KR102039494B1 - 세포 배양 배지 및 방법 - Google Patents

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Abstract

배지, 공급물 및 보충물을 제조하기 위한 조성물 및 방법이 기재된다. 그와 같은 방법 및 배지는 불안정성 성분의 안정성 증가를 나타낼 수 있으며, 예를 들어 마이크로현탁액 및/또는 캡슐화 기술, 킬레이트화, 그리고 임의로 코팅 및/또는 불안정성 화합물과 항산화제의 혼합을 사용할 수 있다. 조성물은 열 및/또는 조사 처리를 견딜 수 있으며, 감소된 바이러스 수를 가진다. 이러한 기술은 연장된 보관 수명을 가지는 생성물, 배양물로의 그의 내부 성분의 연장 방출, 또는 최소 부피를 사용하여 생물반응기에 무균상태로 첨가될 수 있는 생성물을 초래할 수 있다. 상기 조성물 및 방법은 생물생산 워크플로우를 최적화하고 효율을 증가시킬 수 있다.

Description

세포 배양 배지 및 방법 {CELL CULTURE MEDIA AND METHODS}
신규 유형의 세포 배양 배지, 공급물(feed) 및 보충물(supplement)과 관련된 조성물, 방법 및 용도가 본원에서 제공된다. 상기 배지, 공급물 및 보충물은 몇 가지 바람직한 특성을 가지는데, 여기에는 정상적인 용해도 한계를 뛰어넘는 특정 성분을 가진다는 점, 증가된 방사선 내성, 연장된 방출 특성, 높은 용해도, 증가된 보관 수명 및 열안정성이 포함되나, 이에 제한되지 않는다. 특정 실시양태에서, 이와 같은 특징은 소비자 워크플로우(customer workflow) 및 생물반응기 생산성을 향상시킨다.
[도면의 간단한 설명]
하기에서 기술되며 명세서에 통합되어 그 일부를 구성하는 하기 도면은 예시적인 실시양태를 예시하는 바, 본 개시내용의 범주를 제한하는 것으로 간주되어서는 안된다.
도 1은 세포 배양 배지, 공급물 및/또는 보충물 성분의 마이크로/나노현탁액을 제조하기 위하여 개발된 새로운 절차를 나타낸다.
도 2는 마이크로현탁액과 액체 공급물의 세포 성장, 단백질 생산 및 전달 성능의 비교를 나타낸다. 시험된 조건하에서 액체 공급물에 비교하여 마이크로현탁액을 실시한 바, 액체 공급물에 비해 더 높은 전달 효능을 나타내었다.
도 3은 연장 방출을 위하여 추가로 코팅되어 있는 캡슐화 마이크로현탁액 비드의 개략적인 도시이다.
도 4는 마이크로캡슐화 마이크로현탁액 제제 내로부터의 성분의 방출을 지연하는 것에 대한 PLGA 코팅의 영향을 나타낸다. a) 상부 패널: 코팅 없음; b) 하부 패널: PLGA A 및 PLGA B를 가지는 코팅의 비교. A 및 B는 상이한 락티드:글리콜리드 비를 가지고 있다. 85:15 비를 가지는 PLGA B가 우수한 연장 방출 특성을 나타내었으며, 용액 중에서 성분을 방출하는 능력인 그의 형상을 > 15일 유지하였다.
도 5는 본 개시내용의 제제에 대한 조사(irradiation)의 효과를 나타낸다. i) 조사된 마이크로현탁액, ii) 건조된 캡슐화 마이크로현탁액을 사용하여 배양된 세포에서의 단백질 생산 효능 비교시, iii) 여과에 의해 멸균되었던 대조군인 비-조사 액체 공급물에서의 것과 유사하다.
도 6은 대략 30 kGy에서의 조사가, 조사된 시험 공급물에서 세포를 배양하는 동시에, (a) 세포 성장 (상부 패널); 또는 (b) 단백질 생산 (하부 패널)에 부정적인 영향을 주지 않는다는 것을 보여준다. 추가적인 보충물 68 및 86도 시험하였는데, 유사한 결과를 나타내었다 (데이터 미도시).
도 7은 마이크로현탁액 및 건조된 캡슐화 마이크로현탁액에 대한 감마 조사의 영향이 무시할만하다는 것을 보여준다. 이 그래프는 비-조사 액체 대조군과 비교할 때, 캡슐화 화합물 (가장 우측 참조)이 마이크로캡슐 ("비드") 또는 마이크로현탁액 (MS) 중 어느 하나의 상태에서 30 kGy의 감마에 의해 어떻게 영향을 받는지를 보여준다. NG = 감마 조사 없음, G = 감마-조사되었음.
도 8은 조사시 생성되는 산화 종의 영향을 감소시킴으로써 불안정성 분자를 보호하기 위하여 항산화제 중에 매립 및/또는 매몰된 불안정성 성분을 포함하는 마이크로캡슐화 비드의 개략적인 도시를 나타낸다.
도 9는 반응성 종의 킬레이트화, 및 미량 원소 중 금속 이온과 아미노산의 예시적인 배위 착물의 형성을 나타낸다.
도 10은 마이크로현탁액 및 캡슐화 마이크로현탁액 제조 방법의 개략적인 도시를 나타낸다.
도 11은 생물반응기에의 조사된 마이크로캡슐화 비드의 직접적인 첨가를 위한 두 가지 선택사항을 보여준다. 좌측 패널은 오토클레이빙 가능한 다공성 금속 필터 내에서 첨가되는 비드를 나타내는 반면; 우측 패널은 비드가 직접 배양물에 첨가될 수 있음을 나타낸다.
도 12는 (a) PLGA 코팅이 있는 마이크로현탁액 비드 (상부 패널) 및 (b) 비드가 없는 단순한 AGT 공급물에 있어서, 다공성 금속 필터 기구를 사용하여 배양물에 도입된 보충물의 연장 방출의 비교를 나타낸다.
본 개시내용의 개요
본 개시내용에서 기술되는 배지, 공급물 및 보충물 조성물은 몇 가지 바람직한 특성을 가지는데, 여기에는 (i) 배양 시스템에서의 정상적인 용해도 한계를 훨씬 뛰어넘어 연장되는 "초농축" 수준의 특정 성분을 방출하는 능력, (ii) 방사선 멸균 후에도 배지/공급물 기능성을 유지하는 능력의 증가, (iii) 내부 성분 연장 방출 능력의 증가, (iv) 높고 빠른 용해도, (v) 건조 형태에서의 더 긴 보관 수명, (vi) 증가된 열안정성, (vii) 8log까지의 바이러스 오염 위험성 감소, (viii) UV, 여과 및/또는 HTST 저온살균과 같은 다른 멸균 기술과 조합되는 능력, (ix) AGT, DPM, APM과 같은 다양한 배지 형태는 물론, 고농도에서 불안정성 성분을 가지는 제제에 적용되는 능력, (x) 배지, 공급물, 보충물, 기능성 첨가제 등과 같은 다양한 생성물 유형에 적용되는 능력이 포함되나, 이에 제한되지 않는다. 이러한 특징으로 인하여, 조성물은 이미 진행중인 생물반응기 또는 배양물에 직접 첨가될 수 있으며, 그에 따라 소비자 워크플로우 및 생물반응기 생산성을 향상시킬 수 있다.
이에 따라, 본 개시내용에서 기술되는 조성물, 방법 및 용도는 부분적으로 마이크로현탁액을 포함하는 세포 배양 배지, 농축 공급물, 기능성 첨가제, 보충물에 관한 것으로; 또한 1종 이상의 캡슐화 마이크로 및/또는 나노현탁액을 포함하는 신규 세포 배양 배지, 공급물 및/또는 보충물 조성물에 관한 것일 수 있으며; 또한 방사선에의 노출 후에도 배지/공급물의 기능성이 유지되도록 방사선을 사용하여 상기 조성물을 멸균하는 것에 관한 것일 수 있다. 본 개시내용은 또한 상기 배지의 특징을 포함하는 그와 같은 배지의 제조 방법, 및 그의 용도를 제공한다. 본 개시내용 전체에 걸쳐, 일부 언급은 세포 배양 배지에 대해서만 이루어질 수 있으나, 적용가능할 경우, 그에는 공급물 및/또는 보충물도 포함될 것이다.
일부 실시양태에서, 본 개시내용은 배지, 공급물 또는 보충물의 건조 분말에 최소 부피의 수용액을 첨가하여 페이스트를 제조하는 단계; 및 상기 페이스트를 강하게 혼합하여 마이크로현탁액을 제조하는 단계를 포함하는, 배지, 공급물 또는 보충물 조성물의 제조 방법에 관한 것이다.
또 다른 실시양태에서, 본 개시내용은 임의로 유효량의 항산화제를 불안정성 성분의 마이크로현탁액과 혼합하여 혼합물을 형성시키는 단계; 적합한 캡슐 재료에 마이크로현탁액 또는 단계 2의 혼합물을 캡슐화하여 마이크로캡슐 또는 비드가 형성되도록 하는 단계; 및 마이크로캡슐 또는 비드를 건조하는 단계를 포함하는, 불안정성 성분을 포함하는 조성물의 제조 방법에 관한 것이다. 한 실시양태에서, 불안정성 물질은 덴드리머에 부착된다. 이러한 실시양태 중 어느 것에서, 캡슐 재료는 예를 들어 알기네이트, 폴리-L-락트산, 키토산, 아가로스, 젤라틴, 히알루론산, 콘드로이틴 술페이트, 덱스트란, 덱스트란 술페이트, 헤파린, 헤파린 술페이트, 헤파란 술페이트, 겔란 검, 크산탄 검, 구아 검, 수용성 셀룰로스 유도체 및 카라기난을 포함하는 군으로부터 선택될 수 있다.
상기 방법의 또 다른 실시양태에서, 상기 비드는 추가로 비드로부터의 불안정성 성분의 방출을 연장하는 물질에 의해 코팅된다. 다른 측면에서, 상기 코팅은 예를 들어 폴리-글리콜산, PLGA (폴리-락트산-코-글리콜산), 콜라겐, 폴리히드록시-알카노에이트 (PHA), 폴리-ε-카프로락톤, 폴리-오르토 에스테르, 폴리-무수물, 폴리-포스파젠, 폴리-아미노산, 폴리디메틸실록산, 폴리우레탄, 폴리-테트라플루오로에틸렌, 폴리에틸렌, 폴리술폰, 폴리-메틸 메타크릴레이트, 폴리-2-히드록시에틸메타크릴레이트, 폴리아미드, 폴리프로필렌, 폴리-비닐 클로라이드, 폴리스티렌 및 폴리-비닐 피롤리돈으로 이루어진 군으로부터 선택된다.
한 실시양태에서, 비드는 조사되며, 다른 실시양태에서, 비드는 감마-조사에 의해 조사된다. 특정 실시양태에서, 비드는 UV 선에 의해 추가로 조사될 수 있으며, 이 경우, 비드에는 PPV 및 MMV 바이러스가 없을 수 있다.
몇 가지 실시양태에서, 배지는 건조-형태의 배지이며, 보호될 불안정성 성분은 폴리아민, 성장 인자, 시토카인 및 비타민으로 이루어진 군으로부터 선택된다.
일부 실시양태에서, 캡슐 재료는 수성 용매를 사용한 재구성시 가용성이다. 다른 실시양태에서, 캡슐화 매트릭스는 덴드리머-불안정성 성분 복합체를 캡슐화한다. 일부 실시양태에서, 덴드리머는 폴리아미도아민 덴드리머, 폴리프로필렌이민 덴드리머 또는 폴리프로필아민 (POPAM) 덴드리머이다.
상기 실시양태 중 어느 것에서, 기술되는 방법은 예를 들어 배지, 공급물, 보충물 또는 기능성 첨가제와 관련하여 하기 중 1종 이상을 달성할 수 있다: 1) 조사에 대하여 더 내성이 되게 함 (예를 들어 효능 또는 기능성의 유지를 기준으로 측정되었을 때); 2) 주위 온도에서의 안정성 증가; 3) 일부 성분의 연장 방출을 가능케 함; 4) 주위 온도에서의 수송에 대한 안정성 증가; 5) 온도 변동에 대한 안정성 증가.
상기 방법에서 사용되는 조성물은 불안정성 화합물을 추가로 포함하는 분말화된 세포 배양 배지, 및/또는 1종 이상의 농축된 성분을 포함할 수 있다.
본 개시내용은 또한 배지/공급물 성분의 마이크로현탁액을 포함하는 배지, 공급물 또는 보충물 조성물에 관한 것이다. 한 실시양태에서, 배지, 공급물 또는 보충물 조성물은 캡슐 매트릭스 내에서 비드로 마이크로캡슐화되어 있는 불안정성 성분과 항산화제의 혼합물을 포함한다. 다른 실시양태에서, 캡슐 재료는 예를 들어 알기네이트, 폴리-L-락트산, 키토산, 아가로스, 젤라틴, 히알루론산, 콘드로이틴 술페이트, 덱스트란, 덱스트란 술페이트, 헤파린, 헤파린 술페이트, 헤파란 술페이트, 겔란 검, 크산탄 검, 구아 검, 수용성 셀룰로스 유도체 및 카라기난을 포함하는 군으로부터 선택된다. 또 다른 실시양태에서, 비드는 코팅 용액에 의해 코팅된다. 또 다른 실시양태에서, 상기 코팅 용액은 폴리-글리콜산, PLGA (폴리-락트산-코-글리콜산), 콜라겐, 폴리히드록시알카노에이트 (PHA), 폴리-ε-카프로락톤, 폴리-오르토 에스테르, 폴리-무수물, 폴리-포스파젠, 폴리-아미노산, 폴리디메틸실록산, 폴리우레탄, 폴리-테트라플루오로에틸렌, 폴리에틸렌, 폴리술폰, 폴리-메틸 메타크릴레이트, 폴리-2-히드록시에틸메타크릴레이트, 폴리아미드, 폴리프로필렌, 폴리-비닐 클로라이드, 폴리스티렌, 폴리-비닐 피롤리돈, 폴리-L-리신 및 폴리오르니틴으로 이루어진 군으로부터 선택된다.
다른 실시양태에서, 조성물은 킬레이트화된 반응성 종을 추가로 포함한다. 이와 같은 실시양태의 다른 측면에서, 상기 반응성 종은 양이온, 금속 이온 또는 미량 원소이다. 또 다른 측면에서, 킬레이트화 모이어티는 EDTA, 시트레이트, 숙시네이트, 시클로덱스트린, 클라트레이트, 덴드리머 및 아미노산을 포함하는 군으로부터 선택된다.
상기 기재된 조성물 중 어느 것에서, 조성물은 조사될 수 있다. 다른 측면에서, 상기 조사는 감마선을 사용한 것일 수 있으며; 구체적인 측면에서, 상기 감마선은 약 25-100 kGy일 수 있다. 바람직한 측면에서는, 30-50 kGy의 감마선이 사용된다. 특정 실시양태에서, 감마선은 30 kGy이다. 당업자라면, 예컨대 배지의 기능성 또는 배지 중 특정 성분의 기능성에 대한 영향을 최소화하면서도 (예를 들어 특히 조사에 또는 어떤 멸균 기술이 사용되는지에 관계없이 민감성인 성분에 의해 측정되었을 때), 목적 (예를 들어 살아있는 바이러스의 감소 또는 기타 멸균)을 최대화하는 조사 수준을 결정할 수 있을 것이다.
