CN112251398B - 一种原代肝实质细胞的分离提取方法及其应用 - Google Patents

Abstract

本发明涉及细胞分离技术领域，具体公开了一种原代肝实质细胞的分离提取方法及其应用。本发明的方法为将灌注液Ⅰ和灌注液ⅠⅠ注射在肝组织块中，以消化分离肝实质细胞获得细胞悬液，之后，将所述细胞悬液经过滤后获得的滤液依次进行5次常温离心，离心条件依次为1000‑1580rpm/min×3‑5min、500‑650rpm/min×3‑5min、200‑300rpm/min×4min、200‑300rpm/min×4min、200‑300rpm/min×4min。本发明操作简单，耗时少，无需低温离心设备，能高效去除红细胞和细胞碎片，获得的肝实质细胞存活率和纯度较高。

Description

一种原代肝实质细胞的分离提取方法及其应用

技术领域

本发明涉及细胞分离技术领域，具体地说，涉及一种原代肝实质细胞的分离提取方法及其应用。

背景技术

早期肝实质细胞的分离一般通过机械剪切及强力吹打等物理手段来分离，但该方法细胞得率极低，活性差。后来有研究者在物理剪碎肝组织后，加入胰蛋白酶和胶原酶对组织碎块进行消化，提升了肝实质细胞的得率，但细胞存活率和活性仍然不高。随后，离体胶原酶灌注法被发明出来，该方法是将动物肝脏取出，于门静脉内置管或直接在获得的肝组织块的血管或切口内置管，用预热的无钙无镁的D-Hank's液灌流，然后换用胶原酶作持续灌流，使肝实质细胞与间质分离，经过滤、离心、弃上清后得到肝细胞悬液。离体胶原酶灌注法分离所得肝实质细胞的数量和存活率都有显著提高。随后Seglen等研究者在此基础上创立了改良的Seglen两步灌流法，该方法获得肝实质细胞数量和活性较高，广泛应用于大鼠、小鼠、犬和兔等动物。

但Seglen两步灌流法要求肝组织尽量完整或者体积较小、血管明显，且对操作者的技能水平要求较高，还需要蠕动泵、低温高速离心机等设备。在有些动物(例如，绵羊)饲养实验后所获得的肝组织较难满足两步灌注法的要求。此外，有些动物肝组织体积庞大，若完全照搬两步胶原酶灌注法，则需要极其大量的胶原酶和更长的消化时间才能消化完全，往往会降低细胞得率，且由于肝实质细胞存在体外培养条件下无法长期存活，通常实验中并不需要如此巨量的肝实质细胞。因此，急需建立一种可适用于小块肝组织分离肝实质细胞的研究方法。

发明内容

针对现有技术的问题，本发明的目的是提供一种操作时间短、设备简单，尤其适用于从小块不规则、血管不明显的肝组织中获得高质、高量肝实质细胞的方法。

为了实现该目的，本发明的技术方案如下：

一种原代肝实质细胞的分离提取方法，将灌注液Ⅰ和灌注液ⅠⅠ注射在肝组织块中，以消化分离肝实质细胞获得细胞悬液，之后，将所述细胞悬液经过滤后获得的滤液依次进行5次常温离心，离心条件依次为1000-1580rpm/min×3-5min、500-650rpm/min×3-5min、200-300rpm/min×4min、200-300rpm/min×4min、200-300rpm/min×4min。

优选离心条件依次为：1200rpm/min×4min、570rpm/min×4min、240rpm/min×4min、240rpm/min×4min、240rpm/min×4min。

