TW200812577A - Production of glycoproteins - Google Patents

Description

200812577 九、發明說明： 【發明所屬技術領域；3 發明領域 [0001] 本發明係關於一種在一包含錳之細胞培養基 5 中生產醣蛋白之方法，以及用於此一方法之細胞培養基。 本案之相關申請案 [0002] 本申請案與2006年7月13曰提申之美國臨時 專利申請案第60/830,658號為共審查案、與之共同有至少— 10 位相同發明人，且本案主張其之優先權，其整體内容係被 納入於此作為參考資料。 【冬好】 發明背景 [0003] 蛋白質及多胜肽已逐漸成為重要的治療劑。 15 大部分情況下，這些蛋白質及多胜肽係生產於細胞培養物 中，得自經設計及/或選擇以生產非常高量之所欲特殊蛋白 質或多胜肽的細胞。細胞培養條件之控制及最適化對於蛋 白質或多胜肽之成功商業量產係極為重要的。 [0004] 許多生產於細胞培養物中的蛋白質及多胜肽 20係為醣蛋白，其包含經共價連結的包括寡聚醣鏈之碳水化 合物結構。這些寡聚醣鏈係於内質網及高基氏體中經由Ν_ 鍵結或〇-鍵結連結至蛋白質。該寡聚醣鏈可包含該醣蛋白 質量之一顯著部分。该养聚醣鏈被認為在該醣蛋白之功能 上扮演著重要角色’包括促進該醣蛋白之正確摺疊、媒介 5 200812577 蛋白質-蛋白質的相互作用、授予安定性、授予優良的藥力 學（pharmacodynamic)及 / 或藥動學（pharmacokinetic)性質、 抑制蛋白分解性消化、將該醣蛋白靶定至適當的分泌性路 徑，以及將該醣蛋白靶定至特定器官。 5 [0005] 一般而言，N-鍵結之寡聚醣鏈係被加至内質 網之内腔中之初期、轉位蛋白質上（參見Alberts等人1994 年之Molecular Biology of the Cell，併入本文中作為參 考）。該募聚瑭被加至一包含於Asn-X-Ser/Thr標乾一致性序 列内之天冬醯胺酸殘基的側鏈上胺基，此X可為除了脯胺酸 10 之外的任何胺基酸。該起始募聚醣鏈通常被内質網中之特 定醣解酶酵素剪切，得到一由二個N_醯基葡萄糖胺及三個 甘露糖殘基所組成之短的、枝狀主鏈寡聚醣。 [0006] 内質網中之初始加工之後，醣蛋白經由小微 月曰粒穿送至南基氏體，其中該募聚醣鏈在被分泌至細胞表 15面之前進行進一步之加工。經剪切之N-鍵結寡聚醣鏈可藉 由許多甘露糖殘基之添加而被修飾，得到一高_甘露糖募聚 醣或者，义乙^葡萄糖胺之一或多個單醣單元可被加至 該核心甘露糖次單元以形成複合寡聚醣。半乳糖可被加至 队乙醯葡萄糖胺次單元，且唾液酸次單元可被加至半乳糖 20次單元’得到末端為-唾液酸、半乳糖或N_乙醯葡萄糖胺 殘基中任一者之鏈。再者，海藻糖殘基可被加至核心募聚 _之队乙醯㈣糖胺絲。這些添加之每—者係由特定的 基轉移酶所催化。 [0007] ㉟了藉由N·鍵結之醣化作祕徑修飾之外， 6 200812577 當在高基氏體中時，醣蛋白亦可藉由將〇_鍵結募聚醣鏈添 加至特定的絲胺酸或酥胺酸殘基而被修飾。一 〇_鍵結募聚 醣之殘基一次被添加一個且每個殘基的添加係由一特定的 酵素所催化。相對於N-鍵結之醣化作用，一致性胺基酸序 5 列之〇-鍵結的醣化作用係較不明確。 [0008] 蛋白質醣化作用之最終品質及程度可強烈地 受細胞培養條件所影響。例如，傳統的批次及饋入_批次式 培養方法著眼於所生產胜肽之最終位準，且其通常得到之 醣蛋白的生產具有一較低程度之醣化作用型樣(pattern)及/ 10或一極少反映出該醣蛋白天然型式中所存在之寡聚醣鏈糖 殘基的醣化作用型樣。增加醣化作用之程度及/或調整糖殘 基之組成物至較接近於反映出存在於醣蛋白天然型式中之 酶化作用的位準及組成物，可傾向於得到-具有較大潛 力、改良之藥力學及/或藥動學性質以及較少副作用之治療 15性醣蛋白試劑。雖然對於改良生產於細胞培養物中酷蛋白 之at化作用已有某些努力，但仍需要有更多的改良。特別 是需要發展出用於藉由確定成分培養基中之細胞培養物來 生產具有改良醣化作用型樣之醣蛋白的系統。 【日月内 發明概要 []本^明之方法及組成物提供了 一種用於在細 A— Λ V- /

(例如500 L或更多）之培養方法， ’本發明提供了商業等級 ’其利用一種包含錳之莫 7 200812577 耳累積濃度在大約10至600 nM之間的培養基。於特定實施 例中，培養基中之莫耳累積麩醯胺酸濃度低於大約8 mM。 於特定實施例中，培養基中之莫耳累積麵醯胺酸濃度係低 於大約4 mM。必需瞭解到，上述所用「累積」係指在細胞 5 培養之過程中被加入之一特定成分的總量，包括在該培養 之最初被加入之成分及隨後所加入之成分。於本發明特定 實施例中，最小化隨時間變化之培養「饋入物」係為想要 的，因此最大化最初存在量係為想要的。當然，培養基成 分在培養過程被代謝，因此如果其成分係在不同時間被加 10 入（例如全部在最初即存在，相對於部分由饋入被加入）， 則其成分具有相同累積量之培養物將具有不同的絕對位 準。 [0010] 依據本發明，此一培養基之使用容許生產出 包含所欲醣化作用型樣之醣蛋白。於某些實施例中，醣蛋 15 白可具有一更廣泛的醣化作用型樣及/或可具有一較接近 類似自然宿主細胞所適有之醣蛋白寡聚醣鏈分佈的寡聚醣 鏈分佈。於某些實施例中，本發明系統之使用可得到之醣 蛋白生產，其所具有之醣化作用型樣係相似或相同於如果 該醣蛋白係於一内源性人類細胞中所表現時所存在的醣化 20 作用型樣。 [0011] 一熟習此藝者將明白本發明之培養基配方包 含確定成分培養基及複合培養基二者。於特定實施例中， 該培養基為一確定成分之培養基，其中該培養基之組成物 為已知且經控制者。 8 200812577 [0012] 於某些實施例中，細胞係被培養於一或多種 在美國臨時專利申請案第60/605,097號中所述之條件下，其 併入本文作為參考。於某些實施例中，細胞係被培養於一 或多種在美國專利申請案第11/2i3,308號中所述之條件 5下，其併入本文作為參考。 [0013] 本發明之細胞培養可任擇地補充營養物及/ 或其它培養基成分，包括荷爾蒙及/或其它生長因子、特殊 離子（諸如鈉、氯化物、鈣、鎂及磷化物）、緩衝劑、維他 命、核苷或核苷酸、少量元素（經常以極低最終濃度存在 1〇之無機化合物）、胺基酸、脂質，或者葡萄糖或其它能量源。 於特定實施例中，以諸如六亞甲基-雙乙醯胺（“HMBA”） 及丁酸鈉（“NaB”）之化學感應劑補充該培養基係為有益 的。此類任擇之補充物可在培養之初被加入或者可在其後 之時點被加入以補充被消耗的營養或者為了其它理由。一 15 般而言，依據本發明選擇最小化追加補充之最初培養基成 分係為所欲者。 圖式簡單說明 [0014] 第1圖顯示於UF/DF保留物質中糖苷活性的 20 研究。每一實驗中，代表各種K4及K4,類種之長條，自左至 右為：K4 (Fuc-GlcNAc-Gal-SA)、K4,（Fuc-GlcNAc-Gal)、 K4’（Fuc_GlcNAc)及K4,（Fuc)。 [0015] 第2圖顯示在搖動燒瓶中所產生之rFIX的K4 類種分佈。每一實驗中，代表各種Κ4及Κ4’類種之長條，自 9 200812577 左至右為：K4 (Fuc-GlcNAc-Gal-SA) 、 K4’ (Fuc-GlcNAc-Gal)、K4’（Fuc-GlcNAc)及 K4,（Fuc)。 [0016] 第3圖顯示得自具各種培養基添加劑之搖動 燒瓶培養物的K4類種分佈。每一實驗中，代表各種K4及K4, 5 類種之長條，自左至右為：K4 (Fuc-GlcNAc-Gal-SA)、K4, (Fuc-GlcNAc-Gal)、K4’（Fuc-GlcNAc)及 K4’（Fuc)。 [0017] 第4圖顯示得自具補充培養基之搖動燒瓶培 養物的K4類種分佈。每一實驗中，代表各種K4及K4’類種 之長條，自左至右為：K4 (Fuc_GlcNAc-Gal-SA)、K4, 10 (Fuc-GlcNAc-Gal)、K4’ (Fuc-GlcNAc)及 K4’ (Fuc) 〇 [0018] 第5圖顯示得自具各種培養基添加劑之搖動 燒瓶培養物的K4類種分佈。每一實驗中，代表各種K4及K4’ 類種之長條，自左至右為·· K4 (Fuc-GlcNAc-Gal-SA)、K4’ (Fuc-GlcNAc-Gal)、K4’（Fuc_GlcNAc)及K4,（Fuc)。 15 [0019] 第6圖顯示得自變化錳量下搖動燒瓶培養物 的K4類種分佈。每一實驗中，代表各種K4及K4’類種之長 條，自左至右為：K4 (Fuc-GlcNAc-Gal-SA)、K4’ (Fuc-GlcNAc-Gal)、K4’（Fuc-GlcNAc)及K4’（Fuc) 〇 [0020] 第7圖顯示GO、G1及G2 HPAEC-PED峰值之 2〇 總峰值面積百分比的一圖形比較。每一實驗中，代表複合 N-鍵結雙觸角多醣之長條，自左至右為·· GO、G1及G2。 [0021] 第8圖顯示GO、G1及G2 HPAEC-PED峰值之 總峰值面積百分比的一圖形比較。每一實驗中，代表複合 N-鍵結雙觸角多醣之長條，自左至右為·· GO、G1及G2。 10 200812577 L實施方式j 定義 [0022] 「胺基酸」：用於本文中之「胺基酸」_詞係 才曰一十種天然胺基酸之任一者，其用於多胜肽之自然形 5成，或者這些胺基酸之類似物或衍生物，或者任何非天然 之胺基酸。本發明之胺基酸係被提供於培養基中供細胞培 養。培養基中所提供之胺基酸可以鹽類或水合物形式提供。 [〇〇23] 「抗體」：用於本文中之「抗體」一詞係指一 免疫球蛋白分子或一免疫球蛋白分子之免疫活性部分，亦 10即一包含有一可專一性結合至一抗原之抗原結合位址的分 子，諸如Fab或F(ab’)2片段。於特定實施例中，抗體為一該 領域中之熟習此藝者所知之典型天然抗體，例如，包含有 四條多胜肽鏈之醣蛋白：二條重鏈及二條輕鏈。於特定實 施例中，抗體為一單鏈抗體。例如，於某些實施例中，單 15鏈抗體包含有典型天然抗體之變型，其中該重及/或輕鏈之 >一或夕“成貝被共彳貝連結，例如，透過一胜狀鍵。於特定 實施例中，單鏈抗體為一具有一由一重鏈及一輕鏈所組成 之雙-多胜肽鏈結構的蛋白質，此等鏈被安定化，例如，藉 由鏈間的胜肽連接子，此蛋白質具有專一性結合一抗原的 20能力。於特定實施例中，抗體為一僅包含重鏈之抗體，諸 如’例如’天然存於路駿科成員中者，包括絡馬（llamas)及 HS(camels)(參見’例如，Casterman等人之美國專利第 6,765,087號、Casterman等人之美國專利第6,015,695號及 Castennan等人之美國專利第6,005,079號，每一者均被全文 11 200812577 併入本文為參考）。用於本文中之「單株抗體」及「單株抗 體組成物」係指一種抗體分子之群體，其包含單一種抗原 結合位址且因此通常僅與一種單一抗原決定位或一特定抗 原相作用。單株抗體組成物因此典型地對於一與之免疫反 5應之特疋抗原決定位顯示一單一結合親合性。用於本文中 之多株抗體」及「多株抗體組成物」係指某抗體分子群 體’其包含多數種與一特定抗原相作用的抗原結合位址。 [0024] 「批次培養」：用於本文中之「批次培養」一 詞係指一種培養細胞之方法，其中最終將被用於培養細胞 10之所有成分，包括培養基（參見下述「培養基」之定義） 以及该等細胞本身，均在該培養過程開始時即被提供。批 人k養典型在某些點被停止並收穫，且任擇地純化培養基 中之細胞及/或成分。 [0025] 「生物反應器」：用於本文中之「生物反應器」 15 一詞係指任何用於哺乳類細胞培養物之生長的容器。生物 反應器可為任何尺寸，只要可用於哺乳類細胞之培養。典 型地，此一生物反應器可為至少1公升且可為10、100、250、 500、1〇〇〇、2500、5000、8000、1〇,〇〇〇、12,000公升或更 夕，或者任何介於其間之體積。該生物反應器之内部條件， 20包括但不限於ρί1、溶氧及溫度，典型地在培養期間受到控 制。生物反應器可由適於在本發明培養條件下支持懸浮於 培養基中之哺乳類細胞培養之任何材料所組成，包括破 璃、塑膠或金屬。用於本文中之「量產生物反應器」係指 用於生產所欲醣蛋白之最終生物反應器。該量產生物反應 12 200812577 器之容量典型為至少500公升且可為1000、2500、5000、 8000、10,000、12,000公升或更多，或者任何介於其間之體 積。該領域之熟習此藝者暸解且能夠選擇合適用於實施本 發明的生物反應器。 5 [0026] 「細胞密度」：用於本文中之「細胞密度」一 詞係指於一定體積之培養基中所存在之細胞數量。 [0027] 「細胞存活性」：用於本文中之「細胞存活性」 一詞係指於一培養物中在一定之培養條件或實驗變化之下 細胞存活之能力。用於本文中之該語詞亦指在一特定時間 10 點存活的細胞相對於在彼時間點總細胞數量（活及死細胞） 之部份。 [0028] 「複合培養基」：用於本文中之「複合培養基」 一詞係指一種包含至少一特性或含量未明或未經控制之成 分的培養基。 15 [0029] 「培養物」、「細胞培養物」：用於本文中之這 些語詞係指一在適於存活及/或細胞群體生長之條件下懸 浮於之培養基（參見下述「培養基」之定義）中的細胞群 體。如熟習此藝者所清楚明白者，於特定實施例中，用於 本文中之這些語詞係指包含有細胞群體及該群體所懸浮之 20 培養基的組合。於特定實施例中，該細胞培養物之細胞包 含啸乳類細胞。 [0030] 「確定成分培養基」：用於本文中之「確定成 分培養基」一詞係指一種其中培養基之組成物係已知且經 控制之培養基。 13 200812577 [0031] 「批次饋飼培養」··用於本文中之「批次饋飼 培養」一詞係指一種培養細胞的方法’其中額外成分一次 或接續於培養過程開始後多次提供給該培養物。如此提供 之成分典型包含已在培養過程期間耗盡之細胞用營養性成 5分。再者或或者，此等添加成分可包括補助成分（補助成 分」之定義）。於特定實施例中，添加成分被提供於一饋飼 培養基（參見下述「培養基」之定義）中。批次饋飼培養 典型地在某個時間點停止並收穫，且任擇地純化培養基中 之細胞及/或成分。 [0032] 「饋飼培養基」：用於本文中之「饋飼培養基」 一詞係指一種包含滋養生長中哺乳類細胞之營養物的溶 液，其在該細胞培養開始之後被加入。饋飼培養基可包含 與提供於最初細胞培養基中之成分相同的成分。或者，饋 飼培養基可包含一或多種超出提供於最初的細胞培養基中 15 之外的添加成分。再者或或者’饋飼培養基可能缺少一或 多種提供於最初的細胞培養基中之成分。於特定實施例 中，饋飼培養基之一或多種成分被提供的濃度或含量可相 20 同於或相似於被提供於最初細胞培養基中那些成分之濃戶 或含量。於特定實施例中，饋飼培養基之一或多種成分被 提供的濃度或含量不同於被提供於最初細胞培養基中那此 成分之濃度或含量。例示性的饋飼培養基顯示於表2中，雖 然本發明並不限於這些培養基之使用。一熟習此藝者將瞭 解到，可使用其它的饋飼培養基及/或可對表2中所列之例 示性饋飼培養基的成分作出特定的變更。於特定實施例 14 200812577 (參見下述「補助成分」 中，饋飼培養基包含補助成分 之定義）。 LU033] 片段 於本文中之「片段」一詞係指一 多胜狀，其被界定為—狀h肽妹何《部分，# =或具有該多胜肽之特性。例如，用於本文中之該語 莉特定多胜肽之任何部分，其包括至少—於全長多 胜肽中可找到的確定序列元。特定片段中，該序列元包含 该全長多胜肽之至少 4_5、1G、15、2()、25、3()、35、4()、 45 50或更多胺基酸。或者或再者，用於本文中之該語詞 10 係指-特定多紐之任何單獨部分，其保留該全長多胜狀 之至少-種活性之至少-小部分。於特定實施例中，該所 保留活性之小部分係至少該全長多胜肽之活性的1〇%。於 特定實施例中，該所保留活性之小部分係至少該全長多胜 肽之活性的20%、30%、40%、50%、60%、70%、80%或90%。 15於特定實施例中，該所保留活性之小部分係至少該全長多 胜肽之活性的95%、96%、97%、98%或99%。於特定實施 例中’該小部分保留該全長多胜肽之活性的1〇〇%或更高。 於特定實施例中，本發明之片段包含一作為醣化作用位址 之胜肽序列。於某些實施例中，本發明之片段包含一醣化 20 作用位址之一部分，因此，當連結至包含有醣化作用位址 之其它部分的其它片段時，一功能性醣化作用位址即被重 建。 [0034] 「基因」：用於本文中之「基因」一詞係指任 何核苷酸序列、DNA或RNA，至少其某部分編碼出一單獨 15 200812577 的最終產物，典型但不限於，多胜肽，其作用於細胞性代 謝或發展之某些方面。任擇地，基因不只包含有編碼該多 胜肽或其它單獨終產物之密碼序列，且亦包含有該密碼序 列之A及/或之後其調節基因表現之基本量的序列（參見下 5述「基因控制元」），及/或在個別密碼段落（「表現子」）之 間的中介序列（「插入子」）。 [0035] 「基因控制元」··用於本文中之「基因控制元」 一詞係指任何調節其所操作性連結之基因表現的序列元。 ⑺基因控制元可藉由增加或減少表現量來作用，且可位於該 …馬序列之别之中或之後。基因控制元可藉由調控，作 用於基因表現之任何時期，例如，轉錄之開始、增長或終 止期、mRNAW接、mRNA編輯、刷八穩定、爪囊在細 胞中之定位、轉譯之開始、增長或終止期，或基因表現之 b你何其它時期。基因控制元可個別地或者與它者結合作用。 匕[0036] 「_蛋白」··用於本文中之「醣蛋白」一詞係 $-包含-或多個共價連結寡聚醣鏈之蛋白f或多胜月太。 特醣鏈可由-單一糖殘基（一糖殘基之單一無分枝鍵） 所組成，或可由分枝一或多次之糖殘基之鏈所組成。於特 定實施例中，募聚醣鏈為N 一鍵結。於特定實施例中，募聚 _鏈係0-鍵結。 匕[〇〇37] 「醣化作用型樣」：「醋化作用型樣」一詞係 礼-特定聽蛋白之可觀察的酶化作用。一於寡聚醣鏈中具 有較大量之共價連結糖殘基之醣蛋白意謂具有增強的或更 乏的膽化作用型樣。相反地，―於募聚醣鏈中具有較少 16 200812577 共價連結_基之輕自意謂具有 化作用型樣1於本文中之「輒作不廣泛的酿 於依據本翻教輯表狀 詞亦指一 用型樣之特有分佈。此… 不同醣化作 味在所表_蛋白杨㈣用«之財分佈心 [嶋]「宿主細胞」：用於本文中之「宿主細胞」一 _指-種細胞，其依據本發明被操作以產生—具有如本 文中料合意之酿化作用型樣的酶蛋白。於某些實施例 中，俏主細胞為一種哺乳類細胞。 10 [0039] 「融合瘤」：用於本文中之「融合瘤」一詞係 指-種得自於融合一不死化細胞及一抗體生產細胞所得之 細胞或細胞的後代。此一所得融合瘤為一種不死化的可產 生抗體的細胞。用於建立融合瘤之個別細胞可來自任何哺 乳類來源，包括但不限於大鼠、豬、兔、绵羊、豬、山羊 15及人類。於特定實施例中，融合瘤為一三體瘤細胞株，其 當異種雜合之骨髓瘤融合體（其為人類細胞及鼠類骨聽瘤 細胞株之間融合的產物）隨後與一血漿細胞融合而得。於 特定實施例中，融合瘤為任何不死化之產生抗體的雜合細 胞株’諸如例如，四體瘤（quadroma)(參見，例如Milstein 2〇 等人之Nature, 537:3053, 1983 )。 [0040] 「培養基」、「細胞培養基」、「培養用培養 基」··用於本文中之這些語詞係指一種包含其可滋養生長中 °甫乳類細胞之營養的溶液。典型地，此類溶液提供細胞為 最低生長及/或存活所需之必需及非必需胺基酸、維他命、 17 200812577 能量源、脂質及微量元素。此一溶液亦包含補助成分（參 見下述「補助成分」之定義），其增進高於最基本速率之上 的生長及/或存活，包括但不限於，荷爾蒙及/或其它生長因 子、特殊離子（諸如鈉、氯、鈣、鎂及磷酸）、緩衝劑、維 5他命、核苷或核苷酸、微量元素（通常以極低終濃度存在 之無機化合物）、胺基酸、脂質及/或葡萄糖，或者其它能 量源。於特定實施例中’培養基被有利地調配為一最適於 細胞存活或增殖之pH及鹽濃度。例示性培養用培養基示於 表1中，雖然本發明不限於這些培養基之使用。一熟習此藝 10 者將瞭解到，可使用其它培養用培養基且/或可對表1中所 列例示性培養用培養基之組成物作出特定的改變。於特定 實施例中，培養基為一在細胞培養開始之後才被加入之饋 飼培養基（參見上述「饋飼培養基」之定義）。 [0041] 「多胜肽」：用於本文中之「多胜肽」一詞係 指一經由胜肽鍵所連結一起的胺基酸序列鏈。該語詞被用 於指一具有任何長度之胺基酸鏈，但熟悉該技藝之人士明 白此一語詞不限於長鏈且可指一包含經由一胜肽鍵所連結 一起之二個胺基酸之最小短鏈。如熟悉該技藝之人士所 知，多胜肽可被加工及/或修飾。例如，一多胜肽可_化（參 2〇 見上述「醣蛋白」之定義）。 [0042] 「蛋白質」：用於本文中之「蛋白質」一詞係 指一或多種作用為一單獨單元之多胜肽。如果一單一多胜 肽為單獨的功能單元，且不需與其它多胜肽永久或暫時地 物理性聯合以形成單獨的功能單元，則該語詞「多胜肽」 18 200812577 及「蛋白質」即可互替使用。如果該單獨的功能性單元係 由多於-個多胜肽彼此物理性聯合所構成，則該言^「蛋 白質」即指物理性連結且作用在一起而為該單獨單元之複 數多胜肽。 . 5 _3]「重組表現之醣蛋自」及「重組醣蛋白」：用 ’ ⑨本文中之這些…钱指—由-被人卫操作以表現_蛋白 之宿主細胞所表現的酶蛋白。於特定實施例中，宿主細胞 為一哺乳類細胞。於特定實施例中，此一操作包含一或多 個基因修飾。例如，哺乳類宿主細胞可藉由引入一或多個 1〇編碼欲被表現之醣蛋白的異質性基因而被基因修飾。該異 質性重組表現之醣蛋白可相同或相似於正常表現於哺乳類 宿主細胞中之酶蛋白。該異質性重組表現之醣蛋白亦可為 外來於該宿主細胞，亦即，異質於正常表現於該哺乳類宿 主細胞中之醣蛋白。於特定實施例中，異質性重組表現之 15醣蛋白為嵌合性，在該醣蛋白之一部分包含相同或相似於 正常表現於哺乳類宿主細胞中醣蛋白之胺基酸序列，而其 • 它部分為外來於該宿主細胞。或者，一哺乳類宿主細胞可 藉由一或多個内源性基因之活化或向上調節作用而被基因 修飾。 2〇 [0044] 「補助成分」：用於本文中之「補助成分」一 詞係指增進在最低速率之上的生長及/或存活的成分，包括 仁不限於’荷爾蒙及/或其它生長因子、特殊離子（諸如鈉、 氣、鈣、鎂及磷酸）、緩衝劑、維他命、核苷或核苷酸、微 里元素（通常以極低終濃度存在之無機化合物）、胺基酸、 19 200812577 脂質及/或葡萄糖，或者其它能量源。於特定實施例中，補 助成分可被加入至最初細胞培養物。於特定實施例中，補 助成分可在細胞培養開始之後才被加入。 [0045] 「效量」：用於本文中之「效量」一詞係指於 5 特疋畺之培養基體積中由一哺乳類細胞培養所生產之重 組表現醣蛋白的總量。效量典型地以每毫升培養基之醣蛋 白毫克數為單位表示。 較佳實施例之詳細說明 1〇 [0046] 本發明提供用於在細胞培養物中生產醣蛋白 之改良系統。特別是，所提供之系統得到一包含有所欲醣 化作用型樣之醣蛋白的生產。例如，一醣蛋白可具有一較 廣泛之醣化作用型樣及/或可具有一較接近類似自然宿主 、、、田胞所適有之醣蛋白寡聚醣鏈分佈的募聚醣鏈分佈。於某 5些實施例中，本發明系統之使用可得到之醣蛋白生產所具 有之醣化作用型樣係相似或相同於如果該醣蛋白係於一内 源性人類細胞中所表現時所存在的醣化作用型樣。以下詳 、、、田说明本發明特定實施例。然而，熟習此藝者將瞭解到， 對這些實施例之各種改變係落在所附申請專利範圍之範圍 >〇 ^ , 中。界定出本發明之範圍的申請專利範圍或其均等物並 非且不應被限制為或受限於特定實施例之敘述。 基組成物 [0047]依據本發明可使用多種不同的哺乳類生長培 20 200812577 養基。於特定實施例中，細胞可被培養於多種化學 。< 土之一之中，其中該培養基之成分為已知且經控 制。於特疋貫施例中，細胞可被培養於一複合培養基中， 其中亚非6彡培養基之所有成分均為已知且/或經控制。 [0048]肖於哺乳類細胞培養之化科定成分生長培 養基在過去數十年來已被廣泛發展且公開。確定成分培養 ^之所有成分全被特定化，且如此確定成分之培養基不包 含諸如血清或水解物之複合添加物。早期的培養基配方的 發展，係在允許細胞生長且維持存活，而很少或不關切蛋 =貝生產。近來，培養基配方已以支持高生產性重組蛋白 貝及/或醣蛋白之生產細胞的培養為明確目的而發展。 []破疋成分培養基典型係由在水中之約略5〇種 化學物質以已知濃度所組成。其大部分亦包含—或多種諸 如姨島素、1阳1、顧蛋白或BSA之已特定化的蛋白質， 15但其餘者需要無蛋白質成分且如此被稱為無蛋白質之確定 成分培養基。該騎基之化學成分_為五大類：胺基酸、 維他命、無機鹽、微量元素及—屬難於單純歸類之雜類。 —[〇_ Μ元素係由多種無機鹽以微莫耳或更少之 量所組成。四種最普遍包含而存在於幾乎所有確定成分培 養基中的微量元素為鐵、辞、碼及銅。鐵（含鐵或鐵趟） 及鋅係被典型地加至微莫耳之濃度，而其它二者通常係太 米莫耳(腦_叫之濃度。許多更少量的—般微量元素通 ^以奈米莫耳濃度被添加。 [0051] 猛經常被包含於微量元素中作為二價陽離子 21 200812577 (MnCl2或MnSCU)。在早期的確定成分培養基中，其被略 過或以一 1 μΜ級數之高濃度被包含（參見，例如，Barnes 及Sato, 1980 [培養基DMEM/F12]，以及Kitos等人，1962 [培 養基MD 705/1])。較近發展之確定成分培養基中，已普遍 5 地包含猛’但係以低很多的濃度’例如在1-5 nM之範圍内 (參見，例如，Hamilton及Ham, 1977 [培養基MCDB 301]， 以及Cleveland及Erlanger，1988 [未命名培養基])。 [0052] 本發明包括發現到從在含錳濃度介於這些極 端值間之確定成分培養基中的細胞生長培養物所生產的醣 10 蛋白，比起如果細胞被培養於如上所述之傳統培養基中的 其匕者’包含更廣泛的酶化作用型樣。於特定實施例中， 锰於該培養基中係以一介於大約10及600 nM間之濃度被提 供。於特定實施例中，錳於該培養基中係以一介於大約2〇 及100 nM間之濃度被提供。於特定實施例中，錳於該培養 15 基中被提供之濃度係大約10、15、20、25、30、35、40、 45、50、55、60、65、70、75、80、85、90、95、100、110、 120、130、140、150、160、170、180、190、200、210、 220、230、240、250、260、270、280、290、300、310、 320、330、340、350、360、370、380、390、400、410、 20 420、430、440、450、460、470、480、490、500、510、 520、530、540、550、560、570、580、590或600 nM，或 者在這些濃度之中的任何範圍。 [0053] 本發明亦包括發現到由在含相當低量麩醯胺 酸之確定成分培養基中的細胞生長培養物所生產的醣蛋 22 200812577 白’比起如果細胞被培養於含較高量麵醯㈣之傳統培養 基中的其它者，包含更廣泛的醣< 化作用型樣。於特定實施 〇中’培養基中麟胺酸之·含量係低於或等於大約8 ‘之起始含量係低 mM。於特定實施例中，培養基中麵醯胺酸 於或專於大約4 mM。 _4]-減該技藝之人士㈣基於其實驗設計之 特殊屬性，包括表現其醣蛋白之細胞的特性、欲被生產之 醣蛋白的特性及培養細胞之培養基中其它成分之存在盘 否，在本發明範圍中選擇準確的錳濃度。例如，N_鍵結及 10 〇-鍵結之結構間的差異，或者這些廣泛種類之每者間特殊 寡聚膽結構的差異，於該生長培養基中需要不同的猛濃度 以生產更廣泛及/或更天然的寡聚醣鏈。 醣蛋白 15 [0055]可表現於一宿主細胞中之任何醣蛋白可依據 本發明教示被生產。可由一内源於該宿主細胞之基因，或 由一被導入至該宿主細胞内之異質性基因來表現醣蛋白。 醣蛋白可為一天然存在者，或可選擇性地具有一經人工設 計或選擇之序列。欲被生產之醣蛋白可從個別出現於大自 20然之多胜肽片段組合而成，其至少一者包含一作為醣化作 用位址之胜肽序列。或者，每一多胜肽片段可具有一醣化 作用位址之只有一部分，此位址可在該等多胜肽片段一旦 組合牯被重建。再者或或者，該經設計之醣蛋白可包括一 或多個天然存在之片段，只要該經設計之聽蛋白包含至少 23 200812577 一作為醣化作用位址之胜肽序列。

