KR20210041003A - 동물 세포의 부유 배양용 첨가물, 부유 배양용 배지 및 부유 배양 방법 - Google Patents

동물 세포의 부유 배양용 첨가물, 부유 배양용 배지 및 부유 배양 방법 Download PDF

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šœ페이 후로미쓰
유스케 오야
다쿠야 히구치
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아지노모토 가부시키가이샤
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Abstract

본 발명은, 수용성 폴리머를 함유하는, 동물 세포의 부유 배양용 첨가물 및 배지, 및 수용성 폴리머를 함유하는 배지에서 동물 세포를 부유 배양함을 포함하는 동물 세포의 부유 배양 방법에 관한 것으로, 본 발명에 따르면, 동물 세포의 부유 배양에 있어서, 교반, 진탕, 환류, 기체 통기 등의 물리적 자극에 의한 인슐린 등의 배지 성분의 석출을 억제하고, 동물 세포의 배양 효율 및 배양 세포의 품질을 향상시킬 수 있는 동물 세포의 부유 배양용 첨가물, 부유 배양용 배지 및 부유 배양 방법을 제공할 수 있다.

Description

동물 세포의 부유 배양용 첨가물, 부유 배양용 배지 및 부유 배양 방법
본 발명은, 동물 세포의 부유 배양용 첨가물, 부유 배양용 배지 및 부유 배양 방법에 관한 것이다.
배아 줄기세포, 인공 다능성 줄기세포 등의 줄기세포를 비롯하여, 많은 동물 세포는, 매트리젤이나 비트로넥틴, 라미닌 등의 인간형 재조합 매트릭스 등을 토대 재료로서 사용한 접착 배양에 의해 증식 유지되어 왔다.
그러나, 동물 세포를 연구, 물질 생산, 의료 등에 응용하기 위해, 효율적으로 증식시키는 배양 방법이 요구되고 있다. 동물 세포를 대량으로 배양하는 방법으로서는, 교반 날개로 교반하여 부유 배양하는 수법, 연동 펌프를 사용하여 배지를 환류시켜 배양하는 수법, 바닥면으로부터 스파져(sparger)를 사용하여 기체 통기를 행하면서 배양하는 수법 등이 널리 사용되고 있다.
또한, 많은 동물 세포의 배양에 있어서, 미지의 인자나 프리온, 바이러스 등이 포함될 가능성이 있는 혈청을 함유하지 않는 무혈청 배지나, 알부민 함유량이 적은 저알부민 배지가 사용되지만, 이러한 배지를 사용하여 상기와 같은 교반 등을 수반하는 부유 배양을 행하면 배지 중에 석출을 일으키는 것이 보고되어 있으며, 상기 석출물은, 무혈청 배지나 저알부민 배지에, 세포의 성장에 필요한 인자로서 첨가된 인슐린이, 교반, 환류, 기체 통기 등에 의한 물리적인 자극에 의해 석출된 것은 아닐지 고찰되고 있다(비특허문헌 1).
이러한 배지 성분의 석출이 생기면 세포의 증식이 저하되기 때문에, 효율적인 동물 세포의 배양을 행하기 위해서는, 이러한 석출을 억제하는 것이 바람직하다.
D. Massai et al., Sci. Rep. 7 3950 (2017)
본 발명은 상기 상황 하에 이루어졌다. 본 발명자들은, 무혈청 배지나 저알부민 배지를 사용한 부유 배양에 있어서, 물리적 자극에 의해 생기는 석출물이 인슐린인 것을, 매트릭스 지원 레이저-탈리 이온화법-비행 시간형 질량 분석법(MALDI-TOFMS)에 의해 확인하였다.
따라서, 본 발명의 목적은, 동물 세포의 부유 배양에 있어서, 교반, 진탕, 환류, 기체 통기 등의 물리적 자극에 의한 인슐린 등의 배지 성분의 석출을 억제하고, 동물 세포의 배양 효율 및 배양 세포의 품질을 향상시킬 수 있는 동물 세포의 부유 배양용 첨가물, 부유 배양용 배지 및 부유 배양 방법을 제공하는 것이다.
상기 과제를 해결하기 위해 예의 검토한 결과, 본 발명자들은, 인슐린 등을 함유하는 동물 세포의 부유 배양용 배지에 수용성 폴리머를 첨가함으로써, 물리적 자극에 의해 생기는 인슐린 등의 배지 성분의 석출을 양호하게 억제할 수 있음을 발견하여, 본 발명을 완성하였다.
즉, 본 발명은 이하에 관한 것이다.
[1] 수용성 폴리머를 함유하는, 동물 세포의 부유 배양용 첨가물.
[2] 수용성 폴리머가 계면활성을 갖는 비이온성 수용성 폴리머인, [1]에 기재된 첨가물.
[3] 계면활성을 갖는 비이온성 수용성 폴리머가, 폴리비닐알코올, 폴리옥시에틸렌 폴리옥시프로필렌 블록 코폴리머 및 폴리옥시에틸렌 소르비탄 모노 지방산 에스테르로 이루어지는 그룹으로부터 선택되는 1종 또는 2종 이상인, [2]에 기재된 첨가물.
[4] 동물 세포가 줄기세포인, [1] 내지 [3] 중 어느 하나에 기재된 첨가물.
[5] 줄기세포가, 성체 줄기세포, 배아 줄기세포 및 인공 다능성 줄기세포로 이루어지는 그룹으로부터 선택되는 1종 또는 2종 이상인, [4]에 기재된 첨가물.
[6] 배지 성분의 석출을 억제하기 위한 첨가물인, [1] 내지 [5] 중 어느 하나에 기재된 첨가물.
[7] 배지 성분이 인슐린인, [6]에 기재된 첨가물.
[8] 수용성 폴리머를 함유하는, 동물 세포의 부유 배양용 배지.
[9] 수용성 폴리머가 계면활성을 갖는 비이온성 수용성 폴리머인, [8]에 기재된 배지.
[10] 계면활성을 갖는 비이온성 수용성 폴리머가, 폴리비닐알코올, 폴리 옥시에틸렌 폴리옥시프로필렌 블록 코폴리머 및 폴리옥시에틸렌 소르비탄 모노 지방산 에스테르로 이루어지는 그룹으로부터 선택되는 1종 또는 2종 이상인, [9]에 기재된 배지.
[11] 줄기세포의 부유 배양용인, [8] 내지 [10] 중 어느 하나에 기재된 배지.
[12] 줄기세포가, 성체 줄기세포, 배아 줄기세포 및 인공 다능성 줄기세포로 이루어지는 그룹으로부터 선택되는 1종 또는 2종 이상인, [11]에 기재된 배지.
[13] 배지 성분의 석출이 억제되어 있는, [8] 내지 [12] 중 어느 하나에 기재된 배지.
[14] 배지 성분이 인슐린인, [13]에 기재된 배지.
[15] 수용성 폴리머를 함유하는 배지에서 동물 세포를 부유 배양함을 포함하는, 동물 세포의 부유 배양 방법.
[16] 수용성 폴리머가 계면활성을 갖는 비이온성 수용성 폴리머인, [15]에 기재된 배양 방법.
[17] 계면활성을 갖는 비이온성 수용성 폴리머가, 폴리비닐알코올, 폴리옥시에틸렌 폴리옥시프로필렌 블록 코폴리머 및 폴리옥시에틸렌 소르비탄 모노 지방산 에스테르로 이루어지는 그룹으로부터 선택되는 1종 또는 2종 이상인, [16]에 기재된 배양 방법.
[18] 동물 세포가 줄기세포인, [15] 내지 [17] 중 어느 하나에 기재된 배양 방법.
[19] 줄기세포가, 성체 줄기세포, 배아 줄기세포 및 인공 다능성 줄기세포로 이루어지는 그룹으로부터 선택되는 1종 또는 2종 이상인, [18]에 기재된 배양 방법.
[20] 교반, 진탕, 환류 또는 기체 통기를 행하여 부유 배양하는, [15] 내지 [19] 중 어느 하나에 기재된 배양 방법.
[21] 배지 성분의 석출이 억제된 배지에서 동물 세포를 부유 배양하는, [15] 내지 [20] 중 어느 하나에 기재된 배양 방법.
[22] 배지 성분이 인슐린인, [21]에 기재된 배양 방법.
[23] 세포괴를 형성시켜 동물 세포를 부유 배양하는, [15] 내지 [22] 중 어느 하나에 기재된 배양 방법.
본 발명에 의해, 인슐린 등을 함유하는 동물 세포의 부유 배양용 배지에 첨가함으로써, 교반, 진탕, 환류, 기체 통기 등의 물리적 자극에 의해 생기는 인슐린 등의 배지 성분의 석출을 양호하게 억제할 수 있는 첨가물을 제공할 수 있다.
또한, 본 발명에 의해, 인슐린 등을 함유하는 동물 세포의 부유 배양용 배지로서, 교반, 진탕, 환류, 기체 통기 등의 물리적 자극이 부가되어도 인슐린 등의 배지 성분의 석출이 양호하게 억제된 동물 세포의 부유 배양용 배지를 제공할 수 있고, 인슐린 등을 함유하는 동물 세포의 부유 배양용 배지를 사용하여, 교반, 진탕, 환류, 기체 통기 등을 행하면서 동물 세포의 부유 배양을 행할 수 있다.
그 결과, 크기가 제어된 세포괴를 효율적으로 형성시킬 수 있고, 동물 세포의 배양 효율 및 배양 세포의 품질을 향상시킬 수 있다.
