CN109517738A - 一种调控生物反应器中二氧化碳含量的方法 - Google Patents

一种调控生物反应器中二氧化碳含量的方法 Download PDF

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王琇茔
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    • C12M29/00—Means for introduction, extraction or recirculation of materials, e.g. pumps
    • C12M29/06—Nozzles; Sprayers; Spargers; Diffusers

Abstract

本发明涉及生物医药中哺乳动物细胞培养技术领域，具体而言，涉及一种调控生物反应器中二氧化碳含量的方法。该方法所采用的生物反应器其顶层和/或底部设置有二氧化碳通气管道。该方法特别适用于基于小型生物反应器的小试工艺过程中模拟生产规模的二氧化碳分压趋势，并获得生产规模相似的工艺工艺过程与蛋白产品质量。完成小试工艺后，即可进行500L以上规模的放大试验，缩短蛋白药物的开发时程及开发成本。

Description

一种调控生物反应器中二氧化碳含量的方法
技术领域
本发明涉及生物医药中哺乳动物细胞培养技术领域，具体而言，涉及一种调控生物反应器中二氧化碳含量的方法。
背景技术
生物制药产业在近二十年来逐渐崭露头角。有别于小分子药物，蛋白药具靶点专一性的特性增强了藥物治疗效果更降低了副作用；而蛋白药的结构复杂，其制程难度高，难以仿制，后期带来的效益巨大，成为全球药物发展的主流。
抗体药物研发工艺包括细胞株构建及单克隆筛选、细胞培养、纯化和制剂四个方面，生产工艺则为上游细胞培养、下游纯化、制剂灌装三个方面。其中又以上游工艺最为关键。
随着生物工程技术的快速发展，目前生产规模普遍放大至数百升、甚至数千升不等。对于工艺开发来说，能在不同规模的生产设备上实现稳定一致的工艺过程、稳定一致的蛋白产品质量是一项重要的课题。不论以不锈钢反应器抑或是一次性生产设备，其罐体比例与搅拌桨之几何设计皆以尽量满足于哺乳细胞生长的环境为出发点。而在越大的容积里，气体的分布与易散情形却无法达到如期效果。尤其是二氧化碳会随着罐体体积增加，液压提高导致二氧化碳之溶解度增高。目前现有的二氧化碳清除方式效果有限，也限制于罐体设计，对于药物于小试工艺、中试工艺、生产规模等不同阶段，是否能保持一致的蛋白产品质量，产生一定的工艺开发难度与风险。
为了确保蛋白药物从工艺开发到最终生产过程，能有一致的蛋白产品质量，目前主流的工艺开发过程需经历小试工艺、中试工艺、生产规模等三个阶段，不同阶段需呈现相似或一致的工艺过程及蛋白产品质量。若在工艺放大过程中出现了工艺不一致、或蛋白产品质量不一致的情形时，则需于小试工艺再次进行试验、甚至重新开发工艺。不同的二氧化碳分压对于细胞生长、蛋白质量均有影响，而小试规模与大规模的二氧化碳分压偏差，则形成工艺放大与技术转移的潜在风险，使得工艺放大的时程延长、开发成本提高。
有鉴于此，特提出本发明。
发明内容
本发明的目的在于提供一种生物反应器，并提供相应的生产工艺，使工艺放大程序由小型发酵罐直接放大到生产规模，从而降低工艺开发成本。
为了实现本发明的上述目的，特采用以下技术方案：
本发明涉及一种生物反应器，其顶层和/或底部设置有二氧化碳通气管道。
根据本发明的一方面，本发明还涉及一种调控生物反应器中二氧化碳含量的方法，包括：利用如上所述的生物反应器培养细胞。
与现有技术相比，本发明的有益效果为：
(1)在生物反应器，特别是基于小型生物反应器的小试工艺过程中模拟生产规模的二氧化碳分压趋势。
(2)在小试工艺过程中获得生产规模相似的工艺工艺过程与蛋白产品质量。
(3)完成小试工艺后，即可进行500L以上规模的放大试验，缩短蛋白药物的开发时程及开发成本。
附图说明
为了更清楚地说明本发明具体实施方式或现有技术中的技术方案，下面将对具体实施方式或现有技术描述中所需要使用的附图作简单地介绍，显而易见地，下面描述中的附图是本发明的一些实施方式，对于本领域普通技术人员来讲，在不付出创造性劳动的前提下，还可以根据这些附图获得其他的附图。
图1为本发明一个实施方式中不同细胞培养工艺及规模下二氧化碳分压曲线图。
具体实施方式