본 발명의 한 측면에서, 본원에서 기술되는 방법은 멸균 후 (또는 임의의 최종 처리 또는 마감 단계 후) 배지 또는 조성물의 기능 파라미터를 측정하는 것을 목표로 하는 추가적인 단계(들)와 조합될 수 있다. 예를 들어, 조사 후, 특정 성분 또는 성분 군에 대한 조사의 영향을 측정하기 위한 기능 검정에 샘플이 적용될 수 있다. 이와 같은 단계는 예를 들어 조성물에 적절하게 바이러스가 없는지, 그리고 배지의 성분이 의도된 적용분야를 위한 만족스러운 조건으로 유지되는지를 확인하는 데에 사용될 수 있다.
한 실시양태에서, 상기한 배지, 공급물 또는 보충물 마이크로현탁액 및/또는 캡슐화 마이크로현탁액 조성물 중 어느 것은 무균상태로 생물반응기에 직접 첨가된다. 또 다른 실시양태에서, 상기한 배지, 공급물 또는 보충물 마이크로현탁액 및/또는 캡슐화 마이크로현탁액 조성물 중 어느 것은 생물반응기 내에서 오토클레이빙가능한 다공성 금속 실린더 내에 위치된다.
상기한 배지, 공급물 또는 보충물 중 어느 것은 무-혈청, 무-단백질, 또는 무-혈청 겸 무-단백질일 수 있다. 상기한 배지, 공급물 또는 보충물 중 어느 것은 현탁액 세포 배양용, 포유동물 세포 배양용, 곤충 세포 배양용, 하이브리도마 세포 배양용, 줄기 세포 배양용, 유도된 만능 세포 배양용, 만능 세포 배양용, 조직 외식편 및/또는 기관 배양용, 인공 세포 매트릭스 상에서의 세포의 3-차원 배양용, 그리고 당업자가 본 개시내용의 기술을 적합화할 수 있는 기타 세포 및 조직 배양 적용분야용으로 특별하게 설계될 수 있다.
상기한 배지, 공급물 또는 보충물 중 어느 것은 분말화된 세포 배양 배지를 포함할 수 있으며, 바람직한 실시양태에서, 상기 분말화된 세포 배양 배지는 AGT (진보 과립화 기술 세포 배양 배지)이다.
상기한 배지, 공급물 또는 보충물 중 어느 것은 건조 형태의 세포 배양 배지를 제조하는 데에 사용될 수 있다.
상기한 배지, 공급물 또는 보충물 중 어느 것은 세포 배양 배지의 보관 수명을 증가시킬 수 있다.
상기한 배지, 공급물 또는 보충물 중 어느 것은 재조합 단백질 제조, 백신 제조, 줄기 세포를 포함한 세포 생산, 생물연료 제조 또는 영양소의 제조에 사용될 수 있다.
상기한 배지, 공급물 또는 보충물 중 어느 것은 주위 온도에서 저장 및 취급될 수 있으며, 온도 변동을 견딜 수 있고, HTST 및/또는 UHT 저온살균을 견딜 수 있으며, 감마, UV 및 당업계에 알려져 있는 기타의 것과 같은 멸균 방사선 파장에의 노출을 견딜 수 있다.
지금부터, 다양한 예시적인 실시양태를 상세하게 언급할 것이다. 하기의 상세한 설명은 읽는 사람에게 본 개시내용 측면의 특정 실시양태, 특징, 및 세부사항에 대한 더 완전한 이해를 제공하기 위하여 제공되는 것으로, 본 개시내용의 범주에 대한 제한으로 해석되어서는 안된다는 것이 이해되어야 한다.
정의
본 개시내용이 더 용이하게 이해될 수 있도록 하기 위하여, 먼저 특정 용어가 정의된다. 추가적인 정의는 상세한 설명 전체에 걸쳐 제시되어 있다.
본 출원에서 사용될 때의 "진보 과립화 기술(advanced granulation technology)" 또는 AGT이라는 용어는 민감성 성분이 그의 효능을 상실하지 않는 조건하에 약하고 빠르게 물을 증발시키면서 공기 현탁된 분말화 배지 성분 상에 1종 이상의 수용액을 분무함으로써, 응집된 과립, 및 응집된 과립 전체에 걸친 분무된 성분의 균질한 분포를 초래하는 것을 포함하는, 세포 배양 배지의 제조 방법을 지칭한다. 과립화된 분말 (AGT)에 대해서는 문헌 [Fike et al., Cytotechnology, 2006, 36:33-39], 및 본 출원인의 특허 및/또는 특허 출원 중 그 개시내용의 전문이 본원에 참조로 포함되는 2002년 5월 7일자 공고 U.S.P.N. 6,383,810; 2009년 8월 11일자 공고 U.S.P.N. 7,572,632; 및 2007년 1월 31일자 미국 특허 출원 번호 11/669,827에 논의되어 있다. 간단하게 말하자면, AGT 배지는 커다란 입자 크기, 취급 동안의 미세 분진 양의 감소, 높은 습윤성, 짧은 용매로의 용해 시간, 자동- pH 및 자동 오스몰농도 유지 등과 같은 특성으로 인하여, 당업계에서 매우 바람직한 건조 분말화 배지이다.
또 다른 유형의 건조 분말화 형태는 DPM 분말만큼 미세하지는 않지만 AGT 과립만큼 크지는 않은 유리한 입자 크기 특성을 가지는 "진보 분말 배지(advanced powder media)"인 APM 분말이다.
본 출원에서 사용될 때의 "감수성 화합물" 또는 "민감성 화합물" 또는 "불안정성 화합물"이라는 용어는 분해, 또는 건조 형태 배지 중에 존재하는 "반응성 종"과의 반응으로부터 보호될 물질, 화학물질 또는 화합물을 지칭한다. 세포 배양 배지에서의 그와 같은 화합물의 예에는 에탄올아민, 비타민, 시토카인, 성장 인자, 호르몬 등이 포함되나, 이에 제한되지 않는다.
본 출원에서, "캡슐화제"라는 용어는 가끔 "격리제"로 지칭될 수 있는데, 분해, 또는 아미노산, 미량 금속 원소 예컨대 망가니즈, 구리 등, 무기 완충제 예컨대 중탄산나트륨 및 기타 인산나트륨; 및 감수성 화합물과 천천히 반응함으로써 시간이 지나면서 불안정성 성분이 그의 바람직한 특성을 상실하도록 할 수 있는 유기 완충제 예컨대 MOPS, HEPES, PIPES 등과 같은 다른 반응성 화학물질과의 반응성을 강화하는 조건으로부터 격리시키는, 세포 배양 배지 또는 공급물 중 감수성 화학물질 또는 성분의 캡슐화, 보호, 분리 또는 격리를 지칭한다. 다르게는, 방사선 손상 또는 열 손상 또는 물리적 스트레스와 같은 물리적 손상, 수분/응축에의 노출 또는 탈수 등으로부터 감수성 화학물질 또는 성분을 보호하기 위하여 캡슐화, 보호, 분리 또는 격리가 수행될 수도 있다. 본 개시내용에서, "보호하다" 또는 "분리하다" 또는 "격리하다" 또는 "캡슐화하다"라는 용어는 호환가능하게 사용됨으로써 분해성 조건 또는 화학물질로부터 감수성 화학물질 또는 화합물을 보호한다는 개념을 전달할 수 있다. "가용성 격리제"는 그 자체가 수성 배지를 사용한 재구성시 가용성이어서, 그에 의해 "민감성인" 캡슐화 물질을 방출할 수 있다. 또는, "불용성 격리제"는 수성 배지를 사용한 재구성시 불용성일 수 있는데, 그에 의해 "민감성인" 캡슐화 물질을 방출한 후 그것은 여과, 경사분리 등과 같은 수단에 의해 재구성된 최종산물로부터 제거될 수 있다.
마이크로현탁에 사용될 수 있는 매트릭스의 예에는 알기네이트, 폴리-L-락트산 (PLL), 키토산, 아가로스, 젤라틴, 히알루론산, 콘드로이틴 술페이트, 덱스트란, 덱스트란 술페이트, 헤파린, 헤파린 술페이트, 헤파란 술페이트, 겔란 검, 크산탄 검, 구아 검, 수용성 셀룰로스 유도체, 카라기난 등이 포함되나, 이에 제한되지 않는다.
임의로, 마이크로캡슐은 하기의 몇 가지 이유 중 하나로 인하여 코팅될 수 있다: 마이크로캡슐 성분을 연장하여 천천히 방출하기 위하여; 임의 유형의 손상, 즉 방사선, 열, 탈수 등으로부터의 불안정성 성분의 보호를 위하여. 코팅에는 폴리-글리콜산, PLGA (폴리-락트산-코-글리콜산), 콜라겐, 폴리히드록시-알카노에이트 (PHA), 폴리-ε-카프로락톤, 폴리-오르토 에스테르, 폴리-무수물, 폴리-포스파젠, 폴리-아미노산, 폴리디메틸실록산, 폴리우레탄, 폴리-테트라플루오로에틸렌, 폴리에틸렌, 폴리술폰, 폴리-메틸 메타크릴레이트, 폴리-2-히드록시에틸메타크릴레이트, 폴리아미드, 폴리프로필렌, 폴리-비닐 클로라이드, 폴리스티렌, 폴리-비닐 피롤리돈 등이 포함될 수 있으나, 이에 제한되지 않는다.
불안정성 배지 또는 공급물 성분에는 비타민, 예를 들어 티아민, B12; 글루타민과 같은 아미노산; 에탄올아민과 같은 폴리아민; 시토카인; 성장 인자 등과 같은 화합물이 포함되나, 이에 제한되지 않는다.
배지 내의 반응성 분자를 킬레이트화, 불활성화 또는 차단하기 위하여 사용되는 작용제에는 EDTA, 시트레이트, 숙시네이트, 시클로덱스트린, 클라트레이트, 덴드리머, 아미노산 등과 같은 화합물이 포함되나, 이에 제한되지 않는다.
세포 배양 배지는 바람직하게는 분말화된 세포 배양 배지이다. 한 실시양태에서, 분말화된 세포 배양 배지는 진보 과립화 기술 (AGT) 세포 배양 배지이다. 세포 배양 배지는 또한 공급물, 농축 보충물, 농축 배지, 그리고 적용가능할 경우 일부 경우에서 액체 배지를 지칭한다.
본 출원에서 사용될 때의 "세포 배양(cell culture)" 또는 "배양(culture)"이라는 용어는 인공적인 (예컨대 시험관내) 환경에서의 세포의 유지를 지칭한다. 그러나, "세포 배양"이라는 용어는 일반적인 용어로써, 개별 원핵 (예컨대 박테리아) 또는 진핵 (예컨대 동물, 식물 및 진균) 세포 뿐만 아니라, 조직, 기관, 기관계 또는 전체 생물체의 배양도 포괄하여 사용될 수 있으며, 그에 따라 "조직 배양", "기관 배양", "기관계 배양" 또는 "기관형성 배양"이라는 용어가 때로는 "세포 배양"이라는 용어와 호환가능하게 사용될 수 있다는 것이 이해되어야 한다.
본 출원에서 사용될 때의 "배양(cultivation)"이라는 용어는 세포의 활성 또는 휴지 상태에서 성장, 분화 또는 연속 생존에 유리한 조건하의 인공적인 환경에서의 세포의 유지를 지칭한다. 따라서, "배양"은 "세포 배양" 또는 상기한 그의 동의어 중 어느 것과 호환가능하게 사용될 수 있다.
본 출원에서 사용될 때의 "세포 배양 배지", "배양 배지" 또는 "배지" (및 각 경우에서의 다수의 배지)라는 용어는 세포의 배양 및/또는 성장을 지지하는 영양 조성물을 지칭한다. 세포 배양 배지는 완전 제제, 즉 배양 세포에 대한 보충을 필요로 하지 않는 세포 배양 배지일 수 있거나, 불완전 제제, 즉 보충을 필요로 하는 세포 배양 배지일 수 있거나, 또는 불완전 제제를 보충할 수 있거나 완전 제제의 경우에는 배양 또는 배양 결과를 개선할 수 있는 배지일 수 있다. 문맥상 다르게 표시되지 않는 한, "세포 배양 배지", "배양 배지" 또는 "배지" (및 각 경우에서의 다수의 배지)라는 용어는 세포와 함께 인큐베이팅되지 않은, 컨디셔닝되지 않은 세포 배양 배지를 지칭한다. 따라서, "세포 배양 배지", "배양 배지" 또는 "배지" (및 각 경우에서의 다수의 배지)라는 용어는 많은 원래의 배지 성분은 물론, 다양한 세포 대사물 및 분비 단백질을 함유할 수 있는 "폐(spent)" 또는 "컨디셔닝된" 배지와는 구별된다.
본 출원에서 사용될 때의 "분말" 또는 "분말화된"이라는 용어는 물 또는 혈청과 같은 용매와 복합체화 또는 응집되어 있을 수 있거나 그렇지 않을 수 있는 과립 형태로 존재하는 조성물을 지칭한다. "건조 분말"이라는 용어는 "분말"이라는 용어와 호환가능하게 사용될 수 있으나, 본원에서 사용될 때의 "건조 분말"이라는 용어는 단순히 과립화된 재료의 총체적인 외관을 지칭하는 것으로, 다르게 표시되지 않는 한, 그 재료에 복합체화 또는 응집된 용매가 완전히 없음을 의미하고자 하는 것은 아니다.
"1× 제제"는 작용 농도로 세포 배양 배지에서 발견되는 일부 또는 전체 성분을 함유하는 임의의 수용액을 지칭한다. "1× 제제"는 예를 들어 세포 배양 배지, 또는 그 배지용 성분의 임의의 하위군을 지칭할 수 있다. 1× 용액에서의 성분의 농도는 시험관내에서 세포를 유지 또는 배양하는 데에 사용되는 세포 배양 제제에서 발견되는 그 성분의 농도와 대략 동일하다. 세포의 시험관내 배양에 사용되는 세포 배양 배지는 정의상 1× 제제이다. 수많은 성분이 존재하는 경우, 1× 제제 중 각 성분은 세포 배양 배지에서의 그 성분의 농도와 대략 동일한 농도를 가진다. 이러한 아미노산의 "1× 제제"는 대략 동일한 농도의 이러한 성분을 용액 중에 함유한다. 따라서, "1× 제제"를 언급하는 경우, 용액 중 각 성분은 기술되는 세포 배양 배지에서 발견되는 것과 동일하거나 대략 동일한 농도를 가지는 것을 말한다. 세포 배양 배지의 1× 제제 중 성분의 농도에 대해서는 당업자에게 잘 알려져 있다. 그 전문이 본원에 참조로 포함되는 문헌 [Cell Culture Technology for Pharmaceutical and Cell-Based Therapies, 42-50 (Sadettin Ozturk and Wei-Shou Hu eds., Taylor and Francis Group 2006)]을 참조한다. 그러나, 특히 더 소수의 성분이 1× 제제에 함유되어 있는 경우, 배양 배지와 비교하였을 때, 오스몰농도 및/또는 pH는 1× 제제에서 상이할 수 있다.
