JPH08187079A - 新規デオキシリボヌクレアーゼ - Google Patents
新規デオキシリボヌクレアーゼInfo
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- JPH08187079A JPH08187079A JP25564795A JP25564795A JPH08187079A JP H08187079 A JPH08187079 A JP H08187079A JP 25564795 A JP25564795 A JP 25564795A JP 25564795 A JP25564795 A JP 25564795A JP H08187079 A JPH08187079 A JP H08187079A
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- amino acid
- dnase
- dnaseγ
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Abstract
(57)【要約】
【目的】 クロマチンDNA の切断を触媒する新規デオキ
シリボヌクレアーゼ（DNase)α，β及びγの提供。アポ
トーシスに関与する新規DNase γ、そのアミノ酸配列、
DNase γ cDNA と塩基配列及びDNase γに対する抗体の
提供。 【解決手段】 (1) クロマチンDNA のリンカー部位を選
択的に切断し得る新規DNase α，β及びγに関する。ま
た、アポトーシス時のDNA 断片化に関与するDNase γに
関する。(2) DNase γのアミノ酸配列、該酵素をコード
するcDNAのクローン化及び該cDNAの塩基配列に関する。
また、該cDNAを有する組換えベクター、該組換えベクタ
ーを有する形質転換体及び該形質転換体を培養すること
によるDNase γの製造方法に関する。(3) DNase γ又は
その前駆体のアミノ酸配列に親和性を示す抗体に関す
る。
シリボヌクレアーゼ（DNase)α，β及びγの提供。アポ
トーシスに関与する新規DNase γ、そのアミノ酸配列、
DNase γ cDNA と塩基配列及びDNase γに対する抗体の
提供。 【解決手段】 (1) クロマチンDNA のリンカー部位を選
択的に切断し得る新規DNase α，β及びγに関する。ま
た、アポトーシス時のDNA 断片化に関与するDNase γに
関する。(2) DNase γのアミノ酸配列、該酵素をコード
するcDNAのクローン化及び該cDNAの塩基配列に関する。
また、該cDNAを有する組換えベクター、該組換えベクタ
ーを有する形質転換体及び該形質転換体を培養すること
によるDNase γの製造方法に関する。(3) DNase γ又は
その前駆体のアミノ酸配列に親和性を示す抗体に関す
る。
Description
【０００１】
【発明の属する技術分野】本発明は、３種類の新規なデ
オキシリボヌクレアーゼ（以下、単にＤＮａｓｅとい
う）に関する。詳細には、アポトーシスに特徴的な現象
であるＤＮＡの断片化、すなわちクロマチンＤＮＡをモ
ノまたはオリゴヌクレオソーム単位に分解する反応を触
媒する新規ＤＮａｓｅに関する。また本発明は、上記の
新規ＤＮａｓｅの内の一つ（後述のＤＮａｓｅγ）のア
ミノ酸配列をコードするＤＮＡ、該ＤＮＡを含有するベ
クター、該ベクターで形質転換された宿主細胞、該宿主
細胞を培養することによる該ＤＮａｓｅの製造方法、及
び該ＤＮａｓｅもしくはその断片、又はその前駆体ペプ
チドに対して親和性を有する抗体に関する。
オキシリボヌクレアーゼ（以下、単にＤＮａｓｅとい
う）に関する。詳細には、アポトーシスに特徴的な現象
であるＤＮＡの断片化、すなわちクロマチンＤＮＡをモ
ノまたはオリゴヌクレオソーム単位に分解する反応を触
媒する新規ＤＮａｓｅに関する。また本発明は、上記の
新規ＤＮａｓｅの内の一つ（後述のＤＮａｓｅγ）のア
ミノ酸配列をコードするＤＮＡ、該ＤＮＡを含有するベ
クター、該ベクターで形質転換された宿主細胞、該宿主
細胞を培養することによる該ＤＮａｓｅの製造方法、及
び該ＤＮａｓｅもしくはその断片、又はその前駆体ペプ
チドに対して親和性を有する抗体に関する。
【０００２】
【従来の技術・発明が解決しようとする課題】近年、細
胞組織の死に関して、アポトーシス（apoptosis)が注目
されている。このアポトーシスは、病理的細胞死である
壊死（ネクローシス）とは異なり、細胞自身の遺伝子に
最初から組み込まれている死であると考えられている。
すなわち、何らかの外部的または内部的要因が引き金と
なって、アポトーシスをプログラムする遺伝子が活性化
され、当該自壊プログラムが発動することによって起こ
る能動的な細胞死であると考えられている。
胞組織の死に関して、アポトーシス（apoptosis)が注目
されている。このアポトーシスは、病理的細胞死である
壊死（ネクローシス）とは異なり、細胞自身の遺伝子に
最初から組み込まれている死であると考えられている。
すなわち、何らかの外部的または内部的要因が引き金と
なって、アポトーシスをプログラムする遺伝子が活性化
され、当該自壊プログラムが発動することによって起こ
る能動的な細胞死であると考えられている。
【０００３】
【表１】
【０００４】アポトーシスは、上記表１に示すように非
常に多くの生命現象に関わっている。すなわち、発生過
程での形態形成のみならず、成熟した個体における皮膚
の表皮細胞，小腸や胃の上皮細胞といった正常細胞の交
代（古くなった細胞の除去）、ホルモン依存性の組織で
ある胸腺のグルココルチコイドによる萎縮、去勢による
前立腺の萎縮、さらに自己成分に反応してしまう免疫担
当細胞の排除や、神経栄養因子の除去による神経細胞死
もアポトーシスによることが示唆されている。
常に多くの生命現象に関わっている。すなわち、発生過
程での形態形成のみならず、成熟した個体における皮膚
の表皮細胞，小腸や胃の上皮細胞といった正常細胞の交
代（古くなった細胞の除去）、ホルモン依存性の組織で
ある胸腺のグルココルチコイドによる萎縮、去勢による
前立腺の萎縮、さらに自己成分に反応してしまう免疫担
当細胞の排除や、神経栄養因子の除去による神経細胞死
もアポトーシスによることが示唆されている。
【０００５】また、アポトーシスは、このような生理的
な細胞死だけでなく、放射線照射を受けた細胞や、ウイ
ルス感染した細胞の細胞死にも見られる。さらにＡＩＤ
ＳウイルスによるＴ細胞の減少もアポトーシスによる細
胞死が原因であることが報告され、注目を集めている。
この他に、薬物や毒物の投与、熱といった化学的および
物理的刺激によってもアポトーシスが起こる。さらにア
ルツハイマー病等の神経変性疾患における神経細胞死、
癌病巣内での腫瘍細胞の自然消失や制癌剤による細胞死
にもアポトーシスが関与していることが明らかになって
いる。
な細胞死だけでなく、放射線照射を受けた細胞や、ウイ
ルス感染した細胞の細胞死にも見られる。さらにＡＩＤ
ＳウイルスによるＴ細胞の減少もアポトーシスによる細
胞死が原因であることが報告され、注目を集めている。
この他に、薬物や毒物の投与、熱といった化学的および
物理的刺激によってもアポトーシスが起こる。さらにア
ルツハイマー病等の神経変性疾患における神経細胞死、
癌病巣内での腫瘍細胞の自然消失や制癌剤による細胞死
にもアポトーシスが関与していることが明らかになって
いる。
【０００６】したがって、アポトーシスの分子機構を解
明することは、個体発生及び発癌の制御（調整）におけ
る細胞死の生化学的意義、役割を理解する上に重要であ
る。
明することは、個体発生及び発癌の制御（調整）におけ
る細胞死の生化学的意義、役割を理解する上に重要であ
る。
【０００７】アポトーシスに共通する特徴的な現象は、
細胞膜の変化（微絨毛の消失）を伴う細胞の縮小、クロ
マチンの凝縮等といった形態上の変化およびクロマチン
ＤＮＡの断片化である〔Br. J Cancer 26, 239-257 (19
72) 、Nature 284, 555-556(1980) 〕。中でもクロマチ
ンＤＮＡのヌクレオソーム単位での断片化（図１）は、
アポトーシスの発生要因等の多様性にかかわらず、いず
れのアポトーシス細胞にも共通して見られる最も顕著な
現象であり、このことからアポトーシスのカスケードは
クロマチンＤＮＡの断片化というプロセスに収束するこ
とが示唆されている。
細胞膜の変化（微絨毛の消失）を伴う細胞の縮小、クロ
マチンの凝縮等といった形態上の変化およびクロマチン
ＤＮＡの断片化である〔Br. J Cancer 26, 239-257 (19
72) 、Nature 284, 555-556(1980) 〕。中でもクロマチ
ンＤＮＡのヌクレオソーム単位での断片化（図１）は、
アポトーシスの発生要因等の多様性にかかわらず、いず
れのアポトーシス細胞にも共通して見られる最も顕著な
現象であり、このことからアポトーシスのカスケードは
クロマチンＤＮＡの断片化というプロセスに収束するこ
とが示唆されている。
【０００８】従来から、当該アポトーシスで生じるクロ
マチンＤＮＡの切断が、Ｚｎ2+感受性の、内在性Ｃａ2+
依存性エンドヌクレアーゼによって触媒されることが示
唆されている〔J. Immunol. 132, 38-42 (1984) 、J. B
iol. Chem. 266, 18580-18585 (1991)、 EMBO J. 12, 3
71-377 (1993) 、Biochemistry 32, 9129-9136 (1993)
等〕。かかる示唆のもと、最近、胸腺や培養細胞から、
アポトーシスに関わる酵素の候補として考えられる数種
のエンドヌクレアーゼ（Ｎｕｃ１８、ＤＮａｓｅＩ、Ｄ
ＮａｓｅII）が精製されている〔Biochem. Biophys. Re
s. Commun. 39, 254-259 (1970) 、J. Biol. Chem. 26
6, 18580-18585 (1991)、 EMBO J. 12, 371-377(1993)
、Arch. Biochem. Biophys. 300, 440-450 (1993)
等〕。しかしながら、かかる酵素は正常な状態の細胞か
ら精製されたものであり、該酵素が実際にアポトーシス
に関与しているか否かについての確かな証拠はまだ得ら
れていない。
マチンＤＮＡの切断が、Ｚｎ2+感受性の、内在性Ｃａ2+
依存性エンドヌクレアーゼによって触媒されることが示
唆されている〔J. Immunol. 132, 38-42 (1984) 、J. B
iol. Chem. 266, 18580-18585 (1991)、 EMBO J. 12, 3
71-377 (1993) 、Biochemistry 32, 9129-9136 (1993)
等〕。かかる示唆のもと、最近、胸腺や培養細胞から、
アポトーシスに関わる酵素の候補として考えられる数種
のエンドヌクレアーゼ（Ｎｕｃ１８、ＤＮａｓｅＩ、Ｄ
ＮａｓｅII）が精製されている〔Biochem. Biophys. Re
s. Commun. 39, 254-259 (1970) 、J. Biol. Chem. 26
6, 18580-18585 (1991)、 EMBO J. 12, 371-377(1993)
、Arch. Biochem. Biophys. 300, 440-450 (1993)
等〕。しかしながら、かかる酵素は正常な状態の細胞か
ら精製されたものであり、該酵素が実際にアポトーシス
に関与しているか否かについての確かな証拠はまだ得ら
れていない。
【０００９】従って、アポトーシスのクロマチンＤＮＡ
の断片化に関与するエンドヌクレアーゼおよびその制御
機構の解明は、アポトーシスの分子機構の全容、さらに
は細胞生存および細胞死のメカニズムを理解するうえで
極めて重要である。さらには、アポトーシスが関与する
癌、自己免疫疾患、ＡＩＤＳ等の疾患の診断、予防もし
くは治療薬を開発する手立てとなる点で有用である。
の断片化に関与するエンドヌクレアーゼおよびその制御
機構の解明は、アポトーシスの分子機構の全容、さらに
は細胞生存および細胞死のメカニズムを理解するうえで
極めて重要である。さらには、アポトーシスが関与する
癌、自己免疫疾患、ＡＩＤＳ等の疾患の診断、予防もし
くは治療薬を開発する手立てとなる点で有用である。
【００１０】
【課題を解決するための手段】本発明者らは、アポトー
シスに関与するエンドヌクレアーゼを研究していたとこ
ろ、ラット胸腺細胞の核画分に、クロマチンＤＮＡのリ
ンカー部位を選択的に切断し、アポトーシスに特徴的な
ＤＮＡ断片化を起こす新規なエンドヌクレアーゼを３種
類見出した。そして、これら３種のエンドヌクレアーゼ
を単離精製し、さらなる研究遂行の結果、そのうちの一
つが、アポトーシスのクロマチンＤＮＡの断片化に関与
するエンドヌクレアーゼであることを確認し、さらに該
エンドヌクレアーゼの一次構造及びその遺伝子の塩基配
列を決定、取得することに成功して本発明を完成した。
シスに関与するエンドヌクレアーゼを研究していたとこ
ろ、ラット胸腺細胞の核画分に、クロマチンＤＮＡのリ
ンカー部位を選択的に切断し、アポトーシスに特徴的な
ＤＮＡ断片化を起こす新規なエンドヌクレアーゼを３種
類見出した。そして、これら３種のエンドヌクレアーゼ
を単離精製し、さらなる研究遂行の結果、そのうちの一
つが、アポトーシスのクロマチンＤＮＡの断片化に関与
するエンドヌクレアーゼであることを確認し、さらに該
エンドヌクレアーゼの一次構造及びその遺伝子の塩基配
列を決定、取得することに成功して本発明を完成した。
【００１１】すなわち本発明は次に述べるものである。 （１）クロマチンＤＮＡのリンカー部位を選択的に切断
し得るエンドヌクレアーゼであって、かつ下記性状を有
することを特徴とする新規ＤＮａｓｅ（以下、ＤＮａｓ
ｅγという）。 局在性 ： 細胞核 分子量 ： (i) ３３，０００ （ＳＤＳ−ＰＡＧＥ） (ii) ３１，０００ （ゲル濾過法） 至適ｐＨ： ７．２ ２価陽イオン要求性： Ｃａ2+／Ｍｇ2+，Ｍｎ2+依存性 Ｚｎ2+による阻害 ： ＩＣ50＝４０μＭ ＤＮＡ切断様式 ： ３’−ＯＨ，５’−Ｐ末端生成型 （２）クロマチンＤＮＡのリンカー部位を選択的に切断
し得るエンドヌクレアーゼであって、かつ下記性状を有
することを特徴とする新規ＤＮａｓｅ（以下、ＤＮａｓ
ｅαという）。 局在性 ： 細胞核 分子量 ： (i) ３２，０００ （ＳＤＳ−ＰＡＧＥ） (ii) ２８，０００ （ゲル濾過法） 至適ｐＨ： ５．６ ２価陽イオン要求性： 非依存性 Ｚｎ2+による阻害 ： ＩＣ50＞１ｍＭ ＤＮＡ切断様式 ： ３’−Ｐ，５’−ＯＨ末端生成型 （３）クロマチンＤＮＡのリンカー部位を選択的に切断
し得るエンドヌクレアーゼであって、かつ下記性状を有
することを特徴とする新規ＤＮａｓｅ（以下、ＤＮａｓ
ｅβという）。 局在性 ： 細胞核 分子量 ： (i) ３２，０００ （ＳＤＳ−ＰＡＧＥ） (ii) ３０，０００ （ゲル濾過法） 至適ｐＨ： ５．６ ２価陽イオン要求性： 非依存性 Ｚｎ2+による阻害 ： ＩＣ50＞１ｍＭ ＤＮＡ切断様式 ： ３’−Ｐ，５’−ＯＨ末端生成型 （４）実質的に、配列表配列番号１に示されるアミノ酸
配列（アミノ酸番号２６〜３１０）を有する上記（１）
記載の新規ＤＮａｓｅ。 （５）前駆体ポリペプチドが、Ｎ末端プリカーサーペプ
チド領域を有する上記（１）記載の新規ＤＮａｓｅ。 （６）Ｎ末端プリカーサーペプチド領域として、実質的
に配列表配列番号１に示されるアミノ酸配列（アミノ酸
番号１〜２５）を有する上記（４）記載の新規ＤＮａｓ
ｅ。 （７）上記（１）又は（４）〜（６）のいずれかに記載
のＤＮａｓｅをコードする塩基配列を有するＤＮＡ。好
ましくは、配列表配列番号２記載の塩基配列（塩基番号
８７〜９４１）を有するＤＮＡ、より好ましくは、配列
表配列番号２記載の塩基配列（塩基番号１〜９４１）を
有するＤＮＡ。 （８）上記（７）のＤＮＡを含有する組換えベクター。 （９）上記（８）の組換えベクターで形質転換された宿
主細胞。 （１０）上記（９）の宿主細胞を培養し、得られる培養
物から採取されることを特徴とする上記（１）又は
（４）〜（６）のいずれかに記載のＤＮａｓｅの製造方
法。 （１１）実質的に配列表配列番号１記載のアミノ酸配列
（アミノ酸番号１〜３１０）の全部又は一部を有するペ
プチドに親和性を示す抗体。
し得るエンドヌクレアーゼであって、かつ下記性状を有
することを特徴とする新規ＤＮａｓｅ（以下、ＤＮａｓ
ｅγという）。 局在性 ： 細胞核 分子量 ： (i) ３３，０００ （ＳＤＳ−ＰＡＧＥ） (ii) ３１，０００ （ゲル濾過法） 至適ｐＨ： ７．２ ２価陽イオン要求性： Ｃａ2+／Ｍｇ2+，Ｍｎ2+依存性 Ｚｎ2+による阻害 ： ＩＣ50＝４０μＭ ＤＮＡ切断様式 ： ３’−ＯＨ，５’−Ｐ末端生成型 （２）クロマチンＤＮＡのリンカー部位を選択的に切断
し得るエンドヌクレアーゼであって、かつ下記性状を有
することを特徴とする新規ＤＮａｓｅ（以下、ＤＮａｓ
ｅαという）。 局在性 ： 細胞核 分子量 ： (i) ３２，０００ （ＳＤＳ−ＰＡＧＥ） (ii) ２８，０００ （ゲル濾過法） 至適ｐＨ： ５．６ ２価陽イオン要求性： 非依存性 Ｚｎ2+による阻害 ： ＩＣ50＞１ｍＭ ＤＮＡ切断様式 ： ３’−Ｐ，５’−ＯＨ末端生成型 （３）クロマチンＤＮＡのリンカー部位を選択的に切断
し得るエンドヌクレアーゼであって、かつ下記性状を有
することを特徴とする新規ＤＮａｓｅ（以下、ＤＮａｓ
ｅβという）。 局在性 ： 細胞核 分子量 ： (i) ３２，０００ （ＳＤＳ−ＰＡＧＥ） (ii) ３０，０００ （ゲル濾過法） 至適ｐＨ： ５．６ ２価陽イオン要求性： 非依存性 Ｚｎ2+による阻害 ： ＩＣ50＞１ｍＭ ＤＮＡ切断様式 ： ３’−Ｐ，５’−ＯＨ末端生成型 （４）実質的に、配列表配列番号１に示されるアミノ酸
配列（アミノ酸番号２６〜３１０）を有する上記（１）
記載の新規ＤＮａｓｅ。 （５）前駆体ポリペプチドが、Ｎ末端プリカーサーペプ
チド領域を有する上記（１）記載の新規ＤＮａｓｅ。 （６）Ｎ末端プリカーサーペプチド領域として、実質的
に配列表配列番号１に示されるアミノ酸配列（アミノ酸
番号１〜２５）を有する上記（４）記載の新規ＤＮａｓ
ｅ。 （７）上記（１）又は（４）〜（６）のいずれかに記載
のＤＮａｓｅをコードする塩基配列を有するＤＮＡ。好
ましくは、配列表配列番号２記載の塩基配列（塩基番号
８７〜９４１）を有するＤＮＡ、より好ましくは、配列
表配列番号２記載の塩基配列（塩基番号１〜９４１）を
有するＤＮＡ。 （８）上記（７）のＤＮＡを含有する組換えベクター。 （９）上記（８）の組換えベクターで形質転換された宿
主細胞。 （１０）上記（９）の宿主細胞を培養し、得られる培養
物から採取されることを特徴とする上記（１）又は
（４）〜（６）のいずれかに記載のＤＮａｓｅの製造方
法。 （１１）実質的に配列表配列番号１記載のアミノ酸配列
（アミノ酸番号１〜３１０）の全部又は一部を有するペ
プチドに親和性を示す抗体。
【００１２】以下、本発明を詳細に説明する。アポトー
シスに関与するエンドヌクレアーゼを同定するためのア
プローチは、アポトーシス細胞で見られるクロマチンＤ
ＮＡの各断片の性質とアポトーシス細胞の核から精製し
たエンドヌクレアーゼによって断片化されたＤＮＡの断
片の性質とを比較することである。
シスに関与するエンドヌクレアーゼを同定するためのア
プローチは、アポトーシス細胞で見られるクロマチンＤ
ＮＡの各断片の性質とアポトーシス細胞の核から精製し
たエンドヌクレアーゼによって断片化されたＤＮＡの断
片の性質とを比較することである。
【００１３】アポトーシス細胞で生じるクロマチンＤＮ
Ａの断片は、アポトーシスの進行時間に比例してヌクレ
オソーム単量体，二量体といった短いＤＮＡ断片の比率
が増加していくが、完全に単量体に至るまで進行するわ
けではなく、ある程度の状態で停止する。従って、アポ
トーシスをおこした細胞からＤＮＡを抽出してアガロー
スゲル電気泳動法によりＤＮＡを解析すると、そのＤＮ
Ａ泳動像はヌクレオソーム単量体に含まれるＤＮＡ（約
１８０塩基対）の整数倍の長さの断片としてはしご状に
観察される。また、アポトーシスで生じるＤＮＡの断片
化は、Ｃａ2+／Ｍｇ2+依存性で、Ｚｎ2+により阻害され
る。さらに、産生されるＤＮＡ断片は、いずれも５’末
端側にリン酸基を有する３’−ＯＨ／５’−Ｐ型２本鎖
である。
Ａの断片は、アポトーシスの進行時間に比例してヌクレ
オソーム単量体，二量体といった短いＤＮＡ断片の比率
が増加していくが、完全に単量体に至るまで進行するわ
けではなく、ある程度の状態で停止する。従って、アポ
トーシスをおこした細胞からＤＮＡを抽出してアガロー
スゲル電気泳動法によりＤＮＡを解析すると、そのＤＮ
Ａ泳動像はヌクレオソーム単量体に含まれるＤＮＡ（約
１８０塩基対）の整数倍の長さの断片としてはしご状に
観察される。また、アポトーシスで生じるＤＮＡの断片
化は、Ｃａ2+／Ｍｇ2+依存性で、Ｚｎ2+により阻害され
る。さらに、産生されるＤＮＡ断片は、いずれも５’末
端側にリン酸基を有する３’−ＯＨ／５’−Ｐ型２本鎖
である。
【００１４】（ａ）本発明ＤＮａｓｅγについて 本発明のＤＮａｓｅγは、動物細胞の核、好ましくはラ
ット，子ウシ等哺乳類の胸腺、脾臓または肝臓に由来す
る細胞核、より好ましくは子ウシ胸腺またはラット脾臓
由来の細胞の核に存在するエンドヌクレアーゼである。
また当該ＤＮａｓｅγは、アポトーシスの誘導の有無に
かかわらず、正常細胞の核にもアポトーシス細胞の核に
も共に同程度の活性をもって存在する。この点、該ＤＮ
ａｓｅγは、アポトーシス誘導によって活性が消失する
本発明ＤＮａｓｅαおよびＤＮａｓｅβと相違する。な
お、ここでいうアポトーシスは、その発生要因により特
に限定されることなく、自然発生的アポトーシスのみな
らず、放射線照射やグルココルチコイド処理等により人
為的に生じるアポトーシスも広く包含される。
ット，子ウシ等哺乳類の胸腺、脾臓または肝臓に由来す
る細胞核、より好ましくは子ウシ胸腺またはラット脾臓
由来の細胞の核に存在するエンドヌクレアーゼである。
また当該ＤＮａｓｅγは、アポトーシスの誘導の有無に
かかわらず、正常細胞の核にもアポトーシス細胞の核に
も共に同程度の活性をもって存在する。この点、該ＤＮ
ａｓｅγは、アポトーシス誘導によって活性が消失する
本発明ＤＮａｓｅαおよびＤＮａｓｅβと相違する。な
お、ここでいうアポトーシスは、その発生要因により特
に限定されることなく、自然発生的アポトーシスのみな
らず、放射線照射やグルココルチコイド処理等により人
為的に生じるアポトーシスも広く包含される。
【００１５】また、本発明のＤＮａｓｅγは、ドデシル
硫酸ナトリウム−ポリアクリルアミドゲル電気泳動法
（以下、ＳＤＳ−ＰＡＧＥという）により約３３，００
０の分子量を示し、ゲル濾過クロマトグラフィーにより
約３１，０００の分子量を示す単量体ポリペプチドであ
る。なお、ＳＤＳ−ＰＡＧＥの好ましい態様は後の実施
例２（１）において引用する参考例４に、およびゲル濾
過クロマトグラフィーの好ましい態様は後の実施例２
（１）に詳述する。
硫酸ナトリウム−ポリアクリルアミドゲル電気泳動法
（以下、ＳＤＳ−ＰＡＧＥという）により約３３，００
０の分子量を示し、ゲル濾過クロマトグラフィーにより
