BRPI0714212B1 - método de produzir uma glicoproteína em uma cultura celular - Google Patents

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Stephan M. Koza
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Abstract

MÉTODO DE PRODUZIR UMA GLICOPROTEÍNA EM UMA CULTURA CELULAR, MEIO DE CULTURA CELULAR E GLICOPROTEÍNA. A presente invenção refere-se a um sistema melhorado para a produção em grande escala de glicoproteínas em cultura celular que é fornecido. De acordo com a presente invenção, células que expressam uma glicoproteína são cultivadas em meios que contém manganês em uma concentração entre aproximadamente 10 e 60 NM. O uso de um tal sistema permite a produção de uma glicoproteína com um padrão de glicosilação aumentado e/ou um padrão de glicosilação que reflete mais exatamente o padrão de glicosilação da glicoproteína que ocorre naturalmente. Uma glicoproteína expressa de acordo com a presente invenção pode ser vantajosamente usada na preparação de composições farmacêuticas.

Description

Esta invenção refere-se a um método de produzir uma glicoproteína em um meio de cultura celular compreendendo manganês, e um meio de cultura celular para o uso em um tal método. Referência Cruzada aos Pedidos Relacionados
Este pedido é copendente com, compartilha pelo menos um inventor comum com, e reivindica prioridade ao Pedido de Patente Provisório Número dos Estados Unidos 60/830.658, depositado em 13 de julho 13 de 2006, os conteúdos do qual são por meio deste incorporado por referência em suas totalidades. antecedentes da Invenção
Proteínas e polipeptídeos tornaram-se agentes terapêuticos crescentemente importantes. Na maioria dos casos, estas proteínas e polipeptídeos são produzidos em cultura celular, a partir de células que foram engendradas e/ou selecionadas para produzir níveis surpreendentemente altos da proteína ou polipeptídeo particulares de interesse. O controle e otimização de condições de cultura celular são criticamente importantes para a produção comercial bem-sucedida de proteínas e polipeptídeos.
Muitas proteínas e polipeptídeos produzidos em cultura celular são glicoproteínas que contêm estruturas de carboidrato covalentemente ligadas incluindo cadeias de oligossacarídeo. Estas cadeias de oligossacarídeo são ligadas à proteína no retículo endoplasmático e no complexo de Golgi por intermédio de ligações de N ou ligações de O. As cadeias de oligossacarídeo podem compreender uma porção significante da massa da glicoproteína. As cadeias de oligossacarídeo são consideradas desempenhar papéis chave na função da glicoproteína incluindo facilitar a dobragem correta da glicoproteína, mediar as interações proteína-proteína, conferir estabilidade, conferir propriedades farmacodinâmicas e/ou farmacocinéticas vantajosas, inibir a digestão proteolítica, alvejar a glicoproteína à via secretória apropriada e alvejar a glicoproteína a um órgão ou órgãos particulares.
Geralmente, cadeias de oligossacarídeo ligadas a N são adicionadas à proteína de deslocamento, nascente no lúmen do retículo endoplasmático (ver Molecular Biology of the Cell, by Alberts et al., 1994, incorporado aqui por referência). O oligossacarídeo é adicionado ao grupo amino na cadeia lateral de um resíduo de asparagina contido dentro da sequência de consenso alvo de Asn-X-Ser/Thr, onde X pode ser qualquer aminoácido exceto prolina. A cadeia de oligossacarídeo inicial é usualmente arranjada por enzimas glicosidase específicas no retículo endoplasmático, resultando em um oligossacarídeo curto, de núcleo ramificado composto de dois resíduos de N-acetilglicosamina e três de manose.
Depois do processamento inicial no retículo endoplasmático, a glicoproteína é transportada por intermédio de vesículas pequenas ao complexo de Golgi, onde a cadeia de oligossacarídeo sofre outro processamento antes de ser secretada à superfície celular. A cadeia de oligossacarídeo ligada a N arranjada pode ser modificada pela adição de vários resíduos de manose, resultando em um oligossacarídeo com alto teor de manose. Alter-nativamente, uma ou mais unidades de monossacarídeos de N-acetilglicosamina podem ser adicionadas às subunidades de manose de núcleo para formar oligossacarídeos complexos. Galactose pode ser adicionada às Subunidades de N-acetilglicosamina, e subunidades de ácido siálico podem ser adicionadas às subunidades de galactose, resultando em cadeias que terminam com qualquer um de um ácido siálico, uma galactose ou um resíduo de N-acetilglicosamina. Adicionalmente, um resíduo de fucose pode ser adicionado a um resíduo de N-acetilglicosamina do oligossacarídeo do núcleo. Cada uma destas adições é catalisada por glicosil transferases específicas.
Além de serem modificadas pela via de glicosilação ligada a N, as glicoproteínas também podem ser modificadas pela adição de cadeias de oligossacarídeo ligadas a O aos resíduos de serina ou treonina específicos conforme eles são processados no complexo de Golgi. Os resíduos de um oligossacarídeo ligado a O são adicionados de uma vez e a adição de cada resíduo é catalisada por uma enzima específica. Ao contrário da glicosilação ligada a N, a sequência de aminoácido de consenso para a glicosilação ligada a O é menos bem definida.
A qualidade e extensão fundamentais da glicosilação de proteína pode ser dramaticamente afetada pelas condições da cultura celular. Por exemplo, processos de cultura de lote tradicional e lote alimentado têm focado no nível fundamental do peptídeo produzido e frequentemente resultam na produção de uma glicoproteína com um padrão de glicosilação menos extensivo e/ou um padrão de glicosilação cujos resíduos de açúcar das ca-deias de oligossacarídeo refletem deficientemente os resíduos de açúcar que estão presentes na forma que ocorre naturalmente da glicoproteína. O aumento na extensão da glicosilação e/ou ajuste da composição dos resíduos de açúcar para mais rigorosamente refletem o nível e composição da glicosilação que estão presentes na forma natural da glicoproteína poderiam resultar potencialmente em um agente de glicoproteína terapêutico com maior potência, propriedades farmacodinâmicas e/ou farmacocinética melhoradas e menos efeitos colaterais. Embora algum esforço fosse feito para melhorar a qualidade e quantidade de glicosilação de glicoproteínas produzidas em cultura celular, permanece uma necessidade para melhorias adicionais. Existe uma necessidade particular para o desenvolvimento de sistemas para produzir glicoproteínas com padrões de glicosilação melhorados por cultura celular em meios definidos.
Sumário da Invenção
Métodos e composições da presente invenção fornecem um sistema melhorado para a produção em grande escala de glicoproteínas com padrões de glicosilação melhorados em cultura celular. Por exemplo, em certas modalidades, a presente invenção fornece métodos de cultura em escala comercial (por exemplo, 500 L ou mais) que utilizam um meio contendo uma concentração cumulativa molar de manganês entre aproximadamente 10 e 600 nM. Em certas modalidades, a concentração de glutamina cumulativa molar nos meios é menor do que aproximadamente 8 mM. Em certas modalidades, a concentração de glutamina cumulativa molar nos meios é menor do que aproximadamente 4 mM. Deve ser entendido que "cumulativo", como usado acima, refere-se à quantidade total de um componente particular ou componentes adicionados durante o curso da cultura celular, incluindo componentes adicionados no começo da cultura e componentes subsequentemente adicionados. Em certas modalidades da invenção, é desejável minimizar "alimentações" da cultura com o passar do tempo, de modo que é desejável maximizar quantidades presentes inicialmente. Naturalmente, componentes do meio são metabolizados durante a cultura de modo que as culturas com as mesmas quantidades cumulativas de componentes dados terão níveis absolutos diferentes se estes componentes são adicionados em tempos diferentes (por exemplo, todos presentes inicialmente vs. alguns adicionados por alimentações).
De acordo com a presente invenção, o uso de um tal meio permite a produção de glicoproteínas que contêm padrões de glicosilação desejáveis. Em algumas modalidades, as glicoproteínas podem ter um padrão de glicosilação mais extensivo e/ou podem ter uma distribuição de cadeias de oligossacarídeo que mais estritamente assemelha-se à distribuição de cadeias de oligossacarídeo aplicadas à glicoproteína pela célula hospedeira natural. Em algumas modalidades, o uso do sistema inventivo pode resultar na produção de uma glicoproteína com um padrão de glicosilação similar ou idêntico ao padrão de glicosilação que estaria presente se a glicoproteína fosse expressa em uma célula humana endógena.
Uma pessoa versada na técnica entenderá que formulações de meios da presente invenção abrangem tanto meios definidos quanto complexos. Em certas modalidades, o meio de cultura é um meio definido em que a composição do meio é conhecida e controlada.
Em algumas modalidades, as células são cultivadas sob uma ou mais das condições descritas no Pedido de Patente Provisório dos Estados Unidos Série n60/605.097, incorporado aqui por referência. Em algumas modalidades, as células são cultivadas sob uma ou mais das condições descritas no Pedido de Patente dos Estados Unidos Série n° 11/213.308, incorporado aqui por referência.
Culturas celulares da presente invenção opcionalmente podem ser suplementadas com nutrientes e/ou outros componentes do meio incluindo hormônios e/ou outros fatores de crescimento, ions particulares (tais como sódio, cloreto, cálcio, magnésio, e fosfato), tampões, vitaminas, nucleosídeos ou nucleotídeos, microelementos (compostos inorgânicos usualmente presentes em concentrações finais muito baixas), aminoácidos, lipídeos, ou glicose ou outra fonte de energia. Em certas modalidades, pode ser benéfico suplementar os meios com indutores químicos tais como hexametilenobis(acetamida) ("HMBA") e butirato de sódio ("NaB"). Tais suplementos opcionais podem ser adicionados no começo da cultura ou podem ser adicionados em um ponto posterior de modo a reabastecer nutrientes suprimidos ou por uma outra razão. Em geral, é desejável selecionar a composição de meio inicial para minimizar a suplementação de acordo com a presente invenção.
Breve Descrição dos Desenhos A figura 1 mostra Investigação da Atividade Glicosídica em Material de Concentrado UF/DF. Para cada experimento, as barras representando as várias espécies K4 e K4’ são, da esquerda para direita: K4 (FucGlcNAc-Gal-SA), K4’ (Fuc-GIcNAc-Gal), K4’ (Fuc-GIcNAc) e K4’ (Fuc). A figura 2 mostra Distribuições da Espécie K4 em rFIX Gerado em Culturas em Frasco de Agitação. Para cada experimento, as barras representando as várias espécies K4 e K4’ são, da esquerda para direita: K4 (Fuc-GIcNAc-Gal-SA), K4’ (Fuc-GIcNAc-Gal), K4’ (Fuc-GIcNAc) e K4’ (Fuc). A figura 3 mostra Distribuições da Espécie K4 de Culturas em Frasco de Agitação com Vários Aditivos do Meio. Para cada experimento, as barras representando as várias espécies K4 e K4’ são, da esquerda para direita: K4 (Fuc-GIcNAc-Gal-SA), K4’ (Fuc-GIcNAc-Gal), K4’ (Fuc-GIcNAc) e K4’ (Fuc). A figura 4 mostra Distribuição da Espécie K4 de Culturas em Frasco de Agitação com Meio Suplementado. Para cada experimento, as barras representando as várias espécies K4 e K4’ são, da esquerda para direita: K4 (Fuc-GIcNAc-Gal-SA), K4’ (Fuc-GIcNAc-Gal), K4’ (Fuc-GIcNAc) e K4’ (Fuc). A figura 5 mostra Distribuições da Espécie K4 de Culturas em Frasco de Agitação com Vários Aditivos do Meio. Para cada experimento, as barras representando as várias espécies K4 e K4’ são, da esquerda para direita: K4 (Fuc-GIcNAc-Gal-SA), K4’ (Fuc-GIcNAc-Gal), K4’ (Fuc-GIcNAc) e K4’ (Fuc). A figura 6 mostra Distribuições da Espécie K4 de Culturas em Frasco de Agitação em Níveis de Manganês Variados. Para cada experimento, as barras representando as várias espécies K4 e K4’ são, da esquerda para direita: K4 (Fuc-GIcNAc-Gal-SA), K4’ (Fuc-GIcNAc-Gal), K4’ (FucGlcNAc) e K4’ (Fuc). A figura 7 mostra uma Comparação Gráfica da Porcentagem de Área de Pico Total para Picos de HPAEC-PED GO, G1, e G2. Para cada experimento, as barras representando os glicanos biantenários ligados a N complexos são, da esquerda para direita: GO, G1 e G2. A figura 8 mostra uma Comparação Gráfica da Porcentagem de Área de Pico Total para Picos de HPAEC-PED GO, G1, e G2. Para cada experimento, as barras representando os glicanos biantenários ligados a N complexos são, da esquerda para direita: GO, G1 e G2.
Definições
"Aminoácido": O termo "aminoácido" como usado aqui refere-se a qualquer um dos vinte aminoácidos que ocorrem naturalmente que são normalmente usados na formação de polipeptídeos, ou análogos ou derivados daqueles aminoácidos ou qualquer aminoácido que não ocorre naturalmente. Aminoácidos da presente invenção são fornecidos em meio a culturas celulares. Aminoácidos fornecidos no meio podem ser fornecidos como sais ou na forma hidratada.
"Anticorpo": O termo "anticorpo" como usado aqui refere-se a uma molécula de imunoglobulina ou uma porção imunologicamente ativa de uma molécula de imunoglobulina, isto é, uma molécula que contém um sítio de ligação de antígeno que especificamente liga um antígeno, tal como um fragmento Fab ou F(ab’)2. Em certas modalidades, um anticorpo é um anticorpo natural típico conhecido àqueles de habilidade comum na técnica, por exemplo, glicoproteína compreendendo quatro cadeias de polipeptídeo: duas cadeias pesadas e duas cadeias leves. Em certas modalidades, um anticorpo é um anticorpo de cadeia única. Por exemplo, em algumas modalidades, um anticorpo de cadeia única compreende uma variante de um anticorpo natural típico em que dois ou mais membros das cadeias pesadas e/ou leves foram covalentemente ligados, por exemplo, através de uma ligação de peptídeo. Em certas modalidades, um anticorpo de cadeia única é uma proteína tendo uma estrutura de cadeia de dois polipeptídeos consistindo em uma cadeia pesada e uma leve, cadeias estas que são estabilizadas, por exemplo, por ligadores de peptídeo intercadeia, proteína esta que tem a capacidade para ligar especificamente um antígeno. Em certas modalidades, um anticorpo é um anticorpo compreendido apenas de cadeias pesadas tais como, por exemplo, aqueles encontrados naturalmente em membros da família Camelidae, incluindo lhamas e camelos (ver, por exemplo, Patente US números 6.765.087 de Casterman et al., 6.015.695 de Casterman et al., 6.005.079 e de Casterman et al., cada uma das quais é incorporada por referência em sua totalidade). Os termos "anticorpos monoclonais" e "composição de anticorpo monoclonal", como usado aqui, referem-se a uma população de moléculas de anticorpo que contêm apenas uma espécie de um sítio de ligação de antígeno e, portanto, usualmente interagem com apenas um único epítopo ou um antígeno particular. Composições de anticorpo monoclonal assim tipicamente exibem uma única afinidade de ligação para um epítopo particular com o qual elas imunorreagem. Os termos "anticorpos policlonais" e "composição de anticorpo policlonal" referem-se a populações de moléculas de anticorpo que contêm espécies múltiplas de sítios de ligação de antígeno que interagem com um antígeno particular.
"Cultura por lote": O termo "cultura por lote" como usado aqui refere-se a um método de cultivar células em que todos os componentes que basicamente serão usados na cultura das células, incluindo o meio (ver definição de "Meio" abaixo) assim como as células propriamente ditas, são fornecidos no começo do processo de cultura. Uma cultura por lote é tipicamente parada em algum ponto e as células e/ou componentes no meio são colhidas e opcionalmente purificadas.
"Biorreator": O termo "biorreator" como usado aqui refere-se a qualquer vaso usado para o crescimento de uma cultura celular de mamífero. Um biorreator pode ser de qualquer tamanho contanto que ele seja útil para a cultura de células mamíferas. Tipicamente, um tal biorreator será pelo menos de 1 litro e pode ser de 10, 100, 250, 500, 1000, 2500, 5000, 8000, 10.000, 12.000 litros ou mais, ou qualquer volume entre estes. As condições internas do biorreator, incluindo, mas não limitadas ao pH, oxigênio dissolvido e temperatura, são tipicamente controladas durante o período de cultura. Um biorreator pode ser composto de qualquer material que é adequado para manter as culturas celulares de mamíferos colocadas em suspensão em meios sob as condições de cultura da presente invenção, incluindo vidro, plástico ou metal. O termo "biorreator de produção" como usado aqui referese ao biorreator final usado na produção da glicoproteína de interesse. O volume do biorreator de produção é tipicamente de pelo menos 500 litros e pode ser de 1000, 2500, 5000, 8000, 10,000, 12,000 litros ou mais, ou qualquer volume entre estes. Uma pessoa versada na técnica estará ciente de e será capaz de escolher biorreatores adequados para o uso na prática da presente invenção.
"Densidade celular": O termo "densidade celular" como usado aqui refere-se ao número de células presentes em um volume dado de meio.
"Viabilidade celular": O termo "viabilidade celular" como usado aqui refere-se à capacidade das células em cultura para sobreviverem sob um conjunto dado de condições de cultura ou variações experimentais. O termo como usado aqui também refere-se àquela porção de células que estão vivas em um tempo particular em relação ao número total de células, vivas e mortas, na cultura neste tempo.
"Meio complexo": O termo "meio complexo" como usado aqui refere-se a um meio que contém pelo menos um componente cuja identidade ou quantidade é desconhecida ou descontrolada.
"Cultura", "Cultura celular": Estes termos como usado aqui referem-se a uma população celular que é colocada em suspensão em um meio (ver definição de "Meio" abaixo) sob condições adequadas para a sobrevi vência e/ou crescimento da população celular. Como estará claro àqueles de habilidade comum na técnica, em certas modalidades, estes termos como usado aqui referem-se à combinação compreendendo a população celular e o meio em que a população é colocada em suspensão. Em certas modalidades, as células da cultura celular compreendem células mamíferas.
"Meio definido": O termo "meio definido" como usado aqui referese a um meio em que a composição do meio tanto é conhecida quanto controlada.
"Cultura de lote alimentado": O termo "cultura de lote alimentado" como usado aqui refere-se a um método de cultivar células em que componentes adicionais são fornecidos à cultura em um tempo ou tempos subsequente ao começo do processo de cultura. Tais componentes fornecidos tipicamente compreendem componentes nutricionais para as células que foram suprimidas durante o processo de cultura. Adicional ou alternativamente, tais componentes adicionais podem incluir componentes suplementares (ver definição de "Componentes suplementares" abaixo). Em certas modalidades, componentes adicionais são fornecidos em um meio de alimentação (ver definição de "Meio de alimentação" abaixo). Uma cultura de lote alimentado é tipicamente parada em algum ponto e as células e/ou componentes no meio são colhidos e opcionalmente purificados.