특히, 줄기세포 등의 미분화 세포에 대하여, 유지 배지에서의 유지 배양시 및 분화 유도 배지에서의 분화 유도시 중 어느쪽에서도 배지 성분의 석출이 억제되고, 유지 배양시의 미분화 유지율 및 분화 유도시의 분화율 둘 다를 향상시킬 수 있다.
[도 1] 도 1은, 실시예 2에 있어서, 폴리비닐알코올(PVA) 및 폴록사머(Kolliphor P188 BIO)의 각 첨가 농도가 인슐린의 석출 억제 효과에 미치는 영향을 나타내는 도면이다. 도면 중의 바는, 500μm를 나타낸다.
[도 2] 도 2는, 실시예 3에 있어서, 폴록사머(Kolliphor P188 BIO)의 첨가 농도가 인간 iPS 세포의 세포 증식률, 세포 생존율 및 미분화 유지율에 미치는 영향을 나타내는 도면이다.
[도 3] 도 3은, 실시예 4에 있어서, 폴록사머(Kolliphor P407)의 첨가 농도가 인간 iPS 세포의 세포 증식률에 미치는 영향을 나타내는 도면이다.
[도 4] 도 4는, 실시예 5에 있어서, 폴리비닐알코올(PVA)의 첨가 농도가 인간 iPS 세포의 세포 증식률에 미치는 영향을 나타내는 도면이다.
[도 5] 도 5는, 실시예 6에 있어서, 폴리옥시에틸렌 소르비탄 모노라우레이트(Kolliphor PS20)의 첨가 농도가 인간 iPS 세포의 세포 증식률에 미치는 영향을 나타내는 도면이다.
[도 6] 도 6은, 실시예 7에 있어서, 교반에 의한 인슐린의 석출에 대한 폴록사머(Kolliphor P188 BIO)의 효과를 나타내는 도면이다. 도면 중의 바는 100μm를 나타낸다.
[도 7] 도 7은, 실시예 8에 있어서, 환류에 의한 인슐린의 석출에 대한 폴록사머(Kolliphor P188 BIO) 및 폴리비닐알코올(PVA)의 효과를 나타내는 도면이다. 상단의 도면 중의 바는 500μm를 나타낸다. 하단의 도면은 상단의 도면을 확대 한 도면이며, 도면 중 바는 100μm를 나타낸다.
[도 8] 도 8은, 실시예 9에 있어서, 교반에 의한 인슐린의 석출에 대한 폴록사머(Kolliphor P188 BIO) 및 폴리비닐알코올(PVA)의 효과를 나타내는 도면이다. 도면 중의 바는 500μm를 나타낸다.
[도 9] 도 9는, 실시예 10에 있어서, 폴록사머(Kolliphor P188 BIO)의 첨가가 인간 iPS 세포의 분화 유도에 미치는 영향을 나타내는 도면이다.
본 발명은, 인슐린 등을 함유하는 동물 세포의 부유 배양용 배지에 첨가되는 동물 세포의 부유 배양용 첨가물(이하, 본 명세서에서 「본 발명의 첨가물」이라고도 칭함)을 제공한다.
본 발명의 첨가물은 수용성 폴리머를 함유한다.
본 발명에 있어서 「수용성 폴리머」란, 분자 내에 친수성기를 갖고, 물에 혼화 또는 용해되는 폴리머를 말한다. 본 발명에서는, 25℃에서의 물에 대한 용해도가 5중량% 이상인 것이 바람직하게 사용된다.
또한, 수용성 폴리머로서는, 특별히 한정되는 것은 아니지만, 통상, 크기 배제 크로마토그래피에 의해 측정되는 중량 평균 분자량이 1,000 내지 100,000 정도인 수혼화성 또는 수용성을 나타내는 폴리머가 사용된다.
이러한 수용성 폴리머로서, 예를 들어, 카복시비닐 폴리머; 폴리비닐알코올; 폴리비닐피롤리돈; 폴리옥시에틸렌 알킬 에테르, 폴리옥시에틸렌 알킬페닐에테르, 폴리옥시에틸렌 지방산 에스테르, 폴리옥시에틸렌 다가 알코올 지방산 부분 에스테르(폴리옥시에틸렌 글리세린 지방산 부분 에스테르, 폴리옥시에틸렌 소르비톨 지방산 부분 에스테르, 폴리옥시에틸렌 소르비탄 지방산 부분 에스테르 등), 폴리옥시에틸렌 경화 피마자유, 폴리옥시에틸렌 알킬아민 등의 폴리옥시에틸렌형 비이온성 계면활성제; 폴리옥시에틸렌 폴리옥시프로필렌 랜덤 코폴리머, 폴리옥시에틸렌 폴리옥시프로필렌 블록 코폴리머(폴록사머), 폴리옥시에틸렌 폴리옥시프로필렌 알킬 에테르 등의 폴리옥시에틸렌 폴리옥시프로필렌형 비이온성 계면활성제; 폴리 글리세린 지방산 에스테르 등의 폴리글리세린형 비이온성 계면활성제 등이 예시된다.
본 발명의 목적에는, 수용성 폴리머로서, 계면활성을 갖는 비이온성 수용성 폴리머가 바람직하게 사용되고, 폴리비닐알코올, 폴리옥시에틸렌형 비이온성 계면활성제, 폴리옥시에틸렌 폴리옥시프로필렌형 비이온성 계면활성제 및 폴리글리세린형 비이온성 계면활성제가 바람직한 수용성 폴리머로서 예시된다. 그 중에서도, 폴리비닐알코올, 폴리옥시에틸렌 다가 알코올 지방산 부분 에스테르 및 폴리옥시에틸렌 폴리옥시프로필렌 블록 코폴리머(폴록사머)가 보다 바람직하게 사용되고, 폴리비닐알코올, 폴리옥시에틸렌 소르비탄 모노 지방산 에스테르(폴리옥시에틸렌 소르비탄 모노라우레이트, 폴리옥시에틸렌 소르비탄 모노팔미테이트, 폴리옥시에틸렌 소르비탄 모노스테아레이트, 폴리옥시에틸렌 소르비탄 모노올레에이트 등), 및 폴리옥시에틸렌 폴리옥시프로필렌 블록 코폴리머(폴록사머)가 특히 바람직하게 사용된다.
본 발명의 첨가물에는 수용성 폴리머는 1종을 선택하여 단독으로 사용해도 좋고, 2종 이상을 선택하여 병용할 수도 있다.
본 발명의 첨가물에서의 수용성 폴리머의 함유량은, 배지에 첨가했을 때의 배지 조성물 중에서의 수용성 폴리머의 함유량이, 후술하는 함유량의 범위 내가 되도록 설정된다.
본 발명에서는, 상기한 수용성 폴리머를 그대로 본 발명의 첨가물로 해도 좋고, 또한 물, 다가 알코올 등의 용매에 용해 또는 분산하여, 수용액, 분산액 등의 액상 형태, 또는 부형제, 결합제 등의 일반적으로 제제화에 사용되는 첨가제와 혼합하고, 정립, 조립, 타정 등 하여, 분말상, 과립상, 정제상 등의 고형상 형태의 첨가물로 해도 좋다.
또한, 상기한 수용성 폴리머를, 탄수화물, 무기염 등의 이하에 기술하는 배지 성분의 일부와 혼합하여 본 발명의 첨가물로서 조제해도 좋다.
동물 세포의 부유 배양용 배지에 대한 첨가가 간편하고, 배지와의 혼화도 용이하다는 관점에서, 본 발명의 첨가물은, 바람직하게는 액상, 분말상, 과립상, 정제상 등의 형태로 제공된다.
본 발명의 첨가물은 멸균 처리하여 조제하는 것이 바람직하다. 멸균 처리 방법은 특별히 제한되지 않고, 예를 들어, 121℃에서 20분간의 오토클레이브 멸균, 방사선 멸균, 에틸렌 옥사이드 가스 멸균, 필터 여과 멸균 등을 들 수 있으며, 본 발명의 첨가물의 형태 등에 의해 적절히 선택할 수 있다.
본 발명의 첨가물은, 후술하는 동물 세포의 부유 배양용 배지의 성분에 첨가하여, 동물 세포의 부유 배양용 배지의 조제에 사용할 수 있고, 또한, 후술하는 동물 세포의 부유 배양용 배지에 첨가하여 사용할 수 있다.
본 발명의 첨가물을, 인슐린 등을 함유하는 동물 세포의 부유 배양용 배지에 첨가함으로써, 특히, 상기 동물 세포의 부유 배양용 배지가 무혈청 배지 또는 저알부민 배지인 경우에, 교반, 진탕, 환류, 기체 통기 등의 물리적 자극에 의해 생기는 인슐린 등의 배지 성분의 석출을 양호하게 억제할 수 있고, 크기가 제어된 세포괴의 효율적인 형성이 가능하고, 동물 세포의 배양 효율 및 배양 세포의 품질을 향상시킬 수 있다.
본 발명의 첨가물은, 줄기세포 등의 미분화 세포의 유지 배지나 분화 유도 배지에 첨가함으로써, 유지 배양 및 분화 유도시의 배지 성분의 석출을 억제할 수 있고, 유지 배양시의 미분화 유지율 및 분화 유도시의 분화율 둘 다를 향상시킬 수있다.
본 발명은 또한, 동물 세포의 부유 배양용 배지(이하, 본 명세서에서 「본 발명의 배지」라고도 함)를 제공한다.
여기서, 동물 세포로서는, 포유 동물 유래의 정상 세포, 줄기세포 및 전구 세포를 들 수 있다.
