CN106459907A - 复合培养基粉末制剂和制备用于细胞培养的液体培养基的方法 - Google Patents

复合培养基粉末制剂和制备用于细胞培养的液体培养基的方法 Download PDF

Info

Publication number
CN106459907A
CN106459907A CN201580028914.1A CN201580028914A CN106459907A CN 106459907 A CN106459907 A CN 106459907A CN 201580028914 A CN201580028914 A CN 201580028914A CN 106459907 A CN106459907 A CN 106459907A
Authority
CN
China
Prior art keywords
leu
ser
culture medium
glu
thr
Prior art date
Legal status (The legal status is an assumption and is not a legal conclusion. Google has not performed a legal analysis and makes no representation as to the accuracy of the status listed.)
Granted
Application number
CN201580028914.1A
Other languages
English (en)
Other versions
CN106459907B (zh
Inventor
Y.席莫尼
V.默勒
Current Assignee (The listed assignees may be inaccurate. Google has not performed a legal analysis and makes no representation or warranty as to the accuracy of the list.)
Bayer Corp
Original Assignee
Bayer Corp
Priority date (The priority date is an assumption and is not a legal conclusion. Google has not performed a legal analysis and makes no representation as to the accuracy of the date listed.)
Filing date
Publication date
Application filed by Bayer Corp filed Critical Bayer Corp
Publication of CN106459907A publication Critical patent/CN106459907A/zh
Application granted granted Critical
Publication of CN106459907B publication Critical patent/CN106459907B/zh
Expired - Fee Related legal-status Critical Current
Anticipated expiration legal-status Critical

Links

Classifications

    • C—CHEMISTRY; METALLURGY
    • C12—BIOCHEMISTRY; BEER; SPIRITS; WINE; VINEGAR; MICROBIOLOGY; ENZYMOLOGY; MUTATION OR GENETIC ENGINEERING
    • C12N—MICROORGANISMS OR ENZYMES; COMPOSITIONS THEREOF; PROPAGATING, PRESERVING, OR MAINTAINING MICROORGANISMS; MUTATION OR GENETIC ENGINEERING; CULTURE MEDIA
    • C12N5/00—Undifferentiated human, animal or plant cells, e.g. cell lines; Tissues; Cultivation or maintenance thereof; Culture media therefor
    • C12N5/0018—Culture media for cell or tissue culture
    • C12N5/0037—Serum-free medium, which may still contain naturally-sourced components
    • C—CHEMISTRY; METALLURGY
    • C12—BIOCHEMISTRY; BEER; SPIRITS; WINE; VINEGAR; MICROBIOLOGY; ENZYMOLOGY; MUTATION OR GENETIC ENGINEERING
    • C12N—MICROORGANISMS OR ENZYMES; COMPOSITIONS THEREOF; PROPAGATING, PRESERVING, OR MAINTAINING MICROORGANISMS; MUTATION OR GENETIC ENGINEERING; CULTURE MEDIA
    • C12N5/00—Undifferentiated human, animal or plant cells, e.g. cell lines; Tissues; Cultivation or maintenance thereof; Culture media therefor
    • C12N5/0018—Culture media for cell or tissue culture
    • C—CHEMISTRY; METALLURGY
    • C07—ORGANIC CHEMISTRY
    • C07K—PEPTIDES
    • C07K14/00—Peptides having more than 20 amino acids; Gastrins; Somatostatins; Melanotropins; Derivatives thereof
    • C07K14/435—Peptides having more than 20 amino acids; Gastrins; Somatostatins; Melanotropins; Derivatives thereof from animals; from humans
    • C07K14/745—Blood coagulation or fibrinolysis factors
    • C07K14/755—Factors VIII, e.g. factor VIII C (AHF), factor VIII Ag (VWF)
    • C—CHEMISTRY; METALLURGY
    • C12—BIOCHEMISTRY; BEER; SPIRITS; WINE; VINEGAR; MICROBIOLOGY; ENZYMOLOGY; MUTATION OR GENETIC ENGINEERING
    • C12N—MICROORGANISMS OR ENZYMES; COMPOSITIONS THEREOF; PROPAGATING, PRESERVING, OR MAINTAINING MICROORGANISMS; MUTATION OR GENETIC ENGINEERING; CULTURE MEDIA
    • C12N5/00—Undifferentiated human, animal or plant cells, e.g. cell lines; Tissues; Cultivation or maintenance thereof; Culture media therefor
    • C12N5/0018—Culture media for cell or tissue culture
    • C12N5/0031—Serum-free culture media
    • G—PHYSICS
    • G01—MEASURING; TESTING
    • G01N—INVESTIGATING OR ANALYSING MATERIALS BY DETERMINING THEIR CHEMICAL OR PHYSICAL PROPERTIES
    • G01N31/00—Investigating or analysing non-biological materials by the use of the chemical methods specified in the subgroup; Apparatus specially adapted for such methods
    • G01N31/22—Investigating or analysing non-biological materials by the use of the chemical methods specified in the subgroup; Apparatus specially adapted for such methods using chemical indicators
    • G01N31/221—Investigating or analysing non-biological materials by the use of the chemical methods specified in the subgroup; Apparatus specially adapted for such methods using chemical indicators for investigating pH value
    • C—CHEMISTRY; METALLURGY
    • C12—BIOCHEMISTRY; BEER; SPIRITS; WINE; VINEGAR; MICROBIOLOGY; ENZYMOLOGY; MUTATION OR GENETIC ENGINEERING
    • C12N—MICROORGANISMS OR ENZYMES; COMPOSITIONS THEREOF; PROPAGATING, PRESERVING, OR MAINTAINING MICROORGANISMS; MUTATION OR GENETIC ENGINEERING; CULTURE MEDIA
    • C12N2500/00—Specific components of cell culture medium
    • C12N2500/05—Inorganic components
    • C—CHEMISTRY; METALLURGY
    • C12—BIOCHEMISTRY; BEER; SPIRITS; WINE; VINEGAR; MICROBIOLOGY; ENZYMOLOGY; MUTATION OR GENETIC ENGINEERING
    • C12N—MICROORGANISMS OR ENZYMES; COMPOSITIONS THEREOF; PROPAGATING, PRESERVING, OR MAINTAINING MICROORGANISMS; MUTATION OR GENETIC ENGINEERING; CULTURE MEDIA
    • C12N2500/00—Specific components of cell culture medium
    • C12N2500/05—Inorganic components
    • C12N2500/10—Metals; Metal chelators
    • C12N2500/12—Light metals, i.e. alkali, alkaline earth, Be, Al, Mg
    • C12N2500/14—Calcium; Ca chelators; Calcitonin
    • C—CHEMISTRY; METALLURGY
    • C12—BIOCHEMISTRY; BEER; SPIRITS; WINE; VINEGAR; MICROBIOLOGY; ENZYMOLOGY; MUTATION OR GENETIC ENGINEERING
    • C12N—MICROORGANISMS OR ENZYMES; COMPOSITIONS THEREOF; PROPAGATING, PRESERVING, OR MAINTAINING MICROORGANISMS; MUTATION OR GENETIC ENGINEERING; CULTURE MEDIA
    • C12N2500/00—Specific components of cell culture medium
    • C12N2500/05—Inorganic components
    • C12N2500/10—Metals; Metal chelators
    • C12N2500/20—Transition metals
    • C12N2500/22—Zinc; Zn chelators
    • C—CHEMISTRY; METALLURGY
    • C12—BIOCHEMISTRY; BEER; SPIRITS; WINE; VINEGAR; MICROBIOLOGY; ENZYMOLOGY; MUTATION OR GENETIC ENGINEERING
    • C12N—MICROORGANISMS OR ENZYMES; COMPOSITIONS THEREOF; PROPAGATING, PRESERVING, OR MAINTAINING MICROORGANISMS; MUTATION OR GENETIC ENGINEERING; CULTURE MEDIA
    • C12N2500/00—Specific components of cell culture medium
    • C12N2500/05—Inorganic components
    • C12N2500/10—Metals; Metal chelators
    • C12N2500/20—Transition metals
    • C12N2500/24—Iron; Fe chelators; Transferrin
    • C—CHEMISTRY; METALLURGY
    • C12—BIOCHEMISTRY; BEER; SPIRITS; WINE; VINEGAR; MICROBIOLOGY; ENZYMOLOGY; MUTATION OR GENETIC ENGINEERING
    • C12N—MICROORGANISMS OR ENZYMES; COMPOSITIONS THEREOF; PROPAGATING, PRESERVING, OR MAINTAINING MICROORGANISMS; MUTATION OR GENETIC ENGINEERING; CULTURE MEDIA
    • C12N2500/00—Specific components of cell culture medium
    • C12N2500/30—Organic components
    • C12N2500/32—Amino acids
    • C—CHEMISTRY; METALLURGY
    • C12—BIOCHEMISTRY; BEER; SPIRITS; WINE; VINEGAR; MICROBIOLOGY; ENZYMOLOGY; MUTATION OR GENETIC ENGINEERING
    • C12N—MICROORGANISMS OR ENZYMES; COMPOSITIONS THEREOF; PROPAGATING, PRESERVING, OR MAINTAINING MICROORGANISMS; MUTATION OR GENETIC ENGINEERING; CULTURE MEDIA
    • C12N2500/00—Specific components of cell culture medium
    • C12N2500/30—Organic components
    • C12N2500/34—Sugars
    • C—CHEMISTRY; METALLURGY
    • C12—BIOCHEMISTRY; BEER; SPIRITS; WINE; VINEGAR; MICROBIOLOGY; ENZYMOLOGY; MUTATION OR GENETIC ENGINEERING
    • C12N—MICROORGANISMS OR ENZYMES; COMPOSITIONS THEREOF; PROPAGATING, PRESERVING, OR MAINTAINING MICROORGANISMS; MUTATION OR GENETIC ENGINEERING; CULTURE MEDIA
    • C12N2500/00—Specific components of cell culture medium
    • C12N2500/30—Organic components
    • C12N2500/35—Polyols, e.g. glycerin, inositol
    • C—CHEMISTRY; METALLURGY
    • C12—BIOCHEMISTRY; BEER; SPIRITS; WINE; VINEGAR; MICROBIOLOGY; ENZYMOLOGY; MUTATION OR GENETIC ENGINEERING
    • C12N—MICROORGANISMS OR ENZYMES; COMPOSITIONS THEREOF; PROPAGATING, PRESERVING, OR MAINTAINING MICROORGANISMS; MUTATION OR GENETIC ENGINEERING; CULTURE MEDIA
    • C12N2500/00—Specific components of cell culture medium
    • C12N2500/30—Organic components
    • C12N2500/38—Vitamins
    • C—CHEMISTRY; METALLURGY
    • C12—BIOCHEMISTRY; BEER; SPIRITS; WINE; VINEGAR; MICROBIOLOGY; ENZYMOLOGY; MUTATION OR GENETIC ENGINEERING
    • C12N—MICROORGANISMS OR ENZYMES; COMPOSITIONS THEREOF; PROPAGATING, PRESERVING, OR MAINTAINING MICROORGANISMS; MUTATION OR GENETIC ENGINEERING; CULTURE MEDIA
    • C12N2500/00—Specific components of cell culture medium
    • C12N2500/30—Organic components
    • C12N2500/42—Organic phosphate, e.g. beta glycerophosphate
    • C—CHEMISTRY; METALLURGY
    • C12—BIOCHEMISTRY; BEER; SPIRITS; WINE; VINEGAR; MICROBIOLOGY; ENZYMOLOGY; MUTATION OR GENETIC ENGINEERING
    • C12N—MICROORGANISMS OR ENZYMES; COMPOSITIONS THEREOF; PROPAGATING, PRESERVING, OR MAINTAINING MICROORGANISMS; MUTATION OR GENETIC ENGINEERING; CULTURE MEDIA
    • C12N2500/00—Specific components of cell culture medium
    • C12N2500/30—Organic components
    • C12N2500/44—Thiols, e.g. mercaptoethanol
    • C—CHEMISTRY; METALLURGY
    • C12—BIOCHEMISTRY; BEER; SPIRITS; WINE; VINEGAR; MICROBIOLOGY; ENZYMOLOGY; MUTATION OR GENETIC ENGINEERING
    • C12N—MICROORGANISMS OR ENZYMES; COMPOSITIONS THEREOF; PROPAGATING, PRESERVING, OR MAINTAINING MICROORGANISMS; MUTATION OR GENETIC ENGINEERING; CULTURE MEDIA
    • C12N2500/00—Specific components of cell culture medium
    • C12N2500/30—Organic components
    • C12N2500/46—Amines, e.g. putrescine
    • C—CHEMISTRY; METALLURGY
    • C12—BIOCHEMISTRY; BEER; SPIRITS; WINE; VINEGAR; MICROBIOLOGY; ENZYMOLOGY; MUTATION OR GENETIC ENGINEERING
    • C12N—MICROORGANISMS OR ENZYMES; COMPOSITIONS THEREOF; PROPAGATING, PRESERVING, OR MAINTAINING MICROORGANISMS; MUTATION OR GENETIC ENGINEERING; CULTURE MEDIA
    • C12N2500/00—Specific components of cell culture medium
    • C12N2500/60—Buffer, e.g. pH regulation, osmotic pressure
    • C—CHEMISTRY; METALLURGY
    • C12—BIOCHEMISTRY; BEER; SPIRITS; WINE; VINEGAR; MICROBIOLOGY; ENZYMOLOGY; MUTATION OR GENETIC ENGINEERING
    • C12N—MICROORGANISMS OR ENZYMES; COMPOSITIONS THEREOF; PROPAGATING, PRESERVING, OR MAINTAINING MICROORGANISMS; MUTATION OR GENETIC ENGINEERING; CULTURE MEDIA
    • C12N2501/00—Active agents used in cell culture processes, e.g. differentation
    • C12N2501/10—Growth factors
    • C—CHEMISTRY; METALLURGY
    • C12—BIOCHEMISTRY; BEER; SPIRITS; WINE; VINEGAR; MICROBIOLOGY; ENZYMOLOGY; MUTATION OR GENETIC ENGINEERING
    • C12N—MICROORGANISMS OR ENZYMES; COMPOSITIONS THEREOF; PROPAGATING, PRESERVING, OR MAINTAINING MICROORGANISMS; MUTATION OR GENETIC ENGINEERING; CULTURE MEDIA
    • C12N2501/00—Active agents used in cell culture processes, e.g. differentation
    • C12N2501/30—Hormones
    • C12N2501/33—Insulin

Landscapes

  • Health & Medical Sciences (AREA)
  • Life Sciences & Earth Sciences (AREA)
  • Engineering & Computer Science (AREA)
  • Biomedical Technology (AREA)
  • Biotechnology (AREA)
  • Chemical & Material Sciences (AREA)
  • Organic Chemistry (AREA)
  • Genetics & Genomics (AREA)
  • Zoology (AREA)
  • Bioinformatics & Cheminformatics (AREA)
  • Wood Science & Technology (AREA)
  • General Health & Medical Sciences (AREA)
  • Biochemistry (AREA)
  • General Engineering & Computer Science (AREA)
  • Microbiology (AREA)
  • Cell Biology (AREA)
  • Biophysics (AREA)
  • Molecular Biology (AREA)
  • General Physics & Mathematics (AREA)
  • Analytical Chemistry (AREA)
  • Physics & Mathematics (AREA)
  • Immunology (AREA)
  • Pathology (AREA)
  • Hematology (AREA)
  • Toxicology (AREA)
  • Gastroenterology & Hepatology (AREA)
  • Medicinal Chemistry (AREA)
  • Proteomics, Peptides & Aminoacids (AREA)
  • Micro-Organisms Or Cultivation Processes Thereof (AREA)
  • Peptides Or Proteins (AREA)

Abstract

本发明提供复合细胞培养基粉末制剂，其包含：基础培养基粉末和细胞培养基补充剂，其中所述细胞培养基补充剂包含：一种或多种盐；一种或多种生长因子；一种或多种无机离子；包含天冬酰胺、谷氨酰胺、组氨酸和丝氨酸中的一种或多种的氨基酸补充剂；一种或多种缓冲剂；和一种或多种消泡剂。本发明进一步提供制备复合细胞培养基粉末制剂的方法，制备用于培养哺乳动物细胞的细胞培养基的方法和通过在所述细胞培养基中培养细胞并分离目标蛋白来产生目标蛋白的方法。

