UHFFFAOYSA-N methionine sulfoximine Chemical compound CS(=N)(=O)CCC(N)C(O)=O SXTAYKAGBXMACB-UHFFFAOYSA-N 0.000 description 4
- RXWNCPJZOCPEPQ-NVWDDTSBSA-N puromycin Chemical compound C1=CC(OC)=CC=C1C[C@H](N)C(=O)N[C@H]1[C@@H](O)[C@H](N2C3=NC=NC(=C3N=C2)N(C)C)O[C@@H]1CO RXWNCPJZOCPEPQ-NVWDDTSBSA-N 0.000 description 4
- 229940125644 antibody drug Drugs 0.000 description 3
- 239000007864 aqueous solution Substances 0.000 description 3
- 230000003115 biocidal effect Effects 0.000 description 3
- 229910002091 carbon monoxide Inorganic materials 0.000 description 3
- 230000004540 complement-dependent cytotoxicity Effects 0.000 description 3
- 238000010276 construction Methods 0.000 description 3
- 239000003814 drug Substances 0.000 description 3
- 239000003623 enhancer Substances 0.000 description 3
- ZDXPYRJPNDTMRX-UHFFFAOYSA-N glutamine Natural products OC(=O)C(N)CCC(N)=O ZDXPYRJPNDTMRX-UHFFFAOYSA-N 0.000 description 3
- 150000004676 glycans Chemical class 0.000 description 3
- 150000002697 manganese compounds Chemical class 0.000 description 3
- 239000011780 sodium chloride Substances 0.000 description 3
- 239000013598 vector Substances 0.000 description 3
- 239000011534 wash buffer Substances 0.000 description 3
- 238000005406 washing Methods 0.000 description 3
- QRBLKGHRWFGINE-UGWAGOLRSA-N 2-[2-[2-[[2-[[4-[[2-[[6-amino-2-[3-amino-1-[(2,3-diamino-3-oxopropyl)amino]-3-oxopropyl]-5-methylpyrimidine-4-carbonyl]amino]-3-[(2r,3s,4s,5s,6s)-3-[(2s,3r,4r,5s)-4-carbamoyl-3,4,5-trihydroxy-6-(hydroxymethyl)oxan-2-yl]oxy-4,5-dihydroxy-6-(hydroxymethyl)- Chemical compound N=1C(C=2SC=C(N=2)C(N)=O)CSC=1CCNC(=O)C(C(C)=O)NC(=O)C(C)C(O)C(C)NC(=O)C(C(O[C@H]1[C@@]([C@@H](O)[C@H](O)[C@H](CO)O1)(C)O[C@H]1[C@@H]([C@](O)([C@@H](O)C(CO)O1)C(N)=O)O)C=1NC=NC=1)NC(=O)C1=NC(C(CC(N)=O)NCC(N)C(N)=O)=NC(N)=C1C QRBLKGHRWFGINE-UGWAGOLRSA-N 0.000 description 2
- FWMNVWWHGCHHJJ-SKKKGAJSSA-N 4-amino-1-[(2r)-6-amino-2-[[(2r)-2-[[(2r)-2-[[(2r)-2-amino-3-phenylpropanoyl]amino]-3-phenylpropanoyl]amino]-4-methylpentanoyl]amino]hexanoyl]piperidine-4-carboxylic acid Chemical compound C([C@H](C(=O)N[C@H](CC(C)C)C(=O)N[C@H](CCCCN)C(=O)N1CCC(N)(CC1)C(O)=O)NC(=O)[C@H](N)CC=1C=CC=CC=1)C1=CC=CC=C1 FWMNVWWHGCHHJJ-SKKKGAJSSA-N 0.000 description 2
- 108091033409 CRISPR Proteins 0.000 description 2
- 241000701022 Cytomegalovirus Species 0.000 description 2
- 108020004414 DNA Proteins 0.000 description 2
- YQYJSBFKSSDGFO-UHFFFAOYSA-N Epihygromycin Natural products OC1C(O)C(C(=O)C)OC1OC(C(=C1)O)=CC=C1C=C(C)C(=O)NC1C(O)C(O)C2OCOC2C1O YQYJSBFKSSDGFO-UHFFFAOYSA-N 0.000 description 2
- DHMQDGOQFOQNFH-UHFFFAOYSA-N Glycine Natural products NCC(O)=O DHMQDGOQFOQNFH-UHFFFAOYSA-N 0.000 description 2
- 239000004471 Glycine Substances 0.000 description 2
- 102100037792 Interleukin-6 receptor subunit alpha Human genes 0.000 description 2
- 101710099301 Low affinity immunoglobulin gamma Fc region receptor III-A Proteins 0.000 description 2
- 102100029193 Low affinity immunoglobulin gamma Fc region receptor III-A Human genes 0.000 description 2
- 241001465754 Metazoa Species 0.000 description 2
- PXHVJJICTQNCMI-UHFFFAOYSA-N Nickel Chemical compound [Ni] PXHVJJICTQNCMI-UHFFFAOYSA-N 0.000 description 2
- 102000003992 Peroxidases Human genes 0.000 description 2