約３１，０００の分子量を示す単量体ポリペプチドであ
る。なお、ＳＤＳ−ＰＡＧＥの好ましい態様は後の実施
例２（１）において引用する参考例４に、およびゲル濾
過クロマトグラフィーの好ましい態様は後の実施例２
（１）に詳述する。
【００１６】本発明のＤＮａｓｅγは、クロマチンＤＮ
Ａのリンカー部位を選択的に切断して、５’末端側にリ
ン酸基をもつモノまたはオリゴヌクレオソームを生成す
る（５’−Ｐ／３’−ＯＨ生成型）ＤＮａｓｅである。
当該ＤＮａｓｅ活性に最適なｐＨ条件は、中性ｐＨ、好
ましくはＭＯＰＳ−ＮａＯＨ緩衝液またはトリス塩酸中
でｐＨ約６．８〜約７．６、より好ましくはｐＨ約７．
２である。また、当該ＤＮａｓｅγの活性化には、Ｃａ
2+及びＭｇ2+の両者、またはＭｎ2+単独の少なくともい
ずれかの存在を必要とする（なお、本発明において、Ｃ
ａ2+／Ｍｇ2+，Ｍｎ2+依存性と略す）。当該Ｃａ2+、Ｍ
ｇ2+またはＭｎ2+の濃度は、それぞれ１〜３ｍＭ、好ま
しくはそれぞれ３ｍＭである。より好ましくは、３ｍＭ
濃度のＣａ2+及び３ｍＭ濃度のＭｇ2+の両者が存在する
ことである。さらに、ＤＮａｓｅγの活性は、アポトー
シスを阻害することが知られているマイクロモル濃度の
Ｚｎ2+に対して感受性を示し、４０μＭという低濃度の
Ｚｎ2+により活性の５０％が阻害される（ＩＣ50＝４０
μＭ）。また、ＤＮａｓｅおよびＲＮａｓｅの阻害剤で
あるオウリントリカルボン酸１００μＭで完全に活性が
阻害される。しかしながら、当該ＤＮａｓｅγの活性
は、ＤＮａｓｅＩを阻害することが知られているＧ−ア
クチンによっては阻害されない。
Ａのリンカー部位を選択的に切断して、５’末端側にリ
ン酸基をもつモノまたはオリゴヌクレオソームを生成す
る（５’−Ｐ／３’−ＯＨ生成型）ＤＮａｓｅである。
当該ＤＮａｓｅ活性に最適なｐＨ条件は、中性ｐＨ、好
ましくはＭＯＰＳ−ＮａＯＨ緩衝液またはトリス塩酸中
でｐＨ約６．８〜約７．６、より好ましくはｐＨ約７．
２である。また、当該ＤＮａｓｅγの活性化には、Ｃａ
2+及びＭｇ2+の両者、またはＭｎ2+単独の少なくともい
ずれかの存在を必要とする（なお、本発明において、Ｃ
ａ2+／Ｍｇ2+，Ｍｎ2+依存性と略す）。当該Ｃａ2+、Ｍ
ｇ2+またはＭｎ2+の濃度は、それぞれ１〜３ｍＭ、好ま
しくはそれぞれ３ｍＭである。より好ましくは、３ｍＭ
濃度のＣａ2+及び３ｍＭ濃度のＭｇ2+の両者が存在する
ことである。さらに、ＤＮａｓｅγの活性は、アポトー
シスを阻害することが知られているマイクロモル濃度の
Ｚｎ2+に対して感受性を示し、４０μＭという低濃度の
Ｚｎ2+により活性の５０％が阻害される（ＩＣ50＝４０
μＭ）。また、ＤＮａｓｅおよびＲＮａｓｅの阻害剤で
あるオウリントリカルボン酸１００μＭで完全に活性が
阻害される。しかしながら、当該ＤＮａｓｅγの活性
は、ＤＮａｓｅＩを阻害することが知られているＧ−ア
クチンによっては阻害されない。
【００１７】本発明のＤＮａｓｅγは、動物組織または
細胞を原料として、その細胞核から抽出精製する方法、
化学的合成による方法または遺伝子組換え技術等の公知
手法を適宜用いることによって製造することができる。
具体的には、下記の方法が例示される。ラット、子ウシ
等哺乳類の胸腺、脾臓または肝臓由来の細胞、好ましく
はラットまたは子ウシの胸腺又は脾臓由来の細胞を原料
として、その細胞から非イオン性界面活性剤の存在下で
中性領域、好ましくはｐＨ約７．８の緩衝液を用いてホ
モジネートすることにより細胞核を単離する。ついで得
られた単離核を硫酸アンモニウムの存在下（好適な態様
としては、０．４〜０．５Ｍの濃度の硫酸アンモニウム
の使用が挙げられる。）で、必要により超音波処理する
ことにより可溶化して、遠心処理により上清画分を得
る。得られた上清画分を陽イオン交換体、好ましくは強
酸性陽イオン交換体を担体とするカラムクロマトグラフ
ィーにかけ、塩濃度による直線グラジェント法により展
開させて、溶出した活性画分を取得する。ついで該活性
画分をさらに陽イオン交換体、好ましくは弱酸性陽イオ
ン交換体を担体とする高速液体クロマトグラフィー（以
下、ＨＰＬＣという）にかけ、同様に塩濃度による直線
グラジェント法により展開させる。この際、カラムとし
てＣＭ５ＰＷカラム（５ｍｍ Ｉ．Ｄ．×５０ｍｍ；東
ソー社製）を、また溶離液として１ｍＭ ２−メルカプ
トエタノール、０．１ｍＭ ＰＭＳＦおよび１０％エチ
レングリコールを含有する２０ｍＭ トリス塩酸緩衝液
（ｐＨ７．８）を用いてＫＣｌの濃度勾配法で展開した
場合、本発明のＤＮａｓｅγはＫＣｌ濃度約０．５５Ｍ
の位置に溶出される。ついで、該溶出活性画分をヘパリ
ンカラムによるＨＰＬＣ、ゲル濾過ＨＰＬＣまたは陽イ
オン交換体によるＨＰＬＣなどの公知精製クロマトグラ
フィーを適宜組み合わせることにより、より一層高度に
精製された単量体のＤＮａｓｅγを取得することができ
る。かくして得られたＤＮａｓｅγは、さらに透析、遠
心分離、凍結乾燥等を施すことができる。
細胞を原料として、その細胞核から抽出精製する方法、
化学的合成による方法または遺伝子組換え技術等の公知
手法を適宜用いることによって製造することができる。
具体的には、下記の方法が例示される。ラット、子ウシ
等哺乳類の胸腺、脾臓または肝臓由来の細胞、好ましく
はラットまたは子ウシの胸腺又は脾臓由来の細胞を原料
として、その細胞から非イオン性界面活性剤の存在下で
中性領域、好ましくはｐＨ約７．８の緩衝液を用いてホ
モジネートすることにより細胞核を単離する。ついで得
られた単離核を硫酸アンモニウムの存在下（好適な態様
としては、０．４〜０．５Ｍの濃度の硫酸アンモニウム
の使用が挙げられる。）で、必要により超音波処理する
ことにより可溶化して、遠心処理により上清画分を得
る。得られた上清画分を陽イオン交換体、好ましくは強
酸性陽イオン交換体を担体とするカラムクロマトグラフ
ィーにかけ、塩濃度による直線グラジェント法により展
開させて、溶出した活性画分を取得する。ついで該活性
画分をさらに陽イオン交換体、好ましくは弱酸性陽イオ
ン交換体を担体とする高速液体クロマトグラフィー（以
下、ＨＰＬＣという）にかけ、同様に塩濃度による直線
グラジェント法により展開させる。この際、カラムとし
てＣＭ５ＰＷカラム（５ｍｍ Ｉ．Ｄ．×５０ｍｍ；東
ソー社製）を、また溶離液として１ｍＭ ２−メルカプ
トエタノール、０．１ｍＭ ＰＭＳＦおよび１０％エチ
レングリコールを含有する２０ｍＭ トリス塩酸緩衝液
（ｐＨ７．８）を用いてＫＣｌの濃度勾配法で展開した
場合、本発明のＤＮａｓｅγはＫＣｌ濃度約０．５５Ｍ
の位置に溶出される。ついで、該溶出活性画分をヘパリ
ンカラムによるＨＰＬＣ、ゲル濾過ＨＰＬＣまたは陽イ
オン交換体によるＨＰＬＣなどの公知精製クロマトグラ
フィーを適宜組み合わせることにより、より一層高度に
精製された単量体のＤＮａｓｅγを取得することができ
る。かくして得られたＤＮａｓｅγは、さらに透析、遠
心分離、凍結乾燥等を施すことができる。
【００１８】本発明のＤＮａｓｅγは、当該酵素による
ＤＮＡ断片の切断様式とアポトーシスを起こしたラット
胸腺又は脾臓細胞で産生されるＤＮＡ断片の切断様式と
が一致すること、イオン依存性において類似すること、
および当該酵素がアポトーシスを起こしたラット胸腺又
は脾臓細胞核に存在していること等から、胸腺又は脾
臓、特にラット胸腺又は脾臓でのアポトーシスのＤＮＡ
断片化に関与する酵素であると考えられる。当該ＤＮａ
ｓｅγは、ヒトを含む哺乳動物（ウシ、ウマ、マウス、
ラット、モルモット、ウサギ等）で生じるアポトーシス
を分子レベルで解明するツールの一つとして、またＤＮ
ａｓｅγの抗体を用いた診断薬またはＤＮａｓｅγの阻
害剤および活性化剤によるアポトーシス制御性医薬品の
開発、アポトーシスの評価法またはＤＮａｓｅγの遺伝
子を用いた癌や自己免疫疾患のアポトーシス遺伝子療法
等を確立するための基盤として有用である。
ＤＮＡ断片の切断様式とアポトーシスを起こしたラット
胸腺又は脾臓細胞で産生されるＤＮＡ断片の切断様式と
が一致すること、イオン依存性において類似すること、
および当該酵素がアポトーシスを起こしたラット胸腺又
は脾臓細胞核に存在していること等から、胸腺又は脾
臓、特にラット胸腺又は脾臓でのアポトーシスのＤＮＡ
断片化に関与する酵素であると考えられる。当該ＤＮａ
ｓｅγは、ヒトを含む哺乳動物（ウシ、ウマ、マウス、
ラット、モルモット、ウサギ等）で生じるアポトーシス
を分子レベルで解明するツールの一つとして、またＤＮ
ａｓｅγの抗体を用いた診断薬またはＤＮａｓｅγの阻
害剤および活性化剤によるアポトーシス制御性医薬品の
開発、アポトーシスの評価法またはＤＮａｓｅγの遺伝
子を用いた癌や自己免疫疾患のアポトーシス遺伝子療法
等を確立するための基盤として有用である。
【００１９】（ｂ）本発明ＤＮａｓｅαについて 本発明のＤＮａｓｅαは、動物細胞の核、好ましくはラ
ット，子ウシ等哺乳類の胸腺、脾臓または肝臓に由来す
る細胞核、より好ましくは子ウシ胸腺またはラット脾臓
由来の細胞の核に存在するエンドヌクレアーゼである。
また当該ＤＮａｓｅαは、正常細胞の核に存在し、アポ
トーシス細胞の核には殆ど存在しない。
ット，子ウシ等哺乳類の胸腺、脾臓または肝臓に由来す
る細胞核、より好ましくは子ウシ胸腺またはラット脾臓
由来の細胞の核に存在するエンドヌクレアーゼである。
また当該ＤＮａｓｅαは、正常細胞の核に存在し、アポ
トーシス細胞の核には殆ど存在しない。
【００２０】また、本発明のＤＮａｓｅαは、ＳＤＳ−
ＰＡＧＥにより約３２，０００の分子量を示し、ゲル濾
過クロマトグラフィーにより約２８，０００の分子量を
示す単量体ポリペプチドである。なお、ＳＤＳ−ＰＡＧ
Ｅの好ましい態様は実施例２（１）において引用する参
考例４に、およびゲル濾過クロマトグラフィーの好まし
い態様は実施例２（１）に詳述する。
ＰＡＧＥにより約３２，０００の分子量を示し、ゲル濾
過クロマトグラフィーにより約２８，０００の分子量を
示す単量体ポリペプチドである。なお、ＳＤＳ−ＰＡＧ
Ｅの好ましい態様は実施例２（１）において引用する参
考例４に、およびゲル濾過クロマトグラフィーの好まし
い態様は実施例２（１）に詳述する。
【００２１】本発明ＤＮａｓｅαは、クロマチンＤＮＡ
のリンカー部位を選択的に切断して、３’末端側にリン
酸基をもつオリゴヌクレオソームを生成する（３’−Ｐ
／５’−ＯＨ生成型）ＤＮａｓｅである。当該ＤＮａｓ
ｅ活性に最適なｐＨ条件は、弱酸性ｐＨ、好ましくは酢
酸−ＫＯＨ緩衝液またはＭＥＳ−ＮａＯＨ緩衝液中でｐ
Ｈ約５．４〜約６．０、より好ましくはｐＨ約５．６で
ある。また、当該ＤＮａｓｅαの活性は、Ｃａ2+、Ｍｇ
2+及びＭｎ2+などの二価の金属イオンの存在の有無に影
響されない。さらにＺｎ2+にも非感受性であり活性を約
５０％阻害する濃度は１ｍＭ以上である。また、ＤＮａ
ｓｅおよびＲＮａｓｅの阻害剤であるオウリントリカル
ボン酸１００μＭで完全に活性が阻害される。しかしな
がら、本ＤＮａｓｅαの活性は、Ｇ−アクチンによって
は阻害されない。
のリンカー部位を選択的に切断して、３’末端側にリン
酸基をもつオリゴヌクレオソームを生成する（３’−Ｐ
／５’−ＯＨ生成型）ＤＮａｓｅである。当該ＤＮａｓ
ｅ活性に最適なｐＨ条件は、弱酸性ｐＨ、好ましくは酢
酸−ＫＯＨ緩衝液またはＭＥＳ−ＮａＯＨ緩衝液中でｐ
Ｈ約５．４〜約６．０、より好ましくはｐＨ約５．６で
ある。また、当該ＤＮａｓｅαの活性は、Ｃａ2+、Ｍｇ
2+及びＭｎ2+などの二価の金属イオンの存在の有無に影
響されない。さらにＺｎ2+にも非感受性であり活性を約
５０％阻害する濃度は１ｍＭ以上である。また、ＤＮａ
ｓｅおよびＲＮａｓｅの阻害剤であるオウリントリカル
ボン酸１００μＭで完全に活性が阻害される。しかしな
がら、本ＤＮａｓｅαの活性は、Ｇ−アクチンによって
は阻害されない。
【００２２】本発明のＤＮａｓｅαは、動物組織または
細胞を原料として抽出精製する方法、化学的合成による
方法または遺伝子組換え技術等公知手法を適宜用いるこ
とによって製造することができる。具体的には、下記の
方法が例示される。まず、ラット胸腺由来の細胞から非
イオン性界面活性剤の存在下で中性領域、好ましくはｐ
Ｈ約７．８の緩衝液を用いてホモジネートすることによ
り細胞核を単離する。ついで、硫酸アンモニウムの存在
下（好適な態様としては、０．１５〜０．２５Ｍの硫酸
アンモニウムの使用が挙げられる）で、必要により超音
波処理することにより可溶化して、遠心処理により上清
画分を得る。得られた上清画分を陽イオン交換体、好ま
しくは強酸性陽イオン交換体を担体とするカラムクロマ
トグラフィーにかけ、塩濃度による直線グラジェント法
により展開させて、溶出した活性画分を取得する。つい
で該活性画分をさらに陽イオン交換体、好ましくは弱酸
性陽イオン交換体を担体とするＨＰＬＣにかけ、同様に
塩濃度による直線グラジェント法により展開させる。こ
の際、カラムとしてＣＭ５ＰＷカラム（５ｍｍ Ｉ．
Ｄ．×５０ｍｍ；東ソー社製）を、また溶離液として１
ｍＭ ２−メルカプトエタノール、０．１ｍＭ ＰＭＳ
Ｆおよび１０％エチレングリコールを含有する２０ｍＭ
トリス塩酸緩衝液（ｐＨ７．８）を用いてＫＣｌでグ
ラジェントをかけた場合、本発明のＤＮａｓｅαはＫＣ
ｌ濃度約０．２５Ｍ付近の位置に溶出される。ついで、
該溶出活性画分をヘパリンカラムによるＨＰＬＣ、ゲル
濾過ＨＰＬＣおよび陽イオン交換ＨＰＬＣなど公知精製
クロマトグラフィーを適宜組み合わせることにより、よ
り一層高度に精製された単量体のＤＮａｓｅαを取得す
ることができる。かくして得られたＤＮａｓｅαは、さ
らに透析、遠心分離、凍結乾燥等を施すことができる。
細胞を原料として抽出精製する方法、化学的合成による
方法または遺伝子組換え技術等公知手法を適宜用いるこ
とによって製造することができる。具体的には、下記の
方法が例示される。まず、ラット胸腺由来の細胞から非
イオン性界面活性剤の存在下で中性領域、好ましくはｐ
Ｈ約７．８の緩衝液を用いてホモジネートすることによ
り細胞核を単離する。ついで、硫酸アンモニウムの存在
下（好適な態様としては、０．１５〜０．２５Ｍの硫酸
アンモニウムの使用が挙げられる）で、必要により超音
波処理することにより可溶化して、遠心処理により上清
画分を得る。得られた上清画分を陽イオン交換体、好ま
しくは強酸性陽イオン交換体を担体とするカラムクロマ
トグラフィーにかけ、塩濃度による直線グラジェント法
により展開させて、溶出した活性画分を取得する。つい
で該活性画分をさらに陽イオン交換体、好ましくは弱酸
性陽イオン交換体を担体とするＨＰＬＣにかけ、同様に
塩濃度による直線グラジェント法により展開させる。こ
の際、カラムとしてＣＭ５ＰＷカラム（５ｍｍ Ｉ．
Ｄ．×５０ｍｍ；東ソー社製）を、また溶離液として１
ｍＭ ２−メルカプトエタノール、０．１ｍＭ ＰＭＳ
Ｆおよび１０％エチレングリコールを含有する２０ｍＭ
トリス塩酸緩衝液（ｐＨ７．８）を用いてＫＣｌでグ
ラジェントをかけた場合、本発明のＤＮａｓｅαはＫＣ
ｌ濃度約０．２５Ｍ付近の位置に溶出される。ついで、
該溶出活性画分をヘパリンカラムによるＨＰＬＣ、ゲル
濾過ＨＰＬＣおよび陽イオン交換ＨＰＬＣなど公知精製
クロマトグラフィーを適宜組み合わせることにより、よ
り一層高度に精製された単量体のＤＮａｓｅαを取得す
ることができる。かくして得られたＤＮａｓｅαは、さ
らに透析、遠心分離、凍結乾燥等を施すことができる。
【００２３】本発明のＤＮａｓｅαは、ヒトを含む哺乳
動物（ウシ、ウマ、マウス、ラット、モルモット、ウサ
ギ等）で生じるＤＮＡ切断様式の解析試薬として、また
当該酵素はウイルスＤＮＡを３’−Ｐ／５’−ＯＨ生成
型に切断することから抗ウイルス剤を開発するための基
盤となる点で有用である。
動物（ウシ、ウマ、マウス、ラット、モルモット、ウサ
ギ等）で生じるＤＮＡ切断様式の解析試薬として、また
当該酵素はウイルスＤＮＡを３’−Ｐ／５’−ＯＨ生成
型に切断することから抗ウイルス剤を開発するための基
盤となる点で有用である。
【００２４】（ｃ）本発明ＤＮａｓｅβについて 本発明のＤＮａｓｅβは、動物細胞の核、好ましくはラ
ット，子ウシ等哺乳類の胸腺、脾臓または肝臓に由来す
る細胞核、より好ましくは子ウシ胸腺またはラット脾臓
由来の細胞の核に存在するエンドヌクレアーゼである。
また当該ＤＮａｓｅβは、正常細胞の核に存在し、アポ
トーシス細胞の核には殆ど存在しない。
ット，子ウシ等哺乳類の胸腺、脾臓または肝臓に由来す
る細胞核、より好ましくは子ウシ胸腺またはラット脾臓
由来の細胞の核に存在するエンドヌクレアーゼである。
また当該ＤＮａｓｅβは、正常細胞の核に存在し、アポ
トーシス細胞の核には殆ど存在しない。
【００２５】また、本発明のＤＮａｓｅβは、ＳＤＳ−
ＰＡＧＥによると約３２，０００の分子量を示し、ゲル
濾過クロマトグラフィーによると約３０，０００の分子
量を示す。なお、ＳＤＳ−ＰＡＧＥの好ましい態様は実
施例２（１）において引用する参考例４に、およびゲル
濾過クロマトグラフィーの好ましい態様は実施例２
（１）に詳述する。
ＰＡＧＥによると約３２，０００の分子量を示し、ゲル
濾過クロマトグラフィーによると約３０，０００の分子
量を示す。なお、ＳＤＳ−ＰＡＧＥの好ましい態様は実
施例２（１）において引用する参考例４に、およびゲル
濾過クロマトグラフィーの好ましい態様は実施例２
（１）に詳述する。
【００２６】本発明ＤＮａｓｅβは、クロマチンＤＮＡ
のリンカー部位を選択的に切断して、３’末端側にリン
酸基をもつオリゴヌクレオソーム（３’−Ｐ／５’−Ｏ
Ｈ生成型）を生成するＤＮａｓｅである。当該ＤＮａｓ
ｅ活性に最適なｐＨ条件は、弱酸性ｐＨ、好ましくは酢
酸−ＫＯＨ緩衝液またはＭＥＳ−ＮａＯＨ緩衝液中でｐ
Ｈ約５．２〜約６．２、より好ましくはｐＨ約５．６で
ある。また、当該ＤＮａｓｅβは、Ｃａ2+、Ｍｇ2+及び
Ｍｎ2+などの二価金属陽イオン非依存的に活性を有し、
またＺｎ2+にも非感受性である（５０％活性阻害濃度＞
約１ｍＭ）。また、ＤＮａｓｅおよびＲＮａｓｅの阻害
剤であるオウリントリカルボン酸１００μＭで完全に活
性が阻害される。しかしながら、本ＤＮａｓｅβの活性
は、Ｇ−アクチンによっては阻害されない。
のリンカー部位を選択的に切断して、３’末端側にリン
酸基をもつオリゴヌクレオソーム（３’−Ｐ／５’−Ｏ
Ｈ生成型）を生成するＤＮａｓｅである。当該ＤＮａｓ
ｅ活性に最適なｐＨ条件は、弱酸性ｐＨ、好ましくは酢
酸−ＫＯＨ緩衝液またはＭＥＳ−ＮａＯＨ緩衝液中でｐ
Ｈ約５．２〜約６．２、より好ましくはｐＨ約５．６で
ある。また、当該ＤＮａｓｅβは、Ｃａ2+、Ｍｇ2+及び
Ｍｎ2+などの二価金属陽イオン非依存的に活性を有し、
またＺｎ2+にも非感受性である（５０％活性阻害濃度＞
約１ｍＭ）。また、ＤＮａｓｅおよびＲＮａｓｅの阻害
剤であるオウリントリカルボン酸１００μＭで完全に活
性が阻害される。しかしながら、本ＤＮａｓｅβの活性
は、Ｇ−アクチンによっては阻害されない。
【００２７】本発明のＤＮａｓｅβは、動物組織または
細胞を原料として抽出精製する方法、化学的合成による
方法または遺伝子組換え技術等公知手法を適宜用いるこ
とによって製造することができる。具体的には、下記の
方法が例示される。まず、ラット胸腺、脾臓または肝臓
由来の細胞を原料として、その細胞から非イオン性界面
活性剤の存在下で中性領域、好ましくはｐＨ約７．８の
緩衝液を用いてホモジネートすることにより細胞核を単
離する。次いで硫酸アンモニウムの存在下（好適な態様
としては、０．２〜０．３Ｍの硫酸アンモニウムの使用
が挙げられる）で、必要により超音波処理することによ
り可溶化して、遠心処理により上清画分を得る。得られ
た上清画分を陽イオン交換体、好ましくは強酸性陽イオ
ン交換体を担体とするカラムクロマトグラフィーにか
け、塩濃度による直線グラジェント法により展開させ
て、溶出した活性画分を取得する。ついで該活性画分を
さらに陽イオン交換体、好ましくは弱酸性陽イオン交換
体を担体とするＨＰＬＣにかけ、同様に塩濃度による直
線グラジェント法により展開させる。この際、カラムと
してＣＭ５ＰＷカラム（５ｍｍ Ｉ．Ｄ．×５０ｍｍ；
東ソー社製）を、また溶離液として１ｍＭ ２−メルカ
プトエタノール、０．１ｍＭ ＰＭＳＦおよび１０％エ
チレングリコールを含有する２０ｍＭ トリス塩酸緩衝
液（ｐＨ７．８）を用いてＫＣｌでグラジェントをかけ
た場合、本発明のＤＮａｓｅβはＫＣｌ濃度約０．３５
Ｍ付近の位置に溶出される。ついで、該溶出活性画分を
ヘパリンカラムによるＨＰＬＣ、ゲル濾過ＨＰＬＣおよ
び陽イオン交換体によるＨＰＬＣ等の公知精製クロマト
グラフィーを適宜組み合わせることにより、より一層高
度に精製されたＤＮａｓｅβを取得することができる。
かくして得られたＤＮａｓｅβは、透析、遠心分離、凍
結乾燥等を施すことができる。
細胞を原料として抽出精製する方法、化学的合成による
方法または遺伝子組換え技術等公知手法を適宜用いるこ
とによって製造することができる。具体的には、下記の
方法が例示される。まず、ラット胸腺、脾臓または肝臓
由来の細胞を原料として、その細胞から非イオン性界面
活性剤の存在下で中性領域、好ましくはｐＨ約７．８の
緩衝液を用いてホモジネートすることにより細胞核を単
離する。次いで硫酸アンモニウムの存在下（好適な態様
としては、０．２〜０．３Ｍの硫酸アンモニウムの使用
が挙げられる）で、必要により超音波処理することによ
り可溶化して、遠心処理により上清画分を得る。得られ
た上清画分を陽イオン交換体、好ましくは強酸性陽イオ
ン交換体を担体とするカラムクロマトグラフィーにか
け、塩濃度による直線グラジェント法により展開させ
て、溶出した活性画分を取得する。ついで該活性画分を
さらに陽イオン交換体、好ましくは弱酸性陽イオン交換
体を担体とするＨＰＬＣにかけ、同様に塩濃度による直
線グラジェント法により展開させる。この際、カラムと
してＣＭ５ＰＷカラム（５ｍｍ Ｉ．Ｄ．×５０ｍｍ；
東ソー社製）を、また溶離液として１ｍＭ ２−メルカ
プトエタノール、０．１ｍＭ ＰＭＳＦおよび１０％エ
チレングリコールを含有する２０ｍＭ トリス塩酸緩衝
液（ｐＨ７．８）を用いてＫＣｌでグラジェントをかけ
た場合、本発明のＤＮａｓｅβはＫＣｌ濃度約０．３５
Ｍ付近の位置に溶出される。ついで、該溶出活性画分を
ヘパリンカラムによるＨＰＬＣ、ゲル濾過ＨＰＬＣおよ
び陽イオン交換体によるＨＰＬＣ等の公知精製クロマト
グラフィーを適宜組み合わせることにより、より一層高
度に精製されたＤＮａｓｅβを取得することができる。
かくして得られたＤＮａｓｅβは、透析、遠心分離、凍
結乾燥等を施すことができる。
【００２８】本発明のＤＮａｓｅβは、ヒトを含む哺乳
動物（ウシ、ウマ、マウス、ラット、モルモット、ウサ
ギ等）で生じるＤＮＡ切断様式の解析試薬として、また
当該酵素はウイルスＤＮＡを３’−Ｐ／５’−ＯＨ生成
型に切断することから抗ウイルス剤を開発するための基
盤として有用である。
動物（ウシ、ウマ、マウス、ラット、モルモット、ウサ
ギ等）で生じるＤＮＡ切断様式の解析試薬として、また
当該酵素はウイルスＤＮＡを３’−Ｐ／５’−ＯＨ生成
型に切断することから抗ウイルス剤を開発するための基
盤として有用である。
【００２９】（ｄ）本発明ＤＮａｓｅγの一次構造（ア
ミノ酸配列） 本発明ＤＮａｓｅγの好ましい態様は、実質的に配列表
