CN104650215B - 人睫状神经营养因子突变体、生产方法及用途 - Google Patents

Abstract

本发明公开了一种人睫状神经营养因子突变体、编码所述人睫状神经营养因子突变体的基因、含有所述基因的重组表达载体和重组表达转化体，所述人睫状神经营养因子突变体的制备方法，以及所述人睫状神经营养因子突变体在制备治疗肥胖症药物中的应用。与现有技术相比，所述人睫状神经营养因子突变体具有较高的生物学活性及低免疫原性。

Description

人睫状神经营养因子突变体、生产方法及用途

技术领域

本发明涉及生物领域，具体涉及一种人睫状神经营养因子突变体、生产方法及用途。

背景技术

人睫状神经营养因子(ciliary neurotrophic factor,CNTF)是一种多功能的神经营养因子。它在体内具有多种生物学活性，主要作用于神经系统，对中枢和外周的多种神经元有广泛的促存活作用。人睫状神经营养因子在中枢神经系统中能够促进神经干细胞增殖，抑制神经干细胞向神经胶质细胞的分化。此外，它对感觉神经元、运动神经元、海马胆碱能神经元等具有促进存活的作用，并能够保护受损的神经元。

当前，肥胖症与肥胖相关糖尿病已成为国内外的研究热点。随着经济发展和生活方式的改变，肥胖、糖尿病的发生率明显上升。市场上出现了多种减肥产品，但绝大多数产品的功效不尽如人意。近年来，在对CNTF动物模型及功能研究时发现其具有减轻体重的作用，在多种啮齿动物肥胖症或Ⅱ型糖尿病模型试验中表明CNTF可使体重减轻，如中国专利CN101144082B(授权公告日2012年9月5日)

公开了用CNTF突变体治疗肥胖症。CNTF给药可纠正或改善高胰岛素血症、食欲过盛以及高血脂等与肥胖有关的疾病或症状，但是人睫状神经营养因子的使体重减轻的生物学活性较低。

发明内容

本发明所要解决的技术问题是，克服现有人睫状神经营养因子(CNTF)使体重减轻的活性较低的缺陷，提供一种人睫状神经营养因子突变体、生产方法及用途，所述人睫状神经营养因子突变体具有良好的稳定性和减重效果。

本发明的技术方案之一是：一种人睫状神经营养因子突变体，其是如下(a)或(b)的蛋白质：

(a)将人睫状神经营养因子的氨基酸序列的第17位的半胱氨酸残基取代为丙氨酸残基、第63位的谷氨酸残基取代为精氨酸残基、第186位的异亮氨酸残基进行取代和截短C末端14个氨基酸残基而形成的氨基酸序列组成的蛋白质；

(b)如SEQ ID NO.4所示的氨基酸序列组成的蛋白质、如SEQ ID NO.5所示的氨基酸序列组成的蛋白质或如SEQ ID NO.6所示的氨基酸序列组成的蛋白质。

其中，本发明所述蛋白质(2)中，所述的人睫状神经营养因子来源于人的外周和中枢神经系统(其基因的Genebank登录号为NM_000614.3)，所述人睫状神经营养因子的突变体获得的方法为本领域常规；较佳地，为分离获得、从重组表达所述人睫状神经营养因子的突变体的转化体中分离获得或者人工合成获得。

本发明所述蛋白质(b)中，如SEQ ID NO.4所示的氨基酸序列组成的蛋白质为将(a)所述的蛋白质的氨基酸序列的第186位的异亮氨酸残基取代为谷氨酰胺残基而形成的氨基酸序列组成的蛋白质，命名为CNTF-186Q，为本发明最优选的CNTF突变体。

本发明所述蛋白质(b)中，如SEQ ID NO.5所示的氨基酸序列组成的蛋白质为将(a)所述的蛋白质的氨基酸序列的第186位的异亮氨酸残基取代为精氨酸残基而形成的氨基酸序列组成的蛋白质，命名为CNTF-186R。