- LTQCLFMNABRKSH-UHFFFAOYSA-N Phleomycin Natural products N=1C(C=2SC=C(N=2)C(N)=O)CSC=1CCNC(=O)C(C(O)C)NC(=O)C(C)C(O)C(C)NC(=O)C(C(OC1C(C(O)C(O)C(CO)O1)OC1C(C(OC(N)=O)C(O)C(CO)O1)O)C=1NC=NC=1)NC(=O)C1=NC(C(CC(N)=O)NCC(N)C(N)=O)=NC(N)=C1C LTQCLFMNABRKSH-UHFFFAOYSA-N 0.000 description 2
- 108010035235 Phleomycins Proteins 0.000 description 2
- 108020005091 Replication Origin Proteins 0.000 description 2
- 108010022394 Threonine synthase Proteins 0.000 description 2
- 108010084455 Zeocin Proteins 0.000 description 2
- 239000003242 anti bacterial agent Substances 0.000 description 2
- 229930189065 blasticidin Natural products 0.000 description 2
- 238000011088 calibration curve Methods 0.000 description 2
- 239000001569 carbon dioxide Substances 0.000 description 2
- 230000010261 cell growth Effects 0.000 description 2
- 230000004663 cell proliferation Effects 0.000 description 2
- 238000004587 chromatography analysis Methods 0.000 description 2
- 239000000306 component Substances 0.000 description 2
- 239000010432 diamond Substances 0.000 description 2
- 102000004419 dihydrofolate reductase Human genes 0.000 description 2
- 238000010790 dilution Methods 0.000 description 2
- 239000012895 dilution Substances 0.000 description 2
- 238000010828 elution Methods 0.000 description 2
- 238000011156 evaluation Methods 0.000 description 2
- BRZYSWJRSDMWLG-CAXSIQPQSA-N geneticin Natural products O1C[C@@](O)(C)[C@H](NC)[C@@H](O)[C@H]1O[C@@H]1[C@@H](O)[C@H](O[C@@H]2[C@@H]([C@@H](O)[C@H](O)[C@@H](C(C)O)O2)N)[C@@H](N)C[C@H]1N BRZYSWJRSDMWLG-CAXSIQPQSA-N 0.000 description 2
- 125000000404 glutamine group Chemical group N[C@@H](CCC(N)=O)C(=O)* 0.000 description 2
- 102000005396 glutamine synthetase Human genes 0.000 description 2
- 108020002326 glutamine synthetase Proteins 0.000 description 2
- 229960002449 glycine Drugs 0.000 description 2
- 125000003630 glycyl group Chemical group [H]N([H])C([H])([H])C(*)=O 0.000 description 2
- 229940027941 immunoglobulin g Drugs 0.000 description 2
- 108040006858 interleukin-6 receptor activity proteins Proteins 0.000 description 2
- 210000003734 kidney Anatomy 0.000 description 2
- 239000003550 marker Substances 0.000 description 2
- 239000002773 nucleotide Substances 0.000 description 2
- 125000003729 nucleotide group Chemical group 0.000 description 2
- 108040007629 peroxidase activity proteins Proteins 0.000 description 2
- CWCMIVBLVUHDHK-ZSNHEYEWSA-N phleomycin D1 Chemical compound N([C@H](C(=O)N[C@H](C)[C@@H](O)[C@H](C)C(=O)N[C@@H]([C@H](O)C)C(=O)NCCC=1SC[C@@H](N=1)C=1SC=C(N=1)C(=O)NCCCCNC(N)=N)[C@@H](O[C@H]1[C@H]([C@@H](O)[C@H](O)[C@H](CO)O1)O[C@@H]1[C@H]([C@@H](OC(N)=O)[C@H](O)[C@@H](CO)O1)O)C=1N=CNC=1)C(=O)C1=NC([C@H](CC(N)=O)NC[C@H](N)C(N)=O)=NC(N)=C1C CWCMIVBLVUHDHK-ZSNHEYEWSA-N 0.000 description 2
- 229950010131 puromycin Drugs 0.000 description 2
- 229920006395 saturated elastomer Polymers 0.000 description 2
- 235000017557 sodium bicarbonate Nutrition 0.000 description 2
- 229910000030 sodium bicarbonate Inorganic materials 0.000 description 2
- IVLXQGJVBGMLRR-UHFFFAOYSA-N 2-aminoacetic acid;hydron;chloride Chemical compound Cl.NCC(O)=O IVLXQGJVBGMLRR-UHFFFAOYSA-N 0.000 description 1
- DCXYFEDJOCDNAF-UHFFFAOYSA-N Asparagine Natural products OC(=O)C(N)CC(N)=O DCXYFEDJOCDNAF-UHFFFAOYSA-N 0.000 description 1
- 102100030009 Azurocidin Human genes 0.000 description 1
- 101710154607 Azurocidin Proteins 0.000 description 1