본 개시내용은 동일 성분의 농도가 마이크로/나노현탁액에서는 농축되며, 건조 캡슐화 비드 형태에서는 더욱 더 농축되는 마이크로현탁액 및 건조 마이크로캡슐 비드에 관한 것이다. 따라서, "7× 제제"는 해당 마이크로/나노현탁액 또는 캡슐화 비드 중 각 성분이 상응하는 액체 세포 배양 배지/공급물 또는 보충물 중 동일 성분에 비해 약 7배 더 농축되는 농도를 지칭하여 의미한다. "10× 제제"는 해당 마이크로/나노현탁액 또는 캡슐화 비드 중 각 성분이 액체 세포 배양 배지/공급물 또는 보충물 중 동일 성분에 비해 약 10배 더 농축되는 농도를 지칭하여 의미한다. 용이하게 알 수 있는 바와 같이, "5× 제제", "25× 제제", "50× 제제", "100× 제제", "500× 제제" 및 "1000× 제제"는 1× 세포 액체 배지, 공급물 또는 보충물과 비교하였을 때 각각 약 5 내지 25배, 25 내지 50배, 50 내지 70배, 70 내지 100배, 100 내지 500배, 500 내지 1000배 농도로 성분을 함유하는 제제를 지칭한다. 역시, 배지 제제 및 농축 용액의 오스몰농도 및 pH는 가변적일 수 있다. 제제는 특정 세포 배양 프로토콜과 관련하여서는 1×로, 그러나 다른 배양 프로토콜 또는 다른 기본 배지와 관련하여서는 예를 들어 2, 2.5, 5, 6.7, 9, 12 등의 × 농도로 구성요소 또는 성분을 함유할 수 있다.
마이크로현탁액
영양소 공급물, 기능성 첨가제 또는 보충물은 일반적으로 생물반응기로의 직접 전달을 위한 투명 액체 농축물, 또는 투명 액체 농축물로 재구성되는 분말로 제공된다. 이는 그 안의 성분이 그의 용해도 한계를 결코 뛰어넘지 않는다는 것을 의미한다. 그것이 그의 용해도 한계를 뛰어넘어 제조되는 경우, 플레이크(flake) 또는 미세 침전물 중 어느 하나로서의 침전물이 보통 병 내에 백색 탁도를 형성하는 것으로 알려져 있다. 이러한 성분의 침강은 수 시간 이내에 이루어지는데, 이는 농축 용액이 정확한 양의 공급물을 전달하는 데에는 사용될 수 없다는 것을 의미한다.
본 개시내용은 농축된 성분이 침전 분리되지 않는 방식으로 배지, 공급물 및/또는 보충물 성분을 제조하는 기술을 제공한다. 이는 1종 이상의 농축된 성분을 가지는 건조 분말 세포 배양 배지 또는 공급물로부터 마이크로현탁액 및/또는 나노현탁액 (마이크로/나노현탁액으로도 지칭됨)을 제조하는 것에 의해 달성된다.
한 실시양태에서, 마이크로/나노현탁액은 시간이 지나도 분리되지 않는 수성 용매 기제 중 마이크로/나노-크기의 고체이다. 마이크로/나노현탁액은 예를 들어 해당 성분의 용해도 한계를 뛰어넘어 1종 이상의 배지/공급물 성분을 농축하는 수단을 제공한다. 마이크로/나노현탁액의 일부 바람직한 특성에는 최소한의 부피에서 영양소 보충 농도 (예컨대 아미노산)의 증가를 가능케 하는 것; 수용액에서의 마이크로/나노현탁액 성분의 극히 빠른 용해 (그와 같은 제제 부재시에 배지가 용해시키게 되는 것에 비해 더 빠름); 캡슐화 (즉 캡슐화 형태에서의 성분의 멸균 및 보호) 능력; 생물반응기에서의 기존 배양물에의 멸균 마이크로/나노현탁액 비드의 직접적인 첨가 능력; 생물반응기에서 효율 및 제조 처리를 증가시키는 능력이 포함되나, 이에 제한되지 않는다.
다른 산업, 예를 들어 제약 또는 화장품 산업에서 마이크로현탁액이 제조된 바 있는데, 일반적으로 하기 2종의 접근법을 사용한다: i) 하향식 접근법, 및 ii) 상향식 접근법. 하향식 접근법에서는, 건조 분말의 입자가 마이크로현탁액이 수득될 때까지 피츠(Fitz)® 분쇄 (정밀한 입자 크기 감소의 산업 표준)와 같은 분쇄 과정에 의해, 또는 나노현탁액을 수득하기 위하여 습식-분쇄에 의해 또는 마이크로유동화기(microfluidizer)를 사용하여 분쇄된다. 상향식 접근법에서는, pH 또는 중합 파라미터와 같은 파라미터의 약간의 조작에 의해 마이크로/ 또는 나노현탁액이 수득될 때까지 용액 내 성분이 점차적으로 침전 분리된다. 이들 방법은 본원에서 기술되는 마이크로/ 또는 나노현탁액을 제조하는 데에는 유용하지 않았다. 본원에서 이용되는 배지 및 보충물의 민감성 특성을 고려할 때, 본 출원인은 이러한 배지, 공급물의 마이크로/ 또는 현탁액을 제조하기 위한 신규 방법에 대한 필요성을 인식하였다. 실시예 1 및 도 1에 기술되어 있는 바와 같이, 본 출원인은 건조 배지, 공급물 또는 보충물 분말로 시작하여, 최소량의 WFI수를 건조 분말에 첨가하고, 모든 입자가 수성 상으로 코팅되도록 슬러리를 균질 페이스트로 강하게 혼합함으로써, 마이크로/나노현탁액을 형성시켰다. 당업자라면 본원의 개시에 비추어 알고 있는 바와 같이, 물 이외의 어떠한 수성 기제, 예를 들어 완충제, 균형화된 염 용액, 액체 배지, 또는 아미노산, 지질 등을 포함한 1종 이상의 배지 성분을 포함하는 임의의 용액이 본 개시내용에서 기술되는 마이크로/나노현탁액을 제조하기 위하여 임의의 분말화된 제제에 첨가될 수 있다. 당업자라면, 제안된 프로토콜에서 사용되는 단계 또는 재료 중 어느 것; 예를 들어 첨가 단계의 순서, 혼합 단계의 순서 및 수, 액체의 부피, 혼합 시간, 슬러리를 균질하게 혼합하기 위한 장치 또는 기구, 배지 또는 공급물 제제화 등을 추가로 개조할 있을 것이며, 원하는 마이크로/나노현탁액의 점조도 및 특성에 적합하도록 조건을 조작하는 방법을 알고 있는 것이다.
한 실시양태에서는, 배양 중인 세포에 의해 요구되는 어떠한 구조 또는 정보 분자, 어떠한 영양소도 본원에서 기재되는 기술 또는 기술의 변형을 사용하여 마이크로/나노현탁액으로 제조될 수 있다. 배지 및 공급물 이외에, 구조 및/또는 정보 분자의 예에는 비타민, 아미노산, 펩티드, 거대분자, 항산화제, 호르몬, 성장 인자 등이 포함될 수 있으나, 이에 제한되지 않는다. 특정 실시양태에서는, 3차원적으로 현탁액 내에서 세포를 성장시키기 위하여, 세포 영양소와 복합체화된 세포 스캐폴딩(scaffolding) 매트릭스의 마이크로/나노현탁액이 제조될 수도 있다.
상기한 바와 같이 제조되는 마이크로/나노현탁액 조성물은 많은 적용분야에, 예를 들어 반응기에의 첨가 부피가 최소화되도록 하는, 해당 성분의 용해도 수준을 뛰어넘는 상당히 부양된 성분 농도까지의 영양소 보충에; 또는 하기하는 바와 같이 마이크로현탁액을 캡슐화하고 캡슐화 비드의 건조된 형태를 제조함으로써, 생물반응기에 직접 첨가될 수 있는 "초농축된" 보충물을 초래하는 데에 (이전에는 수행된 바 없음) 유용할 수 있다.
한 실시양태에서, 마이크로현탁액은 농축된 형태로 배양물에 제공될 필요가 있는 임의의 성분의 임의의 건조 분말 형태로부터 제조되어, 동일한 용액 중 성분을 가지는 등가의 액체 농축물 또는 공급물에 비해 2 내지 5배, 5 내지 10배, 10 내지 15배, 15 내지 20배, 20 내지 25배, 25 내지 30배, 30 내지 50배, 50 내지 70배, 70 내지 100배 이상 농도의 마이크로현탁액 중 성분을 제공할 수 있다.
마이크로캡슐화
본 개시내용은 건조 분말화된 세포 배양 배지, 공급물, 보충물 또는 농축물로부터 제조된 상기한 마이크로/나노현탁액의 마이크로캡슐화 방법을 제공한다. 생성되는 캡슐화 생성물은 본 개시내용에서 '마이크로캡슐', '캡슐화 비드', '비드', '캡슐' 또는 '마이크로비드'로 지칭될 수 있다. 캡슐화 마이크로/나노현탁액이 비드로 건조될 경우, 건조 단계는 더 큰 캡슐화 마이크로/나노현탁액의 농축도를 제공한다. 마이크로캡슐화는 예를 들어 세포 배양 배지/공급물과 같은 복합 혼합물 중 민감성 또는 불안정성 성분을 "이격 유지" 또는 격리하기 위하여 수행될 수 있다. 따라서, 캡슐화는 예를 들어 아미노산과 같은 특정 공급물 성분의 더 높은 농도를 산출할 수 있으며, 그에 따라 해당 공급물은 예를 들어 유가식(fed-batch) 배양에서 농축된 고영양 보충물로서 임의의 배양 시스템에 직접 첨가될 수 있다. 캡슐의 추가적인 코팅은 세포-배양물로의 영양소의 지연-방출에 영향을 줄 수 있다 (하기에서 논의됨). 캡슐화는 하기에 의해 수행될 수 있다: (a) 수시간에 걸쳐 일부 또는 전체 성분을 "약하게-방출"하기 위한 마이크로현탁액 및 나노현탁액의 표준 마이크로캡슐화 과정; (b) 내부 성분 방출을 상당히 지체시키기 위한 대안적인 비드-겔화 과정. 지연 방출의 예시적인 입증은 실시예 및 도 3, 4 및 8에서 찾아볼 수 있다.
구체적인 한 실시양태에서, 불안정성 성분을 캡슐화 또는 매립하는 데에 사용된 작용제는 알기네이트이었다. 알기네이트 마이크로캡슐은 약물 전달, 그리고 세포 성장 및 생존을 강화하기 위한 세포 배양물에서의 세포 성장의 고정을 포함한 많은 목적으로 사용되어 왔다. 예를 들어, 모두 그 전문이 참조로 포함되는 문헌 [Serp et al., Biotechnology and Bioengineering, 2000, 70(l):41-53]; [Breguet et. al., Cytotechnology, 2007, 53:81-93]; [Chayosumrit et al., Biomaterials, 2010, 31:505-14]; 미국 특허 번호 7,482,152; 및 미국 특허 번호 7,740,861를 참조한다.
캡슐화 기술은 출원인의 공동-계류 출원인 PCT/US2012/024194에도 기술되어 있는데, 특정 불안정성, 민감성 또는 감수성 화합물, 예컨대 에탄올아민, 비타민, 인슐린과 같은 성장 인자 등을 비제한적으로 알기네이트를 포함한 캡슐화 재료에 포획하는 것에 대해 기술하고 있다.
어떠한 이론에도 얽매이고자 하는 것은 아니나, 민감성 성분을 또 다른 분자 내에 캡슐화 또는 매립하는 것은 그의 분해를 촉진하거나 그의 안정성을 감소시키는 다른 성분 또는 조건과의 불안정성 화합물의 직접적인 접촉을 감소시키는 것으로 보인다. 마이크로캡슐화에 의한 에탄올아민 분해의 감소를 위한 마이크로캡슐의 제조를 기술하고 있는 방법은 그 개시내용의 전문이 본원에 참조로 포함되는 2012년 2월 7일자 본 출원인의 공동-계류 출원 PCT/US2012/024194에 기술되어 있다. 해당 방법이 주로 에탄올아민 안정화의 맥락에서 예시되기는 하였지만, 그것은 배지, 공급물 또는 보충물 중의 어떠한 감수성 또는 불안정성 화학물질 또는 화합물을 안정화하는 데에도 사용/적합화될 수 있다. 본원에서 기술되는 마이크로캡슐화 방법은 비제한적으로 티아민, B12 등과 같은 비타민, 글루타민과 같은 불안정성 아미노산, 시토카인, 성장 인자, 민감성 및 희귀 단백질 또는 펩티드 등을 포함한 세포 배양에 요구되는 임의의 감수성 화합물을 안정화하는 데에, 그리고 안정화된 화합물의 전달을 강화하는 데에 사용될 수 있으며, 세포 배양 배지 개발을 뛰어넘는 분야에 적용될 수 있는 것으로 이해된다. 본 개시내용에서, 캡슐화 기술은 마이크로/나노현탁액 비드에 적합화되어 있는 바, 몇 가지 단계 및 기술의 개조를 필요로 한다. 예를 들어, PCT/US2012/024194 출원에서의 감수성 화합물에 대한 포획 단계에는 몇 가지 단계가 결핍되어 있다. 마이크로현탁액의 캡슐화를 위하여, 알기네이트와 같은 캡슐화 재료가 마이크로현탁액과 혼합 및 블렌딩되었다. 이후 이와 같은 혼합물이 피펫 또는 점적기와 같은 분배 기구로 흡인된 후, 비-점착 표면, 예를 들어 파라필름 상으로 약하게 혼합물을 점적하는 것에 의해 캡슐화 마이크로현탁액의 액적이 점차 생성되었다. 다음에, 가교제가 액적에 첨가됨으로써 비드가 형성되었다. 이러한 비드는 탈수 및 진공 건조됨으로써 수분이 제거되었는데, 일반적으로 "캡슐화 마이크로현탁액 비드" 또는 단순히 "비드"로 지칭된다.
당업자라면 본 개시내용에 기초하여 알고 있는 바와 같이, 제안된 프로토콜에서 사용되는 어떠한 단계 또는 재료도 개조될 수 있다 (실시예 2 참조). 예를 들어, 다양한 캡슐 재료가 사용될 수 있거나, 피펫, 점적기, 시린지 또는 이들의 임의의 개조물을 포함한 다양한 액적 전달 기구가 사용될 수 있거나, 임의의 가교제가 사용될 수 있거나, 또는 비드가 다양한 수단에 의해, 그리고 다양한 건조도 및/또는 경도로 건조 또는 탈수될 수 있다. 당업자라면, 직면한 목적을 위한 적절한 캡슐화제, 예를 들어 알기네이트, 폴리-L-락트산 (PLL), 키토산, 아가로스, 젤라틴, 히알루론산, 콘드로이틴 술페이트, 덱스트란, 덱스트란 술페이트, 헤파린, 헤파린 술페이트, 헤파란 술페이트, 겔란 검, 크산탄 검, 구아 검, 수용성 셀룰로스 유도체, 카라기난 등을 결정할 수 있을 것이다.