"Meio de alimentação": O termo "meio de alimentação" como usado aqui refere-se a uma solução contendo nutrientes que nutrem células mamíferas em crescimento que é adicionada depois do começo da cultura celular. Um meio de alimentação pode conter componentes idênticos àqueles fornecidos no meio de cultura celular inicial. Alternativamente, um meio de alimentação pode conter um ou mais componentes adicionais além daqueles fornecidos no meio de cultura celular inicial. Adicional ou alternativamente, um meio de alimentação pode carecer de um ou mais componentes que foram fornecidos no meio de cultura celular inicial. Em certas modalidades, um ou mais componentes de um meio de alimentação são fornecidos em concentrações ou níveis idênticos ou similares às concentrações ou níveis em que estes componentes foram fornecidos no meio de cultura celular inicial. Em certas modalidades, um ou mais componentes de um meio de alimentação são fornecidos em concentrações ou níveis diferentes das concentrações ou níveis em que aqueles componentes foram fornecidos no meio de cultura celular inicial. Meios de alimentação exemplares são mostrados na Tabela 2, embora a presente invenção não seja limitada ao uso destes meios. Uma pessoa versada na técnica reconhecerá que meios de alimentação alternativos podem ser usados e/ou certas alterações podem ser feitas às composições dos meios de alimentação exemplares listados na Tabela 2. Em certas modalidades, um meio de alimentação contém componentes suplementares (ver definição de "Componentes suplementares" abaixo).
"Fragmento": O termo "fragmento" como usado aqui refere-se a um polipeptídeo que é definido como qualquer porção separada de um polipeptídeo dado que é único para ou característico deste polipeptídeo. Por exemplo, o termo como usado aqui refere-se a qualquer porção de um polipeptídeo dado que inclui pelo menos um elemento de sequência estabelecido encontrado no polipeptídeo de tamanho natural. Em certos fragmentos, o elemento de sequência estende-se sobre pelo menos 4 a 5, 10, 15, 20, 25, 30, 35, 40, 45, 50 ou mais aminoácidos do polipeptídeo de tamanho natural. Alternativa ou adicionalmente, o termo como usado aqui refere-se a qualquer porção separada de um polipeptídeo dado que retém pelo menos uma fração de pelo menos uma atividade do polipeptídeo de tamanho natural. Em certas modalidades, a fração de atividade retida é pelo menos 10 % da atividade do polipeptídeo de tamanho natural. Em certas modalidades, a fração of atividade retida é pelo menos 20 %, 30 %, 40 %, 50 %, 60 %, 70 %, 80 % ou 90 % da atividade do polipeptídeo de tamanho natural. Em certas modalidades, a fração da atividade retida é pelo menos 95 %, 96 %, 97 %, 98 % ou 99 % da atividade do polipeptídeo de tamanho natural. Em certas modalidades, o fragmento retém 100 % de mais da atividade do polipeptídeo de tamanho natural. Em certas modalidades, um fragmento da presente invenção contém uma sequência de peptídeo que serve como um sítio de glicosilação. Em algumas modalidades, um fragmento da presente invenção contém uma porção de um sítio de glicosilação tal que, quando ligada a um outro fragmento que contém a outra porção do sítio de glicosilação, um sítio de glicosilação funcional é reconstituído.
"Gene": O termo "gene" como usado aqui refere-se a qualquer sequência de nucleotídeo, DNA ou RNA, pelo menos alguma porção dos quais codifica um produto final separado, tipicamente, mas não limitado a, um polipeptídeo, que funciona em algum aspecto do metabolismo ou desenvolvimento celulares. Opcionalmente, o gene compreende não apenas a sequência de codificação que codifica o polipeptídeo ou outro produto final se-parado, mas também compreende regiões que precedem e/ou seguem a sequência de codificação que modula o nível basal de expressão (ver definição de "Elemento de controle genético" abaixo), e/ou sequências de intervenção ("introns") entre segmentos de codificação individuais ("éxons").
"Elemento de controle genético": O termo "elemento de controle genético" como usado aqui refere-se a qualquer elemento de sequência que modula a expressão de um gene ao qual ele é operavelmente ligado. Elementos de controle genéticos podem funcionar aumentando-se ou diminuindo-se os níveis de expressão e podem ser localizados antes, dentro ou depois da sequência de codificação. Elementos de controle genéticos podem agir em qualquer estágio da expressão do gene por regulação, por exemplo, iniciação, prolongamento ou terminação da transcrição, união de mRNA, montagem de mRNA, estabilidade de mRNA, localização de mRNA dentro da célula, iniciação, prolongamento ou terminação da tradução, ou qualquer outro estágio de expressão do gene. Elementos de controle genéticos podem funcionar individualmente ou em combinação entre si.
"Glicoproteína": O termo "glicoproteína" como usado aqui referese a uma proteína ou polipeptídeo que contém uma ou mais cadeias de oligossacarídeo covalentemente ligadas. As cadeias de oligossacarídeo podem ser compostas de um único resíduo de açúcar, uma única cadeia não ramificada de resíduos de açúcar ou podem ser compostas de uma cadeia de resíduos de açúcar que ramifica uma ou mais vezes. Em certas modalidades, cadeias de oligossacarídeo são ligadas a N. Em certas modalidades, cadeias de oligossacarídeo são ligadas a O.
"Padrão de glicosilação": O termo "padrão de glicosilação" refere-se à glicosilação observada de uma glicoproteína ou glicoproteínas dadas. Uma glicoproteína com um número maior de resíduos de açúcar covalentemente ligados na cadeia de oligossacarídeo é dito ter um padrão de glicosilação aumentado ou mais extensivo. Reciprocamente, uma glicoproteína com resíduos de açúcar menos covalentemente ligados na cadeia de oligossacarídeo é dito ter um padrão de glicosilação diminuído ou menos extensivo. O termo "padrão de glicosilação" como usado aqui também refere-se a uma distribuição característica de vários padrões de glicosilação diferentes em glicoproteínas individuais expressas de acordo com os ensinamentos da presente invenção. Neste sentido, um padrão de glicosilação aumentado significa um aumento na distribuição característica de padrões de glicosilação das glicoproteínas expressas.
"Célula hospedeira": O termo "célula hospedeira" como usado aqui refere-se a uma célula que é manipulada de acordo com a presente invenção para produzir uma glicoproteína com um padrão de glicosilação desejável como descrito aqui. Em algumas modalidades, uma célula hospedeira é uma célula mamífera.
"Hibridoma": O termo "hibridoma" como usado aqui refere-se a uma célula ou progénie de uma célula que resulta da fusão de uma célula imortalizada e uma célula que produz anticorpo. Um tal hibridoma resultante é uma célula imortalizada que produz anticorpos. Células individuais usadas para criar o hibridoma podem ser de qualquer fonte mamífera, incluindo, mas não limitada a, rato, porco, coelho, ovelha, porco, cabra, e ser humano. Em certas modalidades, um hibridoma é uma linhagem de célula de trioma, que resulta quando a progénie de fusões de mieloma hetero-híbridas, que são o produto de uma fusão entre células humanas e uma linhagem de célula de mieloma de murino, são subsequentemente fundidas com uma célula plasmática. Em certas modalidades, um hibridoma é qualquer linhagem de célula híbrida imortalizada que produz anticorpos tais como, por exemplo, quadromas (Ver, por exemplo, Milstein etal., Nature, 537:3053, 1983).
"Meio", "Meio de cultura celular", "Meio de cultura": Estes termos como usado aqui referem-se a uma solução contendo nutrientes que nutrem células mamíferas em crescimento. Tipicamente, tais soluções fornecem aminoácidos essenciais e não essenciais, vitaminas, fontes de energia, lipídeos, e microelementos requeridos pela célula para crescimento e/ou sobrevivência mínimos. Uma tal solução também pode conter componentes suplementares (ver definição de "Componentes suplementares" abaixo) que realçam o crescimento e/ou sobrevivência acima da taxa mínima, incluindo, mas não limitados a, hormônios e/ou outros fatores de crescimento, íons particulares (tais como sódio, cloreto, cálcio, magnésio, e fosfato), tampões, vitaminas, nucleosídeos ou nucleotídeos, microelementos (compostos inorgânicos usualmente presentes em concentrações finais muito baixas), aminoácidos, lipídeos, e/ou glicose ou outra fonte de energia. Em certas modali-dades, um meio é vantajosamente formulado a um pH e concentração de sal ideal para sobrevivência e proliferação celulares. Meios de cultura exemplares são mostrados na Tabela 1, embora a presente invenção não seja limitada ao uso destes meios. Uma pessoa versada na técnica reconhecerá que meios de cultura alternativos podem ser usados e/ou certas alterações podem ser feitas às composições dos meios de cultura exemplares listados na Tabela 1. Em certas modalidades, um meio é um meio de alimentação que é adicionado depois do começo da cultura celular (ver definição de "Meio de alimentação", acima).
"Polipeptídeo": O termo "polipeptídeo" como usado aqui referese uma cadeia sequencial de aminoácidos ligados entre si por intermédio de ligações de peptídeo. O termo é usado para referir-se a uma cadeia de aminoácido de qualquer comprimento, mas uma pessoa versada na técnica entenderá que o termo não é limitado a cadeias compridas e pode referir-se a uma cadeia mínima compreendendo dois aminoácidos ligados entre si por intermédio de uma ligação de peptídeo. Como é conhecido àqueles habilitados na técnica, polipeptídeos podem ser processados e/ou modificados. Por exemplo, um polipeptídeo pode ser glicosilado (ver definição de "glicoproteína" acima).
"Proteína": O termo "proteína" como usado aqui refere-se a um ou mais polipeptídeos que funcionam como uma unidade separada. Se um único polipeptídeo é a unidade de funcionamento separada e não requer associação física permanente ou temporária com outros polipeptídeos de modo a formar a unidade de funcionamento separada, os termos "polipeptídeo" e "proteína" podem ser usados trocavelmente. Se a unidade funcional separada for compreendida de mais do que um polipeptídeo que fisicamente associam-se entre si, o termo "proteína" refere-se aos polipeptídeos múltiplos que são fisicamente ligados e funcionam juntamente como a unidade separada.
"Glicoproteína recombinantemente expressa" e "Glicoproteína recombinante": Estes termos como usado aqui referem-se a uma glicoproteína expressa a partir de uma célula hospedeira que foi manipulada manualmente para expressar esta glicoproteína. Em certas modalidades, uma célula hospedeira é uma célula mamífera. Em certas modalidades, tal manipulação compreende uma ou mais modificações genéticas. Por exemplo, células hospedeiras mamíferas podem ser geneticamente modificadas pela introdução de um ou mais genes heterólogos que codificam uma glicoproteína a ser expressa. A glicoproteína heteróloga recombinantemente expressa pode ser idêntica ou similar a glicoproteínas que são normalmente expressas na célula hospedeira mamífera. Glicoproteína heteróloga recombinantemente expressa também pode ser estranha à célula hospedeira, isto é, heteróloga a glicoproteínas normalmente expressas na célula hospedeira mamífera. Em certas modalidades, uma glicoproteína heteróloga recombinantemente expressa é quimérica em que porções da glicoproteína contêm sequências de aminoácido que são idênticas ou similares a glicoproteínas normalmente expressas na célula hospedeira mamífera, enquanto outras porções são estranhas à célula hospedeira. Alternativamente, uma célula hospedeira mamífera pode ser geneticamente modificada pela ativação ou suprarregulação de um ou mais genes endógenos.
"Componentes suplementares": O termo "componentes suplementares" como usado aqui refere-se a componentes que realçam o cresci mento e/ou sobrevivência acima da taxa mínima, incluindo, mas não limitados a, hormônios e/ou outros fatores de crescimento, íons particulares (tais como sódio, cloreto, cálcio, magnésio, e fosfato), tampões, vitaminas, nucleosídeos ou nucleotídeos, microelementos (compostos inorgânicos usualmente presentes em concentrações finais muito baixas), aminoácidos, lipídeos, e/ou glicose ou outra fonte de energia. Em certas modalidades, componentes suplementares podem ser adicionados à cultura celular inicial. Em certas modalidades, componentes suplementares podem ser adicionados depois do começo da cultura celular.
"Título": O termo "título" como usado aqui refere-se à quantidade total de glicoproteína recombinantemente expressa produzida por uma cultura celular de mamífero em uma quantidade dada de volume de meio. Título é tipicamente expressado em unidades de miligramas de glicoproteína por mililitro de meio.
Descrição Detalhada de Certas Modalidades
A presente invenção fornece sistemas melhorados para a produção de glicoproteínas em cultura celular. Em particular, sistemas são fornecidos que resultam na produção de uma glicoproteína que contém um padrão de glicosilação desejável. Por exemplo, uma glicoproteína pode ter um padrão de glicosilação mais extensivo e/ou pode ter uma distribuição de cadeias de oligossacarídeo que mais estritamente assemelha-se à distribuição de cadeias de oligossacarídeo aplicadas à glicoproteína pela célula hospedeira natural. Em algumas modalidades, o uso de sistemas inventivos pode resultar na produção de uma glicoproteína com um padrão de glicosilação similar ou idêntico ao padrão de glicosilação que estaria presente se a glicoproteína fosse expressa em uma célula humana endógena. Certas modalidades da invenção são debatidas em detalhe abaixo. Aqueles de habilidade comum na técnica entenderão, entretanto, que várias modificações a estas modalidades estão dentro do escopo das reivindicações anexas. Isto é, as reivindicações e equivalentes destas que definem o escopo da presente invenção, que não são e não deveriam ser limitados a ou por esta descrição de certas modalidades.
Composições dos meios
Uma variedade ampla de meios de crescimento mamíferos pode ser usada de acordo com a presente invenção. Em certas modalidades, células podem ser cultivadas em um de uma variedade de meios quimicamente definidos, em que os componentes dos meios são tanto conhecidos quanto controlados. Em certas modalidades, as células podem ser cultivadas em um meio complexo, em que nem todos os componentes do meio são conhecidos e/ou controlados.
Meios de crescimento quimicamente definidos para cultura celular de mamífero foram extensivamente desenvolvidos e publicados durante as últimas décadas. Todos os componentes de meios definidos são bem caracterizados, e deste modo meios definidos não contêm aditivos complexos tais como soro ou hidrolisados. Formulações de meios iniciais foram desenvolvidas para permitir o crescimento celular e manutenção de viabilidade com pouca ou nenhuma preocupação pela produção de proteína. Mais recentemente, formulações de meios foram desenvolvidas com o propósito claro de suportar culturas celulares que produzem proteína e/ou glicoproteína recombinantes altamente produtivas.
Meios definidos tipicamente consistem em aproximadamente cinquenta entidades químicas em concentrações conhecidas em água. A maioria deles também contém uma ou mais proteínas bem caracterizadas tais como insulina, IGF-1, transferrina ou BSA, mas outros não requerem nenhum componente de proteína e deste modo são referidos como meios definidos isentos de proteína. Os componentes químicos dos meios caem em cinco categorias amplas: aminoácidos, vitaminas, sais inorgânicos, microelementos, e uma categoria variada que contesta a categorização pura.
Os microelementos consistem em uma variedade de sais inorgânicos incluídos em níveis micromolar ou mais baixos. Os quatro microelementos o mais comumente incluídos presentes em quase todos os meios definidos são ferro, zinco, selênio e cobre. Ferro (sais ferrosos ou férricos) e zinco são tipicamente adicionados a concentrações micromolares, enquanto os outros estão usualmente em concentrações nanomolares. Os numerosos microelementos menos comuns são usualmente adicionados em concentrações nanomolares.
Manganês é frequentemente incluído entre os microelementos como um cátion bivalente (MnCfe ou MnSO4). Em versões iniciais de meios definidos, ele foi omitido ou incluído em uma concentração alta na ordem de 1 μM (ver, por exemplo, Barnes e Sato, 1980 [Meio DMEM/F12] e Kitos et al., 1962 [Meio MD 705/1]). Em meios definidos mais recentemente desenvolvidos, manganês foi comumente incluído, mas em concentrações muito mais baixas, por exemplo, na faixa de 1 a 5 nM (ver, por exemplo, Hamilton e Ham, 1977 [Meio MCDB 301] e Cleveland e Erlanger, 1988 [meio não mencionado]).
A presente invenção abrange a descoberta de que glicoproteínas produzidas por uma cultura de células cultivadas em meios definidos contendo concentrações de manganês entre estes extremos contêm padrões de glicosilação mais extensivos do que eles de outro modo conteriam se as células fossem cultivadas em meios tradicionais, tais como aqueles descritos acima. Em certas modalidades, manganês é fornecido no meio em uma concentração entre aproximadamente 10 e 600 nM. Em certas modalidades, manganês é fornecido no meio em uma concentração entre aproximadamente 20 e 100 nM. Em certas modalidades, manganês é fornecido no meio em uma concentração de aproximadamente 10, 15, 20, 25, 30, 35, 40, 45, 50, 55, 60, 65, 70, 75, 80, 85, 90, 95, 100, 110, 120, 130, 140, 150, 160, 170, 180, 190, 200, 210, 220, 230, 240, 250, 260, 270, 280, 290, 300, 310, 320, 330, 340, 350, 360, 370, 380, 390, 400, 410, 420, 430, 440, 450, 460, 470, 480, 490, 500, 510, 520, 530, 540, 550, 560, 570, 580, 590, ou 600 nM, ou em qualquer faixa dentro destas concentrações.
A presente invenção também abrange a descoberta de que glicoproteínas produzidas por uma cultura de células cultivadas em meios definidos contendo níveis relativamente baixos de glutamina contêm padrões de glicosilação mais extensivos do que eles de outro modo conteriam se as células fossem cultivadas em meios tradicionais que contêm níveis mais altos de glutamina. Em certas modalidades, o nível inicial de glutamina no meio é menor do que ou igual a aproximadamente 8 mM. Em certas modalidades, o nível inicial de glutamina no meio é menor do que ou igual a aproximadamente 4 mM.
Uma pessoa versada na técnica será capaz de escolher a concentração de manganês exata dentro destas faixas inventivas com base nos atributos particulares de seu projeto experimental, incluindo o caráter das células a partir da qual a glicoproteína é expressa, o caráter da glicoproteína a ser produzida, e a presença ou ausência de outros componentes no meio em que as células são cultivadas. Por exemplo, diferenças entre estruturas ligadas a N e ligadas a O, ou diferenças entre estruturas de oligossacarídeo particulares dentro de cada uma destas classes amplas podem requerer concentrações de manganês diferentes no meio de crescimento de modo a produzir cadeias de oligossacarídeo mais extensivas e/ou mais naturais. Glicoproteínas
Qualquer glicoproteína que é expressível em uma célula hospedeira pode ser produzida de acordo com os presentes ensinamentos. Uma glicoproteína pode ser expressa a partir de um gene que é endógeno à célula hospedeira, ou a partir de um gene heterólogo que é introduzido na célula hospedeira. Uma glicoproteína pode ser uma que ocorre na natureza, ou pode ter alternativamente uma sequência que foi engendrada ou selecionada manualmente. Uma glicoproteína a ser produzida pode ser montada a partir de fragmentos de polipeptídeo que individualmente ocorrem na natureza, pelo menos um do qual contém uma sequência de peptídeo que serve como um sítio de glicosilação. Alternativamente, cada fragmento de polipeptídeo pode ter apenas uma porção de um sítio de glicosilação, sítio este que é reconstituído na montagem dos fragmentos de polipeptídeo. Adicional ou alternativamente, a glicoproteína engendrada pode incluir um ou mais fragmentos que não são que ocorrem naturalmente, contanto que a glicoproteína engendrada contenha pelo menos uma sequência de peptídeo que serve como um sítio de glicosilação.