LUUJOJ ,π个：π分葸地被表現的醣蛋白時常美於 ‘感興趣或有用之生物或化學活性而被選擇。例如^發 明可被用來表現任何藥學上或產業上相關的酵素、受器: 抗體、荷爾蒙'調節因子、抗原、結合劑等。下列可依本 發明被生產騎蛋白表賊是麻性，且非欲作為一限制 性敘述。-熟悉該技藝之人士將瞭解到任何醣蛋白均可依 據本發明而表現，且將可基於其特殊f要選擇所欲表現之 特定醣蛋白。 10 凝結因子 [0057] 凝結因子已顯示可有效作為藥學及/或產業 试劑。由於重組凝結因子在諸如血友病之疾病治療上的重 要性’依據本發明來最適化重組生產之凝結因子的醣化作 15用型樣特別令人感興趣。例如，凝結因子IX (因子IX或 FIX )為一單鏈醣蛋白，其缺陷導致b型血友病，一種受 傷者之血液無法凝結之疾病。因此，任何導致流血之小傷 口都可能為一致命事件。 [0058] FIX被合成為一單鏈的可藉由釋出一激活胜 2〇 肽被活化為一雙鏈絲胺酸蛋白酶（因子ixa)的酵素原。因 子IXa之催化區塊位於重鏈中（參見chang等人，J· Clin· Invest·，100:4, 1997，併入本文作為參考）。FIX具有包括N-鍵結及0-鍵結醣類之多數醣化作用位址。一在絲胺酸61之 特殊0-鍵結結構（Sia-cx2,3-Gal-pl，4-GlcNAc-pl,3-Fuc-cxl- 24 200812577 Ο - S e r )曾經被認為獨特於F j χ卻已被發現於包括哺乳動物 及果蠅中之Notch蛋白質的少數其它分子上 (Maloney et al，/⑽ma/ ο/β沁/· Chm·，275(13)，2000)。由 中國倉鼠卵（“CHO”）細胞於細胞培養中所生產的FIx，展 5 現出某些在絲胺酸61寡聚醣鏈中的變異性。這些不同的_ 型式，及其它可能的醣型式，在投藥給人類或動物時，可 具有不同的誘發凝結的能力，及/或可於血液中具有不同的 安定性，導致較低的有效凝結。 [0059] 在臨床上與B型血友病不可區分的a型血友 10 病係由於人類凝結因子VIII之缺陷所導致，凝結因子VIII 被合成為一單鏈酵素原然後加工成一雙鏈活性型式之另一 個醣蛋白。本發明亦可被用來控制或改變凝結因子vm之醣 化作用型樣以調節其凝結活性。其它可被生產且其醣化作 用型樣可依據本發明而被控制或改變之醣蛋白凝結因子包 15括，例如但不限於，組織因子及溫韋伯氏因子（von Willebrands factor) 〇 抗體 [0060]抗體係具有專一地結合一特定抗原之能力的 20蛋白質。已有大量的抗體正被使用或正研究為藥學或其它 產業製劑，依據本發明生產出具有所欲醣化作用型樣之抗 體係特別令人感興趣的。並且，具有不同醣化作用型樣之 抗體可能比較不會在受投藥之個體中啟動一免疫反應，達 到一更有效之治療性療法。再者或或者，於其恆定區域 25 200812577 (constant region)中具有不同醣化作用型樣之抗體可能展現 出一改良的藥動學或藥力學受動因子作用。再者或或者， 具有不同酷化作用型樣之抗體在其被生產之細胞培養條件 中可此較穩疋，例如對於細胞培養物中之蛋白酶或盆它成 5分較具耐受性，因此能生產出一較高最終效量之抗體。 [0061] 任何可表現於一宿主細胞中之抗體均可依據 本發明之教示被使用。於某些實施例中，一要被表現之抗 體為一單株抗體。於特定實施例中，一單株抗體為一嵌合 性抗體。一嵌合性抗體包含衍生自多於一個器官以上之胺 10 基酸片段。嵌合性抗體分子可包括，例如，一源自小鼠、 大昧Vi或其匕物種之抗體的抗原結合區塊，與人類的恒定區 域。多種製造嵌合性抗體之途徑已被記述（參見例如， Morrison 等人之尸rac. TVai/· Acad· U.S.A. 81, 6851, 1985 ; Takeda等人之314, 452, 1985 ; Cabilly等人之 15 美國專利第4,816,567號；Boss等人之美國專利第4,816,397 號；Tanaguchi等人之歐洲專利公告第EP171496號；歐洲專 利公告第0173494號，英國專利GB 2177096B，其每一者均 併入本文作為參考）。 [0062] 於某些實施例中，一單株抗體為一人類化抗 20 體。一人類化抗體為一嵌合性抗體，其中大部分的胺基酸 殘基係衍生自人類抗體，因此當被投藥至一人類個體時可 最小化任何潛發之免疫反應。人類化抗體中，於高可變性 區域中之胺基酸殘基被源自一非人類物種其提供一所欲抗 原專一性或親和性之殘基所取代。於特定實施例中，一人 26 200812577 類化抗體具有一胺基酸序列，其相同於人類抗體者有8〇、 85、90、91、92、93、94、95、96、97、98、99百分比或 更高。於特定實施例中，一人類化抗體藉由導入守恆性取 代致丨生序列取代、生殖系取代及/或返突變(backmutation) 5而被最適化。如此經改變之免疫球蛋白分子可藉由多種已 知技術之任一者被製造，（例如Teng等人之施". 版 ΠΑ·，80, 7308-7312, 1983 ; Kozbor等人之/麵卿/哪 7W町，4, 7279，1983 ; Olsson等人之她汍 92, 3-16.1982，其每一者均併入本文作為參考）。於某些實施例 10中’經改變之免疫球蛋白分子係依據PCT公告WO92/06193 或EP 0239400之教示被製造，其每一者之全文均併入本文 作為參考。 [0063] 於特定實施例中，依據本揭露内容之教示所 生產之抗體可包含一展現有改良醣化作用型樣的免疫球蛋 15白恆定或Fc區域。例如，依據本文教示所生產之抗體可更 強或具更高之專一性地結合至諸如補體及/或Fc受器之受 動分子，其可控制該抗體之許多免疫功能，諸如受動細胞 活性、溶解、補體所媒介之活性、抗體清除及抗體半生期。 典型結合至一抗體（例如一IgG抗體）之Fc區域的Fc受器包 20 括，但不限於，FcgRI、FcgRII，以及FcgRIII及FcRn子類型 之受器，包括這些受器之等位基因變異體及其它剪接形 式。Fc受器之總覽見於Ravetch及Kinet，An·· /mmw⑽/ 9:457-92, 1991 ; Capel 等人之 4:25-34， 1994 ;及de Haas 等人之/· C/h· 126:330-41， 27 200812577 1995，其母一者之全文均併入本文作為參考。 [0064] 僅作為一非限制性實施例，一可依據本發明 教示生產之抗體為一抗_ABeta抗體。抗_ABeta抗體為一種 在阿茲海默症之治療上之特殊有希望可能療法途徑。阿茲 5海默症(AD)為一種漸進式疾病，其導致老人痴呆（通常參