本发明所述蛋白质(b)中，如SEQ ID NO.6所示的氨基酸序列组成的蛋白质为将(a)所述的蛋白质的氨基酸序列的第186位的异亮氨酸残基取代为色氨酸残基而形成的氨基酸序列组成的蛋白质，命名为CNTF-186W。

本发明的技术方案之二是：一种人睫状神经营养因子的突变体的基因，其

(1)编码将人睫状神经营养因子的氨基酸序列的第17位的半胱氨酸残基取代为丙氨酸残基、第63位的谷氨酸残基取代为精氨酸残基、第186位的异亮氨酸残基进行取代和截短C末端14个氨基酸残基而形成的氨基酸序列组成的蛋白质；或，

(2)编码如SEQ ID NO.4所示的氨基酸序列组成的蛋白质、如SEQ ID NO.5所示的氨基酸序列组成的蛋白质或如SEQ ID NO.6所示的氨基酸序列组成的蛋白质。

本发明中，较佳地为按照密码子的简并性，为了适合在宿主细胞中有效表达所述人睫状神经营养因子的突变体的核苷酸序列；更佳地，编码如SEQ ID NO.4所示的氨基酸序列组成的蛋白质的核苷酸序列如SEQ ID NO.1所示、编码如SEQ ID NO.5所示的氨基酸序列组成的蛋白质的核苷酸序列如SEQ ID NO.2所示或编码如SEQ ID NO.6所示的氨基酸序列组成的蛋白质的核苷酸序列如SEQ ID NO.3所示。所述如SEQ ID NO.1、SEQ ID NO.2和SEQID NO.3所示的核苷酸序列为大肠杆菌偏好的密码子。

本发明所述的人睫状神经营养因子的突变体的基因获得方法为本领域常规；较佳地从重组表达所述人睫状神经营养因子的突变体的重组表达载体的质粒中扩增获得或人工合成获得。

本发明的技术方案之三是：一种包含所述人睫状神经营养因子的突变体的重组表达载体。

本发明所述重组表达载体由通过本领域常规方法将所述人睫状神经营养因子的突变体的基因连接于各种骨架载体上构建而成；较佳地，可通过下述方法制得：将通过PCR所得的人睫状神经营养因子的突变体的基因的扩增产物与载体连接，形成克隆载体，之后将所述克隆载体和所述骨架载体用限制性内切酶双酶切，形成互补的粘性末端，再经连接酶连接，形成含有所述人睫状神经营养因子的突变体的基因的重组表达载体。所述骨架载体可为本领域常规的各种载体，如市售的质粒、粘粒、噬菌体或病毒载体等，较佳地为带有T7启动子的质粒pET27b。

本发明的技术方案之四是：一种包含所述人睫状神经营养因子的突变体基因的重组载体的转化体。

本发明所述转化体由通过本领域常规方法将所述重组表达载体转化至宿主微生物中制得；较佳地，将所述重组表达质粒转化至E.coli BL21中，即可。所述宿主微生物可为本领域常规的宿主微生物，只要能满足所述重组表达载体可稳定地自行复制，且所携带的所述人睫状神经营养因子的突变体的基因可被有效表达即可；较佳地为大肠杆菌，更佳地为大肠埃希氏菌E.coli BL21。