Glicoproteínas que desejavelmente podem ser expressas de acordo com a presente invenção frequentemente serão selecionadas na ba se de uma atividade biológica ou química interessante ou útil. Por exemplo, a presente invenção pode ser utilizada para expressar qualquer enzima, receptor, anticorpo, hormônio, fator regulador, antígeno, agente de ligação farmacêutica ou comercialmente relevante etc. A seguinte lista de glicoproteínas que podem ser produzidas de acordo com a presente invenção é meramente exemplar na natureza, e não é intencionada a ser uma recitação limitante. Uma pessoa versada na técnica entenderá que qualquer glicoproteína pode ser expressa de acordo com a presente invenção e será capaz de selecionar a glicoproteína particular a ser produzida com base em suas necessidades particulares.
Fatores de Coagulação
Fatores de coagulação mostraram ser eficazes como agentes farmacêuticos e/ou comerciais. Dada a importância de fatores de coagulação recombinantes no tratamento de doenças tais como Hemofilia, a otimização do padrão de glicosilação de fatores de coagulação recombinantemente produzidos de acordo com a presente invenção é de interesse particular. Por exemplo, Fator IX de coagulação (Fator IX, ou "FIX") é uma glicoproteína de cadeia única cuja deficiência resulta em Hemofilia B, um distúrbio em que o sangue do sofredor é incapaz de coagular. Assim, qualquer ferimento pequeno que resulta em sangramento é potencialmente um evento potencialmente fatal.
FIX é sintetizado como um zimogênio de cadeia única que pode ser ativado a uma serina protease de cadeia dupla (Fator IXa) por liberação de um peptídeo de ativação. O domínio catalítico do Fator IXa está localizado na cadeia pesada (ver Chang et al., J. Clin. Invest., 100:4, 1997, incorporado aqui por referência). FIX tem sítios de glicosilação múltiplos incluindo tanto carboidratos ligados a N quanto ligados a O. Uma estrutura ligada a O particular em Serina 61 (Sia-α2,3-Gal-β1,4-GlcNAc-β1,3-Fuc-α1-O-Ser) foi uma vez considerada única para FIX, mas tem sido encontrada desde então em algumas outras moléculas incluindo a proteína Notch em mamíferos e Drosophila (Maloney et al, Journal of Biol. Chem., 275(13), 2000). FIX produzido por células do Ovário de Hamster Chinês ("CHO") em cultura celular exibe alguma variabilidade na cadeia de oligossacarídeo de Serina 61. Estas glicoformas diferentes, e outras glicoformas potenciais, podem ter capacidades diferentes para induzir a coagulação quando administradas a seres humanos ou animais e/ou podem ter estabilidades diferentes no sangue, resultando na coagulação menos eficaz.
Hemofilia A, que é clinicamente indistinguível de Hemofilia B, é causada por um defeito no fator de coagulação humano VIII, uma outra glicoproteína que é sintetizada como um zimogênio de cadeia única e depois processada em uma forma ativa de cadeia dupla. A presente invenção também pode ser utilizada para controlar ou alterar o padrão de glicosilação do fator de coagulação VIII de modo a modular sua atividade de coagulação. Outros fatores de coagulação de glicoproteína que podem ser produzidos e cujo padrão de glicosilação pode ser controlado ou alterado de acordo com a presente invenção incluem, por exemplo, mas não são limitados a, fator tecidual e fator de von Willebrands.
Anticorpos
Anticorpos são proteínas que têm a capacidade para ligar especificamente um antígeno particular. Dado o grande número de anticorpos correntemente em uso ou sob investigação como agentes farmacêuticos ou outros comerciais, a produção de anticorpos com padrões de glicosilação desejáveis de acordo com a presente invenção é de interesse particular. Além disso, anticorpos com padrões de glicosilação diferentes podem ser menos prováveis a iniciar uma resposta imune no indivíduo ao qual eles são administrados, resultando em um regime terapêutico mais eficaz. Adicional ou alternativamente, anticorpos com padrões de glicosilação diferentes em suas regiões constantes podem exibir uma função efetora farmacocinética ou farmacodinâmica melhorada. Adicional ou alternativamente, anticorpos com padrões de glicosilação diferentes podem ser mais estáveis nas condições de cultura celular em que eles são produzidos, por exemplo, por serem mais resistentes a proteases ou outros componentes na cultura celular, tal que um título final superior de anticorpo é produzido.
Qualquer anticorpo que pode ser expressado em uma célula hospedeira pode ser usado de acordo com os ensinamentos da presente descrição. Em algumas modalidades, um anticorpo a ser expressado é um anticorpo monoclonal. Em certas modalidades, um anticorpo monoclonal é um anticorpo quimérico. Um anticorpo quimérico contém fragmentos de aminoácido que são derivados de mais do que um organismo. Moléculas de anticorpo quimérico podem incluir, por exemplo, um domínio de ligação de an-tígeno de um anticorpo de um camundongo, rato, ou outra espécie, com regiões constantes humanas. Uma variedade de métodos para fabricar anticorpos quiméricos foram descritos (ver por exemplo, Morrison et al., Proc. Natl. Acad. Sei. U.S.A. 81, 6851, 1985; Takeda et al., Nature 314, 452, 1985, Cabilly et a!., Patente U.S. Ns 4.816.567; Boss et a!., Patente U.S. N° 4.816.397; Tanaguchi et a!., Publicação de Patente Européia EP171496; Publicação de Patente Européia 0173494, Patente do Reino Unido GB 2177096B, cada uma das quais é incorporada aqui por referência).
Em algumas modalidades, um anticorpo monoclonal é um anticorpo humanizado. Um anticorpo humanizado é um anticorpo quimérico em que a grande maioria dos resíduos de aminoácido são derivados de anticorpos humanos, minimizando assim qualquer reação imune potencial quando liberado a um paciente humano. Em anticorpos humanizados, resíduos de aminoácido na região hipervariável são substituídos com resíduos de uma espécie não humana que confere uma especificidade ou afinidade antigênica desejada. Em certas modalidades, um anticorpo humanizado tem uma sequência de aminoácido que é 80, 85, 90, 91, 92, 93, 94, 95, 96, 97, 98, 99 porcento idêntica ou superior a um anticorpo humano. Em certas modalidades, um anticorpo humanizado é otimizado pela introdução de substituições conservatives, substituições de sequência de consenso, substituições de linha germinativa e/ou retromutações. Tais moléculas de imunoglobulina al-teradas podem ser fabricadas por qualquer uma de várias técnicas conhecidas no ramo, (por exemplo, Teng et a!., Proc. Natl. Acad. Sei. U.S.A., 80, 7308-7312, 1983; Kozbor etal., Immunology Today, 4, 7279, 1983; Olsson et al., Meth. Enzymol., 92, 3-16.1982, cada um dos quais é incorporado aqui por referência). Em algumas modalidades, moléculas de imunoglobulina alte radas são fabricadas de acordo com os ensinamentos da Publicação PCT WO92/06193 ou EP 0239400, cada uma das quais é incorporada aqui por referência em sua totalidade.
Em certas modalidades, um anticorpo produzido de acordo com os ensinamentos da presente descrição pode conter uma região constante ou Fc de imunoglobulina que exibe um padrão de glicosilação melhorado. Por exemplo, um anticorpo produzido de acordo com os ensinamentos aqui pode ligar mais fortemente ou com mais especificidade a moléculas efetoras tais como receptores de complemento e/ou Fc, que podem controlar várias funções imunes do anticorpo tais como atividade de célula efetora, lise, atividade mediada por complemento, liberação de anticorpo, e meia-vida do anticorpo. Receptores de Fc típicos que ligam-se a uma região Fc de um anticorpo (por exemplo, um anticorpo de IgG) incluem, mas não são limitados a, receptores das subclasses FcyRI, FcyRII, e FcyRIII e FcRn, incluindo variantes alélicas e formas alternativamente unidas destes receptores. Receptores de Fc são revisados em Ravetch e Kinet, Annu. Rev. Immunol 9:457-92, 1991; Capei et al., Immunomethods 4:25-34,1994; e de Haas et al., J. Lab. Clin. Med. 126:330-41,1995, cada um dos quais é incorporado aqui por referência em sua totalidade.
Como apenas um exemplo não limitante, um anticorpo que pode ser produzido de acordo com os presentes ensinamentos é um anticorpo anti-ABeta. Anticorpos anti-ABeta são uma passagem potencial particularmente promissora de terapia no tratamento de doença de Alzheimer. A doença de Alzheimer (AD) é uma doença progressiva resultando em demência senil (ver geralmente: Selkoe, TINS 16:403, 1993; Hardy et al., \NO 92/13069; Selkoe, J. Neuropathol. Exp. Neurol. 53:438, 1994; Duff et al., Nature 373:476, 1995; Games et al., Nature 373:523, 1995, cada um dos quais é incorporado aqui por referência). Em geral, a doença cai em duas categorias: início tardio, que ocorre em idade avançada (65 + anos) e início precoce, que desenvolve-se bem antes do período senil, isto é, entre 35 e 60 anos. Em ambos os tipos de doença, a patologia é a mesma, mas as anormalidades tendem a ser mais severas e muito difundidas em casos que começam em uma idade mais precoce. A doença é caracterizada por pelo menos dois tipos de lesões no cérebro, emaranhados neurofibrilares e placas senis. Emaranhados neurofibrilares são depóstitos intracelulares de proteína tau associada a microtúbulo consistindo em dois filamentos trançados entre si em pares. Placas senis (isto é, placas amiloides) são áreas de neurópilo desorganizado até 150 μm cruzados com depósitos amiloides extracelulares no centro que são visíveis por análise microscópica de seções do tecido cerebral. O acúmulo de placas amiloides dentro do cérebro também está associado com a síndrome de Down e outros distúrbios cognitivos.
O principal constituinte das placas é um peptídeo denominado peptídeo ABeta ou Beta-amiloide. Peptídeo ABeta é um fragmento interno de 4-kDa de 39 a 43 aminoácidos de uma glicoproteína de transmembrana maior chamada proteína denominada proteína precursora amiloide (APP). Como um resultado do processamento proteolítico de APP por diferentes enzimas secretase, ABeta é principalmente encontrado tanto em uma forma curta, 40 aminoácidos em comprimento, quanto em uma forma longa, variando de 42 a 43 aminoácidos em comprimento. Parte do domínio de transmembrana hidrofóbico de APP é encontrada na extremidade carbóxi de ABeta, e pode responder pela capacidade de ABeta para agregar-se em placas, particularmente no caso da forma longa. O acúmulo de placas amiloides no cérebro eventualmente leva à morte de célula neuronal. Os sintomas físicos associados com este tipo de deterioração neural caracterizam a doença de Alzheimer.
Várias mutações dentro da proteína APP foram correlacionadas com a presença de doença de Alzheimer (ver, por exemplo, Goate et al., Nature 349:704, 1991 (valina717 à isoleucina); Chartier Harlan et al. Nature 353:844, 1991 (valina717 para glicina); Murrell et al., Science 254:97,1991 (valina717 para fenilalanina); Mullan et al., Nature Genet. 1:345,1992 (uma mutação dupla mudando Iisina595-metionina596 para asparagina595Ieucina596), cada um dos quais é incorporado aqui por referência em sua totalidade). Tais mutações são consideradas causar doença de Alzheimer por processamento aumentado ou alterado de APP para ABeta, particularmente processamento de APP para quantidades aumentadas da forma longa de ABeta (isto é, ABeta1-42 e ABetal 43). Mutações em outros genes, tais como os genes de presenilina, PS1 e PS2, são consideradas afetar indiretamente o processamento de APP para gerar quantidades aumentadas de ABeta de forma longa (ver Hardy, TINS 20: 154,1997, incorporado aqui por referência em sua totalidade).
Modelos de camundongo foram usados com êxito para determinar a importância de placas amiloides na doença de Alzheimer (Games et al., supra; Johnson-Wood et al., Proc. Natl. Acad. Sei. USA 94:1550, 1997, incorporado aqui por referência em sua totalidade). Em particular, quando camundongos transgênicos PDAPP, (que expressam uma forma mutante de APP humana e desenvolvem doença de Alzheimer em uma idade jovem), são injetados com a forma longa de ABeta, eles exibem tanto uma diminuição na progressão da doença de Alzheimer quanto um aumento em títulos de anticorpo ao peptídeo ABeta (Schenk etal., Nature 400, 173, 1999, incorporado aqui por referência em sua totalidade). As observações debatidas acima indicam que ABeta, particularmente em sua forma longa, é um elemento causativo na doença de Alzheimer.
O peptídeo ABeta pode existir em solução e pode ser detectado em CNS (por exemplo, CSF) e plasma. Sob certas condições, ABeta solúvel é transformado em formas fibrilares, tóxicas, de folha Beta encontradas em placas neuríticas e vasos sanguíneos cerebrais de pacientes com AD. Tratamentos envolvendo imunização com anticorpos monoclonais contra ABeta foram investigados. Tanto a imunização ativa quanto passiva foram testadas como em modelos de camundongo de AD. A imunização ativa resultou em alguma redução na carga da placa no cérebro, mas apenas por administração nasal. A imunização passiva de camundongos transgênicos PDAPP também foi investigada (Bard, et al., Nat. Med. 6:916-19, 2000, incorporado aqui por referência em sua totalidade). Foi descoberto que anticorpos que reconhecem os domínios terminais amino e centrais de ABeta estimularam a fagocitose de depósitos de ABeta, ao passo que anticorpos contra domínios próximos ao domínio terminal carbóxi não.
O mecanismo de liberação de ABeta depois da imunização passiva ou ativa está sob investigação contínua. Dois mecanismos foram propostos para a liberação eficaz, isto é, degradação central e degradação periférica. O mecanismo de degradação central conta com anticorpos que são capazes de cruzar a barreira sangue-cérebro, ligar-se a placas, e induzir a liberação de placas preexistentes. A liberação mostrou ser promovida através de uma fagocitose mediada por receptor de Fc (Bard, et al., supra). O mecanismo de degradação periférica de liberação de ABeta conta com uma interrupção do equilíbrio dinâmico de ABeta entre cérebro, CSF, e plasma na administração do anticorpo, levando ao transporte de ABeta a partir de um compartimento a um outro. ABeta centralmente derivado é transportado no CSF e no plasma onde ele é degradado. Estudos recentes concluíram que ABeta solúvel e não ligado estão envolvidos na diminuição da capacidade da memória associada com AD, mesmo sem redução na deposição amiloide no cérebro. Outros estudos são necessários para determinar a ação e/ou interação destas vias para a liberação de ABeta (Dodel, et al., The Lancet Vol. 2:215, 2003, incorporado aqui por referência em sua totalidade).
Anticorpos anti-ABeta são uma via potencialmente promissora de tratamento de AD visto que eles podem ligar-se a e liberar o ABeta ou outros componentes que compreendem as placas amiloides. Anti-ABeta produzido de acordo com os ensinamentos da presente descrição pode servir para melhor tratar a doença de Alzheimer ou outras doenças relacionadas, por exemplo, por componentes de ligação e liberação de placas amiloides mais efetivamente, liberando-se placas amiloides com menos efeitos colaterais ou menos severos, ou impedindo-se a formação ou construção de placas amiloides. Em certas modalidades, anticorpos anti-ABeta produzidos de acordo com os presentes ensinamentos são anticorpos monoclonais.
Em certas modalidades, anticorpos anti-ABeta produzidos de acordo com os presentes ensinamentos ligam especificamente à forma agregada de ABeta sem ligar-se à forma solúvel. Em certas modalidades, anticorpos anti-ABeta produzidos de acordo com os presentes ensinamentos ligam-se especificamente à forma solúvel de anti-ABeta sob condições em que eles não ligam-se à forma agregada. Em certas modalidades, anticorpos anti-ABeta produzidos de acordo com os presentes ensinamentos ligam-se tanto a formas agregadas quanto solúveis. Em certas modalidades, anticorpos anti-ABeta produzidos de acordo com os presentes ensinamentos ligam ABeta em placas. Em certas modalidades, anticorpos anti-ABeta produzidos de acordo com os presentes ensinamentos atravessam a barreira sanguecérebro. Em certas modalidades, anticorpos anti-ABeta produzidos de acordo com os presentes ensinamentos reduzem a carga amiloide em um paciente. Em certas modalidades, anticorpos anti-ABeta produzidos de acordo com os presentes ensinamentos reduzem distrofia neurítica em um paciente. Em certas modalidades, anticorpos anti-ABeta podem manter a arquitetura sináptica (por exemplo, sinaptofisina).
De acordo com algumas modalidades, anticorpos anti-ABeta produzidos de acordo com os presentes ensinamentos ligam-se a um epítopo dentro de resíduos 13 a 28 de ABeta (com o primeiro resíduo terminal N de ABeta natural designado 1). Em algumas modalidades, anticorpos antiABeta produzidos de acordo com os presentes ensinamentos ligam-se a um epítopo dentro dos resíduos 19 a 22 de ABeta. Em algumas modalidades, anticorpos monoclonais múltiplos tendo especificidades de ligação a diferentes epítopos anti-ABeta são usados. Por exemplo, em algumas modalidades, um anticorpo específico para um epítopo dentro dos resíduos 19 a 22 de ABeta é coadministrado com um anticorpo específico para um epítopo fora dos resíduos 19 a 22 de ABeta. Tais anticorpos podem ser administrados sequencial ou simultaneamente. Anticorpos para componentes amiloides exceto ABeta também podem ser usados (por exemplo, administrados ou co-administrados).
Em certas modalidades, anticorpos anti-ABeta produzidos de acordo com os presentes ensinamentos ligam-se a um epítopo de ABeta mais fortemente ou com mais especificidade do que anticorpos anti-ABeta de outro modo produzidos. Especificidade do epítopo de um anticorpo pode ser determinada por técnicas conhecidas, por exemplo, formando-se uma biblioteca de exibição de fago em que membros diferentes exibem subsequências diferentes de ABeta. A biblioteca de exibição de fago depois pode ser selecionada quanto aos membros que especificamente ligam-se a um anticorpo sob teste. Uma família de sequências é isolada. Tipicamente, uma tal família contém uma sequência de núcleo comum, e comprimentos variados de sequências de flanqueamento em membros diferentes. A sequência de núcleo mais curta que mostra ligação específica ao anticorpo tipicamente define o epítopo ligado pelo anticorpo. Alternativa ou adicionalmente, anticorpos podem ser testados quanto à especificidade do epítopo em um ensaio de competição com um anticorpo cuja especificidade do epítopo já foi determinada. Por exemplo, anticorpos que competem com o anticorpo 15C11 pela ligação a ABeta são considerados ligar-se ao mesmo epítopo ou similar como 15C11, isto é, dentro dos resíduos 19 a 22 de ABeta. Em certas modalidades, a triagem de anticorpos quanto à especificidade do epítopo é um prognosticador útil da eficácia terapêutica. Por exemplo, um anticorpo determinado para ligar-se a um epítopo dentro dos resíduos 13 a 28 (por exemplo, a Aβ 19 a 22) de ABeta é provável ser eficaz na prevenção e tratamento de doença de Alzheimer de acordo com as metodologias da presente invenção.