見：Selkoe，TINS 16:403，1993 ; Hardy 等人之 WO 92/13069 ； Selkoe, J. Neuropathol. Exp. Neurol. 53:438, 1994;Duff等人之Nature 373··476, 1995;Games等人之Nature 373:523, 1995，其每一者均併入本文作為參考）。廣泛地來 ίο說，該疾病分為二種類型：晚發型，其發生在老年（65+ 歲）’以及早發型，其在老年期之前，亦即在35至6〇歲之間， 即發生。二種疾病類型中，病理學相同但是如果在早年就 開始的話，其異常性則傾向更嚴重且普遍。該疾病的特徵 為在腦部至少有二種類型的損壞，神經纖維叢及老化斑。 15神經纖維叢為與τ (tau)蛋白相關之微管的細胞内堆積，該 z*蛋白由二條彼此成對扭絞之細絲所組成。老化斑（亦即 類澱粉斑）為無組織之高達150卜❿的神經軸細絲橫跨且有 細胞外類澱粉堆積於中心區域，其藉由腦組織切片之顯微 鏡分析可見到。腦内類殿粉斑之累積亦與唐氏症及其它認 20 知性疾病有關。 [0065] 該等斑塊之主要組成分為—名為从咖或 Beta-類婦胜肽之胜肽。ABeta胜肽為_較大穿舰蛋白的 -4-kDa具39·43個胺基酸之内片段，該穿膜_蛋白名為類 澱粉前驅蛋白（ΑΡΡ)。藉由不同的分泌酶酵素蛋白分解加工 200812577 APP的結果，發現ABeta主要呈一40胺基酸長度之短型及一 42-43胺基酸長度範圍之長型二種。App之疏水性穿膜區塊 部分係在ABeta之羧基端，且賦有ABetH《集為斑塊之能 力，特別是長型的狀態。類澱粉斑在腦中之積聚實際上造 5成神經細胞死亡。與此神經退化型相關之身體病症即特定 化為阿茲海默氏病症。 [0066] 在APP蛋白質内之許多突變已被關聯至阿茲 海默氏病症之出現〔參見，例如Goate等人之Nature 349 ·7〇4, 1991 (綠胺酸717變為異白胺酸）；chartier Harlan等人之 10 Nature 353:844, 1991 (纈胺酸717變為甘胺酸）；Murrell等 人之Science 254:97，1991 (纈胺酸717變為苯丙胺酸）； Mullan等人之Nature Genet· 1:345，1992 ( —雙重突變將離胺 酸595-甲硫胺酸596改變為天冬醯胺酸595-白胺酸596)，其 每一者均全文被併入本文作為參考〕。此類突變被認為會導 15 致阿茲海默氏病症，因APP變至ABeta之加工增加或改變， 特別是APP之加工而使長型之ABeta (亦即ABetal-42及 ABetal 43)的量增加。其它基因中之突變，諸如早衰基因 (presenilin gene)，PS1及PS2，被認為間接影響APP之加工 以產生增加量之長型的ABeta (參見Hardy，TINS 20: 20 154,1997，其全文併入本文中作為參考）。 [0067] 小鼠模式已被成功地用來測定阿茲海默症中 類澱粉斑之重要性（Games等人之前述之文件；Johnson-Wood等人之Proc· Natl· Acad· Sci· USA 94:1550, 1997，其 全文被併入本文作為參考）。特別是，當PDAPP轉殖鼠（其 29 200812577 表現人類APP之突變型，並在年幼期發展出阿茲海默氏病 症）被注射長型的ABeta時，它們顯示出阿茲海默症之進展 以及對ABeta胜肽之抗體效量的增加（Schenk等人之他如代 400, 173, 1999，其全文併入本文中作為參考）。上述觀察指 5出ABeta’特別是長型，為阿茲海默氏病症之一個主要病因。 [0068] ABeta胜肽可存在於溶液中且可於CNS(例如 CSF)及血漿中被偵測出。在特定情況下，可溶性紙㈣皮 轉形為發現於AD病人之神經炎斑塊及腦血管中之細絲 狀、毒性、/3-片型。涉及以抗ABeta之單株抗體進行免疫 1〇之治療已被研究。主動及被動二種免疫方式均已在具八〇之 小鼠模式中測試。主動免疫導致腦中斑塊承載有些下降， 但僅藉由鼻投藥。PDAPP轉殖鼠之被動免疫亦已被研究 (Bard等人之Nat.Med.6:916_19,2〇〇〇,其全文併入本文中 作為參考）。發現到辨識ABeta胺基端及中心區塊之抗體刺 15激八6以&沉積之溶噬作用，而對抗靠近鲮基端區之區塊的抗 體沒有。 [0069] 在被動或主動免疫之後的ABeta清除機制仍 持續在研究中。已提出有二種有效清除機制，亦即，中心 P牛解及周邊降解。中心降解機制依賴於能夠越過血-腦障 2〇蔽結合至斑塊且引發既存斑塊清除之抗體。已顯示出清 除作用可經由-Fe·受H·所媒介之溶嗟作用被促進（_ 等人之前述文件）。ABeta清除之周邊降解機制依賴於在 細CSF及血漿之間ABeta動態平衡於抗體投藥下破壞，導 致ABeta自一間隔傳送至另一間隔。中心所衍生之AB伽傳 30 200812577 送至其已降解之CSF及血漿之中。最近的研究推論出，可溶 性及未結合的ABeta係涉及與AD相關之記憶損傷，甚至沒 有減少腦中的類澱粉沉積。需要更進一步的研究以決定 ABeta清除作用之這些途徑的作用及/或相互影響（Dodel等 5 人之The Lancet Vol· 2:215, 2003，其全文併入本文中作為參 考）。 [0070] 抗- ABeta抗體為一治療AD之潛在可能途 徑，因為它們叢聚結合且清除該ABeta或包含該類澱粉斑之 其它成分。依照本揭露内容之教示所生產之抗-ABeta抗體 1〇玎適於較佳地治療阿茲海默症或其它相關疾病，例如，藉 由更有效地結合及清除類澱粉斑之成分、藉由較低或較輕 副作用地清除類澱粉斑，或者藉由防止類澱粉斑之形成或 建造。於特定實施例中，依照本教示内容所生產之抗_ABeta 抗體為單株抗體。 15 [〇〇71] 於特定實施例中，依照本教示内容所生產之 抗- ABeta抗體專一性地給合至ABeta之聚集形式而未結合 i溶解形式。於特定實施例中，依照本教示内容所生產之 抗-ABeta抗體，在其等不結合至該聚集形式之條件下，專 /性地結合至ABeta溶解形式。於特定實施例中，依照本教 2〇系内容所生產之抗-八以忪抗體結合至聚集及溶解形式二 耆。於特定實施例中，依照本教示内容所生產之抗_ABeta 抗體結合斑塊中之ABeta。於特定實施例中，依照本教示内 容所生產之抗-ABeta抗體越過血_腦障蔽。於特定實施例 中，依妝本教示内谷所生產之抗-ABeta抗體於一個體中減 31 200812577 少類澱粉之負擔。於特定實施例中，依照本教示内容所生 產之抗-A B e t a抗體於一個體中減少神經炎性之營養失調。 於特定實施例中，抗-ABeta抗體可維持突觸機構（例如突 觸素）。 5 [0072] 依據某些實施例，依照本教示内容所生產之 抗-ABeta抗體結合至一在ABeta之殘基13-28内的抗原決定 位（具有天然ABeta被標為1之第一個N端殘基）。於某些實 施例中，依照本教示内容所生產之抗-ABeta抗體結合至一 在ABeta之殘基19-22内的抗原決定位。於某些實施例中， 10 使用多種對不同的抗-ABeta抗原決定位具有結合專一性之 單株抗體。例如，於某些實施例中，一對ABeta之殘基19-22 内的抗原決定位具專一性的抗體與一對ABeta之殘基19-22 之外的抗原決定位具專一性的抗體共投藥。此類抗體可被 順序或同時投藥。對抗ABeta之外之類澱粉成分之抗體亦可 15 被使用（例如，投藥或共投藥）。 [0073] 於特定實施例中，依照本教示内容所生產之 抗-ABeta抗體比較於其它生產之抗-AB eta抗體更強或更專 一地結合至一 ABeta抗原決定位。一抗體之抗原決定位的專 一性可藉由已知技術來決定，例如，藉由形成一噬菌體陳 20 列庫，其中不同成員顯示出ABeta之不同子序列。然後該噬 菌體陳列庫被選擇出專一性結合至一待測抗體之成員。分 離出一序列家族。典型地，此一家族包含一共同的核心序 列，且於不同的成員中側翼序列之長度有所變化。專一性 結合至該抗體之最短核心序列典型地界定為被該抗體所結 32 200812577 合之抗原決定位。或者或再者，可於與一已決定出其抗原 決定位專一性之抗體的一競爭分析中測試抗體之抗原決定 位專一性。例如，與15C11抗體競爭結合至ABetai抗體被 認為其結合至與15C11相同或相似之抗原決定位，亦即在殘 5基ABeta 19-22之内。於特定實施例中，為抗原決定位專一 性篩選抗體係一有用之治療功效預測法。例如，已定出其 結合至一ABeta在殘基13-28内（例如結合至a召19-22)之 抗原決定位的一抗體，依據本發明之方法學，係可能可有 效預防及治療阿茲海默氏病症。 10 [0074]相對於結合至其它區域之單株抗體或結合至 全長ABeta之多株抗體血清，專一性結合至ABeta—較佳小 片段而不結合至ABeta其它區域之抗體具有許多優點。其它 的不談，對於相等的質量劑量而言，專一性結合至較佳小 片段之抗體的劑量包含-較高之可有效清除類澱粉斑之抗 I5體莫耳劑量。同樣地，專一性結合至較佳小片段之抗體可 引發一對抗類澱粉沉積之清除反應而不引發一對抗全長 APP多胜肽之清除反應，藉此減少可能的副作用。 [0075]於特定實施例中，上述單株、嵌合、單鏈或 人類化抗體可包含非天然存在於自然界中任何物種之任何 Μ抗體中之胺基酸殘基。此等外來殘基可被利肖，例如，賦 予該單株、嵌合、單鏈或人類化抗體新穎或經修飾之專一 性、親和性或受動作用。 酵素 33 200812577 [0076] 盆它類Κι丨+ 〃匕#Μ之已顯示可有效作為藥學及/或產 業試劑之醣蛋白肖括 姐 。酵素可為其醣化作用型樣會影 曰到酵素活性之酿泰白 來曰。因此，依照本發明具所欲醣化作 5用型=7 酵素的生產亦特別令人感興趣。 5 > [0077]僅作為一非限制性實施例，一葡萄糖腦御旨 酶(GCR)之缺陷導致一已知為高雪氏症(以磁er，s此·) 之病症#因葡萄糖腦苦能堆積於特定細胞之溶小體中所 造成。得高雪氏症之個體表現出多種症狀，包括脾腫大、 肝腫大肖路疾病、血小板減少症(thr〇mb〇cyt叩enia)及貧 10血症。Friedman&HayeS顯示出，於主要胺基酸序列中包含 單取代之重組GCR (rGCR)展現出一經改變之醣化作用 型樣，特別是海藻糖及N_乙醯葡萄糖胺殘基比天然之gcr 增加（參見美國專利第5,549,892號）。 [0078] Friedman及Hayes亦證實此種rGCR比天然之 15 GCR展現出改良之藥動學性質。例如，比起天然之gcr， 大約二倍量之rGCR靶定至肝臟庫佛氏細胞（Kupffer cells)。雖然二個蛋白質之主要胺基酸序列在一單一殘基有 所不同’ Friedman及Hayes假設該rGCR經改變之化作用型 樣亦可影響庫佛氏細胞之靶定。 2〇 [〇〇79] 一熟習此藝者將瞭解到酵素之其它已知實 例，其由於醣化作用型樣之改變而展現出經改變之酵素 性、藥動學及/或藥力學性質。 生長因子及其它信息分子 34 200812577 [0080]其它類別之已顯示可有效作為藥學及/或產 業試劑之醣蛋白包括生長因子及其它信息分子。因此，依 照本發明具所欲醋化作用型樣之受器的生產亦特別令人感 興趣。生長因子典型為醣蛋白，其由細胞所分泌 ’且結合 5並活化其它細胞上之受器，於該受器細胞中啟動一代謝或 發展。 [0081 ] %乳類生長因子及其它信息分子之非限制性 實施例包括細胞激素；表皮生長因子(EGF);血小板_衍生 生長因子（PDGF);諸如FGF-5之纖維母細胞生長因子 10 (FGFs) ’胰島素類之生長因子J及Η (; des(l-3)-IGF-I (腦);胰島素類生長因子結合蛋白質； 諸如CD-3、CD-4、CD-8及CD-19之CD蛋白質；紅血球生成 素，骨質誘導因子；免疫毒素；骨成形蛋白質(BMp);諸如 干擾素-α、-石及之干擾素；例如m_csf、gm-CSF及 15 G~CSF之促群落因子(CSF);大部分之間白素；腫瘤壞死因 子(TNF)/3，促濾泡激素；抑鈣素；黃體形成激素；諸如蛋 白質C之抗-凝結因子；心房利鈉因子⑼咖丨natriuretic factor)，肺表面活性素(lung surfactam);諸如尿激酶型或人 類尿液或組織型纖維蛋白溶酶原激活素(t_pA)之纖維蛋白 2〇溶酶原激活素（plasmin〇gen activat〇r);造血性 (hematopoietic)生長因子；及腦啡肽酶（enkephalinase)。一 熟悉該技蟄之人士將瞭解其它可依照本發明被表現的生長 因子或信息分子。 [0082]生長因子及其它信息分子之醣化作用型樣的 35 200812577 特定改變已顯示出對其治療性質具有巨大的影響。僅作為 一非限制性實施例，一治療患有慢性貧血之病人的一般方 法，係提供其多次注射的重組人類紅血球生成素 (rHuEPO)，以增強其紅血球細胞之產生。—rHuEPO之類似 5 物，達貝汀 a (darbepoetin alfa)(Aranesp®)，已被發展為具 有一在體内比一般rHuEPO較長之财久性。達貝汀α與 rHuEPO間之主要不同為存在有二個額外的含唾液酸之Ν- 鍵結寡聚醣鏈。達貝汀α之生產已利用活體外醣工程而完 成（參見 Elliott 之 Nature Biotechnology 21(4):414-21, 10 2003)。Elliott等人利用活體外之突變技術以併入額外的醣 化作用位址至rHuEPO多胜肽主幹中，得到達貝汀α類似物 之表現。該額外的寡聚醣鏈係位於ΕΡ0受器結合位之末梢 且顯然不干擾與受器之結合。然而，達貝汀〇：之半生期係 比rHuEPO更高出高達三倍，得到更有效得多之治療試劑。 15 [〇〇83] 此一實施例證實，生長因子或其它信息分子 之醣化作用型樣的改變，可對一治療性醣蛋白之活體外穩 定性及/或活性具有巨大影響。因此依照本發明教示内容， 一所欲生長因子或其它信息分子之表現，可得到具有改良 醣化作用型樣及改良治療性質之經表現生長因子或信息分 20 子。 [0084] 其它類別之已顯示可有效作為藥學及/或產 業試劑之醣蛋白為受器。因此，依照本發明具所欲醣化作 36 200812577 用型樣之文杰、的生產亦特別令人感興趣。受器典型為穿膜 釀蛋白，其因辨識一細胞外配位子而作用。除了配位子辨 識區塊之外，叉器通常具有一蛋白質激酶區塊，其藉由當 一旦結合該配位子時磷酸化標靶細胞内之分子而啟動一信 5息途徑，引起細胞内發展或代謝變化。 [0085]於特定實施例中，要依照本發明被生產的醣 蛋白受器為一受器酪胺酸激酶(RTK)。該RTK家族包括對多 種細胞態樣之不同功能極為重要的受器（參見，例如，

Yarden及Ullrich，Am 心仏57:433-478，1988 ; 10 Ullrich及Schlessinger，CW/ 61:243-254, 1990,其併入本文作 為芩考）。RTK之非限制性實施例包括纖維母細胞生長因子 (FGF)受器家族之成員、表皮生長因子(EGF)受器家族之成 員、血小板衍生生長因子(PDGF)受器、具免疫球蛋白及EGF 同形區塊-1 (TIE-1)及TIE-2受器之酪胺酸激酶（sat〇等人之 15 講 376(6535):70-74，1995)以及c-Met受器，其有些已 被暗示可直接或間接促進血管新生（Mustonen及Alitalo，乂 Ο//价说129:895-898, 1995)。RTK之其它非限制性實施例 包括胎肝激酶1 (FLK-1)〔有時係指一含激酶插入區塊之受 器(KDR) (Terman等人之0卿客撕 6:1677-83，1991)或血 2〇 管内皮細胞生長因子受器2 (VEGFR-2)〕、fms-類之酪胺酸 激酶-1 (Flt-1) (DeVries等人之Sci⑼ce 255;989-991，1992 ; Shibuya等人之5:519-524，1990)，有時指為血管 内皮細胞生長因子受器1 (VEGFR-1)、神經纖毛素 -l(neuropilin-l)、内皮素（endoglin)、内皮唾酸素（endosialin) 37 200812577 及Axl。於特定實施例中，腫瘤壞死因子及万受器 (TNFR-1 ;公開於1991年3月20日之ΕΡ 417,563 ;以及 TNFR-2 ;公開於1991年3月20曰之ΕΡ417,014)依照本發明 被表現（參閱’請見Naismith及Sprang, J /π//麵m. 5 47(1-2):1-7, 1995-96，其併入本文作為參考）。 [0086] 於特定實施例中，一依照本發明要被生產之 醣蛋白受器為一G-蛋白耦合性受器（GPCR)。GPCR為具有 七個穿膜區塊之醣蛋白。一配位子一經結合至一GPCR時， 一信息在細胞内被傳遞，其導致該細胞之生物或生理性質 10之改變。GPCR為供藥物作用及發展之一主要標靶。事實 上’受态已造就了超過半數的現今已知藥物（Drews, Nature