为了促进理解本文描述的实施方式这一目的，将参考某些实施方式，并且将使用特定语言来描述这些实施方式。本文所使用的术语仅用于描述具体实施方式目的，而不旨在限制本公开的范围。在冲突的情况下，本说明书(包括定义)将起支配作用。此外，材料、方法以及实施例仅仅是说明性的，而不旨在限制。实施方式的其他特征和优点将从以下详细的说明书和权利要求中变得明显。
本发明涉及一种生物反应器，其顶层和/或底部设置有二氧化碳通气管道。
大部分商业规模的哺乳动物细胞培养生产转入进料-分批过程，控制以维持相对恒定的重量克分子渗透压浓度、pH值和溶解二氧化碳水平是几乎不可能的。在进料-分批过程中添加营养物和细胞强化剂将总是倾向于提高细胞培养物重量克分子渗透压浓度，而pH值和溶解二氧化碳水平在整个过程中不断变化。
例如，在指数生长期期间产生的二氧化碳可超出了大多数当前的生物反应器的二氧化碳脱除能力，引起溶解二氧化碳水平的持续提高。溶解二氧化碳水平的这种继续提高常常需要添加碱来中和溶解二氧化碳对pH值的影响，因为控制细胞培养基的pH值被看作是管理任何哺乳动物细胞培养过程的最关键参数之一。提高溶解二氧化碳和添加碱都进一步提高了细胞培养基或溶液的重量克分子渗透压浓度。简而言之，细胞培养基或溶液中的pH值、重量克分子渗透压浓度和溶解二氧化碳水平都是紧密地相互联系的。许多本领域技术人员相信最低水平的溶解二氧化碳和重量克分子渗透压浓度将提供哺乳动物细胞培养过程的最佳运行条件。
溶解二氧化碳水平可以被调整或维持在任何期望的水平。为了在细胞培养过程期间的任何时候降低溶解二氧化碳水平，本发明采用顶层和/或底部二氧化碳进气的方式以更优化地调整二氧化碳浓度。
顶层管道优选位于培养基液面之上，其进入生物反应器的顶部空间的扫掠气体的流动速度可以被提高，以快速地从靠近表面的液体中消除其他气体，快速增加二氧化碳的浓度。也可以提高叶轮转速来加速表面液体更新速率。为了提高溶解二氧化碳水平，本领域技术人员可以合理调整扫掠气体流动速度，和/或降低上泵式叶轮的转速。在某些条件下，需要快速提升二氧化碳浓度，例如，在生产生物反应器的接种之后不久的过程的最早期阶段，二氧化碳可以按需要添加到顶部空间中的扫掠气体混合物中。
底部通气则可以增加二氧化碳在培养基中行进的路程，进而快速增加二氧化碳的溶解量。在一些实施方式中，底部通气管道还与气体分散装置相连以打散气泡，增加溶解。底部通气管道调整二氧化碳浓度的过程也可以搭配适宜的反应器内部搅拌装置进行，以使得培养基达到更合适的转速，促进气体混匀。
在典型的哺乳动物细胞培养过程中，溶解氧需求随着分批过程从起初的延缓期到指数生长期的末尾而提高，而溶解二氧化碳浓度由于细胞呼吸而提高，在指数生长期的末尾达到最大浓度，然后在生产期逐渐降低。因此，主要在迟缓期期间添加气体的二氧化碳来调节和维持pH值。并且，某些指定的溶解氧水平需要在细胞生产阶段期间维持。
在某些情况下，本申请所提供的二氧化碳通气管道也可以用于通入氧气以降低生物反应器内的二氧化碳浓度。
在一些实施方式中，所述生物反应器的容积≤500L。
在一些实施方式中，所述生物反应器的容积≤200L。
在一些实施方式中，所述生物反应器的容积≤10L。
与大型生物反应器(通常大于50L)相比，小型的生物反应器由于总容积小，缓冲能力弱，因而更加需要更为精细的二氧化碳浓度调节功能。
在一些实施方式中，所述生物反应器还具有pH-二氧化碳级联控制系统。
生物反应器中通常都设置有pH-二氧化碳级联控制系统，其一般设置与反应器的侧壁等处；在某些实施方式中，本申请所提供的顶层和/或底部二氧化碳通气管段可与该系统共同调节二氧化碳及pH水平，还可搭配额外补碱等操作。
根据本发明的一方面，本发明还涉及一种调控生物反应器中二氧化碳含量的方法，包括：利用如上所述的生物反应器培养细胞。
所述方法尤其适用于悬浮细胞的培养。
在一些实施方式中，其培养模式采用批次培养(Batch)、流加培养(Fed-batch)或灌流培养(Perfusion)模式。
在一些实施方式中，培养控制二氧化碳分压于35～120mmHg。
在一些实施方式中，培养时采取渐进式通气量增加二氧化碳；流量优选控制在2mlpm-25mlpm。
在一些实施方式中，所述细胞为哺乳动物细胞；
在一些实施方式中，所述哺乳动物细胞选自多能干细胞、胚胎干细胞、骨髓基质细胞、造血祖细胞、淋巴干细胞、骨髓干细胞、T细胞、B细胞、巨噬细胞、肝细胞、胰腺细胞、癌瘤细胞以及细胞系中的一种或多种；
在一些实施方式中，所述细胞系是由以下各者所构成的群组中选出：
CHO(优选CHO-S和/或CHO-K1)、DXB-11、DG-44、CHO/-DHFR、CV1、COS-7、HEK293、BHK、TM4、VERO、HELA、MDCK、BRL3A、W138、Hep G2、SK-Hep、MMT、TRI、MRC5、FS4、T细胞系、B细胞系、3T3、RIN、A549、PC12、K562、PER.C6、SP2/0、NS-0、U20S、HT1080、L929、融合瘤以及癌细胞系。