本发明在研究时发现，现有技术中针对从动物肝脏中分离原代肝实质细胞的方案，大多需要较为完整、血管清晰的肝脏，以使得灌注液可经由血管分散渗入到肝脏组织中，从而实现肝实质细胞的消化分离。但该方式不适合体积小、形状不规则、且血管不完整肝组织的提取分离处理，且处理时为了控制灌注液的运送分散效果需要蠕动泵，为了避免细胞活力降低还需要在处理时采用低温离心设备等较高端的设备，提升了整体操作的复杂性和成本。为此，本发明首先对灌注液的施用位置进行了研究，先通过灌注清除大部分红细胞，使肝细胞从组织块上解离下来，再结合后续的细胞碎片及红细胞去除方式的改进，显著清除残留的红细胞以及枯否细胞、星状细胞等杂细胞，免除了红细胞裂解液的使用，避免了该试剂对肝实质细胞的损伤和提取效果的影响，且该方式对肝实质细胞伤害小，有利于提高肝实质细胞的存活率和得率，间接提高成功率。此外，该方式还无需再采用低温离心设备，仅在常温下即能保证细胞存活率，降低了肝实质细胞分离过程中对仪器和试剂的依赖，节省了成本。且较高的细胞得率和纯度增加了实验可行性，间接降低了实验重复率，降低实验开支。

本发明中，第一次离心后加入预冷(4℃)的William’s E完全培养基重悬(所述William’s E完全培养基为含有10％胎牛血清、1×GlutMAX、100u/ml青霉素和100u/ml链霉素的William’s E基础培养基)，第二次离心后每步离心均加入常温的William’s E完全培养基重悬。

离心时加入培养基的体积是根据细胞离心沉淀的体积而定，至少加入2mL。例如，细胞沉淀体积为2mL，则加4mL培养基；细胞沉淀1.5mL，则加3mL培养基；细胞沉淀1mL，则加2mL培养基即可。

本发明中，所述灌注液Ⅰ和所述灌注液ⅠⅠ的注射位点位于所述肝组织块上表面平整且能观察到血管剖面的切面上；注射时先在所述肝组织块的中心进行注射，之后再在所述肝组织块的四周进行注射。

本发明本着“先中心后四周”的原则选择多个灌注位点。

优选，所述灌注液Ⅰ和所述灌注液ⅠⅠ的注射角度垂直于所述切面。

本发明发现当直接在肝组织的特定位点上以垂直角度直接灌注灌注液可既保证灌注液的有效分散，实现肝实质细胞的活性保持和肝组织的充分消化，使得肝实质细胞的得率、纯度和存活率均较高。尤其适用于小体积的肝组织处理。且灌注位点的选择能极大程度地影响红细胞的去除效果，红细胞去除效果好则更容易分离肝实质细胞，反之则降低肝实质细胞得率和存活率。若位点所在面不是切面而是光滑的、有被膜的肝组织表面，则可能导致灌注液Ⅰ无法有效除去组织边缘的红细胞，降低肝实质细胞的得率和存活率。若灌注位点先选在边缘处，则容易造成肝组织中心位置血液凝结，极大地影响红细胞排除，导致肝实质细胞的得率和存活率大幅度降低，实验失败。

本发明中，所述灌注液Ⅰ包括灌注液Ⅰa和灌注液Ⅰb；所述灌注液Ⅰa用于注射所述肝组织块的中心位置，所述灌注液Ⅰa为含有17.5-22.5mmol/L Hepes、1-1.15mmol/L EDTA、200-250u/ml青霉素和200-250u/ml链霉素的HBSS溶液，其中，所述灌注液Ⅰa中的HBSS溶液不含钙、镁离子。

灌注液Ⅰa优选为含有20mmol/L Hepes、1mmol/L EDTA、200u/ml青霉素和200u/ml链霉素的HBSS溶液(不含钙、镁离子)，更利于保持细胞活性，防止血液凝集。

所述灌注液Ⅰb用于注射所述肝组织块的四周位置，所述灌注液Ⅰb为含有17.5-22.5mmol/L Hepes、1.16-1.25mmol/L EDTA、200-250u/ml青霉素和200-250u/ml链霉素的不含钙、镁离子的HBSS溶液，优选为含有20mmol/L Hepes、1.25mmol/L EDTA、200u/ml青霉素和200u/ml链霉素的不含钙、镁离子的HBSS溶液。

