CN101679941A - 在细胞培养物中使用铜和谷氨酸盐生产多肽 - Google Patents

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Abstract

本发明提供一种在细胞培养物中大规模生产多肽的改进系统。根据本发明，使表达所关注多肽的细胞在含有铜、谷氨酸盐或二者的培养基中生长。使用此类系统允许产生错误折叠和/或聚集减少并且总糖基化增加的多肽。根据本发明表达的多肽可有利地用于制备医药、农业或其它商业组合物。

Description

在细胞培养物中使用铜和谷氨酸盐生产多肽
相关申请案的交叉参考
本申请案与2007年3月2日申请的美国临时专利申请案第60/892,749号同在审查中，与所述专利申请案共有至少一个共同的发明人，并主张所述专利申请案的优先权，所述专利申请案的完整内容以引用的方式并入本文中。
技术领域
无
背景技术
蛋白质和多肽已成为越来越重要的治疗剂。在大多数情况下，这些蛋白质和多肽是由已经工程改造过的细胞和/或选择用于产生特别高含量的所关注特定蛋白质或多肽的细胞在细胞培养物产生。细胞培养条件的控制和优化对于成功工业生产蛋白质和多肽极为重要。
细胞培养物所产生的许多蛋白质和多肽都是以分批或补料分批方法得到，其中将细胞培养一段时间，随后终止培养并分离出所产生的蛋白质或多肽。或者，可以灌注细胞培养方法产生蛋白质或多肽，在所述方法中不终止培养，并将新养分和其它组分定期或不断添加到培养物中，且在此期间，定期或不断采集所表达的蛋白质或多肽。所产生的蛋白质或多肽的最终量和品质可明显受细胞培养条件影响。举例来说，传统的分批和补料分批培养方法通常会产生错误折叠和/或呈聚集体形式的蛋白质或多肽。错误折叠和/或聚集蛋白质或多肽的含量增加易于导致正确折叠和/或非聚集蛋白质或多肽的总产量降低。此外，传统的分批和补料分批培养方法通常还产生具有程度较低或其他方面不合意的糖基化模式的蛋白质或多肽。
用于产生正确折叠、不太易于聚集或具有较合意的糖基化模式的蛋白质或多肽的系统可潜在地产生具有较高效力和较少副作用的治疗性蛋白质或多肽剂。此外，这些蛋白质或多肽可用作较为有效的农业或其它工业药剂。因此，对能产生正确折叠、不易于聚集和/或具有较合意的糖基化模式的蛋白质或多肽的改进系统和组合物存在需要。特别对开发出用于以在确定的培养基中生长的细胞培养物产生蛋白质或多肽的改进系统存在需要。
发明内容
本发明提供在细胞培养物中大规模生产蛋白质和/或多肽的改进系统。在某些实施例中，本发明提供一种在包含铜的细胞培养基中生产蛋白质或多肽的系统。在某些实施例中，本发明提供一种在包含谷氨酸盐的细胞培养基中生产蛋白质或多肽的系统。在一些实施例中，本发明提供一种在包含铜和谷氨酸盐的细胞培养基中生产蛋白质或多肽的系统。在某些实施例中，使用本发明的细胞培养基来培养表达所关注蛋白质或多肽的哺乳动物细胞。
在某些实施例中，本发明提供利用含铜和/或谷氨酸盐的培养基的工业规模(例如500L或更大规模)培养方法。在某些实施例中，如本揭示案所教示的培养方法包括在细胞培养过程中一次或多次转变温度。根据本发明的某些方面，与在其它方面相同的生长条件下于其它方面相同的培养基中培养的多肽所观察到的结果相比，使用所述方法所产生的正确折叠蛋白质多肽的含量较高。此外，根据本发明的一些方面，与在其它方面相同的生长条件下于其它方面相同的培养基中培养的多肽所观察到的结果相比，使用所述方法产生的多肽具有程度较高或其他方面较为合意的糖基化模式。在某些实施例中，与在其它方面相同的生长条件下于其它方面相同的培养基中培养的多肽所观察到的结果相比，使用所述方法产生的多肽具有增加的总唾液酸化。
所属领域的普通技术人员应了解，本发明的培养基调配物涵盖确定的培养基和复合培养基。在某些实施例中，培养基为确定的培养基，其中所述培养基的组成为已知且受控的。
在一些实施例中，使细胞在美国专利申请案第11/213,308号、第11/213,317号和第11/213,633号中所述的一种或多种条件下生长，所述专利申请案都是在2005年8月25日申请并且各以全文引用的方式并入本文中。在一些实施例中，使细胞在2006年7月13日申请的美国临时专利申请案第60/830,658号(以全文引用的方式并入本文中)中所述的一种或多种条件下生长。在一些实施例中，使细胞在2006年11月3日申请的美国临时专利申请案第60/856,615号(以全文引用的方式并入本文中)中所述的一种或多种条件下生长。
本发明的细胞培养物可任选补充有养分和/或其它培养基组分，例如包括激素和/或其它生长因子、离子(诸如钠离子、氯离子、钙离子、镁离子和/或磷酸根离子)、缓冲剂、维生素、核苷或核苷酸、微量元素(通常以极低最终浓度存在的无机化合物)、氨基酸、脂质和/或葡萄糖或其它能量源。在某些实施例中，培养基可有益地补充有一种或多种化学诱导剂，诸如六亚甲基-双(乙酰胺)(“HMBA”)和丁酸钠(“NaB”)。这些任选补充物可在培养开始时添加，或可在稍后时间添加以便补足耗尽的养分或出于另一原因。在某些实施例中，需要选择初始培养基组成，以使根据本发明进行的补充最少。
在某些实施例中，进行给定细胞培养的总时间明显高于传统的培养时间，由此使细胞培养物产生的任何指定多肽的产量和品质增加，并使专业人员确定培养表达所关注多肽的细胞的适当时间或最佳时间的灵活性增加。
附图说明
图1绘示在表3中所述的实验条件下生长的细胞培养物的积分活细胞密度(integrated viable cell density，IVCD)。
图2绘示在表3中所述的实验条件下生长的细胞培养物的累积单位生产率(cumulative specific productivity，Qp)。
图3绘示在表3中所述的实验条件下生长的细胞培养物的谷氨酸盐含量。
图4绘示在表3中所述的实验条件下生长的细胞培养物的乳酸盐含量。
图5绘示在表3中所述的实验条件下生长的细胞培养物中所产生的错误折叠和/或聚集TNFR-Ig的第10天相对含量以及第10天滴度。
图6绘示在表4中所述的实验条件下生长的细胞培养物的积分活细胞密度(IVCD)。
图7绘示在表4中所述的实验条件下生长的细胞培养物的累积单位生产率(Qp)。
图8绘示在表4中所述的实验条件下生长的细胞培养物的谷氨酸盐含量。
图9绘示在表4中所述的实验条件下生长的细胞培养物的乳酸盐含量。
图10绘示在表4中所述的实验条件下生长的细胞培养物中所产生的错误折叠和/或聚集TNFR-Ig的第10天相对含量以及第10天滴度。
图11绘示在表5中所述的实验条件下生长的细胞培养物的积分活细胞密度(IVCD)。
图12绘示在表5中所述的实验条件下生长的细胞培养物的累积单位生产率(Qp)。
图13绘示在表5中所述的实验条件下生长的细胞培养物的谷氨酸盐含量。
图14绘示在表5中所述的实验条件下生长的细胞培养物的乳酸盐含量。
图15绘示在表5中所述的实验条件下生长的细胞培养物中所产生的错误折叠和/或聚集TNFR-Ig的第10天相对含量以及第10天滴度。
图16绘示在表4中所述的实验条件下生长的细胞培养物中第8天和第10天时错误折叠和/或聚集TNFR-Ig占参考TNFR-Ig样本的百分比。
图17绘示在表5中所述的实验条件下生长的细胞培养物中第8天、第10天和第12天时错误折叠和/或聚集TNFR-Ig占参考TNFR-Ig样本的百分比。
图18绘示在表4中所述的实验条件下生长的细胞培养物中第8天和第10天时唾液酸化的所表达TNFR-Ig占参考TNFR-Ig样本的百分比。
图19绘示在表5中所述的实验条件下生长的细胞培养物中第8天和第10天时唾液酸化的所表达TNFR-Ig占参考TNFR-Ig样本的百分比。
具体实施方式
定义
“氨基酸”：如本文所使用，术语“氨基酸”是指20种天然存在的氨基酸中的任一种，其通常用于形成所述氨基酸或任何非天然存在的氨基酸的多肽、类似物或衍生物。在某些实施例中，本发明的氨基酸是在培养基中提供给细胞培养物。培养基中所提供的氨基酸可以盐或水合物的形式提供。
“抗体”：如本文所使用，术语“抗体”是指免疫球蛋白分子，或免疫球蛋白分子的免疫活性部分，即，含有与抗原特异性结合(免疫反应)的抗原结合位点的分子，诸如Fab或F(ab′)2片段。在某些实施例中，抗体为所属领域的普通技术人员已知的典型天然抗体，例如包含四条多肽链两条重链和两条轻链的糖蛋白。在某些实施例中，抗体为单链抗体。举例来说，在一些实施例中，单链抗体包含重链和/或轻链的两个或两个以上成员已例如经由肽键共价连接的典型天然抗体的变异体。在某些实施例中，单链抗体为具有由重链和轻链组成的两条多肽链结构的蛋白质，所述链是例如通过链间肽连接子稳定，所述蛋白质能特异性结合抗原。在某些实施例中，抗体为仅包含重链的抗体，例如天然存在于骆驼科(Camelidae family)成员(包括美洲驼和骆驼)中的抗体(例如参看：卡斯特曼(Casterman)等人的美国专利第6,765,087号；卡斯特曼等人的美国专利第6,015,695号；和卡斯特曼等人的美国专利第6,005,079号，所述专利各以全文引用的方式并入本文中)。如本文所使用，术语“单克隆抗体”和“单克隆抗体组合物”是指仅含有一种抗原结合位点且因此通常仅与单一表位或特定抗原相互作用的一组抗体分子。因此，单克隆抗体组合物通常展现对于与其相互作用的特定表位的单一结合亲和力。在某些实施例中，单克隆抗体为人类化抗体，其中大部分氨基酸残基是来源于人类抗体，由此使当递送到人类个体中时发生的任何潜在免疫反应减到最少。术语“多克隆抗体”和“多克隆抗体组合物”是指含有多种与特定抗原相互作用的抗原结合位点的抗体分子群。
“分批培养”：如本文所使用，术语“分批培养”是指一种培养细胞的方法，其中最终将用于培养细胞的包括培养基(参看下文“培养基”的定义)以及细胞本身在内的所有组分都是在培养过程开始时提供。分批培养通常在某一时间点时停止，并采集培养基中的细胞和/或组分并任选加以纯化。
“生物反应器”：如本文所使用，术语“生物反应器”是指可用于生长细胞培养物的任何容器。生物反应器可具有任何尺寸，只要其可用于培养细胞即可。在某些实施例中，所述细胞为哺乳动物细胞。通常，生物反应器将为至少1升，并且可为10、100、250、500、1,000、2,500、5,000、8,000、10,000、12,000升或更高，或为其间任何体积。在培养期间，任选控制生物反应器的内部条件，包括(但不限于)pH值和温度。生物反应器可由适于在本发明的培养条件下保持悬浮于培养基中的哺乳动物细胞培养物的任何材料构成，包括玻璃、塑料或金属。如本文所使用，术语“生产用生物反应器(production bioreactor)”是指用于产生所关注多肽或糖蛋白的最终生物反应器。生产用生物反应器的体积通常为至少500升，并且可为1,000、2,500、5,000、8,000、10,000、12,000升或更高，或为其间任何体积。所属领域的普通技术人员应了解并且能够选择用于实施本发明的适当生物反应器。
“细胞密度”：如本文所使用，术语“细胞密度”是指指定体积培养基中存在的细胞数量。
“细胞活力”：如本文所使用，术语“细胞活力”是指培养物中的细胞在一组指定的培养条件或实验变化下存活的能力。本文所使用的所述术语还指在特定时间存活的细胞相对于在所述时间培养物中存活和死亡的细胞总数的部分。
“复合培养基”：如本文所使用，术语“复合培养基”是指含有至少一种特性或数量未知或不受控制的组分的培养基。
“培养物”、“细胞培养物”：如本文所使用，这些术语都是指在适于细胞群存活和/或生长的条件下悬浮于培养基(参看下文“培养基”的定义)中的细胞群。如所属领域的普通技术人员将从上下文了解，本文中使用的这些术语还指包含细胞群和悬浮所述群体的培养基的组合。在某些实施例中，细胞培养物为哺乳动物细胞培养物。
“确定的培养基”：如本文所使用，术语“确定的培养基”是指培养基的组成已知且受控的培养基。
“补料分批培养”：如本文所使用，术语“补料分批培养”是指在培养过程开始后某一时间将额外组分提供到培养物中的培养细胞的方法。所提供的组分通常包含细胞在培养过程中耗尽的营养组分。另外或其它，所述额外组分可包括补充组分(参看下文“补充组分”的定义)。在某些实施例中，将所述额外组分提供于补料培养基(参看下文“补料培养基”的定义)中。补料分批培养通常在某一时间点停止，并采集培养基中的细胞和/或组分并任选加以纯化。
“补料培养基”：如本文所使用，术语“补料培养基”是指在细胞培养开始后添加的含有滋养正在生长的哺乳动物细胞的养分的溶液。补料培养基可含有与初始细胞培养基中所提供相同的组分。另外或其它，补料培养基可含有一种或多种除初始细胞培养基中所提供的组分外的其它组分。另外或其它，补料培养基可缺乏一种或多种初始细胞培养基中所提供的组分。在某些实施例中，补料培养基的一种或多种组分是以与初始细胞培养基中所提供的所述组分的浓度或含量相同或相似的浓度或含量提供。在某些实施例中，补料培养基的一种或多种组分是以与初始细胞培养基中所提供的所述组分的浓度或含量不同的浓度或含量提供。例示性补料培养基展示于表2中，但本发明不限于使用这些培养基。所属领域的普通技术人员将认识到，可使用替代性补料培养基，和/或可对表2中所列的例示性补料培养基的组成进行某些改变。在某些实施例中，补料培养基含有补充组分(参看下文“补充组分”的定义)。
“片段”：如本文所使用，术语“片段”是指一种多肽且定义为指定多肽的为所述多肽所独有的或特有的任何离散部分。本文中使用的所述术语还指指定多肽的保留所述全长多肽的至少一部分活性的任何离散部分。在某些实施例中，所保留的活性的分率为全长多肽活性的至少10％。在某些实施例中，所保留的活性的分率为全长多肽活性的至少20％、30％、40％、50％、60％、70％、80％或90％。在某些实施例中，所保留的活性的分率为全长多肽活性的至少95％、96％、97％、98％或99％。在某些实施例中，所保留的活性的分率为全长多肽活性的100％或更高。其它或另外，本文中使用的所述术语还指指定多肽的包括至少一个全长多肽中所存在的确定序列元件的任何部分。在一些实施例中，所述序列元件涵盖全长多肽的至少4-5、10、15、20、25、30、35、40、45、50或更多个氨基酸。
“基因”：如本文所使用，术语“基因”是指任何核苷酸序列DNA或RNA，其中至少一些部分编码离散的终产物，通常为(但不限于)多肽。所述术语任选不仅指编码多肽或其它离散终产物的编码序列，而且还可涵盖所述编码序列之前和/或之后调节基础表达水平(参看下文“遗传控制元件”的定义)的区域以及个别编码区段(“外显子”)之间的插入序列(“内含子”)。
“遗传控制元件”：如本文所使用，术语“遗传控制元件”是指调节与其可操作地连接的基因的表达的任何序列元件。遗传控制元件可通过增加或降低表达水平来起作用，并且可位于编码序列之前、编码序列内或编码序列之后。遗传控制元件可在基因表达的任何阶段通过例如调控转录的起始、延长或终止；mRNA剪接；mRNA编辑；mRNA稳定性；mRNA在细胞内的定位；翻译的起始、延长或终止；或基因表达的任何其它阶段来起作用。遗传控制元件可独立作用或相互组合作用。
“糖蛋白”：如本文所使用，术语“糖蛋白”是指含有一个或多个共价连接的寡糖链的蛋白质或多肽。寡糖链可由单一糖残基、单一未分枝糖残基链或一次或多次分枝的糖残基链构成。寡糖链可为N连接型或O连接型。
“糖基化模式”：术语“糖基化模式”是指所观察到的一种或多种指定糖蛋白的糖基化。普遍认为，在寡糖链中具有较大量共价连接的糖残基的糖蛋白具有增加的或程度较高的糖基化模式。相反，认为在寡糖链中具有较少共价连接的糖残基的糖蛋白具有减少的或程度较低的糖基化模式。如本文所使用，术语“糖基化模式”还指根据本发明的教示所表达的个别糖蛋白上数种不同糖基化模式的特征性分布。在此意义上说，糖基化模式增加是指所表达的糖蛋白的糖基化模式的特征性分布增加。
