CN109628377A - 一种小鼠原代肝细胞灌注式分离及离体培养方法 - Google Patents

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Abstract

本发明公开了一种小鼠原代肝细胞灌注式分离及离体培养方法，采用原位活体灌流法进行小鼠原代肝细胞的灌注式分离，可获得高产的单细胞悬液，从而为原代肝细胞的体外长时间离体培养提供基础。采用的刺激培养液中含有小鼠集落刺激因子CSF、小鼠IL‑2、小鼠IL‑6及小鼠重组肝细胞生长因子r‑mHGF等细胞因子，通过合理配比可刺激分离得到的原代肝细胞离体增殖，在72h时可达到初始添加的原代肝细胞数量的2.25倍。本发明在离体条件下至少可以保持1‑2周的细胞增殖活性，解决了肝原代细胞不能长期体外培养的难题，因此，可用于逆转录病毒的感染，为在体外原代细胞中过表达目标基因或敲除目标基因提供基础，大大的扩展了肝原代细胞的运用领域。

Description

一种小鼠原代肝细胞灌注式分离及离体培养方法
技术领域
本发明属于生物医学技术领域，具体涉及一种小鼠原代肝细胞灌注式分离及离体培养方法。
背景技术
肝脏相关疾病及其代谢的研究，都需要从肝组织获得正常的原代肝细胞，并能够实现离体培养。利用原代肝细胞进行体外实验，相较于其它方法的体内外实验方法而言，有着自身显著的优点，因为经过原代培养的肝细胞不受到体内神经内分泌系统的复杂影响，并且还能够保持肝细胞的特异性功能。
肝细胞的分离最初采用的是离体灌流法。到1975年，Seglen采用原位两步胶原酶灌流法成功地分离得到高活率的大鼠肝细胞。原位灌流相较于之前的肝脏离体灌流，原位灌流由于小鼠的肝脏和心脏尚有一定血液循环能力，使得初步冲洗灌流液灌流效果好，不易凝血和出现灌流死角。但是因为肝细胞之间是通过紧密连接结合在一起，不能通过剪碎、研磨、过滤网等常规方法使其成为单细胞悬液，且用胶原蛋白酶酶解肝组织块也很难形成高产的单细胞悬液。
此外，即使获得原代肝细胞，也缺少有效地方法在体外环境离体培养肝原代细胞。这两个技术瓶颈严重阻碍了肝脏相关疾病的研究工作。
发明内容
针对以上存在的技术问题，本发明的目的是一种简单易行的肝脏组织原代细胞分离和培养方法，以供相关科研推广使用。
本发明的技术方案为：一种小鼠原代肝细胞灌注式分离及离体培养方法，包括以下步骤：
步骤1：利用工作液Ⅰ充满整个灌流系统以除去气泡，再将灌流系统的管道置于工作液Ⅱ中，等待灌流；
步骤2：按照300μl/只的量向小鼠腹腔注射5％水合氯醛进行麻醉；
步骤3：待小鼠麻醉后，剪开腹部呈V型，完整露出肝脏，方便灌流及观察；
步骤4：从下腔静脉进针，之后剪断门静脉，不剪断会导致肝脏爆裂，利用步骤A的灌流系统依次使用工作液Ⅰ和工作液Ⅱ开始灌流开始灌流，速度控制在1.2-1.5ml/min，时间为20-30min，直至肝脏会慢慢变亮变脆；
步骤5：摘取小鼠胆囊弃去，再取出经步骤4灌流后的肝脏置于培养皿中，采用细菌培养皿，可防止肝原细胞贴壁；
步骤6：于所述培养皿中加入2mL DMEM，压碎肝脏组织，滤网过滤，得到过滤液；
步骤7：将所述过滤液以600rpm离心5min，弃上清液，加入20mL DMEM，重悬，之后加入工作液Ⅲ，再进行多次离心重悬后计数；
步骤8：在含有刺激培养液的100mm培养皿中加入10ml原代肝细胞原液进行重悬接种，使其浓度少于3×107个/100mm培养皿，在37℃，5％CO2孵箱中孵育24小时以上。
进一步地，步骤1中的工作液Ⅰ的配方为：50ml的1×EBSS，以及体积占比为1％的50mM EGTA，Ph为7.3-7.4，使用前37℃预热。
进一步地，步骤1中的工作液Ⅱ的配方为：在60mL的1×HBSS中加入300mg/mL的胶原蛋白酶Ⅱ和40mg/mL的胰蛋白酶抑制剂各60μl。