配列番号１に示されるアミノ酸配列中、アミノ酸番号２
６〜３１０で示されるアミノ酸配列を有するＤＮａｓｅ
である。かかるアミノ酸配列は、当該ＤＮａｓｅγの性
状を変化させない限り特に限定されず、アミノ酸配列の
一部で置換、欠失、挿入又は修飾が起こっていてもよ
い。該アミノ酸配列を有するＤＮａｓｅγは、動物組織
又は細胞の、細胞核から抽出精製する方法、化学合成に
よる方法又は遺伝子組換え技術等の公知手法を適宜用い
ることにより製造できる。好適には、ラット、仔ウシ等
の哺乳類の胸腺、脾臓又は肝臓由来の細胞、より好まし
くは、ラットの脾臓由来の細胞を原料として、上記
（ａ）に記載の方法と同様の工程により抽出精製する方
法が例示される。また当該ＤＮａｓｅγのアミノ酸配列
は、以下の〜によって得られたデータを総合して同
定する直接的方法、 該酵素を完全加水分解しアミノ酸組成を決定する エドマン法等によりＮ末端を、加ヒドラジン分解等に
よりＣ末端を決定する プロテアーゼ又は化学物質を用いて限定分解後、アミ
ノ酸配列分析装置で各断片のアミノ酸配列を決定する 別のプロテアーゼ又は化学物質を用いてと同様の処
理を行う 又は当該ＤＮａｓｅγのｃＤＮＡもしくはゲノミックＤ
ＮＡをクローニングし、そのコード領域（ＯＲＦ）の塩
基配列より対応するアミノ酸配列を決定する間接的方法
により同定される。
ミノ酸配列） 本発明ＤＮａｓｅγの好ましい態様は、実質的に配列表
配列番号１に示されるアミノ酸配列中、アミノ酸番号２
６〜３１０で示されるアミノ酸配列を有するＤＮａｓｅ
である。かかるアミノ酸配列は、当該ＤＮａｓｅγの性
状を変化させない限り特に限定されず、アミノ酸配列の
一部で置換、欠失、挿入又は修飾が起こっていてもよ
い。該アミノ酸配列を有するＤＮａｓｅγは、動物組織
又は細胞の、細胞核から抽出精製する方法、化学合成に
よる方法又は遺伝子組換え技術等の公知手法を適宜用い
ることにより製造できる。好適には、ラット、仔ウシ等
の哺乳類の胸腺、脾臓又は肝臓由来の細胞、より好まし
くは、ラットの脾臓由来の細胞を原料として、上記
（ａ）に記載の方法と同様の工程により抽出精製する方
法が例示される。また当該ＤＮａｓｅγのアミノ酸配列
は、以下の〜によって得られたデータを総合して同
定する直接的方法、 該酵素を完全加水分解しアミノ酸組成を決定する エドマン法等によりＮ末端を、加ヒドラジン分解等に
よりＣ末端を決定する プロテアーゼ又は化学物質を用いて限定分解後、アミ
ノ酸配列分析装置で各断片のアミノ酸配列を決定する 別のプロテアーゼ又は化学物質を用いてと同様の処
理を行う 又は当該ＤＮａｓｅγのｃＤＮＡもしくはゲノミックＤ
ＮＡをクローニングし、そのコード領域（ＯＲＦ）の塩
基配列より対応するアミノ酸配列を決定する間接的方法
により同定される。
【００３０】（ｅ）本発明ＤＮａｓｅγのＮ末端プリカ
ーサーペプチド領域 また、本発明ＤＮａｓｅγは細胞中で、まずそのＮ末端
側にプリカーサーペプチド領域を有する前駆体ＤＮａｓ
ｅγとして合成され、次いでペプチダーゼによって該Ｎ
末プリカーサーペプチド領域が切断され、成熟ＤＮａｓ
ｅγとなる。該Ｎ末プリカーサーペプチド領域は、実質
的に、配列表配列番号１に示されるアミノ酸配列中、ア
ミノ酸番号１〜２５で示されるアミノ酸配列を有する。
かかるアミノ酸配列は、当該ＤＮａｓｅγの性状を変化
させることなく、且つ正常にプロセッシングされるもの
であれば特に限定されず、アミノ酸配列の一部で置換、
欠失、挿入又は修飾が起こっていてもよい。該Ｎ末プリ
カーサーペプチド領域のアミノ酸配列は、ｃＤＮＡ又は
ゲノミックＤＮＡをクローニングしてその塩基配列を決
定し、該塩基配列に含まれるＯＲＦの塩基配列に対応す
るアミノ酸配列と、成熟ＤＮａｓｅγのＮ末端付近のア
ミノ酸配列とを比較することにより決定することができ
る。
ーサーペプチド領域 また、本発明ＤＮａｓｅγは細胞中で、まずそのＮ末端
側にプリカーサーペプチド領域を有する前駆体ＤＮａｓ
ｅγとして合成され、次いでペプチダーゼによって該Ｎ
末プリカーサーペプチド領域が切断され、成熟ＤＮａｓ
ｅγとなる。該Ｎ末プリカーサーペプチド領域は、実質
的に、配列表配列番号１に示されるアミノ酸配列中、ア
ミノ酸番号１〜２５で示されるアミノ酸配列を有する。
かかるアミノ酸配列は、当該ＤＮａｓｅγの性状を変化
させることなく、且つ正常にプロセッシングされるもの
であれば特に限定されず、アミノ酸配列の一部で置換、
欠失、挿入又は修飾が起こっていてもよい。該Ｎ末プリ
カーサーペプチド領域のアミノ酸配列は、ｃＤＮＡ又は
ゲノミックＤＮＡをクローニングしてその塩基配列を決
定し、該塩基配列に含まれるＯＲＦの塩基配列に対応す
るアミノ酸配列と、成熟ＤＮａｓｅγのＮ末端付近のア
ミノ酸配列とを比較することにより決定することができ
る。
【００３１】（ｆ）本発明ＤＮａｓｅγをコードするＤ
ＮＡ 本発明のＤＮＡは、本発明ＤＮａｓｅγのアミノ酸配列
をコードする塩基配列を有するＤＮＡであれば特に限定
されないが、好ましくは配列表配列番号１に示されるア
ミノ酸配列中、アミノ酸番号２６〜３１０で示されるア
ミノ酸配列をコードするＤＮＡ、より好ましくは配列表
配列番号２に示される塩基配列中、塩基番号８７〜９４
１で示される塩基配列を有するＤＮＡである。また、本
発明のＤＮＡは、Ｎ末プリカーサーペプチド領域を有す
る本発明ＤＮａｓｅγの前駆体ポリペプチドをコードす
るＤＮＡをも包含する。具体的には、実質的に、配列表
配列番号１に示されるアミノ酸配列中アミノ酸番号１〜
２５で示されるアミノ酸配列をＮ末プリカーサーペプチ
ドとして有するＤＮａｓｅγをコードするＤＮＡであ
り、好ましくは配列番号１記載のアミノ酸配列中アミノ
酸番号１〜３１０で示されるアミノ酸配列をコードする
ＤＮＡ、より好ましくは配列番号２記載の塩基配列中塩
基番号１２〜９４１で示される塩基配列を有するＤＮＡ
が例示される。
ＮＡ 本発明のＤＮＡは、本発明ＤＮａｓｅγのアミノ酸配列
をコードする塩基配列を有するＤＮＡであれば特に限定
されないが、好ましくは配列表配列番号１に示されるア
ミノ酸配列中、アミノ酸番号２６〜３１０で示されるア
ミノ酸配列をコードするＤＮＡ、より好ましくは配列表
配列番号２に示される塩基配列中、塩基番号８７〜９４
１で示される塩基配列を有するＤＮＡである。また、本
発明のＤＮＡは、Ｎ末プリカーサーペプチド領域を有す
る本発明ＤＮａｓｅγの前駆体ポリペプチドをコードす
るＤＮＡをも包含する。具体的には、実質的に、配列表
配列番号１に示されるアミノ酸配列中アミノ酸番号１〜
２５で示されるアミノ酸配列をＮ末プリカーサーペプチ
ドとして有するＤＮａｓｅγをコードするＤＮＡであ
り、好ましくは配列番号１記載のアミノ酸配列中アミノ
酸番号１〜３１０で示されるアミノ酸配列をコードする
ＤＮＡ、より好ましくは配列番号２記載の塩基配列中塩
基番号１２〜９４１で示される塩基配列を有するＤＮＡ
が例示される。
【００３２】また、本発明のＤＮＡはいかなる方法で得
られるものであってもよい。例えばｍＲＮＡから調製さ
れる相補ＤＮＡ（ｃＤＮＡ）、ゲノミックＤＮＡから調
製されるＤＮＡ、化学合成によって得られるＤＮＡ、Ｒ
ＮＡ（ｃＤＮＡ）又はＤＮＡを鋳型としてＰＣＲ法で増
幅させて得られるＤＮＡおよびこれらの方法を適当に組
み合わせて構築されるＤＮＡをも全て包含するものであ
る。
られるものであってもよい。例えばｍＲＮＡから調製さ
れる相補ＤＮＡ（ｃＤＮＡ）、ゲノミックＤＮＡから調
製されるＤＮＡ、化学合成によって得られるＤＮＡ、Ｒ
ＮＡ（ｃＤＮＡ）又はＤＮＡを鋳型としてＰＣＲ法で増
幅させて得られるＤＮＡおよびこれらの方法を適当に組
み合わせて構築されるＤＮＡをも全て包含するものであ
る。
【００３３】例えば、ＤＮａｓｅγを産生する細胞由来
のｃＤＮＡライブラリーからＤＮａｓｅγのｃＤＮＡを
クローン化する方法としては、以下の方法が例示され
る。まず、ＤＮａｓｅγを発現・産生するラット胸腺又
は脾臓等の細胞からｍＲＮＡ〔poly (A) RNA〕を調製す
る。ｍＲＮＡの調製は、例えばグアニジンチオシアネー
ト法〔Chirgwin, J. M. et al., Biochem., 18, 5294
(1979) 〕、熱フェノール法もしくは酸グアニジン−フ
ェノール−クロロホルム（ＡＧＰＣ）法等の公知の方法
を用いて調製した全ＲＮＡをオリゴ（ｄＴ）セルロース
やポリＵ−セファロース等によるアフィニティクロマト
グラフィーにかけることによって行うことができる。次
いで得られたｍＲＮＡを鋳型として、例えば逆転写酵素
を用いる等の公知の方法〔Okayama, H. et al., Mol.Ce
ll.Biol., 2, 161 (1982) 及び同誌 3, 280 (1983)、Gu
bler, H. and Hoffman, B.J., Gene, 25, 263(1983)
等〕でｃＤＮＡ鎖を合成し、ＲＮａｓｅＨで鋳型ＲＮＡ
にニックを導入した後ＤＮＡポリメラーゼＩで二本鎖ｃ
ＤＮＡを作製する。さらに末端平滑化、リンカー結合
後、該ｃＤＮＡをプラスミドベクターもしくはファージ
ベクターに組み込み、大腸菌を形質転換して、あるいは
インビトロパッケージングを行いｃＤＮＡライブラリー
を作製する。
のｃＤＮＡライブラリーからＤＮａｓｅγのｃＤＮＡを
クローン化する方法としては、以下の方法が例示され
る。まず、ＤＮａｓｅγを発現・産生するラット胸腺又
は脾臓等の細胞からｍＲＮＡ〔poly (A) RNA〕を調製す
る。ｍＲＮＡの調製は、例えばグアニジンチオシアネー
ト法〔Chirgwin, J. M. et al., Biochem., 18, 5294
(1979) 〕、熱フェノール法もしくは酸グアニジン−フ
ェノール−クロロホルム（ＡＧＰＣ）法等の公知の方法
を用いて調製した全ＲＮＡをオリゴ（ｄＴ）セルロース
やポリＵ−セファロース等によるアフィニティクロマト
グラフィーにかけることによって行うことができる。次
いで得られたｍＲＮＡを鋳型として、例えば逆転写酵素
を用いる等の公知の方法〔Okayama, H. et al., Mol.Ce
ll.Biol., 2, 161 (1982) 及び同誌 3, 280 (1983)、Gu
bler, H. and Hoffman, B.J., Gene, 25, 263(1983)
等〕でｃＤＮＡ鎖を合成し、ＲＮａｓｅＨで鋳型ＲＮＡ
にニックを導入した後ＤＮＡポリメラーゼＩで二本鎖ｃ
ＤＮＡを作製する。さらに末端平滑化、リンカー結合
後、該ｃＤＮＡをプラスミドベクターもしくはファージ
ベクターに組み込み、大腸菌を形質転換して、あるいは
インビトロパッケージングを行いｃＤＮＡライブラリー
を作製する。
【００３４】ここで用いられるプラスミドベクターとし
ては、宿主内で複製保持されるものであれば特に制限さ
れず、また用いられるファージベクターとしても宿主内
で増殖できるものであれば良い。常法的に用いられるク
ローニング用ベクターとしてｐＵＣ１１９，λｇｔ１
０，λｇｔ１１等が例示される。ただし、後述の抗体ス
クリーニングに供する場合は、宿主内でＤＮａｓｅγ遺
伝子を発現させ得るプロモーターを有したベクターであ
ることが好ましい。
ては、宿主内で複製保持されるものであれば特に制限さ
れず、また用いられるファージベクターとしても宿主内
で増殖できるものであれば良い。常法的に用いられるク
ローニング用ベクターとしてｐＵＣ１１９，λｇｔ１
０，λｇｔ１１等が例示される。ただし、後述の抗体ス
クリーニングに供する場合は、宿主内でＤＮａｓｅγ遺
伝子を発現させ得るプロモーターを有したベクターであ
ることが好ましい。
【００３５】プラスミドにｃＤＮＡを組み込む方法とし
ては、例えば Maniatis, T. ら, モレキュラークローニ
ング，ア・ラボラトリー・マニュアル (Molecular Clon
ing,A Laboratory Manual, second edition), Cold Spr
ing Harbor Laboratory, 1.53 (1989) に記載の方法な
どが挙げられる。また、ファージベクターにｃＤＮＡを
組み込む方法としては、Hyunh,T. V. らの方法（Hyunh,
T.V., DNA Cloning, apractical approach,1,49(198
5)）などが挙げられる。簡便には、市販のライゲーショ
ンキット（例えば、宝酒造製等）を用いることもでき
る。このようにして得られる組換えプラスミドやファー
ジベクターは、原核細胞（例えば、Ｅ．ｃｏｌｉＨＢ１
０１，ＤＨ５またはＭＣ１０６１／Ｐ３等）等の適当な
宿主に導入する。
ては、例えば Maniatis, T. ら, モレキュラークローニ
ング，ア・ラボラトリー・マニュアル (Molecular Clon
ing,A Laboratory Manual, second edition), Cold Spr
ing Harbor Laboratory, 1.53 (1989) に記載の方法な
どが挙げられる。また、ファージベクターにｃＤＮＡを
組み込む方法としては、Hyunh,T. V. らの方法（Hyunh,
T.V., DNA Cloning, apractical approach,1,49(198
5)）などが挙げられる。簡便には、市販のライゲーショ
ンキット（例えば、宝酒造製等）を用いることもでき
る。このようにして得られる組換えプラスミドやファー
ジベクターは、原核細胞（例えば、Ｅ．ｃｏｌｉＨＢ１
０１，ＤＨ５またはＭＣ１０６１／Ｐ３等）等の適当な
宿主に導入する。
【００３６】プラスミドを宿主に導入する方法として
は、Maniatis, T.らのモレキュラークローニング，ア・
ラボラトリー・マニュアル(Molecular Cloning, A Labo
ratoryManual, second edition), Cold Spring Harbor
Laboratory, 1.74 (1989)に記載の塩化カルシウム法ま
たは塩化カルシウム／塩化ルビジウム法、エレクトロポ
レーション法等が挙げられる。また、ファージベクター
を宿主に導入する方法としてはファージＤＮＡをインビ
トロパッケージングした後、増殖させた宿主に導入する
方法等が例示される。インビトロパッケージングは、市
販のインビトロパッケージングキット（例えば、ストラ
タジーン社製，アマシャム社製等）を用いることによっ
て簡便に行うことができる。
は、Maniatis, T.らのモレキュラークローニング，ア・
ラボラトリー・マニュアル(Molecular Cloning, A Labo
ratoryManual, second edition), Cold Spring Harbor
Laboratory, 1.74 (1989)に記載の塩化カルシウム法ま
たは塩化カルシウム／塩化ルビジウム法、エレクトロポ
レーション法等が挙げられる。また、ファージベクター
を宿主に導入する方法としてはファージＤＮＡをインビ
トロパッケージングした後、増殖させた宿主に導入する
方法等が例示される。インビトロパッケージングは、市
販のインビトロパッケージングキット（例えば、ストラ
タジーン社製，アマシャム社製等）を用いることによっ
て簡便に行うことができる。
【００３７】上記の方法によって作製されたｃＤＮＡラ
イブラリーから、本発明ＤＮａｓｅγをコードするｃＤ
ＮＡを単離する方法は、一般的なｃＤＮＡスクリーニン
グ法を組み合わせることによって行うことができる。例
えば、別個にＤＮａｓｅγの部分アミノ酸配列に対応す
ると考えられるオリゴヌクレオチドを化学合成したの
ち、これを32Ｐでラベルしてプローブとなし、公知のコ
ロニーハイブリダイゼーション法〔Crunstein, M. and
Hogness, D.S.:Proc. Natl. Acid. Sci. USA 72, 3961
(1975) 〕またはプラークハイブリダイゼーション法〔M
olecular Cloning, A Laboratory Manual, second edit
ion , Cold Spring Harbor Laboratory, 2.108 (198
9)〕により、目的のｃＤＮＡを含有するクローンをスク
リーニングする方法、ＰＣＲプライマーを作製しＤＮａ
ｓｅγの特定領域をＰＣＲ法により増幅し、該領域をコ
ードするＤＮＡ断片を有するクローンを選択する方法等
が挙げられる。また、ｃＤＮＡを発現しうるベクター
（例えば、λｇｔ１１ファージベクター）を用いて作製
したｃＤＮＡライブラリーを用いる場合には、ＤＮａｓ
ｅγに対する抗体を用いるイムノスクリーニングによ
り、目的のクローンを選択することができる。大量にク
ローンを処理する場合には、ＰＣＲ法を利用したスクリ
ーニング法を用いることが好ましい。
イブラリーから、本発明ＤＮａｓｅγをコードするｃＤ
ＮＡを単離する方法は、一般的なｃＤＮＡスクリーニン
グ法を組み合わせることによって行うことができる。例
えば、別個にＤＮａｓｅγの部分アミノ酸配列に対応す
ると考えられるオリゴヌクレオチドを化学合成したの
ち、これを32Ｐでラベルしてプローブとなし、公知のコ
ロニーハイブリダイゼーション法〔Crunstein, M. and
Hogness, D.S.:Proc. Natl. Acid. Sci. USA 72, 3961
(1975) 〕またはプラークハイブリダイゼーション法〔M
olecular Cloning, A Laboratory Manual, second edit
ion , Cold Spring Harbor Laboratory, 2.108 (198
9)〕により、目的のｃＤＮＡを含有するクローンをスク
リーニングする方法、ＰＣＲプライマーを作製しＤＮａ
ｓｅγの特定領域をＰＣＲ法により増幅し、該領域をコ
ードするＤＮＡ断片を有するクローンを選択する方法等
が挙げられる。また、ｃＤＮＡを発現しうるベクター
（例えば、λｇｔ１１ファージベクター）を用いて作製
したｃＤＮＡライブラリーを用いる場合には、ＤＮａｓ
ｅγに対する抗体を用いるイムノスクリーニングによ
り、目的のクローンを選択することができる。大量にク
ローンを処理する場合には、ＰＣＲ法を利用したスクリ
ーニング法を用いることが好ましい。
【００３８】この様にして得られたＤＮＡの塩基配列は
マキサム・ギルバート法〔Maxam, A.M. and Gilbert,
W., Proc. Natl. Acad. Sci. USA., 74, 560 (1977)〕
あるいはファージＭ１３を用いたジデオキシターミネー
ション法〔Sanger,f. ら、Proc. Natl. Acad. Sci. US
A., 74, 5463-5467 (1977)〕によって決定することがで
きる。ＤＮａｓｅγｃＤＮＡは、その全部または一部を
上記のようにして得られるクローンから制限酵素等によ
り切り出すことにより取得できる。
マキサム・ギルバート法〔Maxam, A.M. and Gilbert,
W., Proc. Natl. Acad. Sci. USA., 74, 560 (1977)〕
あるいはファージＭ１３を用いたジデオキシターミネー
ション法〔Sanger,f. ら、Proc. Natl. Acad. Sci. US
A., 74, 5463-5467 (1977)〕によって決定することがで
きる。ＤＮａｓｅγｃＤＮＡは、その全部または一部を
上記のようにして得られるクローンから制限酵素等によ
り切り出すことにより取得できる。
【００３９】また、ゲノミックＤＮＡライブラリーから
本発明ＤＮａｓｅγをコードするＤＮＡを単離する方法
としては以下の方法が例示される。まず、ラット胸腺又
は脾臓等の細胞からＳＤＳーフェノール法、セチルトリ
メチルアンモニウムブロマイド（ＣＴＡＢ）法等の公知
の方法を用いてゲノミックＤＮＡを調製する。好ましく
はリボヌクレアーゼによりＲＮＡを分解除去する。得ら
れるＤＮＡを適当な制限酵素により部分消化し、得られ
るＤＮＡ断片を適当なファージまたはコスミドで増幅し
ライブラリーを作製する。そして目的の配列を有するク
ローンを、例えば放射性標識されたＤＮＡプローブを用
いる方法等により検出し、該クローンからＤＮａｓｅγ
遺伝子の全部または一部を制限酵素等により切り出し取
得する。
本発明ＤＮａｓｅγをコードするＤＮＡを単離する方法
としては以下の方法が例示される。まず、ラット胸腺又
は脾臓等の細胞からＳＤＳーフェノール法、セチルトリ
メチルアンモニウムブロマイド（ＣＴＡＢ）法等の公知
の方法を用いてゲノミックＤＮＡを調製する。好ましく
はリボヌクレアーゼによりＲＮＡを分解除去する。得ら
れるＤＮＡを適当な制限酵素により部分消化し、得られ
るＤＮＡ断片を適当なファージまたはコスミドで増幅し
ライブラリーを作製する。そして目的の配列を有するク
ローンを、例えば放射性標識されたＤＮＡプローブを用
いる方法等により検出し、該クローンからＤＮａｓｅγ
遺伝子の全部または一部を制限酵素等により切り出し取
得する。
【００４０】また、化学的合成による本発明のＤＮＡの
製造は、配列表配列番号２記載の塩基配列中、塩基番号
１２〜９４１で示される塩基配列を基にして、その全部
又は一部を合成することにより行うことができる。
製造は、配列表配列番号２記載の塩基配列中、塩基番号
１２〜９４１で示される塩基配列を基にして、その全部
又は一部を合成することにより行うことができる。
【００４１】（ｇ）さらに本発明は、上述のＤＮａｓｅ
γをコードするＤＮＡを含有する組換えベクターに関す
る。本発明の組換えベクターとしては、原核細胞及び／
または真核細胞の各種の宿主内で複製保持または自己増
殖できるものであれば特に制限されず、プラスミドベク
ターおよびファージベクターが包含される。当該組換え
ベクターは、簡便には当業界において入手可能な組換え
用ベクター（プラスミドＤＮＡおよびバクテリオファー
ジＤＮＡ）に本発明のＤＮａｓｅγをコードするＤＮＡ
を常法により連結することによって調製することができ
る。用いられる組換え用ベクターとして具体的には、大
腸菌由来のプラスミドとして例えばpBR322, pBR325, pU
C12, pUC13など、酵母由来プラスミドとして例えばpSH1
9, pSH15など、枯草菌由来プラスミドとして例えばpUB1
10, pTP5, pC194 などが例示される。また、ファージと
しては、λファージなどのバクテリオファージが、さら
にレトロウイルス、ワクシニヤウイルス、核多角体ウイ
ルスなどの動物や昆虫のウイルス〔pVL1393 （インビト
ロゲン社製) 〕が例示される。
γをコードするＤＮＡを含有する組換えベクターに関す
る。本発明の組換えベクターとしては、原核細胞及び／
または真核細胞の各種の宿主内で複製保持または自己増
殖できるものであれば特に制限されず、プラスミドベク
ターおよびファージベクターが包含される。当該組換え
ベクターは、簡便には当業界において入手可能な組換え
用ベクター（プラスミドＤＮＡおよびバクテリオファー
ジＤＮＡ）に本発明のＤＮａｓｅγをコードするＤＮＡ
を常法により連結することによって調製することができ
る。用いられる組換え用ベクターとして具体的には、大
腸菌由来のプラスミドとして例えばpBR322, pBR325, pU
C12, pUC13など、酵母由来プラスミドとして例えばpSH1
9, pSH15など、枯草菌由来プラスミドとして例えばpUB1
10, pTP5, pC194 などが例示される。また、ファージと
