CN101130745B - 用于造血细胞体外培养的生物反应器系统 - Google Patents

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Abstract

本发明公开了一种用于造血细胞体外培养的生物反应器系统，包括补料瓶和气体混合装置，其特征在于，还包括截面积为矩形的管状反应器；所说的管状反应器的一端的靠下部处设有进液口，另一端靠上部处设有出液口，靠近进液口一端的上底面设有接种口，反应器内部下表面上设有肋条；气体混合装置通过管线与补料瓶相连接；进液口与出液口分别通过管线与补料瓶相连通。本发明的优点在于采用该生物反应器系统可实现循环或连续灌注培养可减少局部浓度梯度，保持培养环境的均一。在培养过程中可根据需要调节反应器内的氧分压。同时利用底面的肋条可使细胞截流、聚集，有利于细胞之间通讯，可更好地扩增造血干细胞并保持其原有功能。

Description

用于造血细胞体外培养的生物反应器系统
技术领域
本发明涉及一种生物反应器系统，具体地说涉及一种用于造血细胞体外培养的生物反应器系统。
背景技术
造血干细胞是一种具有高度的自我更新和多向分化能力的成体干细胞。造血干细胞移植已被广泛应用于恶性血液病、非恶性难治性血液病、遗传性疾病和某些实体瘤的治疗。还可以通过细胞因子诱导造血干细胞向红系、粒系和巨核细胞/血小板分化，用于成分输血和治疗肿瘤放疗、化疗所致的中性粒细胞和血小板减少等症。脐血是优良的造血干细胞来源，具有来源丰富，采集方便；造血干细胞含量丰富，原始干/祖细胞比例高；免疫排斥性低；对供体无伤害等优点，在临床上日益受到关注。但每份脐血的造血干细胞数量有限，单份脐血仅能满足较低体重儿童的移植需要。所以为了拓宽脐血造血干细胞的临床应用，需要对脐血造血干细胞进行体外扩增来增加其数量并保持其生物学特性。
理想的造血干细胞体外培养方式是模拟造血干细胞的体内生长环境，使造血干细胞体外扩增同时又保持其体内造血重建的生物学功能。造血干细胞的体外扩增主要有两种方法：(1)有基质细胞支持的造血细胞共培养；(2)无基质细胞作用的造血细胞单独培养。
基质细胞主要是通过分泌细胞因子刺激或支持造血干细胞的扩增，但人源的基质细胞系较难获得，异源基质细胞与人造血干细胞共培养扩增不能满足临床应用的要求。而随着基质细胞产生和分泌的细胞因子被成功鉴定和克隆表达，使用细胞因子组合促使造血干细胞扩增成为可能。目前应用于无基质造血干细胞的培养模式有：静态培养、动态培养和细胞固定化培养。
静态培养是造血干细胞的体外扩增培养中最常用的一种方式，它在较简单的培养装置中进行，包括孔板、方瓶以及透气培养袋等。它具有操作简便、细胞易于收获等优点，但由于缺少混合，使得培养环境不均一，培养基中pH、溶氧、营养物(细胞因子)和代谢物存在浓度梯度，此浓度梯度还会由于初始条件如接种密度、细胞类型的分布、培养基成分和细胞的扩增程度不同而在各批培养之间造成很大的差异。
与静态培养相比，动态培养能提供了均一的生长环境，具有良好的混合和传质效果，便于培养参数的在线检测和控制，有利于过程放大，已成功地应用于动物细胞的大规模培养。如Zandstra等报道的搅拌式反应器已成功应用于造血干细胞的体外培养，然而，由于造血干细胞对剪切力相当敏感，搅动会影响表面标志的表达，包括细胞因子受体，这在一定程度上影响了造血干细胞的增殖和分化。而且搅拌会使细胞与细胞间处于相对分散的状态，这不利于细胞之间的相互作用。
采用连续灌注培养方式能增加培养基的交换速率和可溶生长因子的供应，改善传质限制，维持主体培养基的相对均一性，且不会对造血干细胞造成机械损伤。如Sandstrom，C.E.et al.(1996)Development of novelperfusion chamber to retain nonadherent cells and its use for comparison ofhuman‘mobilized’peripheral blood mononuclear cell cultures with and withoutirradiated bone marrow stroma.Biotechnol.Bioeng.50，493-504所报道的灌注式培养体系。这种培养腔底部有多个微槽(与培养基流动方向垂直)，可以很好地将细胞保留在腔内，促进细胞间通讯。并且提供了较均一的培养环境，但收获细胞较困难。而谭文松等发明的“一种造血细胞灌注培养方法和装置”(中国专利ZL200410016212.5)，虽然能实现连续灌注培养，但细胞处于悬浮离散状态，存在细胞与细胞之间通讯困难的缺欠。
造血干细胞固定化培养是指利用有孔载体或类似于胞外基质的材料，模拟骨髓微环境的特点，将造血细胞限制在一定的生长范围内，使细胞高密度生长。由于三维培养系统改善了细胞间、细胞与基质间的相互作用，因此，构建的三维微环境有促进造血细胞增殖，然而造血细胞固定化培养的最显著缺点是细胞收获不如悬浮培养那么简便。
在体内，造血干细胞居于骨髓内，骨髓造血腔内的生化参数如氧压等可能会决定造血干细胞的扩增和分化趋向。体外培养系统的氧分压不同也会影响造血干细胞的扩增和分化，有文献报道，与常氧相比，在低氧情况下，造血干细胞的扩增较少，但同时分化也较少，较原始的造血干细胞所占的比例较高。因此，控制体外培养系统的氧分压，有望获得更好的细胞扩增效果。
造血干细胞在体内分布于骨髓腔内，其周围有许多基质细胞。这些基质细胞及其分泌的胞外基质和生长因子等形成的造血微环境会影响造血干细胞的增殖和分化，本反应器通过设置在底面的肋条使细胞聚集在一定空间范围内，加强了细胞间的通讯，克服了动态搅拌式反应器的缺点；同时又通过循环培养的方式，克服了静态的缺点，减少了局部浓度梯度问题。而且，造血干细胞在体内是处于一种低氧的环境下，而本反应器也能通过气体控制装置体外调控氧分压，所以说本反应器比较适合造血干细胞的培养。