Biotechnology，14:1516, 1996)，並且GPCR代表治療性干涉 最重要的標靶，有30%之臨床處方藥拮抗或促進GPCR (Milligan，G· and Rees, S·，TIPS，20: 118-124, 1999)。由於 15此類受器具有一經確定、實證之作為治療標靶之記載，依 照本發明生產具有所欲醣化作用型樣之GpCR亦特別令人 感興趣。例如，依照本發明教示所表現之具有所欲醣化作 用型樣的GPCR的細胞外區塊，可作用為重要的治療劑，藉 由效置測疋或封存法決定出其結合至一内源性GPCR之配 20 位子。 [0087] 伴隨著G-蛋白及受動子（由g-蛋白所調節之 細胞内酵素及通道），GPCR為連接細胞内第二信使狀態至 細胞外輸入的一組合式傳訊系統。此類基因及基因產物係 可能的疾病致病劑。 38 200812577 [0088] GPCR蛋白質總族（superfamily)目前包含超 過250型之旁系同源體(paralogues)，意指由基因複製（或其 匕方法）所產生之變異的受器’與直系同源體(orth〇l〇gues) 相反，其為不同物種間的相同受器。該總族被區分為五個 5家族：第1族，由視紫質（也〇(1(^丨11)及/5 2-腎上腺素受器所 代表之受器，且目前由超過200種獨特成員所表徵；第π族， 近來特徵化為副甲狀腺荷爾蒙/抑鈣素/分泌素受器家 方矢’苐III族’哺乳類之代谢型麵胺酸(11^1^|：)〇匕(^〇 glutamate) 受器家族；第IV族，cAMP受器家族，對黏菌（D. disc〇ideum) 10之趨化反應及發展具重要性；以及第v族，諸如STE2之真 菌雜交費洛蒙。 [0089] GPCR包括生物源胺、發炎之脂質媒質、胜肽 荷爾蒙及感覺信息媒質之受器。當該受器結合至其細胞外 配位子時，GPCR被激活。GPCR之構形變化，其來自配位 15子-受器之相互作用，影響G蛋白結合至該GPCR細胞内區塊 之親和性。此使得GTP能以增強的親和性結合至該G蛋白。 [0090] G蛋白因GTP之活化致使G蛋白α次單元與 腺酸環酶或其它第二信使分子產生子有相互作用。此一相 互作用調節腺酸環酶之活性且因此產生一第二信使分子， 20 CAMP。CAMP調節其它細胞内蛋白質之磷酸化作用及活 化。或者，諸如cGMP或花生四烯酸(eic〇sin〇id)之其它第二 信使奸的細胞性含量，可因仰⑶之活性被向上調節或向 下调即。a亥G蛋白α次單元藉由GTp的水解作用（因⑽酶） 被去活化，且該α、錢7次單元再聚集。然後異質三聚 39 200812577 體G蛋白自腺酸環酶或其它第二信使分子產生子分離。 GPCR之活性亦可被細胞内及細胞外區塊或環之磷酸化所 調節。 [0091] 麩胺酸受器形成一種對神經傳導很重要的 5 GPCR群組。麩胺酸為CNS中一主要之神經傳導子，且被相 信在神經塑性、認知、記憶、學習及些許神經性疾病（諸 如癲癇、中風及神經退化）上具有重要角色（Watson, S.及 S· Arkinstall，1994之The G- Protein Linked Receptor Facts Book，Academic Press，San Diego CA，pp. 130-132)。這些麩 10胺酸之作用被二種不同類別之名為離子通道型（i〇notropic) 及代謝型（metabotropic)的受器所媒介。離子通道型受器包 含一内在之陽離子通道且媒介麵胺酸之快速興奮作用。代 謝型受器係調節型，藉由抑制鈣依賴性鉀傳導率而增加神 經元之膜興奮性，以及抑制又加強離子通道型受器之興奮 15傳遞。代謝型受器基於促進劑藥學及信息傳導途徑被分類 為五種亞型，且廣泛分布於腦組織中。已顯示出，在人類 第Ια代謝型麩胺酸(mGlul alpha)受器的功能上，N-鍵結之 醣化作用是很重要的（Mody等人之Neuropharmacology 38(10):1485-92，1999)。mGlulalpha被正常表現，至少部 20分，為一由大約145及160 KDa之單體所組成之二聚體。以 衣黴素（tunicamycin)為一 N-鍵結之醣化作用之可能抑制 劑，以衣黴素處理mGlulalpha，Mody等人證實雖然細胞表 面表現不受影響，但是只有一具由其主要胺基酸序列預測 為130 kDa質量之單鏈胜肽被表現。在功能上，以衣黴素處 40 200812577 理比未處理之細胞群體，受促進劑刺激之填酸肌醇 (phosphoinositide)水解減少了大約50%。因此，依據本發明 系統調整表現之GPCR醣化作用型樣，在調節所表現GPCR 之信息功能上可為有用的，且可能可控制或影響所表現 5 GPCR之藥學或其它性質。 [0092] 血管活性腸内多胜肽(VIP)家族係為一其作 用亦由GPCR所媒介之相關多胜肽的群組。此一家族之關鍵 成員為VIP本身、分泌素及生長激素釋出因子(GRF)。VIP 具有一廣泛廓形之生理學作用，包括平滑肌之鬆弛、各種 10 組織中分泌之刺激或抑制、各種免疫細胞活性之調節，以 及CNS中之各種興奮及抑制活性。分泌素於胰臟及腸内刺 激酵素及離子之分泌，且亦少量出現於腦中。VIP受器之醣 化作用已被顯示對其同源（cognate) VIP之結合上具有重要 之影響（Chochola等人之J· Biol. Chem. 268: 2312-2318, 15 1993 )。藉由以麥胚凝集素處理該VIP受器而立體阻礙寡聚 醣鏈，係以一劑量依賴方式顯著地抑制了 VIP結合，且降低 了受VIP刺激之cAMP反應。再者，VIP受器中特定的N-鍵 結之醣化作用位址的突變導致該受器保留在内質網中，表 示適當的醣化作用對於遞送至細胞表面至關重要 20 (Couvineau等人之Biochemistry 35(6):1745-52, 1996)。因 此，依據本發明系統調整所表現GPCR之醣化作用型樣，可 用於調節（例如，增加或減少）該所表現GPCR對其同源配 位子之結合，且可能控制或影響該所表現GPCR之藥學或其 它性質。 41 200812577 [_3]-般而言’本發明之實施切選擇—感興趣 之醣蛋白，且將知道其精確的胺基酸序列。本發明技術已 被成功地應用於〇-鍵結（實施例1及2)及义鍵結之（實施 例3及4)醣蛋白二者，表示本發明通常對於釀^白之^ 5係有用的。任何要被依照本發明而表現之醣蛋白，可具有 其本身特別的特性，且可影響到被培養細胞之細胞密度或 存活性，可表現出比其它在相同培養條件下生長之其它醣 蛋白更低之量’且可視確實的培養條件及進行步驟而在一 或多個位址被不同地醋化。一熟習此藝者能夠適當地修改 10依本發明教示用於生產一特定醣蛋白之步驟及組成物，以 最適化細胞生長及任何所欲表現醣蛋白之生產及/或醣化 作用型樣。 [0094]於特定實施例中，腫瘤壞死因子抑制子，呈 腫瘤壞死因子及/5受器之形式（TNFH ;公開於1991年 15 3月20日之EP 417,563 ;以及TNFR-2，公開於1991年3月2〇 曰之EP 417,014，其每一者均全文併入本文作為參考），依 照本發明系統及本發明方法被表現（參閱，請見Naismith and Sprang，//η//⑽mi· 47(1-2):1-7, 1995-96，其全文併入本 文作為參考）。依據某些貫施例，一腫瘤壞死因子抑制子包 2〇含一可溶之TNF受器。於特定實施例中，一腫瘤壞死因子 抑制子包含一可溶之TNFR-Ig。於特定實施例中，本發明之 TNF抑制子為可溶形式之TNFRI及TNFRII。於特定實施例 中，本發明TNF抑制子為可溶的TNF結合蛋白質。於特定實 施例中，本發明TNF抑制子為TNFR-Ig融合蛋白質，例如 42 200812577 或伽。本文中所使用之「啊」係指 TNFR-Fc ’其為_二聚體，二個分子的ρ75ΤΝρα受器之細 胞外部分’每一分子由一235胺基酸的人類igGl之Fc部分所 組成。 5 盘塵瓒蛋白導入至宿主細胞中 [〇〇95]通常，一導入至細胞中之核酸分子編碼該所 欲依據本發明被表現之醣蛋白。或者，一核酸分子可編碼 一藉由該細胞誘發該所欲醣蛋白表現之基因產物。例如， 10導入之基因物質可編碼一活化一内源性或異源性醣蛋白之 轉錄的轉錄因子。或者或再者，一導入之核酸分子可增加 該細胞所表現之醣蛋白的轉譯或安定性。 [0096] 適於將足以達到一感興趣之醣蛋白之表現的

核酸導入至哺乳類宿主細胞之方法係為業界所習知。參 15 見’例如，Gething等人之撕_/^，293:620-625, 1981 ; Mantei 專人之 281:40-46，1979 ; Levinson 等人之 EP 117,060 ;以及EP 117,058，其每一者均併入本文作為參考。 對哺乳類細胞而言，一般將基因物質導入至哺乳類細胞的 方法包括Graham及van der Erb之構酸約沉殿法（Virology， 20 52:456-457，1978 )或者 lipofectamine™ ( Gibco BRL )

Hawley-Nelson之方法（Focus 15:73, 1993)。哺乳類細胞宿 主系統轉形之概略部分已由Axel說明於1983年8月16曰所 核准的美國專利第4,399,216號中。用於將基因物質導入至 哺乳類細胞之各種技術，參見Keown等人之A Μ 43 200812577 五1989、Keown 等人之/π £>zz}W6^(9g}；, 185:527-537，1990,以及Mansour等人之336:348-352, 1988。 [0097] 於某些實施例中，一欲被導入之核酸係以一 5 裸核酸分子之形式。例如，導入至一細胞中之核酸分子可 僅由編碼釀蛋白之核酸及必需基因控制子所組成。或者， 一編碼醣蛋白之核酸（包括必需調節子）可被包含於一質 體載體之中。用於在哺乳類細胞中表現醣蛋白之合適載體 的非限制性代表實施例包括pCDNAl ; pCD，參見Okayama 10 等人之 Mo/· Ce// 5ί·ο/· 5:1136-1142，1985 ; pMClneo Poly-A，參見Thomas等人之〇// 51:503-512, 1987 ; —諸如 pAC 373或pAC 610之桿狀病毒(baculovirus)載體；CDM8， 參見Seed，Β· 329:840，1987 ;以及pMT2PC，參見

Kaufman等人之五6:187-195, 1987，其每一者均全文 15 併入本文作為參考。於某些實施例中，一欲被導入至一細 胞中之核酸分子係被包含於一病毒載體之中。例如，一編 碼酶蛋白之核酸可被插入至病毒基因體（或一部分病毒基 因體）之中。調控醣蛋白之表現的調節子可由插入至該病 毒基因體中之核酸而被包括（亦即連結到經插入至該病毒 20基因體中之基因），或者可由該病毒基因體本身所提供。 [0098] 裸DNA可藉由形成一包含該〇1^八及磷酸鈣 之沈澱物而被導入細胞中。或者，裸DNA之導入至細胞的 方法’亦可藉由形成該DNA及DEAE-右旋糖苷（dextran)2 混合物以及將該混合物與細胞培孵或者藉由將該細胞及該 44 200812577 DNA—起培孵育一適當緩衝液中並送該細胞至一高電壓電 脈衝（例如，藉由電穿孔法）。將裸DNA導入至細胞之另一 方法為藉由將該DNA與一包含陽離子性脂質之脂質體混 合。然後將該DNA/脂質體複合物與細胞培孵。裸DNA亦可 5 藉由例如’顯微注射(microinjection)直接注射入細胞。 [0099] 或者，裸DNA之導入至細胞亦可藉由將該 DNA複合至一陽離子，諸如聚離胺酸，其會被耦合至一細 胞表面受器之配位子（參見例如Wu，G.及Wu，C H. j. Bi〇1.

Chem. 263:14621，1988 ; Wilson等人之 J· Biol· Chem. 10 267:963-967, 1992;以及美國專利第5，166,32〇號，其每一者 之全文均併入本文作為參考）。DNA-配位子複合物對受器 之結合因為受器所媒介之内噬作用而促進了 DNa的攝取。 [00100] 包含特殊核酸序列之病毒載體之使用，例 如，一編碼醣蛋白之cDNA為將核酸序列導入至一細胞中之 15 一通常方法。以一病毒載體注射細胞具有優點，即大部分 的細胞接受該核酸，其可排除需選用接受該核酸之細胞的 要求。再者，在病毒載體内之編碼分子，例如，藉由一包 含於該病毒載體中之cDNA，通常足以於已吸收病毒載體核 酸之細胞中被表現。 2〇 [〇〇101]缺陷性反轉錄病毒被特性化供用於為了基因 治療目的之基因轉移（參閱請見Mmer，A D. m〇〇d 76:271， 1990)。一重組型反轉錄病毒可被建構，令一編碼感興趣醣 蛋白之核酸插入至該反轉錄病毒之基因體中。再者，反轉 錄病毒基因體之部分可被移除而使該反轉錄病毒複製不 45 200812577 全。然後此一複製不全之反轉錄病毒被包裹為病毒體，其 可被用於經由一輔助病毒之使用而藉標準技術來感染細 胞。 [00102]腺病毒之基因體可被操縱使其編碼且表現出 5 —感興趣之醣蛋白，但在其於一正常溶解性病毒生命期中 穩定複製方面卻為失活的。蒼見’例如，Berkner等人之

BioTechniques 6:616，1988 ; Rosenfeld 等人之 252:431-434，1991 ;及 Rosenfeld 等人之 CW/ 68:143-155 1992。衍生自腺病毒株Ad型5 dl324及其它腺病毒株之合適 10 腺病毒載體（例如Ad2、Ad3、Ad7等）為熟習此藝者所習 知。重組型腺病毒之優點在於其不需分裂細胞作為效率之 基因遞送媒介體，且其可被用於感染廣泛之細胞型態，包 括氣道上皮細胞（Rosenfeld等人之1992，前已引述）、内皮 細胞（Lemarchand 等人之 ZVoc. Natl· Acad· Sci· USA 15 89:6482-6486，1992)、肝細胞（Herz及Gerard,尸rac· A^i/·

Ac似/·&/· tASA 90:2812-2816, 1993)以及肌肉細胞（Quantin 等人之Prac·倫"· Ac似/· Sd· iASA 89:2581-2584, 1992)。再 者，經導入之腺病毒DNA (及包含於其中之外來DNA)不 被整合至宿主細胞之基因體中，但保留游離型’因此避免 20 了在導入之DNA整合至宿主基因體中（例如反轉錄病毒 DNA)的情況下插入性突變所造成之可能問題。並且，該 腺病毒基因體攜帶外來DNA之能力相對於其它基因載遞載 體而言為非常大（達8千鹼基）（Berkner等人，前已引述； Haj-Ahmand及Graham，/· V/ra/. 57:267, 1986)。大部分目前 46 200812577 使用中之複製不全腺病毒載體係被刪除全段或部分病毒E i 及E3基因，但保留多達80%之腺病毒基因物質。 [00103] 腺體相關病毒(AAV)係一種自然發生之缺陷 型病毋·’其舄要其匕病毒’諸如一腺病毒或一疮療病毒， 5作為一輔助病毒以能夠完成複製及完成一多產之生命期 (參閱 ύ青見 Muzyczka 專人之 CWr· Tbp/cs M/cra·⑽d /mm⑽〇/·，158:97-129, 1992)。該等少數病毒之又一者，其 可令其DNA融合至非-分裂細胞中，且展現出一高頻率之穩 疋性融合（參見例如Flotte等人之Am. /. /^577/r. CW/. Λ/ο/. 10 7:349-356， 1992 ; Samulski 等人之 /· Vira/· 63:3822-3828，1989 ;以及 McLaughlin 等人之 /· V/ra/· 62:1963-1973, 1989)。包含少至AAV300個鹼基對之載體可 被包裹且可融合。外源性基因DNA之尺寸空間被限制為大 約4.5 kb。一諸如Tratschin等人所述之AAV載體（Μο/· Ο//· 15 价〇/· 5:3251-3260, 1985)可被用於將DNA導入至細胞中。 使用AAV載體已將多種核酸導入至不同的細胞型態中（參 見例如 Hermonat 等人之 Prac· Natl· Acad· Sci· USA 81:6466-6470，1984 ; Tratschin 等人之 Mo/· CW/· β/ο/· 4:2072-2081，1985 ; Wondisford 等人之 Mo/·五m/oenW· 20 2:32-39, 1988 ; Tratschin等人之Λ 51:611-619, 1984 ; 以及Flotte等人之乂所〇/· C/^m. 268:3781-3790, 1993)。 [00104] 當用於將核酸分子導入至一細胞群體中導致 該等細胞之大部分的改變且由該等細胞有效表現醣蛋白 時，該經改變之細胞群體可被使用而不需進一步於該群體 47 200812577 中分離或再選殖出個別細胞。亦即，由該細胞群體可有足 夠的®I蛋白生產，使得不需進一步的細胞分離，且該群體 了被立即使用於接種一細胞培養物以供該醣蛋白之生產。 或者’可能會想要由有效生產該醣蛋白之一少數細胞或一 5單一細胞分離且擴展一同質性細胞群體。 [00105] 有別於將一核酸分子導入至一編碼感興趣醣 蛋白的細胞中，該經導入之核酸可編碼另一多胜肽或蛋白 質，其誘發或增加由一細胞内源性所產生之醣蛋白的表現 量。例如，一細胞可能能夠表現一特定醣蛋白但可能在未 10 另外處理該細胞時不能夠如此。同樣地，該細胞可能表現 出對所欲目的而言不足量的醣蛋白。因此，一刺激該所欲 醣蛋白之表現的試劑可被用於誘發或增加該細胞之醣蛋白 表現。例如，該所導入之核酸分子可編碼一活化或向上調 節該所欲醣蛋白之轉錄的轉錄因子。此一轉錄因子之表現 15 接著導致該所欲醣蛋白之表現或更豐沛的表現。 [00106] 於特定實施例中，一導向醣蛋白之表現的核 酸被穩定地導入至該宿主細胞中。於特定實施例中，一導 向醣蛋白之表現的核酸被暫時性地導入至該宿主細胞中。 一熟悉該技藝之人士能夠基於其實驗需要選擇是否穩定地 20 或暫時性地將一核酸導入至該細胞中。 [00107] 一編碼一感興趣之醣蛋白的基因可任擇地被 連結至一或多個調節性基因控制子。於特定實施例中，一 基因控制子導向該醣蛋白之構成性表現。於特定實施例 中，可使用一基因控制子，其提供一編碼所欲醣蛋白之基 48 200812577 因的可誘發表現。一可誘發基因控制子（例如一可誘式促 進子）之使用使能於該細胞中調控該醣蛋白之生產。可能 用於真核細胞中之可誘發基因控制子的非限制性實施例包 括荷爾蒙所調節之因子（例如，參見Mader，S.及White, J.H. 5 之尸π 爪说 Acd 心/· iASA 90:5603-5607, 1993)，合成的 配位子所调郎之因子（參見’例如Spencer，D.m·等人之 Scknce 262:1019-1024，1993)以及離子化的放射所調節之 因子（例如，參見Manome，Y·等人之 32:10607-10613, 1993; Datta，R·等人之/v〇c· Α^/·&αί/·版 10仍A 89:10149-10153, 1992)。業界所已知之另外的細胞單 一性或其它調控系統可依照本發明而被使用。 [00108] —熟習此藝者將能夠選擇及，任擇地，適當 修改依照本發明教示内容之使細胞表現所欲醣蛋白之基因 導入的方法。 15 細胞 [00109]任何可容許細胞培養且表現醣蛋白之宿主細 胞均可依照本發明被利用。於特定實施例中，一宿主細胞 為哺乳類細胞。可依照本發明被使用之哺乳類細胞的非限 20制性實施例包括BALB/C小鼠骨髓瘤細胞株（NSO/l，ECACC No: 85110503 )，人類視網膜母細胞（per.C6 (CruCell， Leiden，The Netherlands));被SV40轉形之猴子腎CV1 細胞 株（COS-7，ATCC CRL 1651);人類胚胎腎細胞株（經再 選殖供生長於懸浮培養物中之293或293細胞，Graham等人 49 200812577