进一步地，步骤6中所述压碎肝脏组织的方式为采用注射器柄上下直线往复挤压至肝脏组织破碎，压碎后采用DMEM冲洗注射器柄洗下粘附的细胞。不能使用来回研磨的方式压碎细胞，容易造成细胞破碎。
进一步地，步骤6中所述滤网的孔径大小为70μm，过滤前用DMEM先润湿滤网，且用移液器轻轻吹洗几次防止细胞贴壁，再进行过滤。
进一步地，步骤7中所述工作液Ⅲ由18mL Percoll和2mL 10×HBSS组成。
进一步地，步骤7中多次离心重悬的具体操作为：第一次，离心，600rpm，10min，弃上清，加入10mL DMEM，重悬；第二次，离心，600rpm，2min，弃上清，加入10mL DMEM，重悬；第三次，离心，600rpm，2min，弃上清，加入10mL DMEM，重悬之后计数。
进一步地，步骤8中所述刺激培养液的组成为：8.02ml DMEM；1.5ml FBS；100μl，100×青/链霉素；100μl，100×L-谷氨酰胺；10μl，2mg/ml，1000×环丙沙星；50μl，10g/ml，200×小鼠集落刺激因子CSF；10μl，10μg/ml，1000×小鼠IL-2；10μl，10μg/ml，1000×小鼠IL-6；10μl，10g/ml，1000×小鼠重组肝细胞生长因子r-mHGF。
进一步地，所述DMEM中加入有体积比为1％的双抗，使用前37℃预热。
与现有技术相比，本发明的有益效果为：
(1)本发明采用原位活体灌流法进行小鼠原代肝细胞的灌注式分离，灌流效果好，不易凝血和出现灌流死角，可获得高产的单细胞悬液，从而为原代肝细胞的体外长时间离体培养提供基础。
(2)本发明在离体培养中采用的刺激培养液中含有小鼠集落刺激因子CSF、小鼠IL-2、小鼠IL-6及小鼠重组肝细胞生长因子r-mHGF等细胞因子，通过合理配比可实现分离得到的原代肝细胞高速增殖，在72h时可达到初始添加的原代肝细胞数量的2.25倍。
(3)本发明的小鼠原代肝细胞的分离及离体培养方法，在离体条件下至少可以保持1-2周的细胞增殖活性，解决了肝原代细胞不能长期体外培养的难题，因此，可用于逆转录病毒的感染，还可以用于过表达目标基因或敲除目标基因，大大的扩展了肝原代细胞的运用领域。
附图说明
图1是本发明肝原代细胞离体培养增殖实验的MTT法绘制生长曲线对比图；
图2A为本发明离体肝原代细胞增殖活性实验中对照组逆转录病毒转染前的显微图像；
图2B为本发明离体肝原代细胞增殖活性实验中实验组逆转录病毒转染前的显微图像；
图2C为本发明离体肝原代细胞增殖活性实验中对照组通过逆转录病毒转染感染传统培养的原代肝细胞48h后的倒置荧光显微图像；
图2D为本发明离体肝原代细胞增殖活性实验中实验组通过逆转录病毒转染感染传统培养的原代肝细胞48h后的倒置荧光显微图像。
具体实施方式
本发明结合具体实施例对本发明做进一步说明，但本发明的实施并不仅限于此。
下述实施例如无特殊说明所用方法均为常规方法。
(一)小鼠肝脏组织原代细胞灌注式分离
步骤1：采用医院输液器自制灌流器，利用50mL工作液Ⅰ充满整个灌流系统以除去气泡，再将灌流系统的管道置于工作液Ⅱ中，等待灌流；其中，工作液Ⅰ的配方为：50ml的1×EBSS，以及体积占比为1％的50mM EGTA，Ph为7.3-7.4，使用前37℃预热。工作液Ⅱ的配方为：在60mL的1×HBSS中加入300mg/mL的胶原蛋白酶Ⅱ和40mg/mL的胰蛋白酶抑制剂各60μl。
步骤2：按照300μl/只的量向小鼠腹腔注射5％水合氯醛进行麻醉；
步骤3：待小鼠麻醉后，剪开腹部呈V型，完整露出肝脏，方便灌流及观察；
步骤4：从下腔静脉进针，之后剪断门静脉，不剪断会导致肝脏爆裂，利用步骤A的灌流系统依次使用工作液Ⅰ和工作液Ⅱ开始灌流，速度控制在1.2-1.5ml/min，时间为20-30min，直至肝脏会慢慢变亮变脆；