在一些实施方式中，所述CHO细胞为CHO-K1细胞，且在培养时，以活细胞密度为0.5±0.1×106cells/ml接种进入生物反应器进行N阶段细胞培养，在培养的第1天～5天，二氧化碳分压为35～60mmHg，从第6天开始将二氧化碳分压调整到80～120mmHg。
下面将结合实施例对本发明的实施方案进行详细描述，但是本领域技术人员将会理解，下列实施例仅用于说明本发明，而不应视为限制本发明的范围。实施例中未注明具体条件者，按照常规条件或制造商建议的条件进行。所用试剂或仪器未注明生产厂商者，均为可以通过市购获得的常规产品。
实施例
一种用于治疗癌症的单克隆抗体1，以基因工程技术人工构建表达细胞株，hostcell为CHO-K1，谷氨酰胺合成酶基因表达系统，采用单克隆筛选技术，筛选出稳定的表达细胞株。此抗体生产的上游工艺过程为细胞解冻复苏、种子扩增培养、反应器中放大生产(NProduction)、细胞液收获4个步骤。以在10L生物反应器生产工艺为例：
Step 1-细胞解冻复苏：
从细胞库中拿出一只冻管，在37℃水浴中解冻3-5分钟。在生物安全柜中无菌转移至装有29ml基础培养基的125ml摇瓶。iVCD为0.3±0.05×106cells/ml，在infors CO2摇床培养箱进行培养，温度37℃±0.5，转速110rpm，湿度80％±10％。培养3天，活细胞密度达到1.5～3.0×106cells cells/ml，转到下一级培养。
Step 2-种子扩增培养：
N-X种子扩增：iVCD为0.35±0.05×106cells/ml，在基础培养基中培养，培养温度37℃±0.5，摇床转速110±10rpm，湿度80％±10％。培养时间3天，最终活细胞密度为3.0-4.0×106cells/ml.
Step 3-反应器上生产(N Production)：
细胞接种密度(iVCD)为0.5±0.1×106cells/ml，初始培养温度37℃±0.5，10L反应器的搅拌转速为112rpm，pH控制在6.7-7.3，DO控制范围为50％，当活细胞密度达到15±1×106cells/ml，温度降为32℃，于day 2,4,6,8,10,12进行流加补料。葡萄糖浓度控制策略为低于2g/L时补充到4g/L。
原工艺的二氧化碳控制策略仅有pH-二氧化碳级联控制(pH-CO2cascadecontrol)，二氧化碳分压维持在25～45mmHg之间。发酵罐编号为10L w/o CO2-1,10L w/oCO2-2。
本发明优化后的工艺，二氧化碳控制策略除了pH-二氧化碳级联控制(pH-CO2cascade control)之外，在发酵过程中以深通管道并采取渐进式通气量增加二氧化碳，流量控制在2mlpm-25mlpm。发酵罐编号为10L w/CO2-1。
编号500L-1及500L-2为500L规模发酵，单独使用pH-二氧化碳级联控制(pH-CO2cascade control)策略下的二氧化碳分压曲线。
发酵结果如下：
不同细胞培养工艺及规模下二氧化碳分压曲线图如图1所示。
表1不同细胞培养工艺下二氧化碳分压与500L工艺比较
表2不同细胞培养工艺下二氧化碳分压与500L工艺差距百分比
从表1和表2中可知，与原工艺相比：在相同的培养周期(14天)，用本发明优化后的培养工艺可获得与500L生产规模相当接近的二氧化碳分压。
原工艺在培养过程中与500L生产规模二氧化碳分压平均差距为-55.5％；本发明优化工艺在培养过程中与500L生产规模二氧化碳分压平均差距仅为-15.8％。
通过以上实例可实现本发明的目的，即
1.在工作体积小于等于10L的小试工艺过程中模拟生产规模的二氧化碳分压趋势；
2.完成工作体积小于等于10L发酵罐的小试工艺后，即可进行500L以上规模的放大试验，缩短蛋白药物的开发时程及开发成本。
本发明可运用在药物开发过程中，商业化生产技术转移上，可明显缩短工艺开发时程及开发成本，进而可以加速药物上市速度、降低药物的研发成本，降低药物价格，惠及广大病人。
最后应说明的是：以上各实施例仅用以说明本发明的技术方案，而非对其限制；尽管参照前述各实施例对本发明进行了详细的说明，但本领域的普通技术人员应当理解：其依然可以对前述各实施例所记载的技术方案进行修改，或者对其中部分或者全部技术特征进行等同替换；而这些修改或者替换，并不使相应技术方案的本质脱离本发明各实施例技术方案的范围。