所述灌注液Ⅰ的总用量与所述肝组织块的质量之比为13-18mL/g；所述灌注液Ⅰa与所述灌注液Ⅰb的体积比为1：(3-5)，优选为1：3。

本发明中，所述灌注液Ⅱ为含有5-5.5mmol/L CaCl₂和0.8-1.2mg/mLⅣ型胶原酶的HBSS溶液。

灌注液Ⅱ优选为含有5mmol/L CaCl₂和1mg/mLⅣ型胶原酶的HBSS溶液。

HBSS原液含1.2mmol/L的钙离子，仅需额外添加部分CaCl₂使其终浓度为5-5.5mmol/L即可。

所述灌注液Ⅱ的用量与所述肝组织块的质量之比为18-22mL/g。

本发明根据注射位点的变化，调整了灌注液的配合方式，通过两种特定灌注液结合注射位置的变化配合保证了提取效果。具体地，本发明通过在肝组织块的中心区域灌注灌注液Ⅰa后，再采用EDTA浓度增加的灌注液Ⅰb对肝组织块的四周位置进行灌注，进一步保证了细胞得率。

当待灌注组织块较大时(例如，15g)，灌注液Ⅱ中的CaCl₂和Ⅳ型胶原酶的浓度可分别采用5.5mmol/L和1.2mg/mL，以更有利于保证细胞提取效果。

本发明中，所述过滤为采用150μm和40μm孔径的筛网依次进行过滤。

具体地，本发明的方法包括以下步骤：

步骤一：采用预冷的PBS清洗肝组织块的表面；所述PBS含有400-450u/ml青霉素和400-450u/ml链霉素；

步骤二：匀速注射预热的灌注液Ⅰ于所述肝组织块中；

步骤三：匀速注射预热的灌注液Ⅱ于所述肝组织块中；

步骤四：晃动所述肝组织块致肝实质细胞脱落，将得到的细胞悬液继续于37℃消化；优选，所述消化在50rpm/min的震荡下进行；并于消化完成后冰浴15s；

步骤五：用150μm和40μm孔径的筛网依次过滤所述细胞悬液获得滤液；

步骤六：将所述滤液依次经过1000-1580rpm/min×3-5min、500-650rpm/min×3-5min、200-300rpm/min×4min、200-300rpm/min×4min、200-300rpm/min×4min，优选1200rpm/min×4min、570rpm/min×4min、240rpm/min×4min、240rpm/min×4min、240rpm/min×4min条件常温离心，去除细胞碎片和红细胞。

步骤一中所述PBS为1×PBS，pH为7.2-7.4。预冷后的温度为4℃。

步骤二、三中灌注液Ⅰ、灌注液Ⅱ经预热至38℃。可将注射器的注射口刺入所述肝组织块进行注射。注射针刺入的角度根据组织块形状差异而调整，尽量保持与血管方向一致，且注射时保持缓慢、匀速，不能产生气泡。

步骤四中可用无菌眼科镊夹住组织块中的血管或筋膜组织轻轻晃动，使得细胞脱落，悬液中的细胞呈现云雾状，逐渐浑浊，再用眼科镊挑出血管、筋膜等组织。

冰浴指将细胞悬液置于冰水中快速降温。

分离提取后的肝实质细胞可在鼠尾胶原(2ug/cm²的Ⅰ型鼠尾胶原)包被后的培养皿中培养，该方法简便快捷，成本低廉，有利于细胞贴壁存活，细胞生长状态好，可满足原代肝实质细胞实验的要求。并有利于建立体外实验模型细胞，研究肝实质细胞的特性，为细胞移植和药物筛选等研究提供高质量的肝实质细胞。培养皿使用前经过William’s E完全培养基润洗一次，可洗去残留的冰醋酸，提高细胞存活率。