步骤5：摘取小鼠胆囊弃去，再取出经步骤4灌流后的肝脏置于培养皿中，采用细菌培养皿，可防止肝原细胞贴壁；
步骤6：于所述培养皿中加入2mL DMEM，采用注射器柄上下直线往复挤压至肝脏组织破碎，采用DMEM冲洗注射器柄洗下粘附的细胞，不能使用来回研磨的方式压碎细胞，容易造成细胞破碎。然后使用孔径大小为70μm的滤网过滤，过滤前用DMEM先润湿滤网，且用移液器轻轻吹洗几次防止细胞贴壁，再进行过滤，得到过滤液；其中DMEM中加入有体积比为1％的双抗，使用前37℃预热。
步骤7：将所述过滤液以600rpm离心5min，弃上清液，加入20mL DMEM，重悬，之后加入工作液Ⅲ，再经过离心，600rpm，10min，弃上清，加入10mL DMEM，重悬；离心，600rpm，2min，弃上清，加入10mL DMEM，重悬；离心，600rpm，2min，弃上清，加入10mL DMEM，重悬之后计数。其中，工作液Ⅲ由18mL Percoll和2mL 10×HBSS组成。
(二)小鼠肝原代细胞体外培养
在含有刺激培养液的100mm培养皿中加入10ml原代肝细胞原液进行重悬接种，使其浓度少于3×107个/100mm培养皿，在37℃，5％CO2孵箱中孵育24小时以上。所述刺激培养液的组成为：8.02ml DMEM；1.5ml FBS；100μl，100×青/链霉素；100μl，100×L-谷氨酰胺；10μl，2mg/ml，1000×环丙沙星；50μl，10g/ml，200×小鼠集落刺激因子CSF；10μl，10μg/ml，1000×小鼠IL-2；10μl，10μg/ml，1000×小鼠IL-6；10μl，10g/ml，1000×小鼠重组肝细胞生长因子r-mHGF。
(三)肝原代细胞离体培养增殖实验(MMT法绘制生长曲线)：
对照组的培养基液组成为：8.02ml DMEM；1.5ml FBS；100μl，100×青/链霉素；100μl，100×L-谷氨酰胺；10μl，2mg/ml，1000×环丙沙星。
实验组的培养基液采用本实施例中的刺激培养液：8.02ml DMEM；1.5ml FBS；100μl，100×青/链霉素；100μl，100×L-谷氨酰胺；10μl，2mg/ml，1000×环丙沙星；50μl，10g/ml，200×小鼠集落刺激因子CSF；10μl，10μg/ml，1000×小鼠IL-2；10μl，10μg/ml，1000×小鼠IL-6；10μl，10g/ml，1000×小鼠重组肝细胞生长因子r-mHGF。
其余条件均相同，将分离得到的原代肝细胞按照2×105个/孔铺板到96孔板中，每组3个复孔，分别于12h，24h，36h，48h，72h加入MTT试剂终止细胞增殖，利用多功能酶标仪读数，并绘制时间梯度曲线，见图1。其中，对照组与实验组的离体培养增殖实验结果如表1所示：
表1对照组与实验组的离体培养增殖实验结果
通过表1及图1可知，对照组的培养基液在48h时达到0.88倍的增殖峰值，随后开始衰减；而本实验组中培养基液则在48h时为1.83倍的增殖量，并还呈现继续增殖的趋势，在72h时达到了2.25倍的增殖量。由此可见，通过添加细胞因子(小鼠集落刺激因子CSF、小鼠IL-2、小鼠IL-6、小鼠重组肝细胞生长因子r-mHGF可刺激细胞在体外增殖。
(三)离体肝原代细胞增殖活性实验
按照本发明的原代肝细胞分离方法分离出小鼠的原代肝细胞，并均分为对照组和实验组，其中对照组采用传统培养方法进行体外增殖48h，实验组采用本发明含细胞因子的刺激培养液进行体外培养48h，然后使用逆转录病毒转染分别对照组和实验组的增殖后的原代肝细胞48h，并通过倒置荧光显微镜观察逆转录病毒转染原代肝细胞的效率，其中图2A和图2B分别为对照组和实验组逆转录病毒转染前的显微图像，图2C和图2D分别为对照组和实验组通过逆转录病毒转染感染传统培养的原代肝细胞48h后的倒置荧光显微图像，可以看出用同样的病毒去感染不同培养条件的原代肝细胞，能偶发现用细胞因子刺激培养的原代肝细胞获得了更高的转染效率，证明刺激培养的细胞具有更高的活性和增殖效率。