“宿主细胞”：如本文所使用，术语“宿主细胞”是指在根据本发明的培养物中生长从而产生所关注蛋白质或多肽的细胞。所述术语还指根据本发明进行处理从而产生糖蛋白的细胞。在某些实施例中，当根据本文所述的方法且以本文所述的组合物生产时，宿主细胞中产生的糖蛋白展现程度较高和/或较为合意的糖基化模式。在某些实施例中，宿主细胞为哺乳动物细胞。
“杂交瘤”：如本文所使用，术语“杂交瘤”是指通过将永生化细胞与抗体产生细胞融合产生的细胞或细胞的后代。所得杂交瘤为产生抗体的永生化细胞。用于产生杂交瘤的个别细胞可来自任何哺乳动物来源，包括(但不限于)大鼠、猪、兔、绵羊、山羊和人类。所述术语还涵盖三源杂交瘤细胞系(trioma cell line)，它是在将异种杂交骨髓瘤融合体(人类细胞与鼠类骨髓瘤细胞系之间的融合产物)的后代随后与浆细胞融合时产生。此外，所述术语欲包括产生抗体的任何永生化杂交细胞系，诸如四源杂交瘤(quadroma)(例如参看，米尔斯坦(Milstein)等人，自然(Nature)，537：3053，1983)。
“积分活细胞密度”、“IVCD”：如本文所使用，术语“积分活细胞密度”或“IVCD”是指整个培养过程中活细胞的平均密度与执行培养的时间量的乘积。当所产生的多肽和/或蛋白质的量与整个培养过程中存在的活细胞的数量成比例时，积分活细胞密度为估算整个培养过程中所产生的多肽和/或蛋白质的量的有用工具。
“培养基”、“细胞培养基”：本文中所使用的这些术语是指含有滋养正在生长的细胞的养分的溶液。在某些实施例中，培养基可用于培养哺乳动物细胞。通常，培养基提供细胞最低限度生长和/或存活所需的必需和非必需氨基酸、维生素、能量源、脂质和微量元素。培养基还可含有使生长和/或存活增强超过最低等级的补充组分(参看下文“补充组分”的定义)，包括(但不限于)激素和/或其它生长因子、特定离子(诸如钠离子、氯离子、钙离子、镁离子和磷酸根离子)、缓冲剂、维生素、核苷或核苷酸、微量元素(通常以极低最终浓度存在的无机化合物)、氨基酸、脂质和/或葡萄糖或其它能量源。在某些实施例中，有利地将培养基调配成对细胞存活和增殖来说最佳的pH值和盐浓度。例示性培养基展示于表1中，但本发明不限于使用这些培养基。所属领域的普通技术人员将认识到，可使用替代性培养基，和/或可对表1中所列出的例示性培养基的组成进行某些改变。在某些实施例中，培养基为在细胞培养开始后添加的补料培养基(参看上文“补料培养基”的定义)。在某些实施例中，细胞培养基为最初的营养液与在细胞培养开始后添加的任何补料培养基的混合物。
“代谢废物”：如本文所使用，术语“代谢废物”是指由细胞培养物的正常或不正常代谢过程产生的化合物，其在某些方面对细胞培养物有害，尤其对所需重组多肽或蛋白质的表达或活性不利。举例来说，代谢废物可对细胞培养物的生长或活力有害；可减少所产生的重组多肽或蛋白质的量；可改变所表达的多肽或蛋白质的折叠、稳定性、聚集、糖基化或其它翻译后修饰；或可在任何数量的其它方面对细胞和/或重组多肽或蛋白质的表达或活性不利。例示性代谢废物包括由葡萄糖代谢产生的乳酸盐，及由谷氨酰胺代谢产生的铵。细胞培养物可产生一种或一种以上代谢废物。
“多肽”：如本文所使用，术语“多肽”是指经由肽键连接在一起的连续氨基酸链。所述术语用于指任何长度的氨基酸链，但所属领域的普通技术人员应了解，所述术语不限于长链，并且可以指包含两个经由肽键连接在一起的氨基酸的最短链。如所属领域的技术人员所了解，可对多肽进行加工和/或修饰。举例来说，多肽可经糖基化(参看上文“糖蛋白”的定义)。
“蛋白质”：如本文所使用，术语“蛋白质”是指以离散单元起作用的一个或多个多肽。如果单一多肽为离散功能单元且不需要与其它多肽持久或临时物理缔合来形成离散功能单元，则术语“多肽”和“蛋白质”可互换使用。如果离散功能单元包含彼此物理缔合的多个多肽，则本文所使用的术语“蛋白质”是指物理性偶合并一起以离散单元起作用的多个多肽。
“重组表达的多肽”和“重组多肽”：本文中使用的这些术语是指由人工处理成能表达多肽的宿主细胞表达的多肽。在某些实施例中，宿主细胞为哺乳动物细胞。在某些实施例中，所述处理可包含一种或多种遗传修饰。举例来说，可通过引入一个或多个编码所欲表达的多肽的异源基因对宿主细胞进行遗传修饰。重组表达的异源多肽可与宿主细胞中通常所表达的多肽相同或相似。重组表达的异源多肽还可对于宿主细胞而言为外来的，例如对于宿主细胞中通常所表达的多肽而言为异源的。在某些实施例中，重组表达的异源多肽为嵌合多肽。举例来说，部分多肽可含有与宿主细胞中通常所表达的多肽相同或相似的氨基酸序列，而其它部分含有对于宿主细胞而言为外来的氨基酸序列。另外或其它，多肽可含有来自两种或两种以上不同多肽(其通常为在宿主细胞中表达的多肽)的氨基酸序列。此外，多肽可含有来自两种或两种以上多肽(其都对于宿主细胞而言为外来的多肽)的氨基酸序列。在一些实施例中，通过活化或上调一个或多个内源基因来对宿主细胞进行遗传修饰。
“补充组分”：如本文所使用，术语“补充组分”是指使生长和/或存活增强超过最低等级的组分，包括(但不限于)激素和/或其它生长因子、特定离子(诸如钠离子、氯离子、钙离子、镁离子和磷酸根离子)、缓冲剂、维生素、核苷或核苷酸、微量元素(通常以极低最终浓度存在的无机化合物)、氨基酸、脂质和/或葡萄糖或其它能量源。在某些实施例中，补充组分是添加到初始细胞培养物中。在某些实施例中，补充组分是在细胞培养开始后添加。
“滴度”：如本文所使用，术语“滴度”是指在指定量的培养基体积中，由哺乳动物细胞培养物产生的重组表达的蛋白质或多肽的总量。滴度通常以每毫升培养基中蛋白质或多肽的毫克数为单位来表示。
某些实施例的详细描述
本发明提供由细胞培养物生产蛋白质和/或多肽的改进系统和培养基调配物。在某些实施例中，本发明提供使错误折叠和/或聚集蛋白质产物减至最少的系统。当产生错误折叠或聚集蛋白质或多肽时，细胞培养物中所产生的所需蛋白质或多肽的总量由此降低。根据某些实施例，通过使用包含提供包含铜的细胞培养物的方法来减少或消除错误折叠和/或聚集的蛋白质或多肽。在一些实施例中，通过使用包含提供包含谷氨酸盐的细胞培养物的方法来减少或消除错误折叠和/或聚集的蛋白质或多肽。在某些实施例中，通过使用包含提供包含铜和谷氨酸盐两者的细胞培养物的方法来减少或消除错误折叠和/或聚集的蛋白质或多肽。
本发明的某些方法还包括增加细胞培养物所产生的蛋白质或多肽中的糖基化总量，或另外在细胞培养物所产生的蛋白质或多肽中产生更合意的糖基化模式。在某些实施例中，通过使用包含提供包含铜的细胞培养物的方法，来增加所产生的蛋白质或多肽中糖基化的总量，或另外在所产生的蛋白质或多肽中产生更合意的糖基化模式。在一些实施例中，通过使用包含提供包含谷氨酸盐的细胞培养物的方法，来增加所产生的蛋白质或多肽中糖基化的总量，或另外在所产生的蛋白质或多肽中产生更合意的糖基化模式。在一些实施例中，通过使用包含提供包含铜和谷氨酸盐两者的细胞培养物的方法，来增加所产生的蛋白质或多肽中糖基化的总量，或另外在所产生的蛋白质或多肽中产生更合意的糖基化模式。在某些实施例中，细胞培养物为分批或补料分批培养物。
本发明的某些组合物包括包含铜的细胞培养基。本发明的某些组合物包括包含谷氨酸盐的细胞培养基。本发明的某些组合物包括包含铜和谷氨酸盐两者的细胞培养基。根据一些实施例，与细胞在缺乏铜和/或谷氨酸盐但其它方面相同的培养基中生长时所观察到的错误折叠和/或聚集多肽的分率相比，在本发明的培养基组合物中生长的错误折叠和/或聚集多肽相对于所产生的总多肽的分率有所降低。此外，在一些实施例中，相对于由在缺乏铜和/或谷氨酸盐但其它方面相同的培养基中生长的细胞所产生的肽的总唾液酸化，由在本发明的培养基组合物中生长的细胞所产生的多肽的总唾液酸化有所增加。
某些实施例和方面将于下文详细论述。然而，所属领域的普通技术人员应了解，对于这些实施例的各种修改也在随附权利要求的范围内。所述权利要求和其等效内容将界定本发明的范围，而本发明的范围不限于或不应限于所述某些实施例的描述。
细胞
根据本发明，可利用易于进行细胞培养并且易于表达蛋白质或多肽的任何宿主细胞。在某些实施例中，宿主细胞为哺乳动物细胞。可根据本发明使用的哺乳动物细胞的非限制性实例包括BALB/c小鼠骨髓瘤细胞系(NSO/1，ECACC编号：85110503)；人成视网膜细胞(PER.C6，克鲁塞尔公司(CruCell)，荷兰莱顿(Leiden，The Netherlands)；经SV40转化的猴肾CV1细胞系(COS-7，ATCC CRL 1651)；人胚肾细胞系(293细胞或经亚克隆以在悬浮培养物中生长的293细胞，格拉汉姆(Graham)等人，普通病毒学杂志(J.Gen Virol)，36：59，1977)；幼仓鼠肾细胞(BHK，ATCC CCL 10)；中国仓鼠卵巢细胞+/-DHFR(CHO，尔劳(Urlaub)和查斯汀(Chasin)，美国国家科学院院刊(Proc.Natl.Acad.Sci.USA)，77：4216，1980)；小鼠足细胞(Sertoli cell)(TM4，马瑟(Mather)，繁殖生物学(Biol.Reprod.)，23：243-251，1980)；猴肾细胞(CV1 ATCC CCL 70)；非洲绿猴肾细胞(VERO-76，ATCC CRL-1587)；人子宫颈癌细胞(HeLa，ATCC CCL 2)；犬肾细胞(MDCK，ATCC CCL 34)；布法罗大鼠(buffalo rat)肝细胞(BRL 3A，ATCCCRL 1442)；人肺细胞(W138，ATCC CCL 75)；人肝细胞(Hep G2，HB 8065)；小鼠乳腺肿瘤(MMT 060562，ATCC CCL51)；TRI细胞(马瑟(Mather)等人，纽约科学院年报(Annals N.Y.Acad.Sci.)，383：44-68，1982)；MRC 5细胞；FS4细胞；和人肝细胞瘤细胞系(Hep G2)。
另外，可根据本发明利用表达多肽或蛋白质的任何市售和非市售杂交瘤细胞系。所属领域的技术人员应了解，杂交瘤细胞系可能具有不同的营养需求，和/或可能需要不同培养条件以供最佳生长和多肽或蛋白质表达，且可视需要改变条件。
如上文所述，在许多情况下，将选择细胞或对细胞进行工程改造以产生高含量的所关注蛋白质或多肽。通常，例如通过引入编码所关注蛋白质或多肽的基因，和/或通过引入调控编码所关注蛋白质或多肽的基因(无论为内源基因或引入的基因)的表达的控制元件，来处理细胞以产生高蛋白质含量。
所属领域的普通技术人员应了解，在不同细胞类型中产生的蛋白质或多肽可含有不同的所得糖基化模式。举例来说，普里茨比罗(Przybylo)等人表明，当在非恶性输尿管上皮细胞、经v-raf转染的HCV29细胞和膀胱移行细胞癌中表达时，钙粘附蛋白(cadherin)的糖基化模式不同(参看普里茨比罗等人，癌细胞(国际)(Cancer CellInternational)，2(1)：6，2002)。莱弗利(Lifely)等人表明，当在CHO、Y0骨髓瘤和NS0骨髓瘤细胞系中表达时，人类化IgG抗体的糖基化模式和生物活性不同(参看莱弗利等人，糖生物学(Glycobiology)，5(8)：813-22，1995)。所属领域中已知检测和测量特定蛋白质或多肽糖基化的程度和模式的方法。因此，所属领域的普通技术人员将能够选择最合意的细胞系以在不需过多实验的情况下生产任何指定蛋白质或多肽。不管最终选择何种细胞系，都可使用本发明的方法和组合物来产生具有程度较高或其他方面较为合意的糖基化模式的蛋白质或多肽。
某些多肽可对细胞生长、细胞活力或在某些方面最终限制所关注多肽或蛋白质的产生的一些其它细胞特征具有不利影响。即使在工程改造成表达特定多肽的一种特定类型的细胞群中，细胞群内也可能存在变化性，以致某些个别细胞生长较好，产生更多所关注多肽，产生不太易于错误折叠和/或聚集的多肽，和/或产生具有程度较高或其他方面较为合意的糖基化模式的多肽。在某些实施例中，专业人员凭经验选择能在选用于培养细胞的特定条件下稳固生长的细胞系。在某些实施例中，根据细胞生长、最终细胞密度、细胞活力百分比、所表达的多肽的滴度、正确折叠、所需糖基化模式或者这些或专业人员认为重要的任何其它条件的任何组合，选择工程改造成表达特定多肽的个别细胞用于大规模生产。
培养细胞
本发明可与适于表达多肽的任何细胞培养方法或系统合用。举例来说，可以分批或补料分批培养方式培养细胞，其中在表达足量多肽后终止培养，此后采集所表达的多肽并任选加以纯化。或者，可以灌注培养方式培养细胞，其中不终止培养并将新养分和其它组分定期或不断添加到培养物中，在此期间，定期或不断采集所表达的多肽。
可以专业人员所选择的任何适宜体积培养细胞。举例来说，可在体积为数毫升到数升范围内的小规模反应容器中培养细胞。或者，可在体积为约至少1升到10、100、250、500、1000、2500、5000、8000、10,000、12,000升或更高范围内或者为其间任何体积的大规模工业用生物反应器中培养细胞。
细胞培养的温度将主要根据一定温度范围来选择，在所述温度范围下，细胞培养物能保持活力，产生高含量多肽，减少多肽的错误折叠和/或聚集，多肽展现程度较高或其他方面较为合意的糖基化模式，或者这些或专业人员认为重要的其它因素的任何组合。举例来说，在约37℃下，CHO细胞生长良好，并且产生高含量的蛋白质或多肽，和/或产生具有合意的糖基化模式的糖蛋白。一般说来，在约25℃到42℃的范围内，大多数哺乳动物细胞生长良好，并且能产生高含量的蛋白质或多肽，和/或产生具有合意的糖基化模式的糖蛋白，但本发明所教示的方法不限于这些温度。在约35℃到40℃的范围内，某些哺乳动物细胞生长良好，并且可产生高含量的蛋白质或多肽，和/或产生具有合意的糖基化模式的糖蛋白。在某些实施例中，在细胞培养过程中的一个或多个时间，使细胞在20、21、22、23、24、25、26、27、28、29、30、31、32、33、34、35、36、37、38、39、40、41、42、43、44或45℃的温度下生长。所属领域的普通技术人员将能够根据细胞要求和专业人员的生产需求来选择一个或多个培养细胞的适当温度。
此外，在培养过程中，可使培养物经历一次或多次温度转变。当转变培养物的温度时，温度转变可为相对逐渐进行的。举例来说，可耗费数小时或数天来完成温度改变。或者，温度转变可为相对急剧的。在培养过程中，温度可稳定增加或降低。另外或其它，可在培养过程中的不同时间，增加或降低不连续量的温度。后续温度或温度范围可低于或高于初始或先前温度或温度范围。所属领域的普通技术人员应了解，本发明涵盖多次温度转变。举例来说，可转变温度一次(转变到较高或较低温度或温度范围)，在此温度或温度范围下将细胞维持某一段时间，此后可将温度再转变到新的温度或温度范围，所述温度或温度范围可高于或低于先前温度或温度范围的温度或温度范围。在每次不连续的转变后，培养物的温度可恒定，或可保持在某一温度范围内。
与初始温度或温度范围一样，温度转变后细胞培养物的温度或温度范围通常主要根据使细胞培养物保持活力的温度、产生高含量糖蛋白的温度范围和/或所表达的糖蛋白含有合意糖基化模式的温度范围来选择。一般说来，在约25℃到42℃的范围内，大多数哺乳动物细胞都保持活力并表达工业上适当的含量的具有合意糖基化模式的糖蛋白，但本发明所教示的方法不限于这些温度。在某些实施例中，在约25℃到35℃的范围内，哺乳动物细胞仍保持活力，并表达工业上适当的含量的具有合意糖基化模式的糖蛋白。在某些实施例中，在温度转变后一个或多个的时间，使细胞在20、21、22、23、24、25、26、27、28、29、30、31、32、33、34、35、36、37、38、39、40、41、42、43、44或45℃的温度下生长。所属领域的普通技术人员将能够根据细胞的特定要求和专业人员的特定生产需求来选择培养细胞的适当温度或温度范围。视专业人员的要求和细胞本身的需求而定，可使细胞生长任何时间量。