本发明还提供一种上述方法在分离提取原代肝实质细胞的中的应用。

本发明的有益效果至少在于：

传统的两步灌注法对肝组织的完整性和体积以及操作者的技能水平和实验室设备都有较高要求，本发明提供了一种尤其适用于小体积动物肝组织块分离肝实质细胞的操作方法，优于传统的两步灌注法，缩减了操作步骤，减少操作时间，降低了操作门槛，获得的肝实质细胞得率高，纯度高，肝实质细胞形态完整，损伤小，细胞活性高(可快速贴附在培养皿底部，存活能力强)，且质量稳定、重复性好，有利于肝实质细胞贴壁和后期生长。所得原代细胞经细胞形态学观察与免疫荧光鉴定，细胞存活率达90％以上，细胞纯度达95％以上，活细胞数量大，大幅降低了设备成本和技术成本。

附图说明

图1是本发明实施例1分离后培养24h的肝实质细胞图(100×)；

图2是本发明实施例1分离后培养24h的肝实质细胞CK-18蛋白的免疫荧光图；

图3是本发明实施例1分离后培养24h的肝实质细胞细胞核的免疫荧光图；

图4是图2和图3整合后的结果图。

具体实施方式

下面将结合实施例对本发明的优选实施方式进行详细说明。需要理解的是以下实施例的给出仅是为了起到说明的目的，并不是用于对本发明的范围进行限制。本领域的技术人员在不背离本发明的宗旨和精神的情况下，可以对本发明进行各种修改和替换。

下述实施例中所使用的实验方法如无特殊说明，均为常规方法。下述实施例中所用的材料、试剂等，如无特殊说明，均可从商业途径得到。本发明中各实施例与对比例采用同样的结果测试方法。

实施例1

本实施例提供了一种绵羊肝实质细胞的分离提取方法。具体如下：

1)选取一块重量约为7.5g的新鲜绵羊肝脏组织，用4℃预冷的PBS清洗绵羊肝组织块表面；应用10mL注射器刺入绵羊肝组织上表面完整且能观察到血管剖面的切面上，针头垂直于所述切面，避免针头穿过组织块，注射器缓缓推进，将预热38℃的灌注液Ⅰa(25mL)注入肝组织中心处中，可见大量血液流出，中心区域肝组织块由暗红色逐渐变为棕黄色，四周的组织块颜色仍呈红色。再以同样的角度，向四周组织区域注射预热38℃的灌注液Ⅰb(75mL)，可见血液流出，肝组织块颜色逐渐统一为棕黄色或淡黄色。若有部分位点处颜色仍然较深，即在该处重复此过程。注射时压力、流速尽量保持缓慢且匀速，吸取溶液时避免产生气泡。此过程大约需要10-15min。本实施例用时10分钟。

2)应用38℃预热的灌注液Ⅱ(150mL)根据步骤1)的注射原则继续多点灌注，可见组织块变疏松、失去弹性，组织表面变得模糊。同时，为保持胶原酶溶液的温度，将培养皿置于装有85℃热水的T75培养瓶上。根据组织块体积不同，此过程需10-15min。本实施例用时15分钟。

3)用镊子夹住残缺的组织块轻轻晃动，可见培养皿中悬液逐渐浑浊，呈云雾状，无菌眼科剪刀剪去肉眼可见的包膜、白色纤维结缔组织和极少量凝固的血液，移入无菌锥形培养瓶，37℃顺时针50rpm/min震荡消化15min，随着时间的增加，肉眼可见组织块边缘变得模糊，悬液逐渐浑浊。之后将细胞悬液置于冰水中快速降温15s。

4)用巴氏吸管将消化物吹打为细胞悬液，用150μm和40μm筛网依次过滤，滤液移至15mL离心管中。

5)1200rpm/min离心4min，弃上清液，加入4mL 4℃预冷的William’s E完全培养基，滤液570rpm/min×4min离心1次。弃上清液，再加入3mL常温的William’s E完全培养基重悬细胞，240rpm/min×4min离心，此步骤共重复3次，可见上清液逐渐变清澈。