Description

复合培养基粉末制剂和制备用于细胞培养的液体培养基的 方法
电子提交材料的通过引用并入
在此同时提交且标识如下：名称为“序列表_ST25.txt”的一个（66,989字节ASCII（文本））文件（其创建于2014年4月10日）的计算机可读序列表以其整体通过引用并入本文。
领域
本发明涉及细胞生物学和细胞培养的领域。
背景
用于使真核细胞在培养物中培养的各种培养基描述于文献中且可市售。细胞培养基的作用是为细胞提供合适的pH和摩尔渗透压浓度以及细胞存活、生长和蛋白表达所必需的营养物。
一些常见的基础培养基的实例是RPMI培养基1640、培养基199、最小必需培养基(MEM)培养基(用于贴壁的哺乳动物细胞生长的“最小”培养基)、用于在CO2不存在的情况下生长的Leibovitz培养基、Dulbecco氏改良的Eagle氏培养基和Ham氏F12培养基。各种培养基彼此的区别在于它们在精确的氨基酸、维生素、有机盐、痕量元素和促进培养细胞的生长(和蛋白表达)的其他有机化合物中含有不同的组分。
最佳细胞培养基的开发是非常重要的，因为各种组分的变化可以导致细胞生长的意料之外的改善、增加的生长速率、生长至高细胞密度、控制细胞分化的阶段和量的改善、增加的蛋白分泌、增加的表型和遗传稳定性以及许多细胞类型的衰老的消除，当以商业规模产生重组蛋白时，其中所有都是重要的特性。
细胞培养基的制备，特别是在商业设置中，是复杂的，并且通常需要以依次方式储备、转移、制备和储存多种储备溶液和粉末以及配料(batching)。培养基制备中的大量工艺步骤和组分降低效率并增加成本；它们也可以引入可变性，这进而可以影响细胞的生长和蛋白产生。水合也是待克服的重要障碍，因为随着越来越多的组分被添加至培养基制剂中，变得更困难且更不可预测地完全水合和溶解组分以实现均匀的混合物和最佳的重量摩尔渗透压浓度，这是由于组合物的富集性和复杂性，以及各种组分间的相互作用。由于该原因，一些组分经常在复杂培养基制剂中单独水合。然而，这导致生产期间的成本和复杂性增加。
因此，本领域仍然需要改进的/进一步复合的干培养基粉末(DMP)制剂及其制备方法，以降低复杂性和降低成本，同时维持完全水合的液体培养基中的正确组成以及类似的细胞培养性能和重组蛋白产生。
概述
在一个方面，本发明提供复合细胞培养基粉末制剂，其包含：基础培养基粉末和细胞培养基补充剂，其中所述细胞培养基补充剂包含：一种或多种盐；一种或多种生长因子；一种或多种无机离子；包含天冬酰胺、谷氨酰胺、组氨酸和丝氨酸中的一种或多种的氨基酸补充剂；一种或多种缓冲剂；和一种或多种消泡剂。
在一些实施方案中，所述基础培养基粉末包含Dulbecco氏改良的Eagle氏培养基、Ham氏培养基F12、Eagle氏最小必需培养基、RPMI 1640培养基、Dulbecco氏改良的Eagle氏培养基/Ham氏F12培养基(DMEM/F-12；1:1比率)及其组合或修改形式。
在一些实施方案中，所述基础培养基粉末包含以下组分的一种或多种或其组合：生物素、氯化钙、氯化胆碱、氰钴胺素(B12)、D+ 甘露糖、D-泛酸钙、右旋糖(无水)、DL-α-硫辛酸、硝酸铁9H20、硫酸亚铁7H20、叶酸、甘氨酸、次黄嘌呤、I-肌醇、L-丙氨酸、L-精氨酸、L-天冬酰胺、L-天冬氨酸、L-半胱氨酸HCl H20、L-胱氨酸2HCl、L-谷氨酸(无水)、L-谷氨酰胺、L-谷胱甘肽、L-组氨酸 FB、L-组氨酸 HCl、L-异亮氨酸、L-亮氨酸、L-赖氨酸、L-甲硫氨酸、L-苯丙氨酸、L-脯氨酸、L-丝氨酸、L-苏氨酸、L-色氨酸、L-酪氨酸、L-缬氨酸、氯化镁、无水硫酸镁、烟酰胺、O-磷酸乙醇胺、氯化钾、腐胺2HCl、吡哆醛HCl、吡哆醇HCl、核黄素、氯化钠、磷酸二氢钠H20、无水磷酸氢二钠、丙酮酸钠、硫胺素HCl、胸苷、硫酸锌7H20、硫酸铜、二氧化硒、亚油酸、β-巯基乙醇和乙醇胺游离碱FB。
在一些实施方案中，当所述复合细胞培养基粉末制剂与水组合以形成细胞培养基时，所述基础培养基粉末具有8-30 g/L的浓度。在一些实施方案中，当所述复合细胞培养基粉末制剂与水组合以形成细胞培养基时，所述基础培养基粉末具有12-14 g/L的浓度。在一些实施方案中，当所述复合细胞培养基粉末制剂与水组合以形成细胞培养基时，所述基础培养基粉末具有约13 g/L的浓度。
在一些实施方案中，所述复合细胞培养基粉末制剂进一步包含pH指示剂。在一些实施方案中，所述pH指示剂是酚红Na，其中当所述复合细胞培养基粉末制剂与水组合以形成细胞培养基时，所述酚红Na以约0.001至约0.02 g/L的浓度存在。在一些实施方案中，当所述复合细胞培养基粉末制剂与水组合以形成细胞培养基时，所述酚红Na以约0.0069 g/L的浓度存在。
在一些实施方案中，所述基础培养基粉末组分在水合以形成细胞培养基后提供以下最终浓度：
i) 0.0003-0.003 g/L生物素；
ii) 0.035-0.33 g/L氯化钙；
iii) 0.003-0.03 g/L氯化胆碱；
iv) 0.0002-0.002 g/L氰钴胺素 (B12)；
v) 1-10 g/L D+ 甘露糖；
vi) 0.001-0.01 g/L D-泛酸钙；
vii) 0.3-3.0 g/L右旋糖(无水)；
viii) 0.00003-0.0003 g/L DL-α-硫辛酸；
ix) 0.00002-0.00015 g/L 硝酸铁9H20；
x) 0.0001-0.0015 g/L 硫酸亚铁7H20；
xi) 0.001-0.01 g/L 叶酸；
xii) 0.007-0.20 g/L 甘氨酸；
xiii) 0.001-0.01 g/L 次黄嘌呤 2Na；
xiv) 0.005-0.05 g/L I-肌醇；
xv) 0.003-0.03 g/L L-丙氨酸；
xvi) 0.08-1.4 g/L L-精氨酸；
xvii) 0.006-0.16 g/L L-天冬酰胺；
xviii) 0.005-0.10 g/L L-天冬氨酸；
xix) 0.005-0.05 g/L L-半胱氨酸HCl H20；
xx) 0.02-0.2 g/L L-胱氨酸2HCl；
xxi) 0.005-0.15 g/L L-谷氨酸(无水)；
xxii) 0.02-1.5 g/L L-谷氨酰胺；
xxiii) 0.0003-0.003 g/L L-谷胱甘肽；
xxiv) 0.02-0.2 g/L L-组氨酸 HCl；
xxv) 0.03-0.9 g/L L-异亮氨酸；
xxvi) 0.03-0.9 g/L L-亮氨酸；
xxvii) 0.05-1.5 g/L L-赖氨酸；
xxviii) 0.01-0.3 g/L L-甲硫氨酸；
xxix) 0.02-0.6 g/L L-苯丙氨酸；
xxx) 0.008-0.25 g/L L-脯氨酸；
xxxi) 0.009-0.25 g/L L-丝氨酸；
xxxii) 0.03-0.9 g/L L-苏氨酸；
xxxiii) 0.006-0.16 g/L L-色氨酸；
xxxiv) 0.03-0.9 g/L L-酪氨酸 2Na 2H2O；
xxxv) 0.03-0.9 g/L L-缬氨酸；
xxxvi) 0.01-0.18 g/L 氯化镁；
xxxvii) 0.02-0.12 g/L 无水硫酸镁；
xxxviii) 0.001-0.01 g/L 烟酰胺；
xxxix) 0.0005-0.005 g/L O-磷酸-乙醇胺；
xl) 0.1-1.0 g/L 氯化钾；
xli) 0.00002-0.0002 g/L 腐胺2HCl；
xlii) 0.001-0.01 g/L 吡哆醛HCl；
xliii) 0.00001-0.0001 g/L 吡哆醇HCl，
xliv) 0.0001-0.001 g/L 核黄素，
xlv) 2.0-15 g/L 氯化钠，
xlvi) 0.02-0.2 g/L 磷酸二氢钠H20，
xlvii) 0.02-0.2 g/L 无水磷酸氢二钠，
xlviii) 0.015-0.15 g/L 丙酮酸钠，
xlix) 0.001-0.01 g/L 硫胺素HCl，
l) 0.0001-0.001 g/L 胸苷，
li) 0.00015-0.0015 g/L 硫酸锌7H20，
lii) 0.0000006-0.000006 g/L 硫酸铜5H2O，
liii) 0.0000005-0.000008 g/L 二氧化硒，
liv) 0.00001-0.0001 g/L 亚油酸，
lv) 0.0001-0.001 g/L β-巯基乙醇；和
lvi) 0.0003-0.005 g/L 乙醇胺FB。
在一些实施方案中，所述基础培养基粉末组分在水合以形成细胞培养基后提供以下最终浓度：
i) 约0.001 g/L 生物素；
ii) 约0.11665 g/L 氯化钙；
iii) 约0.00998 g/L 氯化胆碱；
iv) 约0.00068 g/L 氰钴胺素 (B12)；
v) 约3 g/L D+ 甘露糖；
vi) 约0.00312 g/L D-泛酸钙；
vii) 约1 g/L 右旋糖(无水)；
viii) 约0.000103 g/L DL-α-硫辛酸；
ix) 约0.00005 g/L 硝酸铁9H20；
x) 约0.000417 g/L 硫酸亚铁7H20；
xi) 约0.00366 g/L 叶酸；
xii) 约0.02626 g/L 甘氨酸；
xiii) 约0.0027 g/L 次黄嘌呤 2Na；
xiv) 约0.01451 g/L I-肌醇；
xv) 约0.01336 g/L L-丙氨酸；
xvi) 约0.27435 g/L L-精氨酸；
xvii) 约0.0225 g/L L-天冬酰胺；
xviii) 约0.01995 g/L L-天冬氨酸；
xix) 约0.01756 g/L L-半胱氨酸HCl H20；
xx) 约0.06256 g/L L-胱氨酸2HCl；
xxi) 约0.02206 g/L L-谷氨酸(无水)；
xxii) 约0.73 g/L L-谷氨酰胺；
xxiii) 约0.001 g/L L-谷胱甘肽；
xxiv) 约0.07348 g/L L-组氨酸 HCl；
xxv) 约0.1057 g/L L-异亮氨酸；
xxvi) 约0.11096 g/L L-亮氨酸；
xxvii) 约0.16385 g/L L-赖氨酸；
xxviii) 约0.03224 g/L L-甲硫氨酸；
xxix) 约0.06748 g/L L-苯丙氨酸；
xxx) 约0.02875 g/L L-脯氨酸；
xxxi) 约0.03676 g/L L-丝氨酸；
xxxii) 约0.10156 g/L L-苏氨酸；
xxxiii) 约0.01902 g/L L-色氨酸；
xxxiv) 约0.10771 g/L L-酪氨酸 2Na 2H2O；
xxxv) 约0.09866 g/L L-缬氨酸；
xxxvi) 约0.028 g/L 氯化镁；
xxxvii) 约0.04884 g/L 无水硫酸镁；
xxxviii) 约0.00302 g/L 烟酰胺；
xxxix) 约0.0014 g/L O-磷酸乙醇胺；
xl) 约0.31182 g/L 氯化钾；
xli) 约0.000081 g/L 腐胺2HCl；
xlii) 约0.003 g/L 吡哆醛HCl；
xliii) 约0.000031 g/L 吡哆醇HCl，
xliv) 约0.000319 g/L 核黄素，
xlv) 约6.1234 g/L 氯化钠，
xlvi) 约0.0625 g/L 磷酸二氢钠H20，
xlvii) 约0.07099 g/L 无水磷酸氢二钠，
xlviii) 约0.055 丙酮酸钠，
xlix) 约0.00317 g/L 硫胺素HCl，
l) 约0.000364 g/L 胸苷，
li) 约0.000432 g/L 硫酸锌7H20，
lii) 约0.00000125 g/L 硫酸铜5H2O，
liii) 约0.00000222 g/L 二氧化硒，
liv) 约0.000042 g/L 亚油酸，
lv) 约0.00039065 g/L β-巯基乙醇；和
lvi) 约0.0012 g/L 乙醇胺FB。
在一些实施方案中，所述细胞培养基补充剂的一种或多种盐在水合以形成细胞培养基后包含浓度为0.5-5 g/L的氯化镁。在一些实施方案中，氯化镁在水合以形成细胞培养基后具有约1.428 g/L的浓度。
在一些实施方案中，所述细胞培养基补充剂包含重组胰岛素作为生长因子。在一些实施方案中，胰岛素在水合以形成细胞培养基后具有0.5-15 mg/L的浓度。在一些实施方案中，胰岛素在水合以形成细胞培养基后具有约3 mg/L的浓度。
在一些实施方案中，所述细胞培养基补充剂的一种或多种无机离子包含选自钼酸铵、硫酸铬钾、硫酸铜、氯化锂、硫酸锰、偏硅酸钠及其组合的痕量金属。在一些实施方案中，所述钼酸铵是钼酸铵4H2O；所述硫酸铬钾是硫酸铬钾12H2O，所述硫酸铜是硫酸铜5H2O，所述氯化锂是氯化锂(无水)，所述硫酸锰是硫酸锰H2O，且所述偏硅酸钠是偏硅酸钠9H2O。
在一些实施方案中，所述痕量金属在水合以形成细胞培养基后提供以下最终浓度：
i) 0.0005-0.01 mg/L钼酸铵4H2O；
ii) 0.0001-0.01 mg/L硫酸铬钾12H2O；
iii) 0.001-0.125 mg/L硫酸铜5H2O；
iv) 0.001-0.1 mg/L氯化锂(无水)；
v) 0.00004-0.004 mg/L硫酸锰H2O；和
vi) 0.04-4.2 mg/L偏硅酸钠9H2O。
在一些实施方案中，所述细胞培养基补充剂包含钼酸铵4H2O、硫酸铬钾12H2O、硫酸铜5H2O、氯化锂(无水)、硫酸锰H2O和偏硅酸钠9H2O的组合。在一些实施方案中，所述痕量金属在水合以形成细胞培养基后提供以下最终浓度：
i) 约0.0037 mg/L钼酸铵4H2O；
ii) 约0.001 mg/L硫酸铬钾12H2O；
iii) 约0.0125 mg/L硫酸铜5H2O；
iv) 约0.01 mg/L氯化锂(无水)；
v) 约0.000452 mg/L硫酸锰H2O；和
vi) 约0.4263 mg/L偏硅酸钠9H2O。
在一些实施方案中，所述细胞培养基补充剂的氨基酸补充剂包含天冬酰胺H2O、谷氨酰胺、组氨酸和丝氨酸的组合。在一些实施方案中，所述氨基酸补充剂在水合以形成细胞培养基后具有以下最终浓度：
i) 0.007-0.07 g/L 天冬酰胺H2O；
ii) 0.25-2.5 g/L 谷氨酰胺；
iii) 0.5-5.0 g/L 组氨酸，游离碱；和
iv) 0.01-0.1 g/L 丝氨酸。
在一些实施方案中，所述氨基酸补充剂在水合以形成细胞培养基后具有以下最终浓度：
i) 约0.0225 g/L 天冬酰胺H2O；
ii) 约0.73 g/L 谷氨酰胺；
iii) 约1.552 g/L 组氨酸；和
iv) 约0.03676 g/L 丝氨酸。
在一些实施方案中，所述细胞培养基补充剂的一种或多种缓冲剂选自3-(N-吗啉代)丙磺酸(MOPS)游离酸、3-(N-吗啉代)丙磺酸(MOPS) Na、羟乙基哌嗪乙磺酸(HEPES)和碳酸氢钠。在一些实施方案中，所述制剂包含MOPS游离酸和MOPS Na的组合。在一些实施方案中，所述缓冲剂在水合以形成细胞培养基后提供以下最终浓度：
i) 0.3-3 g/L MOPS游离酸；和
ii) 1.0-10 g/L MOPS Na。
在一些实施方案中，所述细胞培养基补充剂的消泡剂包含基于环氧乙烷和环氧丙烷的多元醇共聚物。在一些实施方案中，所述消泡剂是Pluronic F68。在一些实施方案中，所述Pluronic F68在水合以形成细胞培养基后具有0.1-10 g/L的浓度。在一些实施方案中，所述Pluronic F68在水合以形成细胞培养基后具有约1 g/L的浓度。
在另一个方面，本发明提供制备本发明的复合细胞培养基粉末制剂的方法，其包括组合基础培养基粉末；一种或多种盐；一种或多种生长因子；一种或多种无机离子；包含天冬酰胺、谷氨酰胺、组氨酸和丝氨酸中的一种或多种的氨基酸补充剂；一种或多种缓冲剂；和一种或多种消泡剂。
在另一个方面，本发明提供制备用于培养哺乳动物细胞的细胞培养基的方法，其包括使所述复合细胞培养基粉末制剂与水接触，由此制备用于培养哺乳动物细胞的细胞培养基。在一些实施方案中，所述组分基本上溶解于水中。在一些实施方案中，所述方法进一步包括组合包含FeSO4 7H2O和螯合剂的溶液。在一些实施方案中，所述螯合剂是乙二胺四乙酸(EDTA)。在一些实施方案中，FeSO4 7H2O和EDTA在细胞培养基中具有以下最终浓度：0.004-0.04 g/L FeSO4 7H2O；和0.006-0.06 g/L EDTA。在一些实施方案中，FeSO4 7H2O和EDTA在细胞培养基中具有以下最终浓度：约0.0138g/L FeSO4 7H2O；和约0.018625 g/LEDTA。
在另一个实施方案中，所述方法进一步包括使本发明的细胞培养基与细胞接触。在一些实施方案中，所述细胞是哺乳动物细胞。
在另一个实施方案中，本发明提供培养细胞的方法，其包括使细胞与本发明的细胞培养基接触，和在培养基中培养细胞一段时间。
在另一个实施方案中，本发明提供产生目标蛋白的方法，其包括使表达目标蛋白的细胞与细胞培养基接触；在所述培养基中培养所述细胞一段时间；和从所述细胞培养基分离目标蛋白。
在一些实施方案中，所述哺乳动物细胞选自中国仓鼠卵巢(CHO)细胞、DP12 CHO细胞、DG44 CHO细胞、人胚肾(HEK)细胞、HEK 293细胞和幼仓鼠肾(BHK)细胞。在一些实施方案中，所述哺乳动物细胞重组表达目标蛋白。在一些实施方案中，所述目标蛋白选自凝血因子VIII (FVIII)、其变体和片段。在一些实施方案中，所述FVIII选自野生型FVIII、B结构域缺失的FVIII和与生物相容性聚合物缀合的FVIII。在一些实施方案中，所述生物相容性聚合物是聚乙二醇(PEG)。在一些实施方案中，PEG在因子VIII氨基酸位置81、129、377、378、468、487、491、504、556、570、711、1648、1795、1796、1803、1804、1808、1810、1864、1903、1911、2091、2118和2284中的一个或多个处共价连接至多肽。
本文记载本教导的这些和其他特征。
附图简述
技术人员将理解，下面描述的附图仅用于说明目的。附图不意在以任何方式限制本教导的范围。
图1.非复合培养基制备的说明。基础培养基粉末中含有大多数(例如，57种)培养基组分，其可以预混合。将额外培养基组分分别添加至其各自目标最终浓度以完成配制。FeSO4 / EDTA、痕量金属组和rH胰岛素作为储备溶液制备，并作为液体添加至培养基批料中，而氯化镁和补充剂作为粉末添加。完全培养基含有基本细胞营养物、盐、碳水化合物、抗剪切因子、氨基酸、维生素、痕量金属、胰岛素和各种其他有助于细胞生长和重组蛋白产生并稳定从细胞分泌的重组蛋白产物的化学品。
图2.使用本文称为“复合”的(几乎完全复合的)制剂制备细胞培养基的举例说明。硫酸亚铁/EDTA不能复合，显然是由于EDTA对其他(存在于培养基中的)二价痕量金属的意外螯合，因此分开添加。
图3. 使用目前和复合制备方法的细胞培养运行表明相似的生长特性、代谢和产物效价(测量为效力)。使用基础培养基粉末(v.1)和依次补充剂添加(图1)和使用仅添加硫酸亚铁/EDTA的复合培养基粉末(v3.3)(图2)的标准方式制备培养基，并且其用于在1L灌注生物反应器运行中培养表达rFVIII的细胞。在从非复合培养基移至复合培养基之后，细胞培养物性能和rFVIII效价(效力)无明显变化。
详述
本发明人已开发了可用于制备细胞培养基和用于重组蛋白产生的复合细胞培养基粉末制剂。本文描述了复合哺乳动物细胞培养基粉末的制剂，所述制剂的制备方法和水合方法，除了本文所述的其他优点，这可降低成本，简化工作流程并降低培养基制备的复杂性 -所有这些在商业环境中尤其重要。
为了解释本说明书的目的，以下定义将适用，并且每当适当时，以单数使用的术语也将包括复数，反之亦然。在下文记载的任何定义与该词在任何其他文件(包括通过引用并入本文的任何文件)中的用法冲突的情况下，出于解释本说明书及其相关权利要求的目的，总是以下文记载的定义为准，除非明确意欲相反含义(例如在最初使用该术语的文件中)。除非另有说明，“或”的使用意指“和/或”。除非另有说明或当“一个/种或多个/种”的使用明显不适当时，本文中的“一个/种(a)”的使用意指“一个/种或多个/种”。“包含(comprise)”、“包含(comprises)”、“包含(comprising)”、“包括(include)”、“包括(includes)”和“包括(including)”的使用是可互换的，并且不意欲限制。此外，当一个或多个实施方案的描述使用术语“包含”时，本领域技术人员将理解，在一些特定情况下，可以可替代地使用语言“基本上由...组成”和/或“由...组成”来描述一个或多个实施方案。
除非另有定义，本文使用的所有技术和科学术语具有与本发明所属领域的普通技术人员通常理解的相同的含义。以下参考文献为技术人员提供本发明中使用的许多术语的一般定义：Academic Press Dictionary of Science and Technology, Morris (编),Academic Press (第1版, 1992); Oxford Dictionary of Biochemistry and Molecular Biology, Smith等人 (编), Oxford University Press (修订版, 2000);Encyclopaedic Dictionary of Chemistry, Kumar (编), Anmol Publications Pvt.Ltd. (2002); Dictionary of Microbiology and Molecular Biology, Singleton等人(编), John Wiley & Sons (第3版, 2002); Dictionary of Chemistry, Hunt (编),Routledge (第1版, 1999); Dictionary of Pharmaceutical Medicine, Nahler (编),Springer-Verlag Telos (1994); Dictionary of Organic Chemistry, Kumar 和Anandand (编), Anmol Publications Pvt. Ltd. (2002);和A Dictionary of Biology (Oxford Paperback Reference), Martin和Hine (编), Oxford University Press (第4版, 2000)。对于本领域的定义和术语，从业人员还涉及Sambrook等人 (1989) Molecular Cloning: A Laboratory Manual (第二版), Cold Spring Harbor Press, Plainview,N.Y.; Ausubel F M等人 (1993)和Current Protocols in Molecular Biology, JohnWiley & Sons, New York, N.Y.; 以及Gelvin和Schilperoot, 编(1997)。本文提供了这些术语中的一些术语的进一步阐述，如同它们特别适用于本发明一样。
关于组合物的术语“约”是指±最高达20％的范围。
如本文所使用，术语“细胞(cell)”、“细胞(cells)”、“细胞系”、“宿主细胞 (hostcell)”和“宿主细胞(host cells)”可互换使用，并且涵盖植物和动物细胞，并且包括无脊椎动物、非哺乳类脊椎动物和哺乳动物细胞。所有此类名称包括细胞群体和后代。因此，术语“转化子”和“转染子”包括原代主体细胞和由此衍生的细胞系，不考虑转移次数。示例性非哺乳类脊椎动物细胞包括，例如，禽类细胞、爬行动物细胞和两栖动物细胞。示例性无脊椎动物细胞包括但不限于昆虫细胞，诸如例如蠋(草地贪夜蛾(Spodoptera frugiperda))细胞、蚊(埃及伊蚊(Aedes aegypti))细胞、果蝇(黑腹果蝇(Drosophila melanogaster))细胞、Schneider细胞和家蚕(Bombyx mori)细胞。参见，例如，Luckow等人, Bio/ Technology 6:47-55 (1988)。细胞可以是分化、部分分化或未分化的，例如干细胞，包括胚胎干细胞和多能干细胞。来源于器官或器官系统的额外组织样品可以根据本发明使用。
术语“细胞培养”或“组织培养”是指在容器诸如滚瓶、组织培养烧瓶、皿、多孔板等中悬浮生长或贴壁至各种表面或基底生长的细胞。术语 “细胞培养”还涵盖大规模方法，诸如生物反应器，包括在搅动发酵罐中附着至微载体生长的贴壁细胞。此外，在本发明的方法中不仅可以培养接触依赖性细胞，而且可以使用悬浮培养技术。示例性微载体包括，例如，葡聚糖、胶原、塑料、明胶和纤维素以及如Butler, Spier & Griffiths, Animal cell Biotechnology 3:283-303 (1988)中描述的其他微载体。还可以使用多孔载体诸如例如CytolineTM或CytoporeTM，以及基于葡聚糖的载体诸如DEAE-葡聚糖(Cytodex 1TM季铵包被的葡聚糖(CytodexTM))，或者基于明胶的载体诸如明胶包被的葡聚糖(Cytodex 3TM)。本发明涵盖大规模和小规模蛋白生产的细胞培养程序。可以使用程序，包括但不限于，流化床生物反应器、中空纤维生物反应器、滚瓶培养或搅拌罐生物反应器系统，其有或无微载体，并且可选地以分批、补料分批或灌注模式操作。
术语“哺乳动物宿主细胞”、“哺乳动物细胞”、“哺乳动物重组宿主细胞”等是指来源于哺乳动物的细胞系，其当以含有适当营养物和生长因子的培养基中的单层培养物或悬浮培养物放置时能够生长和存活。示例性哺乳动物细胞包括，例如，来源于人、非人灵长类、猫、狗、绵羊、山羊、奶牛、马、猪、兔、啮齿类包括小鼠、仓鼠、大鼠和豚鼠的细胞，及其任何衍生物和后代。通常，所述细胞能够表达和向培养基中分泌大量的特定目标蛋白(通常是重组蛋白)，并且为此目的进行培养。然而，所述细胞同样可以培养用于多种其他目的，并且本发明的范围不限于仅培养用于产生重组蛋白的细胞。能够在本发明的培养基中生长的合适的哺乳动物细胞系的实例，包括由SV40转化的猴肾CVI系(COS-7, ATCC® CRL 1651)；人胚肾细胞系293S (Graham等人, J. Gen. Virolo., 36:59 (1977))；幼仓鼠肾细胞(BHK, ATCC® CCL 10)；小鼠塞尔托利氏细胞(TM4, Mather, Biol. Reprod., 23:243 (1980))；猴肾细胞(CVI-76, ATCC® CCL 70)；非洲绿猴肾细胞(VERO-76, ATCC® CRL-1587)；人宫颈癌细胞(HELA, ATCC® CCL 2)；犬肾细胞(MDCK, ATCC® CCL 34)；水牛大鼠肝细胞(BRL 3A,ATCC® CRL 1442)；人肺细胞(W138, ATCC® CCL 75)；人肝细胞(Hep G2, HB 8065)；小鼠乳腺肿瘤细胞(MMT 060562, ATCC® CCL SI)；大鼠肝癌细胞(HTC, MI.54, Baumann等人, J. Cell Biol., 85:1 (1980))；和TR-1细胞(Mather等人, Annals N.Y. Acad. Sci., 383:44 (1982))和杂交瘤细胞系。在一些实施方案中，中国仓鼠卵巢细胞(Urlab和Chasin,Proc. Natl. Acad. Sci. USA, 77:4216 (1980))可以在培养基中生长。适用于本发明方法中的CHO细胞也描述于以下文献中：1989年8月29日公开的EP 117,159; 美国专利号4,766,075; 4,853,330; 5,185,259; Lubiniecki等人, Advances in Animal Cell Biology and Technology for Bioprocesses, Spier等人, 编 (1989), 第442-451页。适用于本文中的已知CHO衍生物包括，例如，CHO/-DHFR (Urlaub和Chasin, Proc. Natl. Acad. Sci. USA, 77: 4216 (1980)), CHO-K1 DUX B11 (Simonsen和Levinson, Proc. Natl. Acad. Sci. USA 80: 2495-2499 (1983); Urlaub和Chasin, 同上)，以及dp12.CHO细胞(1989年3月15日公开的EP 307,247)。在一个实施方案中，可用于在培养基中生长的细胞选自中国仓鼠卵巢(CHO)细胞、DP12 CHO细胞、DG44 CHO细胞、人胚肾(HEK)细胞、HEK 293细胞和幼仓鼠肾(BHK)细胞。在一些实施方案中，所述细胞表达一种或多种目标蛋白。在一些实施方案中，所述细胞已工程改造以重组表达蛋白。
在一个实施方案中，本发明提供包含基础培养基粉末和细胞培养基补充剂的复合细胞培养基粉末制剂，其中所述细胞培养基补充剂包含一种或多种盐；一种或多种生长因子；一种或多种无机离子；包含天冬酰胺、谷氨酰胺、组氨酸和丝氨酸中的一种或多种的氨基酸补充剂；一种或多种缓冲剂；和一种或多种消泡剂。
所述复合细胞培养基粉末制剂通常用作“不含血清”的细胞培养基，其中所述培养基基本上不含来自任何哺乳动物来源的血清(例如胎牛血清(FBS))。“基本上不含”意味着所述细胞培养基包含约0-5％血清，优选约0-1％血清，最优选约0-0.1％血清。有利地，可以使用不含血清的“限定”培养基，其中所述培养基中每种组分的身份和浓度是已知的(即，未限定组分诸如牛垂体提取物(BPE)不存在于所述培养基中)。
尽管如此，本发明中描述的复合细胞培养干粉培养基也可以用于制剂中，其中添加来自各种来源的和/或动物的血清和/或其组合或衍生物(例如，FBS或人血浆蛋白级分溶液、HPPS、等等)，以生成用于培养细胞的最终制剂。
术语“基础培养基粉末”或“基础培养基”是指细胞培养基，其可以含有例如以下任何组分中的任何或全部：蛋白、脂质、碳水化合物、氨基酸、有机和/或无机盐、缓冲剂(例如，碳酸氢盐)、维生素、激素、抗生素和pH指示剂(例如，酚红)。可以根据本发明使用的细胞培养基基质的实例是非限制性的，且可以包括：Dulbecco氏改良的Eagle氏培养基(DMEM)、Ham氏F12培养基、MCDB培养基、Eagle最小必需培养基、RPMI培养基、Ames氏培养基、BGJb培养基(Fitton-Jackson改良形式)、Click氏培养基、CMRL-1066培养基、Fischer氏培养基、Glascow最小必需培养基(GMEM)、Iscove氏改良的Dulbecco氏培养基(IMDM)、L-15培养基(Leibovitz)、McCoy氏5A改良的培养基、NCTC 培养基、Swim氏S-77培养基、Waymouth培养基和William氏培养基E。在一些实施方案中，所述基础培养基粉末是上面列举的细胞培养基基质的组合或修改形式。在一些实施方案中，所述基础培养基粉末是Dulbecco氏改良的Eagle氏培养基/ Ham氏F12培养基(DMEM/F-12；1:1比率)。
在一些实施方案中，所述基础培养基粉末包含以下组分的一种或多种或其组合：生物素、氯化钙、氯化胆碱、氰钴胺素 (B12)、D+ 甘露糖、D-泛酸钙、右旋糖(无水)、DL-α-硫辛酸、硝酸铁9H20、硫酸亚铁7H20、叶酸、甘氨酸、次黄嘌呤、I-肌醇、L-丙氨酸、L-精氨酸、L-天冬酰胺、L-天冬氨酸、L-半胱氨酸HCl H20、L-胱氨酸2HCl、L-谷氨酸(无水)、L-谷氨酰胺、L-谷胱甘肽、L-组氨酸 FB、L-组氨酸 HCl、L-异亮氨酸、L-亮氨酸、L-赖氨酸、L-甲硫氨酸、L-苯丙氨酸、L-脯氨酸、L-丝氨酸、L-苏氨酸、L-色氨酸、L-酪氨酸、L-缬氨酸、氯化镁、无水硫酸镁、烟酰胺、O-磷酸乙醇胺、氯化钾、腐胺2HCl、吡哆醛HCl、吡哆醇HCl、核黄素、氯化钠、磷酸二氢钠H20、无水磷酸氢二钠、丙酮酸钠、硫胺素HCl、胸苷、硫酸锌7H20、硫酸铜、二氧化硒、亚油酸、β-巯基乙醇和乙醇胺游离碱FB。
细胞培养基组分通常可得自以下来源：Research Organics Inc.，UnitedBiochemicals，Angus Chemical Company，(Mikrochem) Bayer Biotechnology，KyowaHakko U.S.A. Inc.，Ferro/Pfanstiehl，Sigma-Aldrich Inc.，Research Organics Inc.，VWR Scientific Inc.，Ajinomoto AminoScience LLC，EMD MILLIPORE CORPORATION，Kyowa Hakko U.S.A. Inc.和Tilley Chemical Co., Inc。
在一些实施方案中，所述复合细胞培养基粉末制剂包含pH指示剂。所述pH指示剂不是限制性的，条件是其适合于细胞培养。在一些实施方案中，所述pH指示剂是酚红Na。在一些实施方案中，当所述复合细胞培养基粉末制剂与水组合以形成细胞培养基时，所述酚红Na以约0.001至约0.02 g/L的浓度存在。在一些实施方案中，所述酚红Na以约0.0069 g/L的浓度存在。
在一些实施方案中，所述基础培养基粉末包含以下组分，其在水合以形成细胞培养基后提供以下最终浓度：
i) 0.0003-0.003 g/L 生物素；
ii) 0.035-0.33 g/L 氯化钙；
iii) 0.003-0.03 g/L 氯化胆碱；
iv) 0.0002-0.002 g/L 氰钴胺素 (B12)；
v) 1-10 g/L D+ 甘露糖；
vi) 0.001-0.01 g/L D-泛酸钙；
vii) 0.3-3.0 g/L 右旋糖(无水)；
viii) 0.00003-0.0003 g/L DL-α-硫辛酸；
ix) 0.00002-0.00015 g/L 硝酸铁9H20；
x) 0.0001-0.0015 g/L 硫酸亚铁7H20；
xi) 0.001-0.01 g/L 叶酸；
xii) 0.007-0.20 g/L 甘氨酸；
xiii) 0.001-0.01 g/L 次黄嘌呤 2Na；
xiv) 0.005-0.05 g/L I-肌醇；
xv) 0.003-0.03 g/L L-丙氨酸；
xvi) 0.08-1.4 g/L L-精氨酸；
xvii) 0.006-0.16 g/L L-天冬酰胺；
xviii) 0.005-0.10 g/L L-天冬氨酸；
xix) 0.005-0.05 g/L L-半胱氨酸HCl H20；
xx) 0.02-0.2 g/L L-胱氨酸2HCl；
xxi) 0.005-0.15 g/L L-谷氨酸(无水)；
xxii) 0.02-1.5 g/L L-谷氨酰胺；
xxiii) 0.0003-0.003 g/L L-谷胱甘肽；
xxiv) 0.02-0.2 g/L L-组氨酸 HCl；
xxv) 0.03-0.9 g/L L-异亮氨酸；
xxvi) 0.03-0.9 g/L L-亮氨酸；
xxvii) 0.05-1.5 g/L L-赖氨酸；
xxviii) 0.01-0.3 g/L L-甲硫氨酸；
xxix) 0.02-0.6 g/L L-苯丙氨酸；