しては、λファージなどのバクテリオファージが、さら
にレトロウイルス、ワクシニヤウイルス、核多角体ウイ
ルスなどの動物や昆虫のウイルス〔pVL1393 （インビト
ロゲン社製) 〕が例示される。
【００４２】ＤＮａｓｅγを発現・生産させる目的にお
いては、発現ベクターが有用である。発現ベクターとし
ては、原核細胞および／または真核細胞の各種の宿主細
胞中でＤＮａｓｅγ遺伝子を発現し、該酵素を生産する
機能を有するものであれば特に制限されない。宿主細胞
として細菌、特に大腸菌を用いる場合、一般に発現ベク
ターは少なくともプロモーター−オペレーター領域，開
始コドン，本発明ＤＮａｓｅγをコードするＤＮＡ，終
止コドン，ターミネーター領域および複製可能単位から
構成される。宿主として酵母，動物細胞または昆虫細胞
を用いる場合、発現ベクターは少なくともプロモータ
ー，開始コドン，本発明ＤＮａｓｅγをコードするＤＮ
Ａ，終止コドンを含んでいることが好ましい。またシグ
ナルペプチドをコードするＤＮＡ，エンハンサー配列，
本発明ＤＮａｓｅγ遺伝子の５’側および３’側の非翻
訳領域，スプライシング接合部，ポリアデニレーション
部位，選択マーカー領域または複製可能単位などを含ん
でいてもよい。
いては、発現ベクターが有用である。発現ベクターとし
ては、原核細胞および／または真核細胞の各種の宿主細
胞中でＤＮａｓｅγ遺伝子を発現し、該酵素を生産する
機能を有するものであれば特に制限されない。宿主細胞
として細菌、特に大腸菌を用いる場合、一般に発現ベク
ターは少なくともプロモーター−オペレーター領域，開
始コドン，本発明ＤＮａｓｅγをコードするＤＮＡ，終
止コドン，ターミネーター領域および複製可能単位から
構成される。宿主として酵母，動物細胞または昆虫細胞
を用いる場合、発現ベクターは少なくともプロモータ
ー，開始コドン，本発明ＤＮａｓｅγをコードするＤＮ
Ａ，終止コドンを含んでいることが好ましい。またシグ
ナルペプチドをコードするＤＮＡ，エンハンサー配列，
本発明ＤＮａｓｅγ遺伝子の５’側および３’側の非翻
訳領域，スプライシング接合部，ポリアデニレーション
部位，選択マーカー領域または複製可能単位などを含ん
でいてもよい。
【００４３】細菌中で本発明のＤＮａｓｅγを発現させ
るためのプロモーター−オペレータ−領域は、プロモー
ター、オペレーターおよび Shine-Dalgarno(SD) 配列
（例えば、ＡＡＧＧなど）を含むものである。例えば宿
主がエシェリキア属菌の場合、好適にはＴｒｐプロモー
ター，ｌａｃプロモーター，ｒｅｃＡプロモーター，λ
ＰＬプロモーター，ｌｐｐプロモーター，ｔａｃプロモ
ーターなどを含むものが例示される。宿主がバチルス属
菌の場合は、ＳＬＯ１プロモーター，ＳＰＯ２プロモー
ター，ｐｅｎＰプロモーターなどが挙げられる。また、
真核細胞の酵母中で本発明のＤＮａｓｅγを発現させる
ためのプロモーターとしては、ＰＨＯ５プロモーター，
ＰＧＫプロモーター，ＧＡＰプロモーター，ＡＤＨプロ
モーターが挙げられ、さらに宿主が哺乳動物細胞等であ
る場合、ＳＶ４０由来のプロモーター，レトロウイルス
のプロモーター，ヒートショックプロモーターなどが挙
げられる。好ましくは、ＳＶ−４０，レトロウイルスで
ある。しかし、特にこれらに限定されるものではない。
また、発現にはエンハンサーの利用も効果的な方法であ
る。
るためのプロモーター−オペレータ−領域は、プロモー
ター、オペレーターおよび Shine-Dalgarno(SD) 配列
（例えば、ＡＡＧＧなど）を含むものである。例えば宿
主がエシェリキア属菌の場合、好適にはＴｒｐプロモー
ター，ｌａｃプロモーター，ｒｅｃＡプロモーター，λ
ＰＬプロモーター，ｌｐｐプロモーター，ｔａｃプロモ
ーターなどを含むものが例示される。宿主がバチルス属
菌の場合は、ＳＬＯ１プロモーター，ＳＰＯ２プロモー
ター，ｐｅｎＰプロモーターなどが挙げられる。また、
真核細胞の酵母中で本発明のＤＮａｓｅγを発現させる
ためのプロモーターとしては、ＰＨＯ５プロモーター，
ＰＧＫプロモーター，ＧＡＰプロモーター，ＡＤＨプロ
モーターが挙げられ、さらに宿主が哺乳動物細胞等であ
る場合、ＳＶ４０由来のプロモーター，レトロウイルス
のプロモーター，ヒートショックプロモーターなどが挙
げられる。好ましくは、ＳＶ−４０，レトロウイルスで
ある。しかし、特にこれらに限定されるものではない。
また、発現にはエンハンサーの利用も効果的な方法であ
る。
【００４４】好適な開始コドンとしては、メチオニンコ
ドン（ＡＴＧ）が例示される。 終止コドンとしては、
常用の終止コドン（例えば、ＴＡＧ，ＴＧＡ，ＴＡＡな
ど）が例示される。ターミネーター領域としては、通常
用いられる天然または合成のターミネーターを用いるこ
とができる。複製可能単位とは、宿主細胞中でその全Ｄ
ＮＡ配列を複製することができる能力をもつＤＮＡをい
い、天然のプラスミド，人工的に修飾されたプラスミド
（天然のプラスミドから調製されたＤＮＡフラグメン
ト）および合成プラスミド等が含まれる。好適なプラス
ミドとしては、E. coli ではプラスミドｐＢＲ３２２、
もしくはその人工的修飾物（ｐＢＲ３２２を適当な制限
酵素で処理して得られるＤＮＡフラグメント）が、酵母
では酵母２μプラスミド、もしくは酵母染色体ＤＮＡ
が、また哺乳動物細胞ではプラスミドpRSVneo ATCC 371
98, プラスミドpSV2dhfr ATCC 37145,プラスミドpdBPV-
MMTneo ATCC 37224,プラスミドpSV2neo ATCC37149等が
あげられる。
ドン（ＡＴＧ）が例示される。 終止コドンとしては、
常用の終止コドン（例えば、ＴＡＧ，ＴＧＡ，ＴＡＡな
ど）が例示される。ターミネーター領域としては、通常
用いられる天然または合成のターミネーターを用いるこ
とができる。複製可能単位とは、宿主細胞中でその全Ｄ
ＮＡ配列を複製することができる能力をもつＤＮＡをい
い、天然のプラスミド，人工的に修飾されたプラスミド
（天然のプラスミドから調製されたＤＮＡフラグメン
ト）および合成プラスミド等が含まれる。好適なプラス
ミドとしては、E. coli ではプラスミドｐＢＲ３２２、
もしくはその人工的修飾物（ｐＢＲ３２２を適当な制限
酵素で処理して得られるＤＮＡフラグメント）が、酵母
では酵母２μプラスミド、もしくは酵母染色体ＤＮＡ
が、また哺乳動物細胞ではプラスミドpRSVneo ATCC 371
98, プラスミドpSV2dhfr ATCC 37145,プラスミドpdBPV-
MMTneo ATCC 37224,プラスミドpSV2neo ATCC37149等が
あげられる。
【００４５】エンハンサー配列、ポリアデニレーション
部位およびスプライシング接合部位については、例えば
それぞれＳＶ４０に由来するもの等、当業者において通
常使用されるものを用いることができる。
部位およびスプライシング接合部位については、例えば
それぞれＳＶ４０に由来するもの等、当業者において通
常使用されるものを用いることができる。
【００４６】選択マーカーとしては、通常使用されるも
のを常法により用いることができる。例えばテトラサイ
クリン，アンピシリン，またはカナマイシン等の抗生物
質耐性遺伝子等が例示される。
のを常法により用いることができる。例えばテトラサイ
クリン，アンピシリン，またはカナマイシン等の抗生物
質耐性遺伝子等が例示される。
【００４７】本発明の発現ベクターは、少なくとも、上
述のプロモーター，開始コドン，本発明のＤＮａｓｅγ
をコードするＤＮＡ，終止コドンおよびターミネーター
領域を連続的かつ環状に適当な複製可能単位に連結する
ことによって調製することができる。またこの際、所望
により制限酵素での消化やＴ４ＤＮＡリガーゼを用いる
ライゲーション等の常法により適当なＤＮＡフラグメン
ト（例えば、リンカー、他の制限部位など）を用いるこ
とができる。
述のプロモーター，開始コドン，本発明のＤＮａｓｅγ
をコードするＤＮＡ，終止コドンおよびターミネーター
領域を連続的かつ環状に適当な複製可能単位に連結する
ことによって調製することができる。またこの際、所望
により制限酵素での消化やＴ４ＤＮＡリガーゼを用いる
ライゲーション等の常法により適当なＤＮＡフラグメン
ト（例えば、リンカー、他の制限部位など）を用いるこ
とができる。
【００４８】（ｈ）本発明の形質転換細胞は、上述の発
現ベクターを宿主細胞に導入することにより調製するこ
とができる。本発明で用いられる宿主細胞としては、前
記の発現ベクターに適合し、形質転換されうるものであ
れば特に限定されず、本発明の技術分野において通常使
用される天然細胞あるいは人工的に樹立された組換え細
胞など種々の細胞〔例えば、細菌（エシェリキア属菌、
バチルス属菌），酵母（サッカロマイセス属、ピキア属
など），動物細胞または昆虫細胞など〕が例示される。
好ましくは大腸菌あるいは動物細胞であり、具体的には
大腸菌（ＤＨ５，ＨＢ１０１等）、マウス由来細胞（Ｃ
ＯＰ、Ｌ、Ｃ１２７、Ｓｐ２／０、ＮＳ−１またはＮＩ
Ｈ3 Ｔ3 等）、ラット由来細胞、ハムスター由来細胞
（ＢＨＫおよびＣＨＯ等）、サル由来細胞（ＣＯＳ１、
ＣＯＳ３、ＣＯＳ７、ＣＶ１およびＶｅｌｏ等）および
ヒト由来細胞（Ｈｅｌａ、２倍体線維芽細胞に由来する
細胞、ミエローマ細胞およびＮａｍａｌｗａ等）などが
例示される。
現ベクターを宿主細胞に導入することにより調製するこ
とができる。本発明で用いられる宿主細胞としては、前
記の発現ベクターに適合し、形質転換されうるものであ
れば特に限定されず、本発明の技術分野において通常使
用される天然細胞あるいは人工的に樹立された組換え細
胞など種々の細胞〔例えば、細菌（エシェリキア属菌、
バチルス属菌），酵母（サッカロマイセス属、ピキア属
など），動物細胞または昆虫細胞など〕が例示される。
好ましくは大腸菌あるいは動物細胞であり、具体的には
大腸菌（ＤＨ５，ＨＢ１０１等）、マウス由来細胞（Ｃ
ＯＰ、Ｌ、Ｃ１２７、Ｓｐ２／０、ＮＳ−１またはＮＩ
Ｈ3 Ｔ3 等）、ラット由来細胞、ハムスター由来細胞
（ＢＨＫおよびＣＨＯ等）、サル由来細胞（ＣＯＳ１、
ＣＯＳ３、ＣＯＳ７、ＣＶ１およびＶｅｌｏ等）および
ヒト由来細胞（Ｈｅｌａ、２倍体線維芽細胞に由来する
細胞、ミエローマ細胞およびＮａｍａｌｗａ等）などが
例示される。
【００４９】発現ベクターの宿主細胞への導入（形質転
換又は形質移入）は従来公知の方法を用いて行うことが
できる。 例えば、細菌（E.coli, Bacillus subtilis
等）の場合は、例えばCohen らの方法〔Proc. Natl. Ac
ad. Sci. USA., 69, 2110 (1972)〕、プロトプラスト法
〔Mol. Gen. Genet., 168, 111 (1979) 〕やコンピテン
ト法〔J. Mol. Biol., 56, 209 (1971) 〕によって、Sa
ccharomyces cerevisiaeの場合は、例えばHinnenらの方
法〔Proc. Natl. Acad. Sci. USA., 75, 1927(1978)〕
やリチウム法〔J. Bacteriol., 153, 163 (1983)〕によ
って、動物細胞の場合は、例えばGrahamの方法〔Virolo
gy, 52, 456 (1973)〕、昆虫細胞の場合は、例えばSumm
ers らの方法〔Mol. Cell. Biol.3, 2156-2165 (1983)
〕によってそれぞれ形質転換することができる。
換又は形質移入）は従来公知の方法を用いて行うことが
できる。 例えば、細菌（E.coli, Bacillus subtilis
等）の場合は、例えばCohen らの方法〔Proc. Natl. Ac
ad. Sci. USA., 69, 2110 (1972)〕、プロトプラスト法
〔Mol. Gen. Genet., 168, 111 (1979) 〕やコンピテン
ト法〔J. Mol. Biol., 56, 209 (1971) 〕によって、Sa
ccharomyces cerevisiaeの場合は、例えばHinnenらの方
法〔Proc. Natl. Acad. Sci. USA., 75, 1927(1978)〕
やリチウム法〔J. Bacteriol., 153, 163 (1983)〕によ
って、動物細胞の場合は、例えばGrahamの方法〔Virolo
gy, 52, 456 (1973)〕、昆虫細胞の場合は、例えばSumm
ers らの方法〔Mol. Cell. Biol.3, 2156-2165 (1983)
〕によってそれぞれ形質転換することができる。
【００５０】（ｉ）本発明のＤＮａｓｅγは、上記の如
く調製される発現ベクターを含む形質転換細胞（以下、
形質移入体を包含する意味で使用する。）を栄養培地で
培養することによって製造することができる。栄養培地
は、宿主細胞（形質転換体）の生育に必要な炭素源，無
機窒素源もしくは有機窒素源を含でいることが好まし
い。炭素源としては、例えばグルコース，デキストラ
ン，可溶性デンプン，ショ糖などが、無機窒素源もしく
は有機窒素源としては、例えばアンモニウム塩類，硝酸
塩類，アミノ酸，コーンスチープ・リカー，ペプトン，
カゼイン，肉エキス，大豆粕，バレイショ抽出液などが
例示される。また所望により他の栄養素〔例えば、無機
塩（例えば塩化カルシウム，リン酸二水素ナトリウム，
塩化マグネシウム），ビタミン類，抗生物質（例えばテ
トラサイクリン，ネオマイシン，アンピシリン，カナマ
イシン等）など〕を含んでいてもよい。
く調製される発現ベクターを含む形質転換細胞（以下、
形質移入体を包含する意味で使用する。）を栄養培地で
培養することによって製造することができる。栄養培地
は、宿主細胞（形質転換体）の生育に必要な炭素源，無
機窒素源もしくは有機窒素源を含でいることが好まし
い。炭素源としては、例えばグルコース，デキストラ
ン，可溶性デンプン，ショ糖などが、無機窒素源もしく
は有機窒素源としては、例えばアンモニウム塩類，硝酸
塩類，アミノ酸，コーンスチープ・リカー，ペプトン，
カゼイン，肉エキス，大豆粕，バレイショ抽出液などが
例示される。また所望により他の栄養素〔例えば、無機
塩（例えば塩化カルシウム，リン酸二水素ナトリウム，
塩化マグネシウム），ビタミン類，抗生物質（例えばテ
トラサイクリン，ネオマイシン，アンピシリン，カナマ
イシン等）など〕を含んでいてもよい。
【００５１】培養は当業界において知られている方法に
より行われる。培養条件、例えば温度，培地のｐＨおよ
び培養時間は、ＤＮａｓｅγが大量に生産されるように
適宜選択される。なお、下記に宿主細胞に応じて用いら
れる具体的な培地および培養条件を例示するが、何らこ
れらに限定されるものではない。
より行われる。培養条件、例えば温度，培地のｐＨおよ
び培養時間は、ＤＮａｓｅγが大量に生産されるように
適宜選択される。なお、下記に宿主細胞に応じて用いら
れる具体的な培地および培養条件を例示するが、何らこ
れらに限定されるものではない。
【００５２】宿主が細菌，放線菌，酵母，糸状菌である
場合、例えば上記栄養源を含有する液体培地が適当であ
る。好ましくは、ｐＨが５〜８である培地である。宿主
がE. coli の場合、好ましい培地としてＬＢ培地，Ｍ９
培地〔Miller. J., Exp. Mol. Genet, p.431, Cold Spr
ing Harbor Laboratory, New York (1972)〕等が例示さ
れる。かかる場合、培養は、必要により通気，攪拌をし
ながら、通常１４〜４３℃、約３〜２４時間行うことが
できる。
場合、例えば上記栄養源を含有する液体培地が適当であ
る。好ましくは、ｐＨが５〜８である培地である。宿主
がE. coli の場合、好ましい培地としてＬＢ培地，Ｍ９
培地〔Miller. J., Exp. Mol. Genet, p.431, Cold Spr
ing Harbor Laboratory, New York (1972)〕等が例示さ
れる。かかる場合、培養は、必要により通気，攪拌をし
ながら、通常１４〜４３℃、約３〜２４時間行うことが
できる。
【００５３】宿主がBacillus属菌の場合、必要により通
気，攪拌をしながら、通常３０〜４０℃、約１６〜９６
時間行うことができる。宿主が酵母である場合、培地と
して、例えばBurkholder最小培地〔Bostian. K. L. et
al, Proc. Natl. Acad. Sci. USA, 77, 4505 (1980) 〕
が挙げられ、ｐＨは５〜８であることが望ましい。培養
は通常約２０〜３５℃で約１４〜１４４時間行なわれ、
必要により通気や攪拌を行うこともできる。
気，攪拌をしながら、通常３０〜４０℃、約１６〜９６
時間行うことができる。宿主が酵母である場合、培地と
して、例えばBurkholder最小培地〔Bostian. K. L. et
al, Proc. Natl. Acad. Sci. USA, 77, 4505 (1980) 〕
が挙げられ、ｐＨは５〜８であることが望ましい。培養
は通常約２０〜３５℃で約１４〜１４４時間行なわれ、
必要により通気や攪拌を行うこともできる。
【００５４】宿主が動物細胞の場合、培地として例えば
約５〜２０％の胎児牛血清を含むＭＥＭ培地〔Science,
122, 501 (1952)〕，ＤＭＥＭ培地〔Virology, 8, 396
(1959) 〕、ＲＰＭＩ１６４０培地〔J. Am. Med. Asso
c., 199, 519 (1967) 〕，１９９培地〔proc. Soc. Ex
p. Biol. Med., 73, 1 (1950)〕等を用いることができ
る。培地のｐＨは約６〜８であるのが好ましく、培養は
通常約３０〜４０℃で約１５〜７２時間行なわれ、必要
により通気や攪拌を行うこともできる。
約５〜２０％の胎児牛血清を含むＭＥＭ培地〔Science,
122, 501 (1952)〕，ＤＭＥＭ培地〔Virology, 8, 396
(1959) 〕、ＲＰＭＩ１６４０培地〔J. Am. Med. Asso
c., 199, 519 (1967) 〕，１９９培地〔proc. Soc. Ex
p. Biol. Med., 73, 1 (1950)〕等を用いることができ
る。培地のｐＨは約６〜８であるのが好ましく、培養は
通常約３０〜４０℃で約１５〜７２時間行なわれ、必要
により通気や攪拌を行うこともできる。
【００５５】宿主が昆虫細胞の場合、例えば胎児牛血清
を含むGrace's 培地〔Proc. Natl.Acad. Sci. USA, 82,
8404 (1985)〕等が挙げられ、そのｐＨは約５〜８であ
るのが好ましい。培養は通常約２０〜４０℃で１５〜１
００時間行なわれ、必要により通気や攪拌を行うことも
できる。
を含むGrace's 培地〔Proc. Natl.Acad. Sci. USA, 82,
8404 (1985)〕等が挙げられ、そのｐＨは約５〜８であ
るのが好ましい。培養は通常約２０〜４０℃で１５〜１
００時間行なわれ、必要により通気や攪拌を行うことも
できる。
【００５６】本発明のＤＮａｓｅγは、上記培養により
得られる培養物より以下のようにして取得できる。すな
わち、本発明のＤＮａｓｅγが、培養物のうち培養液中
に存在する場合は、得られた培養物を濾過または遠心分
離等の方法で培養濾液（上清）を得、該培養濾液から天
然または合成蛋白質を精製並びに単離するために一般に
用いられる常法に従って該ＤＮａｓｅγを精製、単離す
る。単離，精製方法としては、例えば塩析，溶媒沈澱法
等の溶解度を利用する方法、透析，限外濾過，ゲル濾
過，ドデシル硫酸ナトリウム−ポリアクリルアミドゲル
電気泳動など分子量の差を利用する方法、イオン交換ク
ロマトグラフィーやヒドロキシルアパタイトクロマトグ
ラフィーなどの荷電を利用する方法、アフィニティーク
ロマトグラフィーなどの特異的親和性を利用する方法、
逆相高速液体クロマトグラフィーなどの疎水性の差を利
用する方法、等電点電気泳動などの等電点の差を利用す
る方法などが挙げられる。
得られる培養物より以下のようにして取得できる。すな
わち、本発明のＤＮａｓｅγが、培養物のうち培養液中
に存在する場合は、得られた培養物を濾過または遠心分
離等の方法で培養濾液（上清）を得、該培養濾液から天
然または合成蛋白質を精製並びに単離するために一般に
用いられる常法に従って該ＤＮａｓｅγを精製、単離す
る。単離，精製方法としては、例えば塩析，溶媒沈澱法
等の溶解度を利用する方法、透析，限外濾過，ゲル濾
過，ドデシル硫酸ナトリウム−ポリアクリルアミドゲル
電気泳動など分子量の差を利用する方法、イオン交換ク
ロマトグラフィーやヒドロキシルアパタイトクロマトグ
ラフィーなどの荷電を利用する方法、アフィニティーク
ロマトグラフィーなどの特異的親和性を利用する方法、
逆相高速液体クロマトグラフィーなどの疎水性の差を利
用する方法、等電点電気泳動などの等電点の差を利用す
る方法などが挙げられる。
【００５７】一方、本発明ＤＮａｓｅγが培養された形
質転換体のペリプラズムまたは細胞質内に存在する場合
は、培養物を濾過または遠心分離などの常法に付して菌
体あるいは細胞を集め、適当な緩衝液に懸濁し、例えば
超音波、リゾチーム及び凍結融解などの方法で細胞等の
細胞壁および／または細胞膜を破壊した後、遠心分離や
濾過などの方法でＤＮａｓｅγを含有する膜画分を得
る。該膜画分をトライトン−Ｘ１００等の界面活性剤を
用いて可溶化して粗溶液を得る。そして、当該粗溶液を
先に例示したような常法を用いることにより、単離，精
製することができる。また、当該ＤＮａｓｅγが培養さ
れた形質転換細胞の核内に存在する場合は、常法により
細胞壁及び細胞膜を破壊して核を単離した後、超音波処
理等により核膜を破壊し、遠心処理して上清を得、該上
清を先に例示したような常法を用いることにより、単離
・精製することができる
質転換体のペリプラズムまたは細胞質内に存在する場合
は、培養物を濾過または遠心分離などの常法に付して菌
体あるいは細胞を集め、適当な緩衝液に懸濁し、例えば
超音波、リゾチーム及び凍結融解などの方法で細胞等の
細胞壁および／または細胞膜を破壊した後、遠心分離や
濾過などの方法でＤＮａｓｅγを含有する膜画分を得
る。該膜画分をトライトン−Ｘ１００等の界面活性剤を
用いて可溶化して粗溶液を得る。そして、当該粗溶液を
先に例示したような常法を用いることにより、単離，精
製することができる。また、当該ＤＮａｓｅγが培養さ
れた形質転換細胞の核内に存在する場合は、常法により
細胞壁及び細胞膜を破壊して核を単離した後、超音波処
理等により核膜を破壊し、遠心処理して上清を得、該上
清を先に例示したような常法を用いることにより、単離
・精製することができる
【００５８】また、本発明は、上述のＤＮａｓｅγもし
くはその前駆体ポリペプチド又はそれらのアミノ酸配列
の一部を有するペプチドに親和性を有する抗体に関す
る。本発明の抗体は、上記性質を有するポリクローナル
抗体およびモノクローナル抗体を共に包含する。また、
当該モノクローナル抗体には、ＩｇＧ，ＩｇＭ，Ｉｇ
Ａ，ＩｇＤおよびＩｇＥなるいずれのイムノグロブリン
クラスに属するモノクローナル抗体をも包含し、好適に
は、ＩｇＧまたはＩｇＭイムノグロブリンクラスモノク
ローナル抗体が挙げられる。
くはその前駆体ポリペプチド又はそれらのアミノ酸配列