6)弃上清液，分别加2mL William’s E完全培养基，轻轻吹打重悬沉淀细胞，并用台盼蓝染色检测细胞活性并计数，获得活细胞率和细胞数量。随后接种到采用2ug/cm²的Ⅰ型鼠尾胶原包被后的培养皿(使用前经过William’s E完全培养基润洗一次)中，置于37℃、5％CO₂环境中培养，4h后换液除去未贴壁细胞。

7)同时接种细胞于腔室载玻片，24h后通过倒置显微镜观察细胞形态(结果参见图1)，并进行免疫荧光实验，利用肝实质细胞特异性表达CK-18蛋白的特点，检测肝实质细胞纯度。

上述步骤中，PBS为1×PBS，pH为7.4，含有400u/ml青霉素和400u/ml链霉素；

灌注液Ⅰa配方为20mmol/L Hepes、1mmol/L EDTA、200u/ml青霉素、200u/ml链霉素、5.33mmol/L KCl、0.44mmol/L KH₂PO₄、4.17mmol/L NaHCO₃、137.93mmol/L NaCl、0.33mmol/L Na₂HPO₄、5.56mmol/L葡萄糖(即，含有20mmol/L Hepes、1mmol/L EDTA、200u/ml青霉素和200u/ml链霉素的不含钙、镁离子的HBSS溶液)；

所述灌注液Ⅰb配方为含有20mmol/L Hepes、1.25mmol/L EDTA、200u/ml青霉素和200u/ml链霉素的上述不含钙、镁离子的HBSS溶液；

灌注液Ⅱ配方为5mmol/L CaCl₂、1mg/mLⅣ型胶原酶、0.49mmol/L MgCl₂、0.41mmol/L MgSO₄、5.33mmol/L KCl、0.44mmol/L KH₂PO₄、4.17mmol/L NaHCO₃、137.93mmol/L NaCl、0.33mmol/L Na₂HPO₄、5.56mmol/L葡萄糖(即，含有5mmol/L CaCl₂和1mg/mLⅣ型胶原酶的HBSS溶液)；

William’s E完全培养基为含有10％胎牛血清、1×GlutMAX、100u/ml青霉素和100u/ml链霉素的William’s E基础培养基。

从图1中可看到细胞多呈椭圆形或多边形，可明显观察到大部分细胞含有2个细胞核。

绵羊肝实质细胞特异性表达CK-18蛋白，经免疫荧光染色呈绿色，而其他杂细胞则不显示绿色，利用倒置荧光显微镜观察结果如图2所示，代表绵羊肝实质细胞数量；图3是图2在同一视野下细胞核的免疫荧光结果，细胞核可被核酸染料Dapi染色呈蓝色，显示细胞总数；图4为图2和图3整合后的结果，根据公式：细胞纯度＝绵羊肝实质细胞数量/细胞总数×100％，可以计算出细胞纯度：57/60×100％＝95％，即所分离肝实质细胞纯度为95％。细胞存活率为94.9％，活细胞数量为1.63×10⁸个。

实施例2

本实施例提供了一种绵羊肝实质细胞的分离提取方法。具体方法同实施例1，区别仅在于：肝组织块重量约为15g，灌注液Ⅰ用量为200mL(灌注液Ⅰa 50mL、灌注液Ⅰb 150mL)，灌注时间15min；灌注液Ⅱ为含有5.5mmol/L CaCl₂和1.2mg/mLⅣ型胶原酶的HBSS溶液，用量为300mL，灌注时间20min。

实验结果：细胞存活率达95.2％，活细胞数量为2.55×10⁸个，细胞纯度为96.3％。

实施例3

本实施例提供了一种绵羊肝实质细胞的分离提取方法。具体方法同实施例1，区别仅在于：肝组织块重量约为2.5g，灌注液Ⅰ用量为40mL(灌注液Ⅰa 7mL、灌注液Ⅰb 33mL)，灌注时间8min；灌注液Ⅱ用量为50mL，灌注时间6min。