本发明的技术方案之五是：一种所述人睫状神经营养因子的突变体的制备方法，其包括如下步骤：培养所述转化体，从培养液中获得睫状神经营养因子的突变体。

本发明所述人睫状神经营养因子的突变体通过将所述转化体培养后得到。所述培养的方法和条件为本领域常规的方法和条件，可以根据宿主类型和培养方法等因素进行适当的选择，只要使转化体能够生长并产生所述人睫状神经营养因子的突变体即可；较佳地，所述的培养的方法包括以下的步骤：将所述转化体接种至培养基中培养，加入异丙基-β-D-硫代吡喃半乳糖苷进行诱导表达，获得培养液；所述的从培养液中获得人睫状神经营养因子的突变体的方法包括以下的步骤：离心收集所述培养液中的菌体，重悬菌体，高压均质破碎菌体，离心收集包涵体，将所述包涵体用含盐酸胍缓冲液溶解变性，得到包涵体变性液，通过稀释复性方法将包涵体蛋白复性，用切线流系统进行浓缩后再用置换缓冲液进行透析置换得到所述人睫状神经营养因子的突变体的粗品，所述置换缓冲液包括50mMTris-HCL，1mM EDTA，pH8.0，所述切线流系统为Labscale TFF System(Millipore)；更佳地，所述的培养的方法包括以下的步骤：将所述转化体接种至培养基中培养，加入1mM异丙基-β-D-硫代吡喃半乳糖苷进行诱导表达3小时，获得培养液；和/或所述的从培养液中获得人睫状神经营养因子的突变体的方法包括以下的步骤：于4℃，8000g离心30min，收集所述培养液中的菌体，重悬菌体，高压均质破碎菌体，经4℃、8000g离心30分钟后得到包涵体，所得的包涵体用6M盐酸胍溶解，离心收集上清，加入30倍体积含50mMTris-HCL和1mM EDTA，pH8.0的复性缓冲液进行稀释复性。

本发明中，较佳地，还包括从所述的粗品中获得所述人睫状神经营养因子的突变体的步骤：将所述人睫状神经营养因子的突变体的粗品用阴离子交换柱进行层析纯化，再将目的蛋白人睫状神经营养因子的突变体用疏水层析柱进行精细纯化，收集目的蛋白峰，经滤膜过滤除菌后，得到人睫状神经营养因子的突变体的纯品；更佳地，用Q Sepharose FF阴离子交换柱进行层析纯化，用HiTrap Phenyl HP疏水层析柱进行精细纯化。

本发明的技术方案之五是：一种人睫状神经营养因子的突变体在制备治疗肥胖症药物中的应用。

较佳地，本发明所述的人睫状神经营养因子的突变体配制后可以经腹腔给药抑制体重的增长。

较佳地，本发明所述的肥胖症为普通肥胖症或者糖尿病型肥胖症。

在符合本领域常识的基础上，上述各优选条件，可任意组合，即得本发明各较佳实例。

本发明所用试剂和原料均市售可得。

本发明的积极进步效果在于：人睫状神经营养因子的突变体与现有人睫状神经营养因子相比，使体重减轻的活性较高可以明显、安全地抑制体重增长，并且具有良好的稳定性，从而可以应用于制备治疗肥胖症药物。

附图说明

图1为人睫状神经营养因子突变体表达菌全菌破碎产物电泳图，其中泳道1为蛋白质分子量标准品，泳道2为CNTF-186Q表达菌，泳道3为CNTF-186R表达菌，泳道4为CNTF-186W表达菌，泳道5为CNTF-WT表达菌，泳道6为CNTF-CN5表达菌。

图2为纯化后人睫状神经营养因子突变体的电泳图，其中泳道1为纯化的CNTF-CN5，泳道2为纯化的CNTF-WT，泳道3为纯化的CNTF-186Q，泳道4为纯化的CNTF-R，泳道5为纯化的CNTF-W，泳道6为蛋白质分子量标准品。

图3为给药人睫状神经营养因子突变体后，各组小鼠平均体重变化值的曲线图。其中，CNTF-186Q、CNTF-186R、CNTF-186W、CNTF-CN5或CNTF-WT分别表示CNTF-186Q组、CNTF-186R组、CNTF-186W组、CNTF-CN5组或CNTF-WT组。

具体实施方式

下面通过实施例的方式进一步说明本发明，但并不因此将本发明限制在所述的实施例范围之中。下列实施例中未注明具体条件的实验方法，按照常规方法和条件，或按照商品说明书选择。