xxx) 0.008-0.25 g/L L-脯氨酸；
xxxi) 0.009-0.25 g/L L-丝氨酸；
xxxii) 0.03-0.9 g/L L-苏氨酸；
xxxiii) 0.006-0.16 g/L L-色氨酸；
xxxiv) 0.03-0.9 g/L L-酪氨酸 2Na 2H2O；
xxxv) 0.03-0.9 g/L L-缬氨酸；
xxxvi) 0.01-0.18 g/L 氯化镁 ；
xxxvii) 0.02-0.12 g/L 无水硫酸镁；
xxxviii) 0.001-0.01 g/L 烟酰胺；
xxxix) 0.0005-0.005 g/L O-磷酸乙醇胺；
xl) 0.1-1.0 g/L 氯化钾；
xli) 0.00002-0.0002 g/L 腐胺2HCl；
xlii) 0.001-0.01 g/L 吡哆醛HCl；
xliii) 0.00001-0.0001 g/L 吡哆醇HCl，
xliv) 0.0001-0.001 g/L 核黄素，
xlv) 2.0-15 g/L 氯化钠，
xlvi) 0.02-0.2 g/L 磷酸二氢钠H20，
xlvii) 0.02-0.2 g/L 无水磷酸氢二钠，
xlviii) 0.015-0.15 g/L 丙酮酸钠，
xlix) 0.001-0.01 g/L 硫胺素HCl，
l) 0.0001-0.001 g/L 胸苷，
li) 0.00015-0.0015 g/L 硫酸锌7H20，
lii) 0.0000006-0.000006 g/L 硫酸铜5H2O，
liii) 0.0000005-0.000008 g/L 二氧化硒，
liv) 0.00001-0.0001 g/L 亚油酸，
lv) 0.0001-0.001 g/L β-巯基乙醇；和
lvi) 0.0003-0.005 g/L 乙醇胺FB。
在一些实施方案中，所述基础培养基粉末包含以下组分，其在水合以形成细胞培养基后提供以下最终浓度：
i) 约0.001 g/L 生物素；
ii) 约0.11665 g/L 氯化钙；
iii) 约0.00998 g/L 氯化胆碱；
iv) 约0.00068 g/L 氰钴胺素 (B12)；
v) 约3 g/L D+ 甘露糖；
vi) 约0.00312 g/L D-泛酸钙；
vii) 约1 g/L 右旋糖(无水)；
viii) 约0.000103 g/L DL-α-硫辛酸；
ix) 约0.00005 g/L 硝酸铁9H20；
x) 约0.000417 g/L 硫酸亚铁7H20；
xi) 约0.00366 g/L 叶酸；
xii) 约0.02626 g/L 甘氨酸；
xiii) 约0.0027 g/L 次黄嘌呤 2Na；
xiv) 约0.01451 g/L I-肌醇；
xv) 约0.01336 g/L L-丙氨酸；
xvi) 约0.27435 g/L L-精氨酸；
xvii) 约0.0225 g/L L-天冬酰胺；
xviii) 约0.01995 g/L L-天冬氨酸；
xix) 约0.01756 g/L L-半胱氨酸HCl H20；
xx) 约0.06256 g/L L-胱氨酸2HCl；
xxi) 约0.02206 g/L L-谷氨酸(无水)；
xxii) 约0.73 g/L L-谷氨酰胺；
xxiii) 约0.001 g/L L-谷胱甘肽；
xxiv) 约0.07348 g/L L-组氨酸 HCl；
xxv) 约0.1057 g/L L-异亮氨酸；
xxvi) 约0.11096 g/L L-亮氨酸；
xxvii) 约0.16385 g/L L-赖氨酸；
xxviii) 约0.03224 g/L L-甲硫氨酸；
xxix) 约0.06748 g/L L-苯丙氨酸；
xxx) 约0.02875 g/L L-脯氨酸；
xxxi) 约0.03676 g/L L-丝氨酸；
xxxii) 约0.10156 g/L L-苏氨酸；
xxxiii) 约0.01902 g/L L-色氨酸；
xxxiv) 约0.10771 g/L L-酪氨酸 2Na 2H2O；
xxxv) 约0.09866 g/L L-缬氨酸；
xxxvi) 约0.028 g/L 氯化镁；
xxxvii) 约0.04884 g/L 无水硫酸镁；
xxxviii) 约0.00302 g/L 烟酰胺；
xxxix) 约0.0014 g/L O-磷酸乙醇胺；
xl) 约0.31182 g/L 氯化钾；
xli) 约0.000081 g/L 腐胺2HCl；
xlii) 约0.003 g/L 吡哆醛HCl；
xliii) 约0.000031 g/L 吡哆醇HCl，
xliv) 约0.000319 g/L 核黄素，
xlv) 约6.1234 g/L 氯化钠，
xlvi) 约0.0625 g/L 磷酸二氢钠H20，
xlvii) 约0.07099 g/L 无水磷酸氢二钠，
xlviii) 约0.055 丙酮酸钠，
xlix) 约0.00317 g/L 硫胺素HCl，
l) 约0.000364 g/L 胸苷，
li) 约0.000432 g/L 硫酸锌7H20，
lii) 约0.00000125 g/L 硫酸铜5H2O，
liii) 约0.00000222 g/L 二氧化硒，
liv) 约0.000042 g/L 亚油酸，
lv) 约0.00039065 g/L β-巯基乙醇；和
lvi) 约0.0012 g/L 乙醇胺FB。
可用于如本文所讨论的复合培养基制剂中的组分可以是无水或水合形式，并且所述组分的许多此类无水和水合形式是本领域技术人员已知的。例如，如上所示，在一些实施方案中，所述组合物包含硫酸铜、硫酸锌、磷酸二氢钠、L-酪氨酸、L-半胱氨酸、硝酸铁和硫酸亚铁的水合形式。这些组分中的每一种可以用无水形式代替，并且可以基于水合形式和无水形式之间的分子量差异重新计算浓度范围。同样，本说明书中提及的任何无水形式可以用水合形式代替，并且相应地重新计算浓度范围。
在一些实施方案中，所述基础培养基粉末在水合以形成细胞培养基后具有8-30g/L的浓度。在一些实施方案中，所述基础培养基粉末在水合以形成细胞培养基后具有12-14 g/L的浓度。在一些实施方案中，所述基础培养基粉末在水合以形成细胞培养基后具有约13 g/L的浓度。
所述细胞培养基补充剂的一种或多种盐不是限制性的，并且包括适合用于细胞培养中的任何盐和其水合状态。在一些实施方案中，所述一种或多种盐选自NaCl、KCl、NaH2PO4、NaHCO3、CaCl2和MgCl2及其组合。在一些实施方案中，所述补充剂中的盐的量在水合以形成细胞培养基后具有0.5-5 g/L的浓度。在一个实施方案中，所述细胞培养基补充剂的盐是氯化镁。在一些实施方案中，所述补充剂的氯化镁在水合以形成细胞培养基后具有约1.428 g/L的浓度。
所述细胞培养基补充剂的一种或多种生长因子不是限制性的。在一些实施方案中，所述生长因子是双调蛋白、血管生成素、β动物纤维素(Betacellulin)、(骨形态发生蛋白-13、骨形态发生蛋白-14、骨形态发生蛋白-2、人BMP-3、骨形态发生蛋白-4、人BMP-5、骨形态发生蛋白-6、骨形态发生蛋白-7、人CD135配体/Flt-3配体、人粒细胞集落刺激因子(G-CSF)、人粒细胞巨噬细胞集落刺激因子(GM-CSF)、人巨噬细胞集落刺激因子(M-CSF)、人畸胎瘤衍生生长因子-1、人CTGF(结缔组织生长因子)、人EGF(表皮生长因子)、人EG-VEGF(内分泌腺源性血管内皮生长因子)、人红细胞生成素(EPO)、人FGF(成纤维细胞生长因子1-23)、人GDF-11、人GDF-15、人GDF-8、人生长激素释放因子(GHRF、GRF、GHRH、生长激素释放激素)、人肝素结合性表皮生长因子(HB-EGF)、人肝细胞生长因子(HGF)、人调蛋白β1、人胰岛素、人IGF-1(胰岛素样生长因子-1)、人IGF-2(胰岛素样生长因子-2)、人IGFBP-1(胰岛素样生长因子结合蛋白1)、人IGFBP-3(胰岛素样生长因子结合蛋白3)、肠三叶因子(ITF)、人角质形成细胞生长因子1和2、人白血病抑制因子(LIF)、人MSP、人肌肉生长抑制素、人肌肉生长抑制素、原(前肽)、人NRG1、人NGF、人抑癌蛋白M、人成骨细胞特异性因子1(OSF-1、多效生长因子)、人PD-ECGF(血小板源性内皮细胞生长因子)、人PDGF、人PIGF、人胎盘生长因子1(PLGF1)、人胎盘生长因子2(PLGF2)、人SCGF-a(干细胞生长因子-α)、人SCGF-b(干细胞生长因子-β)、人干细胞生长因子(SCF)/CD117配体、人血小板生成素(TPO，THPO)、人转化生长因子、人TGF-α(转化生长因子-α，TGFa)、人 TGF-β1(转化生长因子-β1，TGFb)、人TGF-β1.2(转化生长因子-β1，TGFb)、 人TGF-β2(转化生长因子-β2，TGFb)、人TGF-β3(转化生长因子-β3，TGFb)、 人VEGF(血管内皮生长因子)、人VEGF-121、人VEGF-165和人VEGF-A。上述列表将包括序列变体、类似物和激动剂，包括上述因子的氨基酸取代和/或延伸和/或缺失(例如，IGF-I将包括LR3-IGF-I，美国专利号5,330,971)，其为天然存在和合成的。
在一些实施方案中，所述生长因子包含胰岛素。胰岛素可以是重组产生、从天然来源分离或合成的。在一些实施方案中，所述胰岛素是人重组胰岛素(EMD MILLIPORECORPORATION)。在一些实施方案中，胰岛素在水合以形成细胞培养基后具有0.5-15 mg/L的浓度。在一些实施方案中，胰岛素在水合以形成细胞培养基后具有约3 mg/L的浓度。
在一些实施方案中，所述细胞培养基补充剂的一种或多种无机离子包含选自钼酸铵、硫酸铬钾、硫酸铜、氯化锂、硫酸锰、偏硅酸钠、仲钼酸铵、氧化铵钒、硫酸亚铁、氯化镍、亚硒酸、氯化亚锡、硫酸锌及其组合。在一些实施方案中，所述钼酸铵是钼酸铵4H2O；所述硫酸铬钾是硫酸铬钾12H2O，所述硫酸铜是硫酸铜5H2O，所述氯化锂是氯化锂(无水)，所述硫酸锰是硫酸锰H2O，且所述偏硅酸钠是偏硅酸钠9H2O。所述化学品通常可得自Sigma Aldrich和VWR。
在一些实施方案中，所述细胞培养基补充剂的一种或多种无机离子在水合以形成细胞培养基后具有以下最终浓度：
i) 0.0005-0.01 mg/L钼酸铵4H2O；
ii) 0.0001-0.01 mg/L硫酸铬钾12H2O；
iii) 0.001-0.125 mg/L硫酸铜5H2O；
iv) 0.001-0.1 mg/L氯化锂(无水)；
v) 0.00004-0.004 mg/L硫酸锰H2O；和
vi) 0.04-4.2 mg/L偏硅酸钠9H2O。
在一些实施方案中，所述细胞培养基补充剂的一种或多种无机离子包含钼酸铵4H2O、硫酸铬钾12H2O、硫酸铜5H2O、氯化锂(无水)、硫酸锰H2O和偏硅酸钠9H2O的组合。在一些实施方案中，所述痕量金属在水合以形成细胞培养基后提供以下最终浓度：
i) 约0.0037 mg/L钼酸铵4H2O；
ii) 约0.001 mg/L硫酸铬钾12H2O；
iii) 约0.0125 mg/L硫酸铜5H2O；
iv) 约0.01 mg/L氯化锂(无水)；
v) 约0.000452 mg/L硫酸锰H2O；和
vi) 约0.4263 mg/L偏硅酸钠9H2O。
所述细胞培养基补充剂的氨基酸补充剂可以包括任何氨基酸，包括甘氨酸、丙氨酸、缬氨酸、亮氨酸、异亮氨酸、精氨酸、赖氨酸、天冬氨酸、半胱氨酸、半胱氨酸、甲硫氨酸、苯丙氨酸、脯氨酸、苏氨酸、色氨酸、酪氨酸、天冬酰胺、谷氨酰胺、组氨酸和丝氨酸。在一些实施方案中，所述细胞培养基补充剂的氨基酸补充剂包含天冬酰胺、谷氨酰胺、组氨酸和丝氨酸的组合。适合于细胞培养的氨基酸通常可得自Kyowa Hakko U.S.A.、ResearchOrganics, Inc.和Ajinomoto AminoScience LLC。在一些实施方案中，所述氨基酸补充剂在水合以形成细胞培养基后具有以下最终浓度：
i) 0.007-0.07 g/L 天冬酰胺H2O；
ii) 0.25-2.5 g/L 谷氨酰胺；
iii) 0.5-5.0 g/L 组氨酸，游离碱；和
iv) 0.01-0.1 g/L 丝氨酸。
在一些实施方案中，所述氨基酸补充剂在水合以形成细胞培养基后具有以下最终浓度：
i) 约 0.0225 g/L 天冬酰胺H2O；
ii) 约0.73 g/L 谷氨酰胺；
iii) 约1.552 g/L 组氨酸；和
iv) 约0.03676 g/L 丝氨酸。
所述细胞培养基补充剂的缓冲剂不是限制性的。“缓冲剂”是通过其酸-碱共轭物组分的作用抵抗pH变化的溶液。可以根据例如缓冲剂的期望pH(以及细胞生长和代谢特性、细胞培养物培养系统、pH控制和使用的培养基)采用的各种缓冲剂描述于Buffers. A Guide for the Preparation and Use of Buffers in Biological Systems, Gueffroy,D., 编辑 Calbiochem Corporation (1975)中。在一个实施方案中，所述缓冲剂具有约2至约9、或者约3至约8、或者约4至约7、或者约5至约7的范围内的pH。将控制该范围内的pH的缓冲剂的非限制性实例包括MES、MOPS、MOPSO、Tris、HEPES、磷酸盐、乙酸盐、柠檬酸盐、琥珀酸盐和铵缓冲剂，以及这些的组合。在一些实施方案中，所述缓冲剂选自3-(N-吗啉代)丙磺酸(MOPS)游离酸、3-(N-吗啉代)丙磺酸(MOPS) Na、羟乙基哌嗪乙磺酸(HEPES)和碳酸氢钠。在一些实施方案中，所述制剂包含MOPS游离酸和MOPS Na的组合。在一些实施方案中，当所述复合细胞培养基粉末制剂与水组合以形成细胞培养基时，所述细胞培养基补充剂的缓冲剂提供以下最终浓度：
i) 0.3-3 g/L MOPS游离酸；和
ii) 1.0-10 g/L MOPS Na。
本发明的消泡剂不是限制性的。在一些实施方案中，所述复合细胞培养基粉末制剂的消泡剂包含离子或非离子表面活性剂。消泡(也称为“去泡”)剂可以包括基于油、水、硅氧烷、聚乙二醇/共聚物和聚丙烯酸烷基酯的。常见的实例包括：Schill and Schelinger'sStruktol SB2121 (聚亚烷基二醇)，Schill and Schelinger's Struktol J673A (在植物基础上的烷氧基化脂肪酸酯)，Fluka P2000 (聚丙二醇)，Sigma Antifoam A (硅氧烷聚合物的30％乳剂)和Sigma Antifoam C (硅氧烷聚合物的30％乳剂) (参考文献：Sarah JRoutledge (2012); Beyond de-foaming: the effects of antifoams on bioprocessproductivity.Computational and Structural Biotechnology Journal. 3(4)和其中的参考文献)。在一些实施方案中，所述消泡剂是基于环氧乙烷和环氧丙烷的多元醇共聚物。
在一些实施方案中，所述消泡剂是Pluronic F68。Pluronic F-68是具有8400的平均分子量的非离子嵌段共聚物，其由聚(氧丙烯)的中心嵌段(20重量％)和两端的聚(氧乙烯)的嵌段组成。在一些实施方案中，也可以使用其他多元醇，并且其包括具有约1000至约16,000的分子量范围的聚(氧乙烯)和聚(氧丙烯)的非离子嵌段共聚物。
在一些实施方案中，所述消泡剂是Pluronic F68并且，当所述复合细胞培养基粉末制剂与水组合以形成细胞培养基时，所述消泡剂具有0.1-10 g/L的浓度。在一些实施方案中，当所述复合细胞培养基粉末制剂与水组合以形成细胞培养基时，所述Pluronic F68具有约1 g/L的浓度。
在一些实施方案中，所述复合细胞培养基粉末制剂包含以下组分，其在水合以形成细胞培养基后提供以下最终浓度：
i) 0.0003-0.003 g/L 生物素；
ii) 0.035-0.33 g/L 氯化钙；
iii) 0.003-0.03 g/L 氯化胆碱；
iv) 0.0002-0.002 g/L 氰钴胺素 (B12)；
v) 1-10 g/L D+ 甘露糖；
vi) 0.001-0.01 g/L D-泛酸钙；
vii) 0.3-3.0 g/L 右旋糖(无水)；
viii) 0.00003-0.0003 g/L DL-α-硫辛酸；
ix) 0.00002-0.00015 g/L 硝酸铁9H20；
x) 0.0001-0.0015 g/L 硫酸亚铁7H20；
xi) 0.001-0.01 g/L 叶酸；
xii) 0.007-0.20 g/L 甘氨酸；
xiii) 0.001-0.01 g/L 次黄嘌呤 2Na；
xiv) 0.005-0.05 g/L I-肌醇；
xv) 0.003-0.03 g/L L-丙氨酸；
xvi) 0.08-1.4 g/L L-精氨酸；
xvii) 0.006-0.16 g/L L-天冬酰胺；
xviii) 0.005-0.10 g/L L-天冬氨酸；
xix) 0.005-0.05 g/L L-半胱氨酸HCl H20；
xx) 0.02-0.2 g/L L-胱氨酸2HCl；
xxi) 0.005-0.15 g/L L-谷氨酸(无水)；
xxii) 0.02-0.6 g/L L-谷氨酰胺；
xxiii) 0.0003-0.003 g/L L-谷胱甘肽；
xxiv) 0.02-0.2 g/L L-组氨酸 HCl；
xxv) 0.03-0.9 g/L L-异亮氨酸；
xxvi) 0.03-0.9 g/L L-亮氨酸；
xxvii) 0.05-1.5 g/L L-赖氨酸；
xxviii) 0.01-0.3 g/L L-甲硫氨酸；
xxix) 0.02-0.6 g/L L-苯丙氨酸；
xxx) 0.008-0.25 g/L L-脯氨酸；
xxxi) 0.009-0.25 g/L L-丝氨酸；
xxxii) 0.03-0.9 g/L L-苏氨酸；
xxxiii) 0.006-0.16 g/L L-色氨酸；
xxxiv) 0.03-0.9 g/L L-酪氨酸 2Na 2H2O；
xxxv) 0.03-0.9 g/L L-缬氨酸；
xxxvi) 0.01-0.18 g/L 氯化镁
xxxvii) 0.02-0.12 g/L 无水硫酸镁；
xxxviii) 0.001-0.01 g/L 烟酰胺；
xxxix) 0.0005-0.005 g/L O-磷酸乙醇胺；
xl) 0.1-1.0 g/L 氯化钾；
xli) 0.00002-0.0002 g/L 腐胺2HCl；
xlii) 0.001-0.01 g/L 吡哆醛HCl；
xliii) 0.00001-0.0001 g/L 吡哆醇HCl，
xliv) 0.0001-0.001 g/L 核黄素，
xlv) 2.0-15 g/L 氯化钠，
xlvi) 0.02-0.2 g/L 磷酸二氢钠H20，
xlvii) 0.02-0.2 g/L 无水磷酸氢二钠，
xlviii) 0.015-0.15 g/L 丙酮酸钠，
xlix) 0.001-0.01 g/L 硫胺素HCl，
l) 0.0001-0.001 g/L 胸苷，
li) 0.00015-0.0015 g/L 硫酸锌7H20，
lii) 0.0000006-0.000006 g/L 硫酸铜5H2O，
liii) 0.0000005-0.000008 g/L 二氧化硒，
liv) 0.00001-0.0001 g/L 亚油酸，
lv) 0.0001-0.001 g/L β-巯基乙醇；
lvi) 0.0003-0.005 g/L 乙醇胺FB；
lvii) 0.5-5 g/L MgCl2；
lviii) 0.5-15 mg/L 胰岛素；
lix) 0.0005-0.01 mg/L钼酸铵4H2O；
lx) 0.0001-0.01 mg/L硫酸铬钾12H2O；
lxi) 0.001-0.125 mg/L硫酸铜5H2O；
lxii) 0.001-0.1 mg/L氯化锂(无水)；
lxiii) 0.00004-0.004 mg/L硫酸锰H2O；
lxiv) 0.04-4.2 mg/L偏硅酸钠9H2O；
lxv) 0.007-0.07 g/L 天冬酰胺H2O；
lxvi) 0.25-2.5 g/L 谷氨酰胺；
lxvii) 0.5-5.0 g/L 组氨酸，游离碱；
lxviii) 0.01-0.1 g/L 丝氨酸；
lxix) 0.3-3 g/L MOPS游离酸；
lxx) 1.0-10 g/L MOPS Na；和
lxxi) 0.1-10 g/L Pluronic F68。
在另一个实施方案中，本发明提供制备本发明的复合细胞培养基粉末制剂的方法，其包括组合以下组分：基础培养基粉末；一种或多种盐；一种或多种生长因子；一种或多种无机离子；包含天冬酰胺、谷氨酰胺、组氨酸和丝氨酸中的一种或多种的氨基酸补充剂；一种或多种缓冲剂；和一种或多种消泡剂。所述复合细胞培养基粉末制剂的组分的添加顺序不是限制性的。在一个实施方案中，个别添加所述组合物的每种组分以制备所述复合细胞培养基粉末制剂。在一些实施方案中，首先将基础培养基作为批次制备，然后与构成培养基补充剂的其他组分组合。在一些实施方案中，所述细胞培养基补充剂可以作为批次制备，并且后来与批次的基础培养基粉末组合或通过依次添加与基础培养基粉末的组分组合以制备所述复合细胞培养基粉末制剂。
可以通过进行水合步骤使用本发明的复合细胞培养基粉末制剂来制备细胞培养基。在另一个方面，本发明提供制备用于培养细胞的细胞培养基的方法，其包括使所述复合细胞培养基粉末制剂与水接触，由此制备用于培养细胞的细胞培养基。在一个实施方案中，所述细胞是哺乳动物细胞。在一些实施方案中，所述组分基本上溶解于水中。在一些实施方案中，用水填充罐，并将所述复合细胞培养基粉末制剂添加至罐中。使用者可以任选地进行质量控制处理步骤通过混合并测试重量摩尔渗透压浓度、电导率和pH以确保粉末溶解，从而确保所有组分以目标量存在。
在一个实施方案中，本发明提供制备用于培养细胞的细胞培养基的方法，其包括用水基本上溶解所述复合细胞培养基粉末制剂，并且任选地还包括组合包含FeSO4 7H2O和螯合剂的溶液。在一些实施方案中，首先混合水和包含FeSO4 7H2O和螯合剂的溶液，随后添加所述复合细胞培养基粉末制剂。在一些实施方案中，所述螯合剂是乙二胺四乙酸(EDTA)。在一些实施方案中，FeSO4 7H2O和EDTA在细胞培养基中具有以下最终浓度：0.004-0.04 g/LFeSO4 7H2O；和0.006-0.06 g/L EDTA。在一些实施方案中，FeSO4 7H2O和EDTA在细胞培养基中具有以下最终浓度：约0.0138g/L FeSO4 7H2O；和约0.018625g/L EDTA。
在另一个实施方案中，本发明提供培养细胞的方法，其包括使细胞与本发明的细胞培养基接触，和在培养基中培养细胞一段时间。在一些实施方案中，在补料分批或半分批培养物中孵育所述细胞。在一些实施方案中，在灌注培养物中孵育所述细胞。
在一些实施方案中，所述细胞培养基用于表达目标蛋白。在另一个实施方案中，本发明提供产生目标蛋白的方法，其包括使表达目标蛋白的细胞与细胞培养基接触；在所述培养基中培养所述细胞一段时间；和从所述细胞培养基分离目标蛋白。
在一些实施方案中，所述目标蛋白选自凝血因子VIII (FVIII)及其功能变体和片段。在一些实施方案中，FVIII多肽包括等位变异(allelic variations)、糖基化版本、修饰形式和片段（其导致产生FVIII的衍生物），只要它们含有人FVIII的功能区段和基本的、特征性的人FVIII功能活性。
在一些实施方案中，可用于使用本发明的复合培养基表达的FVIII分子包括全长蛋白、蛋白的前体、蛋白的亚基或片段及其变体和抗原片段。提及FVIII意指包括此类蛋白的所有潜在形式。
重组FVIII的实例包括Recombinate™和Advate®，均由Baxter HealthcareCorporation制造和销售；ReFacto®，由Wyeth Corporation制造和销售的FVIII的B结构域缺失的形式；和KOGENATE，由Bayer Corporation制造和销售。在一些实施方案中，待表达的FVIII多肽包含全长人FVIII。在一些实施方案中，所述全长FVIII包含选自SEQ ID NO:1、SEQ ID NO:2及其组合的氨基酸序列，尽管等位基因变体是可能的。作为分泌的蛋白，FVIII含有在翻译过程期间被蛋白水解切割的信号序列。去除19个氨基酸的信号序列之后，分泌的FVIII产物的第一个氨基酸是丙氨酸。
在一些实施方案中，所述人FVIII是B结构域缺失的FVIII (BDD)。如本文所使用，BDD的特征在于具有含有FVIII的B结构域的除14个氨基酸之外的所有氨基酸的缺失的氨基酸序列。B结构域的前4个氨基酸(SEQ ID NO:3)连接至B结构域的10个最后残基(NPPVLKRHQR，SEQ ID NO:4)。在一些实施方案中，所述BDD FVIII包含选自SEQ ID NO:5和SEQ ID NO:6及其组合的氨基酸序列。
在一些实施方案中，FVIII可以用生物相容性聚合物诸如PEG修饰。因子VIII的聚乙二醇化形式公开于WO 2006/053299和美国专利申请公开号20060115876(其通过引用并入本文)中。
在随后的FVIII的实例中，FVIII突变蛋白以本领域中常规的方式命名。如本文所使用，“突变蛋白”是作为实验室诱导的蛋白或多肽的突变的结果而产生的基因工程改造的蛋白。用于命名突变体的惯例基于如SEQ ID NO:2中提供的成熟全长因子VIII的氨基酸序列。
如常规的和本文中使用的，当提及BDD FVIII中的突变氨基酸时，突变的氨基酸通过其在全长FVIII序列中的位置指定。例如，特定突变蛋白被指定为K1808C，因为其将类似于全长序列中的1808的位置处的赖氨酸(K)改变为半胱氨酸(C)。在一些实施方案中，对于下文讨论的突变体，半胱氨酸替代全长FVIII或B结构域缺失的FVIII的指定位置处的天然氨基酸，并且生物相容性聚合物(诸如PEG)连接至半胱氨酸残基。
用于共价结合生物相容性聚合物诸如PEG的预定位点最好地选自暴露于多肽表面上不参与FVIII活性或不参与体内稳定FVIII的其它机理(诸如结合vWF)的位点。此类位点还最好地选自已知参与FVIII被失活或从循环中清除的机制的那些位点。下面详细讨论了这些位点的选择。优选位点包括在以下的结合位点处或附近的氨基酸残基：(a)低密度脂蛋白受体相关蛋白，(b)硫酸肝素蛋白聚糖，(c)低密度脂蛋白受体和/或(d)因子VIII抑制性抗体。“在结合位点处或附近”意指与结合位点足够接近的残基，使得生物相容性聚合物与该位点的共价连接会导致结合位点的空间位阻。例如，预期此位点在结合位点的20埃内。
在一个实施方案中，所述生物相容性聚合物共价连接至功能因子VIII多肽的以下位置处或附近的氨基酸残基：(a)因子VIII清除受体，(b)能够降解因子VIII的蛋白酶的结合位点，和/或(c) 因子VIII 抑制性抗体的结合位点。蛋白酶可以是活化的蛋白C (APC)。在另一个实施方案中，所述生物相容性聚合物共价连接于功能因子VIII多肽上的预定位点，使得低密度脂蛋白受体相关蛋白与多肽的结合小于当多肽未缀合时与其的结合，且优选地，小于1/2。在一个实施方案中，所述生物相容性聚合物共价连接于功能因子VIII多肽上的预定位点，使得硫酸肝素蛋白聚糖与多肽的结合小于当多肽未缀合时与其的结合，且优选地，小于1/2。在一个进一步实施方案中，所述生物相容性聚合物共价连接于功能因子VIII多肽上的预定位点，使得因子VIII 抑制性抗体与多肽的结合小于当多肽未缀合时与其的结合，优选地，小于当多肽未缀合时与其的结合的1/2。在另一个实施方案中，所述生物相容性聚合物共价连接于功能因子VIII多肽上的预定位点，使得低密度脂蛋白受体与多肽的结合小于当多肽未缀合时与其的结合，优选地，小于1/2。在另一个实施方案中，所述生物相容性聚合物共价连接于功能因子VIII多肽上的预定位点，使得血浆蛋白酶对多肽的降解小于当多肽未缀合时对其的降解。在一个进一步实施方案中，血浆蛋白酶对多肽的降解小于当多肽未缀合时在相同条件下经相同时间段测量的对多肽的降解的1/2。
可以使用表面等离子共振技术(Biacore)确定LRP、LDL受体或HSPG对FVIII的结合亲和力。例如，可以将FVIII直接地或通过FVIII 抗体间接地包被至Biacore芯片，并且可以将各种浓度的LRP经过芯片上以测量相互作用的结合速率和解离速率两者(Bovenschen N.等人, 2003, J. Biol. Chem. 278(11), pp. 9370-7)。两种速率的比率给出亲和力的量度。期望PEG化后亲和力的两倍、优选地五倍、更优选地十倍且甚至更优选地三十倍的降低。
可以通过本领域技术人员已知的任何方法测量蛋白酶APC对FVIII的降解。
在一个实施方案中，所述生物相容性聚合物在FVIII (SEQ ID NO:2)氨基酸位置81、129、377、378、468、487、491、504、556、570、711、1648、1795、1796、1803、1804、1808、1810、1864、1903、1911、2091、2118和2284中的一个或多个处共价连接至所述多肽。在另一个实施方案中，所述生物相容性聚合物在因子VIII (SEQ ID NO:2)氨基酸位置377、378、468、491、504、556、1795、1796、1803、1804、1808、1810、1864、1903、1911和2284中的一个或多个处共价连接至所述多肽，且(1)所述缀合物与低密度脂蛋白受体相关蛋白的结合小于未缀合的多肽与低密度脂蛋白受体相关蛋白的结合；(2)所述缀合物与低密度脂蛋白受体的结合小于未缀合的多肽与低密度脂蛋白受体的结合；或(3)所述缀合物与低密度脂蛋白受体相关蛋白和低密度脂蛋白受体两者的结合小于未缀合的多肽与低密度脂蛋白受体相关蛋白和低密度脂蛋白受体两者的结合。在一个实施方案中，B结构域缺失的FVIII中的残基1804突变为半胱氨酸并与PEG缀合。
在一个进一步实施方案中，所述生物相容性聚合物在FVIII (SEQ ID NO:2)氨基酸位置 377、378、468、491、504、556和711中的一个或多个处共价连接至多肽，并且缀合物与硫酸肝素蛋白聚糖的结合小于未缀合的多肽与硫酸肝素蛋白聚糖的结合。在一个进一步实施方案中，所述生物相容性聚合物在因子VIII (SEQ ID NO:2)氨基酸位置81、129、377、378、468、487、491、504、556、570、711、1648、1795、1796、1803、1804、1808、1810、1864、1903、1911、2091、2118和2284中的一个或多个处共价连接至所述多肽，并且所述缀合物与因子VIII抑制性抗体的结合小于未缀合的多肽。在一个进一步实施方案中，所述生物相容性聚合物在因子VIII (SEQ ID NO:2)氨基酸位置81、129、377、378、468、487、491、504、556、570、711、1648、1795、1796、1803、1804、1808、1810、1864、1903、1911、2091、2118和2284中的一个或多个处、优选在位置377、378、468、491、504、556和711中的一个或多个处共价连接至所述多肽，并且所述缀合物与未缀合的多肽相比被能够降解因子VIII的血浆蛋白酶更少降解。更优选地，所述血浆蛋白酶是活化的蛋白C。
在一个进一步实施方案中，所述生物相容性聚合物共价连接于B-结构域缺失的因子VIII的氨基酸位置129、491、1804和/或1808，更优选地491或1808处。在一个进一步实施方案中，所述生物相容性聚合物在因子VIII氨基酸位置1804处连接至所述多肽，且包含聚乙二醇。优选地，生物相容性聚合物连接的一个或多个预定位点由位点特异性的半胱氨酸突变控制。
功能因子VIII多肽上的一个或多个(优选地，一个或两个)位点可以是聚合物连接的预定位点。在具体实施方案中，所述多肽是单-PEG化的或双PEG化的。
本发明还涉及用于制备缀合物的方法，其包括：突变编码所述功能因子VIII多肽的核苷酸序列，以便在预定位点处将编码序列取代为半胱氨酸残基；表达突变的核苷酸序列，以产生半胱氨酸增强的突变蛋白；纯化所述突变蛋白；使所述突变蛋白与所述生物相容性聚合物反应，所述生物相容性聚合物已经被活化，以便与所述多肽在基本上仅还原的半胱氨酸残基处反应，使得形成缀合物；和纯化所述缀合物。在另一个实施方案中，本发明提供用于位点定向PEG化因子VIII突变蛋白的方法，其包括：(a)表达位点定向的因子VIII 突变蛋白，其中所述突变蛋白用半胱氨酸替代所述因子VIII 突变蛋白的暴露表面上的氨基酸残基，且该半胱氨酸被加帽；(b)在温和地还原所述半胱氨酸突变蛋白和释放所述帽的条件下，使所述半胱氨酸突变蛋白与还原剂接触；(c)从所述半胱氨酸突变蛋白去除所述帽和还原剂；和(d)去除所述还原剂之后至少约5分钟，且优选地至少15分钟，仍更优选地至少30分钟，在使得产生PEG化的因子VIII突变蛋白的条件下，用包含巯基偶联部分的PEG处理所述半胱氨酸突变蛋白。PEG的巯基偶联部分选自硫醇、三氟甲磺酸酯、三氟乙磺酸酯(tresylate)、氮杂环丙烷、环氧乙烷、S-吡啶基和马来酰亚胺部分，优选地，马来酰亚胺。
在一个实施方案中，用半胱氨酸替代一个或多个表面BDD氨基酸，在哺乳动物表达系统中产生所述半胱氨酸突变蛋白，还原在表达期间已经被来自生长培养基的半胱氨酸加帽的半胱氨酸，去除还原剂以允许BDD二硫化物重新形成，和与半胱氨酸-特异性的生物相容性聚合物试剂(诸如诸如PEG-马来酰亚胺)反应。此类试剂的实例是PEG-马来酰亚胺，其中PEG大小为诸如5、22或43 kD，其可得自Nektar Therapeutics of San Carlos, Calif.，Nektar目录号分别为2D2M0H01 mPEG-MAL MW 5,000 Da、2D2M0P01 mPEG-MAL MW 20 kD、2D3X0P01 mPEG2-MAL MW 40 kD，或PEG大小为诸如12或33 kD，其可得自NOF Corporation,Tokyo, Japan，NOF 目录号分别为Sunbright ME-120MA和Sunbright ME-300MA。PEG化的产物使用离子交换色谱纯化以去除未反应的PEG，并使用大小排阻色谱纯化以去除未反应的BDD。该方法可以用于鉴定和选择性遮蔽与FVIII的任何不利反应，诸如受体-介导的清除、抑制性抗体结合和蛋白水解酶的降解。我们注意到，Nektar或NOF提供为5 kD的PEG试剂在我们实验室中测试为6 kD，且类似地，在我们实验室中，提供为直链20 kD的PEG试剂测试为22 kD，提供为40 kD的PEG试剂测试为43 kD，且提供为60 kD的PEG试剂测试为64 kD。为了避免混淆，在本文的讨论中，我们使用如我们实验室中测试的分子量，例外是5 kD PEG，我们将其报道为与制造商将其鉴定一样的5 kD。
除了在BDD的位置491和1808处的半胱氨酸突变(上面公开)以外，将位置487、496、504、468、1810、1812、1813、1815、1795、1796、1803和1804突变成半胱氨酸，以潜在地允许在PEG化后阻断LRP结合。此外，将位置377、378和556突变成半胱氨酸，以允许在PEG化后阻断LRP和HSPG结合。选择位置81、129、422、523、570、1864、1911、2091和2284以使其在BDD上相等地间隔开，使得在这些位置用大PEG (>40 kD)进行的位点定向PEG化连同在天然糖基化位点(41、239和2118)和LRP 结合位点处的PEG化完全覆盖BDD的表面，并鉴定BDD的新颖清除机制。