- 241000894006 Bacteria Species 0.000 description 1
- 206010006187 Breast cancer Diseases 0.000 description 1
- 208000026310 Breast neoplasm Diseases 0.000 description 1
- 238000010354 CRISPR gene editing Methods 0.000 description 1
- OYPRJOBELJOOCE-UHFFFAOYSA-N Calcium Chemical compound [Ca] OYPRJOBELJOOCE-UHFFFAOYSA-N 0.000 description 1
- 206010008342 Cervix carcinoma Diseases 0.000 description 1
- 241000282552 Chlorocebus aethiops Species 0.000 description 1
- RYGMFSIKBFXOCR-UHFFFAOYSA-N Copper Chemical compound [Cu] RYGMFSIKBFXOCR-UHFFFAOYSA-N 0.000 description 1
- 108010051219 Cre recombinase Proteins 0.000 description 1
- SHZGCJCMOBCMKK-UHFFFAOYSA-N D-mannomethylose Natural products CC1OC(O)C(O)C(O)C1O SHZGCJCMOBCMKK-UHFFFAOYSA-N 0.000 description 1
- 108091006020 Fc-tagged proteins Proteins 0.000 description 1
- PNNNRSAQSRJVSB-SLPGGIOYSA-N Fucose Natural products C[C@H](O)[C@@H](O)[C@H](O)[C@H](O)C=O PNNNRSAQSRJVSB-SLPGGIOYSA-N 0.000 description 1
- 101150074355 GS gene Proteins 0.000 description 1
- WQZGKKKJIJFFOK-GASJEMHNSA-N Glucose Natural products OC[C@H]1OC(O)[C@H](O)[C@@H](O)[C@@H]1O WQZGKKKJIJFFOK-GASJEMHNSA-N 0.000 description 1
- 108091005904 Hemoglobin subunit beta Proteins 0.000 description 1
- 241000238631 Hexapoda Species 0.000 description 1
- 241000282412 Homo Species 0.000 description 1
- 101001002657 Homo sapiens Interleukin-2 Proteins 0.000 description 1
- 102000008100 Human Serum Albumin Human genes 0.000 description 1
- 108091006905 Human Serum Albumin Proteins 0.000 description 1
- DGAQECJNVWCQMB-PUAWFVPOSA-M Ilexoside XXIX Chemical compound C[C@@H]1CC[C@@]2(CC[C@@]3(C(=CC[C@H]4[C@]3(CC[C@@H]5[C@@]4(CC[C@@H](C5(C)C)OS(=O)(=O)[O-])C)C)[C@@H]2[C@]1(C)O)C)C(=O)O[C@H]6[C@@H]([C@H]([C@@H]([C@H](O6)CO)O)O)O.[Na+] DGAQECJNVWCQMB-PUAWFVPOSA-M 0.000 description 1
- 108010058683 Immobilized Proteins Proteins 0.000 description 1
- 102000000588 Interleukin-2 Human genes 0.000 description 1
- 108010002350 Interleukin-2 Proteins 0.000 description 1
- DCXYFEDJOCDNAF-REOHCLBHSA-N L-asparagine Chemical compound OC(=O)[C@@H](N)CC(N)=O DCXYFEDJOCDNAF-REOHCLBHSA-N 0.000 description 1
- SHZGCJCMOBCMKK-DHVFOXMCSA-N L-fucopyranose Chemical compound C[C@@H]1OC(O)[C@@H](O)[C@H](O)[C@@H]1O SHZGCJCMOBCMKK-DHVFOXMCSA-N 0.000 description 1
- 239000012515 MabSelect SuRe Substances 0.000 description 1
- FYYHWMGAXLPEAU-UHFFFAOYSA-N Magnesium Chemical compound [Mg] FYYHWMGAXLPEAU-UHFFFAOYSA-N 0.000 description 1
- 241000124008 Mammalia Species 0.000 description 1
- 229910021380 Manganese Chloride Inorganic materials 0.000 description 1
- GLFNIEUTAYBVOC-UHFFFAOYSA-L Manganese chloride Chemical compound Cl[Mn]Cl GLFNIEUTAYBVOC-UHFFFAOYSA-L 0.000 description 1
- UEZVMMHDMIWARA-UHFFFAOYSA-N Metaphosphoric acid Chemical compound OP(=O)=O UEZVMMHDMIWARA-UHFFFAOYSA-N 0.000 description 1
- 241000699666 Mus <mouse, genus> Species 0.000 description 1
- 241000699670 Mus sp. Species 0.000 description 1
- 229930193140 Neomycin Natural products 0.000 description 1
- 206010028980 Neoplasm Diseases 0.000 description 1
- 241000283973 Oryctolagus cuniculus Species 0.000 description 1
- 206010035226 Plasma cell myeloma Diseases 0.000 description 1
- 229920001213 Polysorbate 20 Polymers 0.000 description 1
- ZLMJMSJWJFRBEC-UHFFFAOYSA-N Potassium Chemical compound [K] ZLMJMSJWJFRBEC-UHFFFAOYSA-N 0.000 description 1