在某些实施例中，在所表达的多肽达到足够高的滴度后，即终止分批和/或补料分批细胞培养。作为非限制性实例，当多肽滴度为100、200、300、400、500、600、700、800、900、1000、1100、1200、1300、1400、1500、2000mg/L或更高时，可终止细胞培养。所属领域的普通技术人员将能够选择一个或多个可采集分批和/或补料分批培养物的适当滴度。另外或其它，在某些实施例中，如由专业人员的要求所确定，在所表达的糖蛋白展现合意糖基化模式后，即终止分批和/或补料分批细胞培养。另外和/或其它，如由专业人员的要求所确定，在细胞达到足够高的密度后，即终止分批和/或补料分批细胞培养。举例来说，在细胞达到最大活细胞密度的1％、5％、10％、15％、20％、25％、30％、35％、40％、45％、50％、55％、60％、65％、70％、75％、80％、85％、90％、95％或99％后，即可终止培养。另外或其它，可在诸如乳酸盐和铵等代谢废物过量积累前，终止分批和/或补料分批反应。
在某些实施例中，终止分批和/或补料分批细胞培养以防止错误折叠和/或聚集多肽的不当积累。举例来说，当错误折叠和/或聚集多肽的相对分率为适当折叠和/或非聚集多肽的30％、29％、28％、27％、26％、25％、24％、23％、22％、21％、20％、19％、18％、17％、16％、15％、14％、13％、12％、11％、10％、9％、8％、7％、6％、5％、4％、3％、2％、1％时，可终止细胞培养。在某些实施例中，当错误折叠和/或聚集多肽的相对分率小于适当折叠和/或非聚集多肽的1％时，终止细胞培养。在某些实施例中，所述终止完全是在达到足够高的滴度之前、细胞达到足够高的密度之前和/或代谢废物积累到过量程度之前进行。在某些实施例中，由于所产生的多肽的错误折叠和/或聚集减少，故根据本发明的方法和组合物培养的细胞培养物生长的时间可比使用传统培养方法可能生长的时间长。举例来说，根据本发明的方法和组合物培养的细胞培养物可生长1、2、3、4、5、6、7、8、9、10、11、12、13、14、15、16、17、18、19、20、21、22、23、24、25、26、27、28、29、30天或更多天。所属领域的普通技术人员应了解，能够在错误折叠和/或聚集多肽的量减少的情况下使细胞培养物生长一段较长时间，将会使所产生的正确折叠的非聚集多肽的量增加。因此，本发明的某些方法和组合物使专业人员确定培养表达所关注多肽的细胞的适当或最佳时间的灵活性增加。
在某些情况下，在后续生产阶段期间，向细胞培养物中补充已被细胞耗尽或代谢的养分或其它培养基组分可为有益的或必要的。作为非限制性实例，向细胞培养物中补充激素和/或其它生长因子、特定离子(诸如钠离子、氯离子、钙离子、镁离子和磷酸根离子)、缓冲剂、维生素、核苷或核苷酸、微量元素(通常以极低最终浓度存在的无机化合物)、氨基酸、脂质或葡萄糖或其它能量源可为有益的或必要的。这些补充组分可一次性全部添加到细胞培养物中，或其可以一系列添加提供到细胞培养物中。
在某些实施例中，根据美国专利申请案第11/213,308号、第11/213,317号和第11/213,633号中所述的任一种细胞培养方法培养细胞，所述专利申请案都是在2005年8月25日申请并且各以全文引用的方式并入本文中。举例来说，在某些实施例中，使细胞在累积氨基酸浓度高于约70mM的培养基中生长。在某些实施例中，使细胞在累积谷氨酰胺比累积天冬酰胺的摩尔比小于约2的培养基中生长。在某些实施例中，使细胞在累积谷氨酰胺比累积总氨基酸的摩尔比小于约0.2的培养基中生长。在某些实施例中，使细胞在累积无机离子比累积总氨基酸的摩尔比介于约0.4到1之间的培养基中生长。在某些实施例中，使细胞在累积谷氨酰胺与累积天冬酰胺的组合浓度介于约16与36mM之间的培养基中生长。在某些实施例中，使细胞在含有2、3、4或全部5个前述培养基条件的培养基中生长。在某些实施例中，细胞培养基中谷氨酰胺的浓度局限于小于约13mM。在某些实施例中，细胞培养基中谷氨酰胺的浓度局限于小于约4mM。
在一些实施例中，使细胞在2006年7月13日申请的美国临时专利申请案第60/830,658号(以全文引用的方式并入本文中)中所述的一种或多种条件下生长。举例来说，在一些实施例中，使细胞在含有浓度介于约10与600nM之间的锰的培养基中生长。在一些实施例中，使细胞在含有浓度介于约20与100nM之间的锰的培养基中生长。在一些实施例中，使细胞在含有浓度为约40nM的锰的培养基中生长。
在一些实施例中，使细胞在2006年11月3日申请的美国临时专利申请案第60/856,615号(以全文引用的方式并入本文中)中所述的一种或多种条件下生长。在一些实施例中，使细胞在含有葡萄糖类似物2-脱氧葡萄糖的培养基中生长。在某些实施例中，使细胞培养物在含有2-脱氧葡萄糖的培养基中生长，其中谷氨酰胺是以小于约13mM的浓度存在。在某些实施例中，使细胞培养物在含有2-脱氧葡萄糖的培养基中生长，其中谷氨酰胺是以小于约4mM的浓度存在。在某些实施例中，使细胞培养物在含有磷酸二(2-乙基己基)酯、磷酸三丁酯、磷酸十二烷酯、(二苯基甲基)-磷酸 2-二甲基氨基乙酯、[2-(二苯基磷酰基氧基)乙基]三甲基铵的碘化物、碘乙酸盐和/或氟乙酸盐的培养基中生长，且任选其中谷氨酰胺是以小于约13mM或4mM的浓度存在。
所属领域的普通技术人员将能够制定具体细胞培养条件，以便优化细胞培养物的某些特征，包括(但不限于)生长速率、细胞活力、细胞培养物的最终细胞密度、诸如乳酸盐和铵等有害代谢副产物的最终浓度、所表达多肽的最终滴度、所表达多肽的错误折叠和/或聚集的减少、所表达多肽的程度较高或其他方面较为合意的糖基化模式，或者这些或专业人员认为重要的其它条件的任何组合。
培养基组合物
可根据本发明使用多种生长培养基中的任一种。在某些实施例中，使细胞在多种化学成分确定的培养基中的任一种中生长，其中所述培养基的组分为已知的并且受到控制的。在一些实施例中，使细胞在多种复合培养基中的任一种中生长，其中并非所有培养基组分都是已知的和/或受到控制的。
在过去数十年中，已开发并公开大量用于细胞培养的化学成分明确的生长培养基，包括用于哺乳动物细胞培养的化学成分明确的生长培养基。确定的培养基中的所有组分都经充分表征，因此确定的培养基不含诸如血清或水解产物等复杂添加剂。早期开发的培养基调配物允许细胞生长和维持活力，而与蛋白质生产或品质具有极少关联或无关联。近来，已开发出用于支持高生产率细胞培养的表达目的的培养基调配物。然而，仍有多项工作在开发产生较高品质的蛋白质或多肽(例如，正确折叠、较少聚集和/或具有程度较高或其他方面较为合意的糖基化模式的蛋白质或多肽)的培养基调配物。
确定的培养基通常由约50种在水中具有已知浓度的化学实体组成。大部分确定的培养基还含有一种或多种充分表征的蛋白质，诸如胰岛素、IGF-1、转铁蛋白(transferrin)或BSA，但其它确定的培养基不需要蛋白质组分且因此称为无蛋白质的确定的培养基。确定的培养基中的化学组分通常属于5个主要类别：氨基酸、维生素、无机盐、微量元素和难以简单分类的混杂类别。
所有培养基(确定的培养基或复合培养基)都包括正在生长的细胞的能量源。通常，所述能量源为葡萄糖，即一种化学式为C6H12O6的简单单糖。传统的培养基调配物都含有相对较高的葡萄糖含量，包括市售培养基，诸如汉姆氏F10(Ham′s F10)(西格玛公司(Sigma))、最低必需培养基([MEM]，西格玛公司)、RPMI-1640(西格玛公司)，和达尔伯克改良伊格尔培养基([Dulbecco′s Modified Eagle′s Medium，DMEM]，西格玛公司)。由于葡萄糖为细胞的主要代谢能量源，故通常认为需要大量的葡萄糖。然而，葡萄糖的迅速消耗会引起乳酸盐的积累。乳酸盐是一种有害的代谢废物，并且它还是细胞生长和细胞培养生产率的已知抑制剂(参看乔弗恩(Gorfien)等人，补料分批培养的最佳营养添加剂(Optimized Nutrient Additives for Fed-Batch Cultures)，国际生物制药(Biopharm.International)，2003年4月；劳(Lao)和托斯(Toth)，铵和乳酸盐对重组中国仓鼠卵巢细胞培养物的生长和代谢的影响(Effect of ammonium and lactate on growthand metabolism of a recombinant Chinese Hamster Ovary Cell Culture)，生物技术进展(Biotechnology.Prog.)13(5)：688-691，1997)。
本发明涵盖以下发现：与细胞在诸如上文所述的传统培养基中生长的情况下，所产生的蛋白质或多肽将另外展现的特征相比，使用本文所揭示的某些方法和组合物，由在确定的培养基中生长的细胞培养物产生的蛋白质或多肽展现减少的蛋白质错误折叠、减少的聚集和/或程度较高或其他方面较为合意的糖基化模式。在某些实施例中，包含铜的培养基调配物可用于减少所产生多肽的错误折叠和/或聚集，或可用于产生具有程度较高或其他方面较为合意的糖基化模式的多肽。举例来说，本发明的培养基调配物可包含浓度为0.1、0.2、0.3、0.4、0.5、0.6、0.7、0.8、0.9、1.0、1.1、1.2、1.3、1.4、1.5、1.6、1.7、1.8、1.9、2、3、4、5、6、7、8、9、10、15、20、25、30、35、40、45、50、55、60、65、70、75、80、85、90、95或100μM的铜。
在一些实施例中，包含谷氨酸盐的培养基调配物可用于减少所产生多肽的错误折叠和/或聚集，或可用于产生具有程度较高或其他方面较为合意的糖基化模式的多肽。举例来说，本发明的培养基调配物可包含浓度为1.0、1.1、1.2、1.3、1.4、1.5、1.6、1.7、1.8、1.9、2.0、2.1、2.2、2.3、2.4、2.5、2.6、2.7、2.8、2.9、3.0、3.1、3.2、3.3、3.4、3.5、3.6、3.7、3.8、3.9、4.0、4.1、4.2、4.3、4.4、4.5、4.6、4.7、4.8、4.9、5.0、6、7、8、9、10、11、12、13、14、15、16、17、18、19、20、21、22、23、24、25、26、27、28、29、30、31、32、33、34或35mM的谷氨酸盐。
所属领域的普通技术人员应了解，细胞培养基中铜和/或谷氨酸盐的上述浓度可使用分批培养、补料分批培养或灌注培养实现。
在某些实施例中，包含铜和谷氨酸盐的培养基调配物可用于减少所产生多肽的错误折叠和/或聚集，或可用于产生具有程度较高或其他方面较为合意的糖基化模式的多肽。
本文中所揭示的本发明的培养基调配物可在必要时或需要时任选补充激素和/或其它生长因子、特定离子(诸如钠离子、氯离子、钙离子、镁离子和磷酸根离子)、缓冲剂、维生素、核苷或核苷酸、微量元素(通常以极低最终浓度存在的无机化合物)、氨基酸、脂质、蛋白质水解产物或者葡萄糖或其它能量源。在本发明的某些实施例中，可有益地向培养基补充化学诱导剂，诸如六亚甲基-双(乙酰胺)(“HMBA”)和/或丁酸钠(“NaB”)。这些任选使用的补充物可在培养开始时添加，或可在稍后时间添加以便补足耗尽的养分或出于另一原因。所属领域的普通技术人员将知道本发明的培养基调配物中可包括的任何所需或必要补充物，并且能够根据其实验和/或其它需求选择添加何种特定补充物。
多肽
可根据本发明产生可在宿主细胞中表达的任何多肽。多肽可由宿主细胞的内源基因表达，或由引入宿主细胞中的异源基因表达。所述多肽可为自然界中存在的多肽，或者可具有工程改造过或人工选择的序列。根据本发明产生的多肽可由自然界中独立存在的多肽片段组装而来。另外或其它，工程改造过的多肽可包括一个或多个非天然存在的片段。
通常根据值得关注或有用的生物或化学活性来选择可合意地根据本发明表达的多肽。举例来说，可使用本发明来表达任何医药学上或工业上相关的酶、凝血因子、受体、抗体、激素、调控因子、抗原、结合剂等。以下可根据本发明产生的多肽的列表实质上仅具有例示性，并且不打算作为限制性列举。所属领域的普通技术人员应了解，可根据本发明表达任何多肽，并且能够根据其特殊需要选择欲产生的特定多肽。
抗体
抗体为具有特异性结合特定抗原的能力的蛋白质。鉴于大量抗体当前正作为医药剂或其它工业药剂使用或研究，故根据本发明生产抗体将特别值得关注。举例来说，本发明可用于在细胞培养物中产生抗体，其中所产生抗体的错误折叠和/或聚集减少。
另外或其它，本发明可用于在细胞培养物中产生抗体，其中所产生的抗体具有程度较高或其他方面较为合意的糖基化模式。具有不同糖基化模式的抗体不太可能会在其所投与的个体中启始免疫反应，从而产生较为有效的治疗方案。另外或其它，在恒定区具有不同糖基化模式的抗体可展现改良的药物动力学或药效学效应功能。另外或其它，具有不同糖基化模式的抗体可例如因对细胞培养物中的蛋白酶或其它组分具有较高抗性，而在产生所述抗体的细胞培养条件下更加稳定，以致产生最终滴度较高的抗体。
可根据本发明使用可在宿主细胞中表达的任何抗体。在一些实施例中，欲表达的抗体为单克隆抗体。在某些实施例中，单克隆抗体为嵌合抗体。如所属领域中已知，嵌合抗体含有来源于一种以上生物体的氨基酸片段。嵌合抗体分子可例如包括来自小鼠、大鼠或其它物种的抗体的抗原结合结构域，以及人类恒定区。已描述多种制造嵌合抗体的方法。例如参看：莫里森(Morrison)等人，美国国家科学院院刊(Proc.Natl.Acad.Sci.U.S.A.)81：6851，1985；塔可达(Takeda)等人，自然(Nature)314：452，1985；卡伯利(Cabilly)等人，美国专利第4,816,567号；伯斯(Boss)等人，美国专利第4,816,397号；谷口(Tanaguchi)等人，欧洲专利公开案EP171496；欧洲专利公开案0173494、英国专利GB 2177096B，所述文献各以全文引用的方式并入本文中。
在某些实施例中，单克隆抗体为人类化抗体。人类化抗体为一种嵌合抗体，其中大部分氨基酸残基是来源于人类抗体，由此使当递送到人类个体中时发生的任何潜在免疫反应减到最少。在人类化抗体中，高变区中的氨基酸残基经来自非人类物种的残基置换，从而赋予所需抗原特异性或亲和力。在某些实施例中，人类化抗体具有与人类抗体至少80％、85％、90％、91％、92％、93％、94％、95％、96％、97％、98％、99％一致或更高的氨基酸序列。在某些实施例中，通过引入保守取代、一致序列取代、生殖系取代和/或回复突变来优化人类化抗体。所述改变的免疫球蛋白分子可通过所属领域中已知的数种技术中的任一种制成(例如，滕(Teng)等人，美国国家科学院院刊(Proc.Natl.Acad.Sci.U.S.A.)，80：7308-7312，1983；柯兹伯(Kozbor)等人，今日免疫学(Immunology Today)，4：7279，1983；奥尔逊(Olsson)等人，酶学方法(Meth.Enzymol)，92：3-16，1982)，并且可根据PCT公开案WO92/06193或EP 0239400的教示制造，所述文献各以全文引用的方式并入本文中。