마이크로캡슐은 통상적으로 2 mm 이하, 보통은 0.05-1.5 mm의 직경 범위 이내인 직경을 가지는 구형의 입자이다. 통상적으로, 알기네이트 마이크로캡슐은 다가음이온성 알기네이트와 2가 또는 3가인 다가양이온 예컨대 염화칼슘 사이의 가교에 의해 형성된다. 가교를 위한 다른 염은 2가 또는 3가 양이온, 예컨대 마그네슘 클로라이드, 바륨 클로라이드 및 알루미늄 술페이트일 수 있다.
캡슐화는 몇 가지 장점을 가지는데, 그 중 일부로는 불안정성 성분의 분해 또는 원치않는 반응으로부터의 보호; 또는 세포 배양물로의 캡슐화 성분의 방출-시간을 지연 및/또는 연장하는 것이 포함되나, 이에 제한되지 않는다. 한 실시양태에서는, 배지의 마이크로캡슐화로 인한 보호; 또는 주위 온도에서 불안정성 화합물을 포함하는 세포 배양 배지, 공급물 및 보충물의 안정성 및 저장을 증가시키는 것이다. 캡슐화 화합물은 비드 내로 건조될 수 있으며, 그것은 이후 다른 배지 성분과 블렌딩 및/또는 혼합될 수 있다. 따라서, 마이크로/나노현탁액은 임의의 배지/불안정성 성분 기능성 상실의 1-5%, 5-10%, 10-15%, 15-20%, 20-25%, 25-30%, 30-35%, 35-40%, 40-50%, 50-60%, 60-70%, 70-80%, 80-90% 또는 90-100% 감소를 초래할 수 있으며, 그것은 본 출원에서 개시되는 방법을 포함하여 당업계에 알려져 있는 기술을 사용한 캡슐화 불안정성 또는 배지 성분에 대한 적합한 기능 검정에 의해 측정될 수 있다. 기능 검정의 예는 일수가 지남에 따라 세포 생존력을 증가시키는 마이크로캡슐을 포함하는 배지/공급물 조성물의 능력, 또는 배양 시스템 중 세포 수, 또는 재조합 단백질 생산, 또는 발현되는 재조합 단백질의 양 및/또는 기능의 증가 (예를 들어, 효소 또는 수용체 기능 검정, 아니면 당업자라면 알고 있는 바와 같이 글루타민과 같은 캡슐화 불안정성 성분의 안정성이 배양 동안 평가될 수 있는 것 등임)일 수 있다.
한 실시양태에서는, 에탄올아민-덴드리머 복합체를 캡슐화 또는 매립하기 위하여 알기네이트와 같은 격리제가 사용되었다. 덴드리머는 정해진 구조 및 분자량 특징을 그에 부여하기 위하여 조절되는 순차적 과정을 사용하여 제조될 수 있는 초고-분지형 합성 거대분자로써; 그 전문이 본원에 참조로 포함되는 문헌 [Astruc et al., Chem. Rev. 2010, 110:1857-1959]에 고찰되어 있다. 덴드리머는 본 발명의 캡슐화 마이크로현탁액을 제조하는 데에도 사용될 수 있다. 또 다른 실시양태에서, PCT/US2012/024194에 기술되어 있는 바와 같은 방법에서 사용된 덴드리머는 폴리아미도아민이었는데, 캡슐화 마이크로/나노현탁액에 사용되기 위하여 그것이 개조될 수 있다. 본 출원에서 기술되는 방법에 사용될 수 있는 다른 덴드리머에는 폴리프로필렌이민 (PPI) 덴드리머, 인 덴드리머, 폴리리신 덴드리머, 폴리프로필아민 (POPAM) 덴드리머, 폴리에틸렌이민 덴드리머, 입티센 덴드리머, 지방족 폴리(에테르) 덴드리머 또는 방향족 폴리에테르 덴드리머가 포함되나, 이에 제한되지 않는다.
한 실시양태에서, 마이크로캡슐화 마이크로/나노현탁액은 농축된 형태로 배양물 중에 제공됨으로써, 동일한 용액 중 성분을 가지는 등가의 액체 농축물 또는 공급물에 비해 2 내지 5배, 5 내지 10배, 10 내지 15배, 15 내지 20배, 20 내지 25배, 25 내지 30배, 30 내지 50배, 50 내지 70배, 70 내지 100배 이상 농도의 캡슐화 마이크로/나노현탁액 중 성분을 제공할 필요가 있는 어떠한 성분에 대해서도 제조될 수 있다. 예시적인 한 실시양태에서, 도면에 나타나 있는 바와 같은 농축된 공급 제제 중 마이크로현탁액 제제는 그의 상응하는 액체 공급물에 비해 약 7배 더 농축되어 있는 반면, 동일 마이크로현탁액의 건조된 캡슐화 형태는 그의 상응하는 액체 공급물에 비해 약 10배 더 농축되어 있다.
항산화제
본 개시내용은 또한 캡슐 내의 불안정성 화합물이 캡슐화 과정 전에 1종 이상의 보호 물질, 예컨대 항산화제와 추가로 조합될 수 있는 것에 대해 기술한다. 따라서, 특정 실시양태에서는, 분말화된 배지, 공급물 또는 보충물 중 항산화제와 불안정성 성분의 혼합물이 캡슐화 전에 마이크로현탁액 제제를 제조하기 위한 개시 재료로 사용될 수 있다. 예시적인 항산화제에는 아스코르브산, 베타-카로틴, 비타민 A, E와 같은 비타민, 리코펜, 플라보노이드, 셀레늄 등이 포함되나, 이에 제한되지 않는다. 조사로 인한 보호에 대한 항산화제의 효과는 도 8에 도시되어 있다.
한 실시양태에서, 마이크로캡슐화 이전의 항산화제로 인한 보호는 배지/불안정성 성분 기능성 상실의 1-5%, 5-10%, 10-15%, 15-20%, 20-25%, 25-30%, 30-35%, 35-40%, 40-50%, 50-60%, 60-70%, 70-80%, 80-90% 또는 90-100% 감소를 초래할 수 있으며, 그것은 불안정성 또는 배지 성분에 대한 적합한 기능 검정에 의해 측정될 수 있다. 건조된 마이크로캡슐 비드는 이후 다른 배지 성분에 블렌딩되고/거나 그와 혼합될 수 있다.
킬레이트화
본 개시내용은 또한 양이온, 금속 이온, 미량 원소 등을 포함한 배지 내에서 발견되는 반응성 분자를 킬레이트화, 불활성화 또는 차단 분리하는 작용제인 킬레이트화제(chelation agent)에 대해 기술한다. 반응성 분자는 배지 중의 불안정성 화합물과 부정적으로 상호작용하여 그의 효능을 감소시킨다. 반응성 화합물을 킬레이트화/복합체화함으로써, EDTA, 시트레이트, 숙시네이트, 시클로덱스트린, 클라트레이트, 덴드리머, 아미노산 등과 같은 화합물은 그의 반응성을 감소시킨다. 더하여, 킬레이트화제는 불안정성 화합물을 포함하는 마이크로캡슐/비드 외부에 구분되어 유지되도록 설계될 수 있다. 불안정성 화합물의 보호에 대한 킬레이트화의 효과에 대해서는 도 9에 기술되어 있다.
한 실시양태에서, 마이크로캡슐 외부의 반응성 및/또는 ROS 생산 배지/공급물 성분의 킬레이트화로 인한 보호는 배지/불안정성 성분 기능성 상실의 1-5%, 5-10%, 10-15%, 15-20%, 20-25%, 25-30%, 30-35%, 35-40%, 40-50%, 50-60%, 60-70%, 70-80%, 80-90% 또는 90-100% 감소를 초래할 수 있으며, 그것은 불안정성 또는 배지 성분에 대한 적합한 기능 검정에 의해 측정될 수 있다. 기능 검정의 예는 일수가 지남에 따라 세포 생존력을 증가시키는 마이크로캡슐 및 킬레이트화된 성분을 포함하는 배지/공급물 조성물의 능력, 또는 배양 시스템 중 세포 수, 또는 재조합 단백질 생산, 또는 발현되는 재조합 단백질의 양 및/또는 기능의 증가 (예를 들어, 효소 또는 수용체 기능 검정, 아니면 당업자라면 알고 있는 바와 같이 글루타민과 같은 캡슐화 불안정성 성분의 안정성이 배양 동안 평가될 수 있는 것 등임)일 수 있다.
지연-방출
한 실시양태에서는, 임의로 마이크로캡슐이 마이크로캡슐 내 성분의 지연-방출 또는 연장-방출을 위하여 PLGA와 같은 보호 코팅에 의해 추가로 코팅될 수 있다. 지연 방출을 위한 통상적인 배지 성분에는 비타민, 글루코스, 아미노산, 성장 인자 또는 시토카인이 포함될 수 있으나, 이에 제한되지 않는다. 지연-방출 제제에 따라, 성분은 동일한 마이크로캡슐 내부로부터 동일한 속도로 방출되거나, 또는 상이한 마이크로캡슐로부터 상이한 속도로 상이한 시간에 방출될 수 있다. 그와 같은 이중-형태인 지연 방출 배지의 예시적인 용도는 배양 초기의 성장 성분 (예컨대 글루코스, 아미노산 등)의 방출에 후속하는 이후의 배양물의 log-후 단계로의 생산성 성분 (예컨대 갈락토스 등과 같은 재조합 단백질 발현 유도제)의 방출에 있을 수 있다. 이중-형태 배지가 필요한 성분의 적시 방출을 관리하게 되기 때문에, 그와 같은 배지는 소비자 작용을 필요로 하지 않게 된다. 또 다른 예는 2종 이상의 성분이, 특정 목적상 그것이 배양물 내에서 서로 반응할 필요가 있을 경우 설계된 시간까지 분리 유지되는 것에 있을 수 있다.
마이크로캡슐화 후 코팅에 사용될 수 있는 코팅 용액이 적용됨으로써 추가적인 층을 제공할 수 있는데, 폴리-글리콜산, PLGA (폴리-락트산-코-글리콜산), 콜라겐, 폴리히드록시알카노에이트 (PHA), 폴리-ε-카프로락톤, 폴리-오르토 에스테르, 폴리-무수물, 폴리-포스파젠, 폴리-아미노산, 폴리디메틸실록산, 폴리우레탄, 폴리-테트라플루오로에틸렌, 폴리에틸렌, 폴리술폰, 폴리-메틸 메타크릴레이트, 폴리-2-히드록시에틸메타크릴레이트, 폴리아미드, 폴리프로필렌, 폴리-비닐 클로라이드, 폴리스티렌, 폴리-비닐 피롤리돈, 폴리-L-리신 및 폴리오르니틴이 포함되나, 이에 제한되지 않는다. 비드로 형성되어 외부가 코팅되어 있는 캡슐화 성분 자체가 추가로 캡슐화됨으로써, 둘러싸고 있는 코팅 및 개별 비드 코팅의 코팅 특징에 따라 광범위한 방출 선택사항이 이용가능하게 될 수도 있다.
추가적인 외부 코팅은 알기네이트, 폴리-L-락트산, 키토산, 아가로스, 젤라틴, 히알루론산, 콘드로이틴 술페이트, 덱스트란, 덱스트란 술페이트, 헤파린, 헤파린 술페이트, 헤파란 술페이트, 겔란 검, 크산탄 검, 구아 검, 수용성 셀룰로스 유도체 및 카라기난에서 선택될 수 있다. 코팅의 효과에 대해서는 실시예 및 도 3, 4 및 8에 입증 및 논의되어 있다. 한 실시양태에서, 마이크로캡슐로부터의 내부 성분의 지연-방출은 배양 기간 동안 6-24시간, 24-48시간, 48-72시간, 1일, 2일, 3-5일, 5-10일, 10-15일, 15-20일, 20-25일, 25-30일, 30-40일, 40-50일에 걸친 세포 배양 시스템에서의 캡슐화 성분의 유지를 초래할 수 있다. 지연 방출은 캡슐 내부에 있으며 임의로 또한 연장 방출을 위하여 코팅되었을 수 있는 불안정성 또는 배지 성분에 대한 적합한 시간-방출 검정에 의해 측정될 수 있다. 예시적인 시간 방출 검정에 대해서는 하기에 논의되어 있다. 기능 검정의 다른 예는 일수가 지남에 따라 세포 생존력을 증가시키는 코팅된 마이크로캡슐을 포함하는 배지/공급물 조성물의 능력, 또는 배양 시스템 중 세포 수, 또는 재조합 단백질 생산, 또는 발현되는 재조합 단백질의 양 및/또는 기능의 증가 (예를 들어, 효소 또는 수용체 기능 검정, 아니면 당업자라면 알고 있는 바와 같이 글루타민과 같은 캡슐화 불안정성 성분의 안정성이 배양 동안 평가될 수 있는 것 등임)일 수 있다.
비타민, 글루코스, 아미노산, 성장 인자 또는 시토카인과 같은 통상적인 배지 성분 이외에, 하기의 세포 배양 영양소/시약이 지연-방출을 위한 표적이 될 수도 있다. 여기에는 글루코스 및 기타 형태의 헥소스, 아미노산, 염, 펩티드, 단백질 예컨대 콜라겐 및 단백질 분획, 지질, 호르몬, 비타민, 뉴클레오티드/뉴클레오시드, 미량 원소, 리보뉴클레오티드/리보뉴클레오시드, 혈청, 혈청 분획 예컨대 소 알부민 및 세룰로플라스민, 그리고 직접적으로 대사되지는 않으나 배양물 중 세포에 세포 배양-관련 장점을 제공하는 기타 성분, 예컨대 세포 응집을 방지하는 F68과 같은 다양한 유형의 플루로닉(pluronic), 피브로넥틴 및 펩티드 서열 예컨대 세포 결합을 지지하기 위한 RGD 및 소포 시약과 같은, 성장을 위한 것인지 또는 생성물 합성 및 분비를 위한 것인지에 관계없이 세포 대사를 촉진하는 데에 사용되는 모든 화학물질 또는 조성물이 포함되나, 이에 제한되지 않는다. 단일 또는 다수의 개별 성분 이외에도, 성분의 혼합물이 이와 같은 지연-방출 방법론에 포함될 수 있다. 분말 자체는 미세-분쇄 또는 과립화 (AGT) 형태의 것 중 어느 하나일 수 있다.