发明内容
本发明的目的是提供一种用于造血细胞体外培养的生物反应器系统，以克服现有培养过程和技术存在的缺陷，满足细胞体外扩增的需要。
本发明的技术构思：
发明人认为，造血细胞体外培养过程会不断产生代谢副产物的和消耗营养物。静态培养无法消除因此带来的浓度梯度；动态搅拌培养虽能及时消除这种局部浓度梯度，但细胞处于分散的状态，不利于细胞之间的相互作用，且剪切力较大。发明人认为，若能实现连续灌注或循环培养则可克服以上缺点，而其中的反应器的结构是十分关键的。
本发明的用于造血细胞体外培养的生物反应器系统，包括补料瓶、气体混合装置和截面积为矩形的管状反应器；
所说的管状反应器的一端的靠下部处设有进液口，另一端靠上部处设有出液口，靠近进液口一端的上底面设有接种口，
反应器内部下表面上设有肋条；
所说的气体混合装置用于造血细胞体外培养所需要的空气、氧气、氮气和二氧化碳气体的混合，并通过调节四种气体的比例控制系统的氧分压；
气体混合装置通过管线与补料瓶相连接；
进液口与出液口分别通过管线与补料瓶相连通；
所说的混合气体包括CO2、O2、N2和空气；
所说的造血细胞是指来源于骨髓、外周血和脐血的单个核细胞及造血干/祖细胞，如CD34+细胞；
本发明的反应器是这样操作的：
在补料瓶中加入液体培养基，并添加血清和细胞因子，将造血细胞经接种口接种于反应器；通过管线使培养基从进液口经过反应器后，由出液口回流到补料瓶，并使液体培养基的体积保持在补料瓶体积的10％～15％，不断循环直到反应结束。
整个培养在37℃恒温培养箱中进行，并通过气体混合装置控制培养所需的氧分压。
由上述公开的技术方案可见，本发明通过培养装置底面局部的肋条使细胞不会被流动的培养液冲出而起到截流细胞的作用，能较好地使细胞聚集在一个有限的空间范围内，更好地发挥细胞间的相互作用。通过循环流动培养液可减少局部浓度梯度，较好地解决局部浓度梯度所产生的生长抑制问题。此外，连续灌注或循环培养类似静态的培养方式还能减少搅拌反应器中细胞所受的剪切力的影响。由于补料瓶中气体的体积远大于液体所占的体积，能很好地起到缓冲的作用，减少了由于细胞呼吸带来的氧分压的波动，从而弥补了较小型的反应器无法对氧分压进行在线检测、控制的缺陷。
附图说明
图1为用于造血细胞体外培养的生物反应器系统的结构示意图。
图2为用于造血细胞体外培养的生物反应器结构示意图。
图3为用于造血细胞体外培养的生物反应器俯视图。
具体实施方式
参见图1，所说的用于造血细胞体外培养的生物反应器系统，包括补料瓶(5)、气体混合装置(7)和截面积为矩形的管状反应器(1)；
参见图2和图3，所说的管状反应器(1)的一端的靠下部处设有进液口(2)，另一端靠上部处设有出液口(3)，靠近进液口(2)一端的上底面设有接种口(4)，
反应器(1)内部下表面上设有肋条(6)；
所说的气体混合装置(7)用于造血细胞体外培养所需要的空气、氧气、氮气和二氧化碳气体的混合，并对系统进行氧分压的控制；
气体混合装置(7)通过管线与补料瓶(5)相连接；
进液口(2)与出液口(3)分别通过管线与补料瓶(5)相连通；
优选的，所说的反应器(1)的长度为宽度的3～10倍，比表面积为1～3厘米-1，肋条间隔为0.5～1.0厘米，高度为0.05～0.2厘米；
比表面积的定义如下：底面积与体积之比。
优选的反应器采用低毒生物玻璃制作，如上海玻璃仪器一厂生产的GG17玻璃，反应器内部在使用前用硅化液(二甲基硅烷2％/甲苯)进行硅化处理。
以下实施例中，管状反应器(1)的结构参数如下：
所说的反应器(1)的长度为6.5厘米，宽度为1.5厘米，比表面积为2厘米-1，肋条间隔为1.0厘米，高度为0.1厘米。
液体培养基的体积保持在补料瓶体积的10％。
                        实施例1
在补料瓶内加入10ml含20％FBS(v/v)的IMDM培养基，并添加SCF、FL、TPO三种细胞因子，其浓度分别为50ng/ml、50ng/ml和20ng/ml。从新鲜脐血(取自国际和平妇幼保健院)中分离得CD34+细胞。用含20％FBS(v/v)的IMDM培养基(Gibco)悬浮，以1×105cells/ml密度由接种口接种于反应器。分别采用循环与静置两种方式培养，循环培养时流速为1ml/min，培养在含5％CO2(v/v)的37℃恒温培养箱中进行。培养7天，测定总细胞、CD34+细胞以及CD34+38-细胞的扩增倍数。在循环与不循环情况下总细胞扩增分别为7.29倍和13.94倍；CD34+细胞含量分别为45.11％和32.95％；CD34+细胞扩增情况分别为3.91倍和5.46倍；CD34+38-细胞含量分别为40.1％和10.8％；CD34+38-细胞扩增情况分别为4.31倍和2.22倍。由此可见，虽然循环条件下细胞的扩增不如不循环的情况，但循环条件更有利于造血干/祖细胞(CD34+细胞)尤其是较原始的造血干/祖细胞(CD34+38-细胞)的扩增。
                        实施例2
在补料瓶内加入10ml含20％(v/v)FBS的IMDM培养基，并添加SCF、IL-3、IL-6三种细胞因子，其浓度分别为50ng/ml、5ng/ml和20ng/ml。从新鲜脐血(取自国际和平妇幼保健院)分离得CD34+细胞。用含20％(v/v)FBS的IMDM培养基(Gibco)悬浮，以1.1×105cells/ml密度由接种口接种于反应器。静置2小时后，以1ml/min的流速不断进行循环。分别在在21％(v/v)氧分压(常氧)和5％(v/v)氧分压(低氧)的条件下进行培养。培养7天，测定总细胞、CD34+细胞以及集落形成单位(CFC)的扩增倍数。在常氧与低氧情况下总细胞扩增分别为15.27倍和4.77倍；CD34+细胞含量分别为34.93％和33.74％；CD34+细胞扩增情况分别为5.33倍和1.61倍；每1000个细胞生成的CFC集落数分别为18±2.83和18±1.41。