Anticorpos que especificamente ligam-se a um segmento preferido de ABeta sem ligação a outras regiões de ABeta têm várias vantagens em relação a anticorpos monoclonais que ligam-se a outras regiões, ou a soros policlonais a ABeta intacto. Dentre outras coisas, para dosagens de massa igual, dosagens de anticorpos que especificamente ligam-se a segmentos preferido contêm uma dosagem molar mais alta de anticorpos eficazes em liberar placas amiloides. Também, anticorpos que especificamente ligam-se a segmentos preferidos podem induzir uma resposta de liberação contra depósitos amiloides sem induzir uma resposta de liberação contra polipeptídeo de APP intacto, reduzindo deste modo os efeitos colaterais potenciais.
Em certas modalidades, anticorpos monoclonais, quiméricos, de cadeia única, ou humanizados descritos acima podem conter resíduos de aminoácido que não ocorrem naturalmente em qualquer anticorpo em qual quer espécie na natureza. Tais resíduos estranhos podem ser utilizados, por exemplo, para conferir especificidade, afinidade ou função efetora nova ou modificada no anticorpo monoclonal, quimérico, de cadeia única ou humanizado.
Enzimas
Uma outra classe de glicoproteínas que mostraram ser eficazes como agentes farmacêuticos e/ou comerciais inclui enzimas. Enzimas podem ser glicoproteínas cujo padrão de glicosilação afeta a atividade enzimática. Assim, a produção de enzimas com padrões de glicosilação desejáveis de acordo com a presente invenção também é de interesse particular.
Como apenas um exemplo não limitante, uma deficiência em glucocerebrosidase (GCR) resulta em uma condição conhecida como doença de Gaucher, que é causada por um acúmulo de glucocerebrosidase em lisossomos de certas células. Pacientes com doença de Gaucher exibem uma faixa de sintomas incluindo esplenomegalia, hepatomegalia, distúrbio esquelético, trombocitopenia e anemia. Friedman e Hayes mostraram que GCR recombinante (rGCR) contendo uma única substituição na sequência de aminoácido primária exibiu um padrão de glicosilação alterado, especificamente um aumento em resíduos de fucose e N-acetil glicosamina comparado a GCR que ocorre naturalmente (ver Patente dos Estados Unidos número 5.549.892).
Friedman e Hayes também demonstraram que esta rGCR exibiu propriedades farmacocinéticas melhoradas comparada à rGCR que ocorre naturalmente. Por exemplo, aproximadamente duas vezes mais rGCR alvejou células de Kupffer hepáticas do que GCR que ocorre naturalmente. Embora as sequências de aminoácido primárias das duas proteínas diferissem em um único resíduo, Friedman e Hayes supuseram que o padrão de glicosilação alterado de rGCR também pode influenciar o alvejamento a células de Kupffer.
Uma pessoa versada na técnica estará ciente de outros exemplos de enzimas conhecidos que exibem propriedades enzimáticas, farmacocinéticas e/ou farmacodinâmicas alteradas que resultam de uma alteração em seus padrões de glicosilação.
Fatores de crescimento e Outras Moléculas de Sinalização Uma outra classe de glicoproteínas que mostraram ser eficazes como agentes farmacêuticos e/ou comerciais inclui fatores de crescimento e outras moléculas de sinalização. Assim, a produção de receptores com padrões de glicosilação desejáveis de acordo com a presente invenção também é de interesse particular. Fatores de crescimento são tipicamente glicoproteínas que são secretadas por células e ligam-se a e ativam receptores em outras células, iniciando uma mudança metabólica ou desenvolvente na célula receptora.
Exemplos não limitantes de fatores de crescimento mamíferos e outras moléculas de sinalização incluem citocinas; fator de crescimento epidérmico (EGF); fator de crescimento derivado de plaqueta (PDGF); fatores de crescimento de fibroblasto (FGFs) tais como FGF-5; fator-l e -II de crescimento semelhante à insulina (IGF-I e IGF-II); des(1-3) -IGF-I (IGF-I cerebral), proteínas de ligação de fator de crescimento semelhante à insulina; proteínas CD tais como CD-3, CD-4, CD-8, e CD-19; eritropoietina; fatores osteoindutivos; imunotoxinas; proteínas morfogenéticas ósseas (BMPs); interferons tais como interferon-alfa, -beta, e -gama; fatores de estimulação de colônia (CSFs), por exemplo, M-CSF, GM-CSF, e G-CSF; a maioria das interleucinas; fator de necrose tumoral (TNF) beta; hormônio folículo estimulante; calcitonina; hormônio luteinizante; fatores anticoagulação tais como Proteína C; fator natriurético atrial; tensoativo pulmonar; ativadores de plasminogênio, tais como uroquinase ou ativador de plasminogênio do tipo de urina ou tecido humanos (t-PA); fator de crescimento hematopoiético; e encefalinase. Uma pessoa versada na técnica estará ciente de outros fatores de crescimento ou moléculas de sinalização que podem ser expressos de acordo com a presente invenção.
Alterações específicas no padrão de glicosilação de fatores de crescimento ou outras moléculas de sinalização foram mostradas terem efeitos dramáticos sobre suas propriedades terapêuticas. Como apenas um exemplo não limitante, um método comum de tratamento para pacientes que sofrem de anemia crônica é fornecê-los com injeções frequentes de eritropoietina humana recombinante (rHuEPO) de modo a reforçar sua produção de eritrócitos. Um análogo de rHuEPO, darbepoetina alfa (Aranesp®), foi desenvolvido para ter uma duração mais longa no corpo do que rHuEPO nor5 mal. A diferença primária entre darbepoetina alfa e rHuEPO é a presença de duas cadeias de oligossacarídeo ligadas a N contendo ácido siálico extra. A produção de darbepoetina alfa foi realizada usando glicoengenharia in vitro (ver Elliott et al., Nature Biotechnology 21(4):414-21, 2003). Elliott et al. usaram mutagênese in vitro para incorporar sítios de glicosilação extras na ca10 deia principal de polipeptídeo rHuEPO, resultando na expressão do análogo de darbepoetina alfa. As cadeias de oligossacarídeo extras estão localizadas distais ao sítio de ligação de receptor de EPO e aparentemente não interferem com a ligação do receptor. Entretanto, a meia-vida de darbepoetina alfa é até três vezes mais alta do que rHuEPO, resultando em um agente tera15 pêutico muito mais eficaz.
Este exemplo demonstra que alterações em um fator de crescimento ou outro padrão de glicosilação de molécula de sinalização podem ter efeitos dramáticos sobre a estabilidade e/ou atividade in vivo de uma glicoproteína terapêutica. Assim, a expressão de um fator de crescimento ou ou20 tra molécula de sinalização de interesse de acordo com os ensinamentos da presente invenção pode resultar no fator de crescimento ou molécula de sinalização expressos tendo um padrão de glicosilação melhorado e propriedades terapêuticas melhoradas.
Receptores
Uma outra classe de glicoproteínas que mostraram ser eficazes como agentes farmacêuticos e/ou comerciais são receptores. Assim, a produção de receptores com padrões de glicosilação desejáveis de acordo com a presente invenção também é de interesse particular. Receptores são tipicamente glicoproteínas de transmembrana que funcionam reconhecendo-se 30 um ligantede sinalização extracelular. Além do domínio de reconhecimento de ligando, receptores frequentemente têm um domínio de proteína quinase que inicia uma via de sinalização fosforilando-se moléculas intracelulares alvo na ligação do ligando, levando a mudanças desenvolventes ou metabólicas dentro da célula.
Em certas modalidades, o receptor de glicoproteína a ser produzido de acordo com a presente invenção é um receptor tirosina quinase (RTK). A família de RTK inclui receptores que são cruciais para uma variedade de funções de numerosos tipos celulares (ver, por exemplo, Yarden e Ullrich, Ann. Rev. Biochem. 57:433-478, 1988; Ullrich e Schlessinger, Cell 61:243-254, 1990, incorporado aqui por referência). Exemplos não limitantes de RTKs incluem membros da família do receptor de fator do crescimento de fibroblasto (FGF), membros da família do receptor do fator de crescimento epidérmico (EGF), receptor do fator de crescimento derivado de plaqueta (PDGF), tirosina quinase com receptores de imunoglobulina e domínios de homologia de EGF-1 (TIE-1) e TIE-2 (Sato et al., Nature 376(6535):70-74, 1995) e receptor de c-Met, alguns dos quais foram sugeridos para promover angiogênese, direta ou indiretamente (Mustonen e Alitalo, J. Cell Biol. 129:895-898, 1995). Outros exemplos não limitantes de RTK’s incluem quinase 1 hepática fetal (FLK-1) (algumas vezes referida como receptor contendo domínio de inserção de quinase (KDR) (Terman et al., Oncogene 6:1677-83, 1991) ou receptor do fator de crescimento 2 de célula endotelial vascular (VEGFR-2)), tirosina quinase-1 semelhante a fms (Flt-1) (DeVries et al. Science 255;989-991, 1992; Shibuya et al., Oncogene 5:519-524, 1990), algumas vezes referida como receptor do fator de crescimento 1 de célula endotelial vascular (VEGFR-1), neuropilina-1, endoglina, endosialina, e Axl. Em certas modalidades, receptores do fator de necrose tumoral alfa e beta (TNFR-1; EP 417.563 publicado em 20 de Mar. de 1991; e TNFR-2, EP 417.014 publicado em 20 de Mar. de 1991) são expressos de acordo com a presente invenção (para revisão, ver Naismith e Sprang, J Inflamm. 47(12): 1-7, 1995-96, incorporado aqui por referência).
Em certas modalidades, um receptor de glicoproteína a ser produzido de acordo com a presente invenção é um receptor ligado à proteína G (GPCR). GPCRs são glicoproteínas que têm sete domínios de transmembrana. Na ligação de um ligante a um GPCR, um sinal é transduzido dentro da célula que resulta em uma mudança em uma propriedade biológica ou fisiológica da célula. GPCRs são um alvo principal para ação e desenvolvimento de medicamento. De fato, receptores têm levado a mais do que metade dos medicamentos correntemente conhecidos (Drews, Nature Biotechnology, 14:1516, 1996) e GPCRs representam o alvo mais importante para intervenção terapêutico com 30 % de medicamentos clinicamente prescritos que antagonizam ou agonizam um GPCR (Milligan, G. e Rees, S., TIPS, 20: 118-124, 1999). Visto que tais receptores têm uma história estabelecida, provada como alvos terapêuticos, produção de GPCRs com padrões de glicosilação desejáveis de acordo com a presente invenção também é de interesse particular. Por exemplo, domínios extracelulares de GPCRs com padrões de glicosilação desejáveis expressos de acordo com os ensinamentos da presente invenção poderiam funcionar como agentes terapêuticos importantes titulando-se ou sequestrando-se um ligante cuja ligação a um GPCR endógeno é prejudicial.
GPCRs, junto com as proteínas G e efetores (enzimas intracelulares e canais que são modulados por proteínas G), são os componentes de um sistema de sinalização modular que conecta o estado de mensageiros secundários intracelulares a entradas extracelulares. Tais genes e produtos genéticos são agentes causativos potenciais de doença.
A superfamília da proteína de GPCR agora contém mais de 250 tipos de parálogos, receptores que representam variantes geradas por duplicações de gene (ou outros processos), em oposição a ortólogos, o mesmo receptor a partir de espécies diferentes. A superfamília pode ser decomposta em cinco famílias: Família I, receptores tipificados por rodopsina e o receptor beta2-adrenérgico e correntemente representada por mais de 200 membros únicos; Família II, a família do receptor de hormônio paratireoide/calcitonina/ secretina recentemente caracterizada; Família III, a família do receptor de glutamato metabotrópico em mamíferos; Família IV, a família do receptor de cAMP, importante na quimiotaxia e desenvolvimento de D. discoideum; e Família V, os receptores de feromônio conjugado fúngicos tais como STE2.
GPCRs incluem receptores para aminas biogênicas, para mediadores de lipídeo de inflamação, hormônios de peptídeo, e mediadores de sinal sensorial. O GPCR torna-se ativado quando o receptor liga a seu ligando extracelular. Mudanças conformacionais no GPCR, que resultam da interação do receptor de ligando, afetam a afinidade de ligação de uma proteína 5 G aos domínios intracelulares de GPCR. Isto permite que GTP ligue-se com afinidade realçada à proteína G.
A ativação da proteína G por GTP leva à interação da subunidade α de proteína G com adenilato ciclase ou outros geradores de molécula mensageira secundários. Esta interação regula a atividade de adenilato ci10 clase e consequentemente a produção de uma molécula mensageira secundária, cAMP. cAMP regula a fosforilação e ativação de outras proteínas intracelulares. Alternativamente, níveis celulares de outras moléculas mensa-geiras secundárias, tais como cGMP ou eicosinoides, podem ser suprarregulados ou infrarregulados pela atividade de GPCRs. A proteína G de uma su15 bunidade é desativada por hidrólise da GTP por GTPase, e as subunidades a, Beta e y reassociam-se. A proteína G heterotrimérica depois dissocia-se a partir da adenilato ciclase ou outro gerador de molécula mensageira secundária. A atividade de GPCR também pode ser regulada por fosforilação dos domínios intrae extracelulares ou alças. 20 Receptores de glutamato formam um grupo de GPCRs que são importantes na neurotransmissão. Glutamato é o principal neurotransmissor no CNS e acredita-se que tenha papéis importantes na plasticidade neuronal, cognição, memória, aprendizagem e alguns distúrbios neurológicos tais como epilepsia, acidente vascular cerebral, e neurodegeneração (Watson, S. 25 e S. Arkinstall, 1994) The G-Protein Linked Receptor Facts Book, Academic Press, San Diego CA, pp. 130-132). Estes efeitos do glutamato são mediados por duas classes distintas de receptores denominados ionotrópico e metabotrópico. Receptores ionotrópicos contêm um canal de cátion intrínseco e medeiam ações excitatórias rápidas de glutamato. Receptores metabotrópi30 cos são moduladores, aumentando a excitabilidade da membrana de neurô-nios inibindo-se condutâncias de potássio dependente de cálcio e tanto inibindo quanto potencializando transmissão excitatória de receptores ionotrópicos. Receptores metabotrópicos são classificados em cinco subtipos com base na farmacologia agonista e vias de transdução de sinal e são amplamente distribuídos em tecidos cerebrais. A glicosilação ligada a N mostrou ser importante na função do receptor de glutamato alfa metabotrópico humano tipo 1 (mGlulalfa) (Mody et al., Neuropharmacology 38(10):1485-92, 1999). mGlulalfa é normalmente expressado, pelo menos em parte, como um dímero consistindo em monômeros de aprox. 145 e 160 KDa. Tratandose mGlulalfa com tunicamicina, um inibidor potente de glicosilação ligada a N, Mody et al. demonstraram que embora a expressão da superfície celular não fosse afetada, apenas um único peptídeo com uma massa de 130 kDa prognosticado por sua sequência de aminoácido primária foi expressado. Funcionalmente, o tratamento com tunicamicina reduziu a hidrólise de fosfoinositídeo estimulado por agonista em aproximadamente 50 % comparado às populações celulares não tratadas. Assim, o ajuste de padrões de glicosilação de GPCRs expressos de acordo com o presente sistema inventivo pode ser útil em modular a função de sinalização do GPCR expressado e potencialmente controlar ou afetar as propriedades farmacêuticas ou outras do GPCR expressado.
A família de polipeptídeo intestinal vasoativo (VIP) é um grupo de polipeptídeos relacionados cujas ações também são mediadas por GPCRs. Membros-chaves desta família são VIP propriamente dito, secretina, e fator de liberação do hormônio de crescimento (GRF). VIP tem um amplo perfil de ações fisiológicas incluindo relaxamento de músculos lisos, estimulação ou inibição da secreção em várias tecidos, modulação de várias atividades de célula imune, e várias atividades excitatórias e inibitórias no CNS. A secretina estimula a secreção de enzimas e ions no pâncreas e intestino e também está presente em pequenas quantidades no cérebro. A glicosilação do receptor de VIP mostrou ter um efeito importante sobre a ligação de seu VIP cognato (Chochola et al., J. Biol. Chem. 268: 2312-2318, 1993). Estericamente bloqueando as cadeias de oligossacarídeo tratando-se o receptor de VIP com aglutinina de germe de trigo inibiu marcantemente a ligação de VIP em uma maneira dependente de dose e reduziu a resposta de cAMP estimulada por VIP. Adicionalmente, a mutação de sítios de glicosilação ligada a N específicos no receptor de VIP resultou na retenção do receptor no retículo endoplasmático, indicando que a própria glicosilação foi crítica para liberação à superfície celular (Couvineau et al., Biochemistry 35(6): 1745-52, 5 1996). Assim, o ajuste dos padrões de glicosilação de GPCRs expressos de acordo com o presente sistema inventivo pode ser útil em modular (por exemplo, aumentando ou diminuindo) a ligação do GPCR expressado ao seu ligando cognato e potencialmente para controlar ou afetar as propriedades farmacêuticas ou outras do GPCR expressado. 10 Em geral, médicos da presente invenção selecionarão uma gli coproteína de interesse, e conhecerão sua sequência de aminoácido precisa. As técnicas da presente invenção foram aplicadas com êxito tanto a glicoproteínas ligadas a O (Exemplos 1 e 2) quanto ligadas a N (Exemplos 3 e 4), indicando que a presente invenção será útil para a expressão de glicopro15 teínas no geral. Qualquer glicoproteína dada que deve ser expressa de acordo com a presente invenção pode ter suas próprias características particulares e pode influenciar a densidade celular ou viabilidade das células cultivadas, pode ser expressa em níveis mais baixos do que uma outra glicoproteína cultivada sob condições de cultura idênticas, e pode ser diferente20 mente glicosilada em um ou mais sítios dependendo das condições de cultura exatas e etapas realizadas. Uma pessoa versada na técnica será capaz de modificar apropriadamente as etapas e composições usadas para produzir uma glicoproteína particular de acordo com os ensinamentos da presente invenção de modo a otimizar o crescimento celular e a produção e/ou o pa25 drão de glicosilação de qualquer glicoproteína expressa dada.
Em certas modalidades, inibidores do fator de necrose tumoral, na forma de receptores alfa e beta de fator de necrose tumoral (TNFR-1; EP 417.563 publicado em 20 de Mar. de 1991; e TNFR-2, EP 417.014 publicado em 20 de Mar. de 1991, cada um dos quais é incorporado aqui por referên30 cia em sua totalidade) são expressos de acordo com sistemas e métodos da presente invenção (para revisão, ver Naismith e Sprang, J Inflamm. 47(12): 1-7, 1995-96, incorporado aqui por referência em sua totalidade). De acordo com algumas modalidades, um inibidor do fator de necrose tumoral compreende um receptor de TNF solúvel. Em certas modalidades, um inibidor do fator de necrose tumoral compreende um TNFR-lg solúvel. Em certas modalidades, inibidores de TNF da presente invenção são formas solúveis de TNFRI e TNFRII. Em certas modalidades, inibidores de TNF da presente invenção são proteínas de ligação de TNF solúveis. Em certas modalidades, inibidores de TNF da presente invenção são proteínas de fusão de TNFR-lg, por exemplo, TNFR-Fc ou etanorcept. Como usado aqui, "etanorcept," refere-se a TNFR-Fc, que é um dímero de duas moléculas da porção extracelular do receptor de TNF-a p75, cada molécula consistindo em uma porção Fc de 235 aminoácidos de lgG1 humana.