实验结果：细胞存活率达94.9％，活细胞数量为4.3×10⁷个，细胞纯度为95.6％。

对比例1

本对比例提供了绵羊肝实质细胞的分离提取方法。具体方法同实施例1，区别仅在于：步骤5)中第一次离心采用900rpm/min离心4min，其余离心步骤未改变。

实验发现：离心后细胞沉淀少，且并非都沉淀到最底部，而是沿着离心管壁向上逐渐减少，上清液中含有肉眼可见的悬浮细胞团。细胞存活率达93.3％，细胞纯度为96.5％，与实施例1无显著差异；但活细胞数量为4.1×10⁷个，显著低于实施例1。

对比例2

本对比例提供了绵羊肝实质细胞的分离提取方法。具体方法同实施例1，区别仅在于：步骤5)中在1200rpm/min离心4min并弃上清液后，加入了常温的William’s E完全培养基，其余离心步骤未改变。

实验发现：分离所得肝实质细胞的存活率降低为65.3％，显著低于实施例1，且接种于培养皿后，细胞不易贴壁，难以用于后续实验。原因在于：常温培养基未能有效降低胶原酶活性，导致胶原酶在转移和离心过程中继续消化，造成细胞外表面受损，导致细胞大批量死亡。

对比例3

本对比例提供了绵羊肝实质细胞的分离提取方法。具体方法同实施例1，区别仅在于：步骤5)中具体的离心方式为：1200rpm/min离心4min，弃上清液，加入4mL 4℃预冷的William’s E完全培养基，滤液600rpm/min×3min离心1次。再加入3mL常温William’s E完全培养基重悬细胞，300rpm/min×3min离心，此步骤重复3次。

实验发现：离心后细胞沉淀较多，但其中部分是红色沉淀，镜下观察发现大量扁平状的红细胞夹杂在肝实质细胞中。分离所得细胞存活率为97.3％，活细胞数量为1.1×10⁸个，与实施例1无显著差异；但红细胞残留较多，细胞纯度降为75.4％，显著低于实施例1。

对比例4

本对比例提供了绵羊肝实质细胞的分离提取方法。具体方法同实施例1，区别仅在于：灌注液Ⅰa和Ⅰb的配方中Hepes浓度改为10mmol/L，EDTA浓度改为0.5mmol/L。

实验发现：第一次灌注后组织块保持完整，大部分位置颜色仍保持深红色，第二次灌注后残留大量组织块形态仍保持完整，细胞纯度为96.5％，与实施例1无显著差异；但细胞死亡率较高，细胞存活率仅为76.3％，活细胞数量仅为8.1×10⁶个，显著低于实施例1。

对比例5

本对比例提供了绵羊肝实质细胞的分离提取方法。具体方法同实施例1，区别仅在于：灌注液ⅠⅠ的配方中CaCl₂和Ⅳ型胶原酶的浓度分别改为3mmol/L和0.5mg/mL；

实验发现：第二次灌注后大量组织块形态仍保持完整，细胞纯度为95.3％，细胞存活率为96.7％，与实施例1无显著差异；但活细胞数量仅为6.7×10⁶个，显著低于实施例1。

对比例6

本对比例提供了绵羊肝实质细胞的分离提取方法。具体方法同实施例1，区别仅在于：灌注液Ⅰ和灌注液Ⅱ的用量分别为50mL和100mL。

实验结果为第一次灌注后组织块整体颜色仍保持深红色，第二次灌注时甚至还会冲刷出肉眼可见的红细胞，第二次灌注后组织块质地和形态变化不大，未见细胞流出。细胞纯度为96.5％，细胞存活率为96.3％，与实施例1无显著差异；但活细胞数量仅为3.1×10⁶个，显著低于实施例1。

对比例7

本对比例提供了绵羊肝实质细胞的分离提取方法。具体方法同实施例1，区别仅在于：步骤5)中共进行4次离心，第1次离心40g×3min，弃上清液，加入5mL 4℃预冷的William’s E完全培养基，第2次离心30g×3min，加入5mL常温的William’s E完全培养基重悬细胞，第3次离心30g×离心3min，加入5mL常温的William’s E完全培养基重悬细胞，第4次离心30g，离心3min。每次离心后均去上清，加培养基后吹打混匀。