の一部を有するペプチドに親和性を有する抗体に関す
る。本発明の抗体は、上記性質を有するポリクローナル
抗体およびモノクローナル抗体を共に包含する。また、
当該モノクローナル抗体には、ＩｇＧ，ＩｇＭ，Ｉｇ
Ａ，ＩｇＤおよびＩｇＥなるいずれのイムノグロブリン
クラスに属するモノクローナル抗体をも包含し、好適に
は、ＩｇＧまたはＩｇＭイムノグロブリンクラスモノク
ローナル抗体が挙げられる。
【００５９】本発明の抗体は常法に従って取得すること
ができる（続生化学実験講座５、免疫生化学研究法、日
本生化学会編：東京化学同人発行、等）。 例えば、本
発明のポリクローナル抗体は、以下の方法により作製す
ることができる。本発明ＤＮａｓｅγのアミノ酸配列の
一部又は全部を有する（ポリ）ペプチドをウシ血清アル
ブミン、Keyhole Limpets Hemocyanin（ＫＬＨ）等のキ
ャリアタンパク質に架橋した複合体と、完全（不完全）
フロイントアジュバント〔ＦＣＡ（ＦＩＡ）〕との混和
物を抗原として、ウサギ、マウス、ラット、モルモット
又はハムスター等の哺乳動物に免疫（初回免疫から約１
〜４週間毎に１〜数回追加免役し、各追加免疫の約３〜
１０日後に部分採血した血清の抗体価を従来公知の抗原
抗体反応を利用して測定、その上昇を確認しておく。さ
らに最終免疫から約３〜１０日後全血を採取して抗血清
を精製する。
ができる（続生化学実験講座５、免疫生化学研究法、日
本生化学会編：東京化学同人発行、等）。 例えば、本
発明のポリクローナル抗体は、以下の方法により作製す
ることができる。本発明ＤＮａｓｅγのアミノ酸配列の
一部又は全部を有する（ポリ）ペプチドをウシ血清アル
ブミン、Keyhole Limpets Hemocyanin（ＫＬＨ）等のキ
ャリアタンパク質に架橋した複合体と、完全（不完全）
フロイントアジュバント〔ＦＣＡ（ＦＩＡ）〕との混和
物を抗原として、ウサギ、マウス、ラット、モルモット
又はハムスター等の哺乳動物に免疫（初回免疫から約１
〜４週間毎に１〜数回追加免役し、各追加免疫の約３〜
１０日後に部分採血した血清の抗体価を従来公知の抗原
抗体反応を利用して測定、その上昇を確認しておく。さ
らに最終免疫から約３〜１０日後全血を採取して抗血清
を精製する。
【００６０】また、本発明のＤＮａｓｅγに対するモノ
クローナル抗体は、いわゆる細胞融合によって製造され
るハイブリドーマ（融合細胞）から製造することができ
る。すなわち、抗体産生細胞と骨髄腫系細胞から融合ハ
イブリドーマを形成し、当該ハイブリドーマをクローン
化し、本発明のＤＮａｓｅγ又はその前駆体のアミノ酸
配列の一部または全部を有する（ポリ）ペプチドを抗原
として、それに対して特異的親和性を示す抗体を生産す
るクローンを選択することによって製造される。その操
作は免疫抗原として本発明のＤＮａｓｅγ又はその前駆
体のアミノ酸配列の一部または全部を有する（ポリ）ペ
プチドを使用する以外は、従来既知の手段を用いること
ができる。
クローナル抗体は、いわゆる細胞融合によって製造され
るハイブリドーマ（融合細胞）から製造することができ
る。すなわち、抗体産生細胞と骨髄腫系細胞から融合ハ
イブリドーマを形成し、当該ハイブリドーマをクローン
化し、本発明のＤＮａｓｅγ又はその前駆体のアミノ酸
配列の一部または全部を有する（ポリ）ペプチドを抗原
として、それに対して特異的親和性を示す抗体を生産す
るクローンを選択することによって製造される。その操
作は免疫抗原として本発明のＤＮａｓｅγ又はその前駆
体のアミノ酸配列の一部または全部を有する（ポリ）ペ
プチドを使用する以外は、従来既知の手段を用いること
ができる。
【００６１】免疫抗原は、例えばＤＮａｓｅγ又はその
前駆体のアミノ酸配列の一部または全部を有する（ポ
リ）ペプチドを完全又は不完全フロインドアジュバント
とを混和して調製される。免疫化の対象として用いられ
る動物としては、マウス、ラット、モルモット、ハムス
ター又はウサギ等の哺乳動物、好ましくはマウス又はラ
ット、より好ましくはマウスが例示される。免疫は、こ
れらの哺乳動物の皮下内、筋肉内、静脈内、フッドパッ
ト内あるいは腹腔内に１〜数回注射することにより行わ
れる。通常、初回免疫から約１〜４週間毎に１〜４度追
加免疫を行い、さらに約１〜４週間後に最終免疫を行っ
て、該最終免疫より約３〜１０日後に免疫感作された動
物から抗体産生細胞が採取される。
前駆体のアミノ酸配列の一部または全部を有する（ポ
リ）ペプチドを完全又は不完全フロインドアジュバント
とを混和して調製される。免疫化の対象として用いられ
る動物としては、マウス、ラット、モルモット、ハムス
ター又はウサギ等の哺乳動物、好ましくはマウス又はラ
ット、より好ましくはマウスが例示される。免疫は、こ
れらの哺乳動物の皮下内、筋肉内、静脈内、フッドパッ
ト内あるいは腹腔内に１〜数回注射することにより行わ
れる。通常、初回免疫から約１〜４週間毎に１〜４度追
加免疫を行い、さらに約１〜４週間後に最終免疫を行っ
て、該最終免疫より約３〜１０日後に免疫感作された動
物から抗体産生細胞が採取される。
【００６２】モノクローナル抗体を分泌するハイブリド
ーマの調製は、ケーラー及びミルシュタインらの方法
（Nature, Vol.256, pp.495-497, 1975)及びそれに準じ
る修飾方法に従って行うことができる。すなわち、本発
明のモノクローナル抗体は、前述の如く免疫感作された
動物から取得される脾臓、リンパ節、骨髄あるいは扁桃
等、好ましくは脾臓に含まれる抗体産生細胞と、好まし
くは同種のマウス、ラット、モルモット、ハムスター、
ウサギまたはヒト等の哺乳動物、より好ましくはマウ
ス、ラットまたはヒトの骨髄腫系細胞（ミエローマ）と
の融合により得られる融合細胞（ハイブリドーマ）を培
養することにより調製される。培養は、インビトロ、ま
たはマウス、ラット、モルモット、ハムスターもしくは
ウサギ等の哺乳動物、好ましくはマウスまたはラット、
より好ましくはマウスの腹水中等でのインビボで行うこ
とができ、抗体はそれぞれ該培養上清、または哺乳動物
の腹水から取得することができる。
ーマの調製は、ケーラー及びミルシュタインらの方法
（Nature, Vol.256, pp.495-497, 1975)及びそれに準じ
る修飾方法に従って行うことができる。すなわち、本発
明のモノクローナル抗体は、前述の如く免疫感作された
動物から取得される脾臓、リンパ節、骨髄あるいは扁桃
等、好ましくは脾臓に含まれる抗体産生細胞と、好まし
くは同種のマウス、ラット、モルモット、ハムスター、
ウサギまたはヒト等の哺乳動物、より好ましくはマウ
ス、ラットまたはヒトの骨髄腫系細胞（ミエローマ）と
の融合により得られる融合細胞（ハイブリドーマ）を培
養することにより調製される。培養は、インビトロ、ま
たはマウス、ラット、モルモット、ハムスターもしくは
ウサギ等の哺乳動物、好ましくはマウスまたはラット、
より好ましくはマウスの腹水中等でのインビボで行うこ
とができ、抗体はそれぞれ該培養上清、または哺乳動物
の腹水から取得することができる。
【００６３】細胞融合に用いられる骨髄腫系細胞として
は、例えばマウス由来ミエローマP3/X63-AG8、P3/NSI/1
-Ag4-1、P3/X63-Ag8.U1 、SP2/O-Ag14、FOあるいはBW51
47、ラット由来ミエローマ210RCY3-Ag1.2.3.、ヒト由来
ミエローマU-266AR1、GM1500-6TG-A1-2 、UC729-6 、CE
M-AGR 、D1R11 あるいはCEM-T15 を挙げることができ
る。
は、例えばマウス由来ミエローマP3/X63-AG8、P3/NSI/1
-Ag4-1、P3/X63-Ag8.U1 、SP2/O-Ag14、FOあるいはBW51
47、ラット由来ミエローマ210RCY3-Ag1.2.3.、ヒト由来
ミエローマU-266AR1、GM1500-6TG-A1-2 、UC729-6 、CE
M-AGR 、D1R11 あるいはCEM-T15 を挙げることができ
る。
【００６４】本発明のモノクローナル抗体を産生する融
合細胞クローンのスクリーニングは、融合細胞を、例え
ばマイクロタイタープレート中で培養し、増殖の見られ
たウエルの培養上清の抗原に対する反応性を、例えばＲ
ＩＡやＥＬＩＳＡ等の酵素抗体法によって測定すること
により行うことができる。モノクローナル抗体の精製、
単離は、上述のような方法によって取得される本発明の
モノクローナル抗体を含有する血清、腹水あるいはイオ
ン交換クロマトグラフィー（ＤＥＡＥまたはＤＥ５２な
ど）、抗イムノグロブリンカラムあるいはプロテインＡ
カラム等のアフィニティーカラムクロマトグラフィーに
付することにより行うことができる。
合細胞クローンのスクリーニングは、融合細胞を、例え
ばマイクロタイタープレート中で培養し、増殖の見られ
たウエルの培養上清の抗原に対する反応性を、例えばＲ
ＩＡやＥＬＩＳＡ等の酵素抗体法によって測定すること
により行うことができる。モノクローナル抗体の精製、
単離は、上述のような方法によって取得される本発明の
モノクローナル抗体を含有する血清、腹水あるいはイオ
ン交換クロマトグラフィー（ＤＥＡＥまたはＤＥ５２な
ど）、抗イムノグロブリンカラムあるいはプロテインＡ
カラム等のアフィニティーカラムクロマトグラフィーに
付することにより行うことができる。
【００６５】本発明の「モノクローナル抗体」は、上述
の製造方法に限定されることなく、いかなる方法で得ら
れたものであってもよい。また、通常「モノクローナル
抗体」は、免疫感作を施す哺乳動物の種類によりそれぞ
れ異なる構造の糖鎖を有するが、本発明における「モノ
クローナル抗体」は該糖鎖の構造差異により限定される
ものではなく、あらゆる哺乳動物由来のモノクローナル
抗体をも包含するものである。さらに、例えばヒトイム
ノグロブリン遺伝子を組み込むことにより、ヒト型抗体
を産生するように遺伝子工学的に作出されたトランスジ
ェニックマウスを用いて得られるヒト型モノクローナル
抗体、あるいは、遺伝子組換え技術により、ある哺乳動
物由来のモノクローナル抗体の定常領域（Ｆｃ領域）を
ヒトモノクローナル抗体のＦｃ領域と組み換えたキメラ
モノクローナル抗体、さらには抗原と相補的に直接結合
し得る相補性決定部位（ＣＤＲ：complementarity dete
rmining region）以外、全領域をヒトモノクローナル抗
体抗体の対応領域と組換えたキメラモノクローナル抗体
も本発明の「モノクローナル抗体」に包含される。
の製造方法に限定されることなく、いかなる方法で得ら
れたものであってもよい。また、通常「モノクローナル
抗体」は、免疫感作を施す哺乳動物の種類によりそれぞ
れ異なる構造の糖鎖を有するが、本発明における「モノ
クローナル抗体」は該糖鎖の構造差異により限定される
ものではなく、あらゆる哺乳動物由来のモノクローナル
抗体をも包含するものである。さらに、例えばヒトイム
ノグロブリン遺伝子を組み込むことにより、ヒト型抗体
を産生するように遺伝子工学的に作出されたトランスジ
ェニックマウスを用いて得られるヒト型モノクローナル
抗体、あるいは、遺伝子組換え技術により、ある哺乳動
物由来のモノクローナル抗体の定常領域（Ｆｃ領域）を
ヒトモノクローナル抗体のＦｃ領域と組み換えたキメラ
モノクローナル抗体、さらには抗原と相補的に直接結合
し得る相補性決定部位（ＣＤＲ：complementarity dete
rmining region）以外、全領域をヒトモノクローナル抗
体抗体の対応領域と組換えたキメラモノクローナル抗体
も本発明の「モノクローナル抗体」に包含される。
【００６６】以下、実施例及び参考例を挙げて本発明を
より明確に説明するが、本発明はこれらの実施例によっ
て何ら限定されるものではない。
より明確に説明するが、本発明はこれらの実施例によっ
て何ら限定されるものではない。
【００６７】
参考例１ アポトーシスの誘導 まず、１０週齢の雄ラット（アルビノウィスター種）か
ら、胸腺を取り出して１０ｍＭグルコースの入ったＫｒ
ｅｂｓ−Ｒｉｎｇｅｒホスフェート溶液で懸濁した。該
胸腺を１０Ｇｙ量の60Ｃｏのγ線で照射するか、または
１０-7Ｍデキサメタゾンによって処理した後、３７℃で
４時間インキュベーションすることにより、アポトーシ
スを誘導した。これら処理したアポトーシス胸腺を、電
子顕微鏡による形態上の観察、および２％アガロースゲ
ル電気泳動によるＤＮＡフラグメントの分析に用いた。
ら、胸腺を取り出して１０ｍＭグルコースの入ったＫｒ
ｅｂｓ−Ｒｉｎｇｅｒホスフェート溶液で懸濁した。該
胸腺を１０Ｇｙ量の60Ｃｏのγ線で照射するか、または
１０-7Ｍデキサメタゾンによって処理した後、３７℃で
４時間インキュベーションすることにより、アポトーシ
スを誘導した。これら処理したアポトーシス胸腺を、電
子顕微鏡による形態上の観察、および２％アガロースゲ
ル電気泳動によるＤＮＡフラグメントの分析に用いた。
【００６８】参考例２ ラット胸腺中でのアポトーシス
の特徴 参考例１に従って、γ線照射またはデキサメタゾン処理
によって誘導されたラット胸腺細胞のアポトーシスを特
徴づけるために、アポトーシス細胞の形態上の変化およ
びＤＮＡ断片の性質を調べた。 （１）アポトーシス細胞の形態上の変化 γ線照射処理したラット胸腺を、透過性電子顕微鏡で観
察した。正常な胸腺と比較すると、アポトーシスに特徴
的な核内でのクロマチンの凝縮、および細胞表面の微絨
毛の消失といった形態上の変化が明らかに認められた。
また、デキサメタゾンで処理したラットの胸腺において
も同様な形態上の変化が認められた。
の特徴 参考例１に従って、γ線照射またはデキサメタゾン処理
によって誘導されたラット胸腺細胞のアポトーシスを特
徴づけるために、アポトーシス細胞の形態上の変化およ
びＤＮＡ断片の性質を調べた。 （１）アポトーシス細胞の形態上の変化 γ線照射処理したラット胸腺を、透過性電子顕微鏡で観
察した。正常な胸腺と比較すると、アポトーシスに特徴
的な核内でのクロマチンの凝縮、および細胞表面の微絨
毛の消失といった形態上の変化が明らかに認められた。
また、デキサメタゾンで処理したラットの胸腺において
も同様な形態上の変化が認められた。
【００６９】（２）アポトーシス細胞で産生されるＤＮ
Ａ断片の性状 (i)ＤＮＡ断片のアガロースゲル電気泳動上の挙動 γ照射によりアポトーシスを起こした細胞を、まず溶解
用緩衝液〔５０ｍＭトリス塩酸（ｐＨ７．８）、１０ｍ
Ｍ ＥＤＴＡ、０．５％ｗ／ｖ Ｎ−ラウロニル サル
コシレートＮａ〕中で溶解した。得られたＤＮＡを０．
５ｍｇ／ｍｌＲＮａｓｅＡで２０分間、および０．５ｍ
ｇ／ｍｌプロテイナーゼＫで３０分間、充分処理した
後、２％アガロースゲル電気泳動に付した。そしてエチ
ジウムブロミドで染色したＤＮＡ断片のパターンをＵＶ
照射下で行ったフォトグラフで観察した〔Biochem. Bio
phys. Res. Commun. 194,(1993) 、第３０〜３１頁参
照〕。その結果、放射線照射胸腺由来の細胞の核ＤＮＡ
画分の２％アガロースゲル電気泳動は、クロマチンＤＮ
Ａのヌクレオソーム間が切断されていることを示すアポ
トーシスの特徴であるはしご状パターンを示した。ま
た、デキサメタゾン処理胸腺由来の細胞ＤＮＡのアガロ
ースゲル電気泳動も同様の挙動を示した。
Ａ断片の性状 (i)ＤＮＡ断片のアガロースゲル電気泳動上の挙動 γ照射によりアポトーシスを起こした細胞を、まず溶解
用緩衝液〔５０ｍＭトリス塩酸（ｐＨ７．８）、１０ｍ
Ｍ ＥＤＴＡ、０．５％ｗ／ｖ Ｎ−ラウロニル サル
コシレートＮａ〕中で溶解した。得られたＤＮＡを０．
５ｍｇ／ｍｌＲＮａｓｅＡで２０分間、および０．５ｍ
ｇ／ｍｌプロテイナーゼＫで３０分間、充分処理した
後、２％アガロースゲル電気泳動に付した。そしてエチ
ジウムブロミドで染色したＤＮＡ断片のパターンをＵＶ
照射下で行ったフォトグラフで観察した〔Biochem. Bio
phys. Res. Commun. 194,(1993) 、第３０〜３１頁参
照〕。その結果、放射線照射胸腺由来の細胞の核ＤＮＡ
画分の２％アガロースゲル電気泳動は、クロマチンＤＮ
Ａのヌクレオソーム間が切断されていることを示すアポ
トーシスの特徴であるはしご状パターンを示した。ま
た、デキサメタゾン処理胸腺由来の細胞ＤＮＡのアガロ
ースゲル電気泳動も同様の挙動を示した。
【００７０】(ii) ＤＮＡ切断様式 放射線照射またはデキサメタゾン処理によって誘導され
たアポトーシス胸腺細胞内でのＤＮＡ切断様式を、後述
するエンドラベリング法により調べた。もし、産生され
るヌクレオソームＤＮＡ断片が、その５’末端にリン酸
基を有し３’末端はフリーであるタイプであるなら
（５’−Ｐ／３’−ＯＨ生成型）、該ＤＮＡは、アルカ
リホスファターゼで前処理することなく、ターミナルデ
オキシヌクレオチジルトランスフェラーゼ（以下、Ｔｄ
Ｔという）およびα−32Ｐ−デオキシシチジントリホス
フェート〔以下、（α−32Ｐ）ｄＣＴＰという〕で処理
することにより、その３’末端をラベルすることがで
き、そして、アルカリホスファターゼで前処理した場合
に限り、ポリヌクレオチドキナーゼおよびγ−32Ｐ−ア
デノシントリホスフェート〔以下、（γ−32Ｐ）ＡＴＰ
という〕による処理によって５’末端をラベルすること
ができる。
たアポトーシス胸腺細胞内でのＤＮＡ切断様式を、後述
するエンドラベリング法により調べた。もし、産生され
るヌクレオソームＤＮＡ断片が、その５’末端にリン酸
基を有し３’末端はフリーであるタイプであるなら
（５’−Ｐ／３’−ＯＨ生成型）、該ＤＮＡは、アルカ
リホスファターゼで前処理することなく、ターミナルデ
オキシヌクレオチジルトランスフェラーゼ（以下、Ｔｄ
Ｔという）およびα−32Ｐ−デオキシシチジントリホス
フェート〔以下、（α−32Ｐ）ｄＣＴＰという〕で処理
することにより、その３’末端をラベルすることがで
き、そして、アルカリホスファターゼで前処理した場合
に限り、ポリヌクレオチドキナーゼおよびγ−32Ｐ−ア
デノシントリホスフェート〔以下、（γ−32Ｐ）ＡＴＰ
という〕による処理によって５’末端をラベルすること
ができる。
【００７１】エンドラベリング法 まず、参考例１で得られたアポトーシスラット胸腺か
ら、ＤＮＡをフェノール／クロロホルム抽出法により単
離した。得られたＤＮＡの３’末端側のラベリングは、
２５ｍＭトリス塩酸（ｐＨ７．６）、１０ｍＭ ＤＴＴ
および１ｍＭ ＣａＣｌ2 の存在下で、ＤＮＡ断片をＴ
ｄＴ（５Ｕ；宝酒造社製）および〔α−32Ｐ〕ｄＣＴＰ
（０．８３ｍＣｉ／ｍｌ；デュポン社製）とでインキュ
ベーションすることによって行った。一方、５’末端側
のラベリングは、１００ｍＭトリス塩酸（ｐＨ７．
６）、２０ｍＭ ＭｇＣｌ2 、１０ｍＭ ＤＴＴおよび
０．２ｍＭスペルミジンの存在下で、ＤＮＡ断片をＴ４
ポリヌクレオチドキナーゼ（５Ｕ；宝酒造社製）および
（γ−32Ｐ）ＡＴＰ（０．８３ｍＣｉ／ｍｌ；ジュポン
社製）とでインキュベーションすることにより行った。
ＤＮＡ鎖の末端にリン酸基がある場合には、３６ｍＭト
リス塩酸（ｐＨ８．０）及び１ｍＭ ＭｇＣｌ2 の存在
下で子ウシ小腸アルカリホスファターゼ（２０Ｕ；宝酒
造社製）で前処理することにより除去される。
ら、ＤＮＡをフェノール／クロロホルム抽出法により単
離した。得られたＤＮＡの３’末端側のラベリングは、
２５ｍＭトリス塩酸（ｐＨ７．６）、１０ｍＭ ＤＴＴ
および１ｍＭ ＣａＣｌ2 の存在下で、ＤＮＡ断片をＴ
ｄＴ（５Ｕ；宝酒造社製）および〔α−32Ｐ〕ｄＣＴＰ
（０．８３ｍＣｉ／ｍｌ；デュポン社製）とでインキュ
ベーションすることによって行った。一方、５’末端側
のラベリングは、１００ｍＭトリス塩酸（ｐＨ７．
６）、２０ｍＭ ＭｇＣｌ2 、１０ｍＭ ＤＴＴおよび
０．２ｍＭスペルミジンの存在下で、ＤＮＡ断片をＴ４
ポリヌクレオチドキナーゼ（５Ｕ；宝酒造社製）および
（γ−32Ｐ）ＡＴＰ（０．８３ｍＣｉ／ｍｌ；ジュポン
社製）とでインキュベーションすることにより行った。
ＤＮＡ鎖の末端にリン酸基がある場合には、３６ｍＭト
リス塩酸（ｐＨ８．０）及び１ｍＭ ＭｇＣｌ2 の存在
下で子ウシ小腸アルカリホスファターゼ（２０Ｕ；宝酒
造社製）で前処理することにより除去される。
【００７２】ラベリング処理後、酢酸アンモニウム／イ
ソプロパノールで処理して、ラベル化ＤＮＡをラベルに
用いられなかったヌクレオチドから沈殿させることによ
り回収した。ラベル化ＤＮＡを２％アガロースゲル電気
泳動にかけた後、ゲル中のＤＮＡをナイロン膜に転写
し、そのナイロン膜をオートラジオグラフィーにかけ
た。得られたオートラジオグラムを図２に示す（ａは、
放射線照射アポトーシス誘導胸腺由来のＤＮＡ、ｂは、
デキサメタゾン処理アポトーシス誘導胸腺由来のＤＮ
Ａ）。これから明らかなように、放射線照射およびデキ
サメタゾン処理それぞれによって誘導された両者のアポ
トーシス胸腺において、３’−ＯＨと５’−Ｐ末端を有
するＤＮＡ断片が産生されていることが判明した。これ
らの結果から、アポトーシスは、ＤＮＡ鎖の３’−ＯＨ
／５’−Ｐ切断末端を生じるエンドヌクレアーゼによっ
て触媒されるものと考えられた。
ソプロパノールで処理して、ラベル化ＤＮＡをラベルに
用いられなかったヌクレオチドから沈殿させることによ
り回収した。ラベル化ＤＮＡを２％アガロースゲル電気
泳動にかけた後、ゲル中のＤＮＡをナイロン膜に転写
し、そのナイロン膜をオートラジオグラフィーにかけ
た。得られたオートラジオグラムを図２に示す（ａは、
放射線照射アポトーシス誘導胸腺由来のＤＮＡ、ｂは、
デキサメタゾン処理アポトーシス誘導胸腺由来のＤＮ
Ａ）。これから明らかなように、放射線照射およびデキ
サメタゾン処理それぞれによって誘導された両者のアポ
トーシス胸腺において、３’−ＯＨと５’−Ｐ末端を有
するＤＮＡ断片が産生されていることが判明した。これ
らの結果から、アポトーシスは、ＤＮＡ鎖の３’−ＯＨ
／５’−Ｐ切断末端を生じるエンドヌクレアーゼによっ
て触媒されるものと考えられた。
【００７３】参考例３ エンドヌクレアーゼ（ＤＮａｓ
ｅ）活性の測定 （１）アッセイ１ エンドヌクレアーゼ（ＤＮａｓｅ）の活性は、内在性の
エンドヌクレアーゼを全く含有しないＨｅＬａ Ｓ３細
胞（ヒト子宮頸癌上皮細胞）の核を基質として該核のク
ロモソームＤＮＡの分解を２％アガロースゲル電気泳動
で見ることにより測定することができる〔Biochem. Bio
phys. Res. Commun. 194, (1993)、第３０〜３１頁参
照〕。詳細には、ＨｅＬａ Ｓ３細胞（１．６７×１０
7 ／ｍｌ）およびＤＮａｓｅ画分を含有する反応混液
（３０μｌ）中で３７℃、６０分間処理した後、氷上で
冷却することにより反応を停止する。次いで、反応を終
えた反応混液を２０，０００×ｇで２０秒間遠心し、沈
殿した核を溶解用緩衝液〔５０ｍＭトリス塩酸（ｐＨ
７．８）、１０ｍＭ ＥＤＴＡ、０．５％ｗ／ｖ Ｎ−
ラウロニル サルコシレートＮａ〕中で溶解する。得ら
れたＤＮＡを０．５ｍｇ／ｍｌ ＲＮａｓｅＡで２０分
間、および０．５ｍｇ／ｍｌプロテイナーゼＫで３０分
間、充分処理した後、２％アガロースゲル電気泳動に付
す。エチジウムブロミドで染色したＤＮＡ断片のパター
ンをＵＶ照射下で行ったフォトグラフで観察する。断片
化した割合は（パーセント フラグメンテーション）
を、分子量５ｋｂ未満のＤＮＡ断片の密度によって求め
る。