- 239000012980 RPMI-1640 medium Substances 0.000 description 1
- 240000004808 Saccharomyces cerevisiae Species 0.000 description 1
- MTCFGRXMJLQNBG-UHFFFAOYSA-N Serine Natural products OCC(N)C(O)=O MTCFGRXMJLQNBG-UHFFFAOYSA-N 0.000 description 1
- AYFVYJQAPQTCCC-UHFFFAOYSA-N Threonine Natural products CC(O)C(N)C(O)=O AYFVYJQAPQTCCC-UHFFFAOYSA-N 0.000 description 1
- 239000004473 Threonine Substances 0.000 description 1
- 102000006601 Thymidine Kinase Human genes 0.000 description 1
- 108020004440 Thymidine kinase Proteins 0.000 description 1
- 208000006105 Uterine Cervical Neoplasms Diseases 0.000 description 1
- HCHKCACWOHOZIP-UHFFFAOYSA-N Zinc Chemical compound [Zn] HCHKCACWOHOZIP-UHFFFAOYSA-N 0.000 description 1
- 238000002835 absorbance Methods 0.000 description 1
- 238000001042 affinity chromatography Methods 0.000 description 1
- 235000001014 amino acid Nutrition 0.000 description 1
- 229940024606 amino acid Drugs 0.000 description 1
- AVKUERGKIZMTKX-NJBDSQKTSA-N ampicillin Chemical compound C1([C@@H](N)C(=O)N[C@H]2[C@H]3SC([C@@H](N3C2=O)C(O)=O)(C)C)=CC=CC=C1 AVKUERGKIZMTKX-NJBDSQKTSA-N 0.000 description 1
- 229960000723 ampicillin Drugs 0.000 description 1
- 229940088710 antibiotic agent Drugs 0.000 description 1
- 239000002246 antineoplastic agent Substances 0.000 description 1
- 230000006907 apoptotic process Effects 0.000 description 1
- 229960001230 asparagine Drugs 0.000 description 1
- 235000009582 asparagine Nutrition 0.000 description 1
- WQZGKKKJIJFFOK-VFUOTHLCSA-N beta-D-glucose Chemical compound OC[C@H]1O[C@@H](O)[C@H](O)[C@@H](O)[C@@H]1O WQZGKKKJIJFFOK-VFUOTHLCSA-N 0.000 description 1
- 229960000074 biopharmaceutical Drugs 0.000 description 1
- 108010006025 bovine growth hormone Proteins 0.000 description 1
- 239000007853 buffer solution Substances 0.000 description 1
- 239000011575 calcium Substances 0.000 description 1
- 229910052791 calcium Inorganic materials 0.000 description 1
- 201000011510 cancer Diseases 0.000 description 1
- 125000002091 cationic group Chemical group 0.000 description 1
- 230000030833 cell death Effects 0.000 description 1
- 201000010881 cervical cancer Diseases 0.000 description 1
- 238000010367 cloning Methods 0.000 description 1
- 229910017052 cobalt Inorganic materials 0.000 description 1
- 239000010941 cobalt Substances 0.000 description 1
- GUTLYIVDDKVIGB-UHFFFAOYSA-N cobalt atom Chemical compound [Co] GUTLYIVDDKVIGB-UHFFFAOYSA-N 0.000 description 1
- 229910052802 copper Inorganic materials 0.000 description 1
- 239000010949 copper Substances 0.000 description 1
- 239000012228 culture supernatant Substances 0.000 description 1
- 231100000433 cytotoxic Toxicity 0.000 description 1
- 230000001472 cytotoxic effect Effects 0.000 description 1
- 230000007423 decrease Effects 0.000 description 1
- 230000003247 decreasing effect Effects 0.000 description 1
- 238000011161 development Methods 0.000 description 1
- 229940079593 drug Drugs 0.000 description 1
- 239000012636 effector Substances 0.000 description 1
- 238000004520 electroporation Methods 0.000 description 1
- 238000005516 engineering process Methods 0.000 description 1
- 238000011067 equilibration Methods 0.000 description 1
- 239000013613 expression plasmid Substances 0.000 description 1