实施例1CNTF突变体氨基酸序列及编码CNTF突变体氨基酸序列的核苷酸序列的制备

将人睫状神经营养因子的基因(Genebank登录号：NM_000614.3)的第17位半胱氨酸定点突变为丙氨酸，第63位谷氨酸定点突变为精氨酸，C末端删去14个氨基酸残基，同时将人睫状神经营养因子的基因中的部分密码子改为原核生物偏好的密码子，但不改变基因编码的氨基酸序列，以获得重组CNTF。以重组CNTF为模板，进行定点突变，将186位异亮氨酸分别定点突变为谷氨酰胺、精氨酸或者色氨酸得到CNTF突变体，分别命名为CNTF-186Q、CNTF-186R或CNTF-186W，其氨基酸序列分别如SEQ ID NO.4、SEQ ID NO.5或SEQ ID NO.6所示。然后通过全基因合成方式获得编码CNTF-186Q、CNTF-186R或CNTF-186W突变体的DNA，其核苷酸序列分别如SEQ ID NO.1、SEQ ID NO.2或SEQ ID NO.3所示。同时，为比较本发明突变体减重效果，合成了中国专利CN101144082B(授权公告日2012年9月5日)中减重效果最为显著的突变体CN5基因序列(核苷酸序列如CN101144082B说明书第5页所示)。并在全基因合成上述基因时，在目的基因的上下游分别设计了NdeI和BamHI两个酶切位点。所述全基因合成以及定点突变均由上海捷瑞生物工程有限公司完成。

实施例2包含CNTF突变体的重组载体和转化体的制备

制备包含CNTF突变体的重组载体pET27b-CNTF质粒，即将人工合成的含有核苷酸序列分别如SEQ ID NO.1、SEQ ID NO.2或SEQ ID NO.3所示的基因和含有CN5基因的质粒用NdeI和BamHI双酶切，酶切产物装入用NdeI和BamHI酶处理的pET27b质粒的相应位置，分别命名为pET27b-CNTF-186Q、pET27b-CNTF-186R、pET27b-CNTF-186W或pET27b-CNTF-CN5。同时按上面的方法制备包含天然CNTF(即CNTF-WT)的重组载体pET27b-CNTF-WT。

挑取含pET27b-CNTF-186Q、pET27b-CNTF-186R、pET27b-CNTF-186W、pET27b-CNTF-CN5或pET27b-CNTF-WT的单个大肠杆菌BL21(DE3)菌落于5mL LB培养液中，培养过夜。将得到的菌液作为种子菌，1：100稀释到LB培养液，37℃培养至OD₆₀₀约为0.6时，加入终浓度为1mM异丙基硫代半乳糖苷(IPTG)诱导表达3h，然后将菌液于4℃下8000g离心10min，收集细菌。经凝胶灰度扫描分析，目的蛋白CNTF突变体的表达量占菌体总蛋白的30％以上。分子量约为19kD左右，与理论分子量一致，说明包含CNTF突变体的转化体构建成功。

实施例3CNTF突变体的发酵制备与纯化

1、将实施例2所得的pET27b-CNTF-186Q、pET27b-CNTF-186R、pET27b-CNTF-186W、pET27b-CNTF-CN5或pET27b-CNTF-WT质粒培养后所得的菌液，分别以1：20(V/V)的比例加入含有培养基的10L发酵罐中，所述培养基体积为6L，所述培养基为复合培养基，其成份与组成为：葡萄糖5g/L、酵母粉30g/L、磷酸氢二钾8.7g/L、磷酸二氢钠4.2g/L、硫酸铵5.5g/L、硫酸镁2.5g/L和微量元素液1g/L。控制发酵温度为37℃，pH值7.0±0.2，溶氧＞40％，进行发酵培养，每隔1小时取样检测OD₆₀₀值，当OD₆₀₀在10～12时，加入终浓度为1mM异丙基硫代半乳糖苷(IPTG)诱导表达3h，菌液于4℃，8000g离心30min，收集细菌。

2、将步骤1所得的细菌的菌体重悬于10倍体积的20mM Tris-HCL(pH8.0，含1mMEDTA)中，采用高压均质机破碎菌体，800～900bar，循环2次，镜检破菌率＞95％，即菌体已经完全破碎。此时将破碎的菌体进行电泳，电泳结果如图1所示，图1的结果说明，各组蛋白在宿主菌中均有表达。菌体破碎后悬浊液经4℃、8000g离心30分钟后得到包涵体。