지연-방출을 검출하기 위한 예시적인 검정
방출-지연의 검출은 시간 기간에 걸쳐 해당 성분(들)에 대하여 검정하는 것, 및 시간이 지남에 따른 증가를 관찰하는 것을 포함한다. 통상적인 CHO 세포 영양소 보충물의 예는 글루코스에 대하여 측정하는 것일 수 있다. 글루코스를 함유하는 보충물은 물에 첨가되고, T=0 샘플이 채취된 후, 유지되게 된다. 다음에, 이후 시간 기간에 (예컨대 24, 48, 72시간에) 추가적인 샘플이 채취될 수 있다. 보충물 중에 지연-방출 성분이 존재하는 경우라면, 시간이 지남에 따라 글루코스가 상승하는 것이 관찰될 것이다. 글루코스를 측정하기 위한 한 가지 검정은 키트 형태로 시중에서 이용가능한 글루코스 옥시다제의 측정이 될 것이다. 그 원리는 글루코스 옥시다제가 글루코스와 반응하여 글루콘산 및 과산화수소를 산출한다는 것이다. 과산화수소는 o-디아니시딘과 반응하여 산화된 o-디아니시딘을 산출하는데, 그것은 황산에 노출시 분홍색 색상을 형성한다. 이는 분광광도측정법에 의해 판독될 수 있다. 글루코스 측정 또는 다른 보충물 성분 예컨대 아미노산을 위한 또 다른 검정은 HPLC에 의한 것일 수 있다. 이 방법은 지연-방출의 특질인, 시간이 지남에 따른 방출 성분의 계속적인 증가를 측정하게 된다.
멸균
본 개시내용에서, 불안정성, 민감성 또는 감수성 화합물에는 물리적, 화학적, 방사선 분해/파괴에 민감성인 물질이 포함되나, 이에 제한되지 않는다. 통상적인 민감성 배지 물질은 반응성 산소 종과의 화학적 상호작용에 민감성이거나, 미량 금속을 포함한 금속에 민감성이거나, 고온, 방사선 (감마, X-선, UV, 이온화 등), 냉동 온도, 냉동-해동, 압력, 교반에 민감성인 것 등일 수 있다. 이와 같은 실시양태의 추가적인 측면에서, 반응성 산소 종 (ROS) 등을 생성시키는 미량 원소 또는 물질은 킬레이트화되고/거나 불안정성 성분을 포함하는 마이크로캡슐의 외부에서 유지될 수 있다.
본 개시내용은 예를 들어 항산화제 코팅 및/또는 차후의 캡슐화를 통하여 조사 불안정성 성분을 보호하는 동시에, 방사선을 사용하여 캡슐화 성분을 포함하는 배지를 멸균하기 위한 수단을 제공한다. 멸균 조사에는 감마선, UV 선 및 기타 이온화 방사선과 같은 광 파장이 포함된다. 사용되는 멸균 감마 조사는 5 kGy 내지 100 kGy일 수 있다. 한 실시양태에서, 캡슐화 성분을 포함하는 배지는 배지 또는 공급물 기능성의 상실이 없고/거나 바이러스의 약 8-log 감소를 동반하는 약 50 kGy 이하의 감마 조사에 의해 멸균될 수 있다. 이는 돼지 파르보 바이러스(parvo virus) (PPV) 및/또는 뮤린 미닛 바이러스(minute virus) (MMV)의 >10e-8의 SAL (멸균성 보장 수준)을 만족시킨다. 일부 실시양태에서, 캡슐화 성분을 포함하는 배지는 배지 또는 공급물 기능성의 상실 없이 50 kGy 초과 100 kGy 이하 감마 조사의 조합에 의해 멸균될 수 있다.
특정 실시양태에서는, 약 6-8 log의 SAL, 또는 MMV 및 PPV와 같은 바이러스의 감소가 관찰되었다. UV 조사와 같은 다른 멸균 기술과의 조합에서는, 배지 또는 공급물 기능성의 상실 없이 약 8 log의 SAL까지의 추가적인 SAL 감소가 가능하였다. 또한, 재구성된 배지는 HTST (고온 단시간) 또는 UHT (초고온)과 같은 기술에 의해, 및/또는 세공 크기 0.1-0.2 ㎛의 항-바이러스 필터를 통한 여과에 의해 저온살균될 수 있는데, 이는 배지 또는 공급물 기능성의 상실 없이 베시바이러스, 돼지 시르코바이러스, 그리고 생물공학 업계에서 문제가 되는 기타 소형 외피보유 바이러스와 같은 바이러스의 추가적인 감소를 제공할 수 있다.
멸균되는 그의 능력으로 인하여, 그리고 배지 또는 공급물 기능성의 상실이 없는 것으로 인하여, 본 개시내용의 조성물은 강화된 세포 배양 워크플로우에 적합하게 되며, 기존 세포 배양 동안 직접 생물반응기에 첨가될 수 있기 때문에, 생물반응기 생산성을 향상시킨다. 특정 실시양태에서, 첨가는 캡슐화 비드로서의 것일 수 있거나, 또는 다른 실시양태에서, 첨가는 마이크로/나노현탁액으로서의 것일 수 있다. 또 다른 예는 생물반응기에의 멸균 마이크로캡슐의 직접 첨가, 여과된 물의 첨가, 혼합, 및 이후의 세포의 첨가일 수 있다.
마이크로캡슐은 하기 2종 이상의 방식으로 생물반응기에서의 영양소 보충에 사용될 수 있다: 1) 멸균 마이크로캡슐이 직접 생물반응기에 첨가되고, 그에서 그것이 시간-방출 방식 (우측)으로 성분을 방출할 수 있거나, 또는 2) 약 0.22 μ의 세공 크기를 가지는 다공성 금속 실린더, 케이지 또는 임의의 유사한 장치에 그것이 첨가됨으로써, 배양물 중 세포와 접촉하는 것으로부터 비드를 격리 유지할 수 있음. 선택사항 1의 경우, 비드가 여과를 방해할 수 있거나, 또는 세포 계수 또는 생산성을 감소시킬 수 있다. 선택사항 2의 경우, 생물반응기 교반만으로도 다공성 금속 케이지 내부로부터 영양소 보충물을 용해시켜 생물반응기로 전달하기에 충분하다.
세포 배양 배지
세포 배양 배지는 수많은 성분으로 구성되는데, 이들 성분은 배양 배지마다 가변적이다. 세포 배양 배지는 완전 제제, 즉 배양 세포에 대한 보충을 필요로 하지 않는 세포 배양 배지일 수 있거나, 불완전 제제, 즉 보충을 필요로 하는 세포 배양 배지일 수 있거나, 또는 불완전 제제를 보충하는 데에 사용되거나 완전 제제의 경우에는 배양 또는 배양 결과를 개선할 수 있는 보충물일 수 있다.
일반적으로, 재구성시, 세포 배양 배지는 용매 중에 용해된 용질을 가지게 된다. 용질은 세포 막 (또는 벽)을 가로지르는 삼투압을 균형화하는 삼투력을 제공한다. 또한, 용질은 세포를 위한 영양소를 제공하게 된다. 일부 영양소는 세포 작용을 위한 화학 연료일 것이며; 일부 영양소는 세포가 동화에 사용하기 위한 원료일 수 있고; 일부 영양소는 세포 대사를 촉진하는 효소 또는 담체와 같은 기구일 수 있으며; 일부 영양소는 세포의 사용을 위한 성분에 결합하여 완충하거나, 또는 유해한 세포 생성물에 결합하거나 그것을 격리하는 결합제일 수 있다.
세포 및 의도된 세포의 용도에 따라, 세포 배양 배지의 성분은 세포 배양 성능을 최적화하도록 균형화된 농도로 최적으로 존재하게 된다. 성능은 1종 이상의 원하는 특징, 예를 들어 세포 수, 세포 질량, 세포 밀도, O2 소비, 글루코스 또는 뉴클레오티드와 같은 배양 성분의 소비, 생물분자의 생성, 생물분자의 분비, 폐 생성물 또는 부산물 예컨대 대사물의 형성, 지표 또는 신호 분자에 대한 활성 등에 따라 측정되게 된다. 따라서, 각각의 성분 선택은 바람직하게는 의도된 목적을 위한 작용 농도로 최적화되게 된다.
기본 배지는 통상적으로 세포 배양물의 유지를 위하여 사용되며, 아미노산, 비타민, 유기 및 무기 염, 당 및 기타 성분을 포함한 수많은 성분을 포함할 수 있는데, 각 성분은 시험관내에서의 세포의 배양을 지지하는 양으로 존재한다.
마이크로현탁액 및/또는 캡슐화 마이크로현탁액을 포함하는 본원에서 기술되는 배지는 1× 제제일 수 있거나, 또는 예를 들어 5×, 10×, 20×, 50×, 500× 또는 1000× 배지 제제로 농축될 수 있다. 개별 배지 성분이 별도의 농축된 용액으로 제조되는 경우, 적절한 (충분한) 양의 각 농축물은 1× 배지 제제를 산출하기 위하여 희석제와 조합된다. 통상적으로, 사용되는 희석제는 물이지만, 수성 완충제, 수성 염수 용액 또는 기타 수용액을 포함한 다른 용액이 사용될 수도 있다. 배지는 추가적인 성분이 첨가될 필요가 있는 기본 배지, 또는 추가적인 첨가제를 필요로 하지 않으며 재구성되기만 하면 세포를 성장시킬 수 있는 완전 배지일 수 있다.
한 실시양태에서, 마이크로현탁액 및/또는 캡슐화 마이크로현탁액을 포함하는 건조 분말로부터 재구성되는 배지는 그것이 추가적인 pH 또는 염 농도 조정 없이도 특정 세포 유형을 성장시키는 데에 적합한 원하는 pH 및 오스몰농도를 자동으로 달성하는 데에 기여하는 균형화된 완충제 농도 및/또는 염 농도를 가진다는 점에서, 자동-pH 및/또는 자동-오스몰농도 배지/공급물로 이어진다.
또 다른 실시양태 또는 추가적인 실시양태에서, 마이크로현탁액 및/또는 캡슐화 마이크로현탁액을 포함하는 건조 분말로부터 재구성되는 배지는 화학적으로 한정된 세포 배양 배지로 이어진다. 배지 단백질의 존재는 재조합 단백질의 정제를 어렵고, 시간-소비적이며, 고가의 것이 되게 하며, 생성물 수율 및/또는 순도의 감소로 이어질 수도 있다. 따라서, 한 실시양태에서는, 특정 세포 유형의 성장을 지지할 수 있도록, 세포 배양 배지가 여전히 완전하면서도 무-혈청 및 무-단백질이 되게 된다. 다르게는, 건조 분말로부터 재구성되는 배지는 무-혈청이기는 하지만, 여전히 가수분해물의 형태 또는 정제된 단백질 또는 가수분해물 분획의 형태로 식물, 효모, 조류, 진균, 또는 재조합 공급원 예컨대 박테리아, 진균, 식물, 효모, 조류 등의 것과 같은 1종 이상의 비-동물 유래 공급원 (동물 기원 무-AOF)으로부터 유래하는 단백질을 함유할 수 있다. 다른 경우, 무-혈청 배지는 여전히 알부민, 페투인, 다양한 호르몬 및 기타 단백질을 포함한 1종 이상의 다양한 동물-유래 성분을 함유할 수 있다. 또 다른 실시양태에서, 배지 또는 배지 보충물은 단백질 무함유이며, 또한 지질, 가수분해물 또는 성장 인자를 함유하지 않는다.
본 개시내용의 배지 또는 보충물은 유가식 배양에 사용된다. 세포의 유가식 배양은 통상적으로 세포 농도를 증가시키고 높은 생성물 농도 및 부피 생산성을 위한 배양 수명을 연장하기 위하여, 단백질과 같은 생물분자의 산업적 생산에 사용된다. 유가식 배양은 기본 배지에 대한 글루코스와 같은 1종 이상 영양소의 조절되는 첨가를 포함한다. 영양소(들)는 영양소 고갈 또는 축적 및 부산물 축적을 방지함으로써 최적의 생성물 발현을 위하여 오스몰농도 및 CO2 농도와 같은 중요한 파라미터를 세포 성장을 촉진하고 세포 사멸을 최소화하는 수준 내로 유지하는 것에 의해, 세포 배양물의 성장을 조절하는 것을 돕는다.
세포 및 바이러스
본원에서 기술되는 바와 같은 마이크로현탁액 및/또는 캡슐화 마이크로현탁액을 함유하는 배지/공급물은 또한 다양한 세포를 배양하는 데에 사용될 수 있다. 한 실시양태에서, 배지는 식물 또는 동물 세포, 예컨대 포유동물 세포, 어류 세포, 곤충 세포, 조류(algal) 세포, 양서류 세포 또는 조류(avian) 세포를 포함한 진핵 세포를 배양하는 데에, 또는 바이러스, 바이러스-유사 입자를 제조하는 데에 사용된다.
본원에서 기술되는 배지/공급물을 사용하여 배양될 수 있는 포유동물 세포에는 주로 상피 세포 (예컨대 각질세포, 자궁경부 상피 세포, 기관지 상피 세포, 기관 상피 세포, 신장 상피 세포 및 망막 상피 세포), 그리고 확립되어 있는 세포주 및 그의 균주 (예컨대 293 배아 신장 세포, BHK 세포, HeLa 자궁경부 상피 세포 및 PER-C6 망막 세포, MDBK (NBL-1) 세포, 911 세포, CRFK 세포, MDCK 세포, CHO 세포, BeWo 세포, 창 세포, 디트로이트 562 세포, HeLa 229 세포, HeLa S3 세포, Hep-2 세포, KB 세포, LS180 세포, LS174T 세포, NCI-H-548 세포, RPMI 2650 세포, SW-13 세포, T24 세포, WI-28 VA13, 2RA 세포, WISH 세포, BS-C-I 세포, LLC-MK2 세포, 클론 M-3 세포, 1-10 세포, RAG 세포, TCMK-1 세포, Y-1 세포, LLC-PK1 세포, PK(15) 세포, GH1 세포, GH3 세포, L2 세포, LLC-RC 256 세포, MH1C1 세포, XC 세포, MDOK 세포, VSW 세포 및 TH-I, B1 세포, 또는 이들의 유도체), 임의의 조직 또는 기관 (비제한적으로 심장, 간, 신장, 결장, 장, 식도, 위장, 신경 조직 (뇌, 척수), 폐, 혈관 조직 (동맥, 정맥, 모세혈관), 림프 조직 (림프선, 아데노이드, 편도선, 골수 및 혈액) 및 비장 포함) 유래 섬유모세포, 그리고 섬유모세포 및 섬유모세포-유사 세포주 (예컨대 CHO 세포, TRG-2 세포, IMR-33 세포, Don 세포, GHK-21 세포, 시트룰린혈증 세포, 뎀프시 세포, 디트로이트 551 세포, 디트로이트 510 세포, 디트로이트 525 세포, 디트로이트 529 세포, 디트로이트 532 세포, 디트로이트 539 세포, 디트로이트 548 세포, 디트로이트 573 세포, HEL 299 세포, IMR-90 세포, MRC-5 세포, WI-38 세포, WI-26 세포, MiC11 세포, CHO 세포, CV-1 세포, COS-1 세포, COS-3 세포, COS-7 세포, 베로 세포, DBS-FrhL-2 세포, BALB/3T3 세포, F9 세포, SV-T2 세포, M-MSV-BALB/3T3 세포, K-BALB 세포, BLO-11 세포, NOR-10 세포, C3H/IOTI/2 세포, HSDM1C3 세포, KLN205 세포, 맥코이 세포, 마우스 L 세포, 균주 2071 (마우스 L) 세포, L-M 균주 (마우스 L) 세포, L-MTK-(마우스 L) 세포, NCTC 클론 2472 및 2555, SCC-PSA1 세포, 스위스/3T3 세포, 인디안 문착 세포, SIRC 세포, CII 세포 및 젠센 세포, 또는 이들의 유도체)가 포함된다.