- 230000004927 fusion Effects 0.000 description 1
- 238000001641 gel filtration chromatography Methods 0.000 description 1
- 239000008103 glucose Substances 0.000 description 1
- -1 glutamine Chemical class 0.000 description 1
- 229960001269 glycine hydrochloride Drugs 0.000 description 1
- 230000013595 glycosylation Effects 0.000 description 1
- 238000006206 glycosylation reaction Methods 0.000 description 1
- 239000003102 growth factor Substances 0.000 description 1
- 238000004128 high performance liquid chromatography Methods 0.000 description 1
- 230000006801 homologous recombination Effects 0.000 description 1
- 238000002744 homologous recombination Methods 0.000 description 1
- 239000005556 hormone Substances 0.000 description 1
- 229940088597 hormone Drugs 0.000 description 1
- 102000055277 human IL2 Human genes 0.000 description 1
- 230000002209 hydrophobic effect Effects 0.000 description 1
- 230000003100 immobilizing effect Effects 0.000 description 1
- 210000002865 immune cell Anatomy 0.000 description 1
- 230000008076 immune mechanism Effects 0.000 description 1
- 239000012535 impurity Substances 0.000 description 1
- 230000006698 induction Effects 0.000 description 1
- 238000004255 ion exchange chromatography Methods 0.000 description 1
- 150000002500 ions Chemical class 0.000 description 1
- 208000032839 leukemia Diseases 0.000 description 1
- 150000002632 lipids Chemical class 0.000 description 1
- 238000001638 lipofection Methods 0.000 description 1
- 239000002502 liposome Substances 0.000 description 1
- 239000011777 magnesium Substances 0.000 description 1
- 229910052749 magnesium Inorganic materials 0.000 description 1
- 239000002075 main ingredient Substances 0.000 description 1
- 235000002867 manganese chloride Nutrition 0.000 description 1
- 239000011565 manganese chloride Substances 0.000 description 1
- 229940099607 manganese chloride Drugs 0.000 description 1
- 239000012528 membrane Substances 0.000 description 1
- 201000000050 myeloid neoplasm Diseases 0.000 description 1
- 230000011234 negative regulation of signal transduction Effects 0.000 description 1
- 229960004927 neomycin Drugs 0.000 description 1
- 229910052754 neon Inorganic materials 0.000 description 1
- GKAOGPIIYCISHV-UHFFFAOYSA-N neon atom Chemical compound [Ne] GKAOGPIIYCISHV-UHFFFAOYSA-N 0.000 description 1
- 230000007935 neutral effect Effects 0.000 description 1
- 229910052759 nickel Inorganic materials 0.000 description 1
- 239000002777 nucleoside Substances 0.000 description 1
- 125000003835 nucleoside group Chemical group 0.000 description 1
- 235000015097 nutrients Nutrition 0.000 description 1
- 238000012856 packing Methods 0.000 description 1
- 230000010412 perfusion Effects 0.000 description 1
- 235000010486 polyoxyethylene sorbitan monolaurate Nutrition 0.000 description 1
- 239000000256 polyoxyethylene sorbitan monolaurate Substances 0.000 description 1
- 229920001184 polypeptide Polymers 0.000 description 1
- 230000004481 post-translational protein modification Effects 0.000 description 1
- 239000011591 potassium Substances 0.000 description 1
- 229910052700 potassium Inorganic materials 0.000 description 1
- 239000002243 precursor Substances 0.000 description 1
- 108090000765 processed proteins & peptides Proteins 0.000 description 1
- 102000004196 processed proteins & peptides Human genes 0.000 description 1