포유 동물 유래의 정상 세포로서는, 정자, 난자 등의 생식 세포나, 생체를 구성하는 체세포를 들 수 있다.
생체를 구성하는 체세포의 예로서는, 이하에 한정되는 것은 아니지만, 섬유아세포, 골수 세포, B 림프구, T 림프구, 호중구, 적혈구, 혈소판, 대식 세포, 단구, 골세포, 골수 세포, 혈관 주위 세포, 수지상 세포, 지방 세포, 간엽 세포, 상피 세포, 표피 세포(예를 들어, 각화 세포(케라티노사이트), 각질 세포 등), 내피 세포, 혈관 내피 세포, 간 세포, 연골 세포, 난구 세포, 신경 세포, 글리아 세포, 올리고덴드로사이트(희소 돌기 교세포), 마이크로글리아(소교세포), 아스트로사이트(성상 교세포), 심장 세포, 식도 세포, 근육 세포(예를 들어, 평활근 세포, 골격근 세포), 췌장 베타 세포, 멜라닌 세포 및 단핵 세포 등을 들 수 있다.
상기 체세포에는, 예를 들어 피부, 신장, 비장, 부신, 간, 폐, 난소, 췌장, 자궁, 위, 결장, 소장, 대장, 방광, 전립선, 정소, 흉선, 근육, 결합 조직, 뼈, 연골, 혈관 조직, 혈액(제대혈을 포함함), 골수, 심장, 눈, 뇌, 신경 조직 등의 임의의 조직으로부터 채취되는 세포가 포함된다.
줄기세포란, 자기 복제능과, 다른 종류의 세포로 분화하는 능력을 갖고, 제한 없이 증식할 수 있는 세포를 말한다.
예를 들어, 조혈 줄기세포, 위성 세포, 신경 줄기세포, 간엽계 줄기세포, 유선 줄기세포, 후점막 줄기세포, 신경관 줄기세포, 간 줄기세포, 췌장 줄기세포, 근줄기세포, 생식 줄기세포, 장 줄기세포, 모낭 줄기세포 등의 성체 줄기세포; 배아 줄기세포(ES 세포), 배아 종양 세포, 배아 생식 줄기세포, 인공 다능성 줄기세포(iPS 세포) 등의 다능성 줄기세포; 암 줄기세포 등을 들 수 있다.
전구 세포란, 상기 줄기세포로부터 특정의 체세포나 생식 세포로 분화하는 도중의 단계에 있는 세포이며, 위성 세포, 췌장 전구 세포, 혈관 전구 세포, 혈관 내피 전구 세포, 조혈 전구 세포(제대혈 유래의 CD34 양성 세포 등)를 들 수 있다.
본 발명의 배지는, 바람직하게는 줄기세포의 부유 배양용 배지로서 제공되고, 보다 바람직하게는 성체 줄기세포, 배아 줄기세포 및 인공 다능성 줄기세포의 부유 배양용 배지로서 제공되고, 더욱 바람직하게는 배아 줄기세포 및 인공 다능성 줄기세포의 부유 배양용 배지로서 제공된다.
본 발명의 배지는, 상기한 동물 세포의 부유 배양에 통상 사용되는 배지 성분과 함께 수용성 폴리머를 함유한다.
본 발명의 배지에 함유되는 수용성 폴리머에 대해서는, 본 발명의 첨가물에 있어서 상기한 바와 같고, 본 발명의 배지에는, 수용성 폴리머는 1종을 단독으로, 또는 2종 이상을 조합하여 함유시킬 수 있다.
본 발명에 있어서는, 수용성 폴리머는, 상기한 본 발명의 첨가물로서 조제된 상태에서, 상기 배지 성분과 함께 함유되어도 좋고, 또는 배지 성분에 대하여 직접 첨가되어도 좋다.
본 발명의 배지에서의 수용성 폴리머의 함유량은, 배양시에서의 최종 농도로서, 통상 0.1μg/mL 내지 10mg/mL이고, 바람직하게는 1μg/mL 내지 5mg/mL이며, 보다 바람직하게는 10μg/mL 내지 5mg/mL이고, 더욱 바람직하게는 10μg/mL 내지 1mg/mL이다.
본 발명의 배지에 함유시킬 수 있는 배지 성분으로서는, 동물 세포의 배양에 통상 사용되는 배지 성분을 들 수 있고, 예를 들어, 글루코스, 프룩토스, 수크로스, 말토스 등의 당; 아스파라긴, 아스파르트산, 글루타민, 글루탐산 등의 아미노산; 알부민, 트랜스페린 등의 단백질; 글리실글리실글리신, 대두 펩타이드 등의 펩타이드; 혈청; 비타민 A, 비타민 B군(티아민, 리보플라빈, 피리독신, 시아노코발라민, 비오틴, 엽산, 판토텐산, 니코틴아미드 등), 비타민 C, 비타민 E 등의 비타민; 올레산, 아라키돈산, 리놀레산 등의 지방산; 콜레스테롤 등의 지질; 염화나트륨, 염화칼륨, 염화칼슘, 황산마그네슘, 인산이수소나트륨 등의 무기 염; 아연, 구리, 셀레늄 등의 미량 원소; N,N-비스(2-하이드록시에틸)-2-아미노에탄설폰산(N,N-bis(2-hydroxyethyl)-2-aminoethanesulfonic acid(BES)), 4-(2-하이드록시에틸)-1-피페라진에탄설폰산(4-(2-hydroxyethyl)-1-piperazineethanesulfonic acid(HEPES)), N-[트리스(하이드록시메틸)메틸]글리신(N-[tris(hydroxymethyl)methyl]glycine(Tricine)) 등의 완충제; 암포테리신 B, 카나마이신, 겐타마이신, 스트렙토마이신, 페니실린 등의 항생 물질; Type I 콜라겐, Type II 콜라겐, 피브로넥틴, 라미닌, 폴리-L-라이신, 폴리-D-라이신 등의 세포 접착 인자 및 세포 외 매트릭스 성분; 인터루킨, 섬유 아세포 증식 인자(FGF), 간세포 증식 인자(HGF), 트랜스포밍 증식 인자(TGF)-α, 트랜스포밍 증식 인자(TGF)-β, 혈관 내피 증식 인자(VEGF), 액티빈 A 등의 사이토카인 및 증식 인자; 덱사메타손, 하이드로코르티손, 에스트라디올, 프로게스테론, 글루카곤, 인슐린 등의 호르몬 등을 들 수 있고, 배양하는 동물 세포의 종류에 따라서 적절한 성분을 선택하여 사용할 수 있다.
동물 세포가 줄기세포 등의 미분화 세포인 경우, 줄기세포 등을 미분화 상태로 유지하기 위한 유지 배지에는, 줄기세포 등의 분화를 억제하는 성분을 첨가할 수 있다.
또한, 줄기세포 등의 분화를 유도하는 분화 유도 배지에는, 줄기세포 등의 분화를 유도 또는 촉진하는 성분을 첨가할 수 있다.
줄기세포 등의 분화를 억제하는 성분으로서는, 예를 들어, 배아 줄기세포의 분화 억제 인자인 백혈병 저해 인자(leukemia inhibitory factor, LIF), 섬유 아세포 증식 인자(FGF), 트랜스포밍 증식 인자(TGF)-β, 신경 줄기세포의 분화를 억제 골 형성 인자(bone morphogenetic protein; BMP)나 Notch 단백질, 배아 줄기세포나 iPS 세포의 분화를 억제하는 폴리콤 복합체 등을 들 수 있다.
줄기세포 등의 분화를 유도 또는 촉진하는 성분으로서는, 예를 들어, 배아 줄기세포를 내배엽계 세포로 유도하는 액티빈 A, 레티노산, iPS 세포의 신경 외배엽으로의 분화를 유도하는 골 형성 인자(BMP) 저해제(노긴(noggin) 등), 트랜스포밍 증식 인자(TGF)-β, iPS 세포의 중배엽으로의 분화를 유도하는 세포외분비 당 단백질(WNT), iPS 세포의 중배엽이나 내배엽으로의 분화를 유도하는 액티빈, 글리코겐 합성 효소 키나제 3(GSK3) 저해제 등을 들 수 있다.
외배엽계 세포, 중배엽계 세포, 내배엽계 세포로 초기 분화시킨 후, 각 장기나 조직의 세포로 분화시킬 때에는, 분화 유도하려고 하는 장기나 조직에 따라서 필요한 증식 인자나 영양 인자 등을 첨가할 수 있고, 예를 들어, 뇌신경 유래 신경 영양 인자(BDNF), 글리아 세포 유래 신경 영양 인자(GDNF), 섬유 아세포 증식 인자(FGF), 골 형성 인자(BMP), 간세포 증식 인자(HGF) 등이 사용된다.
또한, 혈청에는 미지의 인자나 프리온, 바이러스 등이 포함될 가능성이 있기 때문에, 본 발명의 배지는, 배지 성분으로서 혈청을 함유하지 않는 것이 바람직하다. 또한, 본 발명의 배지가, 인간 세포의 배양용 배지로서 조제되는 경우에는, 인간 이외의 동물 유래 성분을 함유하지 않는 것이 바람직하다.
또한, 본 발명에서는, 수용성 폴리머는, 상기한 포유 동물 유래의 정상 세포, 줄기세포 및 전구 세포 등의 동물 세포의 부유 배양용으로서 범용되는 배지에 함유시켜서 본 발명의 배지로 해도 좋다.