之J· Gen Virol·，36:59,1977);幼倉鼠腎細胞（ΒΗΚ，ATCC CCL 10);中國倉鼠卵細胞+/-DHFR(CHO，Urlaub及Chasin，

Prac· Acad. 5W· iASA，77:4216，1980);小鼠賽透力細 胞（sertoli cells) ( TM4 5 Mather, Biol. Reprod., 23:243-251, 5 1980);猴子腎細胞（CV1 ATCC CCL 70);非洲綠猴腎細 胞（VERO-76，ATCC CRL-1 587 );人類子宮頸癌細胞

(HeLa，ATCC CCL 2);犬腎細胞（MDCK，ATCC CCL 34);水牛大鼠肝細胞（BRL3A，ATCC CRL 1442);人類 肺細胞（W138，ATCC CCL 75);人類肝細胞（Hep G2， 10 HB 8065);小鼠乳腫瘤（MMT 060562，ATCC CCL51 ); TRI細胞（Mather等人之A励A TV·K Acd· %··，383:44-68, 1982) ; MRC 5細胞；FS4細胞；以及人類肝癌細胞株（Hep G2) 〇 [00110] 再者，任何號碼之可購得或非可購得之表現 15醣蛋白的融合瘤細胞株可依照本發明而被利用。一熟習此 蟄者將瞭解到融合瘤細胞株可能具有不同的營養需求及/ 或可能需要不同的培養條件以最適化生長及醣蛋白表現， 且將能夠視需要修改條件。 [00111] 如上所記，許多例子中，細胞將被選擇或工 20 化以產生⑧位準之醣蛋自。通常，細胞將被人工操縱以 產生间位準之醣蛋白，例如藉由一編石馬所欲釀蛋白之基因 的導入及/或藉由供調節彼基因表現之基目控制子（無論内 源性或經導入）的導入。 [00112] —熟習此藝者將瞭解到，於不同細胞型態中 50 200812577 所產生之醣蛋白可包含不同的所得醣化作用型樣。例如， Przybylo等人證實，鈣黏蛋白（cadherin)當表現於非惡性上 皮輸尿管細胞、v-raf轉染HCV29細胞及膀胱之過渡細胞癌 中時，醣化作用型樣有所不同（參見prZybyl〇等人之cornea 5 Ce// ⑽α/，2(1):6, 2002)。Lifely等人證實，一人類 化IgG抗體當表現於CHO、Y0骨髓瘤及NS0骨髓瘤細胞株中 時，其醣化作用型樣及生物活性有所不同（參見Lifely等人 之G/ycMZo/叹;y. 5(8):813-22，1995)。一熟習此藝者將能夠 在無過度實驗下選擇一用於生產一特定醣蛋白之所欲細胞 10株。不論最終選擇了哪一個細胞株，蛋白可依照本發明 被表現’得到一更廣泛的_化作用型樣。 [00113]特定蛋白對於細胞生長、細胞存活或該細 胞之其它特性可能有害，其在某方面終究限制了所欲醣蛋 白之生產。甚至在一特定型態之經工程化以表現一特定醣 15蛋白之細胞群體之中，該細胞群體之中存有變異性使得特 定的個別細胞將生長較好、產生較多的所欲醣蛋白、產生 一具更廣泛之醣化作用型樣的醣蛋白，或者產生一其化 作用型樣更精確地反映出天然醣蛋白之醣化作用型樣的醣 蛋白。於特定實施例中，一細胞株被實施者憑經驗選擇出 20供於在特定所選定之培養該細胞的條件下大量生長。於某 些貫施例中，基於細胞生長、最終細胞密度、細胞存活百 分率、所表現醣蛋白之效量、募聚醣側鏈之範圍及組成， 或者這些或其它被實施者認定為重要之條件的組合，經工 程化以表現一特定醣蛋白之個別細胞被選用於大規模生 51 200812577 產0 培養細胞 [00114] 本發明可以任何可變化以表現醣蛋白之細胞 5 培養方法被使用。例如，細胞可於批次或批次饋飼培養中 被培養，其中該培養在該醣蛋白足夠表現之後被終止，其 後收穫該所表現之醣蛋白。或者，細胞可被培養於灌流式 培養(perfusion culture)中，其中該培養不會終止且會週期性 或持續性地加入新的養份及其它成分至該培養中，期間週 10期性或持續性地收穫所表現之醣蛋白。 [00115] 細胞可由實施者選用以任何慣用的體積被培 養。例如，細胞可被培養於體積自數毫升至數升範圍内之 小規模反應器中。或者，細胞可被培養於體積自大約至少1 升至 10、100、250、500、1000、2500、5000、8000、1〇,〇0〇、 15 12,000升或更大或者體積介於其間之範圍内的大規模的產 業生物反應器中。 [00116] 細胞培養溫度之選用可主要基於細胞可維持 存活的溫度範圍、於其中可產生一高位準之醋蛋白的範 圍’及/或於其中所表現之醣蛋白包含一所欲之醣化作用型 2 〇 、 樣的範圍。例如，CHO細胞於大約37°C時在產業適當位準 下生長良好且可產生具所欲醣化作用型樣之醣蛋白。一般 而言，大部分的哺乳類細胞在約25°C至42°C之範圍内生長 良好’且可以產業上適當位準產生具所欲醣化作用型樣的 聰蛋白，雖然由本揭露内容所教示之方法不限於這些溫 52 200812577 度。特定的哺乳類細胞在物。u4(rc之範圍内生長良 好，且可以產業上適當鱗產生具所欲醣化仙型樣的酷 蛋白。於特定實施财’-細胞培養物在細胞培養過程中， 可培養在 2〇、21、22、23、24、25、26、27、28 29 3〇、 31、32、33、34、35、36、37、38、39、4〇41、42 43、 44、45 C之溫度—或多次。熟習此藝者能夠選擇適當可培 養細胞之溫度，端賴於糾胞之特別需要及實施者之特別 生產需求而定。 [00117]再者培養物可在該培養期間接受一或多 1〇個溫度變化。當改變一培養物之溫度時，該溫度變化f為 相對漸進式。例如，可花費數小時或數天以完成該溫度變 化。或者，該溫度變化可岛相對陡變。該温度可在培養過 程期間穩定提高或降低。氣者，該溫度可在培養過程期間 的不同時點不連續地提高或:降低。後來的溫度或溫度範圍 15可比起始或先前的溫度或溫度範圍更高或更低。熟習此藝 者將瞭解到多數次的不連續溫度變化係包含於此實施例之 中例如/JDL度可、交化一次（更高或更低的溫度或溫度範 圍），該等細胞維持在此一溫度或溫度範圍一段特定的期 間，其後該溫度可被再次變化至一新的溫度或溫度範圍， 20其可比先前的溫度或溫度範圍更高或更低。在每一次不連 續k化之後的培養溫度可岛固定，或者可被維持於一特定 的溫度範圍。 [00118]至於起始溫度或溫度範圍，一細胞培養物之 溫度或溫度範圍在溫度變化後的選定，一般主要係基於該 53 200812577 細胞培養物持續存活之溫度、該範圍之中可產生_高位準 之醋蛋白，及/或該範圍之中所表現讀蛋白包含-所欲之 聽化作用型樣。—般”，大部分的哺乳類細胞在—約25。 c至4rc之㈣⑽持存活紅產業上料鱗表現 欲膽化作用型樣之畴蛋白，_由本揭露内容所教示之方 法不限於糾溫度。於狀實關巾，__在約25。 10 一 _19]於特定實施例中，批次或批次饋飼培養可在 一旦該所表現之料白達到—足夠高之效量時及/或一旦 該所表現之St蛋自展現出—所欲之㈣二 β止，由實施者之需要嫩。另外或或者，批次或=饋 飼培養可在一旦該細胞達到一足夠高之密度時被終止，由 貫施者之需要所決定。例如，該培養物可在_旦該細胞達 到最大存活密度的百分之1、5、1〇、15、2〇、25、3〇、35、 C至35 C之範圍内保持存活並以產業上適當位準表現且所 欲醣化作用型樣的糖蛋白。熟f此藝者能夠選擇適當可典 養細胞之溫度或溫度_，端_細蚊_需要及實^ 者之特別生產需求㈣。該等細胞可被料任何時間長 度’端賴實施者之特別需要及該等細胞本身之需求而定。 4〇、45、50、55、60、65、70、75、80、85、9〇、％ 或 99 2〇之百分比時被終止。另外或或者，批次或批次饋飼培養可 在諸如乳酸鹽或銨之代謝廢物過多累積之前即被終止。 [00120]於特定例子中’在後來的生產階段期間補充 已被細胞消耗或代謝掉的養份或其它培養基成分係為有利 的。作為非限制性實施例，以下列來補充一細胞培養物係 54 200812577 為有利的：荷爾蒙及/或其它生長因子、無機離子（諸如， 例如’鈉、氣化物、妈、鎭及碟酸鹽）、缓衝劑、維他命、 核苦或核普酸、微量元素（通常以極低終濃度存在之無機 化合物）、胺基酸、脂質，或者葡萄糖或其它能量源。此類 5 補助成分可一次全部加至該細胞培養物，或者它們可以一 系列式之加入提供給該細胞培養物。 [00121] 於特定實施例中，細胞係依照任何說明於美 國臨時專利申請案第60/605,097號中之細胞培養方法被培 養，其併入本文作為參考。於特定實施例中，細胞係在一 10 或多種說明於美國專利申請案第11/213,308號中之條件下 被培養，其併入本文作為參考。 [00122] —熟習此藝者能夠裁定出特定細胞培養條件 以最適化該細胞培養之特定特性，包括但不限於生長速 率、細胞存活性、該細胞培養物之最終細胞密度、諸如乳 15 酸鹽及銨之有害代謝副產物的最終濃度、所表現醣蛋白之 最終效量、募聚醣侧鏈之範圍及組成，或者這些或其它被 實施者認定為重要之條件的組合。 經表現之醣唇白的分離 2〇 [00123] —般而言，典型地會想要分離及/或純化根據 本發明所表現之醣蛋白。於特定實施例中，該經表現之醣 蛋白被分泌至培養基中且因此細胞及其它固體可被移除， 以例如藉由離心或過濾，作為純化過程之第一步驟。 [00124]或者，該經表現之醣蛋白可能結合至該宿主 55 200812577 細胞之表面。例如，培養基可被移除且將表現醣蛋白之宿 主細胞溶解而作為純化過程之第一步驟。哺乳類宿主細胞 之溶解可藉由熟悉該技藝之人士所熟知之任何方法達成， 包括藉由玻璃珠之物理破壞以及曝露於高pH之情況下。 5 [00125]經表現之醣蛋白的分離及純化，可藉由標準 方法進行，包括，但不限於，層析法（例如，離子交換、 親和性、尺寸排除，及羥基磷灰石層析法）、膠體過濾法、 _心法’或差分可溶性法(differential solubility)、酒精沈澱 法’及/或藉由任何其它用於蛋白質純化之可能技術（參 10 見’例如 ’ Scopes，Praidn

Practice 2nd Edition, Springer-Verlag, New York, 1987 ； Higgins, S.J.^Hames, B.D. (eds.), Protein Expression : A /Vaci/ca/Appraac/z，Oxford Univ Press, 1999;以及Deutscher， M.P., Simon, M.I., Abelson, J.N. (eds.), Guide to Protein 15 Purification ： Methods in Enzymology (Methods in

Enzymology Series，Vol· 182)，Academic Press，1997,其每一 者均併入本文作為參考）。特別就免疫親和性層析法而言， 可藉由將_蛋白結合至一親和性管柱而分離之，該親和性 管柱包含有對抗彼醣蛋白而生且被黏附至一固定撐體之抗 20體。或者，諸如流感病毒外鞘序列、聚-組胺酸或麩胱甘肽 S_轉移酶(glutathione-S-transferase)之親和性標籤體(tag)， 可藉由標準重組技術被連附至該醣蛋白，使得可藉由通過 該合適之親和性管柱而被簡單純化。諸如苯基甲基磺醯基 氟化物（PMSF)、亮肽素(leupeptin)、抑肽素(pepstat⑻或艾 56 200812577 普寧(a—nin)之蛋白酶抑制财隸何或財階段被添 加，以減少或去除酷蛋白在純化期間的降解。蛋白酶抑制 劑在當細胞必需被溶解以分離且純化所表現之畴蛋白時， 係特別地有利。另外或或者，轉酶抑制财在任何或所 有階段被添加，以減少或絲該共價軸之寡聚醣鍵之酵 素性剪切。 _26] «本發明所表現之酶蛋白比起生長於傳 10 統細胞培祕件T者，可具妓歧的（否㈣是經改變 的）餹化作用型樣。因此，可在純化步驟採用之本發明的 -個實際好處是，於依照本發明特定方法所生產之酶蛋白 上’額外及/或經改變之糖殘基可賦予它獨特的生化性質， 可被實施例者祕更以地純化出該輕白，或者比起依 照傳統方法所生之-醣蛋白所可能者，被純化至更高的純 度0 15 卿27]—熟習此藝者應明瞭者，確實的純化技術將 依該欲被純化之酿蛋白的特性、要由其表現出該膽蛋白之 細胞的特性，及/或細胞生長於其中之培養基的組成物，而 有所變化。 20 免疫原組成物 [00128]依據本揭露内容之教示所製出的酶蛋白亦可 被用於免疫性組成物，例如，作為疫苗。於特定實施例中， 依照本發明特定方法由生產醣蛋白所達到之改良的聽化作 用型樣，可得到-更有效的免疫性組成物。例如，包含所 57 200812577 生產之醣蛋白的免疫性組成物可能引發一更有效的免疫反 應，其中個體的免疫系統對該醣蛋白產生了一更大量的抗 體，及/或產生了展現出對於一免疫性醣蛋白更高專一性的 抗體。另外或或者，此一醣蛋白可能引發具有較少及/或較 低嚴重田彳作用之免疫反應。於特定實施例中，本發明免疫 組成物包含有一或多的醣蛋白。另外或或者，一發明免疫 n、、且成物可能包括一或多的生理上可接受的載劑。 [00129] —般而言，對於一發明免疫性組成物成分的 適虽「有效量」或劑量之選擇係基於多種因子，包括但不 限於’於所用之免疫性組成物中所選醣蛋白的特性、該醣 蛋白之醣化作用型樣，以及個體之生理情況，最特別的是 包括该党免疫個體之整體健康情形、年齡及/或體重。如該 領域中所習知’投藥之特殊方法及途徑，以及該免疫性組 成物中其它成分之存在，亦可能影響該DNA質體組成物之 15劑量或量。此種選擇及該有效劑量之向上或向下調整係在 為領域之技術範圍内。去引發一免疫反應（包括但不限於， 保遵性反應，或對病人產生一外生效果而無顯著之不良 W作用）所需之免疫性組成物的量係視這些因子而變化。 合適的劑量係由熟習此藝者所輕易決定。 [0013 0]本發明特定的免疫性組成物可能包含一佐 浏。佐劑為一種當與一免疫原或抗原一起投藥時會強化免 疫反應之物質。許多細胞激素或淋巴激素(lymph〇kine)已顯 不具有免疫調節活性，因此可被用作為佐劑，其包括但不 限於，介白素 、i-/5、2、4、5、6、7、8、10、12 (參 58 200812577 見，例如’美國專利第5,723，127號，其全文併入本文作為 多考） 14、15、16、17及18 (以及其突變型）、干擾 素-α、以7、顆粒細胞-巨禮細胞群落刺激因子（參見’ 例如’美國專利第5,078 996號，其全文併入本文作為參 5考）巨巫、、、田胞群洛刺激因子、顆粒細胞群落刺激因子、 GSF’以及腫瘤壞死因子《及/5。其它另可用於本發明之 佐劑包括一趨化激素(chem〇kine)，包括但不限於，MCp—i、 ΜΙΡ-Ια、ΜΠΜ卢及RANTES。黏著分子，諸如一選擇素 (selectin) ’例如L-選擇素、p-選擇素及匕選擇素，亦可被用 10作為佐劑。其它有用的佐劑包括，但不限於，一黏蛋白-類 之分子，例如，CD34、GlyCAM-Ι及MadCAM-Ι ;諸如 LFA-；l、VLA-1、Mac-Ι及ρ150·95之整合素(integr⑻家族的 一員；諸如PECAM、ICAMs (例如ICAM-1、ICAM-2及 ICAM-3)、CD2及LFA-3之免疫球蛋白總族中之一員；諸如 15 CD40及CD40L之共-促進性分子；包括血管生長因子、神經 生長因子、纖維母細胞生長因子、上皮生長因子、B7.2、 PDGF、BL-1及血管内皮生長因子之生長因子、包括Fas、 TNF受器、Fit、Apo-1、p55、WSL-1、DR3、TRAMP、Apo-3、 AIR、LARD、NGRF、DR4、DR5、KILLER、TRAIL-R2、 20 TRICK2及DR6之受器分子。其它的佐劑分子包括Caspase (ICE)。參見，國際專利公開號W098/17799及W099/43839， 其每一者均全文併入本文作為參考。 [00131]亦可有用作為佐劑者為霍亂毒素(CT)及其突 變，包括那些敘述於公開之國際專利申請案〜〇 00/18434 59 200812577 中者〔其中在胺基酸位置29之麩胺酸被另一胺基酸所取代 (除了天冬胺酸以外），較佳者為一組胺酸〕。類似CT者或 突變係敘述於公開之國際專利申請案WO 02/098368中（其 中在胺基酸位置16之異白胺酸被另一胺基酸所取代，單獨 5或組合在胺基酸位置68之絲胺酸被另一胺基酸之取代；及/ 或其中在胺基酸位置72之纈胺酸被另一胺基酸所取代）。其 它ct毒性被敘述於公開之國際專利申請案wo 〇2/〇98369 中（其中在胺基酸位置25之精胺酸被另一胺基酸所取代； 及/或一胺基酸被插入在胺基酸位置49;及/或二胺基酸被插 10入在胺基酸位置35及36)。這些參考文獻的每一者均全文併 入本文作為參考。 [00132]於特定實施例中，本發明免疫性組成物由許 多途徑被投藥至一人類或一非人類脊椎動物，包括但不限 於鼻内、口服、陰道、直腸、非腸胃道、内皮、經皮（參 15見例如，國際專利公開號WO 98/20734，其被全文併入本文 作為參考）、肌肉、腹膜内、皮下、靜脈及動脈投藥。合適 的投藥途徑之選擇可依於該所用之免疫性組成物的性質、 年齡、體重、性別及整體健康情況的評估，及/或熟習此藝 者所習知之其它因子。 2〇 [〇〇133]於特定實施例中，免疫性組成物被多次投 藥。免疫性組成物投藥之次序及個別投藥間之時間間隔可 由热習此蟄者基於熟習此藝者所習知之相關因子而被選 擇，包括但不限於，身體特性及主體對該方法施用的精確 反應。 60 200812577 羡學調配物 [00134]於特定實施例中，所生產之醣蛋白將具有藥 學上的活性且可有用於醫藥品之製備。如上所述之發明組 5成物可被投藥至一個體或可被優先調配，供由任何可用之 途徑遞藥，包括但不限於，非腸胃道（例如，靜脈）、皮内、 皮下、口服、鼻内、支氣管、眼睛、經皮（局部）、經黏膜、 直腸及陰道投藥。發明藥學組成物典型包括一表現自哺乳 類細胞株之經純化的醣蛋白、一遞送劑（亦即，一陽離子 10聚合物、胜肽分子輸送劑、界面活性劑等，如上所述）組 a藥學上可接受之載劑。如本文所使用「藥學上可接a 之載劑」語詞包括溶劑、分散介質、被覆物、抗菌及抗真 菌劑、等滲透及吸收延遲劑，及其類似者，與藥學投藥相 谷者。補充性活性化合物亦可被併入至該組成物中。例如， 15依據本發明所生產之一醣蛋白可被另外共軛結合至供系統 性藥物療法之其它藥物，諸如毒素、低分子量之細胞毒素 藥物、生物反應改質劑，以及放射性核（參見，例如Kunz 專人之 Cglicheamicin derivative-carrier conjugates. US20040082764 A1)。 20 [00135]或者或再者，一依據本發明所生產之蛋白質 或多胜肽可與一或多種另外的藥學活性劑組合（無論是同 時或相繼）投藥。這些藥學活性劑之範例性表單可見於 Physicians’ Desk 55 Edition ，由 Medical