Introdução de Genes para a Expressão de Glicoproteínas em Células Hospedeiras
Geralmente, uma molécula de ácido nucleico introduzida na célula codifica a glicoproteína desejada a ser expressa de acordo com a presente invenção. Alternativamente, uma molécula de ácido nucleico pode codificar um produto genético que induz a expressão da glicoproteína desejada pela célula. Por exemplo, material genético introduzido pode codificar um fator de transcrição que ativa a transcrição de uma glicoproteína endógena ou heteróloga. Alternativa ou adicionalmente, uma molécula de ácido nucleico introduzida pode aumentar a tradução ou estabilidade de uma glicoproteína expressa pela célula.
Métodos adequados para introduzir ácidos nucleicos suficientes para obter a expressão de uma glicoproteína de interesse em células hospedeiras mamíferas são conhecidos na técnica. Ver, por exemplo, Gething et a/., Nature, 293:620-625, 1981; Mantei et al., Nature, 281:40-46, 1979; Levinson et at. EP 117.060; e EP 117.058, cada um dos quais é incorporado aqui por referência. Para células mamíferas, métodos comuns de introduzir material genético em células mamíferas incluem o método de precipitação de fosfato de cálcio de Graham e van der Erb (Virology, 52:456-457, 1978) ou a lipofectamine® (Gibco BRL) Method of Hawley-Nelson (Focus 15:73, 1993). Aspectos gerais de transformações de sistema hospedeiro de célula mamífera foram descritos por Axel em Pat. U.S. N2 4.399.216 publicado em 16 agosto de 1983. Para várias técnicas para introduzir material genético em células mamíferas, ver Keown et al., Methods in Enzymology, 1989, Keown et al., Methods in Enzymology, 185:527-537, 1990, e Mansour et al., Nature, 336:348-352, 1988.
Em algumas modalidades, um ácido nucleico a ser introduzido está na forma de uma molécula de ácido nucleico exposta. Por exemplo, a molécula de ácido nucleico introduzida em uma célula pode consistir apenas do ácido nucleico que codifica a glicoproteína e os elementos de controle genéticos necessários. Alternativamente, um ácido nucleico que codifica a glicoproteína (incluindo os elementos reguladores necessários) pode estar contido dentro de um vetor de plasmídeo. Exemplos representativos não limitantes de vetores adequados para a expressão de glicoproteínas em células mamíferas incluem pCDNAI; pCD, ver Okayama, et al. Mol. Cell Biol. 5:1136-1142, 1985; pMCIneo Poli-A, ver Thomas, et al. Cell 51:503-512, 1987; um vetor de baculovírus tal como pAC 373 ou pAC 610; CDM8, ver Seed, B. Nature 329:840, 1987; e pMT2PC, ver Kaufman, et al. EMBO J. 6:187-195, 1987, cada um dos quais é incorporado aqui por referência em sua totalidade. Em algumas modalidades, uma molécula de ácido nucleico a ser introduzida em uma célula está contida dentro de um vetor virai. Por exemplo, um ácido nucleico que codifica a glicoproteína pode ser inserido no genoma virai (ou um genoma virai parcial). Elementos reguladores que conduzem a expressão da glicoproteína podem ser incluídos com o ácido nucleico inserido no genoma virai (isto é, ligado ao gene inserido no genoma virai) ou pode ser fornecido pelo genoma virai propriamente dito.
O DNA exposto pode ser introduzido em células formando-se um precipitado contendo o DNA e fosfato de cálcio. Alternativamente, o DNA exposto também pode ser introduzido em células formando-se uma mistura do DNA e DEAE-dextrano e incubando-se a mistura com as células ou incubando-se as células e o DNA juntos em um tampão apropriado e submetendo-se as células a um pulso elétrico de alta voltagem (por exemplo, por eletroporação). Um outro método para introduzir células de DNA exposto é por mistura do DNA com uma suspensão lipossomo contendo lipídeos catiônicos. O complexo de DNA/lipossomo depois é incubado com células. O DNA exposto também pode ser diretamente injetado em células, por exemplo, por microinjeção.
Alternativamente, o DNA exposto também pode ser introduzido em células complexando-se o DNA a um cátion, tal como polilisina, que é ligado a um ligante para uma receptor de superfície celular (ver por exemplo Wu, G. e Wu, C.H. J. Biol. Chem. 263:14621, 1988; Wilson et al. J. Biol. Chem. 267:963-967, 1992; e Patente U.S. N2 5.166.320, cada um dos quais é por meio desta incorporado por referência em sua totalidade). A ligação do complexo de DNA-ligante ao receptor facilita a captação do DNA por endocitose mediada por receptor.
Uso de vetores virais contendo sequências de ácido nucleico particulares, por exemplo, um cDNA que codifica uma glicoproteína, é um método comum para introduzir sequências de ácido nucleico em uma célula. A infecção de células com um vetor virai tem a vantagem de que uma grande proporção de células recebem o ácido nucleico, que pode obviar a necessidade para a seleção de células que receberam o ácido nucleico. Adicionalmente, moléculas codificadas dentro do vetor virai, por exemplo, por um cDNA contido no vetor virai, são geralmente expressas eficientemente em células que têm ácido nucleico de vetor virai absorvido.
Retrovirus defeituosos são bem caracterizados para o uso na transferência de gene para propósitos de terapia genética (para uma revisão ver Miller, A.D. Blood 76:271, 1990). Um retrovirus recombinante pode ser construído tendo um ácido nucleico que codifica uma glicoproteína de interesse inserido no retrogenoma virai. Adicionalmente, porções do retrogenoma virai podem ser removidas para tornar a replicação do retrovirus defeituosa. Um tal retrovirus de replicação defeituosa depois é empacotado em virions que podem ser usados para infectar uma célula alvo através do uso de um vírus ajudante por técnicas padrão.
O genoma de um adenovirus pode ser manipulado tal que ele codifica e expressa uma glicoproteína de interesse mas é inativado em ter mos de sua capacidade para replicar em um ciclo de vida virai lítico normal. Ver, por exemplo, Berkneret al. BioTechniques 6:616, 1988; Rosenfeld et al. Science 252:431-434, 1991; e Rosenfeld et al. Cell 68:143-155, 1992. Adenovetores virais adequados derivados da cepa de adenovirus Ad tipo 5 dl324 ou outras cepas de adenovirus (por exemplo, Ad2, Ad3, Ad7 etc.) são conhecidos àqueles habilitados na técnica. Adenovirus recombinantes são vantajosos em que eles não requerem que células em divisão sejam veículos de liberação de gene eficazes e podem ser usados para infectar uma variedade ampla de tipos celulares, incluindo epitélio das vias aéreas (Rosenfeld et al., 1992, citado supra), células endoteliais (Lemarchand et al., Proc. Natl. Acad. Sei. USA 89:6482-6486, 1992), hepatócitos (Herz e Gerard, Proc. Natl. Acad. Sci. USA 90:2812-2816, 1993) e células musculares (Quantin et al., Proc. Natl. Acad. Sci. USA 89:2581-2584, 1992). Adicionalmente, o DNA adenoviral introduzido (e DNA estranha contido neste) não é integrado no genoma de uma célula hospedeira, mas permanece epissômico, evitando deste modo problemas potenciais que podem ocorrer como um resultado da mutagênese insercional em situações onde a introdução de DNA torna-se integrada no genoma do hospedeiro (por exemplo, DNA retroviral). Além disso, a capacidade de carregamento do adenogenoma virai para DNA estranho é grande (até 8 quilobases) em relação a outros vetores de liberação de gene (Berkner et al. citado supra; Haj-Ahmand e Graham, J. Virol. 57:267, 1986). A maioria de vetores adenovirais defeituosos de replicação correntemente em uso são suprimidos para todos ou partes dos genes virais E1 e E3, mas retêm tanto quanto 80 % do material genético adenoviral.
Vírus adeno-associado (AAV) é um vírus defeituoso que ocorre naturalmente que requer um outro vírus, tal como um adenovirus ou um vírus do herpes, como um vírus ajudante para a replicação eficiente e um ciclo de vida produtivo. (Para uma revisão ver Muzyczka et al. Curr. Topics in Micro. and Immunol., 158:97-129, 1992). Ele também é um dos poucos vírus que podem integrar seu DNA em células não em divisão, e exibe uma alta frequência de integração estável (ver por exemplo, Flotte et al., Am. J. Respir. Cell. Mol. Biol. 7:349-356, 1992; Samulski et al., J. Virol. 63:3822-3828, 1989; e McLaughlin et al., J. Virol. 62:1963-1973, 1989). Vetores contendo tão pouco quanto 300 pares de base de AAV podem ser empacotados e podem integrar. O espaço para DNA exógeno é limitado a cerca de 4,5 kb. Um vetor de AAV tal como aquele descrito em Tratschin et al. (Mol. Cell. Biol. 5:3251-3260, 1985) pode ser usado para introduzir o DNA nas células. Uma variedade de ácidos nucleicos foi introduzida em diferentes tipos celulares usando vetores de AAV (ver por exemplo Hermonat et al., Proc. Natl. Acad. Sei. USA 81:6466-6470, 1984; Tratschin et al., Mol. Cell. Biol. 4:2072-2081, 1985; Wondisford et al., Mol. Endocrinol. 2:32-39, 1988; Tratschin et al., J. Virol. 51:611-619, 1984; e Flotte et al., J. Biol. Chem. 268:3781-3790, 1993).
Quando o método usado para introduzir moléculas de ácido nucleico em uma população de células resulta em modificação de uma grande proporção das células e expressão eficiente da glicoproteína pelas células, a população modificada de células pode ser usada sem outro isolamento ou subclonagem de células individuais dentro da população. Isto é, pode ser suficiente a produção da glicoproteína pela população de células tal que nenhum outro isolamento de célula é necessário e a população pode ser imediatamente usada para semear uma cultura celular para a produção da glicoproteína. Alternativamente, pode ser desejável isolar e expandir uma população homogênea de células a partir de algumas células ou uma única célula que eficientemente produz a glicoproteína.
Alternativa à introdução de uma molécula de ácido nucleico em uma célula que codifica uma glicoproteína de interesse, o ácido nucleico introduzido pode codificar um outro polipeptídeo ou proteína que induz ou aumenta o nível de expressão da glicoproteína produzida endogenamente por uma célula. Por exemplo, uma célula pode ser capaz de expressar uma glicoproteína particular, mas pode falhar sem tratamento adicional da célula. Similarmente, a célula pode expressar quantidades insuficientes da glicoproteína para o propósito desejado. Assim, um agente que estimula a expressão da glicoproteína de interesse pode ser usado para induzir ou aumentar a expressão desta glicoproteína pela célula. Por exemplo, a molécula de ácido nucleico introduzida pode codificar um fator de transcrição que ativa ou suprarregula a transcrição da glicoproteína de interesse. A expressão de um tai fator de transcrição por sua vez leva à expressão, ou expressão mais robusta da glicoproteína de interesse.
Em certas modalidades, um ácido nucleico que conduz a expressão da glicoproteína é estavelmente introduzido na célula hospedeira. Em certas modalidades, um ácido nucleico que conduz a expressão da glicoproteína é transitoriamente introduzido na célula hospedeira. Uma pessoa versada na técnica será capaz de escolher se introduz estável ou transitoriamente um ácido nucleico na célula com base em suas necessidades experimentais.
Um gene que codifica uma glicoproteína de interesse opcionalmente pode ser ligado a um ou mais elementos de controle genéticos reguladores. Em certas modalidades, um elemento de controle genético conduz a expressão constitutiva da glicoproteína. Em certas modalidades, um elemento de controle genético que fornece expressão induzível de um gene que codifica a glicoproteína de interesse pode ser usado. O uso de um elemento de controle genético induzível (por exemplo, um promotor induzível) leva em consideração a modulação da produção da glicoproteína na célula. Exemplos não limitantes de elementos de controle genéticos induzíveis potencialmente úteis para o uso em células eucarióticas incluem elementos regulados por hormônio (por exemplo, ver Mader, S. e White, J.H., Proc. Natl. Acad. Sci. USA 90:5603-5607, 1993), elementos regulados por ligando sintéticos (ver, por exemplo Spencer, D.M. et al., Science 262:1019-1024, 1993) e elementos regulados por radiação ionizante (por exemplo, ver Manome, Y. et al., Biochemistry 32:10607-10613, 1993; Datta, R. et al., Proc. Natl. Acad. Sci. USA 89:10149-10153, 1992). Sistemas reguladores específicos de célula adicionais ou outros conhecidos na técnica podem ser usados de acordo com a invenção.
Uma pessoa versada na técnica será capaz de escolher e, opcionalmente, modificar apropriadamente o método de introduzir genes que fazem com que a célula expresse a glicoproteína de interesse de acordo com os ensinamentos da presente invenção.
Células
Qualquer célula hospedeira suscetível à cultura celular, e à expressarão de glicoproteínas, pode ser utilizada de acordo com a presente invenção. Em certas modalidades, uma célula hospedeira é mamífera. Exemplos não limitantes de células mamíferas que podem ser usadas de acordo com a presente invenção incluem linhagem de mieloma de camundongo BALB/c (NSO/I, ECACC No: 85110503); retinoblastos humanos (PER.C6 (CruCell, Leiden, The Netherlands)); linhagem CV1 de rim de macaco transformada por SV40 (COS-7, ATCC CRL 1651); linhagem de rim embrionária humana (293 ou 293 células subclonadas para o crescimento em cultura de suspensão, Graham et al., J. Gen Virol., 36:59,1977); células do rim de filhote de hamster (BHK, ATCC CCL 10); células do Ovário de Hamster Chinês +/-DHFR (CHO, Urlaub e Chasin, Proc. Natl. Acad. Sci. USA, 77:4216, 1980); células de sertoli de camundongo (TM4, Mather, Biol. Reprod., 23:243-251, 1980); células do rim de macaco (CV1 ATCC CCL 70); células do rim de cercopiteco verde (VERO-76, ATCC CRL-1 587); células de carcinoma cervical humanas (HeLa, ATCC CCL 2); células do rim caninas (MDCK, ATCC CCL 34); células hepáticas de rato búfalo (BRL 3A, ATCC CRL 1442); células pulmonares humanas (W138, ATCC CCL 75); células hepáticas humanas (Hep G2, HB 8065); tumor mamário de camundongo (MMT 060562, ATCC CCL51); células de TRI (Mather et al., Annals N.Y. Acad. Sci., 383:44-68, 1982); células de MRC 5; células de FS4; e um linhagem de hepatoma humano (Hep G2).
Adicionalmente, qualquer número de linhagens de célula de hibridoma comercial e não comercialmente disponíveis que expressam glicoproteínas pode ser utilizado de acordo com a presente invenção. Uma pessoa habilitada na técnica avaliará que linhagens de célula de hibridoma podem ter necessidades nutricionais diferentes e/ou podem requerer condições de cultura diferentes para o crescimento ideal e expressão de glicoproteína, e será capaz de modificar as condições conforme necessário.
Como observado acima, em muitos exemplos as células serão selecionadas ou engendradas para produzir altos níveis de glicoproteína.
Frequentemente, as células serão manipuladas manualmente para produzir altos níveis de glicoproteína, por exemplo, por introdução de um gene que codifica a glicoproteína de interesse e/ou por introdução de elementos de controle genéticos que regulam a expressão deste gene (se endógeno ou introduzido).
Uma pessoa versada na técnica avaliará que glicoproteínas produzidas em diferentes tipos celulares pode conter padrões de glicosilação resultantes diferentes. Por exemplo, Przybylo et al. demonstraram que os padrões de glicosilação de caderinas diferiram quando expressos em células de ureter epitelial não malignas, células HCV29 transfectadas por v-raf e cânceres de célula transicional da bexiga urinária (ver Przybylo et al., Cancer Cell International, 2(1 ):6, 2002). Lifely et al. demonstraram que o padrão de glicosilação e atividade biológica de um anticorpo de IgG humanizado diferiu quando expressado em linhagens de célula CHO, de mieloma Y0 e de mieloma NS0 (ver Lifely et al., Glycobiology. 5(8):813-22, 1995). Uma pessoa versada na técnica será capaz de selecionar uma linhagem celular desejável para a produção de uma glicoproteína particular sem experimentação indevida. Não obstante de qual linhagem celular é basicamente selecionada, uma glicoproteína pode ser expressa de acordo com a presente invenção, resultando em um padrão de glicosilação mais extensivo.
Certas glicoproteínas podem ter efeitos prejudiciais sobre o crescimento celular, viabilidade celular ou alguma outra característica das células que basicamente limita a produção da glicoproteína de interesse em algum modo. Ainda entre uma população de células de um tipo particular engendrado para expressar uma glicoproteína específica, a variabilidade dentro da população celular existe tal que certas células individuais crescerão melhor, produzirão mais glicoproteína de interesse, produzirão uma glicoproteína com um padrão de glicosilação mais extensivo, ou produzirão uma glicoproteína cujo padrão de glicosilação reflete mais exatamente o pa-drão de glicosilação da glicoproteína que ocorre naturalmente. Em certas modalidades, uma linhagem celular é empiricamente selecionada pelo médico para o crescimento robusto sob as condições particulares escolhida para cultivar as células. Em algumas modalidades, células individuais engendradas para expressar uma glicoproteína particular são escolhidas para a produção em grande escala com base no crescimento celular, densidade celular final, porcentagem de viabilidade celular, título da glicoproteína expressa, extensão e composição das cadeias laterais de oligossacarídeo ou qualquer combinação destes ou quaisquer outras condições julgadas importantes pelo médico.
Cultura das Células
A presente invenção pode ser usada com qualquer método de cultura celular que é acessível à expressão de glicoproteínas. Por exemplo, células podem ser cultivadas em culturas de lote ou lote alimentado, onde a cultura é terminada depois da expressão suficiente da glicoproteína, depois da qual a glicoproteína expressa é colhida. Alternativamente, células podem ser cultivadas em culturas de perfusão, onde a cultura não é terminada e novos nutrientes e outros componentes são periódica ou continuamente adicionados à cultura, durante a qual a glicoproteína expressa é colhida periódica ou continuamente.
Células podem ser cultivadas em qualquer volume conveniente escolhido pelo médico. Por exemplo, células podem ser cultivadas em vasos de reação em pequena escala variando em volume de alguns mililitros a vários litros. Alternativamente, células podem ser cultivadas em Biorreatores comerciais em grande escala variando em volume de aproximadamente pelo menos 1 litro a 10, 100, 250, 500, 1000, 2500, 5000, 8000, 10.000, 12.000 litros ou mais, ou qualquer volume entre estes.
A temperatura de uma cultura celular será selecionada com base principalmente na faixa de temperaturas em que a cultura celular permanece viável, na faixa em que um alto nível de glicoproteína é produzido e/ou na faixa em que a glicoproteína expressa contém um padrão de glicosilação desejável. Por exemplo, células CHO crescem bem e podem produzir glicoproteínas com padrões de glicosilação desejáveis em níveis comercialmente adequados em aproximadamente 37° C. Em geral, a maioria das células mamíferas crescem bem e podem produzir glicoproteínas com padrões de glicosilação desejáveis em níveis comercialmente adequados dentro de uma faixa de cerca de 25° C a 42° C, embora métodos mostrados pela presente descrição não são limitados a estas temperaturas. Certas células mamíferas crescem bem e podem produzir glicoproteínas com padrões de glicosilação desejáveis em níveis comercialmente adequados dentro da faixa de cerca de 35° C a 40° C. Em certas modalidades, uma cultura celular é cultivada em uma temperatura de 20, 21,22, 23, 24, 25, 26, 27, 28, 29, 30, 31, 32, 33, 34, 35, 36, 37, 38, 39, 40, 41, 42, 43, 44, 45° C em um ou mais tempos durante o processo de cultura celular. Aqueles de habilidade comum na técnica serão capazes de selecionar a temperatura apropriada ou temperaturas em que crescem as células, dependendo das necessidades particulares das células e das necessidades de produção particulares do médico.