Claims (5)

1.用于造血细胞体外培养的生物反应器系统，包括补料瓶(5)和气体混合装置(7)，其特征在于，还包括截面积为矩形的管状反应器(1)；
所说的管状反应器(1)的一端的靠下部处设有进液口(2)，另一端靠上部处设有出液口(3)，靠近进液口(2)一端的上底面设有接种口(4)，
反应器(1)内部下表面上设有肋条(6)；
气体混合装置(7)通过管线与补料瓶(5)相连接；
进液口(2)与出液口(3)分别通过管线与补料瓶(5)相连通；
所说的反应器(1)的底面积与体积之比为1～3厘米-1；
肋条间隔为0.5～1.0厘米，高度为0.05～0.2厘米。
2.根据权利要求1所述的用于造血细胞体外培养的生物反应器系统，其特征在于，所说的反应器(1)的长度为宽度的3～10倍。
3.根据权利要求1～2任一项所述的用于造血细胞体外培养的生物反应器系统，其特征在于，反应器采用低毒生物玻璃制作。
4.根据权利要求1所述的用于造血细胞体外培养的生物反应器系统，其特征在于，所说的造血细胞是指来源于骨髓、外周血和脐血的单个核细胞及造血干/祖细胞。
5.根据权利要求1或4所述的用于造血细胞体外培养的生物反应器系统，其特征在于，气体混合装置(7)混合的气体包括CO2、O2、N2和空气。
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