Economics Co·，Inc.所出版，Montvale，NJ，2001，其併入本 61 200812577 文作為參考。對於這些列出試劑之其中許多種，藥學有效 劑量及療法為業界所習知；許多於尸A㈣咖似，仏焱 介本身之中被提出。 [00136] —藥學組成物可被有利地調配為與其所欲之 5投藥途徑相容。用於供非腸胃道、皮内或皮下施用之溶液 或懸浮液可包括下列成分：一無菌稀釋劑，諸如注射用之 水、生理食鹽水溶液、固定油、聚乙二醇、甘油、丙二醇 或其它合成溶劑；諸如苯曱基醇類或對經苯甲酸甲酉旨 (methyl pamben)之抗菌劑；諸如抗壞血酸或亞硫酸氫納之 10 抗乳化劑，诸如乙二胺四醋酸之嵌合劑；諸如醋酸鹽、摔 檬酸鹽或磷酸鹽之緩衝劑，以及諸如氯化鈉或右旋糖之用 於調整滲透性的試劑。可以酸或鹼調整pH值，諸如以氮氣 酸或氫氧化鈉。非腸胃道之製劑可被包裝於玻璃或塑膠製 之安親、拋棄式注射器或者多劑瓶中。 15 [00137]適於可注射使用之藥學組成物典型地包括無 菌水性溶液（水溶液）或分散液，以及供無菌可注射溶液 或分散液之臨時性製劑用的無菌粉末。對靜脈投藥而言， 合適的載劑包括生理食鹽水、抑菌水、Crem〇ph〇r EL™ (BASF，Parsippany，NJ )或者經磷酸緩衝之食鹽水(pBs )。 20所有的情況下，該組成物應為無菌的且應為方便可注射之 流體。本發明特定的藥學調配物在製造及貯存之條件下為 穩定的，且必需被保存而對抗諸如細菌及真菌微生物的污 染作用。一般而言，相關之載劑可為一溶劑或分散介質， 包含，例如，水、乙醇、多醇（例如，甘油、丙二醇及液 62 200812577 態聚乙二醇，以及類似者），以及其合適的混合物。可維持 適當的流動性，例如，藉由一諸如卵磷脂之被覆物的使用， 如果是分散物則藉由維持所需之顆粒大小，以及藉由界面 活性劑之使用。微生物活動之防止可由各種抗菌及抗真菌 5劑所達到，例如，對羥苯甲酸酯(paraben)、氯丁醇、苯酚、 抗壞血酸、乙汞硫柳酸納⑽加⑽⑹），及其類似者。許多 个月況下，於該組成物中包括等滲透劑係為有利的，例如， 糖、諸如馬尼糖醇(manitol)、山梨糖醇之聚醇類，或者氣 化納。可注射性組成物的延長吸收作用可藉由在該組成物 10中包括-延長吸收之試劑而使之發生，例如，單硬脂酸紹 及明膠。 15 20 [00138] 热動之可注射洛液可藉由將經純化之醋蛋白 以所需量，與上述列舉之成分之一者或一組合，如所需者， 併含入一合適的溶劑中，接著進行過濾無菌化。通常，分 散液之製備可藉由將-自哺乳類細胞株所表現的經純化膽 蛋白’併含人—包含—基礎分散介f及所需之上述列舉直 它成分的載媒中。如果是個於無菌可注射溶_備_ 菌粉末，製備方法則包括，例如’真空乾燥法及冷束乾燥 法，其從一先前的無菌過濾溶液製得一具有活性成八力* 任何其它所欲成分的粉末。 [00139] 口服組成物通常包括一惰性稀釋劑戈一可々 性載劑。為了口服治療性投藥之目的，經純 艮 ώ 酶蛋白可 >、職形劑併合且用於錠劑、片劑或膠囊， ^ , 例如明膠膠囊之 I式。口服組成物亦可使用一流體载劑被製備作為敕 63 200812577 水。藥學上可相容的結合劑及/或佐劑物質可被包括作為該 組成物之一部分。該錠劑、藥丸、膠囊、片劑及類似者可 包含下述之任何成分或具一相似性質之化合物：一諸如微 晶纖維素、黃耆膠(gum tragacanth)或明膠之結合劑；諸如 5澱粉或乳糖之賦形劑；諸如褐藻酸、首膠(Primogel)或玉米 澱粉之崩解劑；一諸如硬脂酸鎂或Sterotes之潤滑劑；諸如 膠狀二氧化矽之助滑劑；諸如蔗糖或糖精之甜化劑；或者 諸如薄荷、甲基水楊酸或柑橙調味之調味劑。供口服用 之調配物可有利地併入用以增進腸胃道内安定性及/或加 10強吸收性之試劑。 吸入器 [00140]用於吸入性投藥，包含一經純化之由一哺乳 类^細胞所表現之醣蛋白及—遞送劑的發明組成物，以—氣 噴霧型式被有利地自__經加壓之包含—合適推進劑的 u =或分配器遞送，該推進器例如—諸如二氧化碳之氣體 或—噴霧器。本發明特別設想組成物使用一鼻用喷霧器、 20 或其它直接遞送至上及/或下呼吸道的遞送方式。針 對對抗流感病毒之DNA疫苗的鼻内投藥已顯示可引發⑽ τ細胞反應’表示當以此—途徑遞送時，在呼吸道中之至少 =些細胞可攝取DNA ’且本發明之投遞劑將強化細胞性攝 ^依據特定實施例’包含有_經純化之自—哺乳類細胞 =表現之醣蛋白及-遞的料物被概絲 投樂之大的孔性顆粒。 [00141]系統性投藥 於經點膜或經皮之投藥而 亦可由經黏膜或經皮之方式。對 a，適於所欲滲透之屏障的滲透 64 200812577 劑被使用於該調配物中。此類滲透劑通常係業界所知，且 包括，例如，用於經黏膜之投藥的清潔劑、膽鹽及夫地西 酸(fusidic acid)衍生物。經黏膜投藥可經由使用鼻用喷霧界 或栓劑而達成。對於經皮投藥而言，經純化之醣蛋白及遞 5 送劑被調配為業界通常習知之油膏、藥膏、凝膠或藥霜。 [00142] 組成物亦可被製備為栓劑之型式（例如與諸 如可可油及其它甘油酯之習用栓劑基底物一起）或者為用 於直腸遞藥之留置灌腸劑(retention enema)。 [00143] 於特定實施例中，發明藥學組成物包含任擇 10之賦形劑，諸如局部麻醉劑、胜肽、包括陽離子脂質之脂 質、脂質體或脂性顆粒、諸如聚離胺酸之聚陽離子、諸如 樹狀聚合物之分枝狀三度空間聚陽離子、碳氫化物、陽離 子雙親性物、清潔劑、苯甲銨界面活性劑，或其它增進聚 核苷酸傳遞至細胞之化合物。此類增進劑包括局部麻醉性 15布比卡因（buPivacaine)或四卡因（tetracaine)(參見例如，美 國專利 5,593,972 ; 5,817,637 ; 5,380,876 ; 5,981，505 及 6,383,512 ’以及國際專利公開號w〇98/17799，其每一者之 全文均併入本文作為參考）。 [00144] 於特定實施例中，以可保護醣蛋白免於被身 2〇體快速清除之載劑來製備組成物，諸如一經控制之釋出調 配物，包括植入物及微膠囊化之遞送系統。可使用生物可 刀解性、生物可容性聚合物，諸如乙烯醋酸乙烯酯、聚酸 野、聚甘醇酸(P〇1yglyc〇lic acid)、膠原蛋白、聚原醋及聚 礼酸。此類調配物的製備方法對熟習此藝者為顯然易知 65 200812577 的材料亦 了購自 Alza C〇rp〇rati〇n及N〇va pharmaceuticais，

Inc。體懸浮液（包括以抗病毒抗原之單株抗體數向至 感染細胞的脂質體）亦可被用作為藥學上可接受的載劑。 此類懸浮液可依據熟習此藝者所習知之方法製備，例如， 5美國專利第4,522,811號中所述者，其全文併入本文作為參 考0 10 15 20 [45]為了易於投藥及一致化劑量，可有利地以單 位劑夏形式配製口服或非經腸胃道之組成物。本文中所用 之單位劑I形式係指可適於供受治療個體作為單位劑量之 實體上刀開的單位，每一單位，結合所需藥學載劑，包含 被算出可產生所欲治療效果的預定量活性醣蛋白。 [00146] 一依據本發明所表現之醣蛋白可以各種間隔 且在不同的所需時間期間被投藥，例如，一週一次投藥1至 1〇週、2至8週、約3至7週、4、邮週等。熟習此藝者將瞭 解到’特定的因子可影響有效治療_個體之所需劑量及時 匕括仁不限於該個體疾病或症狀之嚴重性、先前的治 療、整體健康情況職年齡，以及存在之其它疾病。通常， 、乂本文中所述的-醣蛋白治療-個體，T包括一單一治 '或者在斗多情形下，可包括一系列的治療。可瞭解 =，合適的劑量可視紐蛋白之效力而定，騎任擇地被 修改以合於該特殊的接受者，例如，增加料地投藥直到 '、 預k擇的所欲反應被達成。將更被瞭解到的是，對 於特殊動物個體之特定劑量可視多種因子而定，包括該所 之特疋醣蛋白的活性、年齡、體重、整體健康、該個體 66 200812577 之性別及飲食情況、投藥之時間、投藥之途徑、分泌速率、 任何組合用藥及/或要被表現或調節之活性的程度。 [00147]本發明包括供治療非人類動物之發明組成物 的用途。據此，投藥的劑量及方法可依照已知的獸醫藥學及 5醫學原則被選擇。可參考，例如，Adams，R. (ed.)，怜