Além disso, uma cultura pode ser submetida a uma ou mais mudanças de temperatura durante o curso da cultura. Quando da mudança da temperatura de uma cultura, a mudança da temperatura pode ser relativamente gradual. Por exemplo, ela pode consumir várias horas ou dias para completar a mudança de temperatura. Alternativamente, a mudança de temperatura pode ser relativamente abrupta. A temperatura pode ser constantemente aumentada ou diminuída durante o processo de cultura. Alternativamente, a temperatura pode ser aumentada ou diminuída por quantidades separadas em vários tempos durante o processo de cultura. A(s) temperatura^) subsequente(s) ou faixa(s) de temperatura podem ser mais baixas do que ou mais altas do que a(s) temperatura(s) inicial(is) ou anterior(es) ou faixa(s) de temperatura. Uma pessoa versada na técnica entenderá que múltiplas mudanças de temperatura diferentes são abrangidas nesta forma de realização. Por exemplo, a temperatura pode ser mudada uma vez (a uma temperatura mais alta ou mais baixa ou faixa de temperatura), as células mantidas nesta temperatura ou faixa de temperatura durante um certo período de tempo, depois do qual a temperatura pode ser mudada novamente para uma nova temperatura ou faixa de temperatura, que pode ser mais alta ou mais baixa do que a temperatura ou faixa de temperatura da temperatura anterior ou faixa de temperatura. A temperatura da cultura depois de cada mudança diferente pode ser constante ou pode ser mantida dentro de uma certa faixa de temperaturas.
Como com a temperatura inicial ou faixa de temperatura, a temperatura ou faixa de temperatura de uma cultura celular depois da(s) mudança(s) de temperatura é geralmente selecionada com base principalmente na(s) temperatura(s) em que a cultura celular permanece viável, na faixa em que um alto nível de glicoproteína é produzido e/ou na faixa em que a glicoproteína expressa contém um padrão de glicosilação desejável. Em geral, a maioria das células mamíferas permanecem viáveis e expressam glicoproteínas com padrões de glicosilação desejáveis em níveis comercialmente adequados dentro de uma faixa de cerca de 25° C a 42° C, embora métodos mostrados pela presente descrição não são limitados a estas temperaturas. Em certas modalidades, células mamíferas permanecem viáveis e expressam glicoproteínas com padrões de glicosilação desejáveis em níveis comercialmente adequados dentro de uma faixa de cerca de 25° C a 35° C. Aqueles de habilidade comum na técnica serão capazes de selecionar temperatura(s) apropriada(s) ou faixa(s) de temperatura em que crescem as células, dependendo das necessidades particulares das células e dos requeri-mentos de produção particulares do médico. As células podem ser cultivadas por qualquer quantidade de tempo, dependendo das necessidades do médico e do requerimento das células propriamente ditas.
Em certas modalidades, reações de lote e lote alimentado são terminadas uma vez que a glicoproteína expressa atinge um título suficientemente alto e/ou uma vez que a glicoproteína expressa exibe um padrão de glicosilação desejável, como determinado pelas necessidades do médico. Adicional ou alternativamente, reações de lote e lote alimentado podem ser terminadas uma vez que as células atingem uma densidade suficientemente alta, como determinado pelas necessidades do médico. Por exemplo, a cultura pode ser terminada uma vez que as células atingem 1, 5, 10, 15, 20, 25, 30, 35, 40, 45, 50, 55, 60, 65, 70, 75, 80, 85, 90, 95 ou 99 por cento de densidade celular viável máxima. Adicional ou alternativamente, reações de lote e lote alimentado podem ser terminadas antes do acúmulo excessivo de produtos residuais metabólicos tais como lactato e amónio.
Em certos casos, pode ser benéfico suplementar uma cultura celular durante a fase de produção subsequente com nutrientes ou outros componentes do meio que foram suprimidos ou metabolizados pelas células. Como exemplos não limitantes, pode ser benéfico suplementar uma cultura celular com hormônios e/ou outros fatores de crescimento, ions inorgânicos (tais como, por exemplo, sódio, cloreto, cálcio, magnésio, e fosfato), tampões, vitaminas, nucleosídeos ou nucleotídeos, microelementos (compostos inorgânicos usualmente presentes em concentrações finais muito baixas), aminoácidos, lipídeos, ou glicose ou outra fonte de energia. Tais componentes suplementares podem todos ser adicionados à cultura celular de uma vez, ou eles podem ser fornecidos à cultura celular em uma série de adições.
Em certas modalidades, células são cultivadas de acordo com qualquer um dos métodos de cultura celular descritos no Pedido de Patente Provisório dos Estados Unidos Série n9 60/605.097, incorporado aqui por referência. Em certas modalidades, as células são cultivada sob uma ou mais das condições descritas no Pedido de Patente dos Estados Unidos Série n9 11/213.308, incorporado aqui por referência.
Uma pessoa versada na técnica será capaz de adaptar condições de cultura celular específicas de modo a otimizar certas características da cultura celular incluindo, mas não limitadas a taxa de crescimento, viabilidade celular, densidade celular final da cultura celular, concentração final de subprodutos metabólicos prejudiciais tais como lactato e amónio, título final da glicoproteína expressa, extensão e composição das cadeias laterais de oligossacarídeo ou qualquer combinação destes ou outras condições julgadas importantes pelo médico.
Isolamento da Glicoproteína Expressa Em geral, tipicamente será desejável isolar e/ou purificar glicoproteínas expressas de acordo com a presente invenção. Em certas modalidades, a glicoproteína expressa é secretada no meio e assim células e outros sólidos podem ser removidos, como por centrifugação ou filtração, por exemplo, como uma primeira etapa no processo de purificação.
Alternativamente, a glicoproteína expressa pode ser ligada à superfície da célula hospedeira. Por exemplo, os meios podem ser removidos e as células hospedeiras que expressam a glicoproteína são lisadas como uma primeira etapa no processo de purificação. A lise de células hospedeiras mamíferas pode ser obtida por qualquer número de meios bem conhecidos àqueles de habilidade comum na técnica, incluindo interrupção física por pérolas de vidro e exposição a condições de pH alto.
A glicoproteína expressa pode ser isolada e purificada por métodos padrão incluindo, mas não limitados a, cromatografia (por exemplo, troca de íon, afinidade, exclusão por tamanho, e cromatografia de hidroxiapatita), filtração de gel, centrifugação, ou solubilidade diferencial, precipitação de etanol e/ou por qualquer outra técnica disponível para a purificação de proteínas (Ver, por exemplo, Scopes, Protein Purification Principles and Practice 2^ Edição, Springer-Verlag, Nova Iorque, 1987; Higgins, S.J. e Hames, B.D. (eds.), Protein Expression: A Practical Approach, Oxford Univ Press, 1999; e Deutscher, M.P., Simon, M.I., Abelson, J.N. (eds.), Guide to Protein Purification: Methods in Enzymology (Methods in Enzymology Series, Vol. 182), Academic Press, 1997, cada um dos quais é incorporado aqui por referência). Para cromatografia por imunoafinidade em particular, a glicoproteína pode ser isolada ligando-a a uma coluna de afinidade compreendendo anticorpos que foram promovidos contra esta glicoproteína e foram fixados a um suporte estacionário. Alternativamente, rótulos de afinidade tais como uma sequência de cobertura de influenza, poli-histidina, ou glutationa-S-transferasa podem ser ligados à glicoproteína por técnicas recombinantes padrão para levar em consideração a purificação fácil por passagem sobre a coluna de afinidade apropriada. Inibidores de protease tais como fluoreto de fenil metil sulfonila (PMSF), leupeptina, pepstatina ou aprotinina podem ser adicionados em qualquer um ou todos os estágios de modo a reduzir ou eliminar a degradação da glicoproteína durante o processo de purificação. Inibidores de protease são particularmente vantajosos quando células devem ser lisadas de modo a isolar e purificar a glicoproteína expressa. Adicional ou alter nativamente, inibidores de glicosidase podem ser adicionados em qualquer um ou todos os estágios de modo a reduzir ou eliminar a retificação enzimática das cadeias de oligossacarídeo covalentemente ligadas.
Glicoproteínas expressas de acordo com a presente invenção podem ter padrões de glicosilação mais extensivo, ou de outro modo alterados do que eles teriam se cultivados sob condições de cultura celular tradicionais. Assim, um benefício prático da presente invenção que pode ser explorado na etapa de purificação é que os resíduos de açúcar adicionais e/ou alterados em uma glicoproteína cultivada de acordo com alguns dos métodos inventivos presentes podem conferir sobre ela propriedades bioquímicas distintas que podem ser usadas pelo médico para purificar esta glicoproteína mais facilmente, ou a uma pureza maior, do que seria possível para uma glicoproteína cultivada de acordo com métodos mais tradicionais.
Uma pessoa versada na técnica avaliará que a técnica de purificação exata variará dependendo do caráter da glicoproteína a ser purificada, do caráter das células a partir das quais a glicoproteína é expressa, e/ou da composição do meio em que as células foram cultivadas.
Composições Imunoqênicas Glicoproteínas produzidas de acordo com os ensinamentos da presente descrição também podem ser usadas em composições imunogênicas, por exemplo, como vacinas. Em certas modalidades, um padrão de glicosilação melhorado obtido produzindo-se glicoproteínas de acordo com certos métodos da presente invenção pode resultar em uma composição imunogênica mais eficaz. Por exemplo, a composição imunogênica contendo a glicoproteína produzida pode provocar uma resposta imune mais eficaz em que o sistema imune do paciente produz um número maior de anticorpos para a glicoproteína e/ou produz anticorpos que exibem uma maior especificidade para uma glicoproteína imunogênica. Adicional ou alternativamente, uma tal glicoproteína pode provocar uma resposta imune com menos efeitos colaterais e/ou menos severos. Em certas modalidades, composições imunogênicas da invenção compreendem uma ou mais glicoproteínas. Adicional ou alternativamente, uma composição imunogênica inventiva pode incluir um ou mais portadores fisiologicamente aceitáveis.
Em geral, a seleção da "quantidade eficaz" apropriada ou dosagem para componentes de uma composição imunogênica inventiva é fundamentada em uma variedade de fatores, incluindo, mas não limitados, à identidade da(s) glicoproteína(s) selecionada(s) na composição imunogênica utilizada, ao padrão de glicosilação da(s) glicoproteína(s), e à condição física do paciente, o mais especialmente incluindo a saúde geral, idade e/ou peso do paciente imunizado. Como é conhecido na técnica, os métodos e vias particulares de administração e a presença de componentes adicionais nas composições imunogênicas também podem afetar as dosagens e quantidades das composições de plasmídeo de DNA. Tal seleção e ajuste a montante ou a jusante da dose eficaz está dentro da habilidade da técnica. A quantidade de composição imunogênica requerida para induzir uma resposta imune, incluindo, mas não limitada a uma resposta protetiva, ou produzir um efeito exógeno no paciente sem efeitos colaterais adversos significantes varia dependendo destes fatores. Doses adequadas são facilmente determinadas por pessoas habilitadas na técnica.
Certas composições imunogênicas da presente invenção podem conter um adjuvante. Um adjuvante é uma substância que realça a resposta imune quando administrado juntamente com um imunógeno ou antígeno. Várias citocinas ou linfocinas mostraram ter atividade de modulação imune, e assim podem ser usadas como adjuvantes, incluindo, mas não limitados, às interleucinas 1-a, 1-β, 2, 4, 5, 6, 7, 8, 10, 12 (ver, por exemplo, Patente U.S. N° 5.723.127, incorporada aqui por referência em sua totalidade), 13, 14, 15, 16, 17 e 18 (e suas formas mutantes), os interferons-a, βey, fator estimulante de colônia de granulócito-macrófago (ver, por exemplo, Patente U.S. Ns 5.078.996, incorporada aqui por referência em sua totalidade), fator estimulante de colônia de macrófago, fator estimulante de colônia de granulócito, GSF, e os fatores de necrose tumoral α e β. Ainda outros adjuvantes úteis nesta invenção incluem uma quimiocina, incluindo sem limitação, MCP1, MIP-1α, MIP-1β, e RANTES. Moléculas de adesão, tais como uma seletina, por exemplo, L-seletina, P-seletina e E-seletina também podem ser úteis como adjuvantes. Ainda outros adjuvantes úteis incluem, sem limitação, uma molécula semelhante à mucina, por exemplo, CD34, GlyCAM-1 e MadCAM1, um membro da família de integrina tal como LFA-1, VLA-1, Mac-1 e p150.95, um membro da superfamília de imunoglobulina tal como PECAM, ICAMs, por exemplo, ICAM-1, ICAM-2 e ICAM-3, CD2 e LFA-3, moléculas coestimuladoras tais como CD40 e CD40L, fatores de crescimento incluindo fator de crescimento vascular, fator de crescimento nervoso, fator de crescimento de fibroblasto, fator de crescimento epidérmico, B7.2, PDGF, BL-1, e fator de crescimento endotelial vascular, moléculas receptoras incluindo Fas, receptor de TNF, Fit, Apo-1, p55, WSL-1, DR3, TRAMP, Apo-3, AIR, LARD, NGRF, DR4, DR5, KILLER, TRAIL-R2, TRICK2, e DR6. Ainda uma outra molécula adjuvante inclui Caspase (ICE). Ver, também Publicações de Patentes Internacionais N— WO98/17799 e WO99/43839, cada uma das quais é incorporada aqui por referência em sua totalidade.
Também úteis como adjuvantes são toxinas do cólera (CT) e mutantes destas, incluindo aqueles descritos no Pedido de Patente Internacional publicado número WO 00/18434 (em que o ácido glutâmico na posição de aminoácido 29 é substituído por um outro aminoácido (exceto ácido aspártico), preferivelmente uma histidina). CTs similares ou mutantes são descritos no Pedido de Patente Internacional publicado número WO 02/098368 (em que a isoleucina na posição de aminoácido 16 é substituída por um outro aminoácido, sozinho ou em combinação com a substituição da serina na posição de aminoácido 68 por um outro aminoácido; e/ou em que a valina na posição de aminoácido 72 é substituída por um outro aminoácido). Outras toxinas de CT são descritas no Pedido de Patente Internacional publicado número WO 02/098369 (em que a arginina na posição de aminoácido 25 é substituída por um outro aminoácido; e/ou um aminoácido é inserido na posição de aminoácido 49; e/ou dois aminoácidos são inseridos em posições de aminoácido 35 e 36). Cada uma destas referências é incorporada aqui em sua totalidade.
Em certas modalidades, composições imunogênicas da presente invenção são administradas a um ser humano ou a um vertebrado não hu-
mano por uma variedade de vias incluindo, mas não limitadas a, intranasal, oral, vaginal, retal, parenteral, intradérmica, transdérmica (ver, por exemplo, Publicação de Patente Internacional N° WO 98/20734, que é por meio desta incorporada por referência em sua totalidade), intramuscular, intraperitoneal, subcutânea, intravenosa e intra-arterial. A via apropriada via pode ser selecionada dependendo da natureza da composição imunogênica usada, uma avaliação da idade, peso, sexo e saúde geral do paciente e os antígenos presentes na composição imunogênica, e/ou outros fatores conhecidos àqueles de habilidade comum na técnica.
Em certas modalidades, composições imunogênicas são administradas em tempos múltiplos. A ordem de administração da composição imunogênica e os períodos de tempo entre administrações individuais podem ser selecionados por uma pessoa versada na técnica com base em fatores relevantes conhecidos àqueles de habilidade comum na técnica, incluindo, mas não limitados, às características físicas e respostas precisas do hospedeiro para a aplicação do método.
Formulações Farmacêuticas Em certas modalidades, glicoproteínas produzidas terão atividade farmacológica e serão úteis na preparação de produtos farmacêuticos. Composições inventivas como descrito acima podem ser administradas a um paciente ou primeiro podem ser formuladas para a liberação por qualquer via disponível incluindo, mas não limitada às vias parenteral (por exemplo, intravenosa), intradérmica, subcutânea, oral, nasal, brônquica, oftálmica, transdérmica (tópica), transmucosa, retal, e vaginal. Composições inventivas farmacêuticas tipicamente incluem uma glicoproteína purificada expressa a partir de uma linhagem de célula mamífera, um agente de liberação (isto é, um polímero catiônico, transportador de peptídeo molecular, tensoativo, etc., como descrito acima) em combinação com um portador farmaceuticamente aceitável. Como usado aqui a linguagem "portador farmaceuticamente aceitável" inclui solventes, meios de dispersão, revestimentos, agentes antibacterianos e antifúngicos, agentes isotônicos e de retardo de absorção, e semelhantes, compatíveis com administração farmacêutica. Compostos ativos suplementares também podem ser incorporados nas composições. Por exemplo, uma glicoproteína produzida de acordo com a presente invenção pode ser adicionalmente conjugada a outros medicamentos para a farmacoterapia sistêmica, tais como toxinas, medicamentos citotóxicos de peso molecular baixo, modificadores de resposta biológica, e radionuclídeos (ver, por exemplo, Kunz et al., Calicheamicin derivative-carrier conjugates, US20040082764 A1).
Alternativa ou adicionalmente, uma proteína ou polipeptídeo produzidos de acordo com a presente invenção podem ser administrados em combinação com (se simultânea ou sequencialmente) um ou mais agentes farmaceuticamente ativos adicionais. Uma lista exemplar destes agentes farmaceuticamente ativos pode ser encontrada na Physicians’ Desk Reference, 55 Edição, publicado por Medical Economics Co., Inc., Montvale, NJ, 2001, incorporado aqui por referência. Para muitos destes agentes listados, dosagens e regimes farmaceuticamente eficazes são conhecidos na técnica; muitos serão apresentados no Physicians’ Desk Reference propriamente dito.
Uma composição farmacêutica é vantajosamente formulada para ser compatível com sua via intencionada de administração. Soluções ou suspensões usadas para a aplicação parenteral, intradérmica, ou subcutânea podem incluir os seguintes componentes: um diluente estéril tal como água para injeção, solução salina, óleos fixos, polietileno glicóis, glicerina, propileno glicol ou outros solventes sintéticos; agentes antibacterianos tais como álcool benzílico ou metil parabenos; antioxidantes tais como ácido ascórbico ou bissulfito de sódio; agentes quelantes tais como ácido etilenodiaminatetraacético; tampões tais como acetatos, citratos ou fosfatos e agentes para o ajuste de tonicidade tais como cloreto de sódio ou dextrose. O pH pode ser ajustado com ácidos ou bases, tais como ácido clorídrico ou hidróxido de sódio. A preparação parenteral pode ser incluída em ampolas, seringas descartáveis ou frascos de dose múltipla fabricados de vidro ou plástico.