在某些实施例中，根据本发明的教示产生的抗体含有展现改良的糖基化模式的免疫球蛋白恒定区或Fc区。举例来说，根据本文中的教示产生的抗体可较为紧密或以较高特异性结合效应分子(诸如补体和/或Fc受体)，所述效应分子可控制抗体的数种免疫功能，诸如效应细胞活性、溶解、补体介导的活性、抗体清除和抗体半衰期。与抗体(例如，IgG抗体)Fc区结合的典型Fc受体包括(但不限于)FcγRI、FcγRII和FcγRIII及FcRn亚类的受体，包括这些受体的等位基因变异体和其它剪接形式。Fc受体评述于拉文奇(Ravetch)和肯尼特(Kinet)，免疫学年鉴(Annu.Rev.Immunol)9：457-92，1991；卡佩尔(Capel)等人，免疫方法(Immunomethods)4：25-34，1994；和德哈斯(de Haas)等人，实验室和临床医学杂志(J.Lab.Clin.Med).126：330-41，1995中，所述文献各以全文引用的方式并入本文中。
作为一非限制性实例，可根据本教示产生的抗体为抗Aβ抗体。抗Aβ抗体为治疗阿兹海默氏病(Alzheimer’s disease，“AD”)的特别有前景的潜在治疗途径。AD是一种导致老年性痴呆的进行性疾病(一般参看：塞尔科(Selkoe)，TINS 16：403，1993；哈迪(Hardy)等人，WO 92/13069；塞尔科，神经病理学与实验神经病学杂志(J.Neuropathol.Exp.Neurol.)53：438，1994；杜弗(Duff)等人，自然(Nature)373：476，1995；盖姆斯(Games)等人，自然(Nature)373：523，1995，所述文献各以引用的方式并入本文中)。概括而言，所述疾病属于两类：迟发型，其在老年期(65+岁)发生；和早发型，其完全在老年期之前(即，介于35与60岁之间)发生。在两种类型的疾病中，病理学是相同的，但在年龄较小时开始的情况下，异常性倾向于更严重和普遍。所述疾病以脑中至少两种类型的病变(神经纤维缠结和老年斑)为特征。神经纤维缠结为由关于彼此缠绕的成对的两条纤丝组成的微管相关τ蛋白的细胞内沉积物。老年斑(即，淀粉样斑块)为宽达150μm的杂乱神经纤维网区域，且在所述区域的中心，通过脑组织切片的显微分析可见细胞外淀粉样沉积物。脑内淀粉样斑块的积累还与唐氏综合症(Down′ssyndrome)和其它认知病症相关。
所述斑块的主要成分为称为Aβ或β淀粉样肽的肽。Aβ肽为称为淀粉样前体蛋白(APP)的较大跨膜糖蛋白的具有39-43个氨基酸的4kDa内部片段。由于APP经不同分泌酶蛋白水解加工，故Aβ主要以40个氨基酸长的短形式以及42-43个氨基酸长的长形式存在。APP的疏水性跨膜结构域部分见于Aβ的羧基端，并且可使Aβ(尤其在长形式的情况下)能够聚集成斑块。脑中淀粉样斑块的积累最终会导致神经元细胞死亡。与此种类型的神经退化相关的身体症状即表征阿兹海默氏病。
APP蛋白内的数种突变与AD的存在相关(例如参看，高特(Goate)等人，自然(Nature)349：704，1991(缬氨酸717突变为异亮氨酸)；查提尔哈兰(Chartier Harlan)等人，自然(Nature)353：844，1991(缬氨酸717突变为甘氨酸)；穆拉尔(Murrell)等人，科学(Science)254：97，1991(缬氨酸717突变为苯丙氨酸)；穆兰(Mullan)等人，自然-遗传学(Nature Genet.)1：345，1992(赖氨酸595-甲硫氨酸596突变为天冬酰胺595-亮氨酸596的双重突变)，所述文献各以全文引用的方式并入本文中)。普遍认为，所述突变会通过使APP加工成Aβ增加或改变，尤其使APP加工成长形式的Aβ(即，Aβ1-42和Aβ43)的量增加，来引起AD。诸如早老素(presenilin)基因PS1和PS2等其它基因的突变被认为会间接影响APP的加工，产生增加量的长形式的Aβ(参看哈迪(Hardy)，TINS20：154，1997，以全文引用的方式并入本文中)。
已成功地使用小鼠模型来确定淀粉样斑块在AD中的重要性(盖姆斯(Games)等人，同上文；琼斯-伍德(Johnson-Wood)等人，美国国家科学院院刊(Proc.Natl.Acad.Sci.USA)94：1550，1997，以引用的方式并入本文中)。具体说来，当将长形式的Aβ注射入PDAPP转基因小鼠(其表达突变型人类APP，并在青年期发生阿兹海默氏病)中时，其展现阿兹海默氏病进展的减慢以及针对Aβ肽的抗体滴度的增加(斯奇克(Schenk)等人，自然(Nature)400，173，1999，以全文引用的方式并入本文中)。上文所论述之观察结果表明，Aβ、尤其Aβ的长形式为阿兹海默氏病的致病要素。
Aβ肽可存在于溶液中且可在CNS(例如CSF)和血浆中检测到。在某些情况下，可溶性Aβ转化成AD患者的神经炎斑块和脑血管中所见的有毒、β折叠形式的纤丝。已研究涉及用针对Aβ的单克隆抗体进行免疫的治疗。已在AD小鼠模型中测试主动和被动免疫。主动免疫引起脑中斑块负荷的某种程度的降低，但只有经鼻投与才能实现。也已研究PDAPP转基因小鼠的被动免疫(伯德(Bard)等人，自然-医学(Nat.Med.)6：916-19，2000，以全文引用的方式并入本文中)。已发现，识别Aβ的氨基末端和中心结构域的抗体刺激Aβ沉积物的胞噬作用，而针对邻近羧基末端结构域的结构域的抗体不会。
被动或主动免疫后清除Aβ的机制正在不断研究中。已提出有效清除的两种机制，即中枢降解和周围降解。中枢降解机制取决于抗体能够越过血脑屏障、结合斑块并诱导先前存在的斑块清除。已证实，通过Fc受体介导的胞噬作用能促进清除(伯德(Bard)等人，同上文)。清除Aβ的周围降解机制取决于在投与抗体后脑、CSF与血浆之间Aβ动态平衡的破坏，导致Aβ从一个区室转运到另一区室。中枢来源的Aβ被转运到CSF和血浆中，在此处其被降解。近期的研究推断，可溶性和未结合Aβ牵涉于与AD相关的记忆障碍中，即使在脑中淀粉样沉积未减少的情况下。需要其它研究来确定这些Aβ清除路径的作用和/或相互影响(多德尔(Dodel)等人，柳叶刀(The Lancet)第2卷：215，2003，以全文引用的方式并入本文中)。
由于抗Aβ抗体能够结合并清除Aβ或包含淀粉样斑块的其它组分，故其为治疗AD的潜在有前景的途径。根据本发明的教示产生的抗Aβ抗体可例如通过更有效地结合和清除淀粉样斑块的组分、清除淀粉样斑块而具有极少或不太严重的副作用、或防止淀粉样斑块形成或堆积，更好地治疗AD或其它相关疾病。在某些实施例中，根据本教示产生的抗Aβ抗体为单克隆抗体。
在某些实施例中，根据本教示产生的抗Aβ抗体特异性结合聚集形式的Aβ，而不会结合可溶性形式。在某些实施例中，根据本教示产生的抗Aβ抗体在使其不与聚集形式Aβ结合的条件下与抗Aβ的可溶形式特异性结合。在某些实施例中，根据本教示产生的抗Aβ抗体与聚集形式和可溶形式两者结合。在某些实施例中，根据本教示产生的抗Aβ抗体结合斑块中的Aβ。在某些实施例中，根据本教示产生的抗Aβ抗体越过血脑屏障。在某些实施例中，根据本教示产生的抗Aβ抗体使个体的淀粉样蛋白负荷减少。在某些实施例中，根据本教示产生的抗Aβ抗体使个体的神经炎性萎缩减少。在某些实施例中，抗Aβ抗体可保持突触结构(例如，突触素(synaptophysin))。
根据一些实施例，根据本教示产生的抗Aβ抗体与Aβ的残基13-28(其中将天然Aβ的N末端残基指定为1)内的表位结合。在一些实施例中，根据本教示产生的抗Aβ抗体与Aβ的残基19-22内的表位结合。在一些实施例中，使用多种对不同抗Aβ表位具有结合特异性的单克隆抗体。举例来说，在一些实施例中，将对在Aβ的残基19-22内的表位具特异性的抗体与对Aβ的残基19-22以外的表位具特异性的抗体共同投与。所述抗体可依序投与或同时投与。还可使用(例如，投与或共同投与)针对除Aβ以外的淀粉样组分的抗体。
在某些实施例中，与以其它方法产生的抗Aβ抗体相比，根据本教示产生的抗Aβ抗体较为紧密或以较高特异性结合Aβ表位。可通过已知技术，例如通过形成噬菌体呈现文库(其中不同成员呈现不同的Aβ子序列)，来确定抗体的表位特异性。接着可选择噬菌体呈现文库中与所测试的抗体特异性结合的成员。分离出一组序列。通常，所述序列组中不同成员含有共同的核心序列，和不同长度的侧翼序列。展现与抗体特异性结合的最短核心序列通常确定为抗体所结合的表位。其它或另外，可在利用已确定表位特异性的抗体进行的竞争检定中，测试抗体的表位特异性。举例来说，认为与15C11抗体竞争结合Aβ的抗体与15C11结合相同或相似的表位(即，在残基Aβ19-22内)。在某些实施例中，针对表位特异性对抗体进行筛选能有效预测治疗功效。举例来说，根据本发明的方法，确定与Aβ的残基13-28内的表位(例如，Aβ19-22)结合的抗体可能会有效预防和治疗阿兹海默氏病。
相对于结合其它区域的单克隆抗体或针对完整Aβ的多克隆血清，特异性结合Aβ的优选区段而不结合Aβ其它区域的抗体具有多种益处。尤其对于等质量剂量来说，特异性结合优选区段的抗体的剂量含有较高摩尔剂量的有效清除淀粉样斑块的抗体。另外，特异性结合优选区段的抗体可诱导针对淀粉样沉积物的清除反应，而不会诱导针对完整APP多肽的清除反应，由此减少潜在副作用。
在某些实施例中，上述单克隆抗体、嵌合抗体或人类化抗体都含有并不天然存在于自然界任何物种的任何抗体中的氨基酸残基。这些外来残基可例如用于对单克隆抗体、嵌合抗体或人类化抗体赋予新颖或修饰过的特异性、亲和力或效应功能。
凝血因子
已证实，凝血因子可有效作为医药剂和/或工业药剂。乙型血友病是患者的血液无法凝固的病症。因此，导致出血的任何微小创口都是潜在危及生命的事件。鉴于重组凝血因子在治疗诸如血友病等疾病方面的重要性，故根据本发明产生凝血因子将特别值得关注。举例来说，本发明可用于在细胞培养物中产生凝血因子，其中所产生凝血因子的错误折叠和/或聚集减少。另外或其它，本发明可用于在细胞培养物中产生凝血因子，其中所产生的凝血因子具有程度较高或其他方面较为合意的糖基化模式。
举例来说，凝血因子IX(因子IX或“FIX”)是一种单链糖蛋白，缺乏这种糖蛋白会引起乙型血友病。FIX是以单链酶原的形式合成，其可通过活化肽的释放而活化成双链丝氨酸蛋白酶(因子IXa)。因子IXa的催化结构域位于重链中(参看常(Chang)等人，临床研究杂志(J.Clin.Invest.)，100：4，1997，以全文引用的方式并入本文中)。FIX具有多个糖基化位点，包括N连接型和O连接型碳水化合物。丝氨酸61处的一种特殊O连接型结构(Sia-α2，3-Gal-β1，4-GlcNAc-β1，3-Fuc-α1-O-Ser)曾被认为是FIX独有的，但迄今已在包括哺乳动物和果蝇(Drosophila)中的缺刻蛋白(Notch protein)在内的少数其它分子上发现(马隆尼(Maloney)等人，生物化学杂志(Journal of Biol.Chem.)，275(13)，2000)。在细胞培养物中由中国仓鼠卵巢(“CHO”)细胞产生的FIX的丝氨酸61寡糖链中存在一些变化。这些不同糖型和其它潜在糖型当投与人类或动物时，可具有不同的诱导凝血的能力；和/或可在血液中具有不同稳定性，从而使凝血不太有效。
甲型血友病在临床上不易与乙型血友病区分，其是由人类凝血因子VIII(另一种以单链形式合成且随后加工成双链活性形式的糖蛋白)缺乏引起。本发明也可用于控制或改变凝血因子VIII的糖基化模式，以便调节其凝血活性。可根据本发明产生的其它凝血因子包括组织因子和温韦伯氏因子(von Willebrands factor)。
酶
已证实能有效作为医药剂和/或工业药剂并且能够合意地根据本发明的教示产生的另一类多肽包括酶。鉴于重组酶在治疗疾病以及其它工业和医药用途方面的重要性，故根据本发明产生酶将特别值得关注。举例来说，本发明可用于在细胞培养物中产生酶，其中所产生的酶的错误折叠和/或聚集减少。
酶可为糖基化模式影响酶促活性的糖蛋白。因此，本发明也可用于在细胞培养物中产生酶，其中所产生的酶具有程度较高或其他方面较为合意的糖基化模式。
作为一非限制性实例，葡糖脑苷脂酶(glucocerebrosidase，GCR)缺乏会引起称为戈谢病(Gaucher′s disease)的病状，它是由葡糖脑苷脂酶在某些细胞的溶酶体中积累引起。患有戈谢病的个体展现多种症状，包括脾肿大、肝肿大、骨骼病症、血小板减少和贫血。弗雷德曼(Friedman)和哈耶斯(Hayes)展示，在一级氨基酸序列中含有单一取代的重组GCR(rGCR)展现相比天然存在的GCR有所改变的糖基化模式，尤其岩藻糖和N-乙酰基葡糖胺残基增加(参看美国专利第5,549,892号，以全文引用的方式并入本文中)。
弗雷德曼和哈耶斯还证实，与天然存在的rGCR相比，此rGCR展现改良的药物动力学特性。举例来说，靶向肝脏库普弗细胞(Kupffer cell)的rGCR为天然存在的GCR的约2倍。尽管两种蛋白质的一级氨基酸序列存在单个残基的差异，但弗雷德曼和哈耶斯仍假定rGCR糖基化模式的改变也可能会影响对库普弗细胞的所述靶向。所属领域的普通技术人员将知道因糖基化模式改变而展现改变的酶促、药物动力学和/或药效学特性的酶的其它已知实例。
生长因子和其它信号传输分子
已证实能有效作为医药剂和/或工业药剂并且能够合意地根据本发明的教示产生的另一类多肽包括生长因子和其它信号传输分子。鉴于生长因子和其它信号传输分子的生物重要性以及其作为潜在治疗剂的重要作用，根据本发明产生这些分子将特别值得关注。举例来说，本发明可用于在细胞培养物中产生生长因子或其它信号传输分子，其中所产生的生长因子或其它信号传输分子的错误折叠和/或聚集减少。
生长因子通常为由细胞分泌并且结合和活化其它细胞上的受体，从而引发受体细胞的代谢或发育改变的糖蛋白。因此，本发明也可用于在细胞培养物中产生生长因子或其它信号传输分子，其中所产生的生长因子或其它信号传输分子具有程度较高或其他方面较为合意的糖基化模式。
哺乳动物生长因子和其它信号传输分子的非限制性实例包括细胞因子；表皮生长因子(EGF)；血小板衍生生长因子(PDGF)；成纤维细胞生长因子(FGF)，诸如aFGF和bFGF；转化生长因子(TGF)，诸如TGF-α和TGF-β，包括TGF-β1、TGF-β2、TGF-β3、TGF-β4或TGF-β5；类胰岛素生长因子I和II(IGF-I和IGF-II)；des(1-3)-IGF-I(脑IGF-I)、类胰岛素生长因子结合蛋白；CD蛋白，诸如CD-3、CD-4、CD-8和CD-19；促红细胞生成素；骨生成诱导因子(osteoinductive factor)；免疫毒素；骨形成蛋白(bonemorphogenetic protein，BMP)；干扰素，诸如干扰素α、β和γ；集落刺激因子(CSF)，例如M-CSF、GM-CSF和G-CSF；白细胞介素(TL)，例如IL-1至IL-10；肿瘤坏死因子(TNF)α和β；胰岛素A链；胰岛素B链；胰岛素原；卵泡刺激激素；降钙素(calcitonin)；促黄体生成激素；胰高血糖素；凝血因子，诸如因子VIIIC、因子IX、组织因子和温韦伯氏因子；抗凝血因子，诸如蛋白质C；心房利钠因子；肺表面活性物质；纤溶酶原活化剂，诸如尿激酶或者人尿或组织型纤溶酶原活化剂(t-PA)；蛙皮素(bombesin)；凝血酶，造血生长因子；脑啡肽酶；RANTES(通常由T细胞表达和分泌的活化调控因子)；人巨噬细胞炎性蛋白(MIP-1-α)；缪勒管抑制物质(mullerian-inhibiting substance)；松驰素(relaxin)A链；松驰素B链；松驰素原；小鼠促性腺激素相关肽；神经营养因子，诸如骨源性神经营养因子(BDNF)、神经营养素-3、神经营养素-4、神经营养素-5或神经营养素-6(NT-3、NT-4、NT-5或NT-6)，或神经生长因子，诸如NGF-β。所属领域的普通技术人员将知道可根据本发明的方法和组合物表达的其它生长因子或信号传输分子。