조류 세포를 포함한 진핵 세포는 성장 및 생물연료 생산에 적합한 조건하에서 생물연료를 생산하기 위하여, 마이크로현탁액 및/또는 캡슐화 마이크로현탁액을 포함하는 본 개시내용의 배지 조성물 중에서 배양될 수도 있다.
본원에서 기술되는 배양 배지에 의해 지지되는 세포는 임의의 동물, 바람직하게는 포유동물, 가장 바람직하게는 마우스 또는 인간으로부터 유래될 수도 있다. 본원에서 기술되는 방법에 따라 배양되는 세포는 정상 세포, 질환 세포, 형질전환 세포, 돌연변이 세포, 체세포, 생식 세포, 줄기 세포, 전구체 세포 또는 배아 세포일 수 있으며, 그들 중 어느 것은 확립 또는 형질전환된 세포주일 수 있거나, 또는 자연 공급원으로부터 수득될 수 있다. 세포는 실험 목적으로, 또는 유용한 성분의 생산에 사용될 수 있다.
한 실시양태에서, 본원에서 기술되는 배지는 재조합 CHO 세포, 또는 CHOS, CHOK1, DG44, RevO 등과 같은 CHO-유래 세포주를 포함한 중국 햄스터 난소 (CHO) 세포를 배양하는 데에 사용된다. CHO 세포라는 용어에는 재조합 CHO 세포 및 기술되는 모든 CHO-유래 세포주에 대한 언급이 포함된다. CHO 세포는 중국 햄스터 난소로부터 유래하는 상피 세포 및 섬유모세포 양자로 분류되어 있다. 중국 햄스터 난소로부터 시작된 세포주 (CHO-K1) (문헌 [Kao, F.-T. And Puck, T.T., Proc. Natl. Acad. Sci. USA 60:1275-1281 (1968)])가 여러 해 동안 배양에 사용되어 왔으나, 그의 정체성은 아직 확인되어 있지 않다. 현재 대부분의 생물약제는 CHO 세포에서 단백질을 생산하고 있는데, 세포주가 예컨대 인간-유사 글리코실화 패턴, 정확한 번역-후 변형 및 낮은 인간 바이러스 전파 위험성을 가지는 여러 장점 때문이다.
세포의 배양
본원에서 기술되는 배양 배지에 의해 지지되는 세포는 조사자에 의해 결정되는 실험 조건에 따라 배양될 수 있다. 주어진 동물 세포 유형에 있어서의 최적의 플레이팅 및 배양 조건은 당업자에 의해 일상적인 실험만을 사용하여 결정될 수 있는 것으로 이해되어야 한다. 본원에서 기술되는 세포 배양 배지를 사용하는 일상적인 단층 배양 조건의 경우, 부착 인자 없이 세포가 배양 용기의 표면 상에 플레이팅될 수 있다. 다르게는, 예를 들어 라이프 테크놀로지스, 코포레이션(Life Technologies, Corp.) (캘리포니아 칼스배드 소재), R&D 시스템즈, 인크.(R&D Systems, Inc.) (미네소타 로체스터 소재), 겐자임(Genzyme) (매사추세츠 캠브리지 소재) 및 시그마(Sigma) (미주리 세인트루이스 소재)로부터 시중에서 구입가능한 자연, 재조합 또는 합성 부착 인자 또는 펩티드 단편 (예컨대 콜라겐, 피브로넥틴, 비트로넥틴, 라미닌 등, 또는 이들의 자연 또는 합성 단편)을 사용하여 용기가 사전-코팅될 수 있다. 사전형성 콜라겐 겔 또는 합성 생물중합체 재료와 같은 자연 또는 합성 3-차원 지지체 매트릭스 상에 세포가 접종될 수도 있다. 현탁액 배양의 경우, 세포는 통상적으로 본원에서 기술되는 배양 배지 중에 현탁된 후, 스피너 플라스크, 관류 장치 또는 생물반응기와 같이 현탁액 중 세포의 배양을 촉진하는 배양 용기로 도입된다. 이상적으로는, 배지 성분의 변성 및 배양 동안의 세포의 전단을 방지하기 위하여, 배지 및 현탁된 세포의 교반은 최소화되게 된다.
각 실험 조건에 있어서의 세포 접종 밀도는 사용되는 구체적인 배양 조건에 맞추어 최적화될 수 있다. 플라스틱 배양 용기에서의 일상적인 단층 배양의 경우, 1-5×105 세포/cm2의 개시 접종 밀도가 바람직한 반면, 현탁액 배양의 경우, 더 높은 접종 밀도 (예컨대 5-20×105 세포/cm2)가 사용될 수 있다.
포유동물 세포는 통상적으로 세포 인큐베이터에서 약 37℃로 배양된다. 인큐베이터 분위기는 가습되어야 하며, 약 3-10%의 공기중 이산화탄소, 더욱 바람직하게는 약 8-10%의 공기중 이산화탄소, 가장 바람직하게는 약 8%의 공기중 이산화탄소를 함유해야 하지만, 어떤 세포주의 배양은 최적의 결과를 위해서는 20% 만큼 많은 공기중 이산화탄소를 요구할 수도 있다. 배양 배지 pH는 일반적으로 약 6.2-7.8, 바람직하게는 약 7.1-7.4, 가장 바람직하게는 약 7.1-7.3의 범위이어야 한다. 단백질 생산을 향상시키기 위하여, 상이한 조건 (pH, 온도 및/또는 이산화탄소)하에서 세포가 배양될 수도 있다.
세포가 약 1.5-2.0×106 세포/ml의 밀도에 도달하는 경우, 폐쇄 또는 배치 배양 내 세포는 완전한 배지 교체 (즉 폐 배지를 새로운 배지로 대체하는 것)를 받아야 한다. 관류 배양 (예컨대 생물반응기 또는 발효기에서) 내의 세포는 연속 재순환에 기반하여 새로운 배지를 받게 된다.
바이러스 및 백신 생산
현탁액 또는 단층 배양에서의 세포의 배양 이외에, 본 발명의 배지는 포유동물 세포로부터의 바이러스의 제조 방법에 사용될 수도 있다. 그와 같은 방법은 (a) 바이러스에 의한 세포의 감염을 촉진하는 데에 적합한 조건하에서 세포 (예컨대 포유동물 세포)를 바이러스와 접촉시키는 단계; 및 (b) 세포에 의한 바이러스의 제조를 촉진하는 데에 적합한 조건하에 본원에서 기술되는 배양 배지에서 세포를 배양하는 단계를 포함한다. 세포는 배양 배지에서의 세포의 배양 전, 동안 또는 후 중 어느 하나에 바이러스와 접촉될 수 있다. 포유동물 세포를 바이러스로 감염시키는 최적의 방법에 대해서는 당업계에 잘 알려져 있어서, 당업자에게 익숙할 것이다. 본원에서 기술되는 배양 배지에서 배양되는 바이러스-감염 포유동물 세포는 본원에서 기술되는 세포 배양 배지가 아닌 다른 세포 배양 배지에서 배양되는 세포에 비해 더 높은 바이러스 역가 (예컨대 2, 3, 5, 10, 20, 25, 50, 100, 250, 500 또는 1000배 더 높은 역가)를 산출할 것으로 예상될 수 있다.
이러한 방법은 비제한적으로 아데노바이러스, 아데노-연관 바이러스, 레트로바이러스 등을 포함한 다양한 포유동물 바이러스 및 바이러스 벡터를 제조하는 데에 사용될 수 있는데, 가장 바람직하게는 아데노바이러스 또는 아데노-연관 바이러스를 제조하는 데에 사용된다. 본원에서 기술되는 배양 배지에서의 감염된 세포의 배양 후, 바이러스, 바이러스 벡터, 바이러스 입자 또는 이들의 구성요소 (단백질 및/또는 핵산 (DNA 및/또는 RNA))를 포함하는 사용된 배양 배지는 백신 제조, 세포 형질감염 또는 유전자 치료법에서 사용하기 위한 바이러스 벡터의 제조, 동물 또는 세포 배양물의 감염, 바이러스 단백질 및/또는 핵산의 연구 등을 포함한 다양한 목적으로 사용될 수 있다. 다르게는, 바이러스, 바이러스 벡터, 바이러스 입자 또는 이들의 구성요소는 임의로 당업자에게 익숙할 단백질 및/또는 핵산 단리 기술에 따라 사용된 배양 배지로부터 단리될 수 있다.
재조합 단백질 생산
본 발명의 배양 배지는 현탁액에서의 성장되는 진핵 세포, 그러나 바람직하게는 포유동물 세포, 특히는 현탁액에서 성장되는 포유동물 세포를 포함한 세포로부터의 재조합 단백질의 제조 방법에 사용될 수도 있다. 본 개시내용에 따른 폴리펩티드의 제조 방법은 세포에 의한 폴리펩티드의 발현에 적합한 조건하에 본원에서 기술되는 배양 배지 중에서 폴리펩티드를 생성하도록 유전자 조작된 세포 (예컨대 포유동물 세포)를 배양하는 것을 포함한다. 해당 폴리펩티드를 발현하도록 포유동물 세포를 유전자 조작하는 최적의 방법에 대해서는 당업계에 잘 알려져 있으므로, 당업자에게 익숙할 것이다. 세포는 본 개시내용 배지에서의 배양 전에 유전자 조작될 수 있거나, 또는 배지 중 배양물에 위치된 후 1종 이상의 외인성 핵산 분자를 사용하여 그것이 형질감염될 수 있다. 유전자 조작된 세포는 단층 배양, 또는 더욱 바람직하게는 현탁액 배양 중 어느 하나로서 상기한 방법에 따라 본 발명의 배양 배지에서 배양될 수 있다. 세포의 배양 후, 해당 폴리펩티드는 임의로 당업자에게 익숙할 단백질 단리 기술에 따라 세포 및/또는 사용된 배양 배지로부터 정제될 수 있다.
실시예
실시예 1: 마이크로현탁액 및/또는 나노현탁액의 제조 프로토콜
여기에서 제공되는 것은 배지 성분을 포함하는 마이크로 또는 나노 현탁액의 제조 방법이다. 본 방법은 예를 들어 특정 성분의 마이크로현탁액 (ms) 및/또는 나노현탁액 (ns)에 의해, 그리고 또한 비드를 형성하는 마이크로현탁액 (ms) 및/또는 나노현탁액 (ns)의 캡슐화 후 이어지는 성분 농도의 추가적인 증가가 이루어지는 캡슐화 비드의 탈수에 의해, 용해도를 훨씬 뛰어넘어 배지 및/또는 보충물을 농축시키는 것을 가능케 할 수 있다.
마이크로현탁액의 제조 (도 1 참조)
~7× 농도로 (인산나트륨 없이) 배지 성분의 마이크로현탁액을 제조하기 위해서는:
1) 인산나트륨이 없는 건조 형태의 분말화된 배지, 보충물 또는 공급물 30 g을 모르타르에 칭량 투입한다.
2) 7.5 ml의 WFI (주사용수)를 첨가한다.
3) 분말이 습윤되어 물을 흡수하기 시작하고 페이스트를 형성할 때까지 녹색의 유연성 플라스틱 주걱을 사용하여 혼합한다. 마이크로현탁액의 균질성을 위하여, 페이스트를 철저하고 빠르게 혼합한다.
4) 1 ml의 추가적인 WFI를 마이크로현탁액에 첨가하고, 철저하게 혼합한다.
5) 용기 내에 마이크로현탁액을 수집하고, 주걱을 사용하여 최종량의 마이크로현탁액을 전달용 용기로 "긁어낸다". 부피는 ~29 ml일 것이다.
6) 전달에는 피스톤-전달 기구 (예를 들어; 시린지-유형 기구)를 사용한다.
실시예 2: 알기네이트 마이크로캡슐 중 마이크로현탁액 및 나노현탁액
마이크로캡슐화는 특히 분말화된 세포 배양 배지 중 반응성 성분으로부터 불안정성 성분을 물리적으로 분리 또는 격리하는 메카니즘을 제공할 수 있다. 예를 들어, 알기네이트 또는 임의의 다른 캡슐화 매트릭스 또는 캡슐 재료가 마이크로캡슐화에 사용될 수 있다.
캡슐화 마이크로현탁액을 제조하기 위한 프로토콜
배지, 보충물 또는 공급물을 추가로 농축하는 방식인 캡슐화 마이크로현탁액을 제조하기 위해서는:
1) 인산나트륨이 없는 배지, 보충물 또는 공급물의 마이크로현탁액을 제조한다 (예를 들어 상기와 같음).
2) 13.5 ml의 6% 알기네이트를 마이크로현탁액에 첨가하고, 주걱을 사용하여 철저하게 혼합함으로써, 알기네이트에 블렌딩한다. 부피는 ~40.5 ml가 되어야 한다.
3) 4-면 (중간) 폴리프로필렌 1회용 칭량 보트(weigh boat)의 바닥을 덮기 위한 파라필름 원형을 절단한다. 파라필름을 칭량 보트 바닥에 위치시킨다.
4) 절단이 완전히 내리눌렀을 때의 플런저 단부의 위치만큼 멀지는 않도록 하면서 가위를 사용하여 단부의 ~1/64"를 잘라 제거함으로써, 에펜도르프 리피터-플러스(Eppendorf Repeater-Plus) 팁을 준비한다.
5) 위치 1 (25 μl)로 설정된 2.5 ml 시린지와 함께 에펜도르프 리피터-플러스를 사용하여, 마이크로현탁액을 천천히 시린지로 취출한다. 확실하게 공기가 시린지로 흡인되지 않도록 해야 하는데, 이것이 점성인 마이크로현탁액에 남아 전달되는 부피를 변경시키게 되기 때문이다.
6) 에펜도르프 레버를 수회 내리눌러 시린지를 준비한다. 마이크로현탁액이 시린지 단부로부터 흘러나간 후, 시린지 단부를 씻어낸다. 다음에, 시린지 단부를 파라필름 표면으로부터 수 mm 수직으로 유지하고, 레버를 내리눌러 동일한 지점에서 ~5초 동안 유지함으로써, 25 μl의 액적 전부가 파라필름 표면으로 전달되도록 한다. 다음에, 인접 위치로 이동하여, 반복한다. 파라필름의 전체 표면에 걸쳐 계속하여 액적을 위치시킨다. 파라필름 상에서 수초 동안 안착한 후, 알기네이트-마이크로현탁액 액적은 볼록한 구형의 형상을 형성하게 된다.