ｅ）活性の測定 （１）アッセイ１ エンドヌクレアーゼ（ＤＮａｓｅ）の活性は、内在性の
エンドヌクレアーゼを全く含有しないＨｅＬａ Ｓ３細
胞（ヒト子宮頸癌上皮細胞）の核を基質として該核のク
ロモソームＤＮＡの分解を２％アガロースゲル電気泳動
で見ることにより測定することができる〔Biochem. Bio
phys. Res. Commun. 194, (1993)、第３０〜３１頁参
照〕。詳細には、ＨｅＬａ Ｓ３細胞（１．６７×１０
7 ／ｍｌ）およびＤＮａｓｅ画分を含有する反応混液
（３０μｌ）中で３７℃、６０分間処理した後、氷上で
冷却することにより反応を停止する。次いで、反応を終
えた反応混液を２０，０００×ｇで２０秒間遠心し、沈
殿した核を溶解用緩衝液〔５０ｍＭトリス塩酸（ｐＨ
７．８）、１０ｍＭ ＥＤＴＡ、０．５％ｗ／ｖ Ｎ−
ラウロニル サルコシレートＮａ〕中で溶解する。得ら
れたＤＮＡを０．５ｍｇ／ｍｌ ＲＮａｓｅＡで２０分
間、および０．５ｍｇ／ｍｌプロテイナーゼＫで３０分
間、充分処理した後、２％アガロースゲル電気泳動に付
す。エチジウムブロミドで染色したＤＮＡ断片のパター
ンをＵＶ照射下で行ったフォトグラフで観察する。断片
化した割合は（パーセント フラグメンテーション）
を、分子量５ｋｂ未満のＤＮＡ断片の密度によって求め
る。
【００７４】（２）アッセイ２ また、エンドヌクレアーゼ（ＤＮａｓｅ）の活性は、ス
ーパーコイルドｐＢＳIIＳＫ(-) プラスミドを基質とし
て該プラスミドのクロモソームＤＮＡの分解を０．８％
アガロースゲル電気泳動で見ることにより測定すること
ができる。詳細には、スーパーコイルドｐＢＳIIＳＫ
(-) プラスミド（６．６７ｍｇ／ｍｌ）およびＤＮａｓ
ｅ画分を含有する反応混液（３０μｌ）中で３７℃、１
０分間処理した後、氷上で冷却することにより反応を停
止する。次いで、反応を終えた反応混液をフェノール／
クロロホルム処理することにより、プラスミドＤＮＡを
抽出し、その水層を０．８％アガロースゲル電気泳動に
付す。エチジウムブロミドで染色したＤＮＡ断片のパタ
ーンをＵＶ照射下で行ったフォトグラフで観察する。断
片化した割合は（パーセント フラグメンテーション）
を、分子量５ｋｂ未満のＤＮＡ断片の密度によって求め
る。
ーパーコイルドｐＢＳIIＳＫ(-) プラスミドを基質とし
て該プラスミドのクロモソームＤＮＡの分解を０．８％
アガロースゲル電気泳動で見ることにより測定すること
ができる。詳細には、スーパーコイルドｐＢＳIIＳＫ
(-) プラスミド（６．６７ｍｇ／ｍｌ）およびＤＮａｓ
ｅ画分を含有する反応混液（３０μｌ）中で３７℃、１
０分間処理した後、氷上で冷却することにより反応を停
止する。次いで、反応を終えた反応混液をフェノール／
クロロホルム処理することにより、プラスミドＤＮＡを
抽出し、その水層を０．８％アガロースゲル電気泳動に
付す。エチジウムブロミドで染色したＤＮＡ断片のパタ
ーンをＵＶ照射下で行ったフォトグラフで観察する。断
片化した割合は（パーセント フラグメンテーション）
を、分子量５ｋｂ未満のＤＮＡ断片の密度によって求め
る。
【００７５】なお、ＤＮａｓｅαとβの活性を測定する
ための好適な反応液として、３ｍＭＭｇＣｌ2 、１ｍＭ
２−メルカプトエタノール及び０．１ｍＭ ＰＭＳＦ
を含有する５０ｍＭ ＭＥＳ−ＮａＯＨ（ｐＨ５．６）
緩衝液を用いる。また、ＤＮａｓｅγの活性を測定する
ための好適な反応液として、３ｍＭ ＣａＣｌ2 、３ｍ
Ｍ ＭｇＣｌ2 、１ｍＭ ２−メルカプトエタノール及
び０．１ｍＭ ＰＭＳＦを含有する５０ｍＭ ＭＯＰＳ
−ＮａＯＨ（ｐＨ７．２）緩衝液を用いる。
ための好適な反応液として、３ｍＭＭｇＣｌ2 、１ｍＭ
２−メルカプトエタノール及び０．１ｍＭ ＰＭＳＦ
を含有する５０ｍＭ ＭＥＳ−ＮａＯＨ（ｐＨ５．６）
緩衝液を用いる。また、ＤＮａｓｅγの活性を測定する
ための好適な反応液として、３ｍＭ ＣａＣｌ2 、３ｍ
Ｍ ＭｇＣｌ2 、１ｍＭ ２−メルカプトエタノール及
び０．１ｍＭ ＰＭＳＦを含有する５０ｍＭ ＭＯＰＳ
−ＮａＯＨ（ｐＨ７．２）緩衝液を用いる。
【００７６】参考例４ ＤＮａｓｅ−活性ゲルシステム ＤＮａｓｅの活性物を同定し、またそれらの分子量を決
定するために、Rosenthal らによるＤＮａｓｅ−活性ゲ
ルシステム〔Anal.Biochem. 80, 76-90, (1977) 参照〕
を少々変えて用いた。すなわち、まず実施例１で精製、
取得した各種ＤＮａｓｅを天然の子ウシ胸腺ＤＮＡを２
００μｇ／ｍｌ含むＬａｅｍｍｌｉ ＳＤＳ−ＰＡＧＥ
ゲル中で電気泳動することにより分離した。なお、標準
タンパクで測定したＳＤＳゲル上での分子量の検量線
は、ＳＤＳゲル中の２００μｇ／ｍｌの２重鎖ＤＮＡの
存在によっては影響されなかった。電気泳動後、そのゲ
ルを１０ｍＭトリス塩酸（ｐＨ７．８）および５ｍＭ
２−メルカプトエタノールを用いて５０℃で１時間洗浄
してＳＤＳを除去し、それから４℃で１０ｍＭトリス塩
酸（ｐＨ７．８）で一晩おいて、該ＤＮａｓｅをリフォ
ールディングさせた。次いで該ゲルを１０ｍＭトリス塩
酸（ｐＨ７．８）、３ｍＭ ＣａＣｌ2 および３ｍＭ
ＭｇＣｌ2 を含有する溶液を用いて３７℃で適当時間イ
ンキュベーションした。明確なヌクレアーゼ活性は、ゲ
ルをエチジウムブロミドで染色して、ＵＶでトランス照
射した後、蛍光バックグランド上で暗領域として検出さ
れた。
定するために、Rosenthal らによるＤＮａｓｅ−活性ゲ
ルシステム〔Anal.Biochem. 80, 76-90, (1977) 参照〕
を少々変えて用いた。すなわち、まず実施例１で精製、
取得した各種ＤＮａｓｅを天然の子ウシ胸腺ＤＮＡを２
００μｇ／ｍｌ含むＬａｅｍｍｌｉ ＳＤＳ−ＰＡＧＥ
ゲル中で電気泳動することにより分離した。なお、標準
タンパクで測定したＳＤＳゲル上での分子量の検量線
は、ＳＤＳゲル中の２００μｇ／ｍｌの２重鎖ＤＮＡの
存在によっては影響されなかった。電気泳動後、そのゲ
ルを１０ｍＭトリス塩酸（ｐＨ７．８）および５ｍＭ
２−メルカプトエタノールを用いて５０℃で１時間洗浄
してＳＤＳを除去し、それから４℃で１０ｍＭトリス塩
酸（ｐＨ７．８）で一晩おいて、該ＤＮａｓｅをリフォ
ールディングさせた。次いで該ゲルを１０ｍＭトリス塩
酸（ｐＨ７．８）、３ｍＭ ＣａＣｌ2 および３ｍＭ
ＭｇＣｌ2 を含有する溶液を用いて３７℃で適当時間イ
ンキュベーションした。明確なヌクレアーゼ活性は、ゲ
ルをエチジウムブロミドで染色して、ＵＶでトランス照
射した後、蛍光バックグランド上で暗領域として検出さ
れた。
【００７７】実施例１ ＤＮａｓｅα，βおよびγの精
製 特に示さない限り、以下の処理はすべて０〜４℃で行っ
た。まず、ラット胸腺を０．１％ノイデットＰ−４０(N
P −40) を含有する緩衝液Ａ〔１０ｍＭトリス塩酸（ｐ
Ｈ７．８）、２ｍＭ ２−メルカプトエタノール、０．
３ｍＭ ＰＭＳＦ、３ｍＭ ＭｇＣｌ2 〕中でホモジネ
ートした。該ホモジネートを６００×ｇで１０分間、遠
心分離にかけた。沈殿した核画分（ミトコンドリアを含
有する）を集め、上清画分をさらに１５０，０００×ｇ
で１時間遠心した。その沈殿画分を膜画分（ミクロソー
ムを含有する）と称し、上清画分をサイトゾル画分と称
した。得られた各画分中に存するエンドヌクレアーゼ活
性を参考例３に記載の方法に準じて測定したところ、核
（ミトコンドリア含有）画分、膜（ミクロソーム含有）
画分およびサイトゾル画分にそれぞれ約６５％、２５％
および１０％の活性が局在していた。そこで、核画分を
原料としてエンドヌクレアーゼの精製を行った。
製 特に示さない限り、以下の処理はすべて０〜４℃で行っ
た。まず、ラット胸腺を０．１％ノイデットＰ−４０(N
P −40) を含有する緩衝液Ａ〔１０ｍＭトリス塩酸（ｐ
Ｈ７．８）、２ｍＭ ２−メルカプトエタノール、０．
３ｍＭ ＰＭＳＦ、３ｍＭ ＭｇＣｌ2 〕中でホモジネ
ートした。該ホモジネートを６００×ｇで１０分間、遠
心分離にかけた。沈殿した核画分（ミトコンドリアを含
有する）を集め、上清画分をさらに１５０，０００×ｇ
で１時間遠心した。その沈殿画分を膜画分（ミクロソー
ムを含有する）と称し、上清画分をサイトゾル画分と称
した。得られた各画分中に存するエンドヌクレアーゼ活
性を参考例３に記載の方法に準じて測定したところ、核
（ミトコンドリア含有）画分、膜（ミクロソーム含有）
画分およびサイトゾル画分にそれぞれ約６５％、２５％
および１０％の活性が局在していた。そこで、核画分を
原料としてエンドヌクレアーゼの精製を行った。
【００７８】まず、核画分中のＤＮａｓｅ活性物を０．
５Ｍ硫安を含有する緩衝液Ａ中で超音波処理することに
より溶解し、核の残骸物は１５０，０００×ｇで１時間
遠心することにより除去した。得られた上清（核抽出
物）を緩衝液Ｎ〔２０ｍＭトリス塩酸（ｐＨ７．８）、
１ｍＭ ２−メルカプトエタノール、０．１ｍＭ ＰＭ
ＳＦ、１０％エチレングリコール〕で平衡化したＳ−セ
ファロースカラム（１ｃｍ Ｉ．Ｄ．×１３ｃｍ；ファ
ルマシア社製）に付した。そのカラムを緩衝液Ｎで洗浄
した後、緩衝液Ｎ中の塩濃度（ＫＣｌ）を０Ｍ〜１Ｍ
（３００分間）まで直線的に増加させることにより展開
させた（流速０．１５ｍｌ／ｍｉｎ）。参考例３のアッ
セイ１の方法で測定した結果、ＤＮａｓｅの活性物は
０．６Ｍ ＫＣｌで溶出したシングルピークとして回収
された。この活性物画分を緩衝液Ｎで平衡化したＣＭ５
ＰＷカラム（５ｍｍ Ｉ．Ｄ．×５０ｍｍ；東ソー社
製）によるＨＰＬＣに供して、緩衝液Ｎの０〜１Ｍ Ｋ
Ｃｌの直線グラジェント（３５分間）で溶出させた（流
速０．３ｍｌ／ｍｉｎ）。
５Ｍ硫安を含有する緩衝液Ａ中で超音波処理することに
より溶解し、核の残骸物は１５０，０００×ｇで１時間
遠心することにより除去した。得られた上清（核抽出
物）を緩衝液Ｎ〔２０ｍＭトリス塩酸（ｐＨ７．８）、
１ｍＭ ２−メルカプトエタノール、０．１ｍＭ ＰＭ
ＳＦ、１０％エチレングリコール〕で平衡化したＳ−セ
ファロースカラム（１ｃｍ Ｉ．Ｄ．×１３ｃｍ；ファ
ルマシア社製）に付した。そのカラムを緩衝液Ｎで洗浄
した後、緩衝液Ｎ中の塩濃度（ＫＣｌ）を０Ｍ〜１Ｍ
（３００分間）まで直線的に増加させることにより展開
させた（流速０．１５ｍｌ／ｍｉｎ）。参考例３のアッ
セイ１の方法で測定した結果、ＤＮａｓｅの活性物は
０．６Ｍ ＫＣｌで溶出したシングルピークとして回収
された。この活性物画分を緩衝液Ｎで平衡化したＣＭ５
ＰＷカラム（５ｍｍ Ｉ．Ｄ．×５０ｍｍ；東ソー社
製）によるＨＰＬＣに供して、緩衝液Ｎの０〜１Ｍ Ｋ
Ｃｌの直線グラジェント（３５分間）で溶出させた（流
速０．３ｍｌ／ｍｉｎ）。
【００７９】その結果、エンドヌクレアーゼの活性が約
０．２４Ｍ、０．３４Ｍおよび０．５５Ｍ ＫＣｌ濃度
によって溶出される３つの画分にそれぞれ認められ、溶
出順にＤＮａｓｅα、βおよびγと名付けられた（図
３）。さらに、それぞれの活性画分（ＤＮａｓｅα、Ｄ
ＮａｓｅβおよびＤＮａｓｅγ）について、ヘパリン５
ＰＷ、Ｇ２０００ＳＷおよびＣＭ５ＰＷカラムを用いた
連続したＨＰＬＣにより精製を行った。詳細には、まず
各ＤＮａｓｅ画分を緩衝液Ｎで平衡化したヘパリン５Ｐ
Ｗカラム（５ｍｍ Ｉ．Ｄ．×５０ｍｍ；東ソー社製）
に付し、蛋白質を緩衝液Ｎの０〜１Ｍ ＫＣｌの直線グ
ラジェント（３５分間）で展開、溶出させた（流速０．
３ｍｌ／ｍｉｎ）。溶出活性画分をさらに０．３Ｍ Ｎ
ａＣｌを含有する緩衝液Ｓ〔２０ｍＭ ＭＯＰＳ−Ｎａ
ＯＨ（ｐＨ７．０）、１ｍＭ ２−メルカプトエタノー
ル、０．１ｍＭ ＰＭＳＦ、５％エチレングリコール〕
で平衡化したＧ２０００ＳＷカラム（８ｍｍ Ｉ．Ｄ．
×３０ｃｍ；東ソー社製）を用いたゲル濾過ＨＰＬＣ
（流速０．５ｍｌ／ｍｉｎ）で精製した。得られたＤＮ
ａｓｅ画分を最終的に、０．３Ｍ ＮａＣｌを含有する
緩衝液Ｓで平衡化したＣＭ５ＰＷカラム（５ｍｍ Ｉ．
Ｄ．×５０ｍｍ；東ソー社製）によるＨＰＬＣに付し
て、目的ＤＮａｓｅを緩衝液Ｓの０．３〜１．５Ｍ Ｎ
ａＣｌの直線グラジェント（３５分間）で展開、溶出さ
せた（流速０．３ｍｌ／ｍｉｎ）。得られたＤＮａｓｅ
画分を緩衝液Ｓに対して透析して０〜４℃で保存した。
なお、ＨＰＬＣで得られる各フラクション中のＤＮａｓ
ｅ活性は、参考例３（１）に記載の方法を用いて測定し
た。
０．２４Ｍ、０．３４Ｍおよび０．５５Ｍ ＫＣｌ濃度
によって溶出される３つの画分にそれぞれ認められ、溶
出順にＤＮａｓｅα、βおよびγと名付けられた（図
３）。さらに、それぞれの活性画分（ＤＮａｓｅα、Ｄ
ＮａｓｅβおよびＤＮａｓｅγ）について、ヘパリン５
ＰＷ、Ｇ２０００ＳＷおよびＣＭ５ＰＷカラムを用いた
連続したＨＰＬＣにより精製を行った。詳細には、まず
各ＤＮａｓｅ画分を緩衝液Ｎで平衡化したヘパリン５Ｐ
Ｗカラム（５ｍｍ Ｉ．Ｄ．×５０ｍｍ；東ソー社製）
に付し、蛋白質を緩衝液Ｎの０〜１Ｍ ＫＣｌの直線グ
ラジェント（３５分間）で展開、溶出させた（流速０．
３ｍｌ／ｍｉｎ）。溶出活性画分をさらに０．３Ｍ Ｎ
ａＣｌを含有する緩衝液Ｓ〔２０ｍＭ ＭＯＰＳ−Ｎａ
ＯＨ（ｐＨ７．０）、１ｍＭ ２−メルカプトエタノー
ル、０．１ｍＭ ＰＭＳＦ、５％エチレングリコール〕
で平衡化したＧ２０００ＳＷカラム（８ｍｍ Ｉ．Ｄ．
×３０ｃｍ；東ソー社製）を用いたゲル濾過ＨＰＬＣ
（流速０．５ｍｌ／ｍｉｎ）で精製した。得られたＤＮ
ａｓｅ画分を最終的に、０．３Ｍ ＮａＣｌを含有する
緩衝液Ｓで平衡化したＣＭ５ＰＷカラム（５ｍｍ Ｉ．
Ｄ．×５０ｍｍ；東ソー社製）によるＨＰＬＣに付し
て、目的ＤＮａｓｅを緩衝液Ｓの０．３〜１．５Ｍ Ｎ
ａＣｌの直線グラジェント（３５分間）で展開、溶出さ
せた（流速０．３ｍｌ／ｍｉｎ）。得られたＤＮａｓｅ
画分を緩衝液Ｓに対して透析して０〜４℃で保存した。
なお、ＨＰＬＣで得られる各フラクション中のＤＮａｓ
ｅ活性は、参考例３（１）に記載の方法を用いて測定し
た。
【００８０】これらのクロマトグラフィーの結果、どの
クロマトグラフィーにおいても、それぞれのＤＮａｓｅ
について、複合体および様々な形態の相互変換は見られ
なかった。すなわち、ＤＮａｓｅα，βおよびγはそれ
ぞれ単量体で存在していると考えられた。
クロマトグラフィーにおいても、それぞれのＤＮａｓｅ
について、複合体および様々な形態の相互変換は見られ
なかった。すなわち、ＤＮａｓｅα，βおよびγはそれ
ぞれ単量体で存在していると考えられた。
【００８１】また、同様に放射線照射処理したアポトー
シス胸腺由来の細胞核について精製を行ったＣＭ５ＰＷ
ＨＰＬＣのプロファイルを図４に示す。これから、放
射線照射によりアポトーシスを誘導させるとＤＮａｓｅ
αとβの活性が減少するのに対して、ＤＮａｓｅγ活性
は全く影響されないことが分かった。同様な結果がデキ
サメタゾン処理によるアポトーシス胸腺でも見られた。
シス胸腺由来の細胞核について精製を行ったＣＭ５ＰＷ
ＨＰＬＣのプロファイルを図４に示す。これから、放
射線照射によりアポトーシスを誘導させるとＤＮａｓｅ
αとβの活性が減少するのに対して、ＤＮａｓｅγ活性
は全く影響されないことが分かった。同様な結果がデキ
サメタゾン処理によるアポトーシス胸腺でも見られた。
【００８２】実施例２ ＤＮａｓｅの性質 （１）分子量 実施例１に従って精製したＤＮａｓｅα、βおよびγそ
れぞれの分子量を参考例４に記載のＳＤＳ−ＰＡＧＥ再
生法（活性ゲルシステム）によって求めた。この活性ゲ
ルシステムは、ＳＤＳを除去した後に再生され、インキ
ュベーション中にＤＮＡを分解するＤＮａｓｅの能力に
基づくものである。ゲル中のＤＮａｓｅの局在は、エチ
ジウムブロミド−蛍光バックグラウンド上の暗バンドと
して、ＤＮＡ蛍光の消失により検出することができる。
結果を図５に示す。ＤＮａｓｅγとのインキュベーショ
ン用溶媒にＣａ2+／Ｍｇ2+を添加すると、３３ｋＤａタ
ンパクに相当する部分に非蛍光性のバンドが見られた
（レーン３）。一方、ＤＮａｓｅα（レーン１）および
ＤＮａｓｅβ（レーン２）は、共に３２ｋＤａのタンパ
クに相当する部分に非蛍光性のバンドを示した。
れぞれの分子量を参考例４に記載のＳＤＳ−ＰＡＧＥ再
生法（活性ゲルシステム）によって求めた。この活性ゲ
ルシステムは、ＳＤＳを除去した後に再生され、インキ
ュベーション中にＤＮＡを分解するＤＮａｓｅの能力に
基づくものである。ゲル中のＤＮａｓｅの局在は、エチ
ジウムブロミド−蛍光バックグラウンド上の暗バンドと
して、ＤＮＡ蛍光の消失により検出することができる。
結果を図５に示す。ＤＮａｓｅγとのインキュベーショ
ン用溶媒にＣａ2+／Ｍｇ2+を添加すると、３３ｋＤａタ
ンパクに相当する部分に非蛍光性のバンドが見られた
（レーン３）。一方、ＤＮａｓｅα（レーン１）および
ＤＮａｓｅβ（レーン２）は、共に３２ｋＤａのタンパ
クに相当する部分に非蛍光性のバンドを示した。
【００８３】また、ＤＮａｓｅα、βおよびγをそれぞ
れＧ２０００ＳＷカラム（８ｍｍＩ．Ｄ．×３０ｃｍ；
東ソー社製）を用いたゲル濾過ＨＰＬＣ（流速：０．５
ｍｌ／ｍｉｎ、溶離液：０．３Ｍ ＮａＣｌ含有緩衝液
Ｓ〔２０ｍＭ ＭＯＰＳ−ＮａＯＨ（ｐＨ７．０）、１
ｍＭ ２−メルカプトエタノール、０．１ｍＭ ＰＭＳ
Ｆ、５％エチレングリコール〕）にかけたところ、それ
ぞれ２８ｋＤａ（図６中、ａ）、３０ｋＤａ（図６中、
ｂ）および３１ｋＤａ（図６中、ｃ）のシングルピーク
として検出された（図６）。
れＧ２０００ＳＷカラム（８ｍｍＩ．Ｄ．×３０ｃｍ；
東ソー社製）を用いたゲル濾過ＨＰＬＣ（流速：０．５
ｍｌ／ｍｉｎ、溶離液：０．３Ｍ ＮａＣｌ含有緩衝液
Ｓ〔２０ｍＭ ＭＯＰＳ−ＮａＯＨ（ｐＨ７．０）、１
ｍＭ ２−メルカプトエタノール、０．１ｍＭ ＰＭＳ
Ｆ、５％エチレングリコール〕）にかけたところ、それ
ぞれ２８ｋＤａ（図６中、ａ）、３０ｋＤａ（図６中、
ｂ）および３１ｋＤａ（図６中、ｃ）のシングルピーク
として検出された（図６）。
【００８４】（２）ＤＮａｓｅの至適ｐＨ ＤＮａｓｅα、βおよびγの活性の至適ｐＨは、酸性か
ら塩基性までの様々な緩衝液中でＨｅＬａ Ｓ３核アッ
セイ（参考例３、アッセイ１）を行い、そのＤＮＡ断片
化の割合から求めた。図７に、その結果〔ＨｅＬａ Ｓ
３核アッセイシステムでのＤＮａｓｅα（図ａ）、β
（図ｂ）およびγ（図ｃ）のｐＨ依存性〕を示す。な
お、測定に用いた緩衝液は、図７の左端レーンから、酢
酸−ＫＯＨ緩衝液（ｐＨ４．０、ｐＨ４．４、ｐＨ４．
８、ｐＨ５．２およびｐＨ５．６）、ＭＥＳ−ＮａＯＨ
緩衝液（ｐＨ５．６およびｐＨ６．２）、ＭＯＰＳ−Ｎ
ａＯＨ緩衝液（ｐＨ６．８、ｐＨ７．２およびｐＨ７．
６）、Ｔｒｉｓ−ＨＣ緩衝液（ｐＨ７．４、ｐＨ７．
８、ｐＨ８．２およびｐＨ９．０）およびＣＨＥＳ−Ｎ
ａＯＨ緩衝液（ｐＨ８．６、ｐＨ９．４およびｐＨ１
０．４）である。これからわかるように、ＤＮａｓｅα
の活性は、酢酸−ＫＯＨ緩衝液（ｐＨ５．６）〜ＭＥＳ
−ＮａＯＨ緩衝液（ｐＨ５．６）で見られ、またＤＮａ
ｓｅβの活性は酢酸−ＫＯＨ緩衝液（ｐＨ５．６）〜Ｍ
ＥＳ−ＮａＯＨ緩衝液（ｐＨ５．６、６．２）で見ら
れ、至適ｐＨは共に約５．６であると判断された。一
方、ＤＮａｓｅγの活性は、ＭＯＰＳ−ＮａＯＨ緩衝液
（ｐＨ７．２）付近で最大であり、至適ｐＨは約７．２
であると判断された。
ら塩基性までの様々な緩衝液中でＨｅＬａ Ｓ３核アッ
セイ（参考例３、アッセイ１）を行い、そのＤＮＡ断片
化の割合から求めた。図７に、その結果〔ＨｅＬａ Ｓ
３核アッセイシステムでのＤＮａｓｅα（図ａ）、β
（図ｂ）およびγ（図ｃ）のｐＨ依存性〕を示す。な
お、測定に用いた緩衝液は、図７の左端レーンから、酢
酸−ＫＯＨ緩衝液（ｐＨ４．０、ｐＨ４．４、ｐＨ４．
８、ｐＨ５．２およびｐＨ５．６）、ＭＥＳ−ＮａＯＨ
緩衝液（ｐＨ５．６およびｐＨ６．２）、ＭＯＰＳ−Ｎ
ａＯＨ緩衝液（ｐＨ６．８、ｐＨ７．２およびｐＨ７．
６）、Ｔｒｉｓ−ＨＣ緩衝液（ｐＨ７．４、ｐＨ７．
８、ｐＨ８．２およびｐＨ９．０）およびＣＨＥＳ−Ｎ
ａＯＨ緩衝液（ｐＨ８．６、ｐＨ９．４およびｐＨ１
０．４）である。これからわかるように、ＤＮａｓｅα
の活性は、酢酸−ＫＯＨ緩衝液（ｐＨ５．６）〜ＭＥＳ
−ＮａＯＨ緩衝液（ｐＨ５．６）で見られ、またＤＮａ
ｓｅβの活性は酢酸−ＫＯＨ緩衝液（ｐＨ５．６）〜Ｍ
ＥＳ−ＮａＯＨ緩衝液（ｐＨ５．６、６．２）で見ら
れ、至適ｐＨは共に約５．６であると判断された。一
方、ＤＮａｓｅγの活性は、ＭＯＰＳ−ＮａＯＨ緩衝液
（ｐＨ７．２）付近で最大であり、至適ｐＨは約７．２
であると判断された。
【００８５】（３）二価陽イオンの影響 ＤＮａｓｅα、ＤＮａｓｅβおよびＤＮａｓｅγの活性
に対する二価陽イオンの影響を調べた。具体的には、Ｍ
ｇ2+の影響は、精製したＤＮａｓｅα、βおよびγの活
性を３ｍＭ ＣａＣｌ2 の存在下でＭｇＣｌ2 の濃度を
増加させて測定することにより調べた。またＣａ2+の影
響は、同様に精製したＤＮａｓｅα、βおよびγの活性
を３ｍＭ ＭｇＣｌ2 の存在下でＣａＣｌ2 の濃度を増
加させて測定することにより調べた。さらにＺｎ2+の影
響は、ＤＮａｓｅαおよびβについては、３ｍＭ Ｍｇ
Ｃｌ2 、１ｍＭ ２−メルカプトエタノール及び０．１
ｍＭ ＰＭＳＦを含有する５０ｍＭ ＭＥＳ−ＮａＯＨ
（ｐＨ５．６）緩衝液中でＺｎＣｌ2 の濃度を増加させ
て調べ、ＤＮａｓｅγについては３ｍＭ ＣａＣｌ2 、
３ｍＭ ＭｇＣｌ2 、１ｍＭ ２−メルカプトエタノー
ル及び０．１ｍＭＰＭＳＦを含有する５０ｍＭ ＭＯＰ
Ｓ−ＮａＯＨ（ｐＨ７．２）緩衝液中でＺｎＣｌ2 の濃
度を増加させて調べた。結果を図８に示す。この結果、
ＤＮａｓｅγは、フル活性のためにＣａ2+とＭｇ2+の両
者を必要とし、その両者の至適濃度はともに１〜３ｍＭ
であった（図８、ａ，ｂ）。また、ＤＮａｓｅγは、Ｚ
ｎ2+に感受性があり、４０μＭという低濃度のＺｎ2+に
よって活性が５０％阻害された（図８ｃ）。一方、ＤＮ
ａｓｅα及びＤＮａｓｅβの活性は、Ｍｇ2+やＣａ2+等
によって影響されず、また１ｍＭまではＺｎ2+の存在に
よっても影響されなかった。しかし、１０〜３０ｍＭと
いう高濃度の金属イオンの存在により、ＤＮａｓｅγと
同様にＤＮａｓｅαおよびβのＤＮａｓｅ活性も阻害さ
れた。
に対する二価陽イオンの影響を調べた。具体的には、Ｍ
ｇ2+の影響は、精製したＤＮａｓｅα、βおよびγの活
性を３ｍＭ ＣａＣｌ2 の存在下でＭｇＣｌ2 の濃度を
増加させて測定することにより調べた。またＣａ2+の影
響は、同様に精製したＤＮａｓｅα、βおよびγの活性
を３ｍＭ ＭｇＣｌ2 の存在下でＣａＣｌ2 の濃度を増
加させて測定することにより調べた。さらにＺｎ2+の影
響は、ＤＮａｓｅαおよびβについては、３ｍＭ Ｍｇ
Ｃｌ2 、１ｍＭ ２−メルカプトエタノール及び０．１
ｍＭ ＰＭＳＦを含有する５０ｍＭ ＭＥＳ−ＮａＯＨ
（ｐＨ５．６）緩衝液中でＺｎＣｌ2 の濃度を増加させ
て調べ、ＤＮａｓｅγについては３ｍＭ ＣａＣｌ2 、
３ｍＭ ＭｇＣｌ2 、１ｍＭ ２−メルカプトエタノー
ル及び０．１ｍＭＰＭＳＦを含有する５０ｍＭ ＭＯＰ
Ｓ−ＮａＯＨ（ｐＨ７．２）緩衝液中でＺｎＣｌ2 の濃
度を増加させて調べた。結果を図８に示す。この結果、
ＤＮａｓｅγは、フル活性のためにＣａ2+とＭｇ2+の両
者を必要とし、その両者の至適濃度はともに１〜３ｍＭ
であった（図８、ａ，ｂ）。また、ＤＮａｓｅγは、Ｚ