- 230000035755 proliferation Effects 0.000 description 1
- 230000006798 recombination Effects 0.000 description 1
- 238000005215 recombination Methods 0.000 description 1
- 238000011160 research Methods 0.000 description 1
- 150000003839 salts Chemical class 0.000 description 1
- 210000002966 serum Anatomy 0.000 description 1
- 235000020183 skimmed milk Nutrition 0.000 description 1
- 239000011734 sodium Substances 0.000 description 1
- 229910052708 sodium Inorganic materials 0.000 description 1
- 239000000758 substrate Substances 0.000 description 1
- 239000006228 supernatant Substances 0.000 description 1
- 230000001502 supplementing effect Effects 0.000 description 1
- 230000001225 therapeutic effect Effects 0.000 description 1
- 238000001890 transfection Methods 0.000 description 1
- 238000011426 transformation method Methods 0.000 description 1
- 230000001131 transforming effect Effects 0.000 description 1
- 238000000108 ultra-filtration Methods 0.000 description 1
- 241001529453 unidentified herpesvirus Species 0.000 description 1
- 239000011782 vitamin Substances 0.000 description 1
- 235000013343 vitamin Nutrition 0.000 description 1
- 229940088594 vitamin Drugs 0.000 description 1
- 229930003231 vitamin Natural products 0.000 description 1
- 229910052725 zinc Inorganic materials 0.000 description 1
- 239000011701 zinc Substances 0.000 description 1
Landscapes
- Preparation Of Compounds By Using Micro-Organisms (AREA)
- Peptides Or Proteins (AREA)
Description
前述した濃度のマンガンイオンを添加した培地を入れたフラスコに、抗体を発現可能な哺乳動物細胞を接種後、当該フラスコを振盪させて培養してもよく、
前述した濃度のマンガンイオンを添加した培地を入れたバイオリアクターに、抗体を発現可能な哺乳動物細胞を接種後、回分培養、半回分培養(流加培養ともいう)、潅流培養またはそれらの組合せにより培養してもよい。
哺乳動物細胞がCHO細胞の場合、5%から8%のCO2存在下、温度30℃から37℃
、pH6.8から7.4で培養することが好ましい。
(A)ヒトFcγRIIIa(UniProt No.P08637)のアミノ酸配列のうち17番目のグリシンから192番目のグルタミンまでのアミノ酸残基を少なくとも含む、Fc結合性タンパク質、または
(B)ヒトFcγRIIIa(UniProt No.P08637)のアミノ酸配列のうち17番目のグリシンから192番目のグルタミンまでのアミノ酸残基を少なくとも含み、ただし当該17番目から192番目までのアミノ酸残基において、1以上のアミノ酸残基が欠失、他のアミノ酸残基に置換、または付加されたポリペプチドを含む、Fc結合性タンパク質、
のことを意味する。また前記(B)の好ましい態様として、
特開2015-086216号公報で開示のFc結合性タンパク質、
特開2016-169197号公報で開示のFc結合性タンパク質、
特開2017-118871号公報で開示のFc結合性タンパク質、
WO2018/150973号で開示のFc結合性タンパク質、
WO2019/083048号で開示のFc結合性タンパク質、
があげられる。
(1)以下の方法で抗IL-6R抗体を哺乳動物細胞で発現可能なベクターを構築した。
(1-1)配列番号1に記載のジヒドロ葉酸レダクターゼ(dihydrofolate reductase、dhfr)およびSV40のPolyAをコードする遺伝子に制限酵素SacII認識配列列(CCGCGG)を5’末端および3’末端の両方に付加した遺伝子を全合成し(Integrated DNA Technologies社に委託)プラスミドにクローニングした。
(1-2)(1-1)で作製したプラスミドで大腸菌JM109株を形質転換した。得られた形質転換体を培養し、プラスミドを抽出したのち、制限酵素SacIIで消化することで、dhfr-SV40PolyAをコードする遺伝子を調製しdhfr-P1と命名した。
(1-3)pIRESベクター(Clontech社製)を鋳型として、配列番号2(5’-TCC[CCGCGG]GCGGGACTCTGGGGTTCGAAATGACCG-3’)および配列番号3(5’-TCC[CCGCGG]GGTGGCTCTAGCCTTAAGTTCGAGACTG-3’)に記載の配列からなるオリゴヌクレオチドプライマー(配列番号2および3中の角かっこは制限酵素SacII認識配列を示している)を用いてPCRを行なった。具体的には、表1に示す組成の反応液を調製し、当該反応液を98℃で30秒間熱処理後、98℃で10秒間の第1ステップ、55℃で5秒間の第2ステップ、72℃で5分間の第3ステップを1サイクルとする反応を25サイクル繰り返ことで実施した。このPCRにより、pIRESベクターのうちネオマイシン耐性遺伝子を除いた領域を増幅した。
(1)実施例1で作製したpFU-6RH-dhfrおよびpFU-6RL-dhfrを、CHO細胞(DG44株)にNeon Transfection System(Thermo Fisher Scientific社製)を用いて遺伝子導入した。その後、50μg/mLのカナマイシン、40mL/LのGlutaMAX(Thermo Fisher Scientific社製)を含んだCD OptiCHO Medium(Thermo Fisher Scientific社製)で形質転換細胞を培養抗IL-6R抗体発現細胞を得た。その後、培地に50ng/mLのメトトレキサート
(MTX)を添加することで遺伝子増幅を行なった。
(2-1)抗ヒトFab抗体(Bethyl社製)を、96穴マイクロプレートのウェルに1μg/wellで固定化した(4℃で一晩)。固定化終了後、2%(w/v)のSKIM MILK(Becton Dickinson社製)および150mM塩化ナトリウムを含んだ20mMのトリス塩酸緩衝液(pH7.4)によりブロッキングした。