포유 동물 세포 유래의 정상 세포의 배양에 사용되는 배지로서는, 둘베코 개변 이글 배지(Dulbecco's Modified Eagle's Medium)(DMEM), 햄 F12 배지(Ham's Nutrient Mixture F12), DMEM/F12 배지, 맥코이 5A 배지(McCoy's 5A medium), 최소 필수 배지(Minimum Essential Medium)(MEM), 이글 최소 필수 배지(Eagle's Minimum Essential Medium)(EMEM), α 개변형 이글 최소 필수 배지(alpha Modified Eagle's Minimum Essential Medium)(αMEM), 로즈웰 파크 기념 연구소(Roswell Park Memorial Institute)(RPMI) 1640 배지, 이스코프 개변 둘베코 배지(Iscove's Modified Dulbecco's Medium)(IMDM), MCDB131 배지, 윌리엄 배지 E(William's Medium E), 피셔 배지(Fischer's Medium) 등을 들 수 있다.
줄기세포의 배양에 사용되는 배지로서는, STEMPRO(등록상표) hESC SFM 배지(라이프 테크놀로지스(Life Technologies)사), mTeSR1 배지(스템셀 테크놀로지즈(STEMCELL Technologies)사), TeSR2 배지(스템셀 테크놀로지즈(STEMCELL Technologies)사), TeSR-E8 배지(스템셀 테크놀로지즈(STEMCELL Technologies)사) Essencial 8 배지(라이프 테크놀로지스(Life Technologies)사), HEScGRO(상표) Serum-Free Medium for hES cells(밀리포어(Millipore)사), PluriSTEM(상표) Human ES/iPS Medium(이엠디 밀리포어(EMD Millipore)사), NutriStem(등록상표) hESC XF 배지(바이올로지컬 인더스트리즈 이스라엘 베이트-헤멕(Biological Industries Israel Beit-Haemek) 주식회사), NutriStem(상표) XF/FF Culture Medium(스템젠트(Stemgent)사), AF NutriStem(등록상표) hESC XF 배지(바이올로지컬 인더스트리즈 이스라엘 베이트-헤멕(Biological Industries Israel Beit-Haemek) 주식회사), S-medium(DS 파마 바이오 메디컬 주식회사), StemFit(등록상표) AK03N 배지(아지노모토 가부시키가이샤), hESF9 배지, hESF-FX 배지, CDM 배지, DEF-CS 500 Xeno-Free 3D Spheroid Culture Medium(셀라르티스(Cellartis)사), StemFlex 배지(써모 피셔 사이언티픽(Thermo Fisher Scientific)사) 등을 들 수 있다.
전구 세포의 배양에 사용되는 배지로서는, HPGM(상표)(캠브렉스사), QBSF-60(퀄리티 바이올로지컬사) 등을 들 수 있다.
또한, 본 발명에서는, 줄기세포 등의 분화 유도 배지에 수용성 폴리머를 첨가해도 좋다.
줄기세포 등의 분화 유도 배지로서는, TeSR-E6 배지(스템셀 테크놀로지즈(STEMCELL Technologies)사), TeSR-E7 배지(스템셀 테크놀로지즈(STEMCELL Technologies)사), Essential 6(써모피셔 사이언티픽(Thermo Fisher Scientific) 사) 등을 들 수 있다.
본 발명의 목적에는, 피더 프리(feeder-free)인 동물 세포 배양용 배지를 사용하는 것이 바람직하고, 또한 무혈청 배지 또는 저알부민 배지를 사용하는 것이 보다 바람직하고, 또한, 인간의 세포의 배양용 배지에 사용하려면, 인간 이외의 동물 유래 성분을 함유하지 않은 것(제노프리(xeno-free) 배지)가 바람직하다.
또한, 본 발명의 효과가 보다 현저하게 얻어질 수 있으므로, 본 발명의 배지는, 무혈청 배지 또는 저알부민 배지로서 인슐린을 함유하는 것인 것이 바람직하다.
또한, 동물 세포의 부유 배양에 사용한다는 관점에서, 본 발명의 배지는, 용액, 분산액 등의 액상 형태로 하는 것이 바람직하다.
본 발명의 배지는, 공지의 조성에 따라서, 상기한 배지 성분으로부터 적절히 선택되는 성분을, 수용성 폴리머와 함께 물 등의 용매에 첨가하여, 용해 또는 분산하여 조제할 수 있다.
또한, 본 발명의 배지는, 각 사·각 기관으로부터 제공받고 있는 상기한 동물 세포 배양용 배지에, 수용성 폴리머를 첨가하여 용해 또는 분산하여 조제할 수 있다.
또한, 본 발명의 배지는, 사용시의 농도보다도 농축된 상태나, 동결 건조된 분말상 상태로 조제하여, 사용시에 물 등의 용매로 희석하거나, 또는 물 등의 용매에 용해하여 사용하는 형태로 할 수도 있다.
본 발명의 배지는, 상기한 바와 같은 멸균 처리를 실시하여 조제되는 것이 바람직하다.
본 발명의 배지를 사용하여 동물 세포를 부유 배양할 때, 교반, 진탕, 환류, 기체 통기 등의 물리적 자극에 의해 생기는 인슐린 등의 배지 성분의 석출을 양호하게 억제할 수 있고, 크기가 제어된 세포괴의 효율적인 형성이 가능하며, 동물 세포의 배양 효율 및 배양 세포의 품질을 향상시킬 수 있다.
본 발명의 배지는, 줄기세포 등의 미분화 세포의 유지 배양용 배지로서, 또한 분화 유도용 배지로서 적합하게 사용할 수 있고, 줄기세포 등의 미분화 세포의 유지 배양 또는 분화 유도시에, 배지 성분의 석출을 억제할 수 있고, 유지 배양시의 미분화 유지율 및 분화 유도시의 분화율 둘 다를 향상시킬 수 있다.
또한, 본 발명은, 동물 세포의 부유 배양 방법(이하, 본 명세서에서 「본 발명의 배양 방법」이라고도 칭함)을 제공한다.
본 발명의 배양 방법은, 수용성 폴리머를 함유하는 동물 세포의 부유 배양용 배지에서 동물 세포를 부유 배양함을 포함한다.
「수용성 폴리머를 함유하는 동물 세포의 부유 배양용 배지」에 대해서는 상기한 바와 같고, 본 발명에 있어서, 동물 세포의 부유 배양용 배지에 함유되는 수용성 폴리머는, 상기한 본 발명의 첨가물로서 조제되어 첨가된 것이라도 좋고, 수용성 폴리머 자체가 직접 첨가된 것이라도 좋다.
또한, 본 발명에서는, 수용성 폴리머는, 배양시에서의 최종 농도로서, 통상 0.1μg/mL 내지 10mg/mL의 농도가 되도록 배지에 첨가되고, 1μg/mL 내지 5mg/mL의 농도가 되도록 배지에 첨가되는 것이 바람직하고, 10μg/mL 내지 5mg/mL의 농도가 되도록 배지에 첨가되는 것이 보다 바람직하고, 10μg/mL 내지 1mg/mL의 농도가 되도록 배지에 첨가되는 것이 더욱 바람직하다.
본 발명의 배양 방법에 있어서, 동물 세포의 부유 배양은 통상의 부유 배양의 방법에 따라서 행할 수 있다. 즉, 배양 스케일에 따라서 적절한 세포 배양용 플레이트, 세포 배양 플라스크, 바이오리액터 등의 배양 기구 또는 배양 장치를 사용하여, 상기한 본 발명의 배지 또는 본 발명의 첨가물을 첨가한 동물 세포의 부유 배양용 배지에 동물 세포를 파종하여, 통상 25℃ 내지 39℃, 바람직하게는 33℃ 내지 39℃에서, 통상 4체적% 내지 10체적%, 바람직하게는 4체적% 내지 6체적%의 이산화탄소 존재 하, 또한 통상 1체적% 내지 25체적%, 바람직하게는 4체적% 내지 20체적%의 산소 존재 하에서, 통상 1일간 내지 30일간, 바람직하게는 2일간 내지 14일간 배양을 행한다. 또한, 2 내지 3일마다 배지 교환을 행한다.
배지 교환은, 원심 분리나 여과에 의해 동물 세포와 배지를 분리한 후, 새로운 배지를 동물 세포에 첨가하면 좋다. 또는, 원심 분리나 여과를 행함으로써 동물 세포를 적절히 농축한 후, 새로운 배지를 상기 농축 세포액에 첨가하면 좋다.
상기 원심 분리시의 중력 가속도(G)는, 통상 50G 내지 1,000G, 바람직하게는 100G 내지 500G이고, 여과에 사용하는 필터의 세공의 크기는, 통상 10μm 내지 200μm이다.
본 발명의 배양 방법은, 교반, 진탕, 환류, 기체 통기 등을 행하여 실시할 수 있다.
교반은, 바이오리액터, 교반 날개 부착 배양조 등을 사용하여 행할 수 있다.
교반은, 통상 10rpm 내지 2,000rpm, 바람직하게는 40rpm 내지 1,000rpm의 교반 속도로 행한다.
진탕은, 진탕기나 진탕 배양기를 사용하여 행할 수 있다.
진탕은, 통상 10rpm 내지 500rpm, 바람직하게는 50rpm 내지 250rpm의 진탕 속도로 행한다.
환류는, 연동 펌프, 튜빙 펌프 등을 사용하여 행할 수 있다. 환류용 튜브로서는, 실리콘, 네오프렌(클로로프렌 고무), 마프렌(폴리프로필렌·에틸렌프로필렌 고무)제 등의 연동 펌프용 튜브, 튜빙 펌프용 튜브 등을 사용한다.