在一个实施方案中，所述细胞培养基含有半胱氨酸，其通过形成二硫键而“加帽”突变蛋白上的半胱氨酸残基。在缀合物的制备中，在重组系统中产生的半胱氨酸突变蛋白被来自培养基的半胱氨酸加帽，且该帽被释放该帽的温和还原去除，然后添加半胱氨酸-特异性的聚合物试剂。如本领域技术人员将会显而易见的是，也可以使用本领域已知用于位点特异性突变FVIII的其它方法。
在一些实施方案中，所述FVIII选自野生型FVIII、B结构域缺失的FVIII和与生物相容性聚合物缀合的FVIII。在一些实施方案中，所述生物相容性聚合物是聚乙二醇(PEG)。在一些实施方案中，PEG在因子VIII氨基酸位置81、129、377、378、468、487、491、504、556、570、711、1648、1795、1796、1803、1804、1808、1810、1864、1903、1911、2091、2118和2284中的一个或多个处共价连接至多肽。
尽管已经参考本文的某些具体实例和实施方案描述了本发明，但本领域技术人员将理解，可以出于符合所有相关专利法的目的组合各个实例和实施方案(例如，在具体实例中描述的方法可用于描述本发明的具体方面及其操作，即使此类在对其提及中没有明确记载)。
实施例1
用于产生因子VIII的培养基制备的当前方法涉及添加几种反向添加(add-back)溶液和干粉组分/混合物以构建其细胞培养基。评估几种相关的粉末变化（其包括一些或所有反向添加物(研磨成DPM)），以鉴定具有可接受的生长和性能特征的更复杂(即，更少的反向添加物)粉末制剂。目标是使培养基配制方法简化并降低供应链复杂性(如表1中所见)。
为了产生适合于产生聚乙二醇化因子VIII的粉末培养基制剂，将优化的FVIII粉末制剂与氨基酸粉末共混物(3x AA混合物)共混成一种制剂，并评估特征。
材料/方法
材料
天平是Sartorius MSA124S；渗压计是Advanced Instruments，型号3300；pH读数用ThermoOrion型号720A获取；浊度读数在Hach 2100N浊度计上测量；胰岛素UPLC分析经由Acquity H-Class, Acquity BEH300 C4柱进行；胰岛素ELISA定量使用Millipore ELISA试剂盒进行；氨基酸定量经由Waters HPLC, Zorbax Eclipse AAA柱进行；ICP分析在Agilent720-ES ICP-OES上进行。
方法
DPM版本和所有相关的反向添加溶液和粉末由SAFC的即时优势部门(ImmediateAdvantage department)制造。反向添加粉末和溶液概述于表1中。粉末的版本、描述和SAFC产品编号概述于表2中。
表 1：目前培养基制剂材料
描述 1L中的浓度
R3* 无(w/o)酚红 13.036g/L
rH-胰岛素 3.0mg/L (0.6mL/L)
无水MgCl2* 1.428g/L
10mM FeSO4/EDTA溶液(TE #1) 5mL/L
FeSO4 7H2O 0.0138g/L
EDTA 2Na 2 H2O 0.018625g/L
痕量金属溶液#2 0.1mL/L
钼酸铵4H2O 0.0037mg/L
硫酸铬钾12H2O 0.001mg/L
硫酸铜5H2O 0.0125mg/L
无水氯化锂 0.01mg/L
硫酸锰H2O 0.000452mg/L
偏硅酸钠9H2O 0.4263mg/L
因子VIII(非聚乙二醇化)补充剂 7.856g/L
天冬酰胺H2O 0.0225g/L
谷氨酰胺 0.73g/L
组氨酸 1.552g/L
丝氨酸 0.03676g/L
Lutrol (Pluronic F68) 1.0g/L
MOPS游离酸 1.0465g/L
MOPS Na 3.468g/L
3x AA混合物(仅对于聚乙二醇化的FVIII) 2.594g/L
*参见下面实施例2的制剂。
表 2：评估的各种因子VIII(非聚乙二醇化的)制剂
版本 描述
1 基础培养基(对照) – 无酚红的R3 (68213C)
2 基础培养基+ 所有添加剂
2.1 基础培养基+ 所有添加剂；调整的组氨酸 HCl和FB
3 基础培养基+ 除了TE溶液#1以外的所有添加剂
3.1 基础培养基+ 除了TE溶液#1以外的所有添加剂；调整的组氨酸 HCl
3.2 基础培养基+ 除了TE溶液#1以外的所有添加剂；调整的组氨酸 FB
3.3 基础培养基+ 除了TE溶液#1以外的所有添加剂；调整的组氨酸 HCl和FB
4 基础培养基+ 除了氨基酸混合物以外的所有添加剂
5 基础培养基+ 除了TE溶液#1和氨基酸混合物以外的所有添加剂
6 基础培养基+ 除了Lutrol和MOPS以外的所有添加剂
聚乙二醇化的FVIII制剂是与2.594 g/L 3x AA产生混合物混合的22.29 g/L非聚乙二醇化的FVIII版本的组合。
结果
针对以下特征测试这些版本：
1) 水合的粉末的pH和重量摩尔渗透压浓度
2) 氨基酸浓度的分析
3) Fe浓度的分析
4) 胰岛素浓度的分析。
表3A和3B概述测试的非聚乙二醇化的FVIII版本的数据。
表3A：非聚乙二醇化的FVIII版本1-6的成品结果
表3B：非聚乙二醇化的FVIII版本1-6的成品结果
使用HPLC用于胰岛素定量比使用Millipore ELISA试剂盒用于胰岛素定量更准确和精确。对于胰岛素定量，HPLC方法与USP HPLC方法极端类似，因此是稳健和坚固的(rugged)，并且其准确性和精确度已经确立。相反，设计ELISA方法用于简单的胰岛素制剂，并且不可能优化用于在细胞培养中发现的此类复杂制剂。可能用ELISA测试所见的不一致的结果是由于组分干扰胰岛素结合(或竞争性抑制)，因此使ELISA测试对于在此类复杂细胞培养基中精确定量胰岛素是次优的。
表4概述用于过滤1L版本1、版本2.1和版本3.3的0.22μm滤纸上留下的铁残余物。该铁测试的结果是选择版本3.3作为用于使用的制剂的基础。
表 4：来自用于单独过滤各种版本的非聚乙二醇化的FVIII的经冲洗的0.22μm滤纸的铁量
表5概述测试的KG-N版本的数据。
表 5：聚乙二醇化的FVIII版本的成品结果
结论
非聚乙二醇化的FVIII的最终版本是版本3.3。这是完全培养基减去制剂中的大部分(97.1％)的铁和所有EDTA。由于发现版本2.1(含有研磨成DPM的铁和EDTA)水合后没有适当地螯合(即，溶解)铁并因此从溶液中过滤掉铁(表4)，因此选择该不含铁/EDTA的干粉制剂(利用铁/EDTA液体反向添加)作为制剂。
版本3.3的分析评估测量胰岛素浓度、氨基酸浓度和pH(水合后)，其与完全配制的版本1(对照)相比没有显著不同。
聚乙二醇化的FVIII制剂是用额外的氨基酸强化的非聚乙二醇化的FVIII制剂。
实施例2
本实施例显示示例性基础培养基，其可以通过进一步复合成本发明的复合培养基制剂来增强。在本实施例中，包括指示剂诸如酚红，然而，可以省略指示剂。
组分 单位/升
L-丙氨酸，USP/EP 0.01336 g
L-精氨酸，HCl，USP 0.27435 g
L-天冬酰胺H20 0.0225 g
L-天冬氨酸 USP 0.01995 g
生物素，USP 0.001 g
氯化钙，无水 0.11665 g
D-泛酸钙，USP 0.00312 g
氯化胆碱，USP 0.00998 g
硫酸铜，5H20，ACS 0.000001275 g
氰钴胺素，lisp 0.00068 g
L-半胱氨酸，HCl ，H2O，USP，EP 0.01756 g
L-半胱氨酸，2HC1 0.06256 g
右旋糖，无水，ACS 1.0 g
乙醇胺，FB 0.0012 g
邻磷酸乙醇胺 0.0014 g
硝酸铁，9H20，ACS 0.00005 g
硫酸亚铁，7H20，ACS 0.000417 g
叶酸，USP 0.00366 g
L-谷氨酸，EP 0.02206 g
L-谷氨酰胺，USP 0.73 g
L-谷胱甘肽，还原型 0.001 g
甘氨酸 USP，EP，JP 0.0262 g
L-组氨酸，HCl，H20，EP 0.07348 g
次黄嘌呤 2Na 0.0027 g
i-肌醇 0.01451 g
L-异亮氨酸，USP,EP，JP 0.1057 g
L-亮氨酸，USP，EP，JP 0.11096 g
亚油酸 0.000042 g
DL-α-硫辛酸 0.000103 g
L-赖氨酸，HCl，USP，EP，JP 0.16385 g
氯化镁，6H20 ACS 0.061 g
硫酸镁，无水，USP 0.04884 g
2-巯基乙醇 0.00039065 g
L-甲硫氨酸 USP，EP，JP 0.03224 g
酚红，Na盐，ACS 0.0069 g
烟酰胺，USP 0.00302 g
L-苯丙氨酸，USP，EP 0.06748 g
氯化钾，USP 0.31182 g
L-脯氨酸，USP，EP 0.02875 g
腐胺，2HC1 0.000081 g
吡哆醛HCl 0.003 g
吡哆醇，HCl，USP 0.000031 g
核黄素，USP 0.000319 g
二氧化硒 0.00000222 g
L-丝氨酸，USP，EP 0.03676 g
氯化钠，ACS 6.1234 g
磷酸氢二钠，无水，USP 0.07099 g
磷酸二氢钠，H20，USP 0.0625 g
丙酮酸钠 0.055 g
硫胺素，HCl，USP 0.00317 g
L-苏氨酸，USP，EP，JP 0.10156 g
胸苷 0.000364 g
L-色氨酸，USP，EP，JP 0.01902 g
L-酪氨酸，2Na，2H20 0.10771 g
L-缬氨酸，USP，EP，JP 0.09866 g
硫酸锌，7 H20，ACS 0.000432 g
D-甘露糖 3.0 g
总计 13.042543120 g/L
实施例3
本实施例描述复合培养基粉末制剂的示例性实施方案。
组分 单位/升
L-丙氨酸，USP/EP 0.01336 g
钼酸铵，4H20 0.0000037 g
L-精氨酸，HCl，USP 0.27435 g
L-天冬酰胺H20 0.045 g
L-天冬氨酸 USP 0.01995 g
生物素，USP 0.001 g
氯化钙，无水 0.11665 g
D-泛酸钙，USP 0.00312 g
氯化胆碱，USP 0.00998 g
硫酸铬钾，12H20 0.000001 g
硫酸铜，5H20，ACS 0.00001375 g
氰钴胺素，USP 0.00068 g
L-半胱氨酸，HCl ，H2O，USP，EP 0.01756 g
L-半胱氨酸，2HC1 0.06256 g
右旋糖，无水，ACS 1.0 g
乙醇胺，FB 0.0012 g
邻磷酸乙醇胺 0.0014 g
硝酸铁，9H20，ACS 0.00005 g
硫酸亚铁，7H20，ACS 0.000417 g
叶酸，USP 0.00366 g
L-谷氨酸，EP 0.02206 g
L-谷氨酰胺，USP 1.46 g
L-谷胱甘肽，还原型 0.001 g
甘氨酸 . USP，EP，JP 0.0262 g
L-组氨酸，FB，USP，EP 1.552 g
L-组氨酸，HCl，H20，EP 0.07348 g
次黄嘌呤 2Na 0.0027 g
i-肌醇 0.01451 g
L-异亮氨酸，USP,EP，JP 0.1057 g
L-亮氨酸，USP，EP，JP 0.11096 g
亚油酸 0.000042 g
DL-α-硫辛酸 0.000103 g
氯化锂 0.00001 g
L-赖氨酸，HCl，USP，EP，JP 0.16385 g
氯化镁，无水 1.456951840 g
硫酸镁，无水，USP 0.04884 g
2-巯基乙醇 0.000390650 g
L-甲硫氨酸 USP，EP，JP 0.03224 g
烟酰胺，USP 0.00302 g
L-苯丙氨酸，USP，EP 0.06748 g
Lutrol (R) P-68，NF 1.0 g
氯化钾，USP 0.31182 g
L-脯氨酸，USP，EP 0.02875 g
腐胺，2HC1 0.000081 g
吡哆醛. HCl 0.003 g
吡哆醇，HCl，USP 0.000031 g
核黄素，USP 0.000319 g
二氧化硒 0.00000222 g
L-丝氨酸，USP，EP 0.07352 g
氯化钠，ACS 6.1234 g
偏硅酸钠，9H20 0.0004263 g
磷酸氢二钠，无水 0.07099 g
磷酸二氢钠，H20，USP 0.0625 g
丙酮酸钠 0.055 g
硫胺素，HCl，USP 0.00317 g
L-苏氨酸，USP，EP，JP 0.10156 g
胸苷 0.000364 g
L-色氨酸，USP，EP，JP 0.01902 g
L-酪氨酸，2Na，2H20 0.10771 g
L-缬氨酸，USP，EP，JP 0.09866 g
硫酸锌，7 H20，ACS 0.000432 g
D-甘露糖 3.0 g
MOPS，游离酸，BPC (Sigma M3183) 1.0465 g
MOPS，钠，BPC (Sigma M9024) 3.4680 g
人重组胰岛素，ACF，USP (#4506) 0.003 g
钼酸铵4H2O 0.0037 mg
硫酸铬钾12H2O 0.001 mg
硫酸铜5H2O 0.0125 mg
无水氯化锂 0.01 mg
硫酸锰H2O 0.000452mg
偏硅酸钠9H2O 0.4263 mg
总计 22.290808460 g/L
将复合细胞培养基粉末制剂在水合罐中的1 L双去离子无菌H20中水合。将粉末添加至水中，随后混合以确保充分的分散和溶解。接下来，将包含FeSO4 7H2O和乙二胺四乙酸(EDTA)的溶液添加至罐中。FeSO4 7H2O和EDTA在细胞培养基中具有以下最终浓度：约0.0138g/L FeSO4 7H2O；和约0.018625g/L EDTA。然后将细胞培养基储存在4℃用于以后使用。
实施例4
本实施例描述示例性复合培养基粉末制剂。
组分 单位/升
L-丙氨酸，USP/EP 0.01336 g
钼酸铵，4H20 0.0000037 g
L-精氨酸，HCl，USP 0.82305 g
L-天冬酰胺H20 0.135 g
L-天冬氨酸 USP 0.05985 g
生物素，USP 0.001 g
氯化钙，无水 0.11665 g
D-泛酸钙，USP 0.00312 g
氯化胆碱，USP 0.00998 g
硫酸铬钾，12H20 0.000001 g
硫酸铜，5H20，ACS 0.00001375 g
氰钴胺素，USP 0.00068 g
L-半胱氨酸，HCl，H2O，USP，EP 0.01756 g
L-半胱氨酸，2HCl 0.06256 g
右旋糖，无水，ACS 1.0 g
乙醇胺，FB 0.0012 g
邻磷酸乙醇胺 0.0014 g
硝酸铁，9H20，ACS 0.00005 g
硫酸亚铁，7H20，ACS 0.000417 g
叶酸，USP 0.00366 g
L-谷氨酸，EP 0.06618 g
L-谷氨酰胺，USP 1.46 g
L-谷胱甘肽，还原型 0.001 g
甘氨酸 . USP，EP，JP 0.07878 g
L-组氨酸，FB，USP，EP 1.552 g
L-组氨酸，HCl，H20，EP 0.07348 g
次黄嘌呤 2Na 0.0027 g
i-肌醇 0.01451 g
L-异亮氨酸，USP,EP，JP 0.3171 g
L-亮氨酸，USP，EP，JP 0.33288 g
亚油酸 0.000042 g
DL-α-硫辛酸 0.000103 g
氯化锂 0.00001 g
L-赖氨酸，HCl，USP，EP，JP 0.49155 g
氯化镁，无水 1.456951840 g
硫酸镁，无水，USP 0.04884 g
2-巯基乙醇 0.000390650 g
L-甲硫氨酸 USP，EP，JP 0.09672 g
烟酰胺，USP 0.00302 g
L-苯丙氨酸，USP，EP 0.20244 g
Lutrol (R) P-68，NF 1.0 g
氯化钾，USP 0.31182 g
L-脯氨酸，USP，EP 0.08625 g
腐胺，2HC1 0.000081 g
吡哆醛. HCl 0.003 g
吡哆醇，HCl，USP 0.000031 g
核黄素，USP 0.000319 g
二氧化硒 0.00000222 g
L-丝氨酸，USP，EP 0.22052 g
氯化钠，ACS 6.1234 g
偏硅酸钠，9H20 0.0004263 g
磷酸氢二钠，无水 0.07099 g
磷酸二氢钠，H20，USP 0.0625 g
丙酮酸钠 0.055 g
硫胺素，HCl，USP 0.00317 g
L-苏氨酸，USP，EP，JP 0.30468 g
胸苷 0.000364 g
L-色氨酸，USP，EP，JP 0.05706 g
L-酪氨酸，2Na，2H20 0.32313 g
L-缬氨酸，USP，EP，JP 0.29598 g
硫酸锌，7 H20，ACS 0.000432 g
D-甘露糖 3.0 g
MOPS,游离酸，BPC (Sigma M3183) 1.0465 g
MOPS，钠，BPC (Sigma M9024) 3.4680 g
人重组胰岛素，ACF，USP (#4506) 0.003 g
钼酸铵4H2O 0.0037 mg
硫酸铬钾12H2O 0.001 mg
硫酸铜5H2O 0.0125 mg
无水氯化锂 0.01 mg
硫酸锰H2O 0.000452mg
偏硅酸钠9H2O 0.4263 mg
总计 24.884908460 g/L
将复合细胞培养基粉末制剂在水合罐中的1 L双去离子无菌H20中水合。将粉末添加至水中，随后混合以确保充分溶解。接下来，将包含FeSO4 7H2O和乙二胺四乙酸(EDTA)的溶液添加至罐中。FeSO4 7H2O和EDTA在细胞培养基中具有以下最终浓度：约0.0138g/LFeSO4 7H2O；和约0.018625g/L EDTA。然后将细胞培养基储存在4℃用于以后使用。
沿两个水平表明使用(其他)复合培养基的可行性：(i)水合后的浓度测定和(ii)细胞培养性能研究。水合研究显示，关键培养基组分(在其他复合培养基中)的浓度与理论(预期)值以及与以标准方式制备的液体培养基中的浓度(参见实施例1)一致。1L灌注细胞培养研究进一步表明当使用培养基制备方法时相当的细胞培养性能(生长和代谢)和重组蛋白产生(效力/效价)(图3)。
尽管已经显示和描述了目前据信是本发明的优选实施方案的内容，但本领域技术人员将意识到，在不背离本申请中描述的本发明的精神和范围的情况下，可以进行其他和进一步实施方案，并且本申请包括在本文记载的权利要求的预期范围内的所有此类修改。本文提及和/或引用的所有专利和出版物都通过引用并入，其程度如同每个单独出版物被具体和单独地表示为以其整体通过引用并入。
序列表
<210> 1
<211> 2351
<212> PRT
<213> 智人
<400> 1
Met Gln Ile Glu Leu Ser Thr Cys Phe Phe Leu Cys Leu Leu Arg Phe
1 5 10 15
Cys Phe Ser Ala Thr Arg Arg Tyr Tyr Leu Gly Ala Val Glu Leu Ser
20 25 30
Trp Asp Tyr Met Gln Ser Asp Leu Gly Glu Leu Pro Val Asp Ala Arg
35 40 45
Phe Pro Pro Arg Val Pro Lys Ser Phe Pro Phe Asn Thr Ser Val Val
50 55 60
Tyr Lys Lys Thr Leu Phe Val Glu Phe Thr Val His Leu Phe Asn Ile
65 70 75 80
Ala Lys Pro Arg Pro Pro Trp Met Gly Leu Leu Gly Pro Thr Ile Gln
85 90 95
Ala Glu Val Tyr Asp Thr Val Val Ile Thr Leu Lys Asn Met Ala Ser
100 105 110
His Pro Val Ser Leu His Ala Val Gly Val Ser Tyr Trp Lys Ala Ser
115 120 125
Glu Gly Ala Glu Tyr Asp Asp Gln Thr Ser Gln Arg Glu Lys Glu Asp
130 135 140
Asp Lys Val Phe Pro Gly Gly Ser His Thr Tyr Val Trp Gln Val Leu
145 150 155 160
Lys Glu Asn Gly Pro Met Ala Ser Asp Pro Leu Cys Leu Thr Tyr Ser
165 170 175
Tyr Leu Ser His Val Asp Leu Val Lys Asp Leu Asn Ser Gly Leu Ile
180 185 190
Gly Ala Leu Leu Val Cys Arg Glu Gly Ser Leu Ala Lys Glu Lys Thr
195 200 205
Gln Thr Leu His Lys Phe Ile Leu Leu Phe Ala Val Phe Asp Glu Gly
210 215 220
Lys Ser Trp His Ser Glu Thr Lys Asn Ser Leu Met Gln Asp Arg Asp
225 230 235 240
Ala Ala Ser Ala Arg Ala Trp Pro Lys Met His Thr Val Asn Gly Tyr
245 250 255
Val Asn Arg Ser Leu Pro Gly Leu Ile Gly Cys His Arg Lys Ser Val
260 265 270
Tyr Trp His Val Ile Gly Met Gly Thr Thr Pro Glu Val His Ser Ile
275 280 285
Phe Leu Glu Gly His Thr Phe Leu Val Arg Asn His Arg Gln Ala Ser
290 295 300
Leu Glu Ile Ser Pro Ile Thr Phe Leu Thr Ala Gln Thr Leu Leu Met
305 310 315 320
Asp Leu Gly Gln Phe Leu Leu Phe Cys His Ile Ser Ser His Gln His
325 330 335
Asp Gly Met Glu Ala Tyr Val Lys Val Asp Ser Cys Pro Glu Glu Pro
340 345 350
Gln Leu Arg Met Lys Asn Asn Glu Glu Ala Glu Asp Tyr Asp Asp Asp
355 360 365
Leu Thr Asp Ser Glu Met Asp Val Val Arg Phe Asp Asp Asp Asn Ser
370 375 380
Pro Ser Phe Ile Gln Ile Arg Ser Val Ala Lys Lys His Pro Lys Thr
385 390 395 400
Trp Val His Tyr Ile Ala Ala Glu Glu Glu Asp Trp Asp Tyr Ala Pro
405 410 415
Leu Val Leu Ala Pro Asp Asp Arg Ser Tyr Lys Ser Gln Tyr Leu Asn
420 425 430
Asn Gly Pro Gln Arg Ile Gly Arg Lys Tyr Lys Lys Val Arg Phe Met
435 440 445
Ala Tyr Thr Asp Glu Thr Phe Lys Thr Arg Glu Ala Ile Gln His Glu
450 455 460
Ser Gly Ile Leu Gly Pro Leu Leu Tyr Gly Glu Val Gly Asp Thr Leu
465 470 475 480
Leu Ile Ile Phe Lys Asn Gln Ala Ser Arg Pro Tyr Asn Ile Tyr Pro
485 490 495
His Gly Ile Thr Asp Val Arg Pro Leu Tyr Ser Arg Arg Leu Pro Lys
500 505 510
Gly Val Lys His Leu Lys Asp Phe Pro Ile Leu Pro Gly Glu Ile Phe
515 520 525
Lys Tyr Lys Trp Thr Val Thr Val Glu Asp Gly Pro Thr Lys Ser Asp
530 535 540
Pro Arg Cys Leu Thr Arg Tyr Tyr Ser Ser Phe Val Asn Met Glu Arg
545 550 555 560
Asp Leu Ala Ser Gly Leu Ile Gly Pro Leu Leu Ile Cys Tyr Lys Glu
565 570 575
Ser Val Asp Gln Arg Gly Asn Gln Ile Met Ser Asp Lys Arg Asn Val
580 585 590
Ile Leu Phe Ser Val Phe Asp Glu Asn Arg Ser Trp Tyr Leu Thr Glu
595 600 605
Asn Ile Gln Arg Phe Leu Pro Asn Pro Ala Gly Val Gln Leu Glu Asp
610 615 620
Pro Glu Phe Gln Ala Ser Asn Ile Met His Ser Ile Asn Gly Tyr Val
625 630 635 640
Phe Asp Ser Leu Gln Leu Ser Val Cys Leu His Glu Val Ala Tyr Trp
645 650 655
Tyr Ile Leu Ser Ile Gly Ala Gln Thr Asp Phe Leu Ser Val Phe Phe
660 665 670
Ser Gly Tyr Thr Phe Lys His Lys Met Val Tyr Glu Asp Thr Leu Thr
675 680 685
Leu Phe Pro Phe Ser Gly Glu Thr Val Phe Met Ser Met Glu Asn Pro
690 695 700
Gly Leu Trp Ile Leu Gly Cys His Asn Ser Asp Phe Arg Asn Arg Gly
705 710 715 720
Met Thr Ala Leu Leu Lys Val Ser Ser Cys Asp Lys Asn Thr Gly Asp
725 730 735
Tyr Tyr Glu Asp Ser Tyr Glu Asp Ile Ser Ala Tyr Leu Leu Ser Lys
740 745 750
Asn Asn Ala Ile Glu Pro Arg Ser Phe Ser Gln Asn Ser Arg His Pro
755 760 765
Ser Thr Arg Gln Lys Gln Phe Asn Ala Thr Thr Ile Pro Glu Asn Asp
770 775 780
Ile Glu Lys Thr Asp Pro Trp Phe Ala His Arg Thr Pro Met Pro Lys
785 790 795 800
Ile Gln Asn Val Ser Ser Ser Asp Leu Leu Met Leu Leu Arg Gln Ser
805 810 815
Pro Thr Pro His Gly Leu Ser Leu Ser Asp Leu Gln Glu Ala Lys Tyr
820 825 830
Glu Thr Phe Ser Asp Asp Pro Ser Pro Gly Ala Ile Asp Ser Asn Asn
835 840 845
Ser Leu Ser Glu Met Thr His Phe Arg Pro Gln Leu His His Ser Gly
850 855 860
Asp Met Val Phe Thr Pro Glu Ser Gly Leu Gln Leu Arg Leu Asn Glu
865 870 875 880
Lys Leu Gly Thr Thr Ala Ala Thr Glu Leu Lys Lys Leu Asp Phe Lys
885 890 895
Val Ser Ser Thr Ser Asn Asn Leu Ile Ser Thr Ile Pro Ser Asp Asn
900 905 910
Leu Ala Ala Gly Thr Asp Asn Thr Ser Ser Leu Gly Pro Pro Ser Met
915 920 925
Pro Val His Tyr Asp Ser Gln Leu Asp Thr Thr Leu Phe Gly Lys Lys
930 935 940
Ser Ser Pro Leu Thr Glu Ser Gly Gly Pro Leu Ser Leu Ser Glu Glu
945 950 955 960
Asn Asn Asp Ser Lys Leu Leu Glu Ser Gly Leu Met Asn Ser Gln Glu
965 970 975
Ser Ser Trp Gly Lys Asn Val Ser Ser Thr Glu Ser Gly Arg Leu Phe
980 985 990
Lys Gly Lys Arg Ala His Gly Pro Ala Leu Leu Thr Lys Asp Asn Ala
995 1000 1005
Leu Phe Lys Val Ser Ile Ser Leu Leu Lys Thr Asn Lys Thr Ser
1010 1015 1020
Asn Asn Ser Ala Thr Asn Arg Lys Thr His Ile Asp Gly Pro Ser
1025 1030 1035
Leu Leu Ile Glu Asn Ser Pro Ser Val Trp Gln Asn Ile Leu Glu
1040 1045 1050
Ser Asp Thr Glu Phe Lys Lys Val Thr Pro Leu Ile His Asp Arg
1055 1060 1065
Met Leu Met Asp Lys Asn Ala Thr Ala Leu Arg Leu Asn His Met
1070 1075 1080
Ser Asn Lys Thr Thr Ser Ser Lys Asn Met Glu Met Val Gln Gln
1085 1090 1095
Lys Lys Glu Gly Pro Ile Pro Pro Asp Ala Gln Asn Pro Asp Met
1100 1105 1110
Ser Phe Phe Lys Met Leu Phe Leu Pro Glu Ser Ala Arg Trp Ile
1115 1120 1125
Gln Arg Thr His Gly Lys Asn Ser Leu Asn Ser Gly Gln Gly Pro
1130 1135 1140
Ser Pro Lys Gln Leu Val Ser Leu Gly Pro Glu Lys Ser Val Glu
1145 1150 1155
Gly Gln Asn Phe Leu Ser Glu Lys Asn Lys Val Val Val Gly Lys
1160 1165 1170
Gly Glu Phe Thr Lys Asp Val Gly Leu Lys Glu Met Val Phe Pro
1175 1180 1185
Ser Ser Arg Asn Leu Phe Leu Thr Asn Leu Asp Asn Leu His Glu
1190 1195 1200
Asn Asn Thr His Asn Gln Glu Lys Lys Ile Gln Glu Glu Ile Glu
1205 1210 1215
Lys Lys Glu Thr Leu Ile Gln Glu Asn Val Val Leu Pro Gln Ile
1220 1225 1230
His Thr Val Thr Gly Thr Lys Asn Phe Met Lys Asn Leu Phe Leu
1235 1240 1245
Leu Ser Thr Arg Gln Asn Val Glu Gly Ser Tyr Glu Gly Ala Tyr
1250 1255 1260
Ala Pro Val Leu Gln Asp Phe Arg Ser Leu Asn Asp Ser Thr Asn
1265 1270 1275
Arg Thr Lys Lys His Thr Ala His Phe Ser Lys Lys Gly Glu Glu
1280 1285 1290
Glu Asn Leu Glu Gly Leu Gly Asn Gln Thr Lys Gln Ile Val Glu
1295 1300 1305
Lys Tyr Ala Cys Thr Thr Arg Ile Ser Pro Asn Thr Ser Gln Gln
1310 1315 1320
Asn Phe Val Thr Gln Arg Ser Lys Arg Ala Leu Lys Gln Phe Arg
1325 1330 1335
Leu Pro Leu Glu Glu Thr Glu Leu Glu Lys Arg Ile Ile Val Asp
1340 1345 1350
Asp Thr Ser Thr Gln Trp Ser Lys Asn Met Lys His Leu Thr Pro
1355 1360 1365
Ser Thr Leu Thr Gln Ile Asp Tyr Asn Glu Lys Glu Lys Gly Ala
1370 1375 1380
Ile Thr Gln Ser Pro Leu Ser Asp Cys Leu Thr Arg Ser His Ser
1385 1390 1395
Ile Pro Gln Ala Asn Arg Ser Pro Leu Pro Ile Ala Lys Val Ser
1400 1405 1410
Ser Phe Pro Ser Ile Arg Pro Ile Tyr Leu Thr Arg Val Leu Phe
1415 1420 1425
Gln Asp Asn Ser Ser His Leu Pro Ala Ala Ser Tyr Arg Lys Lys
1430 1435 1440
Asp Ser Gly Val Gln Glu Ser Ser His Phe Leu Gln Gly Ala Lys