实验发现：经过4次离心，细胞沉淀逐渐减少，最终得到的细胞沉淀极少，每次离心后，上清液中均含有大量肉眼可见的悬浮细胞团。细胞存活率达90.3％，细胞纯度为94.5％，与实施例1无显著差异；但活细胞数量为1.3×10⁶个，显著低于实施例1。

对比例8

本对比例提供了绵羊肝实质细胞的分离提取方法。具体方法同实施例1，区别仅在于：步骤5)中共进行4次离心，第1次离心50g×5min，弃上清液，加入5mL 4℃预冷的William’s E完全培养基，第2次离心10g×3min，加入5mL常温的William’s E完全培养基重悬细胞，第3次离心10g×3min，加入5mL常温的William’s E完全培养基重悬细胞，第4次离心10g×3min，每次离心后均去上清，加培养基后吹打混匀。

实验发现：离心后细胞沉淀较少，且每次离心后，上清液中均含有肉眼可见的细胞残留。细胞存活率达91.6％，细胞纯度为92.2％，与实施例1无显著差异；但活细胞数量为1.1×10⁶个，显著低于实施例1。

对比例9

本对比例提供了绵羊肝实质细胞的分离提取方法。具体方法同实施例1，区别仅在于：步骤5)中在第1次离心所得底层沉淀加入红细胞裂解液(碧云天生物技术，C3702-120ml)5mL，室温静置3分钟后，加入5mL常温William’s E完全培养基，吹打混匀，其余离心步骤未改变。

实验发现：加入红细胞裂解液后，第2次离心得到的细胞沉淀少于第1次。细胞纯度为91.9％，与实施例1无显著差异；但细胞存活率降为72.1％，活细胞数量为6.1×10⁶个，显著低于实施例1。

对比例9

本对比例提供了绵羊肝实质细胞的分离提取方法。具体方法同实施例1，区别仅在于：不根据注射位置调整灌注液Ⅰ配方，灌注液Ⅰ统一采用以下配方：含有20mmol/L Hepes、1mmol/L EDTA、200u/ml青霉素和200u/ml链霉素的不含钙、镁离子的HBSS溶液；

实验发现：灌注液Ⅰ灌注后，组织块四周最外层始终存在一圈红色区域，说明此处的红细胞未能被清除；灌注液Ⅱ灌注后，组织中心区域细胞脱落、呈糜状，但四周红色区域组织形态基本未发生改变，且血液的存在拮抗了灌注液Ⅱ中的钙离子，使得胶原酶活性降低。细胞纯度为95.2％，细胞存活率为89.7％，与实施例1无显著差异；但活细胞数量为5.3×10⁶个，显著低于实施例1。

需要说明的是，除了上述给出的具体示例之外，其中的一些步骤可有不同选择。如：在步骤二中，灌注液Ⅰ的用量可根据实际组织块体积而增减；步骤三中，灌注液Ⅱ的用量可根据实际组织块体积而增减；步骤二和三注射针刺入的角度可根据组织块形状差异而调整，尽量保持与血管方向一致，同时垂直组织块切面的角度，且注射时保持缓慢、匀速，不能产生气泡，具体的耗时可根据实际组织块体积而增减；而这些都是本领域技术人员在理解本发明思想的基础上基于其基本技能即可做出的，故在此不再一一例举。

虽然，上文中已经用一般性说明及具体实施方案对本发明作了详尽的描述，但在本发明基础上，可以对之作一些修改或改进，这对本领域技术人员而言是显而易见的。因此，在不偏离本发明精神的基础上所做的这些修改或改进，均属于本发明要求保护的范围。

Claims (7)