已证实，生长因子或其它信号传输分子糖基化模式的特定改变会明显影响其治疗特性。举例来说，治疗慢性贫血患者的常用方法为对其频繁注射重组人促红细胞生成素(rHuEPO)以便促进其产生红血球。已开发出持续时间比正常rHuEPO长的rHuEPO类似物阿法达贝泊汀(darbepoetin alfa)
Figure G2008800069705D00241
阿法达贝泊汀与rHuEPO的主要差别在于存在两个额外的含唾液酸N连接型寡糖链。已使用活体外糖基化工程来实现阿法达贝泊汀的制造(参看艾罗特(Elliott)等人，自然-生物技术(NatureBiotechnology)21(4)：414-21，2003，以全文引用的方式并入本文中)。艾罗特等人使用活体外突变诱发将额外糖基化位点引入rHuEPO多肽主链中，产生阿法达贝泊汀类似物的表达。所述额外寡糖链远离EPO受体结合位点，显然不会干扰受体结合。然而，阿法达贝泊汀的半衰期为rHuEPO的多达3倍，从而成为有效得多的治疗剂。
此实例表明，生长因子或其它信号传输分子糖基化模式的改变可明显影响治疗性糖蛋白的稳定性和/或活性。因此，根据本发明的方法表达所关注生长因子或其它信号传输分子可产生具有改良的糖基化模式和改良的治疗特性的所表达生长因子或信号传输分子。在某些实施例中，根据本发明的方法和组合物表达的糖蛋白将具有增加的或更合意的唾液酸化模式。在一些实施例中，根据本发明的方法和组合物表达的糖蛋白的唾液酸化模式将更准确地反映天然或内源糖蛋白的唾液酸化模式。在一些实施例中，根据本发明的方法和组合物表达的糖蛋白的唾液酸化模式将不同于天然或内源糖蛋白的唾液酸化模式，以致所述糖蛋白具有更为合意的特性或活性。
受体
已证实能有效作为医药剂和/或工业药剂并且能够合意地根据本发明的教示产生的另一类多肽包括受体。鉴于受体的生物重要性以及其作为潜在治疗剂的重要作用，故根据本发明产生这些分子将特别值得关注。举例来说，本发明可用于在细胞培养物中产生受体，其中所产生受体的错误折叠和/或聚集减少。
受体通常为通过识别细胞外信号传输配体来起作用的跨膜糖蛋白。因此，本发明也可用于在细胞培养物中产生受体，其中所产生的受体具有程度较高或其他方面较为合意的糖基化模式。受体通常除具有配体识别结构域外，还具有蛋白激酶结构域。在受体结合配体后，此蛋白激酶结构域通过使目标细胞内的分子磷酸化来启始信号传输路径，引起细胞内发育和代谢的改变。在某些实施例中，根据本文所揭示的方法和系统产生跨膜受体的细胞外结构域。在某些实施例中，根据本文所揭示的方法和系统产生跨膜受体的细胞内结构域。
在某些实施例中，根据本发明的系统和方法表达呈肿瘤坏死因子α和β受体(TNFR-1，1991年2月20日公开的EP 417,563；和TNFR-2，1991年3月20日公开的EP 417,014，其各以全文引用的方式并入本文中)形式的肿瘤坏死因子抑制剂(相关评论，参看奈史密斯(Naismith)和斯普朗(Sprang)，炎症杂志(J Inflamm.)47(1-2)：1-7，1995-96，以全文引用的方式并入本文中)。根据一些实施例，肿瘤坏死因子抑制剂包含可溶性TNF受体。在某些实施例中，肿瘤坏死因子抑制剂包含可溶性TNFR-Ig。在某些实施例中，本发明的TNF抑制剂为可溶形式的TNFRI和TNFRII。在某些实施例中，本发明的TNF抑制剂为可溶性TNF结合蛋白。在某些实施例中，本发明的TNF抑制剂为TNFR-Ig融合蛋白，例如TNFR-Fc或依他西脱(etanercept)。如本文所使用，“依他西脱”是指TNFR-Fc，它为两分子的p75 TNF-α受体的细胞外部分的二聚体，所述分子各由人类IgG1的具有235个氨基酸的Fc部分组成。
在一些实施例中，欲根据本发明产生的受体为受体酪氨酸激酶(RTK)。RTK家族包括对于多种细胞类型的多种功能至关重要的受体(例如参看，雅顿(Yarden)和阿尔德里奇(Ullrich)，生物化学年鉴(Ann.Rev.Biochem.)57：433-478，1988；阿尔德里奇(Ullrich)和施莱辛格(Schlessinger)，细胞(Cell)61：243-254，1990，其各以引用的方式并入本文中)。RTK的非限制性实例包括肿瘤坏死因子α和β受体、成纤维细胞生长因子(FGF)受体家族成员、表皮生长因子受体(EGF)家族成员、血小板衍生生长因子(PDGF)受体、具有免疫球蛋白和EGF同源结构域-1的酪氨酸激酶(TIE-1)和TIE-2受体(萨托(Sato)等人，自然(Nature)376(6535)：70-74，1995，以全文引用的方式并入本文中)，以及c-Met受体，已提出其中有一些能直接或间接促进血管生成(穆斯托恩(Mustonen)和奥利特罗(Alitalo)，细胞生物学杂志(J.Cell Biol.)129：895-898，1995)。RTK的其它非限制性实例包括胎肝激酶1(FLK-1)(有时称为含激酶插入结构域受体(KDR)(特曼(Terman)等人，致癌基因(Oncogene)6：1677-83，1991)或血管内皮细胞生长因子受体2(VEGFR-2))；类fms酪氨酸激酶-1(Flt-1)(德维斯(DeVries)等人，科学(Science)255；989-991，1992；涉谷(Shibuya)等人，致癌基因(Oncogene)5：519-524，1990)，有时称为血管内皮细胞生长因子受体1(VEGFR-1)；神经菌毛素-1(neuropilin-1)；内皮素(endoglin)内涎蛋白(endosialin)；和Ax1。所属领域的普通技术人员将知道可根据本发明表达的其它受体。
在某些实施例中，欲根据本发明产生的受体为G蛋白偶合受体(GPCR)。GPCR为药物作用和研发的主要目标。事实上，超过半数的当前所知的药物都由受体而来(德乌斯(Drews)，自然-生物技术(Nature Biotechnology)，14：1516，1996)，并且GPCR为治疗干预的最重要目标，其中30％的临床上开立的药物对GPCR具有拮抗或促效作用(米利甘G.(Milligan，G.)和瑞斯S.(Rees，S.)，TIPS，20：118-124，1999)。由于这些受体具有已确立、经证实的作为治疗剂的历史，故根据本发明产生GPCR也特别值得关注。
GPCR为具有7个跨膜结构域的蛋白质。在配体与GPCR结合后，在细胞内转导信号，这导致细胞的生物或生理特性改变。GPCR连同G蛋白和效应子(受G蛋白调节的细胞内酶和通道)都为将细胞内第二信使的状态与细胞外输入相连的模块化信号传输系统的组分。这些基因和基因产物都为疾病的潜在致病因素。
GPCR蛋白超家族现含有超过250类旁系同源物，即与直系同源物(来自不同物种的相同受体)相对，代表由基因重复(或其它过程)产生的变异体的受体。所述超家族可细分为五个家族：家族I，以视紫红质和β2胆碱受体为代表的受体且当前存在超过200种独特成员；家族II，近来表征的甲状旁腺激素/降钙素/分泌素受体家族；家族III，哺乳动物中的代谢型谷氨酸受体家族；家族IV，cAMP受体家族，它对于趋化作用和盘基网柄菌(D.discoideum)的发育重要；和家族V，真菌交配信息素受体，诸如STE2。
GPCR包括生物胺、炎症的脂质介质、肽激素和感觉信号介质的受体。当受体结合其细胞外配体时，GPCR被活化。由配体-受体相互作用引起的GPCR的构象改变会影响G蛋白与GPCR细胞内结构域的结合亲和力。这使GTP能以增强的亲和力结合G蛋白。
GTP使G蛋白活化，引起G蛋白α亚基与腺苷酸环化酶或其它第二信使分子产生体的相互作用。此相互作用可调控腺苷酸环化酶的活性，且因此调控第二信使分子cAMP的产生。cAMP调控其它细胞内蛋白质的磷酸化和活化。或者，诸如cGMP或类二十烷酸(eicosinoid)等其它第二信使分子的细胞含量可由GPCR活性上调或下调。以GTP酶水解GTP使得G蛋白α亚基失活，且α、β和γ亚基再缔合。随后异三聚体G蛋白与腺苷酸环化酶或其它第二信使分子产生体解离。也可通过使细胞内和细胞外结构域或环磷酸化来调控GPCR的活性。
谷氨酸受体形成一组在神经传递方面重要的GPCR。谷氨酸为CNS中的主要神经递质，且认为它对于神经元可塑性、认知、记忆、学习和某些神经病症(诸如癫痫、中风和神经退化)具有重要作用(S.沃特森(Watson，S.)和S.艾金斯托(S.Arkinstall)，G蛋白连接受体概况(The G-Protein Linked Receptor Facts Book)，学术出版社(AcademicPress)，加州圣地亚哥(San Diego CA)，第130-132页，1994)。血管活性肠多肽(VIP)家族为作用也由GPCR介导的一组相关多肽。此家族的关键成员为VIP本身、分泌素和生长激素释放因子(GRF)。VIP具有广泛的生理作用特征，包括平滑肌松弛、各种组织中分泌的刺激或抑制、各种免疫细胞活性的调节和CNS中的各种兴奋和抑制活性。分泌素可刺激胰腺和肠中酶和离子的分泌，并且也少量存在于脑中。
一般说来，本发明的专业人员将选择其所关注的蛋白质或多肽，并了解其确切氨基酸序列。欲根据本发明表达的任何指定多肽将具有其自身特有的特征，并且可影响所培养的细胞的细胞密度或活力，且可以比在相同培养条件下培养的另一多肽或蛋白质低的水平表达。所属领域的普通技术人员将能够适当改良本发明的培养基和本文所述的方法，以便优化细胞生长、滴度、糖基化、折叠或所表达的指定多肽或蛋白质的任何其它特性。
宿主细胞中表达多肽的基因的引入
在某些实施例中，引入细胞中的核酸分子编码需要根据本发明表达的多肽。在某些实施例中，核酸分子可编码诱导细胞表达所需多肽的基因产物。举例来说，引入的遗传物质可编码活化内源或异源多肽的转录的转录因子。其它或另外，引入的核酸分子可增加细胞所表达的多肽的翻译或稳定性。
所属领域中已知适于将足以实现所关注多肽的表达的核酸引入哺乳动物宿主细胞中的方法。例如参看格斯林(Gething)等人，自然(Nature)，293：620-625，1981；曼泰(Mantei)等人，自然(Nature)，281：40-46，1979；李文森(Levinson)等人，EP 117,060；和EP 117,058，其各以引用的方式并入本文中。对于哺乳动物细胞来说，将遗传物质引入细胞中的常用方法包括磷酸钙沉淀法(格拉海姆(Graham)和范德埃博(van der Erb)，病毒学(Virology)，52：456-457，1978)或脂质体转染试剂lipofectamineTM(吉伯克公司(Gibco BRL))方法(霍雷-尼尔森(Hawley-Nelson)，焦点(Focus)15：73，1993)。哺乳动物细胞宿主系统转化的概况描述于埃克斯尔(Axel)的1983年8月16日颁布的美国专利第4,399,216号中。有关将遗传物质引入哺乳动物细胞中的各种技术，参看科诺恩(Keown)等人，酶学方法(Methods in Enzymology)，185：527-537，1990，和曼索尔(Mansour)等人，自然(Nature)，336：348-352，1988。
在某些实施例中，欲引入的核酸呈裸核酸分子的形式。在这些实施例的一些方面中，引入细胞中的核酸分子仅由编码多肽和必要遗传控制元件的核酸组成。在这些实施例的一些方面中，编码多肽的核酸(包括必要的调控元件)是包含在质粒载体内。适用于在哺乳动物细胞中表达多肽的载体的非限制性代表性实例包括pCDNA1；pCD，参看冈山(Okayama)等人，分子细胞生物学(Mol.Cell Biol.)5：1136-1142，1985；pMClneo Poly-A，参看托马斯(Thomas)等人，细胞(Cell)51：503-512，1987；杆状病毒载体，诸如pAC373或pAC 610；CDM8(斯德(Seed，B.)，自然(Nature)329：840，1987)和pMT2PC(考夫曼(Kaufman)等人，欧洲分子生物学学会杂志(EMBO J.)6：187-195，1987)。在某些实施例中，欲引入细胞中的核酸分子包含在病毒载体内。举例来说，可将编码多肽的核酸分子插入病毒基因组(或部分病毒基因组)中。插入病毒基因组中的核酸还可包括指导多肽表达的调控元件(即，与插入病毒基因组中的基因连接)，或所述调控元件可由病毒基因组本身提供。
可通过形成含DNA和磷酸钙的沉淀，将裸DNA引入细胞中。另外或其它，还可通过形成DNA与DEAE-葡聚糖的混合物，并将所述混合物与细胞一起培育；或通过在适当缓冲液中一起培育细胞和DNA，并使所述细胞经受高电压电脉冲(即，通过电穿孔)，将裸DNA引入细胞中。在一些实施例中，通过将DNA与含阳离子脂质的脂质体悬浮液混合，将裸DNA引入细胞中。随后，将DNA/脂质体复合物与细胞一起培育。还可例如通过显微注射将裸DNA直接注射到细胞中。
另外或其它，可通过使DNA与偶合细胞表面受体配体的阳离子(诸如多聚赖氨酸)复合，将裸DNA引入细胞中(例如参看吴G.(Wu，G.)和吴C.H.(Wu，C.H.)，生物化学杂志(J.Biol.Chem.)263：14621，1988；维尔森(Wilson)等人，生物化学杂志(J.Biol.Chem.)267：963-967，1992；和美国专利第5,166,320号)。DNA-配体复合物与受体的结合将通过受体介导的内吞作用促进DNA的摄取。
使用含有特定核酸序列(例如，编码多肽的cDNA)的病毒载体为将核酸序列引入细胞中的常用方法。用病毒载体感染细胞的益处在于：使大部分细胞接收核酸，这可避免选择已接收核酸的细胞的需要。另外，病毒载体内编码的分子(例如，由病毒载体中所含的cDNA编码的分子)通常会在已吸收病毒载体核酸的细胞内有效表达。
用于基因疗法目的的基因转移中使用的缺陷型逆转录病毒已得到充分表征(有关评论，参看米勒A.D.(Miller，A.D.)，血液学(Blood)76：271，1990)。可构建重组逆转录病毒，所述逆转录病毒的基因组中插入有编码所关注多肽的核酸。另外，可去除部分逆转录病毒基因组以使所述逆转录病毒成为复制缺陷型。接着将复制缺陷型逆转录病毒包装入病毒粒子中，可借助标准技术，使用病毒粒子通过使用辅助病毒来感染目标细胞。
可对腺病毒基因组进行处理，以使其能编码并表达所关注的多肽，但经灭活以使其无法在正常溶解病毒生命周期中复制。例如参看伯克纳(Berkner)等人，生物技术(BioTechniques)6：616，1988；罗森菲尔德(Rosenfeld)等人，科学(Science)252：431-434，1991；和罗森菲尔德(Rosenfeld)等人，细胞(Cell)68：143-155，1992。所属领域中已知来源于腺病毒株Ad型5 dl324或其它腺病毒株(例如，Ad2、Ad3、Ad7等)的适当腺病毒载体。重组腺病毒的优势在于：其不需要分裂细胞作为有效的基因递送载体，并且可用于感染多种细胞类型，包括呼吸道上皮细胞(罗森菲尔德(Rosenfeld)等人，1992，同上文所引用)、内皮细胞(李马查德(Lemarchand)等人，美国国家科学院院刊(Proc.Natl.Acad.Sci.USA)89：6482-6486，1992)、肝细胞(赫兹(Herz)和杰纳德(Gerard)，美国国家科学院院刊(Proc.Natl.Acad.Sci.USA)90：2812-2816，1993)和肌肉细胞(昆汀(Quantin)等人，美国国家科学院院刊(Proc.Natl.Acad.Sci.USA)89：2581-2584，1992)。另外，所引入的腺病毒DNA(和其中所含的外来DNA)不整合到宿主细胞基因组中，而是仍保持游离，由此避免在所引入的DNA整合到宿主基因组中的情况下(例如，逆转录病毒DNA)因插入突变诱发而导致发生潜在问题。此外，腺病毒基因组承载外来DNA的能力比其它基因递送载体大(多达8千碱基)(伯克纳(Berkner)等人，同上文引用；哈杰-哈曼德(Haj-Ahmand)和格拉海姆(Graham)，病毒学杂志(J.Virol.)57：267，1986)。当前使用的大部分复制缺陷型腺病毒载体都缺失全部或部分病毒E1和E3基因，但保留多达80％的腺病毒遗传物质。