(2-2)洗浄緩衝液(0.05%[w/v]のTween 20(商品名)と150mMのNaClとを含む20mM Tris-HCl緩衝液(pH8.0))で洗浄後、抗体を含んだ培養上清を添加し、抗体と固定化タンパク質とを反応させた(30℃で1時間)。
(2-3)反応終了後、前記洗浄緩衝液で洗浄し、100ng/mLに希釈したペルオキシターゼで標識された抗ヒトFc抗体(Bethyl社製)を100μL/wellで添加した。
(2-4)30℃で1時間反応し、前記洗浄緩衝液で洗浄した後、TMB Peroxidase Substrate(KPL社製)を50μL/wellで添加した。その後、1Mのリン酸を50μL/wellで添加することで発色を止め、マイクロプレートリーダー(テカン社製)を用いて450nmの吸光度を測定し、測定値の高い抗IL-6R抗体高生産細胞株を選択した。
(1)配列番号10に記載のアミノ酸配列からなる抗ヒトgp130受容体(gp130R)抗体の重鎖可変領域をコードする配列番号11に記載のポリヌクレオチドの5’末端に制限酵素EcoRI認識配列(GAATTC)とフレームシフト抑制のためグアニン(G)を付加し、3’末端に制限酵素NheI認識配列(GCTAGC)を付加した遺伝子を全合成しプラスミドにクローニングした(FASMAC社に委託)。作製したプラスミドをpUC-VHgp130と命名した。また、配列番号12に記載のアミノ酸配列からなる抗ヒトgp130R抗体の軽鎖可変領域をコードする配列番号13に記載のポリヌクレオチドの5’末端に制限酵素EcoRI認識配列(GAATTC)とフレームシフト抑制のためグアニン(G)を付加し、3’末端に制限酵素BsiWI認識配列(CGTACG)を付加した遺伝子を全合成しプラスミドにクローニングした(FASMAC社に委託)。作製したプラスミドをpUC-VLgp130と命名した。
(1)実施例2で得られた抗IL-6R抗体高発現細胞または実施例3で得られた抗ヒトgp130R抗体高発現細胞を、50μg/mLのカナマイシン、40mL/LのGlutaMAX(Thermo Fisher Scientific社製)を含む20mLのBalanCD CHO Growth A medium(Irvine Scientific社製)を入れた125mLの三角フラスコ(Corning社製)に接種し、130rpm、37℃、8%CO2の条件下で振盪培養した。
(5-1)FcR9_Fカラムを高速液体クロマトグラフィー装置(島津製作所社製)に接続し、カラムオーブンで前記カラムを25℃の恒温状態に維持し、50mMのクエン酸緩衝液(pH6.5)を流速1.0mL/minで10分間流すことにより前記カラムを平衡化した。
(5-2)(4)で得た抗IL-6R抗体および抗ヒトgp130R抗体を(5-1)で用いた緩衝液で1.0mg/mLに希釈し、当該希釈抗体溶液を流速1.0mL/min
にて10μL添加した。
(5-3)(5-1)で用いた緩衝液を流速1.0mL/minで2分間流した後、50
mMのクエン酸緩衝液(pH4.5)によるpHグラジエント(18分間で50mMのク
エン酸緩衝液(pH4.5)が100%となるグラジエント)でFcR9_Fカラムに吸
着した抗体を溶出した。
使用した培地をCD Opti CHO Medium(Thermo Fisher Scientific社製)とし、培養期間を11日間とした他は、実施例4と同様の方法を用いて、実施例2で得られた抗IL-6R抗体高発現細胞、および実施例3で得られた抗ヒトgp130R抗体高発現細胞を培養し、抗体生産性および生細胞数の測定、ならびに得られた培養物中に含まれる前記細胞が発現した抗体のFcR9_Fカラムによる分析を行なった。
(1)50μg/mLのカナマイシン、40mL/LのGlutaMAX(Thermo Fisher Scientific社製)を含んだ100mLのBalanCD CHO Growth A mediumを入れた500mLの三角フラスコ(Corning社製)に、実施例2で作製した抗IL-6R抗体高発現細胞を接種し、130rpm、37℃、8%CO2の条件下で振盪培養した。
実施例6(2)で硫酸マンガンを添加しないこと、および実施例6(3)での培養期間が9日間であること以外は、実施例6と同様な方法で培養し、生細胞数および抗体生産性の測定ならびにFcR9_Fカラムによる抗体分析を行なった。
(1)50μg/mLのカナマイシン、30mL/LのGlutaMAX(Thermo Fisher Scientific社製)を含んだ50mLのEX-CELL Advanced CHO Fed-batch Mediumを加えた250mLの三角フラスコ(Corning社製)に、実施例2で作製した抗IL-6R抗体高発現細胞を接種し、130rpm、37℃、8%CO2の条件下で振盪培養した。
実施例7(2)で硫酸マンガンを添加しないこと以外は、実施例7と同様の方法で培養し、生細胞数および抗体生産性の測定ならびにFcR9_Fカラムによる抗体分析を行なった。
Claims (4)
- 抗体を発現可能な哺乳動物細胞を培養する工程と、得られた培養物中に含まれる前記哺乳動物細胞が発現した抗体を回収する工程とを含む、抗体の製造方法において、
前記抗体が抗インターロイキン6レセプター抗体または抗ヒトgp130受容体抗体であり、
前記培養工程を0.1μMから50μMのマンガンイオンを添加した培地で行なうことで、抗体依存性細胞傷害活性が向上した抗体を製造する方法。 - 請求項1に記載の製造方法で得られた抗体とヒトFcγRIIIaとの親和性を評価することで、請求項1に記載の製造方法における培養工程をモニタリングする方法。
- 請求項1に記載の製造方法で得られた抗体とヒトFcγRIIIaとの親和性を評価することで、請求項1に記載の製造方法における培地成分を評価する方法。
- 請求項1に記載の製造方法で得られた抗体とヒトFcγRIIIaとの親和性評価を、請求項1に記載の製造方法で得られた抗体とヒトFcγRIIIa固定化分離剤との結合力に基づき行なう、請求項2または請求項3に記載の方法。
Applications Claiming Priority (2)
Application Number | Priority Date | Filing Date | Title |
---|---|---|---|
JP2018243922 | 2018-12-27 | ||
JP2018243922 | 2018-12-27 |
Publications (2)
Publication Number | Publication Date |
---|---|
JP2020103280A JP2020103280A (ja) | 2020-07-09 |
JP7469593B2 true JP7469593B2 (ja) | 2024-04-17 |
Family
ID=71449805
Family Applications (1)
Application Number | Title | Priority Date | Filing Date |
---|---|---|---|
JP2019224246A Active JP7469593B2 (ja) | 2018-12-27 | 2019-12-12 | 抗体依存性細胞傷害活性が向上した抗体を製造する方法 |
Country Status (1)
Country | Link |
---|---|
JP (1) | JP7469593B2 (ja) |