1445 1450 1455
Lys Asn Asn Leu Ser Leu Ala Ile Leu Thr Leu Glu Met Thr Gly
1460 1465 1470
Asp Gln Arg Glu Val Gly Ser Leu Gly Thr Ser Ala Thr Asn Ser
1475 1480 1485
Val Thr Tyr Lys Lys Val Glu Asn Thr Val Leu Pro Lys Pro Asp
1490 1495 1500
Leu Pro Lys Thr Ser Gly Lys Val Glu Leu Leu Pro Lys Val His
1505 1510 1515
Ile Tyr Gln Lys Asp Leu Phe Pro Thr Glu Thr Ser Asn Gly Ser
1520 1525 1530
Pro Gly His Leu Asp Leu Val Glu Gly Ser Leu Leu Gln Gly Thr
1535 1540 1545
Glu Gly Ala Ile Lys Trp Asn Glu Ala Asn Arg Pro Gly Lys Val
1550 1555 1560
Pro Phe Leu Arg Val Ala Thr Glu Ser Ser Ala Lys Thr Pro Ser
1565 1570 1575
Lys Leu Leu Asp Pro Leu Ala Trp Asp Asn His Tyr Gly Thr Gln
1580 1585 1590
Ile Pro Lys Glu Glu Trp Lys Ser Gln Glu Lys Ser Pro Glu Lys
1595 1600 1605
Thr Ala Phe Lys Lys Lys Asp Thr Ile Leu Ser Leu Asn Ala Cys
1610 1615 1620
Glu Ser Asn His Ala Ile Ala Ala Ile Asn Glu Gly Gln Asn Lys
1625 1630 1635
Pro Glu Ile Glu Val Thr Trp Ala Lys Gln Gly Arg Thr Glu Arg
1640 1645 1650
Leu Cys Ser Gln Asn Pro Pro Val Leu Lys Arg His Gln Arg Glu
1655 1660 1665
Ile Thr Arg Thr Thr Leu Gln Ser Asp Gln Glu Glu Ile Asp Tyr
1670 1675 1680
Asp Asp Thr Ile Ser Val Glu Met Lys Lys Glu Asp Phe Asp Ile
1685 1690 1695
Tyr Asp Glu Asp Glu Asn Gln Ser Pro Arg Ser Phe Gln Lys Lys
1700 1705 1710
Thr Arg His Tyr Phe Ile Ala Ala Val Glu Arg Leu Trp Asp Tyr
1715 1720 1725
Gly Met Ser Ser Ser Pro His Val Leu Arg Asn Arg Ala Gln Ser
1730 1735 1740
Gly Ser Val Pro Gln Phe Lys Lys Val Val Phe Gln Glu Phe Thr
1745 1750 1755
Asp Gly Ser Phe Thr Gln Pro Leu Tyr Arg Gly Glu Leu Asn Glu
1760 1765 1770
His Leu Gly Leu Leu Gly Pro Tyr Ile Arg Ala Glu Val Glu Asp
1775 1780 1785
Asn Ile Met Val Thr Phe Arg Asn Gln Ala Ser Arg Pro Tyr Ser
1790 1795 1800
Phe Tyr Ser Ser Leu Ile Ser Tyr Glu Glu Asp Gln Arg Gln Gly
1805 1810 1815
Ala Glu Pro Arg Lys Asn Phe Val Lys Pro Asn Glu Thr Lys Thr
1820 1825 1830
Tyr Phe Trp Lys Val Gln His His Met Ala Pro Thr Lys Asp Glu
1835 1840 1845
Phe Asp Cys Lys Ala Trp Ala Tyr Phe Ser Asp Val Asp Leu Glu
1850 1855 1860
Lys Asp Val His Ser Gly Leu Ile Gly Pro Leu Leu Val Cys His
1865 1870 1875
Thr Asn Thr Leu Asn Pro Ala His Gly Arg Gln Val Thr Val Gln
1880 1885 1890
Glu Phe Ala Leu Phe Phe Thr Ile Phe Asp Glu Thr Lys Ser Trp
1895 1900 1905
Tyr Phe Thr Glu Asn Met Glu Arg Asn Cys Arg Ala Pro Cys Asn
1910 1915 1920
Ile Gln Met Glu Asp Pro Thr Phe Lys Glu Asn Tyr Arg Phe His
1925 1930 1935
Ala Ile Asn Gly Tyr Ile Met Asp Thr Leu Pro Gly Leu Val Met
1940 1945 1950
Ala Gln Asp Gln Arg Ile Arg Trp Tyr Leu Leu Ser Met Gly Ser
1955 1960 1965
Asn Glu Asn Ile His Ser Ile His Phe Ser Gly His Val Phe Thr
1970 1975 1980
Val Arg Lys Lys Glu Glu Tyr Lys Met Ala Leu Tyr Asn Leu Tyr
1985 1990 1995
Pro Gly Val Phe Glu Thr Val Glu Met Leu Pro Ser Lys Ala Gly
2000 2005 2010
Ile Trp Arg Val Glu Cys Leu Ile Gly Glu His Leu His Ala Gly
2015 2020 2025
Met Ser Thr Leu Phe Leu Val Tyr Ser Asn Lys Cys Gln Thr Pro
2030 2035 2040
Leu Gly Met Ala Ser Gly His Ile Arg Asp Phe Gln Ile Thr Ala
2045 2050 2055
Ser Gly Gln Tyr Gly Gln Trp Ala Pro Lys Leu Ala Arg Leu His
2060 2065 2070
Tyr Ser Gly Ser Ile Asn Ala Trp Ser Thr Lys Glu Pro Phe Ser
2075 2080 2085
Trp Ile Lys Val Asp Leu Leu Ala Pro Met Ile Ile His Gly Ile
2090 2095 2100
Lys Thr Gln Gly Ala Arg Gln Lys Phe Ser Ser Leu Tyr Ile Ser
2105 2110 2115
Gln Phe Ile Ile Met Tyr Ser Leu Asp Gly Lys Lys Trp Gln Thr
2120 2125 2130
Tyr Arg Gly Asn Ser Thr Gly Thr Leu Met Val Phe Phe Gly Asn
2135 2140 2145
Val Asp Ser Ser Gly Ile Lys His Asn Ile Phe Asn Pro Pro Ile
2150 2155 2160
Ile Ala Arg Tyr Ile Arg Leu His Pro Thr His Tyr Ser Ile Arg
2165 2170 2175
Ser Thr Leu Arg Met Glu Leu Met Gly Cys Asp Leu Asn Ser Cys
2180 2185 2190
Ser Met Pro Leu Gly Met Glu Ser Lys Ala Ile Ser Asp Ala Gln
2195 2200 2205
Ile Thr Ala Ser Ser Tyr Phe Thr Asn Met Phe Ala Thr Trp Ser
2210 2215 2220
Pro Ser Lys Ala Arg Leu His Leu Gln Gly Arg Ser Asn Ala Trp
2225 2230 2235
Arg Pro Gln Val Asn Asn Pro Lys Glu Trp Leu Gln Val Asp Phe
2240 2245 2250
Gln Lys Thr Met Lys Val Thr Gly Val Thr Thr Gln Gly Val Lys
2255 2260 2265
Ser Leu Leu Thr Ser Met Tyr Val Lys Glu Phe Leu Ile Ser Ser
2270 2275 2280
Ser Gln Asp Gly His Gln Trp Thr Leu Phe Phe Gln Asn Gly Lys
2285 2290 2295
Val Lys Val Phe Gln Gly Asn Gln Asp Ser Phe Thr Pro Val Val
2300 2305 2310
Asn Ser Leu Asp Pro Pro Leu Leu Thr Arg Tyr Leu Arg Ile His
2315 2320 2325
Pro Gln Ser Trp Val His Gln Ile Ala Leu Arg Met Glu Val Leu
2330 2335 2340
Gly Cys Glu Ala Gln Asp Leu Tyr
2345 2350
<210> 2
<211> 2332
<212> PRT
<213> 智人
<400> 2
Ala Thr Arg Arg Tyr Tyr Leu Gly Ala Val Glu Leu Ser Trp Asp Tyr
1 5 10 15
Met Gln Ser Asp Leu Gly Glu Leu Pro Val Asp Ala Arg Phe Pro Pro
20 25 30
Arg Val Pro Lys Ser Phe Pro Phe Asn Thr Ser Val Val Tyr Lys Lys
35 40 45
Thr Leu Phe Val Glu Phe Thr Val His Leu Phe Asn Ile Ala Lys Pro
50 55 60
Arg Pro Pro Trp Met Gly Leu Leu Gly Pro Thr Ile Gln Ala Glu Val
65 70 75 80
Tyr Asp Thr Val Val Ile Thr Leu Lys Asn Met Ala Ser His Pro Val
85 90 95
Ser Leu His Ala Val Gly Val Ser Tyr Trp Lys Ala Ser Glu Gly Ala
100 105 110
Glu Tyr Asp Asp Gln Thr Ser Gln Arg Glu Lys Glu Asp Asp Lys Val
115 120 125
Phe Pro Gly Gly Ser His Thr Tyr Val Trp Gln Val Leu Lys Glu Asn
130 135 140
Gly Pro Met Ala Ser Asp Pro Leu Cys Leu Thr Tyr Ser Tyr Leu Ser
145 150 155 160
His Val Asp Leu Val Lys Asp Leu Asn Ser Gly Leu Ile Gly Ala Leu
165 170 175
Leu Val Cys Arg Glu Gly Ser Leu Ala Lys Glu Lys Thr Gln Thr Leu
180 185 190
His Lys Phe Ile Leu Leu Phe Ala Val Phe Asp Glu Gly Lys Ser Trp
195 200 205
His Ser Glu Thr Lys Asn Ser Leu Met Gln Asp Arg Asp Ala Ala Ser
210 215 220
Ala Arg Ala Trp Pro Lys Met His Thr Val Asn Gly Tyr Val Asn Arg
225 230 235 240
Ser Leu Pro Gly Leu Ile Gly Cys His Arg Lys Ser Val Tyr Trp His
245 250 255
Val Ile Gly Met Gly Thr Thr Pro Glu Val His Ser Ile Phe Leu Glu
260 265 270
Gly His Thr Phe Leu Val Arg Asn His Arg Gln Ala Ser Leu Glu Ile
275 280 285
Ser Pro Ile Thr Phe Leu Thr Ala Gln Thr Leu Leu Met Asp Leu Gly
290 295 300
Gln Phe Leu Leu Phe Cys His Ile Ser Ser His Gln His Asp Gly Met
305 310 315 320
Glu Ala Tyr Val Lys Val Asp Ser Cys Pro Glu Glu Pro Gln Leu Arg
325 330 335
Met Lys Asn Asn Glu Glu Ala Glu Asp Tyr Asp Asp Asp Leu Thr Asp
340 345 350
Ser Glu Met Asp Val Val Arg Phe Asp Asp Asp Asn Ser Pro Ser Phe
355 360 365
Ile Gln Ile Arg Ser Val Ala Lys Lys His Pro Lys Thr Trp Val His
370 375 380
Tyr Ile Ala Ala Glu Glu Glu Asp Trp Asp Tyr Ala Pro Leu Val Leu
385 390 395 400
Ala Pro Asp Asp Arg Ser Tyr Lys Ser Gln Tyr Leu Asn Asn Gly Pro
405 410 415
Gln Arg Ile Gly Arg Lys Tyr Lys Lys Val Arg Phe Met Ala Tyr Thr
420 425 430
Asp Glu Thr Phe Lys Thr Arg Glu Ala Ile Gln His Glu Ser Gly Ile
435 440 445
Leu Gly Pro Leu Leu Tyr Gly Glu Val Gly Asp Thr Leu Leu Ile Ile
450 455 460
Phe Lys Asn Gln Ala Ser Arg Pro Tyr Asn Ile Tyr Pro His Gly Ile
465 470 475 480
Thr Asp Val Arg Pro Leu Tyr Ser Arg Arg Leu Pro Lys Gly Val Lys
485 490 495
His Leu Lys Asp Phe Pro Ile Leu Pro Gly Glu Ile Phe Lys Tyr Lys
500 505 510
Trp Thr Val Thr Val Glu Asp Gly Pro Thr Lys Ser Asp Pro Arg Cys
515 520 525
Leu Thr Arg Tyr Tyr Ser Ser Phe Val Asn Met Glu Arg Asp Leu Ala
530 535 540
Ser Gly Leu Ile Gly Pro Leu Leu Ile Cys Tyr Lys Glu Ser Val Asp
545 550 555 560
Gln Arg Gly Asn Gln Ile Met Ser Asp Lys Arg Asn Val Ile Leu Phe
565 570 575
Ser Val Phe Asp Glu Asn Arg Ser Trp Tyr Leu Thr Glu Asn Ile Gln
580 585 590
Arg Phe Leu Pro Asn Pro Ala Gly Val Gln Leu Glu Asp Pro Glu Phe
595 600 605
Gln Ala Ser Asn Ile Met His Ser Ile Asn Gly Tyr Val Phe Asp Ser
610 615 620
Leu Gln Leu Ser Val Cys Leu His Glu Val Ala Tyr Trp Tyr Ile Leu
625 630 635 640
Ser Ile Gly Ala Gln Thr Asp Phe Leu Ser Val Phe Phe Ser Gly Tyr
645 650 655
Thr Phe Lys His Lys Met Val Tyr Glu Asp Thr Leu Thr Leu Phe Pro
660 665 670
Phe Ser Gly Glu Thr Val Phe Met Ser Met Glu Asn Pro Gly Leu Trp
675 680 685
Ile Leu Gly Cys His Asn Ser Asp Phe Arg Asn Arg Gly Met Thr Ala
690 695 700
Leu Leu Lys Val Ser Ser Cys Asp Lys Asn Thr Gly Asp Tyr Tyr Glu
705 710 715 720
Asp Ser Tyr Glu Asp Ile Ser Ala Tyr Leu Leu Ser Lys Asn Asn Ala
725 730 735
Ile Glu Pro Arg Ser Phe Ser Gln Asn Ser Arg His Pro Ser Thr Arg
740 745 750
Gln Lys Gln Phe Asn Ala Thr Thr Ile Pro Glu Asn Asp Ile Glu Lys
755 760 765
Thr Asp Pro Trp Phe Ala His Arg Thr Pro Met Pro Lys Ile Gln Asn
770 775 780
Val Ser Ser Ser Asp Leu Leu Met Leu Leu Arg Gln Ser Pro Thr Pro
785 790 795 800
His Gly Leu Ser Leu Ser Asp Leu Gln Glu Ala Lys Tyr Glu Thr Phe
805 810 815
Ser Asp Asp Pro Ser Pro Gly Ala Ile Asp Ser Asn Asn Ser Leu Ser
820 825 830
Glu Met Thr His Phe Arg Pro Gln Leu His His Ser Gly Asp Met Val
835 840 845
Phe Thr Pro Glu Ser Gly Leu Gln Leu Arg Leu Asn Glu Lys Leu Gly
850 855 860
Thr Thr Ala Ala Thr Glu Leu Lys Lys Leu Asp Phe Lys Val Ser Ser
865 870 875 880
Thr Ser Asn Asn Leu Ile Ser Thr Ile Pro Ser Asp Asn Leu Ala Ala
885 890 895
Gly Thr Asp Asn Thr Ser Ser Leu Gly Pro Pro Ser Met Pro Val His
900 905 910
Tyr Asp Ser Gln Leu Asp Thr Thr Leu Phe Gly Lys Lys Ser Ser Pro
915 920 925
Leu Thr Glu Ser Gly Gly Pro Leu Ser Leu Ser Glu Glu Asn Asn Asp
930 935 940
Ser Lys Leu Leu Glu Ser Gly Leu Met Asn Ser Gln Glu Ser Ser Trp
945 950 955 960
Gly Lys Asn Val Ser Ser Thr Glu Ser Gly Arg Leu Phe Lys Gly Lys
965 970 975
Arg Ala His Gly Pro Ala Leu Leu Thr Lys Asp Asn Ala Leu Phe Lys
980 985 990
Val Ser Ile Ser Leu Leu Lys Thr Asn Lys Thr Ser Asn Asn Ser Ala
995 1000 1005
Thr Asn Arg Lys Thr His Ile Asp Gly Pro Ser Leu Leu Ile Glu
1010 1015 1020
Asn Ser Pro Ser Val Trp Gln Asn Ile Leu Glu Ser Asp Thr Glu
1025 1030 1035
Phe Lys Lys Val Thr Pro Leu Ile His Asp Arg Met Leu Met Asp
1040 1045 1050
Lys Asn Ala Thr Ala Leu Arg Leu Asn His Met Ser Asn Lys Thr
1055 1060 1065
Thr Ser Ser Lys Asn Met Glu Met Val Gln Gln Lys Lys Glu Gly
1070 1075 1080
Pro Ile Pro Pro Asp Ala Gln Asn Pro Asp Met Ser Phe Phe Lys
1085 1090 1095
Met Leu Phe Leu Pro Glu Ser Ala Arg Trp Ile Gln Arg Thr His
1100 1105 1110
Gly Lys Asn Ser Leu Asn Ser Gly Gln Gly Pro Ser Pro Lys Gln
1115 1120 1125
Leu Val Ser Leu Gly Pro Glu Lys Ser Val Glu Gly Gln Asn Phe
1130 1135 1140
Leu Ser Glu Lys Asn Lys Val Val Val Gly Lys Gly Glu Phe Thr
1145 1150 1155
Lys Asp Val Gly Leu Lys Glu Met Val Phe Pro Ser Ser Arg Asn
1160 1165 1170
Leu Phe Leu Thr Asn Leu Asp Asn Leu His Glu Asn Asn Thr His
1175 1180 1185
Asn Gln Glu Lys Lys Ile Gln Glu Glu Ile Glu Lys Lys Glu Thr
1190 1195 1200
Leu Ile Gln Glu Asn Val Val Leu Pro Gln Ile His Thr Val Thr
1205 1210 1215
Gly Thr Lys Asn Phe Met Lys Asn Leu Phe Leu Leu Ser Thr Arg
1220 1225 1230
Gln Asn Val Glu Gly Ser Tyr Glu Gly Ala Tyr Ala Pro Val Leu
1235 1240 1245
Gln Asp Phe Arg Ser Leu Asn Asp Ser Thr Asn Arg Thr Lys Lys
1250 1255 1260
His Thr Ala His Phe Ser Lys Lys Gly Glu Glu Glu Asn Leu Glu
1265 1270 1275
Gly Leu Gly Asn Gln Thr Lys Gln Ile Val Glu Lys Tyr Ala Cys
1280 1285 1290
Thr Thr Arg Ile Ser Pro Asn Thr Ser Gln Gln Asn Phe Val Thr
1295 1300 1305
Gln Arg Ser Lys Arg Ala Leu Lys Gln Phe Arg Leu Pro Leu Glu
1310 1315 1320
Glu Thr Glu Leu Glu Lys Arg Ile Ile Val Asp Asp Thr Ser Thr
1325 1330 1335
Gln Trp Ser Lys Asn Met Lys His Leu Thr Pro Ser Thr Leu Thr
1340 1345 1350
Gln Ile Asp Tyr Asn Glu Lys Glu Lys Gly Ala Ile Thr Gln Ser
1355 1360 1365
Pro Leu Ser Asp Cys Leu Thr Arg Ser His Ser Ile Pro Gln Ala
1370 1375 1380
Asn Arg Ser Pro Leu Pro Ile Ala Lys Val Ser Ser Phe Pro Ser
1385 1390 1395
Ile Arg Pro Ile Tyr Leu Thr Arg Val Leu Phe Gln Asp Asn Ser
1400 1405 1410
Ser His Leu Pro Ala Ala Ser Tyr Arg Lys Lys Asp Ser Gly Val
1415 1420 1425
Gln Glu Ser Ser His Phe Leu Gln Gly Ala Lys Lys Asn Asn Leu
1430 1435 1440
Ser Leu Ala Ile Leu Thr Leu Glu Met Thr Gly Asp Gln Arg Glu
1445 1450 1455
Val Gly Ser Leu Gly Thr Ser Ala Thr Asn Ser Val Thr Tyr Lys
1460 1465 1470
Lys Val Glu Asn Thr Val Leu Pro Lys Pro Asp Leu Pro Lys Thr
1475 1480 1485
Ser Gly Lys Val Glu Leu Leu Pro Lys Val His Ile Tyr Gln Lys
1490 1495 1500
Asp Leu Phe Pro Thr Glu Thr Ser Asn Gly Ser Pro Gly His Leu
1505 1510 1515
Asp Leu Val Glu Gly Ser Leu Leu Gln Gly Thr Glu Gly Ala Ile
1520 1525 1530
Lys Trp Asn Glu Ala Asn Arg Pro Gly Lys Val Pro Phe Leu Arg
1535 1540 1545
Val Ala Thr Glu Ser Ser Ala Lys Thr Pro Ser Lys Leu Leu Asp
1550 1555 1560
Pro Leu Ala Trp Asp Asn His Tyr Gly Thr Gln Ile Pro Lys Glu
1565 1570 1575
Glu Trp Lys Ser Gln Glu Lys Ser Pro Glu Lys Thr Ala Phe Lys
1580 1585 1590
Lys Lys Asp Thr Ile Leu Ser Leu Asn Ala Cys Glu Ser Asn His
1595 1600 1605
Ala Ile Ala Ala Ile Asn Glu Gly Gln Asn Lys Pro Glu Ile Glu
1610 1615 1620
Val Thr Trp Ala Lys Gln Gly Arg Thr Glu Arg Leu Cys Ser Gln
1625 1630 1635
Asn Pro Pro Val Leu Lys Arg His Gln Arg Glu Ile Thr Arg Thr
1640 1645 1650
Thr Leu Gln Ser Asp Gln Glu Glu Ile Asp Tyr Asp Asp Thr Ile
1655 1660 1665
Ser Val Glu Met Lys Lys Glu Asp Phe Asp Ile Tyr Asp Glu Asp
1670 1675 1680
Glu Asn Gln Ser Pro Arg Ser Phe Gln Lys Lys Thr Arg His Tyr
1685 1690 1695
Phe Ile Ala Ala Val Glu Arg Leu Trp Asp Tyr Gly Met Ser Ser
1700 1705 1710
Ser Pro His Val Leu Arg Asn Arg Ala Gln Ser Gly Ser Val Pro
1715 1720 1725
Gln Phe Lys Lys Val Val Phe Gln Glu Phe Thr Asp Gly Ser Phe
1730 1735 1740
Thr Gln Pro Leu Tyr Arg Gly Glu Leu Asn Glu His Leu Gly Leu
1745 1750 1755
Leu Gly Pro Tyr Ile Arg Ala Glu Val Glu Asp Asn Ile Met Val
1760 1765 1770
Thr Phe Arg Asn Gln Ala Ser Arg Pro Tyr Ser Phe Tyr Ser Ser
1775 1780 1785
Leu Ile Ser Tyr Glu Glu Asp Gln Arg Gln Gly Ala Glu Pro Arg
1790 1795 1800
Lys Asn Phe Val Lys Pro Asn Glu Thr Lys Thr Tyr Phe Trp Lys
1805 1810 1815
Val Gln His His Met Ala Pro Thr Lys Asp Glu Phe Asp Cys Lys
1820 1825 1830
Ala Trp Ala Tyr Phe Ser Asp Val Asp Leu Glu Lys Asp Val His
1835 1840 1845
Ser Gly Leu Ile Gly Pro Leu Leu Val Cys His Thr Asn Thr Leu
1850 1855 1860
Asn Pro Ala His Gly Arg Gln Val Thr Val Gln Glu Phe Ala Leu
1865 1870 1875
Phe Phe Thr Ile Phe Asp Glu Thr Lys Ser Trp Tyr Phe Thr Glu
1880 1885 1890
Asn Met Glu Arg Asn Cys Arg Ala Pro Cys Asn Ile Gln Met Glu
1895 1900 1905
Asp Pro Thr Phe Lys Glu Asn Tyr Arg Phe His Ala Ile Asn Gly
1910 1915 1920
Tyr Ile Met Asp Thr Leu Pro Gly Leu Val Met Ala Gln Asp Gln
1925 1930 1935
Arg Ile Arg Trp Tyr Leu Leu Ser Met Gly Ser Asn Glu Asn Ile
1940 1945 1950
His Ser Ile His Phe Ser Gly His Val Phe Thr Val Arg Lys Lys
1955 1960 1965
Glu Glu Tyr Lys Met Ala Leu Tyr Asn Leu Tyr Pro Gly Val Phe
1970 1975 1980
Glu Thr Val Glu Met Leu Pro Ser Lys Ala Gly Ile Trp Arg Val
1985 1990 1995
Glu Cys Leu Ile Gly Glu His Leu His Ala Gly Met Ser Thr Leu
2000 2005 2010
Phe Leu Val Tyr Ser Asn Lys Cys Gln Thr Pro Leu Gly Met Ala
2015 2020 2025
Ser Gly His Ile Arg Asp Phe Gln Ile Thr Ala Ser Gly Gln Tyr
2030 2035 2040
Gly Gln Trp Ala Pro Lys Leu Ala Arg Leu His Tyr Ser Gly Ser
2045 2050 2055
Ile Asn Ala Trp Ser Thr Lys Glu Pro Phe Ser Trp Ile Lys Val
2060 2065 2070
Asp Leu Leu Ala Pro Met Ile Ile His Gly Ile Lys Thr Gln Gly
2075 2080 2085
Ala Arg Gln Lys Phe Ser Ser Leu Tyr Ile Ser Gln Phe Ile Ile
2090 2095 2100
Met Tyr Ser Leu Asp Gly Lys Lys Trp Gln Thr Tyr Arg Gly Asn
2105 2110 2115
Ser Thr Gly Thr Leu Met Val Phe Phe Gly Asn Val Asp Ser Ser
2120 2125 2130
Gly Ile Lys His Asn Ile Phe Asn Pro Pro Ile Ile Ala Arg Tyr
2135 2140 2145
Ile Arg Leu His Pro Thr His Tyr Ser Ile Arg Ser Thr Leu Arg
2150 2155 2160
Met Glu Leu Met Gly Cys Asp Leu Asn Ser Cys Ser Met Pro Leu