Pharmacology and Thempeutics，第# edition，Iowa State University press; ISBN·· 0813817439; 2001 中之教導。 [00148]發明藥學組成物可連同投藥指示被納含於一 容器、包裝或分配器中。 1〇 [〇〇149]前述說明係被瞭解為僅作為代表而非限制。 其它用於執行本發明的方法及材料以及另外的應用，對於 熟習此藝者係顯然易知的，且其等應被包含於所附之申請 專利範圍之中。 實施例 15實施例1:培養基配方 [00150]本發明包括發現，由一生長於含錳（在一或 夕個發明濃度下）培養基中之細胞培養物所生產的醣蛋 白，比起其它如果細胞被培養於傳統培養基中者，包含更 貝乏的酶化作用型樣。猛可被加至任何支持細胞生長之培 20養基。錳可在任何發明濃度之内被加入，其例示性培養基 =列於表1中，雖然本發明不限於這些培養基之利用。如熟 習此藝者所瞭解的，其它培養基可被用於培養細胞及/或可 皆表中所列之例示性培養基的組成物作出特定變化。 67 200812577 表ι·例示性培養基 培養基A 培養基B 培養基c 培養基D 培養基E 胺基酸 mg/L mM mg/L mM mg/L mM mg/L mM mg/L mM 丙胺酸 96.03 1.08 24.87 0.28 17.80 0.20 24.87 0.28 精胺酸 1186.99 6.82 423.43 2.43 347.97 2.00 84.00 0.40 423.43 2.43 天冬醯胺酸·η20 713.59 4.76 173.90 1.16 75.00 0,50 173.90 1.16 天冬胺酸 318.53 2.39 52.72 0.40 26.20 0.20 52.72 0.40 半胱胺酸·ηοη2ο 70.01 0.40 70.01 0.40 70.19 0.40 35.10 0.20 70.01 0.40 半胱胺酸·2ΗΟΙ 297.09 0.95 62.09 0.20 62.25 0.20 62.09 0.20 麩胺酸 29.40 0.20 41.08 0.28 單鈉麩胺酸鹽 158.59 1.08 41.08 0.28 麩醯胺酸 1892.40 12.96 1162.40 7.96 1163.95 7.97 584.60 4.00 1162 7.96 甘胺酸 95.88 1.28 35.92 0.48 30.00 0.40 30.00 0.40 35.92 0.48 組胺酸·ηοη2ο 369.10 1.76 75.27 0.36 46.00 0.22 42.00 0.20 75.27 0.36 異白胺酸 623.63 4.76 151.90 1.16 104.99 0.80 104.80 0.80 151.90 1.16 白胺酸 852.31 6.51 172.69 1.32 104.99 0.80 104.80 0.80 172.69 1.32 離胺酸·ΗΟΙ 945.96 5,20 218.38 1.20 145.99 0.80 146.20 0.80 218.38 1.20 甲硫胺酸 291.82 1.96 53.55 0.36 29.80 0.20 30.00 0.20 53.55 0.36 苯基丙胺酸 428.62 2.60 98.81 0.60 65.99 0.40 66.00 0.40 98.81 0.60 脯胺酸 372.25 3.24 96.40 0.84 68.99 0.60 96.40 0.84 絲胺酸 904.71 8.62 273.07 2.60 126.00 1.20 273.07 2.60 蘇胺酸 513.39 4.31 132.81 1.12 94.99 0.80 95.20 0.80 132.81 1.12 色胺酸 159.32 0.78 28.99 0.14 16.00 0.08 16.00 0.08 28.99 0.14 酪胺酸·2Ν3·2Η20 560.81 2.15 145.10 0.56 103.79 0.40 89.46 0.40 145.10 0.56 纈胺酸 505.36 4.32 131.17 1.12 93.99 0.80 93.60 0.80 131.17 1.12 維他命 mg/L μΜ mg/L μΜ mg/L μΜ mg/L μΜ mg/L μΜ 生物素 2.00 8.21 0.36 1.49 0.20 0.821 0.36 1.49 泛酸鈣 22.02 46.27 4.03 8.47 2.24 4.71 4.00 8.40 4.03 8.47 膽鹼氯化物 87.67 630.74 16.11 115.92 8.99 64.31 4.00 28.60 16.11 115.92 葉酸 25.95 58.84 4.76 10.80 2.65 6.01 4.00 9.10 4.76 10.80 肌醇 123.39 685.47 22.64 125.79 12.60 70.00 7.00 38.90 22.64 125.79 菸鹼醯胺 19.60 160.70 3.61 29.62 2.02 16.56 4.00 32.80 3.61 29.62 吡哆醛·Ηα 1.99 9.83 1.99 9.83 2.00 9.89 4.00 19.60 1.99 9.83 吡哆醇《HCI 18.06 87.67 1.67 8.10 0.03 0.15 1.67 8.10 核黃素 2.20 5.85 0.40 1.06 0.22 0.58 0.40 1.10 0.40 1.06 硫胺·Ηα 21.51 63.84 3.92 11.64 2.17 6.44 4.00 11.90 3.92 11.64 維他命Β12 6.93 5.12 1.34 0.99 0.78 0.58 1.34 0.99 無機鹽 mg/L mM mg/L mM mg/L mM mg/L mM mg/L mM CaCl2 115.78 1.04 115.78 1.04 116.1 1.046 200.0 1.80 115.78 1.04 68 200812577 KCI 310.94 4.17 310.94 4.17 311.8 4.179 400.0 5.40 310.94 4.17 Na2HP04 70.81 0.50 70.81 0.50 71.0 0.500 70.81 0.50 NaCI 1104.96 18.92 3704.96 63.44 5539.0 94.846 6400.0 110.30 3704 63.44 NaH2P〇4*H20 636.33 4.61 114.53 0.83 62.5 0.453 140.0 0.91 114.33 0.83 MgS04 48.70 0.41 48.70 0.41 48.8 0.407 48.70 0.41 MgS04*7H20 95.00 0.39 8.60 0.03 200.0 0.80 8.60 0.03 MgC!2 28.53 0.30 28.53 0.30 28.6 0.301 28.53 0.30 NaHC03 2000.00 23.81 1220.00 14.52 2440.0 29.044 3700.0 44.00 2440 29.04 微量元素 M9/L nM M9/L nM Mg/L nM Mg/L nM Mg/L nM 亞硒酸鈉 28.00 161.94 7.00 40.49 0.005 29.0 7.00 40.49 Fe(N03)3*9H20 49.86 123.42 49.86 123.42 0.050 124 0.10 250 49.86 123.42 CuS04 2.69 16.80 0.97 6.06 0.001 5.0 0.97 6.06 CuS04*5H2〇 11.24 45.00 7.49 30.00 7.49 30.00 FeS04*7H20 2503.85 9006.64 1542 5549 0.84 3.021 1542 5549 ZnS04*7H20 2734.77 9528.82 1383 4821 0.430 1498 1383 4821 MnS〇4.H2〇 0.26 1.51 0.17 1.01 0.17 1.01 Na2Si〇3*9H2〇 210.00 739.27 140 492.84 140.00 492.84 (ΝΗ4)6Μο7024·4Η20 1.86 1.50 1.24 1.00 1.24 1.00 nh4vo3 0.98 8.33 0.65 5.56 0.65 5.56 NiS04*6H20 0.20 0.74 0.13 0.49 0.13 0.49 SnCI2*2H20 0.18 0.80 0.12 0.53 0.12 0.53 其它成分 mg/L μΜ mg/L μΜ mg/L μΜ mg/L μΜ mg/L μΜ 氫皮質酮 0.23 0.64 .0864 .24 0.036 0.0001 0.09 0.24 腐胺 (Putrescine)*2HCI 6.48 40.22 2.48 15.39 1.080 0.0067 2.48 15.39 亞麻油酸 0.22 0.80 0.057 0.20 0.040 0.0001 0.06 0.20 硫辛酸(thioctic acid) 0.56 2.73 0.14 0.69 0.100 0.0005 0.14 0.69 D-葡萄糖(右旋糖） 16039 89107 11042.24 61350 8950.7 49.7 4500.0 25000 11042 61345 PVA 2560 2520.00 2400.0 2400.0 2520 0.00 新胞素（Nucellin) 54.00 14.00 10.000 10.00 14.00 0.00 丙酮酸鈉 54.85 498.63 54.85 500 54.995 500 110.0 1000 54.85 498.63 [00151] 於特定實施例中，細胞在開始培養之後，以 一或多次之饋飼培養基一或多次地補充。例示之饋飼培養 基被列示於表2中，雖然本發明不限於這些饋飼培養基之利 用。如熟習此藝者所瞭解的，其它饋飼培養基可被用於培 5 養細胞，及/或可對表2中所列之例示性饋飼培養基的組成 物作出特定變化。例如，此類饋飼培養基之一或多種成分 69 200812577 濃度可被增加或減少以達到此等成分之所欲濃度。於特定 實施例中，每一饋飼培養基成分之濃度以相同的因數被增 加或減少。例如，每一饋飼培養基成分之濃度以1X、2x、 3x、4x、5x、6x、7x、8x、9x、10x、llx、12x、13x、14x、 15x、16x、17x、18x、19x、20x、25x、30x ' 35x、40x、 45x、50x或更多倍被增加或減少。 表2·例示之饋飼培養基 培養基F 培養基G 培養基H 培養基1 培養基J 胺基酸 mg/L mM mg/L mM mg/L mM mg/L mM mg/L mM 丙胺酸 17.81 0.20 213.72 2.40 27.47 0.31 142.47 1.60 142.48 1.60 精胺酸 191.07 1.10 2292.84 13.20 1074.21 6.17 1528.84 8.79 1528 8.79 天冬醯胺酸·η2ο 270.05 1.80 3240.60 21.60 3200.00 21.33 1080.60 7.20 1080 7.20 天冬胺酸 66.66 0.50 799.92 6.00 338.70 2.55 532.40 4.00 532.40 4.00 半胱胺酸·ηοη2ο 0.00 0.00 0.00 0.00 108.66 0.62 473.00 1.51 半胱胺酸·2ΗΟΙ 48.83 0.16 585.96 1.92 687.50 2.20 470 1.50 235.38 1.60 麩胺酸 29.47 0.20 353.64 2.40 235.38 1.60 142.48 1.60 單鈉麩胺酸鹽 52.17 0.31 麩醯胺酸 456.25 3.13 5475.00 37.56 6000 41.10 4820 33.01 甘胺酸 15.01 0.20 180.12 2.40 178.26 2.38 120.07 1.60 120.07 1.60 組胺酸·ηοη2ο 73.53 0.35 882.36 4.20 732.50 3.49 588.33 2.80 588.32 2.80 異白胺酸 118.05 0.90 1416.60 10.80 880.87 6.72 944.52 7.21 944.52 7.21 白胺酸 170.07 1.30 2040.84 15.60 1590.79 12.14 1360.75 10.39 1360 10.39 離胺酸·Η(：Ι 182.07 1.00 2184.84 12.00 2162.93 11.88 1456.81 8.00 1456 8.00 甲硫胺酸 59.62 0.40 715.44 4.80 597.92 4.01 477.06 3.20 477.06 3.20 phenyl丙胺酸 82.53 0.50 990.36 6.00 782.51 4.74 660.36 4.00 660.36 4.00 脯胺酸 69.03 0.60 828.36 7.20 832.67 7.24 552.31 4.80 552.31 4.80 絲胺酸 158.06 1.51 1896.72 18.12 1623.67 15.46 1264.70 12.04 1264 12.04 蘇胺酸 95.24 0.80 1142.88 9.60 871.72 7.33 762.02 6.40 762.02 6.40 色胺酸 32.61 0.16 391.32 1.92 423.14 2.07 260.94 1.28 260.94 1.28 酪胺酸·2Ν3·2Η20 104.26 0.40 1251.12 4.80 1100.00 4.21 832.62 3.19 832.62 3.19 纈胺酸 93.64 0.80 1123.68 9.60 1156,01 9.88 749.21 6.40 749.21 6.40 維他命 mg/L μΜ mg/L μΜ mg/L μΜ mg/L μΜ mg/L μΜ 生物素 17.81 73.00 4.92 20.16 4.14 16.96 3.28 13.44 3.28 0.01 70 200812577 泛酸鈣 191.07 401.41 54.00 113.52 33.84 71.14 36.02 75.67 36.02 0.08 膽鹼氯化物 270.05 1943 214.92 1545 244.57 1759 143.28 1030 143.28 1.03 葉酸 66.66 151.27 63.72 144.60 40.02 90.86 42.43 96.21 42.43 0.10 肌醇 302.52 1680 253.09 1406 201.71 1120. 201.71 1.12 菸鹼醯胺 48.83 400.41 48.00 393.60 40.48 331.93 32.018 262.44 32.02 0.26 吡哆醛·ΗΟΙ 29.47 145.17 3.13 15.42 吡哆醇·Η(：Ι 456.25 2215 49.20 238.92 55.76 207.68 32.82 159.32 32.82 0.16 核黃素 15.01 39.92 5.40 14.40 3.73 9.92 3.60 9.57 3.60 0.01 硫胺·ΗΟΙ 73.53 218.19 92.88 275.40 100.86 299.28 35.22 104.51 35.22 0.10 維他命Β12 118.05 87.12 16.80 12.36 32.67 24.11 11.21 8.27 11.21 0.01 無機鹽 mg/L mM mg/L mM mg/L mM mg/L mM mg/L mM CaCI2 179.9 1.62 113.27 1.02 KCI 482.9 6.47 kh2po4 1640 12.06 1635 12.02 Na2HP04 87.4 0.62 NaCI NaH2P〇4«H2〇 130.50 0.95 1566.00 11.40 1496.8 10.85 MgS〇4 213.0 1.77 MgS04*7H2〇 21.50 0.09 258.00 1.08 170 0.690 171.98 0.70 MgCI2 44.0 0.46 NaHC03 微量元素 M9/L nM mq/l nM mq/l nM Mg/L nM Mg/L nM 亞硒酸鈉 5.00 28.92 60.00 347.04 0.069 0.400 40 231.35 40.00 231.35 Fe(N03)3*9H20 0.077 0.191 CuS〇4 0.43 2.69 5.16 32.28 0.016 0.099 3.44 21.51 3.44 21.51 CuS04*5H20 1.54 6.19 18.48 74.28 0.025 0.100 7.49 30.00 7.49 30.00 FeS04*7H20 571.64 2056 6859 24675 7.000 25.180 2534 9115 2534 9115 ZnS04*7H20 408.08 1421 4896 17062 4.075 14.199 2704 9421 2704 9421 MnS04»H20 0.10 0.57 1.20 6.84 0.17 1.01 0.17 1.01 Na2Si03*9H20 78.75 277.22 945.00 3326 140 492.84 140 492.84 (NH4)6Mo7〇24*4H2〇 0.70 0.56 8.40 6.72 1.24 1.00 1.24 1.00 NH4VO3 0.37 3.13 4.44 37.56 0.65 5.56 0.65 5.56 NiS04*6H20 0.07 0.28 0.84 3.36 0.13 0.49 0.13 0.49 SnCI2*2H20 0.07 0.30 0.84 3.60 0.12 0.53 0.12 0.53 AICI3*6H2〇 1.2 4.97 1.20 4.97 AgN03 0.17 1.00 0.17 1.00 Ba(C2H3〇2)2 2.55 9.98 2.55 9.98 KBr 0.12 1.01 0.12 1.01 CdCI2.2.5H20 2.28 9.99 2.28 9.99 CoCl2#6H2〇 2.38 10.00 2.38 10.00 CrCI3 0.32 2.02 0.32 2.02 71 200812577

NaF 4.2 100.02 4.20 100.02 Ge02 0.53 —5.07 0.53 5.07 ΚΙ 0.17 —1.02 0.17 1.02 RbCI 1.21 10.01 1.21 10.01 ZrOCI2«8H2〇 3.22 —9.99 3.22 9.99 mg/L μΜ mg/L μΜ mg/L μΜ mg/L μΜ mg/L μΜ 氫皮質酮 0.04 0.10 0.48 1.20 0.288 0.794 0.288 0.79 腐月女·2Η(3Ι 1.00 6.21 12.00 74.52 8 49.66 8 49.66 亞麻油酸 0.04 0.15 0.48 1.80 0.336 1.20 0.336 1.20 硫辛酸 0.11 0.51 1.32 6.12 0.841 4.08 0.841 4.08 D-葡萄糖(右旋糖） 4194.14 23300.80 50329 279609 43005 238922 33005 183.37 PVA 200.00 2400 2400 2400 新胞素 10.00 120.00 80 80.00 内酮酸鈉 實施例2 : rFIX胜肽圖譜(peptide Mapping)之小規模研究 [00152]前言··在重組型人類血液凝結因子Ιχ (“rFIX，，) 大量藥物原料(“BDS”)生產期間，可在胜肽圖譜之中觀察 5到’ K4胜肽之相對峰值面積比(“RPAR”)在每批與每批之間 的差異。樣σ口的製備疋藉由以得自無色菌（Achromobacter lyticus)之離胺基肽鏈内切酶（“Achr〇K，，，Wak〇 catal〇g #129-02541)消化，然後進行逆相式hplc離析而製備。於 特定批別中，該K4胜肽之RPAR落於參考材料對照組樣品 10 82%的下限以下，且達到該對照組樣品之78%的最小值。該 材料的剩餘部分(balance)可見於該K4,峰值中。二峰值間之 差異係元全歸因於在Ser-61位置醣化作用的程度。該K4類 種具有一連結至絲胺酸的Sia-a2,3_Gal_pi，4_GkNAejU_

Fuc-al-O四醣，而該成比例增加之K4,類種只具有海藻糖。 15 [00153]在該胜肽圖譜差異產生之一期間内進行全規 模之細胞培養實驗。細胞被培養於一以J7eS〇4、CuS〇4及膦 72 200812577 鹼氣化物分別補充至2X、7X及2X之細胞培養基中。由實驗 性批別之小規模純化所製得的BDS顯示出經改良的K4 RPAR，但以相同方式純化之對照組材料則無。BDS批料通 過胜肽圖譜要求（1對照組樣品之82%)，雖然其並未達到 5參考材料中所見的位準。此表示於RPAR圖譜中所觀察到的 差異係細胞培養方法所造成的結果，且可能相關於營養的 缺乏。 [00154] 在製之樣品(in-process Sample)分析：來自 個別的供分析用之生物反應器之細胞藉由微過濾（“MF”)及 1〇超過濾/透析(“UF/DF”)步驟被移出細胞培養基，得到相當純 的材料。 [00155] 研究該K4類種是否係在細胞分泌之後被分 解回到該K4’（唯-海藻糖）類種，於一來自UF/DF滯留物之 在製樣品進行一經改良之分析。該滯留物之大樣品被分為 15 二專份。一者於一小規模掘取管柱(capture column)上被立 即純化；此作為一負對照組。其它二者以一相似的方式在 被純化之前各被培孵在37QC隔夜。放隔夜之其中一份加入 唾液酸酶’以自K4類種移除末端的唾液酸免得該唾液酸防 礙其它醣解酶之活性。該小規模純化之後，如上述分析三 20 組樣品之K4類種。第1圖顯示在唾液酸酶催化之下，任一樣 品中均無分解反應。此乃強烈顯示，該胜肽圖譜問題為合 成代謝性’意謂在Ser_61位置「遺失的」糖殘基不會被加回 到初生鏈。雖然極不可能，但負責移除那些糖殘基的糖苷 活性仍可能因MF及UF/DF步驟而失活。該等結果證實了小 73 200812577 規模純化糸統用於分析來自q Sepharose步驟上游樣品之眘 用性。 、 [00156] 小規模模式化：培養於搖動燒瓶中之小規模 rFIX培養物被用作為一評估各種培養基及添加物對κ4類種 5之影響的模型。於每一例中，使用以體積為基礎之峰值收 集，於一小規模擷取管柱上直接純化自該搖動燒瓶之條件 性培養基，並決定該樣品中之Κ4分佈。 [00157] 使用與在全規模實驗中相同之添加物來證實 小規模模型的貫用性。鐘之添加亦被分析，因為一文獻檢 10索發現Μη++對一果貫酵素之類似醣化作用活性而言係需 要的（參見Moloney等人之又价说CA⑽275(13): 9604-9611，2000 ; Bruckner 等人之伽說 406: 411-415 2000)。於搖動燒瓶中進行四次繼代(passage)之比較，結果 顯示於第2圖中。每一樣品均以重覆注射顯示。「p#」表示 15每一條件之繼代數目。就ρ1·2而言，Μη之濃度為1 nM ;就 P3-4而言，其為l〇nM。在對照組及經補充之培養基間，K4 類種分佈的不同可比於量產生物反應器中所見之不同。在 一單一繼代之後即表現出不同，且多數繼代未有顯示出任 何趨勢。 20 [00158]由於該添加劑包括三成分（FeS04、CuS04 及膽鹼氣化物），下一實驗著重在這些成分之何者係負責該 經改良K4類種之分佈。該三成分被加至三個rFIX搖動燒瓶 培養物。該等成分被成對地加入以顯示是否有任何協同效 果。其它培養物包括正（三成分全部）及負（無添加劑） 74 200812577 對照組。

大量地出現於測試樣品及試樣 第3圖且於以下實驗中持續。 參考組。此一趨勢明顯見於第3圖 [00160]肖養基粉末之鐵含量的誘導耦合式電紧光譜 (IndUCtiVely_C〇Upled P1嶋叫喻oscopy HCP，)）分析顯 K)示，有適當量的鐵存在於該粉末中。此得到的假設是，由 添加FeS〇4所衍生之好處確實係由粗物料之微量污染物所 導致的。藉由ICP分析來分析被用於起始培養基條件之 FeSCU批料，且顯示許多微量雜質具有高於偵測限制之量。 藉由消除rFIX細胞培養基之已知抑制劑及成分 ，可將表單 I5縮小至下列9種可能有利元素：Sb、Bi、B、c〇、Ge、嫩、

Mo、Ni及 V。 [00161]其次，進行小規模模式化實驗以探究出可能 補助該起始培養基添加劑之其它可能添加劑。測試額外的 CuS〇4、ZnS〇4及MnS〇4 (至ι〇ηΜ)。包括ZnS04係因為鋅 20可競爭性地抑制其它二價陽離子之攝取。由於不明原因， 對照組及實驗組條件得到非常相似的K4類種分佈，其較接 近之前在對照組條件所觀察到的（參見第4圖，每一樣品均 以重覆注射顯示）。然而，將MnS04添加至實驗組條件則清 楚地改良了 K4類種分佈。此顯示出被添加之ZnS〇4可能損 75 200812577 害了 K4類種分佈，但差異的顯著性並不確定。 [00162] 由上述可知，於第3圖中可觀察到，該經去唾 液酸化之Κ4’的峰值位準增加。此一現象在所述小規模研究 之整個過程中持續且趨於向上。此一趨勢不改變所示結果 5 之解釋。 [00163] 結論：在製(in-process)以及小規模擷取管柱 洗出液之延伸測試已提供有力證明，即培養基粉末上之差 異導致K4 RPAR之變移，其再造成多重胜肽圖譜的差異。 因為將特定成分加至細胞培養基已部分回復了該變移，所 10以很可能培養基粉末上之差異係一或多種成分變得更低 量。因為所發現的最有效添加劑為FeS04，且ICP分析顯示 出培養基粉末包含合適當量之化，因此假設FeS〇4中的一微 量雜質係為Ser-61位置上適當醣化作用所必需。基於該 FeS〇4之ICP分析，該微量雜質並非該培養基粉末中一經特 15定化之成分，而是一過去總會出現於該培養基中之非主要 養分。 實施例3 ··培養基添加物對rFIX胜肽圖譜之影響的小規模研究 [00164] 前言：實施例2證實了 Ser-61位置上醣化作用 2〇紅度之批與批間的差異可在不同的rFIX批別中觀察到，其 可被視如K4胜肽群體分佈之變移。所有的rFIX批別在此一 位置具有一鏈長分佈，主要者為全長tra，（Sia-a2,3-Gal- pl，4-GlcNAc-pi，3-Fuc-al )，但有些批別具有一不常見之高 量的唯-海藻糖形式集份。 76 200812577 [00165] 實施例2亦證實了 K4分佈的變移發生在生物 反應器中，且密切相關於培養基粉末之批號變化。實施例2 之結果對於聽型分佈之變化為一合成代謝作用而非分解代 謝作用的假設給予有力的支持。並且，這些實驗證實了補 5 充的FeS04可部分地回復該變移，但是ICP分析顯示出在該 等培養基粉末批號間，FeS04濃度沒有顯著的差異。因此， 可假設，FeS04之另一未經確認之隨不同培養基粉末批號以 不同量出現的微量成分係攸關該變移。 [00166] 添加劑之影響：如實施例2中所述，ICP分析 10 顯示出實驗培養條件用之FeS〇4批料中，可測出9種微量元 素之量。這些微量元素相較於公開培養基配方中者，去除 加Sb或Bi之需要。基於該等培養基配方及FeS〇42K：P分 析，做出5種成分之混合，以加至該rFIX培養物（所設最終 培養基濃度）：1 nM (NH4)6Mo7024、10 nM CoCl2、5.5 nM 15 NH4V03、1.5 nM NiS04及20 nM H3B03。MnS04被分開加 入’因為一早期文獻回顧已指出錳對於醣基轉移酶之活性 可此很重要（參見 Breton and Imberty，Cwrr. /η