Claims (10)

1.一种生物反应器，其特征在于，其顶层和/或底部设置有二氧化碳通气管道。
2.根据权利要求1所述的生物反应器，其特征在于，所述生物反应器的容积≤500L。
3.根据权利要求2所述的生物反应器，其特征在于，所述生物反应器的容积≤200L。
4.根据权利要求3所述的生物反应器，其特征在于，所述生物反应器的容积≤10L。
5.根据权利要求1～4任一项所述的生物反应器，其特征在于，所述生物反应器还具有pH-二氧化碳级联控制系统。
6.一种调控生物反应器中二氧化碳含量的方法，其特征在于，利用权利要求1～5任一项所述的生物反应器培养细胞。
7.根据权利要求6所述的方法，其特征在于，其培养模式采用批次培养、流加培养或灌流培养模式。
8.根据权利要求6所述的方法，其特征在于，培养控制二氧化碳分压于35～120mmHg。
9.根据权利要求6所述的方法，其特征在于，所述细胞为哺乳动物细胞；
优选的，所述哺乳动物细胞选自多能干细胞、胚胎干细胞、骨髓基质细胞、造血祖细胞、淋巴干细胞、骨髓干细胞、T细胞、B细胞、巨噬细胞、肝细胞、胰腺细胞、癌瘤细胞以及细胞系中的一种或多种；
优选的，所述细胞系是由以下各者所构成的群组中选出：
CHO(优选CHO-S和/或CHO-K1)、DXB-11、DG-44、CHO/-DHFR、CV1、COS-7、HEK293、BHK、TM4、VERO、HELA、MDCK、BRL3A、W138、Hep G2、SK-Hep、MMT、TRI、MRC5、FS4、T细胞系、B细胞系、3T3、RIN、A549、PC12、K562、PER.C6、SP2/0、NS-0、U20S、HT1080、L929、融合瘤以及癌细胞系。
10.根据权利要求9所述的方法，其特征在于，所述CHO细胞为CHO-K1细胞，且在培养时，以活细胞密度为0.5±0.1×106cells/ml接种进入生物反应器进行N阶段细胞培养，在培养的第1天～5天，二氧化碳分压为35～60mmHg，从第6天开始将二氧化碳分压调整到80～120mmHg。
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