腺相关病毒(AAV)是一种天然存在的缺陷型病毒，其需要另一种病毒(诸如腺病毒或疱疹病毒)作为有效复制和生产性生命周期的辅助病毒。(有关评论，参看穆齐卡(Muzyczka)等人，微生物学和免疫学当前热点(Curr.Topics in Micro，and Immunol.)158：97-129，1992)。在极少数病毒中也有一种能将其DNA整合到非分裂细胞中，并展现高频率的稳定整合(例如参看弗洛特(Flotte)等人，美国细胞和分子生物学杂志(Am.J.Respir.Cell.Mol.Biol.)7：349-356，1992；萨姆尔斯基(Samulski)等人，病毒学杂志(J.Virol.)63：3822-3828，1989；和麦克劳琳(McLaughlin)等人，病毒学杂志(J.Virol.)62：1963-1973，1989)。含有少至300个AAV碱基对的载体可被包装并整合。外源DNA的容量限于约4.5kb。可使用AAV载体(诸如塔斯奇(Tratschin)等人(分子细胞生物学(Mol.Cell.Biol.)5：3251-3260，1985)中所述的载体)将DNA引入细胞中。已使用AAV载体将多种核酸引入不同细胞类型中(例如参看，赫蒙特(Hermonat)等人，美国国家科学院院刊(Proc.Natl.Acad.Sci.USA)81：6466-6470，1984；塔斯奇(Tratschin)等人，分子细胞生物学(Mol.Cell.Biol.)4：2072-2081，1985；万蒂斯福德(Wondisford)等人，分子与细胞内分泌学(Mol.Endocrinol.)2：32-39，1988；塔斯奇(Tratschin)等人，病毒学杂志(J.Virol.)51：611-619，1984；和弗洛特(Flotte)等人，生物化学杂志(J.Biol.Chem.)268：3781-3790，1993)。
当用于将核酸分子引入细胞群中的方法使大部分细胞被修饰且使细胞有效表达多肽时，可在不进一步分离或亚克隆经修饰细胞群内的个别细胞的情况下，使用所述经修饰细胞群。也就是说，所述细胞群产生足够的所述多肽，使得无需进一步分离细胞，并且所述细胞群可立即用于接种细胞培养物以供产生所述多肽。在一些实施例中，可能需要从有效产生所述多肽的单一细胞分离和扩增出同源细胞群。
作为向细胞中引入编码所关注多肽的核酸分子的替代方案，引入可编码诱导细胞内源性产生的蛋白质或多肽的表达或增加其表达水平的另一多肽、蛋白质或调控元件的核酸。举例来说，细胞能够表达特定多肽，但在不对细胞进行额外处理的情况下，可能无法表达。类似地，细胞可表达不足量的多肽用于所需目的。因此，可使用刺激所关注多肽表达的试剂来诱导或增加细胞对所述多肽的表达。举例而言，引入的核酸分子可编码活化或上调所关注多肽的转录的转录因子。所述转录因子的表达又引起所关注多肽的表达或更为稳固的表达。类似地，引入的核酸分子可含有一个或多个可从所关注多肽的调控区滴定去除一个或多个转录阻遏子的调控元件。
在某些实施例中，将指导多肽表达的核酸稳定引入宿主细胞中。在某些实施例中，将指导多肽表达的核酸瞬时引入宿主细胞中。所属领域的普通技术人员将能够根据其实验要求选择将核酸稳定还是瞬时引入细胞中。
可任选将编码所关注多肽的基因可操作地连接到一个或多个遗传控制调控元件。在一些实施例中，遗传控制元件指导多肽的组成性表达。在一些实施例中，可使用提供编码所关注多肽的基因的可诱导表达的遗传控制元件。使用可诱导的遗传控制元件(例如，可诱导启动子)将允许调节细胞中多肽的产生。真核细胞中所用的可能适用可诱导遗传控制元件的非限制性实例包括激素调控型元件(例如参看S.马德尔(Mader，S.)和J.H.怀特(White，J.H.)，美国国家科学院院刊(Proc.Natl.Acad.Sci.USA)90：5603-5607，1993)、合成配体调控型元件(例如参看D.M.斯潘塞(Spencer，D.M.)等人，科学(Science)262：1019-1024，1993)和电离辐射调控型元件(例如参看Y.曼诺姆(Manome，Y.)等人，生物技术(Biochemistry)32：10607-10613，1993；R.德塔(Datta，R.)等人，美国国家科学院院刊(Proc.Natl.Acad.Sci.USA)89：10149-10153，1992)。根据本文所述的方法和组合物使用所属领域中已知的其它细胞特异性或其它调控系统。
所属领域的普通技术人员将能够选择并任选适当地修改引入根据本发明的教示使细胞表达所关注多肽的基因的方法。
所表达多肽的分离
在某些实施例中，需要分离和/或纯化根据本发明表达的蛋白质或多肽。在某些实施例中，所表达的多肽或蛋白质是分泌于培养基中，且因此，可如以例如离心或过滤作为纯化过程的第一步骤，来去除细胞和其它固体。
在一些实施例中，所表达的多肽或蛋白质是结合于宿主细胞的表面。在所述实施例中，去除培养基并将溶解表达多肽或蛋白质的宿主细胞作为纯化过程的第一步骤。可通过任何数量的所属领域的普通技术人员已知的方式，包括通过玻璃珠物理破坏和暴露于高pH值条件，来实现哺乳动物宿主细胞的溶解。
可通过标准方法来分离和纯化多肽或蛋白质，所述标准方法包括(但不限于)色谱法(例如，离子交换、亲和、尺寸排阻和羟磷灰石色谱)、凝胶过滤、离心或差异溶解度、乙醇沉淀或任何其它用于纯化蛋白质的可用技术(例如参看斯科普斯(Scopes)，蛋白质纯化原理和实践(Protein Purification Principles and Practice)第2版，施普林格纽约分公司(Springer-Verlag，New York)，1987；S.J.海金司(Higgins，S.J.)和B.D.哈姆斯(Hames，B.D.)(编)，蛋白质表达：实用方法(Protein Expression：A Practical Approach)，牛津大学出版社(Oxford Univ Press)，1999；和M.P.德驰(Deutscher，M.P.)，M.I.西蒙(Simon，M.I.)，J.N.艾伯森(Abelson，J.N.)(编)，蛋白质纯化指南：酶学方法(Guide toProtein Purification：Methods in Enzymology)(酶学方法系列(Methods in EnzymologySeries)，第182卷)，学术出版社(Academic Press)，1997，其各以全文引用的方式并入本文中)。具体来说，对于免疫亲和色谱，可通过使蛋白质与包含针对所述蛋白质产生并附着于固相支撑物上的抗体的亲和柱结合，来分离所述蛋白质。可通过标准重组技术将诸如流感病毒外壳序列、多聚组氨酸或谷胱甘肽硫转移酶等亲和标签与蛋白质连接，从而允许容易地经由通过适当亲和柱来进行纯化。可在任何或所有阶段，添加诸如苯甲磺酰氟(PMSF)、亮肽素(leupeptin)、胃酶抑素(pepstatin)或抑胰肽酶(aprotinin)等蛋白酶抑制剂，以便减少或消除在纯化过程中多肽或蛋白质的降解。当必须溶解细胞以便分离和纯化所表达的多肽或蛋白质时，蛋白酶抑制剂将特别有益。
与在非本发明细胞培养条件下培养的蛋白质或多肽相比，根据本发明的某些方法表达的蛋白质或多肽可具有程度较高和/或经修饰的糖基化模式。因此，在纯化步骤中可利用的本发明的一个实用益处在于：根据某些本发明的方法和/或组合物培养的糖蛋白上存在的额外和/或经修饰糖残基可赋予其与众不同的生物化学特性，专业人员可使用这些生物化学特性，比根据非本发明的方法和/或组合物培养的糖蛋白更容易地纯化所述糖蛋白，或达到更高纯度。
所属领域的普通技术人员应了解，具体的纯化技术可视待纯化的多肽或蛋白质的特性、表达多肽或蛋白质的细胞的特性和/或细胞所生长的培养基的组成而变化。
免疫原性组合物
根据本发明的教示产生的蛋白质或多肽还可用于免疫原性组合物(例如，疫苗)中。在某些实施例中，所产生的蛋白质或多肽错误折叠和/或聚集的减少将产生更有效的免疫原性组合物。
在某些实施例中，通过根据本发明的某些方法和/或组合物产生糖蛋白获得的改良的糖基化模式产生更有效的免疫原性组合物。举例来说，含有所产生的糖蛋白的免疫原性组合物可触发更有效的免疫反应，其中个体的免疫系统将产生更大数量的针对所述糖蛋白的抗体，和/或产生对免疫原性糖蛋白展现更高特异性的抗体。另外或其它，糖蛋白可触发免疫反应而具有较少和/或不太严重的副作用。在某些实施例中，本发明的免疫原性组合物包含一种或多种糖蛋白。另外或其它，本发明的免疫原性组合物可包括一种或多种生理学上可接受的载剂。
大体而言，本发明的免疫原性组合物中各组分的适当“有效量”或剂量的选择通常是基于多种因素，包括(但不限于)所使用的免疫原性组合物中所选多肽的特性、多肽的糖基化模式和个体的身体情况，最重要的是包括免疫个体的一般健康状况、年龄和体重。如所属领域中所已知，投药的特定方法和途径以及免疫原性组合物中其他组分的存在也会影响DNA质粒组合物的剂量和量。有效剂量的所述选择和上调或下调都在在所属领域的技能范围内。在患者体内诱导免疫反应(包括(但不限于)保护反应)或产生外源效应而无明显不利副作用所需的免疫原性组合物的量视这些因素而变化。所属领域的技术人员将易于确定适当剂量。
本发明的某些免疫原性组合物可含有佐剂。佐剂为当与免疫原或抗原一起投与时增强免疫反应的物质。已证实，多种细胞因子或淋巴因子具有免疫调节活性，且因此可用作佐剂，包括(但不限于)白细胞介素1-α、1-β、2、4、5、6、7、8、10、12(例如参看美国专利第5,723,127号，以全文引用的方式并入本文中)、13、14、15、16、17和18(和其突变形式)；干扰素-α、β和γ；粒细胞-巨噬细胞集落刺激因子(例如参看美国专利第5,078,996号，以全文引用的方式并入本文中)；巨噬细胞集落刺激因子；粒细胞集落刺激因子；GSF；和肿瘤坏死因子α和β。适用于本发明中的其它佐剂包括趋化因子，包括(但不限于)MCP-1、MIP-1α、MIP-1β和RANTES。诸如选择素(selectin)(例如，L-选择素、P-选择素和E-选择素)等粘附分子也可用作佐剂。其它适用佐剂包括(但不限于)类粘蛋白分子(mucin-like molecule)，例如CD34、GlyCAM-1和MadCAM-1；整合素家族成员，诸如LFA-1、VLA-1、Mac-1和p150.95；免疫球蛋白超家族成员，诸如PECAM、ICAM(例如ICAM-1、ICAM-2和ICAM-3)、CD2和LFA-3；共刺激分子，诸如CD40和CD40L；生长因子，包括血管生长因子、神经生长因子、成纤维细胞生长因子、表皮生长因子、B7.2、PDGF、BL-1和血管内皮生长因子；受体分子，包括Fas、TNF受体、Flt、Apo-1、p55、WSL-1、DR3、TRAMP、Apo-3、AIR、LARD、NGRF、DR4、DR5、KILLER、TRAIL-R2、TRICK2和DR6。另一佐剂分子包括卡斯帕酶(Caspase)(ICE)。也参看国际专利公开案第WO98/17799号和第WO99/43839号，其各以全文引用的方式并入本文中。
适用作佐剂的还有霍乱毒素(CT)和其突变体，包括已公开的国际专利申请案第WO 00/18434号中所述者(其中第29位氨基酸谷氨酸经另一氨基酸(除天冬氨酸外，例如组氨酸)置换)。类似CT或突变体描述于已公开的国际专利申请案第WO 02/098368号中(其中第16位氨基酸异亮氨酸单独经另一氨基酸置换，或者所述置换与第68位氨基酸丝氨酸经另一氨基酸置换组合；和/或其中第72位氨基酸缬氨酸经另一氨基酸置换)。其它CT毒素描述于已公开的国际专利申请案第WO 02/098369号中(其中第25位氨基酸精氨酸经另一氨基酸置换；和/或一个氨基酸插入第49位氨基酸位置处；和/或两个氨基酸插入第35位和第36位氨基酸位置处)。这些参考文献各以全文引用的方式并入本文中。
在某些实施例中，通过多种途径，包括(但不限于)鼻内、经口、阴道、直肠、非经肠、皮内、透皮(例如参看国际专利公开案第WO 98/20734号，其以全文引用的方式并入本文中)、肌肉内、腹膜内、皮下、静脉内和关节内，向人类或非人类脊椎动物投与本发明的免疫原性组合物。可根据所使用的免疫原性组合物的性质；对患者年龄、体重、性别和一般健康状况的评价；和免疫原性组合物中存在的抗原，和/或所属领域的普通技术人员已知的其它因素，来选择适当途径。
在某些实施例中，多次投与免疫原性组合物。免疫原性组合物的投药次序和个别投药之间的时间间隔可由所属领域的技术人员根据所属领域的普通技术人员已知的相关因素(包括(但不限于)宿主的身体特征和宿主对于方法应用的确切反应)加以选择。
医药调配物
在某些实施例中，所产生的多肽或蛋白质将具有药理活性，并可用于制备医药剂。如上文所述的本发明的组合物可通过任何可用途径投与个体或可首先经调配以用于经由任何可用途径递送，所述途径包括(但不限于)非经肠、静脉内、肌肉内、皮内、皮下、经口、颊内、舌下、鼻、支气管、眼、透皮(局部)、透粘膜、直肠和阴道途径。本发明的医药组合物通常包括经纯化的由哺乳动物细胞系表达的多肽或蛋白质、递送剂(即，阳离子聚合物、肽分子转运体、表面活性剂等，如上文所述)与医药学上可接受的载剂的组合。如本文所使用，术语“医药学上可接受的载剂”包括与医药投药相容的溶剂、分散介质、包衣、抗细菌和抗真菌剂、等渗剂和吸收延迟剂等。也可将补充活性化合物并入本发明的组合物中。举例来说，根据本发明产生的蛋白质或多肽可与用于全身药物疗法的药物连结，所述药物诸如毒素、低分子量细胞毒性药物、生物反应修饰剂和放射性核素(例如参看昆兹(Kunz)等人，加里刹霉素衍生物-载剂连结物(Calicheamicinderivative-carrier conjugates)，US20040082764 A1)。适用于制备本发明的医药组合物的其它成分例如包括调味剂、润滑剂、增溶剂、悬浮剂、填充剂、助流剂、压缩助剂、粘合剂、片剂崩解剂、囊封材料、乳化剂、缓冲剂、防腐剂、甜味剂、增稠剂、着色剂、粘性调节剂、稳定剂或渗透压调节剂、或其组合。
其它或另外，根据本发明产生的蛋白质或多肽可与一种或多种其他医药活性剂组合投与(无论为同时或依次投与)。这些医药活性剂的例示性列表可见于医师案头参考(Physicians′Desk Reference)第55版，它是由医药经济有限公司(Medical Economics Co.，Inc.)，新泽西州蒙特费(Montvale，NJ)于2001年出版并以全文引用的方式并入本文中。许多所列药剂的医药有效量和方案为所属领域中所已知；许多都提供于《医师案头参考》中。