Composições farmacêuticas adequadas para o uso injetável tipicamente incluem soluções aquosas estéreis (onde solúvel em água) ou dis persões e pós estéreis para a preparação extemporânea de soluções injetáveis estéreis ou dispersão. Para a administração intravenosa, portadores adequados incluem solução salina fisiológica, água bacteriostática, Cremophor EL® (BASF, Parsippany, NJ) ou solução salina tamponada com fosfato (PBS). Em todos os casos, a composição deve ser estéril e deve ser fluido à medida que a seringabilidade fácil existe. Certas formulações farmacêuticas da presente invenção são estáveis sob as condições de fabricação e armazenamento e devem ser preservadas contra a ação contaminante de microorganismos tais como bactérias e fungos. Em geral, um portador relevante pode ser um solvente ou meio de dispersão contendo, por exemplo, água, etanol, poliol (por exemplo, glicerol, propileno glicol, e polietileno glicol líquido, e semelhantes), e misturas adequadas destes. A fluidez apropriada pode ser mantida, por exemplo, pelo uso de um revestimento tal como lecitina, pela manutenção do tamanho de partícula necessário no caso de dispersão e pelo uso de tensoativos. A prevenção da ação de micro-organismos pode ser obtida por vários agentes antibacterianos e antifúngicos, por exemplo, parabenos, clorobutanol, fenol, ácido ascórbico, timerosal, e semelhantes. Em muitos casos, será vantajoso incluir agentes isotônicos, por exemplo, açúcares, poliálcoois tais como manitol, sorbitol, ou cloreto de sódio na composição. A absorção prolongada das composições injetáveis pode ser realizada incluindo-se na composição um agente que retarda a absorção, por exemplo, monoestearato de alumínio e gelatina.
Soluções injetáveis estéreis podem ser preparadas incorporando-se a glicoproteína purificada na quantidade necessária em um solvente apropriado com uma ou uma combinação de ingredientes enumerados acima, conforme necessário, seguido por esterilização de filtrado. Geralmente, dispersões são preparadas incorporando-se a glicoproteína purificada expressa a partir de uma linhagem de célula mamífera em um veículo estéril que contém um meio de dispersão básico e os outros ingredientes necessários a partir daqueles enumerados acima. No caso de pós estéreis para a preparação de soluções injetáveis estéreis, métodos de preparação incluem, por exemplo, secagem a vácuo e liofilização que produz um pó do ingredien te ativo mais qualquer ingrediente desejado adicional a partir de uma solução de filtrado previamente estéril deste.
Composições orais geralmente incluem um diluente inerte ou um portador comestível. Para o propósito de administração terapêutica oral, a glicoproteína purificada pode ser incorporada com excipientes e usada na forma de tabletes, comprimidos, ou cápsulas, por exemplo, cápsulas de gelatina. Composições orais também podem ser preparadas usando um portador fluido para o uso como uma solução para lavagem bucal. Agentes de ligação farmaceuticamente compatíveis e/ou materiais adjuvantes podem ser incluídos como parte da composição. Os comprimidos, pílulas, cápsulas, comprimidos e semelhantes podem conter qualquer um dos ingredientes seguintes, ou compostos de uma natureza similar: um aglutinante tal como celulose microcristalina, goma de tragacanto ou gelatina; um excipiente tal como amido ou lactose, um agente desintegrante tal como ácido algínico, Primogel, ou amido de milho; um lubrificante tal como estearato de magnésio ou Sterotes; um deslizante tal como dióxido de silício coloidal; um agente adoçante tal como sacarose ou sacarina; ou um agente flavorizante tal como hortelã-pimenta, salicilato de metila, ou flavorizante de laranja. Formulações para a liberação oral vantajosamente podem incorporar agentes para melhorar a estabilidade dentro do trato gastrointestinal e/ou para realçar a absor-ção.
Para a administração por inalação, as composições inventivas compreendendo uma glicoproteína purificada expressa a partir de uma linhagem de célula mamífera e um agente de liberação são vantajosamente liberadas na forma de uma pulverização de aerossol a partir de um recipiente pressurizado ou dispensador que contém um propulsor adequado, por exemplo, um gás tal como dióxido de carbono, ou um nebulizador. A presente invenção particularmente considera a liberação das composições usando uma pulverização nasal, inalador, ou outra liberação direta às vias aéreas superiores e/ou inferiores. A administração intranasal de vacinas de DNA dirigidas contra vírus influenza mostrou induzir respostas de célula T CD8, indicando que pelo menos algumas células no trato respiratório podem absorver o DNA quando liberadas por esta via, e os agentes de liberação da invenção realçarão a captação celular. De acordo com certas modalidades, composições compreendendo uma glicoproteína purificada expressa a partir de uma linhagem de célula mamífera e um agente de liberação são formulados como partículas porosas grandes para a administração por aerossol.
A administração sistêmica também pode ser por meios transmucosos ou transdérmicos. Para a administração transmucosa ou transdérmica, penetrantes apropriados à barreira a ser permeada são usados na formulação. Tais penetrantes são geralmente conhecidos na técnica, e incluem, por exemplo, para a administração transmucosa, detergentes, sais biliares, e derivados de ácido fusídico. A administração transmucosa pode ser realizada através do uso de pulverizações nasais ou supositórios. Para a administração transdérmica, a glicoproteína purificada e agentes de liberação são formulados em unguentos, pomadas, géis, ou cremes como geralmente conhecido na técnica.
Composições também podem ser preparadas na forma de supositórios (por exemplo, com bases de supositório convencionais tais como manteiga de cacau e outros glicerídeos) ou enemas de retenção para a liberação retal.
Em certas modalidades, composições inventivas farmacêuticas contêm excipientes opcionais tais como um anestésico local, um peptídeo, um lipídeo incluindo lipídeos catiônicos, um lipossomo ou partícula lipídica, um policátion tal como polilisina, um policátion ramificado, tridimensional tal como um dendrímero, um carboidrato, um anfífilo catiônico, um detergente, um tensoativo de benzilamônio, ou um outro composto que facilita a transferência de polinucleotídeo às células. Tais agentes facilitadores incluem os anestésicos locais bupivacaína ou tetracaína (ver por exemplo, Patente U.S. N— 5.593.972; 5.817.637; 5.380.876; 5.981.505 e 6.383.512 e Publicação de Patente Internacional N-WO98/17799, cada uma das quais é por meio desta incorporada por referência em sua totalidade).
Em certas modalidades, composições são preparadas com portadores que protegerão a glicoproteína contra a eliminação rápida do corpo, tal como uma formulação de liberação controlada, incluindo implantes e sistemas de liberação microencapsulados. Polímeros biodegradáveis, biocompatíveis podem ser usados, tais como vinil acetato de etileno, polianidridos, ácido poliglicólico, colágeno, poliortoésteres, e ácido poliláctico. Métodos para a preparação de tais formulações estarão evidentes àqueles habilitados na técnica. Os materiais também podem ser obtidos comercialmente a partir de Alza Corporation e Nova Pharmaceuticals, Inc. Suspensões lipossômicas (incluindo lipossomos alvejados a células infectadas com anticorpos monoclonais a antígenos virais) também podem ser usadas como portadores farmaceuticamente aceitáveis. Tais suspensões podem ser preparadas de acordo com métodos conhecidos àqueles habilitados na técnica, por exemplo, como descrito na Patente U.S. N2 4.522.811, incorporada aqui por referência em sua totalidade.
Pode ser vantajoso formular composições orais ou parenterais em forma de dosagem unitária para facilidade de administração e uniformidade de dosagem. Forma de dosagem unitária como usado aqui refere-se a unidades fisicamente separadas adequadas como dosagens unitárias para o paciente a ser tratado, cada unidade contendo uma quantidade predeterminada de glicoproteína ativa calculada para produzir o efeito terapêutico desejado em associação com o portador farmacêutico requerido.
Uma glicoproteína expressa de acordo com a presente invenção pode ser administrada em vários intervalos e durante períodos de tempo diferentes conforme necessário, por exemplo, uma vez por semana durante entre cerca de 1 a 10 semanas, entre 2 a 8 semanas, entre cerca de 3 a 7 semanas, cerca de 4, 5, ou 6 semanas, etc. O técnico habilitado avaliará que certos fatores podem influenciar a dosagem e regulação do tempo necessários para tratar efetivamente um paciente, incluindo, mas não limitado à severidade da doença ou distúrbio, tratamentos anteriores, a saúde geral e/ou idade do paciente, e outras doenças presentes. Geralmente, tratamento de um paciente com uma glicoproteína como descrito aqui pode incluir um único tratamento ou, em muitos casos, pode incluir uma série de tratamentos. Será entendido que doses apropriadas podem depender da potência da glicoproteína e opcionalmente podem ser adaptadas ao receptor particular, por exemplo, através de administração de doses crescentes até que uma resposta desejada pré selecionada seja obtida. Além disso, será entendido que o nível de dose específico para qualquer paciente animal particular pode depender de uma variedade de fatores incluindo a atividade da glicoproteína específica utilizada, a idade, peso corporal, saúde geral, sexo, e dieta do paciente, o tempo de administração, a via de administração, a taxa de excreção, qualquer combinação de medicamento, e/ou o grau de expressão ou atividade a ser modulado.
A presente invenção inclui o uso de composições inventivas para o tratamento de animais não humanos. Consequentemente, doses e métodos de administração podem ser selecionados de acordo com princípios conhecidos de farmacologia e medicina veterinárias. Orientação pode ser encontrada, por exemplo, em Adams, R. (ed.), Veterinary Pharmacology and Therapeutics, 8edição, Iowa State University Press; ISBN: 0813817439; 2001.
Composições inventivas farmacêuticas podem ser incluídas em um recipiente, embalagem, ou dispensador juntamente com instruções para a administração.
A descrição precedente deve ser entendida como sendo representativa apenas e não é intencionada a ser limitante. Métodos e materiais alternativos para implementar a invenção e também aplicações adicionais estarão evidentes a uma pessoa versada na técnica, e são intencionados a serem incluídos dentro das reivindicações anexas.
Exemplos
Exemplo 1: Formulações de meios
A presente invenção abrange a descoberta de que glicoproteínas produzidas por uma cultura de células cultivadas em meios de cultura contendo manganês em uma ou mais concentrações inventivas contêm padrões de glicosilação mais extensivos do que elas de outro modo conteriam se as células fossem cultivadas em meios tradicionais. Manganês pode ser adicionado a qualquer meio de cultura que é capaz de suportar o crescimen to celular. Meios de cultura exemplares aos quais manganês pode ser adicionado dentro de qualquer uma das concentrações inventivas são listados na Tabela 1, embora a presente invenção não seja limitada à utilização destes meios de cultura. Como será entendido por uma pessoa versada na téc5 nica, outros meios de cultura podem ser utilizados para cultivar células e/ou certas alterações podem ser feitas às composições dos meios de cultura exemplares listados na Tabela 1.
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Outros componentes mg/L μM mg/L μM mg/L μM mg/L μM mg/L μM Hidrocortisona 0,23 0,64 ,0864 ,24 0,036 0,0001 0,09 0,24 Putrescina*2HCI 6,48 40,22 2,48 15,39 1,080 0,0067 2,48 15,39 ácido linoléico 0,22 0,80 0,057 0,20 0,040 0,0001 0,06 0,20 ácido tióctico 0,56 2,73 0,14 0,69 0,100 0,0005 0,14 0,69 D-glicose (Dextrose) 16039 89107 11042,24 61350 8950,7 49,7 4500,0 25000 11042 61345 PVA 2560 2520,00 2400,0 2400,0 2520 0,00 Nucelina 54,00 14,00 10,000 10,00 14,00 0,00 Piruvato de sódio 54,85 498,63 54,85 500 54,995 500 110,0 1000 54,85 498,63
Em certas modalidades, as células são suplementadas em uma ou mais vezes depois que a cultura inicial é iniciada com um ou mais meios de alimentação. Meios de alimentação exemplares são listados na Tabela 2, embora a presente invenção não seja limitada à utilização destes meios de 5 alimentação. Como será entendido por uma pessoa versada na técnica, outros meios de alimentação podem ser utilizados para cultivar células e/ou certas alterações podem ser feitas às composições dos meios de alimentação exemplares listados na Tabela 2. Por exemplo, as concentrações de um ou mais componentes de tais meios de alimentação podem ser aumentadas 10 ou diminuídas para obter uma concentração desejada de tais componentes.
Em certas modalidades, a concentração de cada componente do meio de alimentação é aumentada ou diminuída pelo mesmo fator. Por exemplo, a concentração de cada componente do meio de alimentação pode ser aumentada ou diminuída em 1x, 2x, 3x, 4x, 5x, 6x, 7x, 8x, 9x, 10x, 11x, 12x, 15 13x, 14x, 15x, 16x, 17x, 18x, 19x, 20x, 25x, 30x, 35x, 40x, 45x, 50x ou mais.
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Exemplo 2: Investigação em Pequena Escala de Mapeamento de Peptídeo rFIX
Introdução: Durante a produção de substância de medicamento em massa ("BDS") com fator IX de coagulação sanguínea humano recombinante ("rFIX"), uma diferença de lote a lote foi obsen/ada na razão de área de pico relativa ("RPAR") do peptídeo de K4 dentro do mapa de peptídeo. As amostras foram preparadas por digestão com lisil endopeptidase a partir de Achromobacter lyticus ("AchroK", Wako catálogo #129-02541), e resolução subsequente por HPLC de fase reversa. O RPAR do peptídeo de K4 caiu abaixo do limite inferior de 82 % da amostra de controle do material de referência em certos lotes e atingiu um mínimo de 78 % da amostra de controle. O equilíbrio do material foi encontrado no pico de K4. A diferença entre os dois picos é inteiramente devido à extensão da glicosilação em Ser-61. A espécie K4 tem um tetrassacarídeo Sia-α2,3-Gal-β1,4-GlcNAc-β1,3-Fuc-α1O ligado à serina, enquanto a espécie K4’ que aumentou proporcionalmente tem apenas fucose.
Um experimento de cultura celular completo foi conduzido durante um período quando as diferenças no mapa de peptídeo estavam ocorrendo. Células foram cultivadas em um meio de cultura celular que foi suplementado com FeSO4, CuSO4 e cloreto de colina a 2X, 7X e 2X, respectivamente. BDS produzido por purificação em pequena escala dos lotes experimentais mostrou RPAR de K4 melhorada, mas o material de controle purificado do mesmo modo não. Os lotes de BDS ultrapassaram os requerimentos do mapa de peptídeo (> 82 % de amostra de controle), embora eles não atingissem o nível observado no material de referência. Isto indicou que a diferença observada nos mapas de RPAR é um resultado do processo de cultura celular e poderia estar relacionado a uma deficiência de nutriente.
Análises de Amostra Em Processo: As células foram removidas do meio de cultura celular por etapas de microfiltração ("MF") e ultrafiltração/diafiltração ("UF/DF"), resultando em material regularmente puro a partir de biorreatores individuais que estavam disponíveis para a análise.
Para investigar se ou não a espécie K4 está sendo degradada de volta à espécie K4’ (fucose apenas) depois da secreção da célula, uma análise modificada foi realizada em uma amostra em processo a partir do concentrado de UF/DF. Uma grande amostra do concentrado foi dividida em três alíquotas iguais. Uma foi purificada imediatamente em uma coluna de captura em pequena escala; isto serviu como um controle negativo. As outras duas foram todas incubadas durante a noite a 37° C antes de serem purificadas em uma maneira similar. Uma das alíquotas noturnas teve sialidase adicionada para remover o ácido siálico terminal da espécie K4 e no caso o ácido siálico estava bloqueando a atividade de alguma outra glicosidase. Depois da purificação em pequena escala, todas as três amostras foram analisadas quanto à espécie K4 como acima. A figura 1 mostra que não houve nenhuma degradação em qualquer amostra além daquela catalisada pela sialidase. Esta foi uma indicação muito forte de que o problema no mapa de peptídeo foi anabólico, significando que os resíduos de açúcar "perdidos" em Ser-61 nunca foram adicionados à cadeia nascente. Permaneceu possível, embora seja extremamente improvável, que a atividade glicosídica responsável por remover aqueles resíduos de açúcar foi inativada ou removida pelas etapas de MF e UF/DF. Os resultados também demonstraram a utilidade do sistema de purificação em pequena escala para analisar as amostras a montante da etapa de Q Sefarose.
Moldagem em pequena escala: Culturas de rFIX em pequena escala cultivadas em frascos de agitação foram usadas como um modelo para avaliar os efeitos de vários meios e aditivos sobre a espécie K4. Em cada caso, o meio condicionado dos frascos de agitação foi purificado diretamente (sem UF/DF) em uma coluna de captura em pequena escala usando coleta de pico com base em volume e a distribuição de K4 na amostra foi determinada.
A utilidade do modelo em pequena escala foi demonstrada usando os mesmos aditivos como no experimento completo. Adições de manganês também foram analisadas, visto que uma pesquisa de literatura descobriu que Mn++ é requerido para a atividade de glicosilação similar de uma enzima de mosca-das-frutas (ver Moloney et al., J. Biol. Chem. 275(13): 9604-9611, 2000; Bruckner et al., Nature 406: 411-415, 2000). As comparações foram realizadas sobre quatro passagens nos frascos de agitação, e os resultados são mostrados na figura 2. Injeções em duplicada para cada amostra são mostradas. "P#" indica o número de passagem de cada condição. Para P1-2, a concentração de Mn foi de 1 nM; para P3-4, ela foi de 10 nM. A diferença entre o controle e as distribuições de espécie K4 do meio suplementado é comparável à diferença observada nos biorreatores de produção. Diferenças são manifestadas depois de uma única passagem e múltiplas passagens não revelam nenhuma tendência.
Visto que os aditivos incluíram três componentes (FeSO4, CuSO4 e cloreto de colina), o seguinte experimento dirigido a qualquer um destes componentes foi responsável pela distribuição de espécie K4 melhorada. Os três componentes foram adicionados a três culturas de frasco de agitação de rFIX. Os componentes foram adicionados aos pares para revelar quaisquer efeitos sinérgicos. Outras culturas incluíram controles positivos (todos os três componentes) e negativos (nenhum aditivo).
A figura 3 mostra que FeSO4 foi o aditivo que foi responsável para ajudar a melhorar a distribuição da espécie K4. Injeções em duplicada para cada amostra são mostradas. Adições estavam nas concentrações experimentais. Parece que a adição de CuSO4 e cloreto de colina, na ausência de FeSO4, ainda pode fazer com que a distribuição piore. Deve ser observado que, por razões desconhecidas, a forma dessialilada de K4’ começou aparecendo em maior abundância em ambas as amostras de teste e na referência de ensaio. Esta tendência é evidente na figura 3 e continua em experimentos subsequentes.
A análise de plasmaespectroscopia induzivelmente ligada ("ICP") do teor de ferro do pó do meio demonstrou que a quantidade apropriada de ferro estava presente no pó. Isto levou à hipótese de que o benefício derivado do FeSO4 adicionado é realmente causado por um contaminante traço daquela matéria-prima. O lote de FeSO4 que foi usado nas condições do meio original foi analisado por análise de ICP, e várias impurezas traço apresentaram em níveis acima do limite de detecção. Eliminando-se inibidores e componentes conhecidos do meio de cultura celular de rFIX, a lista foi limitada aos nove elementos potencialmente benéficos seguintes: Sb, Bi, B, Co, Ge, Mn, Mo, Ni, e V.