환류는, 통상 10μL/분 내지 1,000mL/분, 바람직하게는 1mL/분 내지 100mL/분의 유속으로 행한다.
기체 통기는, 마이크로 스파저(micro sparger), 필터 스파저(filter sparger) 등 각종 스파저를 사용하여 행할 수 있다.
기체 통기는, 통상 1mL/분 내지 1,000mL/분, 바람직하게는 50mL/분 내지 200mL/분의 통기량으로 행할 수 있다.
크기가 제어된 세포괴를 효율적으로 얻기 위해서는, 동물 세포의 부유 배양은, 교반 또는 진탕을 행하여 실시하는 것이 바람직하다.
배양된 동물 세포는, 원심 분리 또는 필터를 사용한 여과에 의해 회수할 수 있다.
원심 분리는, 50G 내지 1,000G, 바람직하게는 100G 내지 500G에서 1분간 내지 10분간 정도 행한다.
또한, 여과는, 10μm 내지 200μm 정도의 세공을 갖는 필터를 사용하여 행할 수 있다.
배양된 동물 세포는, 스템-셀뱅커(STEM-CELLBANKER)(닛폰 젠야쿠 코교 가부시키가이샤) 등의 동결 보호제를 함유하는 동결용 배지를 사용하여 액체 질소 중에서 보존하는 것이 바람직하다.
본 발명의 배양 방법에 의해, 교반, 진탕, 환류, 기체 통기 등을 행하여 동물 세포의 부유 배양을 실시했을 때, 물리적 자극에 의해 생기는 인슐린 등의 배지 성분의 석출을 양호하게 억제할 수 있고, 크기가 제어된 세포괴를 형성시켜 부유 배양을 행할 수 있다. 그 결과, 동물 세포의 배양 효율 및 배양 세포의 품질을 향상시킬 수 있다.
본 발명의 배양 방법은, 줄기세포 등의 미분화 세포의 유지 배양, 및 분화 유도 중 어느 것에도 적합하게 사용할 수 있고, 줄기세포 등의 미분화 세포의 유지 배양 또는 분화 유도시에 배지 성분의 석출을 억제할 수 있고, 유지 배양시의 미분화 유지율 및 분화 유도시의 분화율 둘 다를 향상시킬 수 있다.
실시예
이하, 본 발명에 대하여, 실시예에 의해 더욱 상세하게 설명한다.
이하의 실시예에 있어서, 하기 줄기세포 배양용 배지와, 하기 수용성 폴리머를 사용하여, 줄기세포로서 미분화 인간 iPS 세포(hiPSC)를 사용하여, 다음과 같이 교반에 의한 부유 배양을 행하였다.
(1) 줄기세포 배양용 배지로서는, Essential 8 배지(써모 피셔 사이언티픽(Thermo Fisher Scientific)사, A1517001) StemFit(등록상표) AK03N 배지(아지노모토 가부시키가이쟈) 및 후술하는 분화 유도 배지를 사용하였다.
(2) 수용성 폴리머로서는, 폴리비닐알코올(PVA)(닛폰 고세 카가쿠코교 가부시키가이샤, EG-03P), 폴록사머(폴리옥시에틸렌(160) 폴리옥시프로필렌(27) 블록 코폴리머)(콜리포어(Kolliphor)(등록상표) P188 BIO)(비에이에스에프(BASF)사), 폴록사머(폴리옥시에틸렌(202) 폴리옥시프로필렌(56) 블록 코폴리머)(콜리포어(Kolliphor)(등록상표) P407)(비에이에스에프(BASF)사), 폴록사머(폴리옥시에틸렌 (20) 폴리옥시프로필렌(20) 블록 코폴리머)(콜리솔브(Kollisolv) P124)(비에이에스에프(BASF)사), 폴리옥시에틸렌(20) 소르비탄 모노라우레이트(콜리포어(Kolliphor) PS 20(비에이에스에프(BASF)사), 폴리옥시에틸렌(20) 소르비탄 모노팔미테이트(콜리포어(Kolliphor) PS 40)(비에이에스에프(BASF)사) 및 폴리옥시에틸렌(20) 소르비탄 모노올레에이트(콜리포어(Kolliphor PS 80)(비에이에스에프(BASF)사)를 사용 하였다.
(3) 교반에 의한 배지 중의 인슐린의 석출의 평가
교반 배양 기재로서, 싱글 유즈(single-use) 바이오리액터 5mL 용량(에이블 가부시키가이샤(ABLE Corporation), S-1467)을 사용하였다. 상기 배양 기재에 배지를 5mL 첨가하여, 37℃, 5체적% 이산화탄소 및 20체적% 산소의 조건 하에 120rpm으로 24시간 교반을 행하였다. 그 후, 배지를 6웰 세포 배양 플레이트에 옮기고, 도립 현미경(「CKX41」, 올림푸스 가부시키가이샤(Olympus Corporation), 배율＝40배)로 관찰하고, 사진 촬영을 하였다.
(4) 미분화 인간 iPS 세포(hiPSC)의 교반에 의한 부유 세포 배양
미분화 인간 iPS 세포(hiPSC)로서는, 1210B2주의 hiPS 세포(Nakagawa, M.et al., Sci. Rep. 4, 3594, 2014 참조)를 사용하였다.
교반에 의한 부유 세포 배양은, 배양 기재로서, 싱글 유즈 바이오리액터 5mL용량(에이블 가부시키가이샤(ABLE Corporation) S-1467)을 사용하여 행하였다.
상기 바이오리액터에 10μM의 Rho 결합 키나제 저해제(Y-27632)(후지 필름 와코 쥰야쿠 가부시키가이샤, 034-24024)를 함유하는 배지 5mL를 첨가하여, 싱글 셀화한 hiPSC를 첨가하여, 37℃, 5체적% 이산화탄소 및 20체적% 산소의 조건 하에 80rpm으로 교반 배양을 행하였다.
2일째 이후에는 배지 교환을 행하였다. 배지 교환은, 각 실시예에 기재된 양의 배지 상청을 뽑아내고, 200G, 5min 원심 분리하여 상청을 제거 후, 동량의 새로운 배지를 첨가하고, 펠릿을 현탁 후 바이오리액터에 첨가하여 행하였다.
또한, 하기의 각 실시예에 있어서, 배양된 줄기세포에서의 세포괴 수와 장경의 측정, 세포수 및 생존율의 측정, 세포의 미분화 유지 비율 및 배자 내배엽 세포로의 분화율의 측정은, 이하와 같이 행하였다.
(1) 세포괴 수와 장경의 측정
세포괴를 포함하는 배지 상청을 24웰 플레이트에 500μL 분취하였다. 세포괴를 진탕하여 분산시킨 후, BZ-X 형광 현미경(가부시키가이샤 키엔스(Keyence))로 웰 전체를 촬영하였다. 촬영한 화상에 대하여 매크로셀 카운트를 행함으로써, 세포괴의 개수와 장경의 평균을 구하였다.
(2) 세포수 및 생존율의 측정
세포괴를 포함하는 배지 상청을 전량 회수하고, 500G, 5min 원심 분리하였다. 상청을 제거 후, 10회 탭핑(tapping)을 행하고, 1mL의 세포 분리/분산 용액(Accumax(밀리포어(Millipore)사, SCR006)을 첨가하여, 세포괴 펠렛을 현탁하였다. 실온에서 5min 인큐베이팅한 후, 피펫팅(pipetting)에 의해 세포괴를 재현탁하였다. 다시 실온에서 5min 인큐베이팅한 후, 피펫팅에 의해 세포괴를 싱글 셀화하였다. 4mL의 배지를 첨가하고, 500G, 5min 원심 분리하였다. 상청을 제거 후, 10회 탭핑을 행함으로써 펠렛을 파쇄하고, 1mL의 Rho 결합 키나제 저해제(Y-27632)를 함유하는 배지를 첨가하여 피펫팅함으로써 세포를 재현탁하였다. 현탁액을 40μm의 셀 스트레이너(cell strainer)(BD Falcon(코닝사), 2-1919-02)를 통과시켜, 추가로 1mL의 Rho 결합 키나제 저해제(Y-27632)를 함유하는 배지에서 셀 스트레이너를 프리워싱(prewash)하였다. 회수한 세포 현탁액을 생사세포 오토애널라이저-Vi-CELL XR(벡크만 코울터 주식회사)로 분석함으로써, 세포수와 생존율의 측정을 행하였다.
회수한 세포 중의 생세포수를 회수한 전체 세포 수로 나누어 세포의 생존율을 구하고, 생세포수를 파종한 세포수로 나누어 세포의 증식률(배)을 구하였다.
(3) 세포의 미분화 유지율의 측정
배양 후 싱글 셀화한 세포를, 세포 고정화/세포 투과화 용액(BD Cytofix/Cytoperm(상표) Kit(비디 바이오사이언스(BD Biosciences)사, 554714))에 의해 고정화하였다. 구체적으로는, 200μL의 Cytofix/Cytoperm을 첨가하고, 얼음 위에서 20분 정치함으로써 hiPSC의 고정을 행하였다.
이어서, 1mL의 BD Perm/Wash buffer(상표)(비디 바이오사이언스(BD Biosciences)사, 554723)를 첨가하여, 5,000rpm, 2min 원심 분리를 행하여 상청을 제거하였다. 다음에, 적당량의 BD Perm/Wash buffer(상표)에 현탁하고, 이중 염색용 샘플, 단염색용 샘플, isotype control용 샘플, 비염색용 샘플로 나누어 각각 원심관에 분주하고, 5,000rpm, 2min 원심 분리를 행하여 상청을 제거하였다.