Arwciwra/ 9: 563-571，1999 ; Bruckner等人之 406: 411-415, 2000)。同一實驗中，測試額外的FeS〇4 ( 2χ 20或4Χ)以決定其是否可更增加該四醣之相對量。於每一例 中，除了實施例2中所述之補充物之外，使用該等添加劑。 [00167] 此一添加實驗之結果顯示於第5圖中。以四組 Κ4峰值之每一組之面積對其總和的比例決定出類種分佈及 報告值。該圖亦顯示一參考組物料、對照組（無添加劑） 77 200812577 5 15 20 及經補充者（如實施例2中）。每一樣品均以重覆注射被顯 示。每一組管柱中，最左邊之管柱對應至在Ser_61位置具有 一四醣之分子的集份，以及最右邊管柱為只具有一海藻糠 之集份。此觀察到，在正及負對照組培養物間的差異（分 別為經補充者及未經補充者）係比之前所見者更小。無論 如何’第5圖清楚地顯示出，微量元素之混合對⑽貞種分佈 亚無影響，而FeSCU及]yinS〇4二者之添加均改良了 K4類種分 佈。當加至補充物令時，15nMMnS〇4具有與額外之12_ FeS〇4對K4類種分佈之影響大約相同的影響。 [00168] f懷之強烈反應引發設計實驗，以發現猛於 禮細胞培養基中之最適遭度。第6圖顯示此一實驗的結果 與顯示於第5圖中之結果—致，即所有添祕之培養物均比 經補充組或賴組具有更少的唯·海藻糖似。事實上，具有 4 0 η Μ或更鋒之培養物’具有與試樣參考組㈣大約相同 里的唯海滞糖Κ4。然而，刚或5〇〇 似乎比仙_猛具 有更多的四醣。因此，決定出對Ser 6i位置上更廣泛之ριχ 醣化作用而言，40 nM為1可預期優異的⑷農度。 規模模式之利用性：這些小規模實驗以 及實施例2中賴㈣’1非行雜即三_去唾液酸 之類種在實驗與實驗間的變化級量。因為此—類種變化與 試樣參考組相似’相信其為-種單-鍋分解法(single-P〇t digeSti〇nmeth〇d)之人為現象。由於一實驗之所有樣品在使 用相同粗製物的相同時間被消化，此一可變性相信不會影 響此一實驗或實驗2中所呈現之分析。 78 200812577 [00170] 結論：這些實驗證實了，將4〇 nM MnS04添 加至rFIX細胞培養基會改良K4類種分佈。 實施例4 :抗_ABeta培養基樣品之N-鍵結之寡聚醣分析 [00171] 前言：表現一人類化抗-ABeta胜肽IgGl單株 抗體之CHO細胞（抗-ABeta細胞）的N-鍵結寡聚醣指紋譜， 在四種培養基條件下被研究。樣品辨識編號及相關資料列 於表3中。 10 表3·收取自各種培養條件之抗-ABeta樣品

1篆品ID 條件 Gin 微量 E 體積 (mL) 曰數 濃度 1 高 無 1 14 3.06 mg/mL 2 微畺E 有 1 14 4.61 mg/mL 3 低 Gin (4mM) 微量E 低 有 1 14 4.44 mgTrnlT 4 低 Gin (4mM) 2 g/L Glu 低 無 1 14 4.14 mg/mL

[00172] 方法：抗-ABeta培養物1被培養且週期性地饋 入饋飼培養基。於抗-ABeta培養物2中，微量元素E在開始 時被添加。表4列出微量元素E之組成物。抗-ABeta培養物 15 3，除了起始之麩醯胺酸量為4 mM之外，被培養於與培養 物2相同之條件。抗-ABeta培養物4，除了不添加微量e且饋 飼培養基係以麵胺酸補充至2 g/L之外，被培養於與培養物3 相同之條件。 [00173] 每一樣品之·型分佈的決定係藉由pNGase 20 F分解、接著由高pH陰離子交換層析結合以脈衝電化學偵測 79 200812577

(HPAEC-PED)分析。簡言之，樣品被緩衝液交換為5〇 mM 甲酸銨、在pH 7.3下緩衝，使用 AmiC0I1 Ultra 30,000 MWCO 蛋白質濃縮器。在回收後，每一樣品以5 mLPNGase F (不 含甘油）消化分解並且在37°C下培孵過夜。然後樣品藉由 • 5高速真空離心法乾燥，並重新溶於純水中。然後將樣品移 • 轉至用於HPAEC-PED分析之自動注射器樣品瓶 (autosampler vial)。HPAEC-PED 系統裝設以一 Dionex CarboPac PA100保護件及分析管柱(2 X 250 mm)，以及一 ED-40偵測器。使用醋酸鈉之線性梯度，其包括二個洗提 10 液··洗提液A由lOOmMNaOH組成，以及洗提液B由100mM NaOH/500 mM醋酸鈉所組成。 表4· 微量元素E之組成物 微量元素E mq/l nM (ΝΗ4)6Μο7〇24·4Η2ϋ 123.60 100.00 AICI3*6H20 0.48 2.00 H3BO3 6.18 100.00 CrCI3 7.92 50.00 CuS04e5H2〇 49.94 200.00 Ge〇2 0.21 2.00 KBr 0.24 2.00 Kl 16.60 100.00 LiCI 0.08 2.00 MnS04*H20 16.90 100.00 Na2Si03*9H2〇 142.03 500.00 NaF 0.08 2.00 NH4VO3 1.17 10.00 NiS04*6H20 2.63 10.00 RbCI 0.24 2.00 SnCI2*2H2〇 0.45 2.00 亞石西酸納 34.58 200.00 80 200812577 [00174] 數據分析：三種類型的與抗_ABeta抗體相關 之複合N-鍵結雙觸角多醣包含零個（“G〇”）、一個（“G1”)或二 個（G2 )半乳糖殘基於其等外部N-鍵結之雙觸角臂上。所 有樣mi均顯示出存在有三個代表、gi及〇2醣型的峰值。 5第7圖顯示母一樣品之G0、G1及G2 HPAEC-PED峰值的總峰 值面積百分比的一比較圖。所有樣品之圖形中均可觀察到 另外小的峰值的存在。觀察到的峰值代表低量的經單及雙 -唾液酸化之醣型。 [00175] 討論：這些實驗測試出在不同的實驗條件下 10補充以饋飼培養基之抗-ABeta培養物之G〇 : Gl ·· G2峰值的 相對分佈。在其中加入微量元素E的培養物證實了，相對於 缺少微量元素E之培養條件，G0量有一下降，而G1及G2量 有一對應增加（第7圖）。以低麵醯胺酸為條件的培養條件 具有一類似作用，且該等作用為附加性的。其中添加有微 15量元素E之低麩醯胺酸(4 mM)培養物證實在N_鍵結醣型之 分佈上有一劇烈的變移，且G0及G1幾乎等比例而G2對應總 峰值面積之大約10% (第7圖）。其中加入微量元素e之培養 物包含156 nM濃度錳。然而，應注意的是，該等培養物亦 包含提高量的其它金屬。因此，有可能在除了錳之外，其 20 它的培養條件造就了所觀察到的改良醣化作用型樣。 [00176] 結論·在彳几-ABeta樣品中所觀察到的釀化作 用分佈上的差異最可能歸因於培養條件之各別改變。我們 的數據有力地建議著，低筵醯胺酸(4 mM)的存在及/或包含 有100 mMMnS〇4之微量元素E的添加，導致抗—ABeta中各 81 200812577 種N-鍵結之醣型在百分比分佈上有一巨大的改變。這些作 用顯示為獨立且為附加性的。 實施例5 :抗-ABeta錳研究樣品之虬鍵結募聚醣分析 5 [〇〇177]前言：實施例4證明了在抗-ABeta樣品之醣化 作用分佈上的改良，可藉由將微量元素E添加至培養條件以 及藉由維持低量的麩醯胺酸而獲得。在此我們要測試單獨 八有將鍾添加於培養條件中是否可對醣化作用分佈達到一 類似的改良。 1〇 [〇〇178]方法：抗-ABeta培養物被培養於一包含或缺 乏40 mM錳之培養基中。以4〇%總體積之饋飼培養基饋入該 培養物。收取樣品並依據實施例4中所述之方法分析。 [〇〇179]數據分析：經分析之樣品就峰值之出現及每 一峰值之總峰值面積的百分比作一比較。第8圖顯示每一樣 15 °〇之〇〇、G1及G2 HPAEC_pED峰值之總峰值面積百分比的 一圖形比較。 [00180]討論：三種類型的與抗_ABeta抗體相關之複 合N-鍵結雙觸角多醣為G〇、G1&G2結構，其分別包含零 们 個或一個半乳糖殘基於其等外部N-鍵結雙觸角臂 2〇上。自生長於缺乏或包含4〇 mM錳之培養基中的細胞所收 取的樣品均顯示出存在有三個代表G〇、〇1及〇2醣型的峰 值。該G0峰值從在對照組樣品減少68%總峰值面積到在從 包含加入錳之培養基所收取之樣品減少53% (參見第8 圖）。在G1及G2之總峰值面積百分比上的增加亦可見於自 82 200812577 包含錳的培養基所收取之樣品中。該G1之總峰值面積百分 比在對照組為26%，且在加錳之樣品為39%。該〇2之總峰 值面積百分比在對照組為6%，且在加錳之樣品為9% (第8 圖）。 5 結論：這些數據指出錳的單獨添加至培養基，導致一 更廣泛的醣化作用型樣，如同由在這些樣品在G〇 : Gi : G2 之百分比分佈上的變移所證實者。 【圖式簡單明】 第1圖顯示於UF/DF保留物質中糖苷活性的研究。每一 10實驗中，代表各種K4及K4,類種之長條，自左至右為：K4 (Fuc-GlcNAc-Gal-SA) 、 K49 (Fuc-GlcNAc-Gal) 、 K49 (Fuc-GlcNAc)及 Κ4’（Fuc)。 第2圖顯示在搖動燒瓶中所產生之rFIX的K4類種分 佈。每一實驗中，代表各種Κ4及Κ4’類種之長條，自左至右 15 為：Κ4 (Fuc-GlcNAc-Gal，SA)、Κ4,（Fuc-GlcNAc-Gal)、Κ4, (Fuc-GlcNAc)及 K4,（Fuc)。 第3圖顯示得自具各種培養基添加劑之搖動燒瓶培養 物的K4類種分佈。每一實驗中，代表各種K4及K4’類種之 長條，自左至右為：K4 (Fuc-GlcNAc-Gal-SA)、K4, 20 (Fuc-GlcNAc-Gal)、K4,（Fuc-GlcNAc)及 K4,（Fuc)。 第4圖顯示得自具補充培養基之搖動燒瓶培養物的K4 類種分佈。每一實驗中，代表各種Κ4及Κ4’類種之長條，自 左至右為：Κ4 (Fuc-GlcNAc-Gal-SA) 、 K4, (Fuc-GlcNAc-Gal)、K4’（Fuc-GlcNAc)及K4’（Fuc) 〇 83 200812577 第5圖顯示得自具各種培養基添加劑之搖動燒瓶培養 物的K4類種分佈。每一實驗中，代表各種K4及K4,類種之 長條，自左至右為：K4 (Fuc-GlcNAc-Gal-SA)、K4, (Fuc，GlcNAc-Gal)、K4’（Fuc-GlcNAc)及 K4’（Fuc)。 5 第6圖顯示得自變化猛量下搖動燒瓶培養物的K4類種 分佈。每一實驗中，代表各種Κ4及Κ4’類種之長條，自左至 右為：Κ4 (Fuc-GlcNAc_Gal_SA)、Κ4’（Fuc-GlcNAc-Gal)、 K4,（Fuc_GlcNAc)及K4,（Fuc)。 第7圖顯示G0、G1及G2 HPAEC-PED峰值之總峰值面積 10 百分比的一圖形比較。每一實驗中，代表複合N-鍵結雙觸 角多醣之長條，自左至右為：GO、G1及G2。 第8圖顯示G0、G1及G2 HPAEC-PED峰值之總峰值面積 百分比的一圖形比較。每一實驗中，代表複合鍵結雙觸 角多聽之長條，自左至右為：G0、G1及G2。 15 【主要元件符號說明】 84

Claims (1)

1. 200812577 十、申請專利範圍： 1· 一種於一細胞培養物中生產醣蛋白之方法，其包含有： 將包含一編碼所欲醣蛋白之基因的哺乳類細胞於 條件下在一包含大約10 nM至600 nM間之錳的細胞培養 基中培養一段足以容許該醣蛋白表現的時間，其中該所 表現之醣蛋白的醣化作用型樣係比在其它方面相同條 件下於缺乏錢之其它確定成分培養基中所得之醣化作 用型樣更為廣泛。 2·如申请專利範圍第1項之方法，其包含下列步驟： 將包含一編碼所欲醣蛋白之基因的哺乳類細胞培 養於一包含大約1〇 nMS6〇〇 nM間之錳的細胞培養基 中； 將該培養維持在一第一溫度範圍一段第一時間期 間，使足以容許該細胞繁殖至在如果該培養物被維持在 該第一溫度範圍内的最大可能存活細胞密度之約 20%-80%範圍内的一存活細胞密度； 將該培養改變到一第二溫度範圍，其中該第二溫度 範圍之至少一溫度係低於該第一溫度範圍之最低溫度； 將該培養維持在條件下一段第二時間期間以容許 该醣蛋白之表現，其中該所表現之醣蛋白的醣化作用型 樣係比在其它方面相同條件下於缺乏錳之其它確定成 分培養基中所得之醣化作用型樣更為廣泛。 3·如申請專利範圍第2項之方法，其中該第一溫度範圍包 含有一大約為30至42°C之溫度範圍。 85 200812577 4. 如申請專利範圍第3項之方法，其中該第一溫度範圍包 含有一大約為37°C之溫度。 5. 如申請專利範圍第2至4項中任一項之方法，其中該第二 溫度範圍包含有一大約為25至41QC之溫度範圍。 5 6.如申請專利範圍第5項之方法，其中該第二溫度範圍包 含有一大約為31°C之溫度。 7. 如申請專利範圍第2至6項中任一項之方法，其更包含一 第二改變步驟接在第一改變步驟之後，其包含將該培養 改變到一第三溫度或溫度範圍，其中該第三溫度範圍之 10 至少一溫度係低於該第二溫度範圍之最低溫度。 8. 如申請專利範圍第7項之方法，其中該第三溫度範圍包 含有一大約為25至40°C之溫度範圍。 9. 如申請專利範圍第1至8項中任一項之方法，其中該細胞 培養基包含有大約20至200 nM間的錳。 15 10·如申請專利範圍第9項之方法，其中該細胞培養基包含 有大約40 nM的猛。 11.如申請專利範圍第1至10項中任一項之方法，其中該細 胞培養基包含有一起始濃度低於或等於大約8 mM的麵 酿胺酸。 20 12.如申請專利範圍第11項之方法，其中該細胞培養基之起 始麩醯胺酸濃度係低於或等於大約4 mM。 13. 如申請專利範圍第1至12項中任一項之方法，其中該細 胞培養之體積為至少大約500 L。 14. 如申請專利範圍第1至13項中任一項之方法，其中該細 86 200812577 胞培養在該起始細胞培養開始之後更被提供一饋飼培 養基。 15.如申請專利範圍第1至14項中任一項之方法，其中該細 胞培養更被提供以補助成分。 5 16.如申請專利範圍第15項之方法，其中該補助成分係擇自 於由下列所組成之群中：荷爾蒙及/或其它生長因子、無 機離子、緩衝劑、維他命、核苷或核苷酸、微量元素、 胺基酸、脂質、葡萄糖或其它能量源，以及其等之組合。 17. 如申請專利範圍第16項之方法，其中該細胞培養被補充 10 以每公升大約2克的葡萄糖。 18. 如申請專利範圍第1至17項中任一項之方法，其中該細 胞培養基係成分確定者。 19. 如申請專利範圍第1至18項中任一項之方法，其中該所 欲醣蛋白包含凝結因子IX。 15 20.如申請專利範圍第19項之方法，其中該凝結因子IX為重 組型人類凝結因子IX。 21. 如申請專利範圍第1至18項中任一項之方法，其中該所 欲醣蛋白包含一抗-ABeta抗體。 22. 如申請專利範圍第21項之方法，其中該抗-ABeta抗體為 20 —單株抗體。 23. 如申請專利範圍第22項之方法，其中該抗-ABeta抗體為 一人類化抗-ABeta胜肽之IgGl單株抗體。 24. —種細胞培養基，其包含有大約10至600 nM間之錳。 25. 如申請專利範圍第24項之細胞培養基，其包含有大約20 87 200812577 - 5 Ψ 至200 ηΜ間之錳。 26. 如申請專利範圍第25項之細胞培養基，其包含有大約40 ηΜ之猛。 27. 如申請專利範圍第24至26項中任一項之細胞培養基，其 中該細胞培養基包含有一低於或等於大約8 mM之起始 濃度的麩醯胺酸。 28. 如申請專利範圍第27項之細胞培養基，其中該起始麩醯 Ο 胺酸濃度為低於或等於大約4 mM。 29.如申請專利範圍第24至28項中任一項之細胞培養基，其 10 中該培養基係成分確定者。 30.—種藉由如申請專利範圍第1至23項中任一項之方法所 獲得之醣蛋白。 88