1.一种原代肝实质细胞的分离提取方法，其特征在于，将灌注液Ⅰ和灌注液ⅠⅠ注射在肝组织块中，以消化分离肝实质细胞获得细胞悬液，之后，将所述细胞悬液经过滤后获得的滤液依次进行5次常温离心，离心条件依次为1200rpm×4min、570rpm×4min、240rpm×4min、240rpm×4min、240rpm×4min；第一次离心后加入4℃预冷的William’s E完全培养基进行重悬，第二次离心后每步离心均加入常温的William’s E完全培养基重悬；

所述灌注液Ⅰ和所述灌注液ⅠⅠ的注射位点位于所述肝组织块上表面平整且能观察到血管剖面的切面上；注射时先在所述肝组织块的中心进行注射，使中心区域肝组织块由暗红色逐渐变为棕黄色，之后再在所述肝组织块的四周进行注射，使肝组织块颜色逐渐统一为棕黄色或淡黄色；所述灌注液Ⅰ和所述灌注液ⅠⅠ的注射角度垂直于所述切面；

所述灌注液Ⅰ包括灌注液Ⅰa和灌注液Ⅰb；

所述灌注液Ⅰa用于注射所述肝组织块的中心位置，所述灌注液Ⅰa为含有17.5-22.5mmol/L Hepes、1-1.15mmol/L EDTA、200-250u/ml青霉素和200-250u/ml链霉素的不含钙、镁离子的HBSS溶液；

所述灌注液Ⅰb用于注射所述肝组织块的四周位置，所述灌注液Ⅰb为含有17.5-22.5mmol/L Hepes、1.16-1.25mmol/L EDTA、200-250u/ml青霉素和200-250u/ml链霉素的不含钙、镁离子的HBSS溶液；

所述灌注液Ⅱ为含有5-5.5mmol/L CaCl₂和0.8-1.2mg/mLⅣ型胶原酶的HBSS溶液；

所述灌注液Ⅰ的总用量与所述肝组织块的质量之比为13-18mL/g；所述灌注液Ⅰa与所述灌注液Ⅰb的体积比为1：(3-5)；所述灌注液Ⅱ的用量与所述肝组织块的质量之比为18-22mL/g。

2.根据权利要求1所述的方法，其特征在于，所述William’s E完全培养基为含有10％胎牛血清、1×GlutMAX、100u/ml青霉素和100u/ml链霉素的William’s E基础培养基。

3.根据权利要求1所述的方法，其特征在于，所述灌注液Ⅰa为含有20mmol/L Hepes、1mmol/L EDTA、200u/ml青霉素和200u/ml链霉素的不含钙、镁离子的HBSS溶液；

所述灌注液Ⅰb为含有20mmol/L Hepes、1.25mmol/L EDTA、200u/ml青霉素和200u/ml链霉素的不含钙、镁离子的HBSS溶液。

4.根据权利要求1所述的方法，其特征在于，所述灌注液Ⅱ为含有5mmol/L CaCl₂和1mg/mLⅣ型胶原酶的HBSS溶液。

5.根据权利要求1所述的方法，其特征在于，所述过滤为采用150μm和40μm孔径的筛网依次进行过滤。

6.根据权利要求1-5任一项所述的方法，其特征在于，包括以下步骤：

步骤一：采用预冷的PBS清洗肝组织块的表面；所述PBS含有400-450u/ml青霉素和400-450u/ml链霉素；

步骤二：匀速注射预热的灌注液Ⅰ于所述肝组织块中；

步骤三：匀速注射预热的灌注液Ⅱ于所述肝组织块中；

步骤四：晃动所述肝组织块致肝实质细胞脱落，将得到的细胞悬液继续于37℃消化，并于消化完成后冰浴15s；

步骤五：用150μm和40μm孔径的筛网依次过滤所述细胞悬液获得滤液；

步骤六：将所述滤液依次经过1200rpm×4min、570rpm×4min、240rpm×4min、240rpm×4min、240rpm×4min条件常温离心。

7.根据权利要求6所述的方法，其特征在于，步骤四中，所述消化在50rpm的震荡下进行。

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