이중 염색 및 단염색은 1:5(5배) 희석의 Alexa Fluor(등록상표) 488 mouse anti-oct3/4(벡톤 딕킨슨(Becton Dickinson)사, 560253) 및 1:10(10배) 희석의 Alexa Fluor(등록상표) 647 mouse anti-SSEA-4(벡톤 딕킨슨(Becton Dickinson)사, 560796)의 양쪽, 또는 한쪽을 BD Perm/Wash buffer(상표)에 첨가한 용액을 100μL 첨가하여, 실온, 차광 하에 20min 인큐베이션함으로써 행하였다.
Isotype control용 샘플에는 1:20(20배) 희석의 Alexa Fluor(등록상표) 488 Mouse IgG1 κ Isotype Control(벡톤 딕킨슨(Becton Dickinson)사, 557721) 또는 1:20(20배) 희석의 Alexa Fluor(등록상표) 647 Mouse IgG3, κ Isotype Control(벡톤 디킨슨(Becton Dickinson)사, 560803)을 첨가한 BD Perm/Wash buffer(상표)를 100μL 추가하고, 마찬가지로 실온, 차광 하에 20min 인큐베이션하였다.
상기 각 반응 후, 500μL의 BD Perm/Wash buffer(상표)를 첨가하여 5,000rpm, 2min 원심 분리하여 상청을 제거하였다. 각 샘플에 Focusing fluid (써모 피셔 사이언티픽(Thermo Fisher Scientific)사, 4488621)를 1mL 첨가하여, 다시 5,000rpm, 2min 원심 분리를 행하여 200μL의 Focusing fluid(써모 피셔 사이언티픽(Thermo Fisher Scientific)사, 4488621)에 현탁하였다. 조제한 샘플은, Attune NxT Flow Cytometer(써모 피셔 사이언티픽(Thermo Fisher Scientific)사)로 해석을 실시하였다. Alexa Fluor(등록상표) 488은 BL1, Alexa Fluor(등록상표) 647은 RL1로 검출을 행하였다.
세포의 미분화 유지율은, 배양된 세포에서의 Oct3/4/SSEA4 양성률에 의해 나타낼 수 있다.
(4) hiPSC의 배자 내배엽 세포로의 분화율의 측정
배양 후 싱글 셀화한 세포를 5,000rpm, 2min 원심 분리하였다. 세포 펠렛을 100μL의 BD Perm/Wash buffer(상표)(비디 바이오사이언스(BD Biosciences)사, 554723)에 현탁하고, 1μL의 BD Pharmingen(상표) APC Mouse Anti-Human CD184(비 디 바이오사이언스(BD Biosciences)사, 560936) 또는 1μL의 BD Pharmingen(상표) APC Mouse IgG2a, κ Isotype Control(비디 바이오사이언스(BD Biosciences)사, 555576)를 첨가하여, 실온, 차광 하에 20min 인큐베이션함으로써 염색을 행하였다. 염색한 세포는 1,000μL의 FACS buffer로 한 번 세정한 후, 다시 원심 분리하여 펠렛으로 하고, 세포 고정화/세포 투과화 용액(BD Cytofix/Cytoperm(상표) Kit(비디 바이오사이언스(BD Biosciences)사, 554714))에 의해 고정화하였다. 구체적으로는, 200μL의 Cytofix/Cytoperm을 첨가하여, 얼음 위에서 20분 정치함으로써 세포의 고정을 행하였다.
다음에, 1mL의 BD Perm/Wash buffer를 첨가하여, 5,000rpm, 2min 원심 분리를 행하여 상청을 제외하고, 200μL의 BD Perm/Wash buffer(상표)에 현탁하였다. 1μL의 BD Pharmingen(상표) PE Mouse anti-Human Sox17(비디 바이오사이언스(BD Biosciences)사, 561591) 또는 BD Pharmingen(상표) PE Mouse IgG1, κ Isotype Control(비디 바이오사이언스(BD Biosciences)사, 400139)를 첨가하여, 실온, 차광 하에 20min 인큐베이션하여 반응시켰다.
상기 반응 후, 500μL의 BD Perm/Wash buffer(상표)를 첨가하고 5,000rpm, 2min 원심 분리하여 상청을 제거하였다. 각 샘플에 Focusing fluid(써모 피셔 사이언티픽(Thermo Fisher Scientific)사, 4488621)를 1mL 첨가하고, 다시 5,000rpm, 2min 원심 분리를 행하여, 200μL의 Focusing fluid(써모 피셔 사이언티픽(Thermo Fisher Scientific)사, 4488621)에 현탁하였다. 조제한 샘플은, Attune NxT Flow Cytometer(써모 피셔 사이언티픽(Thermo Fisher Scientific)사)로 해석을 실시하였다. PE는 BL1, APC는 RL1로 검출을 행하였다.
세포의 분화율은, 배양된 세포에서의 CXCR4 또는 SOX17 양성률에 의해 나타낼 수 있다.
[실시예 1] 각종 수용성 폴리머의 인슐린 석출에 대한 효과의 검토
인슐린을 함유하는 Essential 8 배지에, 상기한 수용성 폴리머 각 1mg/mL를 첨가하고, 상기한 바와 같이, 교반 배양 기재 중에서 120rpm으로 24시간 교반을 행하였다. 그 후, 배지의 상태를 도립형 현미경으로 관찰하여, 배지 중의 인슐린의 석출의 정도에 의해, 수용성 폴리머의 인슐린 석출 억제 효과를 하기 평가 기준에 의해 평가하였다.
또한, 비교를 위해, 수용성 폴리머를 첨가하지 않고 동일하게 처리하여, 배지 중의 인슐린의 석출의 정도를 평가하였다.
결과를 표 1에 나타내었다.
<평가 기준>
매우 양호함(인슐린의 석출이 완전히 억제되어 있음); ＋＋
양호함(인슐린의 석출이 거의 억제되어 있음); ＋
억제 효과 없음(인슐린의 석출이 보임); －
[표 1]
Figure pct00001
표 1에 나타난 바와 같이, 폴리비닐알코올, 각종 폴록사머 및 각종 폴리옥시에틸렌 소르비탄 모노 지방산 에스테르를 첨가한 경우에는, 교반에 의한 인슐린의 석출은 양호하게 억제되는 것이 확인되었다.
실시예 1의 상기 결과로부터, 폴리비닐알코올 등의 수용성 폴리머를 인슐린 함유 배지에 첨가함으로써, 배지를 교반했을 때에 생기는 인슐린의 석출을 억제할 수 있는 것이 명백해졌다.
[실시예 2] 인슐린 석출 억제 효과에 미치는 폴리비닐알코올 및 폴록사머의 각 첨가 농도의 영향의 검토
인슐린을 함유하는 Essential 8 배지에, 500ng/mL 내지 10mg/mL의 폴리비닐알코올(PVA), 또는 100ng/mL 내지 1mg/mL의 폴록사머(Kolliphor P188 BIO)를 첨가하고, 상기와 같이 5mL의 바이오리액터 중에서 120rpm로 24시간 교반을 행하였다. 24시간 교반 후에 배지를 도립형 현미경으로 관찰하였다.
또한, 비교를 위해, 폴리비닐알코올 및 폴록사머를 첨가하지 않고 동일하게 처리하여, 도립 현미경 하에 사진 촬영을 행하였다.
현미경 하에 촬영한 사진을 도 1에 나타내었다.
도 1에 나타난 바와 같이, 인슐린을 함유하는 Essential 8 배지를 바이오리액터 중에서 교반하면 인슐린의 석출이 확인되었다. 이에 대하여, 각 농도의 폴리비닐알코올(PVA) 및 폴록사머(Kolliphor P188 BIO)를 각각 첨가한 경우에는, 어느 농도에서도 인슐린의 석출이 억제되는 것이 확인되었다.
실시예 2의 상기 결과로부터, 폴리비닐알코올을 500ng/mL 이상, 또한 폴록사머(폴리옥시에틸렌(160) 폴리옥시프로필렌(27) 블록 코폴리머)를 100ng/mL 이상 인슐린 함유 배지에 첨가함으로써, 배지를 교반함으로써 발생하는 인슐린의 석출을 억제할 수 있는 것이 밝혀졌다.
[실시예 3] hiPSC의 증식에 대한 폴록사머(Kolliphor P188 BIO)의 효과의 검토
인슐린을 함유하는 Essential 8 배지에 0.1μg/mL 내지 1mg/mL의 폴록사머 (Kolliphor P188 BIO)를 첨가하고, hiPSC를 4일간 교반 부유 배양하여, 각 농도의 폴록사머의 효과를 평가하였다.
1210B2주의 hiPSC를 5mL의 바이오리액터에 1×106 세포 파종하여, 상기와 같이 80rpm의 교반 속도로 교반 배양을 행하였다. 3일째에 3.5mL의 배지 교환을 행하고, 4일째에 세포괴를 파쇄하여, 세포의 증식률, 생존율 및 미분화 유지율을 구하였다. 결과를 도 2에 나타내었다.
도 2에 나타나는 바와 같이, 각 농도의 폴록사머(Kolliphor P188 BIO)를 첨가한 배지에서 hiPSC의 교반 부유 배양을 행하면, 세포의 증식률, 생존율 및 미분화 유지율이 향상되었다.