固体医药组合物可含有一种或多种固体载剂以及任选一种或多种其它添加剂，诸如调味剂、润滑剂、增溶剂、悬浮剂、填充剂、助流剂、压缩助剂、粘合剂或片剂崩解剂，或囊封材料。适当固体载剂例如包括磷酸钙、硬脂酸镁、滑石粉、糖、乳糖、糊精、淀粉、明胶、纤维素、甲基纤维素、羧甲基纤维素钠、聚乙烯吡咯烷酮、低熔点蜡或离子交换树脂，或其组合。对于粉末医药组合物，载剂可为细粉状固体，其与细粉状活性成分形成混合物。对于片剂，通常将活性成分与适当比例的具有必要压缩特性的载剂以及任选使用的其它添加剂混合，并压缩成所需的形状和尺寸。
液体医药组合物可含有根据本发明表达的多肽或蛋白质和一种或多种液体载剂以形成溶液、悬浮液、乳液、糖浆、酏剂或加压组合物。医药学上可接受的液体载剂例如包括水、有机溶剂、医药学上可接受的油或脂肪，或其组合。液体载剂可含有其它适当医药添加剂，诸如增溶剂、乳化剂、缓冲剂、防腐剂、甜味剂、调味剂、悬浮剂、增稠剂、着色剂、粘性调节剂、稳定剂或渗透压调节剂，或其组合。如果打算将液体调配物用于儿科用途，则通常需要避免包括醇或限制醇的用量。
适于经口或非经肠投与的液体载剂的实例包括水(任选含有添加剂，诸如纤维素衍生物，诸如羧甲基纤维素钠)、醇或其衍生物(包括一元醇或多元醇，诸如二醇)或油(例如，分馏椰子油和花生油)。对于非经肠投药来说，载剂也可以是油性酯，诸如油酸乙酯和豆蔻酸异丙酯。用于加压组合物的液体载剂可以是卤代烃或其它医药学上可接受的推进剂。
可例如通过肌肉内、腹膜内、硬膜外、鞘内、静脉内或皮下注射非经肠投与呈无菌溶液或悬浮液形式的液体医药组合物。用于经口或透皮投与的医药组合物可呈液体或固体组合物形式。
在某些实施例中，将医药组合物调配成可与其预定投药途径相容。用于非经肠、皮内或皮下应用的溶液或悬浮液可包括以下组分：无菌稀释剂，诸如注射用水、生理盐水溶液、不挥发性油、聚乙二醇、甘油、丙二醇或其它合成溶剂；抗细菌剂，诸如苯甲醇或对羟基苯甲酸甲酯；抗氧化剂，诸如抗坏血酸或亚硫酸氢钠；螯合剂，诸如乙二胺四乙酸；缓冲剂，诸如乙酸盐或磷酸盐；和调节张力的试剂，诸如氯化钠或右旋糖。可以利用酸或碱(诸如盐酸或氢氧化钠)来调节pH值。非经肠制剂可以密封于由玻璃或塑料制成的安瓿、一次性注射器或多剂量小瓶中。
适于注射使用的医药组合物通常包括无菌水溶液(在溶于水的情况下)或分散液，以及用于即时制备无菌可注射溶液或分散液的无菌粉末。对于静脉内投药，适当载剂包括生理盐水、抑菌水、聚氧乙烯蓖麻油(Cremophor ELTM)(巴斯夫公司(BASF)，新泽西州帕瑟伯尼(Parsippany，N.J.))或磷酸盐缓冲生理盐水(PBS)。在所有情况下，所述组合物应为无菌的，并且应在某种程度上可流动从而方便注射。有利的是，某些医药组合物在制造和储存条件下稳定，并且须防止微生物(诸如细菌和真菌)的污染作用。相关载剂通常可为溶剂或分散介质，其例如含有水、乙醇、多元醇(例如，甘油、丙二醇和液态聚乙二醇等)和其适当混合物。可例如通过利用诸如卵磷脂等包衣、在分散液的情况下通过保持所需粒度以及通过利用表面活性剂，来保持适当流动性。防止微生物作用可通过例如对羟基苯甲酸酯、氯丁醇、苯酚、抗坏血酸、硫柳汞等各种抗细菌剂和抗真菌剂实现。在某些情况下，组合物中有益地包括等渗剂，例如糖、多元醇(诸如甘露糖醇、山梨糖醇)或氯化钠。延长可注射组合物的吸收可通过在组合物中包括延缓吸收的试剂(例如，单硬脂酸铝和明胶)来实现。
可通过将适当溶剂中的所需量的经纯化多肽或蛋白质与一种上文所列举的成分或上文所列举成分的组合合并，需要时随后过滤灭菌，来制备无菌可注射溶液。一般说来，通过将经纯化的由哺乳动物细胞系表达的多肽或蛋白质并入含有基础分散介质和上文所列举成分中的所需其它成分的无菌媒剂中，来制备分散液。在用于制备无菌可注射溶液的无菌粉末的情况下，有利制备方法为真空干燥和冷冻干燥，此举将从先前无菌过滤的溶液得到活性成分加上任何其它所需成分的粉末。
口服组合物一般包括惰性稀释剂或可食用载剂。出于经口治疗性投药的目的，可将经纯化的多肽或蛋白质与赋形剂合并，并以片剂、锭剂或胶囊(例如明胶胶囊)的形式使用。口服组合物还可使用流体载剂制备，例如用作漱口液。可包括医药学上相容的粘合剂和/或佐剂物质作为所述组合物的一部分。片剂、丸剂、胶囊、锭剂等可含有以下任何成分，或具有类似性质的化合物：粘合剂，诸如微晶纤维素、黄芪胶或明胶；赋形剂，诸如淀粉或乳糖；崩解剂，诸如褐藻酸、普雷莫胶(Primogel)或玉米淀粉；润滑剂，诸如硬脂酸镁或斯特罗特(Sterotes)；助流剂，诸如胶状二氧化硅；甜味剂，诸如蔗糖或糖精；或调味剂，诸如薄荷、水杨酸甲酯或橙味调味剂。所述制剂可为混合型可咀嚼或液体调配物或食物材料或液体(必要时)，例如以便利对儿童、吞咽片剂的能力受损的个体或动物投药。用于经口递送的调配物可有利地并有用于改良胃肠道内的稳定性和/或增强吸收的药剂。
对于经吸入投药，也可经鼻内或吸入投与包含经纯化的由哺乳动物细胞系表达的多肽或蛋白质以及递送剂的本发明的组合物，并且其可便利地以干粉吸入剂或在使用或不使用适当推进剂情况下由加压容器、泵、喷雾器、雾化器或喷洒器提供的气雾剂喷雾的形式递送，所述推进剂例如二氯二氟甲烷、三氯氟甲烷、二氯四氟乙烷、氟代烷烃(诸如1，1，1，2-四氟乙烷(HFA 134ATM)或1，1，1，2，3，3，3-七氟丙烷(HFA 227EATM))、二氧化碳或其它适当气体。在加压气雾剂的情况下，可通过提供阀确定剂量单位来递送计算量，例如治疗有效量。本发明尤其涵盖使用鼻喷雾器、吸入器或其它上呼吸道和/或下呼吸道直接递送装置来递送本发明的组合物。已证实，鼻内投与针对流感病毒的DNA疫苗可诱导CD8 T细胞反应，这表明当经由此途径递送时，呼吸道中至少有一些细胞能吸收DNA，并且本发明的递送剂将增强细胞摄取。根据某些实施例，将包含经纯化的由哺乳动物细胞系表达的多肽以及递送剂的组合物调配为大的多孔颗粒的形式用于气雾剂投药。
改良释放型和脉冲释放型口服剂型可含有充当释放速率调节剂的赋形剂，这些赋形剂是包覆在装置主体上和/或包括在装置主体内。释放速率调节剂包括(但不仅限于)羟丙基甲基纤维素、甲基纤维素、羧甲基纤维素钠、乙基纤维素、乙酸纤维素、聚氧化乙烯、黄原胶、卡波姆(Carbomer)、季胺基甲基丙烯酸酯共聚物、氢化蓖麻油、巴西棕榈蜡(carnauba wax)、石蜡、乙酸邻苯二甲酸纤维素、羟丙基甲基纤维素邻苯二甲酸酯、甲基丙烯酸共聚物和其混合物。改良释放型和脉冲释放型口服剂型可含有一种释放速率调节赋形剂或释放速率调节赋形剂的组合。释放速率调节赋形剂可存在于剂型内(即，在基质内)和/或存在于剂型上(即，在表面或包衣上)。
全身投药也可通过透粘膜或透皮方式实现。对于透粘膜或透皮投药来说，调配物中可使用适用于渗透障壁的渗透剂。所述渗透剂一般为所属领域中所已知，并且例如包括供透粘膜投药用的崩解剂、胆汁盐和夫西地酸(fusidic acid)衍生物。透粘膜投药可使用鼻喷雾剂或栓剂实现。对于透皮投药来说，可将经纯化多肽或蛋白质以及递送剂调配为含有悬浮或溶解于例如具有以下一种或多种的混合物中的活性化合物的适当油膏：矿物油、液体矿脂、白矿脂、丙二醇、聚氧乙烯聚氧丙烯化合物、乳化蜡和水。或者，可将其调配为悬浮或溶解于例如以下一种或多种的混合物中的适当洗液或乳膏：矿物油、单硬脂酸脱水山梨醇酯、聚乙二醇、液体石蜡、聚山梨醇酯60、鲸蜡酯蜡、鲸蜡硬酯醇、2-辛基十二烷醇、苯甲醇和水。
另外，所述化合物可以栓剂或子宫托形式投与，或其可以凝胶、水凝胶、洗液或其它三酸甘油酯、溶液、乳膏、油膏或撒布粉(dusting powder)形式局部涂覆。
在一些实施例中，利用防止多肽或蛋白质被身体迅速消除的载剂来制备组合物，诸如控制释放调配物，包括植入物和微胶囊化递送系统。一般说来，本发明的组合物可调配用于立即释放、延迟释放、改良释放、持续释放、脉冲释放或控制释放递送。可使用生物可降解、生物可相容聚合物，诸如乙烯乙酸乙烯酯、聚酐、聚乙醇酸、胶原蛋白、聚原酸酯和聚乳酸。制备所述调配物的方法对于所属领域的技术人员将显而易见。适当材料还可购自阿尔扎公司(Alza Corporation)和诺瓦医药有限公司(Nova Pharmaceuticals，Inc.)。脂质体悬浮液(包括靶向受感染细胞的脂质体以及针对病毒抗原的单克隆抗体)也可用作医药学上可接受的载剂。其可根据所属领域的技术人员已知的方法(例如，如美国专利第4,522,811号中所述)来制备。
根据本发明产生的蛋白质或多肽也可与环糊精组合使用。已知环糊精能与某些分子形成包合和非包合复合物。环糊精复合物的形成可改良蛋白质或多肽的溶解性、溶解速率、生物可用性和/或稳定性。环糊精复合物一般适用于大多数剂型和投药途径。作为引导与蛋白质或多肽复合的替代选择，可将环糊精用作辅助添加剂，例如作为载剂、稀释剂或增溶剂。α-、β-和γ-环糊精为最常用的，且适当实例描述于公开的国际专利申请案WO91/11172、WO94/02518和WO98/55148中。
在一些实施例中，本发明的医药组合物是以单位剂型(诸如片剂或胶囊)提供。有利的是，出于投药的便利性和剂量的均一性，可调配呈单位剂型的口服或非经肠组合物。在所述形式中，将所述组合物再分成含有合适量的多肽或蛋白质的单位剂量。所述单位剂型可为包装的组合物，例如包装散剂、小瓶、安瓿、预填充注射器或含有液体的小袋。单位剂型可例如为胶囊或片剂本身，或者其可为适当数量的呈包装形式的任何所述组合物。所属领域的技术人员将认识到，治疗上有效的单位剂量将视数种因素而定，例如包括投药方法、多肽或蛋白质的效力，和/或接受者的体重，以及医药组合物中其它组分的特性。
根据本发明表达的多肽或蛋白质可以各种时间间隔并视需要历经不同时间投与，例如每周1次持续约1到10周、2到8周、约3到7周、约4、5或6周等。所属领域的技术人员应了解，某些因素可影响有效治疗个体所需的剂量和时程，包括(但不限于)疾病或病症的严重程度、先前治疗、一般健康状况和/或个体的年龄，以及存在的其它疾病。用本文所述的多肽或蛋白质治疗个体可包含单次治疗或一系列治疗。还应了解，适当剂量可视多肽或蛋白质的效力而定，并且可任选例如通过投与递增剂量直到获得预先选择的所需反应，来制定特定接受者的剂量。应了解，用于任何特定动物个体的具体剂量含量可视多种因素而定，包括所使用的具体多肽或蛋白质的活性；个体的年龄、体重、一般健康状况、性别和饮食；投药时间；投药途径；排泄速率；任何药物组合；以及欲调节的表达或活性的程度。
本发明涵盖本发明组合物用于治疗非人类动物的用途。因此，可根据兽医药理学和医学中的已知原理选择投药剂量和方法。指南例如可见于R.亚当(Adams，R.)(编)，兽医药理学和治疗(Veterinary Pharmacology and Therapeutics)，第8版，爱荷华州立大学出版社(Iowa State University Press)；ISBN：0813817439；2001。
本发明的医药组合物可与投药说明书一起包括在容器、包装或分配器中。
实例
实例1：培养基调配物
本发明涵盖以下发现：与当细胞在传统培养基中生长时会产生的多肽相比，由在含有一种或多种本发明浓度的铜和/或谷氨酸盐的培养基中生长的细胞的培养物产生的多肽展现降低的错误折叠和/或聚集程度。本发明还涵盖以下发现：与当细胞在传统培养基中生长时所观察到的多肽的总糖基化模式相比，由在含有一种或多种本发明浓度的铜和/或谷氨酸盐的培养基中生长的细胞的培养物产生的多肽展现增加的总糖基化。可将铜和/或谷氨酸盐添加到能够支持细胞生长的任何培养基中。表1中列出可添加本发明的任何浓度范围内的铜和/或谷氨酸盐的例示性培养基，但本发明不限于利用这些培养基。所属领域的普通技术人员应了解，可利用其它培养基来培养细胞，和/或可对表1中所列的例示性培养基的组成进行某些改变。
表1.例示性培养基
Figure G2008800069705D00391
Figure G2008800069705D00401
在某些实施例中，在初始培养开始后一个或多个时间，向细胞中补充一种或多种补料培养基。例示性补料培养基列于表2中，但本发明不限于利用这些补料培养基。所属领域的普通技术人员应了解，可利用其它补料培养基来培养细胞，和/或可对表2中所列的例示性补料培养基的组成进行某些改变。举例来说，可增加或减低所述补料培养基中一种或多种组分的浓度，以实现所述组分的所需浓度。在某些实施例中，使各补料培养基组分的浓度增加或降低相同倍数。举例来说，可使各补料培养基组分的浓度增加或降低1x、2x、3x、4x、5x、6x、7x、8x、9x、10x、11x、12x、13x、14x、15x、16x、17x、18x、19x、20x、25x、30x、35x、40x、45x、50x或更高倍数。
表2.例示性补料培养基
Figure G2008800069705D00402
Figure G2008800069705D00411
实例2：将铜和谷氨酸盐添加到成分明确的生长培养基中的影响
介绍：在细胞培养物中表达蛋白质或多肽的一个挑战在于：使所表达的蛋白质或多肽的错误折叠或聚集减至最少。已提出多种关于此问题的解决方法，包括降低细胞培养物的pH值和/或温度，以及添加诸如HMBA等诱导剂。
为确定细胞培养物的氧化还原环境是否在错误折叠和聚集多肽积累中起到作用，进行以下实验。为得到氧化性较强的环境，根据已知的铜和谷氨酸盐影响氧化还原状态的细胞内机制，将铜和谷氨酸盐影添加到细胞培养基中。铜催化半胱氨酸(还原形式)细胞外氧化成胱氨酸(氧化形式)。假定将铜添加到细胞培养基中能促进胱氨酸积累，产生氧化性较强的环境。已证实，谷氨酸盐会干扰细胞吸收胱氨酸并将其还原成半胱氨酸的能力。认为使用谷氨酸盐阻断细胞摄取胱氨酸且接着将胱氨酸转化成半胱氨酸的能力，将产生氧化性较强的环境。
材料与方法：对于所有以下实验，遵循标准灌注方法，在1L生产用生物反应器中培养TNFR-Ig。一组特定实验(如表3、4和5中所说明)的各细胞培养物都是从同一接种源接种。略微修改各实验之间的pH值和温度设定值，详情如表3、4和5中所说明。生产运行当天，对初始细胞培养物投与铜和谷氨酸盐。在表3、4和5中所说明的时间，将诱导剂HMBA和NaB添加到细胞培养物中。
使各细胞培养物最初在第一温度下生长，随后在第1天转变至较低温度。在各实验结束时，在-80℃下储存无细胞条件培养基。遵循标准方案，利用解冻的材料进行蛋白质制备。使用从各所测试细胞培养条件保留下来的柱洗脱液进行产物品质分析。
表3.实验1：对于将铜或谷氨酸盐添加到细胞培养生长培养基中的评估
 铜(30℃，pH 6.95)   谷氨酸盐(30℃，pH 6.95)   对照组(30℃，pH 6.95)
  温度设定值  37℃   37℃   37℃
  pH值设定值  6.95+/-.02   6.95+/-.02   6.95+/-.02
  DO设定值  60   60   60
  铜  1μM   -   -
  谷氨酸盐  -   5mM   -
补料比率  第3天、第6天和第8天时5％ 第3天、第6天和第8天时5％ 第3天、第6天和第8天时5％
  诱导剂  3mM HMBA   3mM HMBA   3mM HMBA
  诱导日  D1   D1   D1
  诱导剂  1mM NaB   1mM NaB   1mM NaB
  诱导日  D1   D1   D1
  第2温度  30℃   30℃   30℃
  温度转变日  D1   D1   D1
表4.实验2：对于将铜、谷氨酸盐或二者添加到细胞培养生长培养基中的评估
  谷氨酸盐(30℃，pH6.95)   铜(30℃，pH6.95)   组合(30℃，pH 6.95)   对照组(30℃，pH6.95)   铜(29.5℃，pH6.85)   对照组(29.5℃，pH6.85)