ｎ2+に感受性があり、４０μＭという低濃度のＺｎ2+に
よって活性が５０％阻害された（図８ｃ）。一方、ＤＮ
ａｓｅα及びＤＮａｓｅβの活性は、Ｍｇ2+やＣａ2+等
によって影響されず、また１ｍＭまではＺｎ2+の存在に
よっても影響されなかった。しかし、１０〜３０ｍＭと
いう高濃度の金属イオンの存在により、ＤＮａｓｅγと
同様にＤＮａｓｅαおよびβのＤＮａｓｅ活性も阻害さ
れた。
【００８６】また、表２に示す条件下での各ＤＮａｓｅ
のエンドヌクレアーゼ活性を測定した結果を示す〔参考
例２（１）アッセイ１使用〕。なお、ＤＮａｓｅαおよ
びβは、基質としてＨｅＬａ Ｓ３細胞核クロマチンＤ
ＮＡ、反応液として３ｍＭ ＭｇＣｌ2 、１ｍＭ ２−
メルカプトエタノール及び０．１ｍＭ ＰＭＳＦを含有
する５０ｍＭ ＭＥＳ−ＮａＯＨ（ｐＨ５．６）緩衝液
を用いて測定したエンドヌクレアーゼ活性を１００％と
し、またＤＮａｓｅγは、基質としてＨｅＬａ Ｓ３細
胞核クロマチンＤＮＡ、反応液として３ｍＭ ＣａＣｌ
2 、３ｍＭ ＭｇＣｌ2 、１ｍＭ ２−メルカプトエタ
ノール及び０．１ｍＭ ＰＭＳＦを含有する５０ｍＭ
ＭＯＰＳ−ＮａＯＨ（ｐＨ７．２）緩衝液を用いて測定
したエンドヌクレアーゼ活性を１００％として活性を換
算した。なお、表中、−は上記最適反応液から該成分を
削除したことを、＋は上記最適反応液に該成分を添加し
たことを意味する。
のエンドヌクレアーゼ活性を測定した結果を示す〔参考
例２（１）アッセイ１使用〕。なお、ＤＮａｓｅαおよ
びβは、基質としてＨｅＬａ Ｓ３細胞核クロマチンＤ
ＮＡ、反応液として３ｍＭ ＭｇＣｌ2 、１ｍＭ ２−
メルカプトエタノール及び０．１ｍＭ ＰＭＳＦを含有
する５０ｍＭ ＭＥＳ−ＮａＯＨ（ｐＨ５．６）緩衝液
を用いて測定したエンドヌクレアーゼ活性を１００％と
し、またＤＮａｓｅγは、基質としてＨｅＬａ Ｓ３細
胞核クロマチンＤＮＡ、反応液として３ｍＭ ＣａＣｌ
2 、３ｍＭ ＭｇＣｌ2 、１ｍＭ ２−メルカプトエタ
ノール及び０．１ｍＭ ＰＭＳＦを含有する５０ｍＭ
ＭＯＰＳ−ＮａＯＨ（ｐＨ７．２）緩衝液を用いて測定
したエンドヌクレアーゼ活性を１００％として活性を換
算した。なお、表中、−は上記最適反応液から該成分を
削除したことを、＋は上記最適反応液に該成分を添加し
たことを意味する。
【００８７】
【表２】
【００８８】（４）ＤＮａｓｅγの加水分解の様式 上記（１）〜（３）で示されたＤＮａｓｅγの特徴は、
ＤＮａｓｅγがアポトーシスのＤＮＡ断片化に関与する
エンドヌクレアーゼである可能性を示唆するものであっ
た。そこで、ＤＮａｓｅγによって処理ＤＮＡが、３’
−ＯＨ／５’−Ｐ末端をもつフラグメントを産生するか
否かを、参考例２（２）(ii)に記載したエンドラベリン
グ法に準じて調べた。結果を図９に示す。これからわか
るように、ＤＮａｓｅγ（図中ｃ）で消化したＨｅＬａ
Ｓ３細胞核由来の精製ＤＮＡがエンドラベルされた時
に、参考例２（図２、ａ，ｂ）で見られたのと同じラベ
ルパターンが見られた。エンドラベリングの間、ＤＮＡ
断片の５’末端はアルカリホスファターゼ前処理しなけ
れば、ラベルされなかった（図９、レーン４）。これか
ら、ＤＮａｓｅγは、ＤＮＡ鎖の３’−ＯＨ／５’−Ｐ
末端を生じることが判明した。一方、ＤＮａｓｅα（図
中ａ）とβ（図中ｂ）によって生じたＤＮＡ断片は、ア
ルカリホスファターゼ前処理後にのみＴｄＴにより３’
末端がラベル化され、またアルカリホスファアーゼ前処
理しなくても５’末端が全て反応することから、３’−
Ｐ／５’−ＯＨ末端を有していることが判明した。
ＤＮａｓｅγがアポトーシスのＤＮＡ断片化に関与する
エンドヌクレアーゼである可能性を示唆するものであっ
た。そこで、ＤＮａｓｅγによって処理ＤＮＡが、３’
−ＯＨ／５’−Ｐ末端をもつフラグメントを産生するか
否かを、参考例２（２）(ii)に記載したエンドラベリン
グ法に準じて調べた。結果を図９に示す。これからわか
るように、ＤＮａｓｅγ（図中ｃ）で消化したＨｅＬａ
Ｓ３細胞核由来の精製ＤＮＡがエンドラベルされた時
に、参考例２（図２、ａ，ｂ）で見られたのと同じラベ
ルパターンが見られた。エンドラベリングの間、ＤＮＡ
断片の５’末端はアルカリホスファターゼ前処理しなけ
れば、ラベルされなかった（図９、レーン４）。これか
ら、ＤＮａｓｅγは、ＤＮＡ鎖の３’−ＯＨ／５’−Ｐ
末端を生じることが判明した。一方、ＤＮａｓｅα（図
中ａ）とβ（図中ｂ）によって生じたＤＮＡ断片は、ア
ルカリホスファターゼ前処理後にのみＴｄＴにより３’
末端がラベル化され、またアルカリホスファアーゼ前処
理しなくても５’末端が全て反応することから、３’−
Ｐ／５’−ＯＨ末端を有していることが判明した。
【００８９】以上の実験結果から、ＤＮａｓｅα，βお
よびγの性状および生理学的意義について次のことがい
える。これら３種のＤＮａｓｅは、細胞核の中に単量体
の形態で存在しており、クロマチンＤＮＡのリンカー領
域を切断し、ヌクレオソームオリゴマーを産生する。Ｄ
Ｎａｓｅαおよびβは、ともに核から容易に可溶化して
得られたことから、核質内に存在するエンドヌクレアー
ゼであると考えられる。一方、ＤＮａｓｅγは、高塩濃
度下で超音波処理しないと可溶化できないことから、あ
る核構造物と強く結合して存在していると考えられた。
よびγの性状および生理学的意義について次のことがい
える。これら３種のＤＮａｓｅは、細胞核の中に単量体
の形態で存在しており、クロマチンＤＮＡのリンカー領
域を切断し、ヌクレオソームオリゴマーを産生する。Ｄ
Ｎａｓｅαおよびβは、ともに核から容易に可溶化して
得られたことから、核質内に存在するエンドヌクレアー
ゼであると考えられる。一方、ＤＮａｓｅγは、高塩濃
度下で超音波処理しないと可溶化できないことから、あ
る核構造物と強く結合して存在していると考えられた。
【００９０】本発明のＤＮａｓｅγは、その活性にＣａ
2+およびＭｇ2+の両方を必要とする細胞核に内在するエ
ンドヌクレアーゼである。当該ＤＮａｓｅγによって切
断されるＤＮＡ断片の末端は、アポトーシスラット胸腺
で産生されるＤＮＡ断片の末端と同じ５’−Ｐ／３’−
ＯＨ生成型であり、またアポトーシスを抑制することが
知られるμＭオーダーのＺｎ2+で、ＤＮａｓｅγの活性
も抑制される。これらのことから、ＤＮａｓｅγは胸腺
のアポトーシスのＤＮＡ断片化に関与するエンドヌクレ
アーゼであると考えられる。
2+およびＭｇ2+の両方を必要とする細胞核に内在するエ
ンドヌクレアーゼである。当該ＤＮａｓｅγによって切
断されるＤＮＡ断片の末端は、アポトーシスラット胸腺
で産生されるＤＮＡ断片の末端と同じ５’−Ｐ／３’−
ＯＨ生成型であり、またアポトーシスを抑制することが
知られるμＭオーダーのＺｎ2+で、ＤＮａｓｅγの活性
も抑制される。これらのことから、ＤＮａｓｅγは胸腺
のアポトーシスのＤＮＡ断片化に関与するエンドヌクレ
アーゼであると考えられる。
【００９１】一方、本発明のＤＮａｓｅαおよびＤＮａ
ｓｅβは、物理的および酵素上の性質において上記ＤＮ
ａｓｅγと相違しており、その相違はクロモソームＤＮ
Ａの切断様式および二価の金属陽イオンの要求性におい
て顕著であった。ＤＮａｓｅαおよびβは、ＤＮａｓｅ
αおよびβと同種の形態の酵素が子ウシ胸腺の細胞核お
よびラット脾臓，肝臓の細胞核に存在していることか
ら、核機能におけるＤＮＡ代謝やウイルスＤＮＡの分解
に重要な働きを担っていると考えられる。
ｓｅβは、物理的および酵素上の性質において上記ＤＮ
ａｓｅγと相違しており、その相違はクロモソームＤＮ
Ａの切断様式および二価の金属陽イオンの要求性におい
て顕著であった。ＤＮａｓｅαおよびβは、ＤＮａｓｅ
αおよびβと同種の形態の酵素が子ウシ胸腺の細胞核お
よびラット脾臓，肝臓の細胞核に存在していることか
ら、核機能におけるＤＮＡ代謝やウイルスＤＮＡの分解
に重要な働きを担っていると考えられる。
【００９２】実施例３ ＤＮａｓｅγのｃＤＮＡクロー
ニング （１）ＤＮａｓｅγの大量精製 ラット胸腺細胞では、ＤＮａｓｅγの活性（タンパク
量）が低く、部分アミノ酸配列を決定するために必要な
十分量の該タンパクが得られなかった。そこでＤＮａｓ
ｅγ活性の高い脾臓細胞よりＤＮａｓｅγの精製を行っ
た。特に示さない限り、以下の処理は４℃で行った。ラ
ット脾臓細胞１００ｇを０．３％ノイデットＰ−４０(N
P −40) を含有する緩衝液Ａ〔１０ｍＭトリス塩酸（ｐ
Ｈ７．８）、２ｍＭ ２−メルカプトエタノール、０．
３ｍＭ ＰＭＳＦ、３ｍＭ ＭｇＣｌ2 〕中でホモジネ
ートした。該ホモジネートを６００×ｇで１０分間、遠
心分離にかけた。沈殿した核画分を集め、核画分中のＤ
Ｎａｓｅ活性物を０．３Ｍ硫安を含有する緩衝液Ａ中で
超音波処理することにより溶解し、核の残骸物は１５
０，０００×ｇで１時間遠心することにより除去した。
得られた上清（核抽出物）を緩衝液Ｎ〔２０ｍＭトリス
塩酸（ｐＨ７．８）、１ｍＭ ２−メルカプトエタノー
ル、０．１ｍＭ ＰＭＳＦ、２．５％エチレングリコー
ル〕で平衡化したＳ−カートリッジ（バイオラッド社
製）に付した。そのカラムを緩衝液Ｎで洗浄した後、緩
衝液Ｎ中の塩濃度（ＫＣｌ）を０Ｍ〜１Ｍ（５０分間）
まで直線的に増加させることにより展開させた（流速
２．０ｍｌ／ｍｉｎ）。参考例３のアッセイ１の方法で
測定した結果、ＤＮａｓｅの活性物は０．６Ｍ ＫＣｌ
で溶出したシングルピークとして回収された。この活性
物画分を緩衝液Ｎで平衡化したＣＭ５ＰＷカラム（５ｍ
ｍ Ｉ．Ｄ．×５０ｍｍ；東ソー社製）によるＨＰＬＣ
に供して、緩衝液Ｎの０〜１Ｍ ＫＣｌの直線グラジェ
ント（３０分間）で溶出させた（流速０．３ｍｌ／ｍｉ
ｎ）。
ニング （１）ＤＮａｓｅγの大量精製 ラット胸腺細胞では、ＤＮａｓｅγの活性（タンパク
量）が低く、部分アミノ酸配列を決定するために必要な
十分量の該タンパクが得られなかった。そこでＤＮａｓ
ｅγ活性の高い脾臓細胞よりＤＮａｓｅγの精製を行っ
た。特に示さない限り、以下の処理は４℃で行った。ラ
ット脾臓細胞１００ｇを０．３％ノイデットＰ−４０(N
P −40) を含有する緩衝液Ａ〔１０ｍＭトリス塩酸（ｐ
Ｈ７．８）、２ｍＭ ２−メルカプトエタノール、０．
３ｍＭ ＰＭＳＦ、３ｍＭ ＭｇＣｌ2 〕中でホモジネ
ートした。該ホモジネートを６００×ｇで１０分間、遠
心分離にかけた。沈殿した核画分を集め、核画分中のＤ
Ｎａｓｅ活性物を０．３Ｍ硫安を含有する緩衝液Ａ中で
超音波処理することにより溶解し、核の残骸物は１５
０，０００×ｇで１時間遠心することにより除去した。
得られた上清（核抽出物）を緩衝液Ｎ〔２０ｍＭトリス
塩酸（ｐＨ７．８）、１ｍＭ ２−メルカプトエタノー
ル、０．１ｍＭ ＰＭＳＦ、２．５％エチレングリコー
ル〕で平衡化したＳ−カートリッジ（バイオラッド社
製）に付した。そのカラムを緩衝液Ｎで洗浄した後、緩
衝液Ｎ中の塩濃度（ＫＣｌ）を０Ｍ〜１Ｍ（５０分間）
まで直線的に増加させることにより展開させた（流速
２．０ｍｌ／ｍｉｎ）。参考例３のアッセイ１の方法で
測定した結果、ＤＮａｓｅの活性物は０．６Ｍ ＫＣｌ
で溶出したシングルピークとして回収された。この活性
物画分を緩衝液Ｎで平衡化したＣＭ５ＰＷカラム（５ｍ
ｍ Ｉ．Ｄ．×５０ｍｍ；東ソー社製）によるＨＰＬＣ
に供して、緩衝液Ｎの０〜１Ｍ ＫＣｌの直線グラジェ
ント（３０分間）で溶出させた（流速０．３ｍｌ／ｍｉ
ｎ）。
【００９３】０．５５Ｍ ＫＣｌで溶出したＤＮａｓｅ
γ活性画分を、続いてヘパリン５ＰＷ、ＴＳＫＧ２００
０ＳＷおよびＳＰ５ＰＷカラムを用いた連続したＨＰＬ
Ｃにより精製を行った。詳細には、まず各ＤＮａｓｅ画
分を緩衝液Ｎで平衡化したヘパリン５ＰＷカラム（５ｍ
ｍ Ｉ．Ｄ．×５０ｍｍ；東ソー社製）に付し、蛋白質
を緩衝液Ｎの０〜１Ｍ ＫＣｌの直線グラジェント（３
０分間）で展開、溶出させた（流速０．３ｍｌ／ｍｉ
ｎ）。溶出活性画分をさらに０．３Ｍ ＮａＣｌを含有
する緩衝液Ｍ〔２０ｍＭ ＭＥＳ−ＮａＯＨ（ｐＨ５．
６）、１ｍＭ ２−メルカプトエタノール、０．１ｍＭ
ＰＭＳＦ、２．５％エチレングリコール〕で平衡化し
たＴＳＫＧ２０００ＳＷカラム（８ｍｍ Ｉ．Ｄ．×３
０ｃｍ；東ソー社製）を用いたゲル濾過ＨＰＬＣ（流速
０．５ｍｌ／ｍｉｎ）で精製した。得られたＤＮａｓｅ
γ画分を最終的に緩衝液Ｍで平衡化したＳＰ５ＰＷカラ
ム（５ｍｍ Ｉ．Ｄ．×５０ｍｍ；東ソー社製）による
ＨＰＬＣに付して、緩衝液Ｓの０．３〜０．７Ｍ Ｎａ
Ｃｌの直線グラジェント（３５分間）で展開、溶出させ
た（流速０．３ｍｌ／ｍｉｎ）。ＳＰ５ＰＷ ＨＰＬＣ
のプロファイルを図１０に示す。０．５８Ｍ ＮａＣｌ
で溶出したＤＮａｓｅγ活性画分を回収し、ＳＤＳ−Ｐ
ＡＧＥに付した。尚、ＤＮａｓｅ活性は参考例３の
（１）の方法を用いて測定した（図１０中）。
γ活性画分を、続いてヘパリン５ＰＷ、ＴＳＫＧ２００
０ＳＷおよびＳＰ５ＰＷカラムを用いた連続したＨＰＬ
Ｃにより精製を行った。詳細には、まず各ＤＮａｓｅ画
分を緩衝液Ｎで平衡化したヘパリン５ＰＷカラム（５ｍ
ｍ Ｉ．Ｄ．×５０ｍｍ；東ソー社製）に付し、蛋白質
を緩衝液Ｎの０〜１Ｍ ＫＣｌの直線グラジェント（３
０分間）で展開、溶出させた（流速０．３ｍｌ／ｍｉ
ｎ）。溶出活性画分をさらに０．３Ｍ ＮａＣｌを含有
する緩衝液Ｍ〔２０ｍＭ ＭＥＳ−ＮａＯＨ（ｐＨ５．
６）、１ｍＭ ２−メルカプトエタノール、０．１ｍＭ
ＰＭＳＦ、２．５％エチレングリコール〕で平衡化し
たＴＳＫＧ２０００ＳＷカラム（８ｍｍ Ｉ．Ｄ．×３
０ｃｍ；東ソー社製）を用いたゲル濾過ＨＰＬＣ（流速
０．５ｍｌ／ｍｉｎ）で精製した。得られたＤＮａｓｅ
γ画分を最終的に緩衝液Ｍで平衡化したＳＰ５ＰＷカラ
ム（５ｍｍ Ｉ．Ｄ．×５０ｍｍ；東ソー社製）による
ＨＰＬＣに付して、緩衝液Ｓの０．３〜０．７Ｍ Ｎａ
Ｃｌの直線グラジェント（３５分間）で展開、溶出させ
た（流速０．３ｍｌ／ｍｉｎ）。ＳＰ５ＰＷ ＨＰＬＣ
のプロファイルを図１０に示す。０．５８Ｍ ＮａＣｌ
で溶出したＤＮａｓｅγ活性画分を回収し、ＳＤＳ−Ｐ
ＡＧＥに付した。尚、ＤＮａｓｅ活性は参考例３の
（１）の方法を用いて測定した（図１０中）。
【００９４】（２）ＤＮａｓｅγの部分アミノ酸配列の
決定 ＳＰ５ＰＷ ＨＰＬＣによるＤＮａｓｅγ精製画分をト
リクロロ酢酸で沈殿処理し、常法に従って〔Laemmli,
U., K., Nature, 227: 680-685 (1970)等〕、１０％ア
クリルアミドによるＳＤＳ−ＰＡＧＥにかけ、銀染色に
より３３ｋＤａのバンドを検出した（図１０中）。次い
で、ＤＮａｓｅγタンパクのバンドをミニトランスブロ
ットセル（バイオラッド社製）を用いてエレクトロブロ
ッティングによりＰＶＤＦ膜（ミリポア社製）にトラン
スファーし、その一部を用いて気相プロテインシークエ
ンサー（ＰＳＱ−１、島津製作所製）によりＮ末端アミ
ノ酸配列を決定した（表３）。また、残りについては、
まず過剰のメルカプトエタノールを加えてタンパク質内
のジスルフィド結合をスルフヒドリル基に還元後、ヨー
ド酢酸を用いて該スルフヒドリル基をアルキル化し、Ｓ
−カルボキシメチル誘導体とした。次いで、Ｌｙｓ−Ｃ
エンドペプチダーゼ（ペプチドのリジン残基のカルボキ
シル基側のペプチド結合を特異的に切断する酵素）を含
む緩衝液中にＤＮａｓｅγタンパクを結合したＰＶＤＦ
膜を加え、３７℃で反応させた。酵素消化後、逆相ＨＰ
ＬＣにより膜より遊離する各ペプチドフラグメントを分
離回収した。ペプチドを含むフラクションを波長２１４
ｎｍでモニターした（図１１ａ）。ピークとして検出さ
れるフラグメントの各フラクションは、遠心エバポレー
ターにて乾燥後、ＳＤＳ溶液に溶解し、気相プロテイン
シークエンサー（島津製作所、ＰＳＱ−１）にかけて、
アミノ酸分析を行い、各ペプチド断片の部分アミノ酸配
列を決定した〔表３、（Ｋ）は酵素消化により切断され
たリジン残基を示す〕。さらに、まだ膜上に結合してい
るペプチドをＡｓｐ−Ｎエンドペプチダーゼ（ペプチド
のアスパラギン酸残基のアミノ基側のペプチド結合を特
異的に切断する酵素）で上述の方法により処理し、得ら
れるペプチドフラグメントを同様に逆相ＨＰＬＣで分離
回収し（図１１ｂ）、アミノ酸配列を決定した（表
３）。
決定 ＳＰ５ＰＷ ＨＰＬＣによるＤＮａｓｅγ精製画分をト
リクロロ酢酸で沈殿処理し、常法に従って〔Laemmli,
U., K., Nature, 227: 680-685 (1970)等〕、１０％ア
クリルアミドによるＳＤＳ−ＰＡＧＥにかけ、銀染色に
より３３ｋＤａのバンドを検出した（図１０中）。次い
で、ＤＮａｓｅγタンパクのバンドをミニトランスブロ
ットセル（バイオラッド社製）を用いてエレクトロブロ
ッティングによりＰＶＤＦ膜（ミリポア社製）にトラン
スファーし、その一部を用いて気相プロテインシークエ
ンサー（ＰＳＱ−１、島津製作所製）によりＮ末端アミ
ノ酸配列を決定した（表３）。また、残りについては、
まず過剰のメルカプトエタノールを加えてタンパク質内
のジスルフィド結合をスルフヒドリル基に還元後、ヨー
ド酢酸を用いて該スルフヒドリル基をアルキル化し、Ｓ
−カルボキシメチル誘導体とした。次いで、Ｌｙｓ−Ｃ
エンドペプチダーゼ（ペプチドのリジン残基のカルボキ
シル基側のペプチド結合を特異的に切断する酵素）を含
む緩衝液中にＤＮａｓｅγタンパクを結合したＰＶＤＦ
膜を加え、３７℃で反応させた。酵素消化後、逆相ＨＰ
ＬＣにより膜より遊離する各ペプチドフラグメントを分
離回収した。ペプチドを含むフラクションを波長２１４
ｎｍでモニターした（図１１ａ）。ピークとして検出さ
れるフラグメントの各フラクションは、遠心エバポレー
ターにて乾燥後、ＳＤＳ溶液に溶解し、気相プロテイン
シークエンサー（島津製作所、ＰＳＱ−１）にかけて、
アミノ酸分析を行い、各ペプチド断片の部分アミノ酸配
列を決定した〔表３、（Ｋ）は酵素消化により切断され
たリジン残基を示す〕。さらに、まだ膜上に結合してい
るペプチドをＡｓｐ−Ｎエンドペプチダーゼ（ペプチド
のアスパラギン酸残基のアミノ基側のペプチド結合を特
異的に切断する酵素）で上述の方法により処理し、得ら
れるペプチドフラグメントを同様に逆相ＨＰＬＣで分離
回収し（図１１ｂ）、アミノ酸配列を決定した（表
３）。
【００９５】
【表３】
【００９６】（３）ｃＤＮＡライブラリー ラット脾臓ｃＤＮＡライブラリーは、市販のRat spleen
5'-STRETCH cDNA Library（クロンテック社製）を用い
た。このライブラリーは、成体ラット（Sprague-Dawle
y, オス) の全脾臓より抽出・精製したｍＲＮＡから、
オリゴ（ｄＴ）ランダムプライマーを用いて調製したｃ
ＤＮＡ（平均サイズ：１．８ｋｂ）クローン（２×１０
6 インディペンデントクローン）をアダプターを介して
λｇｔ１１ベクターのＥｃｏＲＩ部位に挿入したもので
ある。
5'-STRETCH cDNA Library（クロンテック社製）を用い
た。このライブラリーは、成体ラット（Sprague-Dawle
y, オス) の全脾臓より抽出・精製したｍＲＮＡから、
オリゴ（ｄＴ）ランダムプライマーを用いて調製したｃ
ＤＮＡ（平均サイズ：１．８ｋｂ）クローン（２×１０
6 インディペンデントクローン）をアダプターを介して
λｇｔ１１ベクターのＥｃｏＲＩ部位に挿入したもので
ある。
【００９７】（４）ＤＮＡプローブの作製 表３に示されるＤＮａｓｅγの部分アミノ酸配列中、下
線で示した配列から推定される塩基配列に基づき、オリ
ゴＤＮＡプローブを合成した。表４に該オリゴＤＮＡプ
ローブの塩基配列を示す（最後のアミノ酸に対応するコ
ドンが１つに絞れない場合は合成しなかった）。
線で示した配列から推定される塩基配列に基づき、オリ
ゴＤＮＡプローブを合成した。表４に該オリゴＤＮＡプ
ローブの塩基配列を示す（最後のアミノ酸に対応するコ
ドンが１つに絞れない場合は合成しなかった）。
【００９８】
【表４】
【００９９】（５）スクリーニング スクリーニング用フィルターの作製 大腸菌Ｙ１０９０r-を０．２％マルトースと１０ｍＭ
ＭｇＳＯ4 を含む４０ｍｌのＬＢ培地で一晩培養後、菌
体を遠心して回収し、該菌体を３０〜４０ｍｌの１０ｍ
Ｍ ＭｇＳＯ4 に懸濁した。懸濁液２００μｌと上記
（３）のラットｃＤＮＡを有するλｇｔ１１ファージ液
とを混合し、ＳＭ１０緩衝液〔10mM Tris-HCl(ph7.6),
10mM MgCl 2 , 68mM NaCl,0.1mg/mlゼラチン〕を加えて
全量を４００μｌとして３７℃で２０〜３０分間インキ
ュベーションした。大腸菌・ファージ混合液を１０ｍＭ
ＭｇＳＯ4 を含む１．５％ＬＢ寒天培地上にまき、次
いで６０〜６５℃のＬＢトップアガロース６ｍｌをまい
てよく混合した。トップアガロースが固まったら３７℃
で一晩インキュベーションした。インキュベーション
後、該プレートを４℃で１時間静置し、次いでナイロン
フィルター（ポール社製）をトップアガロース上に置き
トランスファーを行った。該ナイロンフィルターを変性
液中で２０秒間、次いで中和液中で２０秒間処理し、該
フィルターを濾紙上で乾燥させた後さらにＵＶ照射によ
り固定した。
ＭｇＳＯ4 を含む４０ｍｌのＬＢ培地で一晩培養後、菌
体を遠心して回収し、該菌体を３０〜４０ｍｌの１０ｍ
Ｍ ＭｇＳＯ4 に懸濁した。懸濁液２００μｌと上記
（３）のラットｃＤＮＡを有するλｇｔ１１ファージ液
とを混合し、ＳＭ１０緩衝液〔10mM Tris-HCl(ph7.6),
10mM MgCl 2 , 68mM NaCl,0.1mg/mlゼラチン〕を加えて
全量を４００μｌとして３７℃で２０〜３０分間インキ
ュベーションした。大腸菌・ファージ混合液を１０ｍＭ
ＭｇＳＯ4 を含む１．５％ＬＢ寒天培地上にまき、次
いで６０〜６５℃のＬＢトップアガロース６ｍｌをまい
てよく混合した。トップアガロースが固まったら３７℃
で一晩インキュベーションした。インキュベーション
後、該プレートを４℃で１時間静置し、次いでナイロン
フィルター（ポール社製）をトップアガロース上に置き
トランスファーを行った。該ナイロンフィルターを変性
液中で２０秒間、次いで中和液中で２０秒間処理し、該
フィルターを濾紙上で乾燥させた後さらにＵＶ照射によ
り固定した。
【０１００】プローブの標識 上記（４）で作製したオリゴＤＮＡプローブを〔γ−32
Ｐ〕ＡＴＰとＴ４キナーゼを用いて、５’末端を32Ｐ標
識した。以下の組成の反応液を３７℃で３０分間インキ
ュベーションした。 １０ｎｇ／μｌ オリゴＤＮＡ １μｌ １０× キナーゼバッファー ４μｌ 〔γ−32Ｐ〕ＡＴＰ １０μｌ ＵＰＷ ２３μｌ Ｔ４キナーゼ ２μｌ
Ｐ〕ＡＴＰとＴ４キナーゼを用いて、５’末端を32Ｐ標
識した。以下の組成の反応液を３７℃で３０分間インキ
ュベーションした。 １０ｎｇ／μｌ オリゴＤＮＡ １μｌ １０× キナーゼバッファー ４μｌ 〔γ−32Ｐ〕ＡＴＰ １０μｌ ＵＰＷ ２３μｌ Ｔ４キナーゼ ２μｌ
【０１０１】プラークハイブリダイゼーション 以下のように、プレハイブリダイゼーション液を調製し
た。 ５× Ｄｅｎｈａｒｄｔ溶液 ６× ＳＳＰＥ溶液 ０．２５％ ＳＤＳ ４０μｇ／ｍｌ 熱変性サケ精子ＤＮＡ 上記で作製したフィルターを該プレハイブリダイゼー
ション液中に入れ、３７℃で一晩放置した。次いで、上
記で調製した標識化プローブを適量のプレハイブリダ
イゼーション液と混合し、フィルター１枚あたり５μｌ
のプローブ溶液を用いて３７℃、１８時間ハイブリダイ