3、将步骤2所得的包涵体用20mM Tris-HCL(pH8.0，含5mM EDTA、2％Triton 100和2M尿素)洗涤2次，除去杂蛋白。洗涤后的包涵体用6M盐酸胍溶解，离心收集上清得到包涵体变性液，加入30倍体积的复性缓冲液(含50mMTris-HCL和1mM EDTA，pH8.0)，进行稀释复性。得到的复性液用超滤膜包(购自Millipore)超滤，收集超滤浓缩液。

4、将步骤3所得的超滤浓缩液上Q Sepharose FF阴离子交换柱进行纯化。阴离子交换柱用10mM Tris-HCL，pH8.0的平衡缓冲液平衡后，再用平衡缓冲液充分清洗至流出液的吸光度接近基线。用含1mol/L NaCl的平衡缓冲液洗脱，收集洗脱峰，经0.22μm滤膜过滤除菌后，得到高纯度的CNTF-186Q、CNTF-186R、CNTF-186W、CNTF-CN5或CNTF-WT并进行复性。所述高纯度的CNTF-186Q、CNTF-186R、CNTF-186W、CNTF-CN5或CNTF-WT的纯度可以高于95％。

将CNTF-186Q、CNTF-186R、CNTF-186W、CNTF-CN5或CNTF-WT进行电泳，电泳结果如图2所示，经计算后发现纯化后的CNTF蛋白纯度高于95％。为便于保存，可将高纯度的CNTF-186Q、CNTF-186R或CNTF-186W过滤后加入合适的辅料，真空冷冻干燥，即可制成冻干剂，也可制成胶囊剂型、膜片剂。

实施例4CNTF突变体的生物性活性检测

采用正常小鼠减重法检测CNTF突变体CNTF-186Q、CNTF-186R、CNTF-186W或CNTF-CN5和天然CNTF(CNTF-WT)的生物学活性。具体方法是：随机选取体重在14～18克的清洁级昆明鼠，精确称量体重，按体重随机分组，每组6～8只动物，共为6个实验组：分别给药CNTF-186Q、CNTF-186R、CNTF-186W或CNTF-CN5的CNTF-186Q组、CNTF-186R组、CNTF-186W组或CNTF-CN5组、给药生理盐水的对照组和给药人睫状神经营养因子CNTF-WT组。每日经腹腔给药一次，连续给药5～6天，对照组注射生理盐水。各组试验动物从给药0天起，每天于给药前称量体重一次。各试验组每天给予成分一致且及分量充足的饲料及饮水供其随意取用。试验结束后，计算体重增长抑制率即减重效率。计算公式如下：

体重增长抑制率(％)＝[对照组某日体重增值-(CNTF-186Q组、CNTF-186R组、CNTF-186W组、CNTF-CN5组或CNTF-WT组某日体重增值)]/对照组某日体重增值×100％

给药5天后各组小鼠平均体重变化结果见表1及图3。

表1CNTF突变体蛋白给药后每天小鼠体重情况

表1中CNTF-WT组、CNTF-CN5组、CNTF-186Q组、CNTF-186R组或CNTF-186W组给药剂量：6只小鼠/组，每只小鼠按公斤体重计算，每天给药剂量125微克，即：125μg/Kg.d；对照组：6只小鼠，每天注射与CNTF-WT组、CNTF-CN5组、CNTF-186Q组、CNTF-186R组或CNTF-186W组等体积生理盐水。各组小鼠每日平均体重增加值见图3。

从表1和图3可以看出，重组CNTF突变体给药后小鼠体重增长量显著降低，特别是CNTF-186Q组给药后出现负增长，并且优于中国专利CN101144082B(授权公告日2012年9月5日)中最佳减重效果的突变体CN5。上述结果表明，CNTF-186Q、CNTF-186R或CNTF-186W均有显著减重效果。对照组小鼠在5天后体重平均增加了5.9克，CNTF-WT组增加了4.0克，而CNTF-186R/W组分别增加了0.6、2.2克，CNTF-186Q突变组甚至体重比给药前还减少了1.6克，均低于对照组，体重增加抑制率大于60％，其中CNTF-186Q突变组抑制率高达126％，而CNTF-CN5组的抑制率仅为112.9％。