  温度设定值   37℃   37℃   37℃   37℃   37℃   37℃
  pH值设定值   6.95+/-.02   6.95+/-.02   6.95+/-.02   6.95+/-.02   6.85+/-.02   6.85+/-.02
  DO设定值   60   60   60   60   60   60
  铜   -   1μM   1μM   -   1μM   -
  谷氨酸盐   5mM   -   5mM   -   -   -
  补料比率   第3天、第6天和第8天时5％   第3天、第6天和第8天时5％   第3天、第6天和第8天时5％   第3天、第6天和第8天时5％   第3天、第6天和第8天时5％   第3天、第6天和第8天时5％
  诱导剂   3mM HMBA   3mM HMBA   3mM HMBA   3mM HMBA   3mM HMBA   3mM HMBA
  诱导日   D1   D1   D1   D1   D1   D1
  诱导剂   1mM NaB   1mM NaB   1mM NaB   1mM NaB   1mM NaB   1mM NaB
  诱导日   D1   D1   D1   D1   D1   D1
  第2温度   30℃   30℃   30℃   30℃   29.5℃   29.5℃
  温度转变日   D1   D1   D1   D1   D1   D1
表5.实验3：对于将铜、谷氨酸盐或二者添加到细胞培养生长培养基中的评估
  组合，附加Cu(29.5℃，pH 6.95)   组合，低Glu(29.5℃，pH6.95)   组合(29.5℃，pH6.95)   组合，附加HMBA(29.5℃，pH6.95)   对照组(29.5℃，pH6.95)   对照组(无温度转变)   组合(无温度转变)
  温度设定值   37℃   37℃   37℃   37℃   37℃   29.5℃   29.5℃
  pH值设定值   6.95+/-.02   6.95+/-.02   6.95+/-.02   6.95+/-.02   6.85+/-.02   6.85+/-.02   6.85+/-.02
  DO设定值   60   60   60   60   60   60   60
  铜   1.5μM   1μM   1μM   1μM   1μM
  谷氨酸盐   5mM   2.5mM   5mM   5mM   5mM
  补料比率   第3天、第6天、第8天和第10天时5％   第3天、第6天、第8天和第10天时5％   第3天、第6天、第8天和第10天时5％   第3天、第6天、第8天和第10天时5％   第3天、第6天、第8天和第10天时5％   第3天、第6天、第8天和第10天时5％   第3天、第6天、第8天和第10天时5％
  诱导剂   3mMHMBA   3mMHMBA   3mMHMBA   4mMHMBA   3mMHMBA   3mMHMBA   3mMHMBA
  诱导日   D1   D1   D1   D1   D1   D1   D1
  诱导剂   1mM NaB   1mM NaB   1mM NaB   1mM NaB   1mM NaB   1mM NaB   1mM NaB
  诱导日   D1   D1   D1   D1   D1   D3   D3
  第2温度   29.5℃   29.5℃   29.5℃   29.5℃   29.5℃   -   -
  温度转变日   D1   D1   D1   D1   D1   -   -
结论：图1-5、6-10和11-15分别提供表3、4和5中所述实验的结果。图1、6和11绘示三个实验中每一实验所测试的各细胞培养物的积分活细胞密度(IVCD)。图2、7和12绘示三个实验中每一实验所测试的各细胞培养物的累积单位生产率(Qp)。图3、8和13绘示三个实验中每一实验所测试的各细胞培养物的谷氨酸盐含量。图4、9和14绘示三个实验中每一实验所测试的各细胞培养物的乳酸盐含量。图5、10和15绘示三个实验中每一实验所测试的各细胞培养物的第10天时细胞培养物中错误折叠的TNFR-Ig占所产生的总TNFR-Ig的百分比，以及第10天滴度。表6为表3、4和5中所述各细胞培养物的品质结果(错误折叠/聚集TNFR-Ig的百分比)的汇总。另外，表6还展示所表达的TNFR-Ig的总唾液酸化占TNFR-Ig参考样本总唾酸化的百分比。
表6.表3、4和5中所述实验的多肽品质结果一览表。
Figure G2008800069705D00451
图16和17分别绘示表4和5中所述的实验所测试的各细胞培养物在第8天和第10天时错误折叠/聚集TNFR-Ig的百分含量。图18和19分别绘示表4和5中所述的实验中第8天、第10天和第12天时所表达的TNFR-Ig的总唾液酸化占TNFR-Ig参考样本的总唾液酸化的百分比。
细胞培养物性能：当在各实验内与对照组情形相比较时，添加铜、谷氨酸盐或二者的组合不会明显影响培养物性能。如图1、6和11中所示，所述添加对累积细胞密度不具负面影响。如图2、7和12中所示，所有添加中的一个一致效应为单位生产率相比对照组略有降低，即，在所有三个实验中始终观察到差异。在大多数情况下，获得的滴度略低于对照处理，这与考虑到单位生产率的较小差异而预期的结果相符。
在各生产运行过程中，测量谷氨酸盐积累。如图3、8和13中所示，最上面的投与谷氨酸盐的情形(单独谷氨酸盐和组合情形)具有总体较低的谷氨酸盐生产率。尽管单位生产率较低，但这些含谷氨酸盐添加的一个一致效应为：最终谷氨酸盐浓度始终比对照组高约1.5mM。就谷氨酸盐产生曲线来说，仅投与铜的情形与对照组情形相同(参看图3、8和13)。这表明仅添加铜不会影响正常的谷氨酸盐积累机制。
在添加铜、谷氨酸盐或二者的组合的所有情形中，都观察到乳酸盐消耗的减少(参看图4、9和14)。因此，这些情形获得比对照组高的乳酸盐积累。不希望受任何特定理论的束缚，本发明的发明人提出，所观察到的铜和/或谷氨酸盐添加与乳酸盐消耗之间的相反趋势可指示氧化还原状态与细胞乳酸盐消耗速率之间的关系。
产物品质影响：这些实验的主要目的在于，评定当将铜、谷氨酸盐或二者的组合添加到细胞培养物中时对所产生的多肽的品质的影响。具体说来，这些实验是针对确定铜、谷氨酸盐或二者的添加是否能在不会负面影响细胞培养物性能的情况下，降低所产生多肽的错误折叠和/或聚集总量。如可从表6看出，添加铜、谷氨酸盐或二者的组合实际上改良所产生多肽的品质。在所有三个实验中，在含有铜和/或谷氨酸盐的情形中，错误折叠和/或聚集多肽的总量较低。
有趣的是，由实验2和3的培养条件得到的时程数据表明，对于含有铜和/或谷氨酸盐的情形，错误折叠和/或聚集多肽的总量随时间稳定(分别参看图16和17，和表6)。对照组情形显示，错误折叠和/或聚集多肽的含量随时间明显增加。在修改的“无温度转变”过程中没有观察到这一效应(参看图17实例3a对照组相对于实例3a组合)，这表明在某些实验条件下，温度转变有利于降低错误折叠和/或聚集多肽的量。总的说来，所有三个实验都证实：在指定的收获日(第8天、第10天或第12天)，铜和/或谷氨酸盐情形中错误折叠和/或聚集多肽的总量低于对照处理。在所研究的所有情形中，在收获时谷氨酸盐与铜的组合始终降低错误折叠和/或聚集多肽的量。
一个意外但振奋人心的结果是所述各种添加对于总唾液酸化的影响。如从表6中可看出，实验1的结果表明：铜和谷氨酸盐情形具有比对照组情形高的总唾液酸化。此外，从表4和5中所述的实验得到的时程数据指示，对于含铜和/或谷氨酸盐的情形，总唾液酸化随时间稳定或略有增加(参看图18和19)。所述实验中的对照组情形显示总唾液酸化随时间减少。此外，在低pH值培养条件(参看表6和图18)以及无温度转变的培养条件(参看表6和图19)下，观察到总唾液酸增加，表明所述机制可能与pH值和温度工艺策略无关。
前述描述应理解成仅具代表性，而不打算具有限制性。实施本发明以及其它应用的替代方法和材料对于所属领域的技术人员将显而易见，并且预期所述替代方法和材料包括在以上权利要求的范围内。

Claims (44)

1.一种在细胞培养物中产生多肽的方法，其包含以下步骤：
在允许表达所关注多肽的条件下，在包含介于约0.5μM与5μM之间的铜和介于约1.7mM与33mM之间的谷氨酸盐的细胞培养基中，培养含有编码所述多肽的基因的哺乳动物细胞历时一段足以允许所述多肽表达的时间，其中与在其它方面相同的条件下，在缺乏铜和谷氨酸盐但其它方面相同的培养基中所观察到的错误折叠和/或聚集多肽的分率相比，错误折叠和/或聚集多肽相对于所产生的总多肽的分率降低。
2.一种在细胞培养物中产生多肽的方法，其包含以下步骤：
在包含介于约0.5μM与5μM之间的铜和介于约1.7mM与33mM之间的谷氨酸盐的细胞培养基中，培养含有编码所关注多肽的基因的哺乳动物细胞；
在第一温度范围下，将所述培养物保持足以使所述细胞繁殖达到在一定范围内的活细胞密度的第一时间段，所述活细胞密度范围为在所述第一温度范围下保持所述培养物的情况下的最大可能活细胞密度的约20％-80％；
将所述培养物转变到第二温度范围，其中所述第二温度范围中的至少一个温度低于所述第一温度范围的最低温度；
在允许表达所述多肽的条件下，将所述培养物保持足以允许所述多肽表达的第二时间段，其中与在其它方面相同的条件下，在缺乏铜和谷氨酸盐但其它方面相同的培养基中所观察到的错误折叠和/或聚集多肽的分率相比，错误折叠和/或聚集多肽相对于所产生的总多肽的分率降低。
3.根据权利要求2所述的方法，其中所述第一温度范围包含为约30摄氏度到42摄氏度的温度范围。
4.根据权利要求2所述的方法，其中所述第二温度范围包含为约25摄氏度到41摄氏度的温度范围。
5.根据权利要求2所述的方法，其在所述第一转变步骤后包括第二转变步骤，所述第二转变步骤包含：将所述培养物转变到第三温度或温度范围，其中所述第三温度范围中的至少一个温度低于所述第二温度范围的最低温度。
6.根据权利要求5所述的方法，其中所述第三温度范围包含为约25摄氏度到40摄氏度的温度范围。
7.根据权利要求1或2所述的方法，其中所述细胞培养基的初始谷氨酰胺浓度小于或等于约4mM。
8.根据权利要求1或2所述的方法，其中进一步向所述细胞培养物补充每升约2克葡萄糖。
9.根据权利要求1或2所述的方法，其中进一步向所述细胞培养物补充补充组分。
10.根据权利要求9所述的方法，其中所述补充组分是于补料培养基中提供。
11.根据权利要求10所述的方法，其中所述补充组分是以多个时间间隔提供。
12.根据前述权利要求中一个或多个权利要求所述的方法，其中所述细胞培养基是确定的。
13.根据权利要求12所述的方法，其中所述确定的细胞培养基不含添加的血清或水解产物。
14.根据权利要求12所述的方法，其中所述确定的细胞培养基不含蛋白质。
15.根据前述权利要求中任一权利要求所述的方法，其中所述细胞培养基包含介于约0.7μM与1.5μM之间的铜。
16.根据权利要求15所述的方法，其中所述细胞培养基包含约1μM的铜。
17.根据前述权利要求中任一权利要求所述的方法，其中所述细胞培养基包含介于约3mM与7mM之间的谷氨酸盐。
18.根据权利要求17所述的方法，其中所述细胞培养基包含约5mM的谷氨酸盐。
19.一种细胞培养基，其包含介于约0.5μM与5μM之间的铜和介于约1.7mM与33mM之间的谷氨酸盐。
20.根据权利要求19所述的细胞培养基，其中所述细胞培养基中的初始谷氨酰胺浓度小于或等于约4mM。
21.根据权利要求19或20所述的细胞培养基，其进一步包含每升约2克葡萄糖。
22.根据权利要求19至21中任一权利要求所述的细胞培养基，其中所述细胞培养基是确定的。
23.根据权利要求22所述的细胞培养基，其中所述确定的细胞培养基不含添加的血清或水解产物。
24.根据权利要求22所述的细胞培养基，其中所述确定的细胞培养基不含蛋白质。
25.根据权利要求19至24中任一权利要求所述的细胞培养基，其中所述细胞培养基包含介于约0.7μM与1.5μM之间的铜。
26.根据权利要求25所述的细胞培养基，其中所述细胞培养基包含约1μM的铜。
27.根据权利要求19至24中任一权利要求所述的细胞培养基，其中所述细胞培养基包含介于约3mM与7mM之间的谷氨酸盐。
28.根据权利要求27所述的细胞培养基，其中所述细胞培养基包含约5mM的谷氨酸盐。
29.一种在细胞培养物中产生多肽的方法，其包含以下步骤：
在允许表达所关注多肽的条件下，在包含介于约0.5μM与5μM之间的铜和介于约1.7mM与33mM之间的谷氨酸盐的细胞培养基中，培养含有编码所述多肽的基因的哺乳动物细胞历时一段足以允许所述多肽表达的时间，其中相对于在其它方面相同的条件下，在缺乏铜和谷氨酸盐但其它方面相同的培养基中所观察到的所表达多肽的糖基化模式，所表达多肽的糖基化模式增加。
30.一种在细胞培养物中产生多肽的方法，其包含以下步骤：
在包含介于约0.5μM与5μM之间的铜和介于约1.7mM与33mM之间的谷氨酸盐的细胞培养基中，培养含有编码所关注多肽的基因的哺乳动物细胞；
在第一温度范围下，将所述培养物保持足以使所述细胞繁殖达到在一定范围内的活细胞密度的第一时间段，所述活细胞密度范围为在所述第一温度范围下保持所述培养物的情况下的最大可能活细胞密度的约20％-80％；
将所述培养物转变到第二温度范围，其中所述第二温度范围中的至少一个温度低于所述第一温度范围的最低温度；
在允许所述多肽表达的条件下，将所述培养物保持足以允许所述多肽表达的第二时间段，其中相对于在其它方面相同的条件下，在缺乏铜和谷氨酸盐但其它方面相同的培养基中所观察到的所表达多肽的糖基化模式，所表达多肽的糖基化模式增加。
31.根据权利要求29或30所述的方法，其中所述所表达多肽的糖基化模式增加包含总唾液酸化增加。
32.根据权利要求29或30所述的方法，其中所述细胞培养基是确定的。
33.根据权利要求32所述的方法，其中所述确定的细胞培养基不含添加的血清或水解产物。
34.根据权利要求32所述的方法，其中所述确定的细胞培养基不含蛋白质。
35.根据权利要求29至34中任一权利要求所述的方法，其中所述细胞培养基包含介于约0.7μM与1.5μM之间的铜。
36.根据权利要求35所述的方法，其中所述细胞培养基包含约1μM的铜。
37.根据权利要求29至34中任一权利要求所述的方法，其中所述细胞培养基包含介于约3mM与7mM之间的谷氨酸盐。
38.根据权利要求37所述的方法，其中所述细胞培养基包含约5mM的谷氨酸盐。
39.根据权利要求1至18及29至38中任一权利要求所述的方法，其中所述多肽为TNFR-Ig。
40.根据权利要求1至18及29至38中任一权利要求所述的方法，其中所述多肽为TNFR-Fc。
41.根据权利要求1至18及29至38中任一权利要求所述的方法，其中所述多肽为选自由以下组成的群组的多肽：酶、凝血因子、受体、抗体、激素、调控因子、抗原和结合剂。
42.根据权利要求41所述的方法，其中所述多肽为抗Aβ抗体。
43.根据权利要求1至18及29至41中任一权利要求所述的方法，其中所述培养步骤包含以分批培养方式培养所述哺乳动物细胞。
44.根据权利要求1至18及29至41中任一权利要求所述的方法，其中分离和/或纯化所述多肽或蛋白质。
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