2165 2170 2175
Gly Met Glu Ser Lys Ala Ile Ser Asp Ala Gln Ile Thr Ala Ser
2180 2185 2190
Ser Tyr Phe Thr Asn Met Phe Ala Thr Trp Ser Pro Ser Lys Ala
2195 2200 2205
Arg Leu His Leu Gln Gly Arg Ser Asn Ala Trp Arg Pro Gln Val
2210 2215 2220
Asn Asn Pro Lys Glu Trp Leu Gln Val Asp Phe Gln Lys Thr Met
2225 2230 2235
Lys Val Thr Gly Val Thr Thr Gln Gly Val Lys Ser Leu Leu Thr
2240 2245 2250
Ser Met Tyr Val Lys Glu Phe Leu Ile Ser Ser Ser Gln Asp Gly
2255 2260 2265
His Gln Trp Thr Leu Phe Phe Gln Asn Gly Lys Val Lys Val Phe
2270 2275 2280
Gln Gly Asn Gln Asp Ser Phe Thr Pro Val Val Asn Ser Leu Asp
2285 2290 2295
Pro Pro Leu Leu Thr Arg Tyr Leu Arg Ile His Pro Gln Ser Trp
2300 2305 2310
Val His Gln Ile Ala Leu Arg Met Glu Val Leu Gly Cys Glu Ala
2315 2320 2325
Gln Asp Leu Tyr
2330
<210> 3
<211> 4
<212> PRT
<213> 人工序列
<220>
<223> 肽
<400> 3
Ser Phe Ser Gln
1
<210> 4
<211> 10
<212> PRT
<213> 人工序列
<220>
<223> 肽
<400> 4
Asn Pro Pro Val Leu Lys Arg His Gln Arg
1 5 10
<210> 5
<211> 1457
<212> PRT
<213> 人工序列
<220>
<223> B-结构域缺失的重组FVIII
<400> 5
Met Gln Ile Glu Leu Ser Thr Cys Phe Phe Leu Cys Leu Leu Arg Phe
1 5 10 15
Cys Phe Ser Ala Thr Arg Arg Tyr Tyr Leu Gly Ala Val Glu Leu Ser
20 25 30
Trp Asp Tyr Met Gln Ser Asp Leu Gly Glu Leu Pro Val Asp Ala Arg
35 40 45
Phe Pro Pro Arg Val Pro Lys Ser Phe Pro Phe Asn Thr Ser Val Val
50 55 60
Tyr Lys Lys Thr Leu Phe Val Glu Phe Thr Val His Leu Phe Asn Ile
65 70 75 80
Ala Lys Pro Arg Pro Pro Trp Met Gly Leu Leu Gly Pro Thr Ile Gln
85 90 95
Ala Glu Val Tyr Asp Thr Val Val Ile Thr Leu Lys Asn Met Ala Ser
100 105 110
His Pro Val Ser Leu His Ala Val Gly Val Ser Tyr Trp Lys Ala Ser
115 120 125
Glu Gly Ala Glu Tyr Asp Asp Gln Thr Ser Gln Arg Glu Lys Glu Asp
130 135 140
Asp Lys Val Phe Pro Gly Gly Ser His Thr Tyr Val Trp Gln Val Leu
145 150 155 160
Lys Glu Asn Gly Pro Met Ala Ser Asp Pro Leu Cys Leu Thr Tyr Ser
165 170 175
Tyr Leu Ser His Val Asp Leu Val Lys Asp Leu Asn Ser Gly Leu Ile
180 185 190
Gly Ala Leu Leu Val Cys Arg Glu Gly Ser Leu Ala Lys Glu Lys Thr
195 200 205
Gln Thr Leu His Lys Phe Ile Leu Leu Phe Ala Val Phe Asp Glu Gly
210 215 220
Lys Ser Trp His Ser Glu Thr Lys Asn Ser Leu Met Gln Asp Arg Asp
225 230 235 240
Ala Ala Ser Ala Arg Ala Trp Pro Lys Met His Thr Val Asn Gly Tyr
245 250 255
Val Asn Arg Ser Leu Pro Gly Leu Ile Gly Cys His Arg Lys Ser Val
260 265 270
Tyr Trp His Val Ile Gly Met Gly Thr Thr Pro Glu Val His Ser Ile
275 280 285
Phe Leu Glu Gly His Thr Phe Leu Val Arg Asn His Arg Gln Ala Ser
290 295 300
Leu Glu Ile Ser Pro Ile Thr Phe Leu Thr Ala Gln Thr Leu Leu Met
305 310 315 320
Asp Leu Gly Gln Phe Leu Leu Phe Cys His Ile Ser Ser His Gln His
325 330 335
Asp Gly Met Glu Ala Tyr Val Lys Val Asp Ser Cys Pro Glu Glu Pro
340 345 350
Gln Leu Arg Met Lys Asn Asn Glu Glu Ala Glu Asp Tyr Asp Asp Asp
355 360 365
Leu Thr Asp Ser Glu Met Asp Val Val Arg Phe Asp Asp Asp Asn Ser
370 375 380
Pro Ser Phe Ile Gln Ile Arg Ser Val Ala Lys Lys His Pro Lys Thr
385 390 395 400
Trp Val His Tyr Ile Ala Ala Glu Glu Glu Asp Trp Asp Tyr Ala Pro
405 410 415
Leu Val Leu Ala Pro Asp Asp Arg Ser Tyr Lys Ser Gln Tyr Leu Asn
420 425 430
Asn Gly Pro Gln Arg Ile Gly Arg Lys Tyr Lys Lys Val Arg Phe Met
435 440 445
Ala Tyr Thr Asp Glu Thr Phe Lys Thr Arg Glu Ala Ile Gln His Glu
450 455 460
Ser Gly Ile Leu Gly Pro Leu Leu Tyr Gly Glu Val Gly Asp Thr Leu
465 470 475 480
Leu Ile Ile Phe Lys Asn Gln Ala Ser Arg Pro Tyr Asn Ile Tyr Pro
485 490 495
His Gly Ile Thr Asp Val Arg Pro Leu Tyr Ser Arg Arg Leu Pro Lys
500 505 510
Gly Val Lys His Leu Lys Asp Phe Pro Ile Leu Pro Gly Glu Ile Phe
515 520 525
Lys Tyr Lys Trp Thr Val Thr Val Glu Asp Gly Pro Thr Lys Ser Asp
530 535 540
Pro Arg Cys Leu Thr Arg Tyr Tyr Ser Ser Phe Val Asn Met Glu Arg
545 550 555 560
Asp Leu Ala Ser Gly Leu Ile Gly Pro Leu Leu Ile Cys Tyr Lys Glu
565 570 575
Ser Val Asp Gln Arg Gly Asn Gln Ile Met Ser Asp Lys Arg Asn Val
580 585 590
Ile Leu Phe Ser Val Phe Asp Glu Asn Arg Ser Trp Tyr Leu Thr Glu
595 600 605
Asn Ile Gln Arg Phe Leu Pro Asn Pro Ala Gly Val Gln Leu Glu Asp
610 615 620
Pro Glu Phe Gln Ala Ser Asn Ile Met His Ser Ile Asn Gly Tyr Val
625 630 635 640
Phe Asp Ser Leu Gln Leu Ser Val Cys Leu His Glu Val Ala Tyr Trp
645 650 655
Tyr Ile Leu Ser Ile Gly Ala Gln Thr Asp Phe Leu Ser Val Phe Phe
660 665 670
Ser Gly Tyr Thr Phe Lys His Lys Met Val Tyr Glu Asp Thr Leu Thr
675 680 685
Leu Phe Pro Phe Ser Gly Glu Thr Val Phe Met Ser Met Glu Asn Pro
690 695 700
Gly Leu Trp Ile Leu Gly Cys His Asn Ser Asp Phe Arg Asn Arg Gly
705 710 715 720
Met Thr Ala Leu Leu Lys Val Ser Ser Cys Asp Lys Asn Thr Gly Asp
725 730 735
Tyr Tyr Glu Asp Ser Tyr Glu Asp Ile Ser Ala Tyr Leu Leu Ser Lys
740 745 750
Asn Asn Ala Ile Glu Pro Arg Ser Phe Ser Gln Asn Pro Pro Val Leu
755 760 765
Lys Arg His Gln Arg Glu Ile Thr Arg Thr Thr Leu Gln Ser Asp Gln
770 775 780
Glu Glu Ile Asp Tyr Asp Asp Thr Ile Ser Val Glu Met Lys Lys Glu
785 790 795 800
Asp Phe Asp Ile Tyr Asp Glu Asp Glu Asn Gln Ser Pro Arg Ser Phe
805 810 815
Gln Lys Lys Thr Arg His Tyr Phe Ile Ala Ala Val Glu Arg Leu Trp
820 825 830
Asp Tyr Gly Met Ser Ser Ser Pro His Val Leu Arg Asn Arg Ala Gln
835 840 845
Ser Gly Ser Val Pro Gln Phe Lys Lys Val Val Phe Gln Glu Phe Thr
850 855 860
Asp Gly Ser Phe Thr Gln Pro Leu Tyr Arg Gly Glu Leu Asn Glu His
865 870 875 880
Leu Gly Leu Leu Gly Pro Tyr Ile Arg Ala Glu Val Glu Asp Asn Ile
885 890 895
Met Val Thr Phe Arg Asn Gln Ala Ser Arg Pro Tyr Ser Phe Tyr Ser
900 905 910
Ser Leu Ile Ser Tyr Glu Glu Asp Gln Arg Gln Gly Ala Glu Pro Arg
915 920 925
Lys Asn Phe Val Lys Pro Asn Glu Thr Lys Thr Tyr Phe Trp Lys Val
930 935 940
Gln His His Met Ala Pro Thr Lys Asp Glu Phe Asp Cys Lys Ala Trp
945 950 955 960
Ala Tyr Phe Ser Asp Val Asp Leu Glu Lys Asp Val His Ser Gly Leu
965 970 975
Ile Gly Pro Leu Leu Val Cys His Thr Asn Thr Leu Asn Pro Ala His
980 985 990
Gly Arg Gln Val Thr Val Gln Glu Phe Ala Leu Phe Phe Thr Ile Phe
995 1000 1005
Asp Glu Thr Lys Ser Trp Tyr Phe Thr Glu Asn Met Glu Arg Asn
1010 1015 1020
Cys Arg Ala Pro Cys Asn Ile Gln Met Glu Asp Pro Thr Phe Lys
1025 1030 1035
Glu Asn Tyr Arg Phe His Ala Ile Asn Gly Tyr Ile Met Asp Thr
1040 1045 1050
Leu Pro Gly Leu Val Met Ala Gln Asp Gln Arg Ile Arg Trp Tyr
1055 1060 1065
Leu Leu Ser Met Gly Ser Asn Glu Asn Ile His Ser Ile His Phe
1070 1075 1080
Ser Gly His Val Phe Thr Val Arg Lys Lys Glu Glu Tyr Lys Met
1085 1090 1095
Ala Leu Tyr Asn Leu Tyr Pro Gly Val Phe Glu Thr Val Glu Met
1100 1105 1110
Leu Pro Ser Lys Ala Gly Ile Trp Arg Val Glu Cys Leu Ile Gly
1115 1120 1125
Glu His Leu His Ala Gly Met Ser Thr Leu Phe Leu Val Tyr Ser
1130 1135 1140
Asn Lys Cys Gln Thr Pro Leu Gly Met Ala Ser Gly His Ile Arg
1145 1150 1155
Asp Phe Gln Ile Thr Ala Ser Gly Gln Tyr Gly Gln Trp Ala Pro
1160 1165 1170
Lys Leu Ala Arg Leu His Tyr Ser Gly Ser Ile Asn Ala Trp Ser
1175 1180 1185
Thr Lys Glu Pro Phe Ser Trp Ile Lys Val Asp Leu Leu Ala Pro
1190 1195 1200
Met Ile Ile His Gly Ile Lys Thr Gln Gly Ala Arg Gln Lys Phe
1205 1210 1215
Ser Ser Leu Tyr Ile Ser Gln Phe Ile Ile Met Tyr Ser Leu Asp
1220 1225 1230
Gly Lys Lys Trp Gln Thr Tyr Arg Gly Asn Ser Thr Gly Thr Leu
1235 1240 1245
Met Val Phe Phe Gly Asn Val Asp Ser Ser Gly Ile Lys His Asn
1250 1255 1260
Ile Phe Asn Pro Pro Ile Ile Ala Arg Tyr Ile Arg Leu His Pro
1265 1270 1275
Thr His Tyr Ser Ile Arg Ser Thr Leu Arg Met Glu Leu Met Gly
1280 1285 1290
Cys Asp Leu Asn Ser Cys Ser Met Pro Leu Gly Met Glu Ser Lys
1295 1300 1305
Ala Ile Ser Asp Ala Gln Ile Thr Ala Ser Ser Tyr Phe Thr Asn
1310 1315 1320
Met Phe Ala Thr Trp Ser Pro Ser Lys Ala Arg Leu His Leu Gln
1325 1330 1335
Gly Arg Ser Asn Ala Trp Arg Pro Gln Val Asn Asn Pro Lys Glu
1340 1345 1350
Trp Leu Gln Val Asp Phe Gln Lys Thr Met Lys Val Thr Gly Val
1355 1360 1365
Thr Thr Gln Gly Val Lys Ser Leu Leu Thr Ser Met Tyr Val Lys
1370 1375 1380
Glu Phe Leu Ile Ser Ser Ser Gln Asp Gly His Gln Trp Thr Leu
1385 1390 1395
Phe Phe Gln Asn Gly Lys Val Lys Val Phe Gln Gly Asn Gln Asp
1400 1405 1410
Ser Phe Thr Pro Val Val Asn Ser Leu Asp Pro Pro Leu Leu Thr
1415 1420 1425
Arg Tyr Leu Arg Ile His Pro Gln Ser Trp Val His Gln Ile Ala
1430 1435 1440
Leu Arg Met Glu Val Leu Gly Cys Glu Ala Gln Asp Leu Tyr
1445 1450 1455
<210> 6
<211> 1438
<212> PRT
<213> 人工序列
<220>
<223> B-结构域缺失的重组FVIII
<400> 6
Ala Thr Arg Arg Tyr Tyr Leu Gly Ala Val Glu Leu Ser Trp Asp Tyr
1 5 10 15
Met Gln Ser Asp Leu Gly Glu Leu Pro Val Asp Ala Arg Phe Pro Pro
20 25 30
Arg Val Pro Lys Ser Phe Pro Phe Asn Thr Ser Val Val Tyr Lys Lys
35 40 45
Thr Leu Phe Val Glu Phe Thr Asp His Leu Phe Asn Ile Ala Lys Pro
50 55 60
Arg Pro Pro Trp Met Gly Leu Leu Gly Pro Thr Ile Gln Ala Glu Val
65 70 75 80
Tyr Asp Thr Val Val Ile Thr Leu Lys Asn Met Ala Ser His Pro Val
85 90 95
Ser Leu His Ala Val Gly Val Ser Tyr Trp Lys Ala Ser Glu Gly Ala
100 105 110
Glu Tyr Asp Asp Gln Thr Ser Gln Arg Glu Lys Glu Asp Asp Lys Val
115 120 125
Phe Pro Gly Gly Ser His Thr Tyr Val Trp Gln Val Leu Lys Glu Asn
130 135 140
Gly Pro Met Ala Ser Asp Pro Leu Cys Leu Thr Tyr Ser Tyr Leu Ser
145 150 155 160
His Val Asp Leu Val Lys Asp Leu Asn Ser Gly Leu Ile Gly Ala Leu
165 170 175
Leu Val Cys Arg Glu Gly Ser Leu Ala Lys Glu Lys Thr Gln Thr Leu
180 185 190
His Lys Phe Ile Leu Leu Phe Ala Val Phe Asp Glu Gly Lys Ser Trp
195 200 205
His Ser Glu Thr Lys Asn Ser Leu Met Gln Asp Arg Asp Ala Ala Ser
210 215 220
Ala Arg Ala Trp Pro Lys Met His Thr Val Asn Gly Tyr Val Asn Arg
225 230 235 240
Ser Leu Pro Gly Leu Ile Gly Cys His Arg Lys Ser Val Tyr Trp His
245 250 255
Val Ile Gly Met Gly Thr Thr Pro Glu Val His Ser Ile Phe Leu Glu
260 265 270
Gly His Thr Phe Leu Val Arg Asn His Arg Gln Ala Ser Leu Glu Ile
275 280 285
Ser Pro Ile Thr Phe Leu Thr Ala Gln Thr Leu Leu Met Asp Leu Gly
290 295 300
Gln Phe Leu Leu Phe Cys His Ile Ser Ser His Gln His Asp Gly Met
305 310 315 320
Glu Ala Tyr Val Lys Val Asp Ser Cys Pro Glu Glu Pro Gln Leu Arg
325 330 335
Met Lys Asn Asn Glu Glu Ala Glu Asp Tyr Asp Asp Asp Leu Thr Asp
340 345 350
Ser Glu Met Asp Val Val Arg Phe Asp Asp Asp Asn Ser Pro Ser Phe
355 360 365
Ile Gln Ile Arg Ser Val Ala Lys Lys His Pro Lys Thr Trp Val His
370 375 380
Tyr Ile Ala Ala Glu Glu Glu Asp Trp Asp Tyr Ala Pro Leu Val Leu
385 390 395 400
Ala Pro Asp Asp Arg Ser Tyr Lys Ser Gln Tyr Leu Asn Asn Gly Pro
405 410 415
Gln Arg Ile Gly Arg Lys Tyr Lys Lys Val Arg Phe Met Ala Tyr Thr
420 425 430
Asp Glu Thr Phe Lys Thr Arg Glu Ala Ile Gln His Glu Ser Gly Ile
435 440 445
Leu Gly Pro Leu Leu Tyr Gly Glu Val Gly Asp Thr Leu Leu Ile Ile
450 455 460
Phe Lys Asn Gln Ala Ser Arg Pro Tyr Asn Ile Tyr Pro His Gly Ile
465 470 475 480
Thr Asp Val Arg Pro Leu Tyr Ser Arg Arg Leu Pro Lys Gly Val Lys
485 490 495
His Leu Lys Asp Phe Pro Ile Leu Pro Gly Glu Ile Phe Lys Tyr Lys
500 505 510
Trp Thr Val Thr Val Glu Asp Gly Pro Thr Lys Ser Asp Pro Arg Cys
515 520 525
Leu Thr Arg Tyr Tyr Ser Ser Phe Val Asn Met Glu Arg Asp Leu Ala
530 535 540
Ser Gly Leu Ile Gly Pro Leu Leu Ile Cys Tyr Lys Glu Ser Val Asp
545 550 555 560
Gln Arg Gly Asn Gln Ile Met Ser Asp Lys Arg Asn Val Ile Leu Phe
565 570 575
Ser Val Phe Asp Glu Asn Arg Ser Trp Tyr Leu Thr Glu Asn Ile Gln
580 585 590
Arg Phe Leu Pro Asn Pro Ala Gly Val Gln Leu Glu Asp Pro Glu Phe
595 600 605
Gln Ala Ser Asn Ile Met His Ser Ile Asn Gly Tyr Val Phe Asp Ser
610 615 620
Leu Gln Leu Ser Val Cys Leu His Glu Val Ala Tyr Trp Tyr Ile Leu
625 630 635 640
Ser Ile Gly Ala Gln Thr Asp Phe Leu Ser Val Phe Phe Ser Gly Tyr
645 650 655
Thr Phe Lys His Lys Met Val Tyr Glu Asp Thr Leu Thr Leu Phe Pro
660 665 670
Phe Ser Gly Glu Thr Val Phe Met Ser Met Glu Asn Pro Gly Leu Trp
675 680 685
Ile Leu Gly Cys His Asn Ser Asp Phe Arg Asn Arg Gly Met Thr Ala
690 695 700
Leu Leu Lys Val Ser Ser Cys Asp Lys Asn Thr Gly Asp Tyr Tyr Glu
705 710 715 720
Asp Ser Tyr Glu Asp Ile Ser Ala Tyr Leu Leu Ser Lys Asn Asn Ala
725 730 735
Ile Glu Pro Arg Ser Phe Ser Gln Asn Pro Pro Val Leu Lys Arg His
740 745 750
Gln Arg Glu Ile Thr Arg Thr Thr Leu Gln Ser Asp Gln Glu Glu Ile
755 760 765
Asp Tyr Asp Asp Thr Ile Ser Val Glu Met Lys Lys Glu Asp Phe Asp
770 775 780
Ile Tyr Asp Glu Asp Glu Asn Gln Ser Pro Arg Ser Phe Gln Lys Lys
785 790 795 800
Thr Arg His Tyr Phe Ile Ala Ala Val Glu Arg Leu Trp Asp Tyr Gly
805 810 815
Met Ser Ser Ser Pro His Val Leu Arg Asn Arg Ala Gln Ser Gly Ser
820 825 830
Val Pro Gln Phe Lys Lys Val Val Phe Gln Glu Phe Thr Asp Gly Ser
835 840 845
Phe Thr Gln Pro Leu Tyr Arg Gly Glu Leu Asn Glu His Leu Gly Leu
850 855 860
Leu Gly Pro Tyr Ile Arg Ala Glu Val Glu Asp Asn Ile Met Val Thr
865 870 875 880
Phe Arg Asn Gln Ala Ser Arg Pro Tyr Ser Phe Tyr Ser Ser Leu Ile
885 890 895
Ser Tyr Glu Glu Asp Gln Arg Gln Gly Ala Glu Pro Arg Lys Asn Phe
900 905 910
Val Lys Pro Asn Glu Thr Lys Thr Tyr Phe Trp Lys Val Gln His His
915 920 925
Met Ala Pro Thr Lys Asp Glu Phe Asp Cys Lys Ala Trp Ala Tyr Phe
930 935 940
Ser Asp Val Asp Leu Glu Lys Asp Val His Ser Gly Leu Ile Gly Pro
945 950 955 960
Leu Leu Val Cys His Thr Asn Thr Leu Asn Pro Ala His Gly Arg Gln
965 970 975
Val Thr Val Gln Glu Phe Ala Leu Phe Phe Thr Ile Phe Asp Glu Thr
980 985 990
Lys Ser Trp Tyr Phe Thr Glu Asn Met Glu Arg Asn Cys Arg Ala Pro
995 1000 1005
Cys Asn Ile Gln Met Glu Asp Pro Thr Phe Lys Glu Asn Tyr Arg
1010 1015 1020
Phe His Ala Ile Asn Gly Tyr Ile Met Asp Thr Leu Pro Gly Leu
1025 1030 1035
Val Met Ala Gln Asp Gln Arg Ile Arg Trp Tyr Leu Leu Ser Met
1040 1045 1050
Gly Ser Asn Glu Asn Ile His Ser Ile His Phe Ser Gly His Val
1055 1060 1065
Phe Thr Val Arg Lys Lys Glu Glu Tyr Lys Met Ala Leu Tyr Asn
1070 1075 1080
Leu Tyr Pro Gly Val Phe Glu Thr Val Glu Met Leu Pro Ser Lys
1085 1090 1095
Ala Gly Ile Trp Arg Val Glu Cys Leu Ile Gly Glu His Leu His
1100 1105 1110
Ala Gly Met Ser Thr Leu Phe Leu Val Tyr Ser Asn Lys Cys Gln
1115 1120 1125
Thr Pro Leu Gly Met Ala Ser Gly His Ile Arg Asp Phe Gln Ile
1130 1135 1140
Thr Ala Ser Gly Gln Tyr Gly Gln Trp Ala Pro Lys Leu Ala Arg
1145 1150 1155
Leu His Tyr Ser Gly Ser Ile Asn Ala Trp Ser Thr Lys Glu Pro
1160 1165 1170
Phe Ser Trp Ile Lys Val Asp Leu Leu Ala Pro Met Ile Ile His
1175 1180 1185
Gly Ile Lys Thr Gln Gly Ala Arg Gln Lys Phe Ser Ser Leu Tyr
1190 1195 1200
Ile Ser Gln Phe Ile Ile Met Tyr Ser Leu Asp Gly Lys Lys Trp
1205 1210 1215
Gln Thr Tyr Arg Gly Asn Ser Thr Gly Thr Leu Met Val Phe Phe
1220 1225 1230
Gly Asn Val Asp Ser Ser Gly Ile Lys His Asn Ile Phe Asn Pro
1235 1240 1245
Pro Ile Ile Ala Arg Tyr Ile Arg Leu His Pro Thr His Tyr Ser
1250 1255 1260
Ile Arg Ser Thr Leu Arg Met Glu Leu Met Gly Cys Asp Leu Asn
1265 1270 1275
Ser Cys Ser Met Pro Leu Gly Met Glu Ser Lys Ala Ile Ser Asp
1280 1285 1290
Ala Gln Ile Thr Ala Ser Ser Tyr Phe Thr Asn Met Phe Ala Thr
1295 1300 1305
Trp Ser Pro Ser Lys Ala Arg Leu His Leu Gln Gly Arg Ser Asn
1310 1315 1320
Ala Trp Arg Pro Gln Val Asn Asn Pro Lys Glu Trp Leu Gln Val
1325 1330 1335
Asp Phe Gln Lys Thr Met Lys Val Thr Gly Val Thr Thr Gln Gly
1340 1345 1350
Val Lys Ser Leu Leu Thr Ser Met Tyr Val Lys Glu Phe Leu Ile
1355 1360 1365
Ser Ser Ser Gln Asp Gly His Gln Trp Thr Leu Phe Phe Gln Asn
1370 1375 1380
Gly Lys Val Lys Val Phe Gln Gly Asn Gln Asp Ser Phe Thr Pro
1385 1390 1395
Val Val Asn Ser Leu Asp Pro Pro Leu Leu Thr Arg Tyr Leu Arg
1400 1405 1410
Ile His Pro Gln Ser Trp Val His Gln Ile Ala Leu Arg Met Glu
1415 1420 1425
Val Leu Gly Cys Glu Ala Gln Asp Leu Tyr
1430 1435