实施例5突变体CNTF的免疫原性

选取16～19克健康balb/c小鼠30只，每组6只，随机分为5组。每天注射一次药物，共注射4周。比较天然的人CNTF(CNTF-WT)和各突变体CNTF注射小鼠后抗体产生的滴度。分组及给药浓度如下：1)对照组，等体积生理盐水；2)CNTF-WT：300微克人睫状神经营养因子/千克体重·天；3)CNTF-186Q：300微克CNTF-186Q/千克体重·天；4)CNTF-186W：300微克CNTF-186W/千克体重·天；5)CNTF-186R：300微克CNTF-186R/千克体重·天。末次注射后收集血浆，在4℃下放置12小时，并保存在-80℃。用过氧化物酶标记的羊抗鼠免疫球蛋白IgG测定小鼠血清中抗CNTF抗体的效价(参见中国专利CN101144082B(授权公告日2012年9月5日))。实验结果见表2。

表2CNTF给药4周后产生抗体效价情况

从表2看出，CNTF-186Q,CNTF-186W,CNTF-186R各突变体长期给药后产生的抗体滴度远低于人睫状神经营养因子CNTF-WT，且药效优于CNTF-WT。在长期给药及高剂量给药情况下仍然可以保持较高药效。说明CNTF突变体的免疫原性低于CNTF-WT。

应理解，在阅读了本发明的上述内容之后，本领域技术人员可以对本发明作各种改动或修改，这些等价形式同样落于本申请所附权利要求书所限定的范围。

Claims (10)

1.一种人睫状神经营养因子突变体，其特征在于，是如SEQ ID NO.4所示的氨基酸序列组成的蛋白质。

2.一种人睫状神经营养因子的突变体的基因，其特征在于，其

编码如SEQ ID NO.4所示的氨基酸序列组成的蛋白质。

3.如权利要求2所述的基因，其特征在于，所述的编码如SEQ ID NO.4所示的氨基酸序列组成的蛋白质的基因的核苷酸序列如SEQ ID NO.1所示。

4.一种包含如权利要求2所述的人睫状神经营养因子的突变体的基因的重组载体。

5.一种包含如权利要求4所述的重组载体的转化体。

6.如权利要求5所述的转化体，其特征在于，所述的转化体的宿主微生物为E.coliBL21。

7.一种人睫状神经营养因子的突变体的制备方法，其特征在于，包括如下步骤：培养如权利要求5所述的转化体，从培养液中获得人睫状神经营养因子的突变体。

8.如权利要求7所述的制备方法，其特征在于，所述的培养的方法包括以下的步骤：将所述转化体接种至培养基中培养，加入异丙基-β-D-硫代吡喃半乳糖苷进行诱导表达，获得培养液；所述的从培养液中获得人睫状神经营养因子的突变体的方法包括以下的步骤：离心收集所述培养液中的菌体，重悬菌体，高压均质破碎菌体，离心收集包涵体，将所述包涵体用含盐酸胍缓冲液溶解变性，得到包涵体变性液，通过稀释复性方法将包涵体蛋白复性，用切线流系统进行浓缩后再用置换缓冲液进行透析置换得到所述人睫状神经营养因子的突变体的粗品，所述置换缓冲液包括50mMTris-HCL和1mM EDTA，pH8.0，所述切线流系统为购自Millipore的Labscale TFF System；和/或，还包括从所述的粗品中获得所述人睫状神经营养因子的突变体的步骤：将所述人睫状神经营养因子的突变体的粗品用阴离子交换柱进行层析纯化，再将目的蛋白人睫状神经营养因子的突变体用疏水层析柱进行精细纯化，收集目的蛋白峰，经滤膜过滤除菌后，得到人睫状神经营养因子的突变体的纯品。

9.一种如权利要求1所述的人睫状神经营养因子的突变体在制备治疗肥胖症药物中的应用。

10.如权利要求9所述的应用，其特征在于，所述的肥胖症为普通肥胖症或者糖尿病型肥胖症。