실시예 3의 상기 결과로부터, 폴록사머(폴리옥시에틸렌(160) 폴리옥시프로필렌(27) 블록 코폴리머)(Kolliphor P188 BIO)를 0.1μg/mL 내지 1mg/mL의 농도로 배지에 첨가하여 hiPSC의 교반 부유 배양을 행함으로써, 배지 중의 인슐린의 석출이 억제되는 동시에, 세포괴의 성장을 촉진하고, 상태가 좋은 hiPSC를 효율적으로 증식시키는 것이 가능해지는 것이 밝혀졌다.
[실시예 4] hiPSC의 증식에 대한 폴록사머(Kolliphor P407)의 효과의 검토
인슐린을 함유하는 Essential 8 배지에, 1μg/mL 내지 1mg/mL의 폴록사머(Kolliphor P407)를 첨가하고, hiPSC를 5일간 교반 부유 배양하여, 각 농도의 폴록사머의 효과를 평가하였다.
1210B2주의 hiPSC를 5mL의 바이오리액터에 1×106 세포 파종하여, 상기와 같이 80rpm의 교반 속도로 교반 배양을 행하였다. 2, 3일째에 3.5mL의 배지 교환을 행하고, 5일째에 세포괴를 파쇄하여, 세포의 증식률을 구하였다. 결과를 도 3에 나타내었다.
도 3에 나타난 바와 같이, 1μg/mL 내지 1mg/mL의 폴록사머(Kolliphor P407)를 첨가한 배지에서 배양을 행하면, 세포의 증식률이 향상되었다.
실시예 4의 상기 결과로부터, 폴록사머(폴리옥시에틸렌(202) 폴리옥시프로필렌(56) 블록 코폴리머)(Kolliphor P407)를 1μg/mL 내지 1mg/mL의 농도로 배지에 첨가하여 hiPSC의 교반 부유 배양을 행함으로써, 배지 중의 인슐린의 석출이 억제되는 동시에, 세포괴의 성장을 촉진하고, 상태가 좋은 hiPSC를 효율적으로 증식시키는 것이 가능해지는 것이 밝혀졌다.
[실시예 5] hiPSC의 증식에 대한 폴리비닐알코올(PVA)의 효과의 검토
인슐린을 함유하는 Essential 8 배지에 50μg/mL 내지 5mg/mL의 폴리비닐알코올(PVA)을 첨가하고, hiPSC를 4일간 교반 배양하여, 각 농도의 폴리비닐알코올의 효과를 평가하였다.
1210B2주의 hiPSC를 5mL의 바이오리액터에 1×106 세포 파종하여, 상기와 같이 80rpm의 교반 속도로 교반 부유 배양을 행하였다. 배양 2일째에 3.5mL의 배지 교환을 행하고, 4일째에 세포괴를 파쇄하여, 세포의 증식률을 구하였다. 결과를 도 4에 나타내었다.
도 4에 나타나는 바와 같이, 50μg/mL 내지 5mg/mL의 폴리비닐알코올(PVA)을 첨가한 배지에서 배양을 행하면, 세포의 증식률이 향상되었다.
실시예 5의 상기 결과로부터, 폴리비닐알코올(PVA)을 50μg/mL 내지 5mg/mL의 농도로 배지에 첨가하여 hiPSC의 교반 부유 배양을 행함으로써, 배지 중의 인슐린의 석출이 억제되는 동시에, 세포괴의 성장을 촉진하고, 상태가 좋은 hiPSC를 효율적으로 증식시키는 것이 가능해지는 것이 밝혀졌다.
[실시예 6] hiPSC의 증식에 대한 폴리옥시에틸렌 소르비탄 모노라우레이트(Kolliphor PS 20)의 효과의 검토
인슐린을 함유하는 Essential 8 배지에 100ng/mL 내지 10μg/mL의 폴리옥시에틸렌 소르비탄 모노라우레이트(Kolliphor PS 20)를 첨가하여, hiPSC를 4일간 교반 배양하여, 각 농도의 폴리옥시에틸렌 소르비탄 모노라우레이트의 효과를 평가하였다.
1210B2주의 hiPSC를 5mL의 바이오리액터에 1×106 세포 파종하여, 상기와 같이 80rpm의 교반 속도로 교반 부유 배양을 행하였다. 2일째에 3.5mL의 배지 교환을 행하고, 3일째에 세포괴를 파쇄하여, 세포의 증식률을 구하였다. 결과를 도 5에 나타내었다.
도 5에 나타나는 바와 같이, 100ng/mL 내지 10μg/mL의 폴리옥시에틸렌 소르비탄 모노라우레이트(Kolliphor PS 20)를 첨가한 배지에서 배양을 행하면, 세포의 증식률이 향상되었다.
실시예 6의 상기 결과로부터, 폴리옥시에틸렌 소르비탄 모노라우레이트(Kolliphor PS 20)를 100ng/mL 내지 10μg/mL의 농도로 배지에 첨가하여 hiPSC의 교반 배양을 행함으로써, 배지 중의 인슐린의 석출이 억제되는 동시에, 세포괴의 성장을 촉진하여, 상태가 좋은 hiPSC를 효율적으로 증식시키는 것이 가능해지는 것이 밝혀졌다.
[실시예 7] 교반 날개를 사용한 교반에 의한 인슐린의 석출에 대한 폴록사머의 효과의 검토
교반 배양 기재로서, 액량 2L의 동물 세포 배양조(하부 마그네트 교반형)(에이블 주식회사(ABLE Corporation)) 및 스테인리스강(SUS316L)제 교반 날개를 사용하여, 교반에 의한 인슐린의 석출에 대한 폴록사머의 효과를 평가하였다.
상기 동물 세포 배양조에, 인슐린을 함유하는 Essential 8 배지 500mL 및 1mg/mL의 폴록사머(Kolliphor P188 BIO)를 첨가하여, 37℃에서 150rpm으로 8시간 교반을 행하였다. 그 후, 배지를 6웰 세포 배양 플레이트에 옮기고, 도립 현미경( 「CKX53」, 올림푸스 가부시키가이샤(Olympus Corporation))으로 관찰하여(배율＝100배) 사진 촬영을 행하였다.
또한, 비교를 위해, 폴록사머를 첨가하지 않고 동일하게 처리하여, 도립 현미경으로 사진 촬영을 행하였다.
현미경 하에 촬영한 사진을 도 6에 나타내었다.
도 6에 나타난 바와 같이, 배지의 교반에 의해 인슐린이 석출되는 것이 확인되었는데, 폴록사머(Kolliphor P188 BIO)의 첨가에 의해 인슐린의 석출이 억제되었다.
실시예 7의 상기 결과로부터, 폴록사머(폴리옥시에틸렌(160) 폴리옥시프로필렌(27) 블록 코폴리머)를 1mg/mL의 농도로, 인슐린을 함유하는 배지에 첨가함으로써, 교반 날개를 사용하여 배지를 교반하는 경우에도, 이로 인해 발생하는 인슐린의 석출을 억제할 수 있는 것이 밝혀졌다.
[실시예 8] 환류에 의한 인슐린의 석출에 대한 수용성 폴리머의 효과의 검토
배지 환류용 기재로서, 연동 펌프(「페리스타 바이오미니 펌프 AC-2120」(아토 가부시키가이샤(ATTO Corporation))를 사용하여, 환류에 의한 인슐린의 석출에 대한 수용성 폴리머의 영향을 평가하였다. 환류용 튜브로서는, 내경＝3mm, 외경＝5mm의 실리콘 튜브를 사용하였다.
50mL 용량의 플라스틱 튜브에 인슐린을 함유하는 Essential 8 배지 45mL, 및 폴록사머(Kolliphor P188 BIO) 및 폴리비닐알코올(PVA) 각 1mg/mL를 각각 첨가하고, 상기 연동 펌프에 의해, 실온에서 5mL/분의 유속으로 24시간 환류를 행하였다. 그 후, 배지를 6웰 세포 배양 플레이트에 옮겨, 도립 현미경(「CKX41」올림푸스 가부시키가이샤(Olympus Corporation))으로 관찰하여(배율＝40배 및 100배) 사진 촬영을 행하였다.
또한, 비교를 위해, 폴록사머 및 폴리비닐알코올을 첨가하지 않고 동일하게 처리하여, 도립 현미경 하에 사진 촬영을 행하였다.
현미경 하에 촬영한 사진을 도 7에 나타내었다.
도 7에 나타나는 바와 같이, 배지를 환류함으로써 인슐린의 석출이 발생하지만, 폴록사머(Kolliphor P188 BIO) 또는 폴리비닐알코올(PVA)을 배지에 첨가함으로써 인슐린의 석출이 억제되었다.
실시예 8의 상기 결과로부터, 폴록사머(폴리옥시에틸렌(160) 폴리옥시프로필렌(27) 블록 코폴리머) 및 폴리비닐알코올을 각각 1mg/mL의 농도로, 인슐린을 함유하는 배지에 첨가함으로써, 배지를 환류할 때에 발생하는 인슐린의 석출을 억제할 수 있는 것이 밝혀졌다.
[실시예 9] 줄기세포의 분화 유도 배지에서의 인슐린 석출에 대한 수용성 폴리머의 효과의 검토
인슐린을 함유하는 분화 유도 배지(4(w/v)%의 TeSR-E6 배지 중의 서플리먼트(스템셀 테크놀로지즈(STEMCELL Technologies)사)를 첨가한 RPMI1640 배지)에, 1mg/mL의 폴리비닐알코올(PVA), 1mg/mL의 폴록사머(Kolliphor P188 BIO)를 첨가하고, 상기와 같이 5mL의 바이오리액터 중에서 80rpm으로 48시간 교반을 행하였다. 그 후, 배지를 도립형 현미경 CKX41으로 관찰하였다.