Em seguida, experimentos de moldagem em pequena escala foram conduzidos para explorar alguns outros aditivos possíveis que poderiam complementar os aditivos do meio original. CuSO4, ZnSO4 e MnSO4 adicionais (até 10 nM) foram testados. O ZnSO4 foi incluído porque o zinco pode inibir competitivamente a captação de outros cátions bivalentes. Por razões desconhecidas, as condições de controle e experimentais forneceram distribuições de espécie K4 muito similares que foram mais semelhantes ao que foi previamente observado para as condições de controle (ver figura 4, injeções em duplicada para cada amostra são mostradas). Entretanto, a adição de MnSO4 à condição experimental melhorou claramente a distribuição da espécie K4. Parece que o ZnSO4 adicionado pode ter piorado a distribuição da espécie K4, mas a importância desta diferença não é certa.
Foi observado acima que um aumento no nível do pico de K4’ dessialilado foi observado na figura 3. Este fenômeno continuou e tendeu aumentar durante o curso dos estudos em pequena escala descritos. Esta tendência não muda a interpretação dos resultados como apresentado.
Conclusão: Teste extensivo de eluatos de coluna de captura em processo e em pequena escala tem fornecido forte evidência de que a um diferença no pó do meio causou a mudança no RPAR K4, que por sua vez levou a diferenças de mapa de peptídeo múltiplas. Porque a adição de certos componentes ao meio de cultura celular reverteu a mudança, em parte, foi provavelmente que a diferença no pó do meio é que um ou mais componentes mudou para níveis mais baixos. Visto que o aditivo mais eficaz descoberto foi FeSO4, e análise de ICP mostrou que o pó do meio continha a quantidade apropriada de Fe, portanto foi suposto que uma impureza traço no FeSO4 é necessária para a glicosilação apropriada em Ser-61. Com base na análise de ICP do FeSO4, a impureza traço não foi um componente específico do pó do meio, mas ao invés foi um nutriente suplementar que previamente sempre esteve presente no meio.
Exemplo 3: Estudos em pequena escala do Impacto de Aditivos do Meio sobre o Mapa de Peptídeo de rFIX
Introdução: O Exemplo 2 demonstrou que diferenças de lote a lote na extensão da glicosilação em Ser-61 foram observadas em vários lotes de rFIX, que são observadas como uma mudança na distribuição da população de peptídeo K4. Todos os lotes de rFIX têm uma distribuição de comprimentos de cadeia neste sítio dominados pelo tetrassacarídeo de tamanho natural (Sia-α2,3-Gal-β1,4-GlcNAc-β1,3-Fuc-α1), mas alguns lotes tiveram uma fração surpreendentemente alta da forma de fucose apenas.
O Exemplo 2 também demonstrou que a mudança na distribuição de K4 ocorreu no biorreator e foi firmemente ligada a uma mudança de lote do pó do meio. Os resultados do Exemplo 2 fornecem suporte forte para a hipótese de que a mudança na distribuição de glicoforma foi uma função anabólica, não uma unidade catabólica. Além disso, estes experimentos demonstraram que FeSO4 suplementar pode parcialmente reverte a mudança, mas a análise de ICP mostrou que não houve nenhuma diferença significante na concentração de FeSO4 entre os lotes de pó do meio. Assim, foi suposto que um outro componente traço não identificado do FeSO4 que estava presente em níveis variados com os lotes de pó do meio diferentes foi responsável pela mudança.
Efeitos Aditivos: Como debatido no Exemplo 2, a análise de ICP mostrou quantidades mensuráveis de nove microelementos no lote de FeSO4 usadas para as condições de cultura experimentais. Uma comparação destes microelementos contra aqueles em formulações de meio publicadas eliminou a necessidade para adicionar Sb ou Bi. Com base nas formulações do meio e análise de ICP do FeSO4, uma mistura de cinco compostos foi criada para adicionar às culturas de rFIX (concentrações médias finais dadas): 1 nM de (NH4)6Mo7O24, 10 nM de C0CI2, 5,5 nM de NH4VO3, 1,5 nM de NiSO4, e 20 nM de H3BO3. MnSO4 foi adicionado separadamente visto que uma revisão de literatura mais inicial indicou que o manganês poderia ser importante para a atividade de glicosiltransferase (ver Breton e Imberty, Curr. Opinion in Structural Biol. 9: 563-571, 1999; Bruckner et al., Nature 406: 411415, 2000). No mesmo experimento, FeSO4 adicional (2X ou 4X) foi testado para determinar se ele pode aumentar mais a quantidade relativa do tetrassacarídeo. Em cada caso, os aditivos foram usados além dos suplementos descritos no Exemplo 2.
Os resultados deste experimento de adição são mostrados na figura 5. Distribuições de espécie foram determinadas e os valores relatados são as razões da área de cada um dos quatro picos de K4 para sua soma. A figura também mostra um material de referência, o controle (nenhum aditivo) e as culturas suplementadas (como no Exemplo 2). Injeções em duplicada para cada amostra são mostradas. Em cada conjunto de colunas, a coluna mais à esquerda corresponde à fração de moléculas com um tetrassacarídeo em Ser-61, e a coluna mais à direita é a fração com apenas uma fucose. A diferença observada entre as culturas de controle positivo e negativo (suplementadas e não suplementadas, respectivamente) foi menor do que foi observado previamente. Não obstante, a figura 5 demonstra claramente que a mistura de microelementos não teve nenhum efeito sobre a distribuição da espécie K4, enquanto a adição de FeSO4 e MnSO4 ambos melhoraram a distribuição da espécie K4. Quando adicionado aos suplementos, 15 nM de MnSO4 teve aproximadamente o mesmo efeito sobre a distribuição da espécie K4 em 12 μM de FeSO4 adicional.
A resposta forte ao manganês levou a experimentos designados para encontrar uma concentração ideal para o manganês no meio de cultura celular de rFIX. A figura 6 mostra que este experimento forneceu resultados compatíveis com aqueles mostrados na figura 5, visto que todas as culturas com manganês adicionado tiveram menos K4 de fucose apenas do que a cultura suplementada ou a de controle. De fato, culturas com 40 nM ou mais de manganês tiveram cerca da mesma quantidade de K4 de fucose apenas como o ensaio material de referência. Entretanto, pareceu haver mais do trissacarídeo em 100 ou 500 nM do que em 40 nM de manganês. Assim, foi determinado que 40 nM foi uma concentração de manganês inesperadamente vantajosa para glicosilação de FIX mais extensiva em Ser-61.
Utilidade do Modelo em Pequena Escala: Uma característica incomum destes experimentos em pequena escala, e aqueles apresentados no Exemplo 2, foi o nível variado do trissacarídeo, ou espécies dessialadas, de experimento a experimento. Porque esta espécie varia similarmente à referência de ensaio, acredita-se que ela seja um artefato do método de digestão de pote único. Visto que todas as amostras para um experimento dado foram digeridas ao mesmo tempo usando a mesma matéria-prima, não acredita-se que esta variabilidade impacte as análises apresentadas neste exemplo ou no Exemplo 2.
Conclusão: Estes experimentos demonstraram que a adição de 40 nM de MnSO4 ao meio de cultura celular de rFIX melhora a distribuição da espécie K4.
Exemplo 4: Análise de Oligossacarídeo ligado a N de Amostras de Meio de Cultura anti-ABeta
Introdução: Os padrões de oligossacarídeo ligado a N de células CHO que expressam um anticorpo monoclonal de lgG1 anti-peptídeo ABeta humanizado ("células anti-ABeta") foram investigados sob quatro condições médias. As identificações da amostra e informação relevante são listadas na Tabela 3.
Tabela 3. Amostras anti-ABeta colhidas a partir de várias condições de cultura.
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periodicamente com meio de alimentação. Na cultura 2 de anti-ABeta, Microelementos E foram adicionados no início. A Tabela 4 lista a composição de Microelementos E. A cultura 3 de anti-ABeta foi cultivada em condições idênticas à cultura 2 exceto que o nível de glutamina inicial foi de 4 mM. A cultura 4 de anti-ABeta foi cultivada em condições idênticas à cultura 3 exceto que nenhum Traço E foi adicionado e o meio de alimentação foi suplementado com glutamato para 2 g/L.
Distribuições de glicoforma de cada amostra foram determinadas 5 por digestão de PNGase F, seguido por Cromatografia de Troca Aniônica de pH Alto com análise de Detecção Eletroquímica Pulsada (HPAEC-PED). Brevemente, amostras foram trocadas em tampão em 50 mM de formiato de amónio, tamponadas no pH 7,3, usando concentradores de proteína 30.000 MWCO Amicon Ultra. Depois da recuperação, cada amostra foi digerida com 10 5 μL de PNGase F (livre de glicerol) e incubada durante a noite a 37° C. As amostras depois foram secas por centrifugação a vácuo por velocidade e reconstituídas em água purificada. As amostras depois foram transferidas a frascos autoamostradores para a análise de HPAEC-PED. O sistema de HPAEC-PED é equipado com uma proteção Dionex CarboPac PA100 e co15 luna analítica (2 x 250 mm), e um detector de ED-40. Um gradiente linear de acetato de sódio foi usado que inclui dois eluentes: Eluente A que consiste em 100 mM de NaOH e Eluente B que consiste em 100 mM de NaOH/500 mM de acetato de sódio. Tabela 4. Composição de Microelementos E.
Figure img0013
Figure img0014
Análise de dados: Os três tipos de glicanos biantenários ligados a N complexos que estão associados com o anticorpo anti-ABeta contêm zero ("GO"), um ("G1") ou dois (G2") resíduos de galactose em suas ramificações biantenárias ligadas a N externas. Todas as amostras mostraram a presença dos três picos representativos de glicoformas de GO, G1, e G2. A figura 7 mostra uma comparação gráfica da porcentagem de área de pico total para os picos de HPAEC-PED de GO, G1, e G2 de cada amostra. A presença de pequenos picos adicionais foi observada nos perfis de todas as amostras submetidas. Os picos observados representam baixos níveis de glicoformas monoe dissialilada.
Debate: Estes experimentos testaram a distribuição relativa de picos de G0:G1:G2 de culturas anti-ABeta suplementadas com meios de alimentação sob várias condições experimentais. Culturas em que Microelementos E foram adicionados demonstraram uma queda em níveis de GO, com um aumento correspondente em níveis de G1 e G2 em relação a condições de cultura que careceram de Microelementos E (figura 7). Condições de cultura que continham baixo teor de glutamina tiveram um efeito similar, e os efeitos foram aditivos. Culturas de baixo teor de glutamina (4 mM) em que Microelementos Eforam adicionados demonstraram uma mudança dramática na distribuição de glicoformas ligadas a N, com proporções aproximadamente iguais de GO e G1 e com G2 representando aproximadamente 10 % da área de pico total (figura 7). Culturas às quais Microelementos E foram adicionados continham manganês em uma concentração de 156 nM. Entretanto, deve ser observado que as culturas também continham níveis elevados de outros metais. Assim, é possível que, além de manganês, outras condições de cultura contribuíssem para o padrão de glicosilação melhorado observado.
Conclusão: Diferenças nas distribuições de glicosilação observadas nas amostras anti-ABeta são o mais provavelmente devido a mudanças respectivas em condições de cultura. Nossos dados sugerem fortemente que a presença de baixo teor de glutamina (4 mM) e/ou a adição de Microelemento E contendo 100 mM de MnSO4 resulta em uma mudança dramática na porcentagem de distribuição as várias glicoformas ligadas a N em antiABeta. Estes efeitos parecem ser independentes e aditivos.
Exemplo 5: Análise de Oligossacarídeo ligado a N de Amostras de Estudo de Manganês anti-ABeta
Introdução: O Exemplo 4 demonstrou que melhoras em distribuições de glicosilação de amostras anti-ABeta podem ser obtidas pela adição de Microelementos E às condições de cultura e mantendo-se níveis de glutamina baixos. Aqui nós testamos se a adição de manganês sozinho nas condições de cultura pode efetuar uma melhora similar em distribuições de glicosilação.
Procedimento: Culturas anti-ABeta foram cultivadas em meios de cultura contendo ou carecendo de 40 mM de manganês. As culturas foram alimentadas com 40 % de volume total de meios de alimentação. As amostras foram colhidas e analisadas de acordo com o método descrito no Exemplo 4.
Análise de dados: As amostras analisadas foram comparadas em termos de presença e porcentagem de pico da área de pico total para cada pico. A figura 8 mostra uma comparação gráfica de porcentagem de área de pico total para os picos de HPAEC-PED de G0, G1, e G2 de cada amostra.
Debate: Os três tipos de glicanos biantenários ligados a N complexos que estão associados com o anticorpo anti-ABeta são as estruturas de G0, G1, e G2, que respectivamente contêm zero, um ou dois resíduos de galactose em suas ramificações biantenárias ligadas a N externas. As amostras colhidas de células cultivadas em meios carecendo ou contendo 40 mM de manganês mostraram a presença de todos os três picos representativos de glicoformas de G0, G1, e G2. O pico de G0 diminuiu de 68 % da área de pico total na amostra de controle para 53 % na amostra colhida a partir de meios contendo manganês adicionado (ver a figura 8). Aumentos em porcentagens de G1 e G2 da área de pico total também foram observados na amostra colhida a partir de meios contendo manganês. As porcentagens de G1 da área de pico total foram 26 % na amostra de controle, e 39 % na a5 mostra adicionada com manganês. As porcentagens de G2 da área de pico total foram 6 % na amostra de controle e 9 % na amostra adicionada com manganês (figura 8). Conclusão: Estes dados indicam que a adição de manganês sozinho ao meio de cultura resulta em um padrão de glicosilação mais extensi10 vo como demonstrado por uma mudança na porcentagem de distribuição de G0:G1:G2 nestas amostras.

Claims (18)

1. Método de produzir uma glicoproteína em uma cultura celular, caracterizado pelo fato de que compreende: cultivar células mamíferas que contêm um gene que codifica uma glicoproteína de interesse em um meio de cultura celular compreen-dendo entre aproximadamente 10 nM e 600 nM de manganês, em que a glicoproteína de interesse compreende cadeias de oligossacarídeos O-ligadas; manter a cultura em uma primeira faixa de temperatura de cerca de 30 a 42 graus Celsius durante um primeiro período de tempo suficiente para permitir que as células se reproduzam para uma densidade celular viá-vel dentro de um intervalo de cerca de 20%-80% da densidade celular viável máxima possível se a cultura fosse mantida na primeira faixa de temperatu-ra; e mudar a cultura para uma segunda faixa de temperatura e man-ter a cultura durante um segundo período de tempo suficiente para permitir a expressão da glicoproteína, em que a segunda faixa de temperatura com-preende uma faixa de temperatura que é de aproximadamente 25 a 41 graus Celsius, em que o padrão de glicosilação da glicoproteína expressa é mais extensa do que o padrão de glicosilação observado sob condições idênticas em meio idêntico que não possui manganês.
2. Método de acordo com a reivindicação 1, caracterizado pelo fato de que a primeira faixa de temperatura compreende uma temperatura que é aproximadamente 37 graus Celsius.
3. Método de acordo com a reivindicação 1, caracterizado pelo fato de que a segunda faixa de temperatura compreende uma temperatura que é aproximadamente 31 graus Celsius.
4. Método de acordo com a reivindicação 1, caracterizado pelo fato de que o meio de cultura celular compreende entre aproximadamente 20 e 200 nM de manganês.
5. Método de acordo com a reivindicação 4, caracterizado pelo fato de que o meio de cultura celular compreende aproximadamente 40 nM de manganês.
6. Método de acordo com a reivindicação 1, caracterizado pelo fato de que o meio de cultura celular compreende glutamina em uma con-centração inicial que é menor do que ou igual a aproximadamente 8 mM.
7. Método de acordo com a reivindicação 6, caracterizado pelo fato de que a concentração de glutamina inicial do meio de cultura celular é menor do que ou igual a aproximadamente 4 mM.
8. Método de acordo com a reivindicação 1, caracterizado pelo fato de que o volume da cultura celular é cerca de 500 L.
9. Método de acordo com a reivindicação 1, caracterizado pelo fato de que a cultura celular é ainda fornecida com um meio de alimentação após o início da cultura celular inicial.
10. Método de acordo com a reivindicação 1, caracterizado pelo fato de que a cultura celular é ainda fornecida com componentes suplemen-tares.
11. Método de acordo com a reivindicação 10, caracterizado pelo fato de que os componentes suplementares são selecionados do grupo consistindo em hormônios e/ou outros fatores de crescimento, íons inorgâni-cos, tampões, vitaminas, nucleosídeos ou nucleotídeos, microelementos, aminoácidos, lipídeos, glicose ou outras fontes de energia, e combinações destes.
12. Método de acordo com a reivindicação 11, caracterizado pelo fato de que a cultura celular é suplementada com aproximadamente 2 gramas por litro de glicose.
13. Método de acordo com a reivindicação 1, caracterizado pelo fato de que o meio de cultura celular é definido.
14. Método de acordo com a reivindicação 1, caracterizado pelo fato de que a glicoproteína de interesse compreende o fator IX de coagula-ção.
15. Método de acordo com a reivindicação 14, caracterizado pelo fato de que o fator IX de coagulação é fator IX de coagulação humano recombinante.
16. Método de produzir uma glicoproteína em uma cultura celular, caracterizado pelo fato de que compreende: cultivar células mamíferas que contêm um gene que codifica o fator IX de coagulação (FIX) como uma glicoproteína de interesse em um meio de cultura celular compreendendo aproximadamente 40 nM de manga-nês, sob condições e durante um tempo suficiente para permitir a expressão da glicoproteína FIX, em que o padrão de glicosilação da glicoproteína FIX expressa é mais extenso a 40 nM de manganês do que o padrão de glicosilação FIX observado em outros níveis de manganês sob condições idênticas em meio idêntico.
17. Método de produzir uma glicoproteína em uma cultura celu-lar, caracterizado pelo fato de que compreende: cultivar células mamíferas que contêm um gene que codifica o fator IX de coagulação (FIX) como uma glicoproteína de interesse em um meio de cultura celular compreendendo 10-600 nM de manganês, sob con-dições e durante um tempo suficiente para permitir a expressão da glicoproteína FIX, em que o padrão de glicosilação da glicoproteína FIX expressa é mais extenso a 10-600 nM de manganês do que o padrão de glicosilação FIX observado em outros níveis de manganês sob condições idênticas em meio idêntico.
18. Método de produzir uma glicoproteína em uma cultura celu-lar, caracterizado pelo fato de que compreende: cultivar células mamíferas que contêm um gene que codifica uma glicoproteína de interesse em um meio de cultura celular compreen-dendo entre aproximadamente 10 nM e 600 nM de manganês, em que o meio de cultura celular compreende glutamina em uma concentração inicial que é menor do que ou igual a aproximadamente 8 mM, e em que a glicoproteína de interesse compreende cadeias de oligossacarídeos O-ligadas; manter a cultura em uma primeira faixa de temperatura de cerca de 30 a 42 graus Celsius durante um primeiro período de tempo suficiente para permitir que as células se reproduzam para uma densidade celular viá-vel dentro de um intervalo de cerca de 20%-80% da densidade celular viável máxima possível se a cultura fosse mantida na primeira faixa de temperatura; e manter a cultura por um segundo período de tempo suficiente para permitir a expressão da glicoproteína, em que o padrão de glicosilação da glicoproteína expressa é mais extensa do que o padrão de glicosilação 5 observado sob condições idênticas em meio idêntico que não possui man-ganês.
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