7) 알기네이트를 가교시켜 히드로겔을 형성하도록 하기 위하여, 25 ml의 133 g/L 염화칼슘 (무수) 용액을 칭량 보트에 전달한다. 핀셋을 사용하여 염화칼슘 용액 표면 아래에 파라필름 (및 알기네이트-마이크로현탁액 액적)을 유지하는 것이 필요할 수 있는데, Ca 용액이 아래에 있는 경우 액적이 부상하게 되기 때문이다.
8) 파라필름 및 알기네이트-마이크로현탁액 액적을 염화칼슘 아래에서 30초 동안 유지한다. 비드가 형성된다.
9) 30초 후, 핀셋을 사용하여 파라필름의 일 단부를 잡고, 밀어 느슨하게 하여 모든 비드를 분리한다. 그것은 칭량 보트에서 파라필름을 뒤집고 염화칼슘에서 전후로 움직이는 것을 돕는다. 비드는 용이하게 파라필름으로부터 분리되게 된다.
10) 지체없이 단계 11-18을 통과하는데, 흡수제 박엽지(absorbent tissue paper) 상에 위치될 때까지 (단계 16) 마이크로현탁액이 처리 내내 천천히 용해될 것이기 때문이다.
11) 즉시 칭량 보트를 반으로 접고, 조심스럽게 좁아진 단부에 의해 칭량 보트 내에 비드를 유지하면서 염화칼슘 용액을 따라낸다.
12) 칭량 보트 상에서 느슨하게 유지하면서, 즉시 충분한 WFI를 첨가하여 (부어) 절반을 채운다.
13) 즉시 이전과 같이 칭량 보트를 접고, WFI를 따라낸다.
14) 칭량 보트 상에서 느슨하게 유지하면서, 즉시 충분한 WFI를 부어 절반을 채운다.
15) 즉시 이전과 같이 칭량 보트를 접고, WFI를 따라낸다.
16) 이중 박엽지 상에 각 칭량 보트를 뒤집어 쏟음으로써, 비드로부터 가능한 한 많은 물을 흡수한다.
17) 칭량 보트 상에서 박엽지를 유지하면서, 백색의 유연성인 플라스틱 주걱을 사용하여 비드를 퍼담는다.
18) 2개의 백색 플라스틱 주걱을 사용하여, 서로 접촉하지 않도록 비드를 분리한다.
19) 밤새 퓸 후드(fume hood)하에 위치시킨다.
20) 다음날 아침, 비드를 CaSO4 상 진공 건조 챔버에 위치시킨다.
21) 3일 동안 건조시킨 다음, 약간의 부착이 있을 수 있는 칭량 보트의 표면으로부터 비드를 제거 분리한다. 깨끗한 칭량 팬을 뒤집어 해당 칭량 팬 내의 비드를 덮는 데에 사용한다. 한 단부를 약간 들어올리고, 칭량 팬의 표면을 따라 백색의 유연성 주걱을 밀어, 비드를 분리한다. 모두 분리된 후, 새로운 칭량 팬에 위치시키고, 다시 CaSO4 상 진공 건조 챔버에 추가 4일 동안 놓아둠으로써, 확실하게 건조시킨다.
실시예 3: 비타민과 같은 부수적인 배지 성분의 캡슐화
캡슐화 표적이 비타민과 같은 부수적인 배지 성분인 경우, 단계 I은 캡슐화될 성분의 농축 용액을 직접 2% 알기네이트 용액에 혼합하는 것을 포함한다. 용액은 2% 알기네이트 부피의 1% 이하가 요구되도록 충분히 농축된다. 마이크로현탁액의 형성은 필요하지 않다. 다음에, 이와 같은 알기네이트-성분 용액이 133 g/L CaCl2 용액으로 직접 낙하하는 25 μl 액적으로 첨가된 후, 30초 동안 유지된다.
a) CaCl2 용액의 비드를 배출하고, 빠르게 2× 세정한다.
b) 비드를 분리하고, 편평한 표면 상에서 수일 동안 건조함으로써, < 1%의 수분을 확보한다.
c) 다음에, 비드가 굴절성 및 경질이 될 때까지 수일 동안 CaSO4 상 진공 탈수기에 위치시킨다.
d) 건조 비드는 추가 사용을 위한 준비가 된다.
건조 비드를 사용하는 것은 거의 100%의 영양소 보충 화학물질을 생물반응기에 첨가하는 것과 유사하다.
실시예 4: 알기네이트 -캡슐화 마이크로현탁액 상에 연장-방출 코팅을 적용하기 위한 프로토콜
비드 코팅 장비에 대한 접근이 이용가능하지 않았기 때문에, 대체 과정을 개발하였다. 비드의 연장-방출 코팅 층에는 절대적으로 구멍 또는 약한 영역이 발생하게 되지 않도록 할 필요성이 발견되었다. 무손상 비드는 수동으로 첨가되는 유기 상의 특성으로 인하여 균일하게 반복적으로 코팅될 수 없었다. 따라서, 슬라이드 대체 코팅 및 시험 검정을 개발하였다.
1) 상기한 바와 같이 알기네이트-마이크로현탁액을 제조한다.
2) 에펜도르프 피펫터(pipettor)를 사용하여, 적색의 고리가 있는 슬라이드의 투명 유리 원형 영역 내에 5 μl의 알기네이트-마이크로현탁액을 방점(dot)하였다.
3) 즉시 플라스틱 주걱 또는 다른 유연성 도구를 사용하여 5 μl의 알기네이트-마이크로현탁액을 "평활화(smoosh)" 또는 편평화함으로써, 가능한 한 많은 원형 유리 투명 영역을 충진하였다 (목표는 알기네이트-마이크로현탁액의 표면을 가능한 한 낮게 낮춤으로써 차후의 PLGA 코팅을 돕는 것으로써: 큰 비드는 작용하지 않는데, 그것이 슬라이드 상에 너무 높게 상향 돌출도기 때문이다).
4) 슬라이드를 133 g/L 염화칼슘 용액에 ~20-30초 동안 위치시킨다.
5) WFI에 침지시킴으로써 세정한다.
6) 슬라이드로부터 WFI를 배출 제거하고 (각 웰에 티슈를 접촉하여 과량의 물을 빨아냄), 퓸 후드에서 밤새 건조시킨다.
7) 다음에, CaSO4 상 진공에 위치시켜 탈수한다.
8) PLGA 25 mg/클로로포름 0.6 ml 스톡(stock). 50 μL의 클로로포름 중 PLGA를 첨가하여, 적색의 고리가 있는 슬라이드의 웰을 덮는다. 50 μL의 부피는 원형의 웰 영역 및 비드를 "충진하여" 덮음으로써, 웰 상에 오목한 혹을 생성시키게 된다. 이와 같은 부피의 PLGA-클로로포름은 용이하게 증발되어, 건조된 알기네이트-마이크로현탁액 상에 편평한 콘택트-렌즈형 덮개를 형성하게 된다. 지연: 3 코팅 > 2 코팅 > 1 코팅.
9) PLGA가 건조된 후, 가변적인 농도 및 글리콜산 대 락트산 비로 연장-방출 비교를 수행하는 데에 사용한다.
건조된 비드 상에 PLGA와 같은 용액의 균일한 코팅을 수득하는 것에 도전하였다. 다양한 프로토콜을 사용하여 몇 가지 시도를 수행하였다. 효과가 있는 프로토콜을 상기에 나타내었는데, 그것을 원하는 코팅 수준이 수득될 때까지 프로토콜로부터 개조하였다. 예를 들어, 비드를 편평화하는 것은 연장 방출 용도를 위한 최고의 코팅 결과를 제공하였다. 최고의 결과를 달성하기 위해서는, 코팅 성분 농도, 비드 크기, % 알기네이트, 코팅용 프로토콜, 건조 조건 및 건조도 수준, 사전-코팅용 용매 등과 같은 몇 가지 파라미터가 최적화되어야 하였다.
실시예 5: 가변적인 PLGA 농도 및 글리콜산 대 락트산 비의 연장-방출 비교: 검정
1. 55 ml의 PBS를 50 ml 원심분리 튜브에 위치시킨다.
2. 14개 웰 전체를 덮는 동일한 PLGA 조성물의 1개 슬라이드를 첨가한다. 실온에서 수평으로 인큐베이팅한다.
3. 가변적인 코팅 재료 성분의 비: 글리콜산 대 락트산 비로 연장-방출 특성을 연구하기 위하여, 예시적인 캡슐화 글루코스 비드를 글루코스에 대하여 검정하였다.
4. 다양한 시점에서의 샘플링을 위하여, 글루코스에 대해 시그마 글루코스 옥시다제 검정 (GAGO)을 수행하였다.
a) 50 ml 원심분리 튜브로부터의 0.10 ml 샘플을 10×75 mm 유리 튜브 또는 1.5 ml 휘튼(Wheaton) 유리 고무 마개 화학 분석용 바이알에 위치시킨다.
b) 0.20 ml의 시약을 동일 튜브에 위치시키고, 혼합한다.
c) 37℃에서 15분 동안 인큐베이팅한다.
d) 0.20 ml의 12 N 황산을 첨가하고, 혼합한다.
e) 대조군: 1 g/L의 글루코스 용액을 1:10으로 (0.1 ml + 0.9 ml WFI, 1OO ug/ml와 동일) 희석: 연속 2× 희석하여 (0.5 ml 글루코스 + 0.5 ml WFI) 12.5 ug/ml까지 하향. 대조군은 100, 50, 25 및 12.5 ug/ml 글루코스이다. WFI 바탕도 포함시킨다.
f) 안내하자면, 전체 14개 웰로부터의 마이크로현탁액 전부를 용해시키는 경우, 샘플은 대조군 표준의 범위 이내가 되도록 1:4로 희석될 필요가 있다 [적용되는 총 글루코스는 14개 웰에서 슬라이드 당 0.022 g이어야 한다, pg 69 NB 1138].
결과를 판독하는 데에는, 스펙트라맥스(SpectraMax) 384: 96 웰 트레이 중 350 μl의 샘플을 사용한다. 벽체가 투명하거나 짙은 것은 모두 동일하게 작용하여, 차이가 없다. 540 nm에서 흡광도를 판독한다.
계산: [시그마 글루코스 (GO) 검정 키트, 제품 코드 GAGO-20으로부터]
mg 글루코스 = (540 시험에서의 ΔA) (표준에서의 mg 글루코스*)
* 4개 희석물 중 최근접 표준의 농도
Δ는 시험 또는 표준 빼기 바탕 판독치의 OD 판독치 사이의 차이를 의미함.
** 상기에서 측정된 mg 글루코스에 샘플 제조시 이루어진 희석 계수를 곱함.
실시예 6: 다공성 금속 실린더
알기네이트-캡슐화 마이크로현탁액의 건조된 비드를 사용하여 다공성 금속 실린더를 충전하고, 생물반응기 내부의 조건을 모방하기 위하여 교반 막대와 함께 1 L 비커 내에 위치시켰다. 지연-방출을 위한 비드의 PLGA 코팅은 없었다. 도 11의 그래프는 생물반응기 내에서의 교반만으로 비드로부터 영양소 보충물을 수득하기에, 그리고 용해시켜 "생물반응기"로 전달하기에 충분하다는 것을 보여준다. 다공성 금속 실린더는 보충물이 세포 배양물로 가도록 하는 데에 펌핑, 관류 등을 필요로 하지 않는다. 한 연구 실험에서는, 실제로 너무 빨라서, 알기네이트 비드 중 보충물만으로도 (PLGA 코팅 없음) 약 20시간 내에 그의 적재물을 완전히 방출하였다. 연장-방출은 비드가 다공성 금속 내에 있는 경우에도 PLGA 코팅을 필요로 한다. 도 11의 하부 차트는 AGT 분말만으로도 비교적 빠르게 다공성 금속 실린더를 통과할 수 있지만, AGT 단독이 지연-방출을 위한 작용을 하게 되지는 않는다는 것을 보여준다. 유의할 점은 다공성 금속 실린더가 생물반응기에 장착된 채 오토클레이빙될 수 있으며, 보충물 비드가 배양 동안의 어느 때나 첨가될 수 있다는 것이다.
도 11은 연장-방출 마이크로캡슐이 생물반응기의 영양소 보충에 사용될 수 있는 하기 두 가지 방식을 보여준다: 1) 멸균 마이크로캡슐이 직접 생물반응기에 첨가되고, 그에서 그것이 시간-방출 방식으로 (우측) 성분을 방출할 수 있거나, 또는 2) 그것이 0.22 μ의 세공 크기를 가지는 다공성 금속 실린더에 첨가됨으로써, 비드가 배양물 중 세포와 접촉하는 것을 방지할 수 있다. 선택사항 1의 경우, 비드가 여과를 방해할 수 있거나, 또는 세포 계수 또는 생산성을 감소시킬 수 있다. 선택사항 2의 경우, 생물반응기 교반만으로도 다공성 금속 케이지 내부로부터 영양소 보충물을 용해시켜 생물반응기로 전달하기에 충분하다.
예시적인 일부 실시양태
배지, 공급물 또는 보충물의 건조 분말에 최소 부피의 수용액을 첨가하여 페이스트를 제조하는 단계;
상기 페이스트를 강하게 혼합하여 마이크로현탁액을 제조하는 단계
포함하는, 배지, 공급물 또는 보충물 조성물의 제조 방법.
청구범위 제1항에 따른 배지의 마이크로현탁액을 제조하는 단계;
임의로, 유효량의 항산화제를 마이크로현탁액과 혼합하여 혼합물을 형성시키는 단계;
적합한 캡슐 재료에 마이크로현탁액 또는 단계 2의 혼합물을 캡슐화하여 마이크로캡슐 또는 비드가 형성되도록 하는 단계;
마이크로캡슐 또는 비드를 건조하는 단계
를 포함하며, 배지가 불안정성 물질을 포함하는 것인, 배지 조성물의 제조 방법.
불안정성 물질이 덴드리머에 부착되는 것인, 청구범위 제2항의 방법.
배지가 하기로 이루어진 군으로부터 선택되는 특성 중 1종 이상을 위하여 제조되는 것인, 청구범위 제2항의 방법: 1종 이상의 성분이 초농축 상태에 있음, 증가된 안정성, 방사선 노출에 대한 내성의 증가, 열안정성, 연장된 보관 수명, 및 연장된 불안정성 성분의 방출.
배지 조성물이 캡슐화 성분의 연장-방출에 대한 검정, 열안정성에 대한 검정, 바이러스 수 감소에 대한 검정, 조사 후 기능성에 대한 검정, 연장된 보관 수명에 대한 검정, 수송 동안의 안정성에 대한 검정, 및 주위 온도에서의 저장에 대한 검정으로 이루어진 군으로부터 선택되는 검정을 위하여 검정되는 것인, 청구범위 제2항의 방법.
캡슐 재료가 알기네이트, 폴리-L-락트산, 키토산, 아가로스, 젤라틴, 히알루론산, 콘드로이틴 술페이트, 덱스트란, 덱스트란 술페이트, 헤파린, 헤파린 술페이트, 헤파란 술페이트, 겔란 검, 크산탄 검, 구아 검, 수용성 셀룰로스 유도체 및 카라기난으로 이루어진 군으로부터 선택되는 것인, 청구범위 제2항의 방법.