上述实施例的说明只是用于理解本发明的方法及其核心思想。应当指出，对于本领域的普通技术人员来说，在不脱离本发明原理的前提下，还可以对本发明进行若干改进和修饰，这些改进和修饰也将落入本发明权利要求的保护范围内。

Claims (8)

1.一种小鼠原代肝细胞灌注式分离及离体培养方法，其特征在于，包括以下步骤：
步骤1：利用工作液Ⅰ充满整个灌流系统以除去气泡，再将灌流系统的管道置于工作液Ⅱ中，等待灌流；
步骤2：按照300μl/只的量向小鼠腹腔注射5％水合氯醛进行麻醉；
步骤3：待小鼠麻醉后，剪开腹部呈V型，完整露出肝脏，方便灌流及观察；
步骤4：从下腔静脉进针，之后剪断门静脉，利用步骤A的灌流系统依次使用工作液Ⅰ和工作液Ⅱ开始灌流开始灌流，速度控制在1.2-1.5ml/min，时间为20-30min；
步骤5：摘取小鼠胆囊弃去，再取出经步骤4灌流后的肝脏置于培养皿中；
步骤6：于所述培养皿中加入2mL DMEM，压碎肝脏组织，滤网过滤，得到过滤液；
步骤7：将所述过滤液以600rpm离心5min，弃上清液，加入20mL DMEM，重悬，之后加入工作液Ⅲ，再进行多次离心重悬后计数；
步骤8：在含有刺激培养液的100mm培养皿中加入10ml原代肝细胞原液进行重悬接种，使其浓度少于3×107个/100mm培养皿，在37℃，5％CO2孵箱中孵育24小时以上。
2.如权利要求1所述的一种小鼠原代肝细胞灌注式分离及离体培养方法，其特征在于，步骤1中的工作液Ⅰ的配方为：50ml的1×EBSS，以及体积占比为1％的50mM EGTA，Ph为7.3-7.4，使用前37℃预热。
3.如权利要求1所述的一种小鼠原代肝细胞灌注式分离及离体培养方法，其特征在于，步骤1中的工作液Ⅱ的配方为：在60mL的1×HBSS中加入300mg/mL的胶原蛋白酶Ⅱ和40mg/mL的胰蛋白酶抑制剂各60μl。
4.如权利要求1所述的一种小鼠原代肝细胞灌注式分离及离体培养方法，其特征在于，步骤6中所述滤网的孔径大小为70μm，过滤前用DMEM先润湿滤网，且用移液器轻轻吹洗几次防止细胞贴壁，再进行过滤。
5.如权利要求1所述的一种小鼠原代肝细胞灌注式分离及离体培养方法，其特征在于，步骤7中所述工作液Ⅲ由18mL Percoll和2mL 10×HBSS组成。
6.如权利要求1所述的一种小鼠原代肝细胞灌注式分离及离体培养方法，其特征在于，步骤7中多次离心重悬的具体操作为：第一次，离心，600rpm，10min，弃上清，加入10mLDMEM，重悬；第二次，离心，600rpm，2min，弃上清，加入10mL DMEM，重悬；第三次，离心，600rpm，2min，弃上清，加入10mL DMEM，重悬之后计数。
7.如权利要求1所述的一种小鼠原代肝细胞灌注式分离及离体培养方法，其特征在于，所述刺激培养液的组成为：8.02ml DMEM；1.5ml FBS；100μl，100×青/链霉素；100μl，100×L-谷氨酰胺；10μl，2mg/ml，1000×环丙沙星；50μl，10g/ml，200×小鼠集落刺激因子CSF；10μl，10μg/ml，1000×小鼠IL-2；10μl，10μg/ml，1000×小鼠IL-6；10μl，10g/ml，1000×小鼠重组肝细胞生长因子r-mHGF。
8.如权利要求1或5或7中所述的一种小鼠原代肝细胞灌注式分离及离体培养方法，其特征在于，所述DMEM中加入有体积比为1％的双抗，使用前37℃预热。
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