Citations (1)
Publication number | Priority date | Publication date | Assignee | Title |
---|---|---|---|---|
JP2016525352A (ja) | 2013-07-23 | 2016-08-25 | バイオコン・リミテッド | タンパク質におけるフコシル化レベルを制御するための方法 |
-
2019
- 2019-12-12 JP JP2019224246A patent/JP7469593B2/ja active Active
Patent Citations (1)
Publication number | Priority date | Publication date | Assignee | Title |
---|---|---|---|---|
JP2016525352A (ja) | 2013-07-23 | 2016-08-25 | バイオコン・リミテッド | タンパク質におけるフコシル化レベルを制御するための方法 |
Non-Patent Citations (1)
Title |
---|
東ソー研究・技術報告,2017年,vol.61,PP.33-41 |
Also Published As
Publication number | Publication date |
---|---|
JP2020103280A (ja) | 2020-07-09 |
Similar Documents
Publication | Publication Date | Title |
---|---|---|
JP7083802B2 (ja) | グリコシル化された免疫グロブリンの調製方法 | |
US11267899B2 (en) | Afucosylated protein, cell expressing said protein and associated methods | |
TWI513818B (zh) | 岩藻糖基化(fucosylation)-缺乏之細胞 | |
US9499634B2 (en) | Process and methods for efficient manufacturing of highly pure asymmetric antibodies in mammalian cells | |
US20120258496A1 (en) | Production of low fucose antibodies in h4-ii-e rat cells | |
JP6351598B2 (ja) | 糖タンパク質を産生するための組成物および方法 | |
US9657310B2 (en) | Expression vector | |
SG173796A1 (en) | Metabolic engineering of a galactose assimilation pathway in the glycoengineered yeast pichia pastoris | |
EP2714732A1 (en) | METHOD FOR PREPARING Fc-CONTAINING POLYPEPTIDES HAVING IMPROVED PROPERTIES | |
JP2014508759A (ja) | シアリル化抗体の生産の方法 | |
TWI781973B (zh) | 用於以活體外進行抗體糖基化工程之方法 | |
JP2012525826A (ja) | Cho/cert細胞系 | |
JP7469593B2 (ja) | 抗体依存性細胞傷害活性が向上した抗体を製造する方法 | |
JP2020188737A (ja) | 抗体依存性細胞傷害活性が向上した抗体の製造方法 | |
JP2022094382A (ja) | 抗体依存性細胞傷害活性が向上した抗体を製造する方法 | |
EP3810761A1 (en) | Methods of glycoengineering proteoglycans with distinct glycan structures | |
Bebbington | Expression of antibody genes in mammalian cells | |
JP7081139B2 (ja) | 新規プロモーターおよびそれを含む発現ベクター | |
JP2023522417A (ja) | スルフヒドリル化合物およびその誘導体を用いた酵素および経路調節 | |
Jung | Engineering mammalian cell line for N-linked glycosylation control | |
Bennun et al. | 4 Engineering of the Product |
Legal Events
Date | Code | Title | Description |
---|---|---|---|
A521 | Request for written amendment filed |
Free format text: JAPANESE INTERMEDIATE CODE: A523 Effective date: 20200302 |
|
A621 | Written request for application examination |
Free format text: JAPANESE INTERMEDIATE CODE: A621 Effective date: 20221116 |
|
A977 | Report on retrieval |
Free format text: JAPANESE INTERMEDIATE CODE: A971007 Effective date: 20231020 |
|
A131 | Notification of reasons for refusal |
Free format text: JAPANESE INTERMEDIATE CODE: A131 Effective date: 20231031 |
|
A521 | Request for written amendment filed |
Free format text: JAPANESE INTERMEDIATE CODE: A523 Effective date: 20231218 |
|
TRDD | Decision of grant or rejection written | ||
A01 | Written decision to grant a patent or to grant a registration (utility model) |
Free format text: JAPANESE INTERMEDIATE CODE: A01 Effective date: 20240305 |
|
A61 | First payment of annual fees (during grant procedure) |
Free format text: JAPANESE INTERMEDIATE CODE: A61 Effective date: 20240318 |
|
R150 | Certificate of patent or registration of utility model |
Ref document number: 7469593 Country of ref document: JP Free format text: JAPANESE INTERMEDIATE CODE: R150 |