Claims (44)

1.复合细胞培养基粉末制剂，其包含基础培养基粉末和细胞培养基补充剂，其中所述细胞培养基补充剂包含
i) 一种或多种盐；
ii) 一种或多种生长因子；
iii) 一种或多种无机离子；
iv) 包含天冬酰胺、谷氨酰胺、组氨酸和丝氨酸中的一种或多种的氨基酸补充剂；
v) 一种或多种缓冲剂；和
vi) 一种或多种消泡剂。
2.权利要求1的复合细胞培养基粉末制剂，其中所述基础培养基粉末包含Dulbecco氏改良的Eagle氏培养基、Ham氏培养基F12、Eagle氏最小必需培养基、RPMI 1640培养基和Dulbecco氏改良的Eagle氏培养基/Ham氏F12培养基(DMEM/F-12；1:1比率)。
3.权利要求1的复合细胞培养基粉末制剂，其中所述基础培养基粉末包含以下组分的一种或多种或其组合：生物素、氯化钙、氯化胆碱、氰钴胺素 (B12)、D+ 甘露糖、D-泛酸钙、右旋糖(无水)、DL-α-硫辛酸、硝酸铁9H20、硫酸亚铁7H20、叶酸、甘氨酸、次黄嘌呤、I-肌醇、L-丙氨酸、L-精氨酸、L-天冬酰胺、L-天冬氨酸、L-半胱氨酸HCl H20、L-胱氨酸2HCl、L-谷氨酸(无水)、L-谷氨酰胺、L-谷胱甘肽、L-组氨酸 FB、L-组氨酸 HCl、L-异亮氨酸、L-亮氨酸、L-赖氨酸、L-甲硫氨酸、L-苯丙氨酸、L-脯氨酸、L-丝氨酸、L-苏氨酸、L-色氨酸、L-酪氨酸、L-缬氨酸、氯化镁、无水硫酸镁、烟酰胺、O-磷酸乙醇胺、氯化钾、腐胺2HCl、吡哆醛HCl、吡哆醇HCl、核黄素、氯化钠、磷酸二氢钠H20、无水磷酸氢二钠、丙酮酸钠、硫胺素HCl、胸苷、硫酸锌7H20、硫酸铜、二氧化硒、亚油酸、β-巯基乙醇和乙醇胺游离碱FB。
4.权利要求3的复合细胞培养基粉末制剂，其中所述基础培养基粉末在水合以形成细胞培养基后具有8-30 g/L的浓度。
5.权利要求4的复合细胞培养基粉末制剂，其中所述基础培养基粉末在水合以形成细胞培养基后具有约13 g/L的浓度。
6.权利要求1-5的复合细胞培养基粉末制剂，其进一步包含pH指示剂。
7.权利要求6的复合细胞培养基粉末制剂，其中所述pH指示剂是酚红Na，其中所述酚红Na在水合以形成细胞培养基后以约0.001至约0.02 g/L的浓度存在。
8.权利要求7的复合细胞培养基粉末制剂，其中所述酚红Na在水合以形成细胞培养基后以约0.0069 g/L的浓度存在。
9.权利要求3的复合细胞培养基粉末制剂，其中所述基础培养基粉末组分在水合以形成细胞培养基后具有以下最终浓度：
i) 0.0003-0.003 g/L 生物素；
ii) 0.035-0.33 g/L 氯化钙；
iii) 0.003-0.03 g/L 氯化胆碱；
iv) 0.0002-0.002 g/L 氰钴胺素 (B12)；
v) 1-10 g/L D+ 甘露糖；
vi) 0.001-0.01 g/L D-泛酸钙；
vii) 0.3-3.0 g/L 右旋糖(无水)；
viii) 0.00003-0.0003 g/L DL-α-硫辛酸；
ix) 0.00001-0.00015 g/L 硝酸铁；
x) 0.00005-0.0015 g/L 硫酸亚铁；
xi) 0.001-0.01 g/L 叶酸；
xii) 0.007-0.20 g/L 甘氨酸；
xiii) 0.001-0.01 g/L 次黄嘌呤 2Na；
xiv) 0.005-0.05 g/L I-肌醇；
xv) 0.003-0.03 g/L L-丙氨酸；
xvi) 0.08-1.4 g/L L-精氨酸；
xvii) 0.006-0.16 g/L L-天冬酰胺；
xviii) 0.005-0.10 g/L L-天冬氨酸；
xix) 0.005-0.05 g/L L-半胱氨酸HCl；
xx) 0.02-0.2 g/L L-胱氨酸2HCl；
xxi) 0.005-0.15 g/L L-谷氨酸(无水)；
xxii) 0.02-1.5 g/L L-谷氨酰胺；
xxiii) 0.0003-0.003 g/L L-谷胱甘肽；
xxiv) 0.02-0.2 g/L L-组氨酸 HCl；
xxv) 0.03-0.9 g/L L-异亮氨酸；
xxvi) 0.03-0.9 g/L L-亮氨酸；
xxvii) 0.05-1.5 g/L L-赖氨酸；
xxviii) 0.01-0.3 g/L L-甲硫氨酸；
xxix) 0.02-0.6 g/L L-苯丙氨酸；
xxx) 0.008-0.25 g/L L-脯氨酸；
xxxi) 0.009-0.25 g/L L-丝氨酸；
xxxii) 0.03-0.9 g/L L-苏氨酸；
xxxiii) 0.006-0.16 g/L L-色氨酸；
xxxiv) 0.02-0.9 g/L L-酪氨酸 2Na；
xxxv) 0.03-0.9 g/L L-缬氨酸；
xxxvi) 0.01-0.18 g/L 氯化镁 ；
xxxvii) 0.02-0.12 g/L 无水硫酸镁；
xxxviii) 0.001-0.01 g/L 烟酰胺；
xxxix) 0.0005-0.005 g/L O-磷酸乙醇胺；
xl) 0.1-1.0 g/L 氯化钾；
xli) 0.00002-0.0002 g/L 腐胺2HCl；
xlii) 0.001-0.01 g/L 吡哆醛HCl；
xliii) 0.00001-0.0001 g/L 吡哆醇HCl，
xliv) 0.0001-0.001 g/L 核黄素，
xlv) 2.0-15 g/L 氯化钠，
xlvi) 0.01-0.2 g/L 磷酸二氢钠，
xlvii) 0.02-0.2 g/L 无水磷酸氢二钠，
xlviii) 0.015-0.15 g/L 丙酮酸钠，
xlix) 0.001-0.01 g/L 硫胺素HCl，
l) 0.0001-0.001 g/L 胸苷，
li) 0.00006-0.0015 g/L 硫酸锌，
lii) 0.0000003-0.000006 g/L 硫酸铜，
liii) 0.0000005-0.000008 g/L 二氧化硒，
liv) 0.00001-0.0001 g/L 亚油酸，
lv) 0.0001-0.001 g/L β-巯基乙醇；和
lvi) 0.0003-0.005 g/L 乙醇胺。
10.权利要求9的复合细胞培养基粉末制剂，其中所述基础培养基粉末组分在水合以形成细胞培养基后具有以下最终浓度：
i) 约0.001 g/L 生物素；
ii) 约0.11665 g/L 氯化钙；
iii) 约0.00998 g/L 氯化胆碱；
iv) 约0.00068 g/L 氰钴胺素 (B12)；
v) 约3 g/L D+ 甘露糖；
vi) 约0.00312 g/L D-泛酸钙；
vii) 约1 g/L 右旋糖(无水)；
viii) 约0.000103 g/L DL-α-硫辛酸；
ix) 约0.00005 g/L 硝酸铁9H20；
x) 约0.000417 g/L 硫酸亚铁7H20；
xi) 约0.00366 g/L 叶酸；
xii) 约0.02626 g/L 甘氨酸；
xiii) 约0.0027 g/L 次黄嘌呤 2Na；
xiv) 约0.01451 g/L I-肌醇；
xv) 约0.01336 g/L L-丙氨酸；
xvi) 约0.27435 g/L L-精氨酸；
xvii) 约0.0225 g/L L-天冬酰胺；
xviii) 约0.01995 g/L L-天冬氨酸；
xix) 约0.01756 g/L L-半胱氨酸HCl H20；
xx) 约0.06256 g/L L-胱氨酸2HCl；
xxi) 约0.02206 g/L L-谷氨酸(无水)；
xxii) 约0.73 g/L L-谷氨酰胺；
xxiii) 约0.001 g/L L-谷胱甘肽；
xxiv) 约0.07348 g/L L-组氨酸 HCl；
xxv) 约0.1057 g/L L-异亮氨酸；
xxvi) 约0.11096 g/L L-亮氨酸；
xxvii) 约0.16385 g/L L-赖氨酸；
xxviii) 约0.03224 g/L L-甲硫氨酸；
xxix) 约0.06748 g/L L-苯丙氨酸；
xxx) 约0.02875 g/L L-脯氨酸；
xxxi) 约0.03676 g/L L-丝氨酸；
xxxii) 约0.10156 g/L L-苏氨酸；
xxxiii) 约0.01902 g/L L-色氨酸；
xxxiv) 约0.10771 g/L L-酪氨酸 2Na 2H2O；
xxxv) 约0.09866 g/L L-缬氨酸；
xxxvi) 约0.028 g/L 氯化镁 ；
xxxvii) 约0.04884 g/L 无水硫酸镁；
xxxviii) 约0.00302 g/L 烟酰胺；
xxxix) 约0.0014 g/L O-磷酸乙醇胺；
xl) 约0.31182 g/L 氯化钾；
xli) 约0.000081 g/L 腐胺2HCl；
xlii) 约0.003 g/L 吡哆醛HCl；
xliii) 约0.000031 g/L 吡哆醇HCl，
xliv) 约0.000319 g/L 核黄素，
xlv) 约6.1234 g/L 氯化钠，
xlvi) 约0.0625 g/L 磷酸二氢钠H20，
xlvii) 约0.07099 g/L 无水磷酸氢二钠，
xlviii) 约0.055 丙酮酸钠，
xlix) 约0.00317 g/L 硫胺素HCl，
l) 约0.000364 g/L 胸苷，
li) 约0.000432 g/L 硫酸锌7H20，
lii) 约0.00000125 g/L 硫酸铜5H2O，
liii) 约0.00000222 g/L 二氧化硒，
liv) 约0.000042 g/L 亚油酸，
lv) 约0.00039065 g/L β-巯基乙醇；和
lvi) 约0.0012 g/L 乙醇胺FB。
11.权利要求1-10的复合细胞培养基粉末制剂，其中权利要求1的部分i)的一种或多种盐包含在水合以形成细胞培养基后浓度为0.5-5 g/L的氯化镁。
12.权利要求11的复合细胞培养基粉末制剂，其中所述氯化镁在水合以形成细胞培养基后具有约1.428 g/L的浓度。
13.权利要求1-12的复合细胞培养基粉末制剂，其中所述生长因子包含重组胰岛素。
14.权利要求13的复合细胞培养基粉末制剂，其中所述胰岛素在水合以形成细胞培养基后具有0.5-15 mg/L的浓度。
15.权利要求14的复合细胞培养基粉末制剂，其中所述胰岛素在水合以形成细胞培养基后具有约3 mg/L的浓度。
16.权利要求1-15的复合细胞培养基粉末制剂，其中所述一种或多种无机离子包含选自钼酸铵、硫酸铬钾、硫酸铜、氯化锂、硫酸锰、偏硅酸钠及其组合的痕量金属。
17.权利要求16的复合细胞培养基粉末制剂，其中所述钼酸铵是钼酸铵4H2O；所述硫酸铬钾是硫酸铬钾12H2O，所述硫酸铜是硫酸铜5H2O，所述氯化锂是氯化锂(无水)，所述硫酸锰是硫酸锰H2O，且所述偏硅酸钠是偏硅酸钠9H2O。
18.权利要求17的复合细胞培养基粉末制剂，其中所述痕量金属在水合以形成细胞培养基后具有以下最终浓度：
i) 0.0005-0.01 mg/L钼酸铵4H2O；
ii) 0.0001-0.01 mg/L硫酸铬钾12H2O；
iii) 0.001-0.125 mg/L硫酸铜5H2O；
iv) 0.001-0.1 mg/L氯化锂(无水)；
v) 0.00004-0.004 mg/L硫酸锰H2O；和
vi) 0.04-4.2 mg/L偏硅酸钠9H2O。
19.权利要求1-18的复合细胞培养基粉末制剂，其中所述复合细胞培养基粉末制剂包含钼酸铵4H2O、硫酸铬钾12H2O、硫酸铜5H2O、氯化锂(无水)、硫酸锰H2O和偏硅酸钠9H2O的组合。
20.权利要求19的复合细胞培养基粉末制剂，其中所述痕量金属在水合以形成细胞培养基后具有以下最终浓度：
i) 约0.0037 mg/L钼酸铵4H2O；
ii) 约0.001 mg/L硫酸铬钾12H2O；
iii) 约0.0125 mg/L硫酸铜5H2O；
iv) 约0.01 mg/L氯化锂(无水)；
v) 约0.000452 mg/L硫酸锰H2O；和
vi) 约0.4263 mg/L偏硅酸钠9H2O。
21.权利要求1-20的复合细胞培养基粉末制剂，其中所述氨基酸补充剂包含天冬酰胺H2O、谷氨酰胺、组氨酸和丝氨酸的组合。
22.权利要求1-21的复合细胞培养基粉末制剂，其中所述氨基酸补充剂在水合以形成细胞培养基后具有以下最终浓度：
i) 0.007-0.07 g/L 天冬酰胺H2O；
ii) 0.25-2.5 g/L 谷氨酰胺；
iii) 0.5-5.0 g/L 组氨酸，游离碱；和
iv) 0.01-0.1 g/L 丝氨酸。
23.权利要求1-22的复合细胞培养基粉末制剂，其中所述氨基酸补充剂在水合以形成细胞培养基后具有以下最终浓度：
i) 约0.0225 g/L 天冬酰胺H2O；
ii) 约0.73 g/L 谷氨酰胺；
iii) 约1.552 g/L 组氨酸；和
iv) 约0.03676 g/L 丝氨酸。
24.权利要求1-23的复合细胞培养基粉末制剂，其中所述一种或多种缓冲剂选自3-(N-吗啉代)丙磺酸(MOPS)游离酸、3-(N-吗啉代)丙磺酸(MOPS) Na、羟乙基哌嗪乙磺酸(HEPES)和碳酸氢钠。
25.权利要求1-24的复合细胞培养基粉末制剂，其中所述制剂包含MOPS游离酸和MOPSNa的组合。
26.权利要求1-25的复合细胞培养基粉末制剂，其中所述缓冲剂在水合以形成细胞培养基后具有以下最终浓度：
i) 0.3-3 g/L MOPS游离酸；和
ii) 1.0-10 g/L MOPS Na。
27.权利要求1-26的复合细胞培养基粉末制剂，其中所述消泡剂包含基于环氧乙烷和环氧丙烷的多元醇共聚物。
28.权利要求1-27的复合细胞培养基粉末制剂，其中所述消泡剂是Pluronic F68。
29.权利要求1-28的复合细胞培养基粉末制剂，其中所述Pluronic F68在水合以形成细胞培养基后具有0.1-10 g/L的浓度。
30.权利要求29的复合细胞培养基粉末制剂，其中所述Pluronic F68在水合以形成细胞培养基后具有约1 g/L的浓度。
31.制备权利要求1-30的复合细胞培养基粉末制剂的方法，其包括组合基础培养基粉末；氯化镁；胰岛素；一种或多种痕量金属；包含天冬酰胺、谷氨酰胺、组氨酸和丝氨酸中的一种或多种的氨基酸补充剂；一种或多种缓冲剂；和一种或多种消泡剂。
32.制备用于培养哺乳动物细胞的细胞培养基的方法，其包括组合权利要求1-30的复合细胞培养基粉末制剂与水，由此制备用于培养哺乳动物细胞的细胞培养基。
33.权利要求32的方法，其中所述方法进一步包括组合包含FeSO4 7H2O和螯合剂的溶液。
34.权利要求33的方法，其中所述螯合剂是乙二胺四乙酸(EDTA)。
35.权利要求34的方法，其中所述FeSO4 7H2O和EDTA在细胞培养基中具有以下最终浓度：
i) 0.004-0.04 g/L FeSO4 7H2O；和
ii) 0.006-0.06 g/L EDTA。
36.权利要求35的方法，其中所述FeSO4 7H2O和EDTA在细胞培养基中具有以下最终浓度：
i) 约0.0138g/L FeSO4 7H2O；和
ii) 约0.018625g/L EDTA。
37.权利要求32-36的方法，其进一步包括使所述细胞培养基与哺乳动物细胞接触。
38.权利要求37的方法，其中所述哺乳动物细胞选自中国仓鼠卵巢(CHO)细胞、DP12CHO细胞、DG44 CHO细胞、人胚肾(HEK)细胞、HEK 293细胞和幼仓鼠肾(BHK)细胞。
39.权利要求38的方法，其中所述哺乳动物细胞重组表达目标蛋白。
40.权利要求39的方法，其中所述目标蛋白选自凝血因子VIII (FVIII)、其变体和片段。
41.权利要求40的方法，其中所述FVIII选自野生型FVIII、B结构域缺失的FVIII和与生物相容性聚合物缀合的FVIII。
42.权利要求41的方法，其中所述生物相容性聚合物是聚乙二醇(PEG)。
43.权利要求42的方法，其中所述PEG在因子VIII氨基酸位置81、129、377、378、468、487、491、504、556、570、711、1648、1795、1796、1803、1804、1808、1810、1864、1903、1911、2091、2118和2284中的一个或多个处共价连接至所述多肽。
44.权利要求38-43的方法，其中所述哺乳动物细胞是BHK细胞。
CN201580028914.1A 2014-04-10 2015-04-07 复合培养基粉末制剂和制备用于细胞培养的液体培养基的方法 Expired - Fee Related CN106459907B (zh)