비드가 비드로부터의 불안정성 성분의 방출을 연장하는 코팅에 의해 추가로 코팅되는 것인, 청구범위 제2항의 방법.
코팅이 폴리-글리콜산, PLGA (폴리-락트산-코-글리콜산), 콜라겐, 폴리히드록시-알카노에이트 (PHA), 폴리-ε-카프로락톤, 폴리-오르토 에스테르, 폴리-무수물, 폴리-포스파젠, 폴리-아미노산, 폴리디메틸실록산, 폴리우레탄, 폴리-테트라플루오로에틸렌, 폴리에틸렌, 폴리술폰, 폴리-메틸 메타크릴레이트, 폴리-2-히드록시에틸메타크릴레이트, 폴리아미드, 폴리프로필렌, 폴리-비닐 클로라이드, 폴리스티렌 및 폴리-비닐 피롤리돈으로 이루어진 군으로부터 선택되는 것인, 청구범위 제5항의 방법.
비드가 조사되는 것인, 청구범위 제2항의 방법.
비드가 멸균성에 대하여 검정되는 것인, 청구범위 제8항의 방법.
비드가 감마-조사에 의해 조사되는 것인, 청구범위 제4항의 방법.
비드가 UV 선에 의해 추가로 조사되는 것인, 청구범위 제5항의 방법.
비드에 PPV 및 MMV 바이러스가 없는 것인, 청구범위 제5항의 방법.
조성물이 건조-형태의 배지인, 청구범위 제1항 또는 제2항의 방법.
불안정성 성분이 폴리아민, 성장 인자, 시토카인 및 비타민으로 이루어진 군으로부터 선택되는 것인, 청구범위 제1항 또는 제2항의 방법.
캡슐 재료가 수성 용매를 사용한 재구성시 가용성인, 청구범위 제2항의 방법.
캡슐화 매트릭스가 덴드리머-불안정성 성분 복합체를 캡슐화하는 것인, 청구범위 제3항의 방법.
덴드리머가 폴리아미도아민 덴드리머, 폴리프로필렌이민 덴드리머 또는 폴리프로필아민 (POPAM) 덴드리머인, 청구범위 제14항의 방법.
조성물이 1종 이상의 아미노산을 포함하는 분말화된 세포 배양 배지를 포함하는 것인, 청구범위 제1항 내지 제15항 중 어느 한 항의 방법.
성분을 포함하는 마이크로현탁액을 포함하는 배지, 공급물 또는 보충물 조성물.
캡슐 매트릭스에 의해 비드 내로 마이크로캡슐화되어 있는 불안정성 성분과 항산화제의 혼합물을 포함하는 배지, 공급물 또는 보충물 조성물.
캡슐 재료가 알기네이트, 폴리-L-락트산, 키토산, 아가로스, 젤라틴, 히알루론산, 콘드로이틴 술페이트, 덱스트란, 덱스트란 술페이트, 헤파린, 헤파린 술페이트, 헤파란 술페이트, 겔란 검, 크산탄 검, 구아 검, 수용성 셀룰로스 유도체 및 카라기난으로 이루어진 군으로부터 선택되는 것인, 청구범위 제18항의 배지, 공급물 또는 보충물 조성물.
비드가 코팅 용액에 의해 코팅되어 있는 것인, 청구범위 제18항의 배지, 공급물 또는 보충물 조성물.
코팅 용액이 폴리-글리콜산, PLGA (폴리-락트산-코-글리콜산), 콜라겐, 폴리히드록시알카노에이트 (PHA), 폴리-ε-카프로락톤, 폴리-오르토 에스테르, 폴리-무수물, 폴리-포스파젠, 폴리-아미노산, 폴리디메틸실록산, 폴리우레탄, 폴리-테트라플루오로에틸렌, 폴리에틸렌, 폴리술폰, 폴리-메틸 메타크릴레이트, 폴리-2-히드록시에틸메타크릴레이트, 폴리아미드, 폴리프로필렌, 폴리-비닐 클로라이드, 폴리스티렌, 폴리-비닐 피롤리돈, 폴리-L-리신 및 폴리오르니틴으로 이루어진 군으로부터 선택되는 것인, 청구범위 제20항의 배지, 공급물 또는 보충물 조성물.
조성물이 킬레이트화된 반응성 종을 추가로 포함하는 것인, 청구범위 제18항의 배지, 공급물 또는 보충물 조성물.
상기 반응성 종이 양이온, 금속 이온 또는 미량 원소인, 청구범위 제21항의 배지, 공급물 또는 보충물 조성물.
킬레이트화 모이어티가 EDTA, 시트레이트, 숙시네이트, 시클로덱스트린, 클라트레이트, 덴드리머 및 아미노산으로 이루어진 군으로부터 선택되는 것인, 청구범위 제21항의 배지, 공급물 또는 보충물 조성물.
조성물이 조사되는 것인, 청구범위 제17항 내지 제23항 중 어느 한 항의 배지, 공급물 또는 보충물 조성물.
상기 조사가 감마선에 의한 것인, 청구범위 제24항의 배지, 공급물 또는 보충물 조성물.
감마선이 25-100 kGy인, 청구범위 제25항의 배지, 공급물 또는 보충물 조성물.
감마선이 30-50 kGy인, 청구범위 제26항의 배지, 공급물 또는 보충물 조성물.
감마선이 30 kGy인, 청구범위 제26항의 배지, 공급물 또는 보충물 조성물.
무균상태로 생물반응기에 첨가되는 것인, 청구범위 제17항 내지 제28항 중 어느 한 항의 배지, 공급물 또는 보충물 조성물.
세포 배양 배지, 공급물 또는 보충물이 단백질 무함유인, 청구범위 제17항 내지 제29항 중 어느 한 항의 배지, 공급물 또는 보충물 조성물.
마이크로현탁액에 사용되는 분말화된 세포 배양 배지가 AGT (진보 과립화 기술 세포 배양 배지)인, 청구범위 제17항 내지 제30항 중 어느 한 항의 배지, 공급물 또는 보충물 조성물.
건조 형태 세포 배양 배지를 제조하기 위한 상기 기재된 조성물 중 어느 하나의 용도.
세포 배양 배지의 보관 수명을 증가시키기 위한 상기 기재된 조성물 중 어느 하나의 용도.
주위 온도에서 저장 및 취급하기 위한 상기 기재된 조성물 중 어느 하나의 용도.
다르게 정의되지 않는 한, 본원에서 사용되는 모든 기술 및 과학 용어는 당업자에 의해 통상적으로 이해되는 것과 동일한 의미를 가진다. 충돌하는 경우, 정의를 포함한 본 명세서가 우선하게 된다. 관련 당업자라면, 본원에서 기술되는 방법 및 적용분야에 대한 다른 적합한 변형 및 개조가 자명하여, 개시내용의 영역 또는 그의 특정 실시양태에서 벗어나지 않고도 이루어질 수 있음을 용이하게 알 수 있을 것이다. 또한, 재료, 방법 및 실시예는 단지 예시적인 것으로써, 제한하고자 하는 것은 아니다. 본원에서 인용된 모든 특허, 특허 출원 및 공개된 참고문헌은 그 전문이 본원에 참조로 포함된다.

Claims (22)

  1. (i) 불안정성 성분을 포함하는 배지, 공급물 또는 보충물의 건조 분말 형태에 최소 부피의 수용액을 첨가하여 페이스트를 제조하는 단계;
    (ii) 상기 페이스트를 강하게 혼합하여 마이크로현탁액을 제조하는 단계;
    (iii) 캡슐 재료 내에 단계 (ii)의 마이크로현탁액을 캡슐화하여 비드를 형성하는 단계; 및
    (iv) 비드를 건조하여 보호되고 안정한 불안정성 성분을 함유하는 조성물을 형성하는 단계를 포함하고,
    불안정성 성분은 폴리아민, 아미노산, 성장 인자, 시토카인, 호르몬, 또는 비타민을 포함하는,
    보호되고 안정한 불안정성 성분을 포함하는 진핵 세포 배양 배지, 공급물 또는 보충물 조성물의 제조 방법.
  2. 제1항에 있어서, 단계 (ii)와 단계 (iii) 사이에, 유효량의 항산화제를 마이크로현탁액에 추가하여 혼합물을 형성하는 단계를 더 포함하고,
    단계 (iii)의 캡슐화는, 캡슐 재료 내에, 단계 (ii)의 마이크로현탁액을 캡슐화하거나, 상기 혼합물을 캡슐화하여, 비드를 형성하는 것인 방법.
  3. 제1항에 있어서, 비드가 생물반응기 내에 무균상태로 첨가되는 방법.
  4. 제1항에 있어서, 진핵 세포 배양 배지, 공급물 또는 보충물 조성물이 단백질 무함유인 방법.
  5. 제1항에 있어서, 마이크로현탁액을 제조하는데 사용되는 단계 (i)의 분말이 AGT(advanced granulation technology cell culture medium, 진보 과립화 기술 세포 배양 배지) 형태인 방법.
  6. 이하의 단계에 의해 마이크로현탁액으로서 제조되고,
    (i) 불안정성 성분을 포함하는 배지, 공급물 또는 보충물의 건조 분말 형태에 최소 부피의 수용액을 첨가하여 페이스트를 제조하는 단계;
    (ii) 상기 페이스트를 강하게 혼합하여 마이크로현탁액을 제조하는 단계;
    (iii) 캡슐 재료 내에 마이크로현탁액을 캡슐화하여 비드를 형성하는 단계; 및
    (iv) 비드를 건조하여 보호된 안정한 불안정성 성분을 함유하는 조성물을 형성하는 단계,
    불안정성 성분은 폴리아민, 아미노산, 성장 인자, 시토카인, 호르몬, 또는 비타민을 포함하는,
    보호되고 안정한 불안정성 성분을 포함하는 진핵 세포 배양 배지, 공급물 또는 보충물 조성물.
  7. 제6항에 있어서, 비드 내에 항산화제를 더 포함하는 진핵 세포 배양 배지, 공급물 또는 보충물 조성물.
  8. 제7항에 있어서, 비드는 알기네이트, 폴리-L-락트산, 키토산, 아가로스, 젤라틴, 히알루론산, 콘드로이틴 술페이트, 덱스트란, 덱스트란 술페이트, 헤파린, 헤파린 술페이트, 헤파란 술페이트, 겔란 검, 크산탄 검, 구아 검, 수용성 셀룰로스 유도체 및 카라기난을 포함하는 군으로부터 선택되는 캡슐 재료로 제조되는 진핵 세포 배양 배지, 공급물 또는 보충물 조성물.
  9. 제8항에 있어서, 비드가 코팅 용액으로 코팅되는 진핵 세포 배양 배지, 공급물 또는 보충물 조성물.
  10. 제9항에 있어서, 코팅 용액이 폴리-글리콜산, PLGA (폴리-락트산-코-글리콜산), 콜라겐, 폴리히드록시알카노에이트 (PHA), 폴리-ε-카프로락톤, 폴리-오르토 에스테르, 폴리-무수물, 폴리-포스파젠, 폴리-아미노산, 폴리디메틸실록산, 폴리우레탄, 폴리-테트라플루오로에틸렌, 폴리에틸렌, 폴리술폰, 폴리-메틸 메타크릴레이트, 폴리-2-히드록시에틸메타크릴레이트, 폴리아미드, 폴리프로필렌, 폴리-비닐 클로라이드, 폴리스티렌, 폴리-비닐 피롤리돈, 폴리-L-리신 및 폴리오르니틴으로 이루어진 군으로부터 선택되는 진핵 세포 배양 배지, 공급물 또는 보충물 조성물.
  11. 제9항에 있어서, 킬레이트화제를 사용하여 킬레이트화된 반응성 종을 더 포함하고, 반응성 종이 양이온, 금속 이온, 또는 미량 원소를 포함하는 진핵 세포 배양 배지, 공급물 또는 보충물 조성물.
  12. 제11항에 있어서, 킬레이트화제가 EDTA, 시트레이트, 숙시네이트, 시클로덱스트린, 클라트레이트, 덴드리머 및 아미노산을 포함하는 군으로부터 선택되는 진핵 세포 배양 배지, 공급물 또는 보충물 조성물.
  13. 제6항에 있어서, 배지, 공급물 또는 보충물 조성물이 조사된(irradiated) 진핵 세포 배양 배지, 공급물 또는 보충물 조성물.
  14. 제13항에 있어서, 조사(irradiation)가 감마선에 의한 것인 진핵 세포 배양 배지, 공급물 또는 보충물 조성물.
  15. 제14항에 있어서, 감마선이 25-100 kGy인 진핵 세포 배양 배지, 공급물 또는 보충물 조성물.
  16. 제14항에 있어서, 감마선이 30-50 kGy인 진핵 세포 배양 배지, 공급물 또는 보충물 조성물.
  17. 제16항에 있어서, 감마선이 30 kGy인 진핵 세포 배양 배지, 공급물 또는 보충물 조성물.
  18. (i) 불안정성 성분을 포함하는 배지, 공급물 또는 보충물의 건조 분말 형태에 최소 부피의 수용액을 첨가하여 페이스트를 제조하는 단계;
    (ii) 상기 페이스트를 강하게 혼합하여 마이크로현탁액을 제조하는 단계;
    (iii) 캡슐 재료 내에 단계 (ii)의 마이크로현탁액을 캡슐화하여 비드를 형성하는 단계; 및
    (iv) 비드를 건조하여, 주위 온도에서 배지, 공급물 또는 보충물 조성물에 제공하기 위한, 보호되고 안정한 불안정성 성분을 함유하는 조성물을 형성하는 단계를 포함하고,
    불안정성 성분은 폴리아민, 아미노산, 성장 인자, 시토카인, 호르몬, 또는 비타민을 포함하는,
    보호되고 안정한 불안정성 성분을 포함하는 진핵 세포 배양 배지, 공급물 또는 보충물 조성물의 보관 수명을 증가시키기 위한 방법.
  19. 제18항에 있어서, 단계 (ii)와 단계 (iii) 사이에, 유효량의 항산화제를 마이크로현탁액에 추가하여 혼합물을 형성하는 단계를 더 포함하고,
    단계 (iii)의 캡슐화는, 캡슐 재료 내에, 단계 (ii)의 마이크로현탁액을 캡슐화하거나, 상기 혼합물을 캡슐화하여, 비드를 형성하는 것인 방법.
  20. 제18항에 있어서, 비드가 비타민, 아미노산, 펩티드, 거대분자, 호르몬, 및 성장 인자로 이루어진 군으로부터 선택되는 분자를 더 포함하는 방법.
  21. 제20항에 있어서, 단계 (iv)의 마이크로현탁액은 비드 내로 분자가 농축된 방법.
  22. 제9항에 있어서, 코팅이 성분의 지연된 방출을 제공하는 진핵 세포 배양 배지, 공급물 또는 보충물 조성물.
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