또한, 비교를 위해, 폴리비닐알코올 및 폴록사머를 첨가하지 않고 동일하게 처리하여 도립 현미경 하에 관찰하였다.
상기에서, 현미경 하에 촬영한 사진을 도 8에 나타내었다.
도 8에 나타나는 바와 같이, 인슐린을 함유하는 분화 유도 배지를 바이오리액터 중에서 교반하면, 인슐린의 석출이 확인되었다. 이에 반하여, 폴리비닐알코올(PVA) 및 폴록사머(Kolliphor P188 BIO) 각 1mg/mL를 첨가한 경우에는, 모두 인슐린의 석출이 억제되었다.
실시예 9의 상기 결과로부터, 폴록사머(폴리옥시에틸렌(160) 폴리옥시프로필렌(27) 블록 코폴리머) 및 폴리비닐알코올을 각각 1mg/mL의 농도로, 인슐린을 함유하는 분화 유도 배지에 첨가함으로써, 배지를 교반함으로써 발생하는 인슐린의 석출을 억제할 수 있는 것이 확인되었다.
[실시예 10] hiPSC의 배자 내배엽 세포로의 분화 유도에 대한 폴록사머(Kolliphor P188 BIO)의 효과의 검토
30mL 용량의 바이오리액터에, StemFit(등록상표) AK03N 배지(아지노모토 가부시키가이샤)를 30mL 첨가하고, 1210B2주의 hiPSC를 6×106 세포 파종하고, 120rpm으로 6일간 교반 부유 배양을 행하여, hiPSC의 세포괴를 형성시켰다. 5mL분의 세포괴를 5mL 용량의 바이오리액터로 옮겨, 0.1mg/mL의 폴록사머(Kolliphor P188 BIO)를 첨가한 분화 유도 배지(4(w/v)%의 TeSR-E6 배지 중의 서플리먼트(스템셀 테크놀로지즈(STEMCELL Technologies)사), 2μM의 글리코겐 생성 키나제 3 저해제(CHIR99021), 100ng/mL의 액티빈 A(Activin A)을 첨가한 RPMI1640 배지) 중, 80rpm으로 5일간 교반 부유 배양을 행하여, 배자 내배엽 세포로의 분화를 유도하였다.
또한, 비교를 위해, 폴록사머를 첨가하지 않고 동일하게 교반 부유 배양을 행하여, 배자 내배엽 세포로의 분화를 유도하였다.
분화 유도 후, 세포괴를 파쇄하고, 상기와 같이 생세포수 및 세포 생존율을 측정하였다. 또한, 상기한 플로우 사이토메트리 해석에 의해, 배자 내배엽 세포의 마커인 CXCR4 및 SOX17 각각에 대하여 양성 세포의 비율을 정량하였다.
결과를 도 9에 나타내었다.
도 9에 나타나는 바와 같이, 폴록사머(Kolliphor P188 BIO)를 첨가한 분화 유도 배지에서 hiPSC를 교반 부유 배양하여 분화 유도를 행하면, 생세포수 및 세포 생존율의 향상이 확인되었다.
또한, 배자 내배엽 세포 마커인 CXCR4 및 SOX17 각각에 대하여, 양성인 세포의 비율이 증가하였다.
실시예 10의 상기 결과로부터, 폴록사머(폴리옥시에틸렌(160) 폴리옥시프로필렌(27) 블록 코폴리머)를 함유하는 분화 유도 배지에서 hiPSC를 교반 부유 배양함으로써, 세포의 증식률 및 생존율이 향상되고, 배자 내배엽 세포로의 분화도 촉진되는 것이 확인되었다.
이상, 상기한 바와 같이, 본 발명에 의해, 인슐린 등을 함유하는 동물 세포의 부유 배양용 배지에 첨가함으로써, 교반, 진탕, 환류, 기체 통기 등의 물리적 자극에 의한 인슐린 등의 배지 성분의 석출을 양호하게 억제할 수 있는 첨가물을 제공할 수 있다.
또한, 본 발명에 의해, 인슐린 등을 함유하는 동물 세포의 부유 배양용 배지로서, 교반, 진탕, 환류, 기체 통기 등의 물리적 자극이 부가되어도, 인슐린 등의 배지 성분의 석출이 양호하게 억제된 동물 세포의 부유 배양용 배지를 제공할 수 있고, 인슐린 등을 함유하는 동물 세포의 부유 배양용 배지를 사용하여, 교반, 진탕, 환류, 기체 통기 등을 행하면서 동물 세포의 부유 배양을 행할 수 있다.
그 결과, 본 발명에 의해, 크기가 제어된 세포괴를 형성시켜 동물 세포의 부유 배양을 행할 수 있고, 동물 세포의 배양 효율 및 배양 세포의 품질을 향상시킬 수 있다.
특히, 줄기세포 등의 미분화 세포에 대하여, 유지 배지에서의 유지 배양시 및 분화 유도 배지에서의 분화 유도시 중 어느 시기에서도 배지 성분의 석출이 억제되고, 유지 배양시의 미분화 유지율 및 분화 유도시의 분화율 둘 다를 향상시킬 수 있다.
본원은, 일본에서 출원된 특허출원 제2018-141909호를 기초로 하고 있고, 이의 내용은 본 명세서에 전부 포함되는 것이다.

Claims (23)

  1. 수용성 폴리머를 함유하는, 동물 세포의 부유 배양용 첨가물.
  2. 제1항에 있어서, 수용성 폴리머가 계면활성을 갖는 비이온성 수용성 폴리머인, 첨가물.
  3. 제2항에 있어서, 계면활성을 갖는 비이온성 수용성 폴리머가, 폴리비닐알코올, 폴리옥시에틸렌 폴리옥시프로필렌 블록 코폴리머 및 폴리옥시에틸렌 소르비탄 모노 지방산 에스테르로 이루어지는 그룹으로부터 선택되는 1종 또는 2종 이상인, 첨가물.
  4. 제1항 내지 제3항 중 어느 한 항에 있어서, 동물 세포가 줄기세포인, 첨가물.
  5. 제4항에 있어서, 줄기세포가, 성체 줄기세포, 배아 줄기세포 및 인공 다능성 줄기세포로 이루어지는 그룹으로부터 선택되는 1종 또는 2종 이상인, 첨가물.
  6. 제1항 내지 제5항 중 어느 한 항에 있어서, 배지 성분의 석출을 억제하기 위한 첨가물인, 첨가물.
  7. 제6항에 있어서, 배지 성분이 인슐린인, 첨가물.
  8. 수용성 폴리머를 함유하는, 동물 세포의 부유 배양용 배지.
  9. 제8항에 있어서, 수용성 폴리머가 계면활성을 갖는 비이온성 수용성 폴리머인, 배지.
  10. 제9항에 있어서, 계면활성을 갖는 비이온성 수용성 폴리머가, 폴리비닐알코올, 폴리옥시에틸렌 폴리옥시프로필렌 블록 코폴리머 및 폴리옥시에틸렌 소르비탄 모노 지방산 에스테르로 이루어지는 그룹으로부터 선택되는 1종 또는 2종 이상인, 배지.
  11. 제8항 내지 제10항 중 어느 한 항에 있어서, 줄기세포의 부유 배양용인, 배지.
  12. 제11항에 있어서, 줄기세포가, 성체 줄기세포, 배아 줄기세포 및 인공 다능성 줄기세포로 이루어지는 그룹으로부터 선택되는 1종 또는 2종 이상인, 배지.
  13. 제8항 내지 제12항 중 어느 한 항에 있어서, 배지 성분의 석출이 억제되어 있는, 배지.
  14. 제13항에 있어서, 배지 성분이 인슐린인, 배지.
  15. 수용성 폴리머를 함유하는 배지에서 동물 세포를 부유 배양함을 포함하는, 동물 세포의 부유 배양 방법.
  16. 제15항에 있어서, 수용성 폴리머가 계면활성을 갖는 비이온성 수용성 폴리머인, 배양 방법.
  17. 제16항에 있어서, 계면활성을 갖는 비이온성 수용성 폴리머가, 폴리비닐알코올, 폴리옥시에틸렌 폴리옥시프로필렌 블록 코폴리머 및 폴리옥시에틸렌 소르비탄 모노 지방산 에스테르로 이루어지는 그룹으로부터 선택되는 1종 또는 2종 이상인, 배양 방법.
  18. 제15항 내지 제17항 중 어느 한 항에 있어서, 동물 세포가 줄기세포인, 배양 방법.
  19. 제18항에 있어서, 줄기세포가, 성체 줄기세포, 배아 줄기세포 및 인공 다능성 줄기세포로 이루어지는 그룹으로부터 선택되는 1종 또는 2종 이상인, 배양 방법.
  20. 제15항 내지 제19항 중 어느 한 항에 있어서, 교반, 진탕, 환류 또는 기체 통기를 행하여 부유 배양하는, 배양 방법.
  21. 제15항 내지 제20항 중 어느 한 항에 있어서, 배지 성분의 석출이 억제된 배지에서 동물 세포를 부유 배양하는, 배양 방법.
  22. 제21항에 있어서, 배지 성분이 인슐린인, 배양 방법.
  23. 제15항 내지 제22항 중 어느 한 항에 있어서, 세포괴를 형성시켜 동물 세포를 부유 배양하는, 배양 방법.
KR1020217005944A 2018-07-27 2019-07-26 동물 세포의 부유 배양용 첨가물, 부유 배양용 배지 및 부유 배양 방법 KR20210041003A (ko)

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