Applications Claiming Priority (3)

Application Number Priority Date Filing Date Title
US201461978027P 2014-04-10 2014-04-10
US61/978027 2014-04-10
PCT/US2015/024780 WO2015157335A1 (en) 2014-04-10 2015-04-07 Compounded media powder formulation and method of preparation of liquid medium for cell culture

Publications (2)

Publication Number Publication Date
CN106459907A true CN106459907A (zh) 2017-02-22
CN106459907B CN106459907B (zh) 2020-11-06

Family

ID=53055095

Family Applications (1)

Application Number Title Priority Date Filing Date
CN201580028914.1A Expired - Fee Related CN106459907B (zh) 2014-04-10 2015-04-07 复合培养基粉末制剂和制备用于细胞培养的液体培养基的方法

Country Status (14)

Country Link
US (1) US10227559B2 (zh)
EP (1) EP3129463B1 (zh)
JP (1) JP6665104B2 (zh)
KR (1) KR20160144429A (zh)
CN (1) CN106459907B (zh)
AU (1) AU2015243961A1 (zh)
CA (1) CA2945390A1 (zh)
IL (1) IL248218A0 (zh)
MX (1) MX2016013223A (zh)
PE (1) PE20161326A1 (zh)
RU (1) RU2016144057A (zh)
SG (1) SG11201608390SA (zh)
WO (1) WO2015157335A1 (zh)
ZA (1) ZA201607719B (zh)

Cited By (1)

* Cited by examiner, † Cited by third party
Publication number Priority date Publication date Assignee Title
CN109628377A (zh) * 2019-01-02 2019-04-16 贵州省人民医院 一种小鼠原代肝细胞灌注式分离及离体培养方法

Families Citing this family (6)

* Cited by examiner, † Cited by third party
Publication number Priority date Publication date Assignee Title
TWI734775B (zh) * 2016-04-26 2021-08-01 美商美國泰福生技股份有限公司 細胞培養基
CN107653222A (zh) * 2016-07-25 2018-02-02 赵玉明 一种无菌液体细胞培养基的配置方法
CN106011071B (zh) * 2016-08-09 2019-03-01 海南海医药物安全性评价研究有限责任公司 一种原代肿瘤细胞培养组合物及其应用
KR102216302B1 (ko) * 2018-09-21 2021-02-17 메디포스트(주) 피부 세포 활성화용 조성물 및 이의 용도
WO2021078938A1 (en) * 2019-10-25 2021-04-29 Fundació Centre De Regulació Genòmica Culture media for mycoplasma
EP3889251A1 (en) * 2020-03-31 2021-10-06 Fundació Centre de Regulació Genòmica Culture media for mycoplasma

Citations (9)

* Cited by examiner, † Cited by third party
Publication number Priority date Publication date Assignee Title
WO2002036735A2 (en) * 2000-11-06 2002-05-10 Invitrogen Corporation Dry powder cells and cell culture reagents and methods of production thereof
CN1362514A (zh) * 2002-01-25 2002-08-07 华东理工大学 一种适于幼仓鼠肾细胞生长与维持的无血清培养基
WO2002066603A2 (en) * 2001-02-15 2002-08-29 Centocor, Inc. Chemically defined medium for cultured mammalian cells
WO2005066331A1 (en) * 2003-12-30 2005-07-21 Invitrogen Corporation Dry powder cells and cell culture reagents and methods of production thereof
CN101603026A (zh) * 2009-06-19 2009-12-16 华东理工大学 适于动物细胞产品生产的无动物来源低蛋白培养基
CN101663390A (zh) * 2006-09-13 2010-03-03 艾博特公司 细胞培养改良
CN101679941A (zh) * 2007-03-02 2010-03-24 惠氏公司 在细胞培养物中使用铜和谷氨酸盐生产多肽
CN102115728A (zh) * 2009-12-31 2011-07-06 北京清大天一科技有限公司 无血清动物细胞培养基干粉、液体培养基及其制备方法
CN102892878A (zh) * 2010-04-23 2013-01-23 生命技术公司 包含小肽的细胞培养基

Family Cites Families (13)

* Cited by examiner, † Cited by third party
Publication number Priority date Publication date Assignee Title
US5185259A (en) 1982-05-05 1993-02-09 Genentech, Inc. Truncated human tissue plasminogen activator
US4766075A (en) 1982-07-14 1988-08-23 Genentech, Inc. Human tissue plasminogen activator
US4853330A (en) 1983-04-07 1989-08-01 Genentech, Inc. Human tissue plasminogen activator
FR2539642B1 (fr) 1983-01-20 1985-12-13 Choquenet Sa L Filtre-presse comprenant des moyens d'extraction des boues
IL87737A (en) 1987-09-11 1993-08-18 Genentech Inc Method for culturing polypeptide factor dependent vertebrate recombinant cells
DE69021335T2 (de) 1989-06-09 1996-04-11 Gropep Pty. Ltd., Adelaide Wachstumshormonfusionsproteine.
US6383810B2 (en) * 1997-02-14 2002-05-07 Invitrogen Corporation Dry powder cells and cell culture reagents and methods of production thereof
US8129504B2 (en) 2001-08-30 2012-03-06 Biorexis Technology, Inc. Oral delivery of modified transferrin fusion proteins
EP2371856B1 (en) 2004-11-12 2022-05-18 Bayer HealthCare LLC Site-directed modification of FVIII
WO2007047504A2 (en) 2005-10-14 2007-04-26 Biorexis Pharmaceutical Corporation Natriuretic peptide modified transferrin fusion proteins
EP2222329A1 (en) * 2007-11-09 2010-09-01 Baxter International Inc. Modified recombinant factor viii and von willebrand factor and methods of use
DK2235197T3 (en) * 2007-12-27 2017-10-09 Baxalta GmbH Methods of cell culture
WO2013096858A1 (en) * 2011-12-22 2013-06-27 Life Technologies Corporation Cell culture media and methods

Patent Citations (9)

* Cited by examiner, † Cited by third party
Publication number Priority date Publication date Assignee Title
WO2002036735A2 (en) * 2000-11-06 2002-05-10 Invitrogen Corporation Dry powder cells and cell culture reagents and methods of production thereof
WO2002066603A2 (en) * 2001-02-15 2002-08-29 Centocor, Inc. Chemically defined medium for cultured mammalian cells
CN1362514A (zh) * 2002-01-25 2002-08-07 华东理工大学 一种适于幼仓鼠肾细胞生长与维持的无血清培养基
WO2005066331A1 (en) * 2003-12-30 2005-07-21 Invitrogen Corporation Dry powder cells and cell culture reagents and methods of production thereof
CN101663390A (zh) * 2006-09-13 2010-03-03 艾博特公司 细胞培养改良
CN101679941A (zh) * 2007-03-02 2010-03-24 惠氏公司 在细胞培养物中使用铜和谷氨酸盐生产多肽
CN101603026A (zh) * 2009-06-19 2009-12-16 华东理工大学 适于动物细胞产品生产的无动物来源低蛋白培养基
CN102115728A (zh) * 2009-12-31 2011-07-06 北京清大天一科技有限公司 无血清动物细胞培养基干粉、液体培养基及其制备方法
CN102892878A (zh) * 2010-04-23 2013-01-23 生命技术公司 包含小肽的细胞培养基

Non-Patent Citations (2)

* Cited by examiner, † Cited by third party
Title
王永芬等: "《动物细胞培养技术》", 31 July 2012, 华中科技大学出版社 *
郭葆玉: "《生物技术制药》", 30 September 2011, 清华大学出版社 *

Cited By (1)

* Cited by examiner, † Cited by third party
Publication number Priority date Publication date Assignee Title
CN109628377A (zh) * 2019-01-02 2019-04-16 贵州省人民医院 一种小鼠原代肝细胞灌注式分离及离体培养方法

Also Published As

Publication number Publication date
SG11201608390SA (en) 2016-11-29
IL248218A0 (en) 2016-11-30
EP3129463A1 (en) 2017-02-15
AU2015243961A1 (en) 2016-10-27
JP6665104B2 (ja) 2020-03-13
US20170191025A1 (en) 2017-07-06
WO2015157335A1 (en) 2015-10-15
RU2016144057A (ru) 2018-05-15
EP3129463B1 (en) 2021-05-26
CA2945390A1 (en) 2015-10-15
ZA201607719B (en) 2018-11-28
KR20160144429A (ko) 2016-12-16
US10227559B2 (en) 2019-03-12
JP2017510283A (ja) 2017-04-13
CN106459907B (zh) 2020-11-06
PE20161326A1 (es) 2016-12-11
RU2016144057A3 (zh) 2018-11-22
MX2016013223A (es) 2017-04-27

Similar Documents

Publication Publication Date Title
CN106459907A (zh) 复合培养基粉末制剂和制备用于细胞培养的液体培养基的方法
CN102549145B (zh) 用于adamts蛋白表达的细胞培养基
KR102039494B1 (ko) 세포 배양 배지 및 방법
US8715954B2 (en) Method of producing C3A serum-free clonal cell line
CA2277278A1 (en) Embryonic stem cell serum replacement
CN103097409A (zh) 在细胞培养物中生产重组高分子量vWF的方法
Reid et al. Cell culture studies using extracts of extracellular matrix to study growth and differentiation in mammalian cells
MXPA06003028A (es) Medios de cultivo de celulas.
CN101984048A (zh) 一种培养间充质干细胞的培养基
CN104837988A (zh) 用于人的间充质干细胞的无血清培养基
MX2010011356A (es) Metodos para la produccion mejorada de proteinas morfogeneticas de hueso.
EP1210410B1 (en) Metal binding compounds and their use in cell culture medium compositions
Minamoto et al. Development of a serum-free and heat-sterilizable medium and continuous high-density cell culture
CN100432218C (zh) 无血清配方的动物细胞培养基胎牛血清替代剂
JP2016508376A (ja) 組換えタンパク質産生の増加のための製剤及び方法
JP2022550315A (ja) 濃縮灌流培地
RU2728377C2 (ru) Композиция на основе янтарной кислоты и аспарагина для повышения продуктивности клеточных линий-продуцентов рекомбинантных белков
Gerdtzen Medium Design, Culture Management, and the PAT Initiative
US20120264208A1 (en) Materials and methods for enhanced iron uptake in cell culture
KR20150125781A (ko) 재조합 단백질 생산 증가를 위한 염화리튬을 포함하는 세포 배양용 배지 조성물 및 이의 용도
WO2023003804A1 (en) Proteolytic enzymes for cell culture media
ES2665596T3 (es) Uso de compuestos intermedios de ácido tricarboxílico (ATC) para controlar la generación de amoníaco en cultivo celular
Kaplan Andrew J. Stouta, Addison B. Mirliania, Eugene C. Whiteb, John SK Yuen Jr., David L. Kaplana Affiliations aBiomedical Engineering Department, Tissue Engineering Resource Center, Tufts University, 4 Colby St, Medford, MA, USA.

Legal Events

Date Code Title Description
C06 Publication
PB01 Publication
SE01 Entry into force of request for substantive examination
SE01 Entry into force of request for substantive examination
REG Reference to a national code

Ref country code: HK

Ref legal event code: DE

Ref document number: 1230645

Country of ref document: HK

GR01 Patent grant
GR01 Patent grant
CF01 Termination of patent right due to non-payment of annual fee

Granted publication date: 20201106

CF01 Termination of patent right due to non-payment of annual fee