ズさせた。ハイブリダイゼーション終了後、該フィルタ
ーを０．１％ ＳＤＳを含む２×ＳＳＣで洗い、さらに
０．１％ ＳＤＳを含む２×ＳＳＣ中に該フィルターを
入れ、４２℃で１〜１．５時間浸とうさせながら洗浄し
た。該操作を３回繰り返した後濾紙上でフィルターを乾
燥させ、オートラジオグラフィーを行った（３日間）。
た。 ５× Ｄｅｎｈａｒｄｔ溶液 ６× ＳＳＰＥ溶液 ０．２５％ ＳＤＳ ４０μｇ／ｍｌ 熱変性サケ精子ＤＮＡ 上記で作製したフィルターを該プレハイブリダイゼー
ション液中に入れ、３７℃で一晩放置した。次いで、上
記で調製した標識化プローブを適量のプレハイブリダ
イゼーション液と混合し、フィルター１枚あたり５μｌ
のプローブ溶液を用いて３７℃、１８時間ハイブリダイ
ズさせた。ハイブリダイゼーション終了後、該フィルタ
ーを０．１％ ＳＤＳを含む２×ＳＳＣで洗い、さらに
０．１％ ＳＤＳを含む２×ＳＳＣ中に該フィルターを
入れ、４２℃で１〜１．５時間浸とうさせながら洗浄し
た。該操作を３回繰り返した後濾紙上でフィルターを乾
燥させ、オートラジオグラフィーを行った（３日間）。
【０１０２】オートラジオグラフィーの結果、ポジティ
ブクローンを示すシグナルの位置に対応するトップアガ
ロースを取り出し、５００μｌの１×λバッファー中に
入れ、室温で３０〜６０分間放置した後、その１０3 倍
希釈液１〜１０μｌを大腸菌Ｙ１０９０r-懸濁液２００
μｌと混合した。該混合液を用いて上記〜の操作を
繰り返して二次スクリーニングを行い、単一プラークを
分離した。その結果、１６個のポジティブクローンが得
られた。該ポジティブクローンを再び大腸菌Ｙ１０９０
r-に感染させ、ＬＢ寒天培地プレート１枚に一面にプラ
ークができるようにまき、そのλｇｔ１１ファージＤＮ
Ａを回収した。ファージＤＮＡの回収法の詳細について
は、Maniatisらの方法〔Molecular Cloning, A Laborat
ory Manual, second edition 2.64 (1989)〕を参照し
た。
ブクローンを示すシグナルの位置に対応するトップアガ
ロースを取り出し、５００μｌの１×λバッファー中に
入れ、室温で３０〜６０分間放置した後、その１０3 倍
希釈液１〜１０μｌを大腸菌Ｙ１０９０r-懸濁液２００
μｌと混合した。該混合液を用いて上記〜の操作を
繰り返して二次スクリーニングを行い、単一プラークを
分離した。その結果、１６個のポジティブクローンが得
られた。該ポジティブクローンを再び大腸菌Ｙ１０９０
r-に感染させ、ＬＢ寒天培地プレート１枚に一面にプラ
ークができるようにまき、そのλｇｔ１１ファージＤＮ
Ａを回収した。ファージＤＮＡの回収法の詳細について
は、Maniatisらの方法〔Molecular Cloning, A Laborat
ory Manual, second edition 2.64 (1989)〕を参照し
た。
【０１０３】（６）サザン法によるｃＤＮＡインサート
の確認 回収したファージＤＮＡをＢｓｉｗＩ処理してｃＤＮＡ
インサートを切り出した後、一部についてアガロースゲ
ル電気泳動を行いエチジウムブロミド染色によりインサ
ートの長さを確認した。電気泳動後、サザンらの方法
〔J.Mol.Biol., 98, p503 (1975)〕に従ってＤＮＡをナ
イロン膜〔バイオダイン、ポール社製〕にトランスファ
ーし、スクリーニングの時と同様にハイブリダイゼーシ
ョンを行った。
の確認 回収したファージＤＮＡをＢｓｉｗＩ処理してｃＤＮＡ
インサートを切り出した後、一部についてアガロースゲ
ル電気泳動を行いエチジウムブロミド染色によりインサ
ートの長さを確認した。電気泳動後、サザンらの方法
〔J.Mol.Biol., 98, p503 (1975)〕に従ってＤＮＡをナ
イロン膜〔バイオダイン、ポール社製〕にトランスファ
ーし、スクリーニングの時と同様にハイブリダイゼーシ
ョンを行った。
【０１０４】（７）ポジティブクローンのサブクローニ
ング ＢｓｉｗＩ処理したファージＤＮＡをアガロースゲル電
気泳動し、GENECLEANII Kitを用いてインサートＤＮＡ
を回収した。そして、Ｋｌｅｎｏｗ酵素で末端平滑化し
た後、Ｔ４リガーゼによってインサートＤＮＡをＢＡＰ
処理したｐＢＳIIＫＳ（＋）のＳｍａＩサイトに組み込
んだ。そのライゲーション溶液を用いてコンピテント大
腸菌ＤＨ５αを形質転換した。すなわち、全量７μｌの
ライゲーション溶液にコンピテント大腸菌０．３ｍｌを
加えて氷上で数時間放置後、４２℃で４０秒間熱刺激を
加え氷上に戻し、２００μｌのＬＢ培地を加え、３７℃
で３０分間インキュベーションした後、アンピシリン含
有ＬＢ寒天培地プレートに注ぎ３７℃で一晩インキュベ
ーションした。シングルコロニーを採取し、１．５ｍｌ
ＬＢ培地に入れ、５時間振盪培養した。遠心した沈殿
からアルカリ法〔Molecular Cloning, A Laboratory Ma
nual, second edition 1.25 (1989)〕によってｐＢＳII
ＫＳ（＋）ＤＮＡを回収した。
ング ＢｓｉｗＩ処理したファージＤＮＡをアガロースゲル電
気泳動し、GENECLEANII Kitを用いてインサートＤＮＡ
を回収した。そして、Ｋｌｅｎｏｗ酵素で末端平滑化し
た後、Ｔ４リガーゼによってインサートＤＮＡをＢＡＰ
処理したｐＢＳIIＫＳ（＋）のＳｍａＩサイトに組み込
んだ。そのライゲーション溶液を用いてコンピテント大
腸菌ＤＨ５αを形質転換した。すなわち、全量７μｌの
ライゲーション溶液にコンピテント大腸菌０．３ｍｌを
加えて氷上で数時間放置後、４２℃で４０秒間熱刺激を
加え氷上に戻し、２００μｌのＬＢ培地を加え、３７℃
で３０分間インキュベーションした後、アンピシリン含
有ＬＢ寒天培地プレートに注ぎ３７℃で一晩インキュベ
ーションした。シングルコロニーを採取し、１．５ｍｌ
ＬＢ培地に入れ、５時間振盪培養した。遠心した沈殿
からアルカリ法〔Molecular Cloning, A Laboratory Ma
nual, second edition 1.25 (1989)〕によってｐＢＳII
ＫＳ（＋）ＤＮＡを回収した。
【０１０５】（８）塩基配列の決定 （７）で得られたｐＢＳIIＫＳ（＋）ＤＮＡからTaKaRa
Taq サイクルシーケンスキット(SIMAZU 用、宝酒造社
製) を用いて、ＤＮＡシークエンサー（ＤＳＱ−１００
０、島津製作所製）でＤＮａｓｅγ ｃＤＮＡインサー
トの塩基配列を決定した。その結果、１６個のポジティ
ブクローン全てがＤＮａｓｅγの全長をコードしていた
（配列表配列番号２）。該ｃＤＮＡクローンの全長は１
２０８ｂｐであり、その内部に９３３ｂｐから成るオー
プンリーディングフレーム（配列番号２の塩基番号１２
〜９４４）が存在し、３１０アミノ酸残基（配列表配列
番号１）をコードしていた。精製したＤＮａｓｅγタン
パクＮ末端のアミノ酸配列解析結果と比較したところ、
該ＤＮａｓｅγ遺伝子一次翻訳産物は、Ｎ末端側に２５
アミノ酸残基（配列番号１のアミノ酸番号１〜２５）か
ら成るプリカーサーペプチド領域を有することが判明し
た。したがって、成熟ＤＮａｓｅγタンパクは２８５ア
ミノ酸残基（配列番号１のアミノ酸番号２６〜３１０）
より成り、かかるアミノ酸配列から推定される該タンパ
ク質の分子量は３３，０２７である。この値は、該タン
パク質のＳＤＳ−ＰＡＧＥによる分子量とよく一致し
た。
Taq サイクルシーケンスキット(SIMAZU 用、宝酒造社
製) を用いて、ＤＮＡシークエンサー（ＤＳＱ−１００
０、島津製作所製）でＤＮａｓｅγ ｃＤＮＡインサー
トの塩基配列を決定した。その結果、１６個のポジティ
ブクローン全てがＤＮａｓｅγの全長をコードしていた
（配列表配列番号２）。該ｃＤＮＡクローンの全長は１
２０８ｂｐであり、その内部に９３３ｂｐから成るオー
プンリーディングフレーム（配列番号２の塩基番号１２
〜９４４）が存在し、３１０アミノ酸残基（配列表配列
番号１）をコードしていた。精製したＤＮａｓｅγタン
パクＮ末端のアミノ酸配列解析結果と比較したところ、
該ＤＮａｓｅγ遺伝子一次翻訳産物は、Ｎ末端側に２５
アミノ酸残基（配列番号１のアミノ酸番号１〜２５）か
ら成るプリカーサーペプチド領域を有することが判明し
た。したがって、成熟ＤＮａｓｅγタンパクは２８５ア
ミノ酸残基（配列番号１のアミノ酸番号２６〜３１０）
より成り、かかるアミノ酸配列から推定される該タンパ
ク質の分子量は３３，０２７である。この値は、該タン
パク質のＳＤＳ−ＰＡＧＥによる分子量とよく一致し
た。
【０１０６】実施例４ ＤＮａｓｅγ抗体の作製 実施例３の（２）で決定された本発明ＤＮａｓｅγの部
分アミノ酸配列を基に、合成した下記の２種のペプチド
を使用抗原としてＤＮａｓｅγに対するポリクローナル
抗体を作製した。
分アミノ酸配列を基に、合成した下記の２種のペプチド
を使用抗原としてＤＮａｓｅγに対するポリクローナル
抗体を作製した。
【０１０７】ＫＥＮＨＮＡＭＤＩ ＫＥＱＹＡＦＬＹＫ
【０１０８】上記２種の合成ペプチドを、それぞれマレ
イミド法によりキャリアタンパクであるKeyhole Limpet
s Hemocyanin（ＫＬＨ）に架橋した複合体と、完全フロ
イントアジュバント（ＦＣＡ）との混和物を抗原とし
て、ウサギ〔Ｋｂｌ：ＪＷ、１５齢、オス、体重３〜
３．５ｋｇ（初回免疫時）、各抗原に対して２羽使用〕
に背部皮下注射により０．５ｍｇ免疫した。初回免疫か
ら３週間毎に計３回０．５ｍｇずつ追加免疫し、各追加
免疫の１０日後に部分採血し、抗体価を測定しらに最終
免疫（３回目の追加免疫）から１０日後に全血を採取し
て抗血清を得た。
イミド法によりキャリアタンパクであるKeyhole Limpet
s Hemocyanin（ＫＬＨ）に架橋した複合体と、完全フロ
イントアジュバント（ＦＣＡ）との混和物を抗原とし
て、ウサギ〔Ｋｂｌ：ＪＷ、１５齢、オス、体重３〜
３．５ｋｇ（初回免疫時）、各抗原に対して２羽使用〕
に背部皮下注射により０．５ｍｇ免疫した。初回免疫か
ら３週間毎に計３回０．５ｍｇずつ追加免疫し、各追加
免疫の１０日後に部分採血し、抗体価を測定しらに最終
免疫（３回目の追加免疫）から１０日後に全血を採取し
て抗血清を得た。
【０１０９】抗体価の測定は以下の方法で行った。抗原
を１０μｇ／ｍｌの濃度でマイクロタイタープレートに
固相化し、ブロッキング後、感作ウサギの部分血（初回
感作後０，３１，５２日）を１０1 〜１０8 まで希釈し
て抗原と反応させた。洗浄後、抗ウサギＩｇＧ−ペルオ
キシダーゼ標識二次抗体を反応させ、洗浄後、基質液Ａ
ＢＴＳの発色により抗体価を測定した。その結果、いず
れの場合も経時的に抗体価の上昇が確認された（表
５）。
を１０μｇ／ｍｌの濃度でマイクロタイタープレートに
固相化し、ブロッキング後、感作ウサギの部分血（初回
感作後０，３１，５２日）を１０1 〜１０8 まで希釈し
て抗原と反応させた。洗浄後、抗ウサギＩｇＧ−ペルオ
キシダーゼ標識二次抗体を反応させ、洗浄後、基質液Ａ
ＢＴＳの発色により抗体価を測定した。その結果、いず
れの場合も経時的に抗体価の上昇が確認された（表
５）。
【０１１１】
【表５】
【０１１２】
【発明の効果】本発明は、クロマチンＤＮＡのリンカー
部位を選択的に切断する反応を触媒する新規ＤＮａｓｅ
α，βおよびγを提供するものである。また、本発明は
アポトーシスに関与する新規なＤＮａｓｅγを提供す
る。さらに本発明はラットのＤＮａｓｅγのアミノ酸配
列、該アミノ酸配列をコードするＤＮＡ、該ＤＮＡの塩
基配列、該ＤＮＡを有する組換えベクター、該組換えベ
クターで形質転換させた宿主細胞、該宿主細胞を培養す
ることによる該ＤＮａｓｅγの製造方法、及び該ＤＮａ
ｓｅγもしくはその前駆体、又はそれらの断片に対する
抗体を提供する。
部位を選択的に切断する反応を触媒する新規ＤＮａｓｅ
α，βおよびγを提供するものである。また、本発明は
アポトーシスに関与する新規なＤＮａｓｅγを提供す
る。さらに本発明はラットのＤＮａｓｅγのアミノ酸配
列、該アミノ酸配列をコードするＤＮＡ、該ＤＮＡの塩
基配列、該ＤＮＡを有する組換えベクター、該組換えベ
クターで形質転換させた宿主細胞、該宿主細胞を培養す
ることによる該ＤＮａｓｅγの製造方法、及び該ＤＮａ
ｓｅγもしくはその前駆体、又はそれらの断片に対する
抗体を提供する。
【０１１３】本発明ＤＮａｓｅγによれば、、アポトー
シスによる生体内での発癌の制御機構、自己免疫の制御
機構、ＡＩＤＳの発症等を分子レベルで解明することが
可能であり、また、本酵素は癌、自己免疫疾患、ウイル
ス感染症等の予防、治療および診断薬の開発に貢献する
点で有用である。また、癌の悪性度が増すほど、その癌
細胞中のＤＮａｓｅγの活性が低下すること等から、本
発明ＤＮａｓｅγをもとにして作成される抗体は、癌の
悪性度を診断する試薬として有用であると考えられる。
さらに、ＤＮａｓｅγ活性を指標に探索される阻害剤及
び活性化剤は、新規な“アポトーシス制御性医薬品”と
なり得ることや、ＤＮａｓｅγの遺伝子は癌（センスＤ
ＮＡの富化によるアポトーシスの促進）、自己免疫疾患
（アンチセンスＤＮＡによるアポトーシス抑制）のアポ
トーシス遺伝子療法を確立するための情報および試料と
して有用であると考えられる。
シスによる生体内での発癌の制御機構、自己免疫の制御
機構、ＡＩＤＳの発症等を分子レベルで解明することが
可能であり、また、本酵素は癌、自己免疫疾患、ウイル
ス感染症等の予防、治療および診断薬の開発に貢献する
点で有用である。また、癌の悪性度が増すほど、その癌
細胞中のＤＮａｓｅγの活性が低下すること等から、本
発明ＤＮａｓｅγをもとにして作成される抗体は、癌の
悪性度を診断する試薬として有用であると考えられる。
さらに、ＤＮａｓｅγ活性を指標に探索される阻害剤及
び活性化剤は、新規な“アポトーシス制御性医薬品”と
なり得ることや、ＤＮａｓｅγの遺伝子は癌（センスＤ
ＮＡの富化によるアポトーシスの促進）、自己免疫疾患
（アンチセンスＤＮＡによるアポトーシス抑制）のアポ
トーシス遺伝子療法を確立するための情報および試料と
して有用であると考えられる。
【０１１４】一方、本発明のＤＮａｓｅαおよびβは、
ウイルス感染時に増加しウイルスＤＮＡを切断すること
から、ウイルス感染の治療薬の開発に有用である。ま
た、本発明ＤＮａｓｅαまたはβをもとにして作成され
る抗体は、ウイルス感染等を診断する試薬として有用で
あると考えられる。
ウイルス感染時に増加しウイルスＤＮＡを切断すること
から、ウイルス感染の治療薬の開発に有用である。ま
た、本発明ＤＮａｓｅαまたはβをもとにして作成され
る抗体は、ウイルス感染等を診断する試薬として有用で
あると考えられる。
【０１１５】
配列番号：1 配列の長さ：310 配列の型：アミノ酸 配列の種類：タンパク質 配列： Met Ser Leu Tyr Pro Ala Ser Pro Tyr Leu Ala Ser Leu Leu Leu Phe 5 10 15 Ile Leu Ala Leu His Gly Ala Leu Ser Leu Arg Leu Cys Ser Phe Asn 20 25 30 Val Arg Ser Phe Gly Glu Ser Lys Lys Glu Asn His Asn Ala Met Asp 35 40 45 Ile Ile Val Lys Ile Ile Lys Arg Cys Asp Leu Ile Leu Leu Met Glu 50 55 60 Ile Lys Asp Ser Asn Asn Asn Ile Cys Pro Met Leu Met Glu Lys Leu 65 70 75 80 Asn Gly Asn Ser Arg Arg Ser Thr Thr Tyr Asn Tyr Val Ile Ser Ser 85 90 95 Arg Leu Gly Arg Asn Thr Tyr lys Glu Gln Tyr Ala Phe Leu Tyr Lys 100 105 110 Glu Lys Leu Val Ser Val Lys Ala lys Tyr Leu Tyr His Asp Tyr Gln 115 120 125 Asp Gly Asp Thr Asp Val Phe Ser Arg Glu Pro Phe Val Val Trp Phe 130 135 140 Gln Ala Pro Phe Thr Ala Ala Lys Asp Phe Val Ile Val Pro Leu His 145 150 155 160 Thr Thr Pro Glu Thr Ser Val Lys Glu Ile Asp Glu Leu Ala Asp Val 165 170 175 Tyr Thr Asp Val Arg Arg Arg Trp Lys Ala Glu Ile Phe Ile Phe Met 180 185 190 Gly Asp Phe Asn Ala Gly Cys Ser Tyr Val Pro Lys Lys Ala Trp Lys 195 200 205 Asn Ile Arg Leu Arg Thr Asp Pro Asn Phe Val Trp Leu Ile Gly Asp 210 215 220 Gln Glu Asp Thr Thr Val Lys Lys Ser Thr Ser Cys Ala Tyr Asp Arg 225 230 235 240 Ile Val Val Arg Gly Gln Glu Ile Val Asn Ser Val Val Pro Arg Ser 245 250 255 Ser Gly Val Phe Asp Phe Gln Lys Ala Tyr Glu Leu Ser Glu Glu Glu 260 265 270 Ala Leu Asp Val Ser Asp His Phe Pro Val Glu Phe Lys Leu Gln Ser 275 280 285 Ser Arg Ala Phe Thr Asn Ser Arg Lys Ser Val Ser Leu Lys Lys Lys 290 295 300 Lys Lys Gly Ser Arg Ser 305 310
【０１１６】配列番号：2 配列の長さ：1208 配列の型：核酸 鎖の数：二本鎖 トポロジ─：直鎖状 配列の種類：cDNA 配列の特徴 特徴を表す記号：CDS 存在位置：12..941 特徴を決定した方法：E 配列： CGAGTGCAAA G ATG TCC CTT TAC CCA GCT TCC CCA TAC CTG GCC TCC CTC 50 Met Ser Leu Tyr Pro Ala Ser Pro Tyr Leu Ala Ser leu 5 10 CTA CTC TTC ATC CTT GCC CTT CAT GGT GCC CTG TCC CTG AGG CTC TGC 98 Leu Leu Phe Ile Leu Ala Leu His Gly Ala Leu Ser Leu Arg Leu Cys 15 20 25 TCC TTC AAT GTG AGG TCC TTT GGA GAG AGC AAG AAG GAA AAC CAC AAT 146 Ser Phe Asn Val Arg Ser Phe Gly Glu Ser Lys Lys Glu Asn His Asn 30 35 40 45 GCC ATG GAT ATC ATT GTG AAG ATC ATC AAA CGC TGC GAC CTC ATA CTG 194 Ala Met Asp Ile Ile Val Lys Ile Ile Lys Arg Cys Asp Leu Ile Leu 50 55 60 CTG ATG GAA ATC AAG GAC AGC AAC AAC AAC ATC TGT CCC ATG CTG ATG 242 Leu Met Glu Ile Lys Asp Ser Asn Asn Asn Ile Cys Pro Met Leu Met 65 70 75 GAG AAG CTG AAT GGA AAC TCA CGA AGA AGC ACG ACA TAC AAC TAC GTG 290 Glu Lys Leu Asn Gly Asn Ser Arg Arg Ser Thr Thr Tyr Asn Tyr Val 80 85 90 ATT AGC TCT CGG CTT GGA AGA AAC ACA TAT AAA GAA CAG TAT GCC TTC 338 Ile Ser Ser Arg Leu Gly Arg Asn Thr Tyr Lys Glu Gln Tyr Ala Phe 95 100 105 CTC TAC AAG GAG AAG CTG GTG TCT GTG AAG GCA AAA TAC CTC TAC CAT 386 Leu Tyr Lys Glu Lys Leu Val Ser Val Lys Ala Lys Tyr Leu Tyr His 110 115 120 125 GAC TAT CAG GAT GGA GAC ACA GAC GTG TTT TCC AGG GAG CCC TTT GTG 434 Asp Tyr Gln Asp Gly Asp Thr Asp Val Phe Ser Arg Glu Pro Phe Val 130 135 140 GTT TGG TTC CAG GCG CCC TTC ACT GCT GCC AAG GAC TTC GTG ATT GTC 482 Val Trp Phe Gln Ala Pro Phe Thr Ala Ala Lys Asp Phe Val Ile Val 145 150 155 CCC TTG CAC ACA ACT CCT GAA ACC TCC GTT AAA GAG ATA GAT GAG CTG 530 Pro Leu His Thr Thr Pro Glu Thr Ser Val lys Glu Ile Asp Glu Leu 160 165 170 GCT GAC GTC TAC ACG GAT GTT AGA AGA CGA TGG AAG GCA GAG ATT TTC 578 Ala Asp Val Tyr Thr Asp Val Arg Arg Arg Trp Lys Ala Glu Ile Phe 175 180 185 ATC TTC ATG GGT GAT TTC AAT GCT GGC TGC AGC TAC GTC CCC AAG AAG 626 Ile Phe Met Gly Asp Phe Asn Ala Gly Cys Ser Tyr Val Pro Lys Lys 190 195 200 205 GCC TGG AAG AAC ATC CGT TTG AGG ACA GAC CCC AAC TTT GTT TGG CTG 674 Ala Trp lys Asn Ile Arg Leu Arg Thr Asp Pro Asn Phe Val Trp Leu 210 215 220 ATT GGG GAC CAA GAG GAC ACC ACG GTC AAG AAG AGC ACC AGC TGT GCC 722 Ile Gly Asp Gln Glu Asp Thr Thr Val Lys Lys Ser Thr Ser Cys Ala 225 230 235 TAT GAC AGG ATT GTC GTT CGC GGA CAA GAG ATA GTC AAC TCT GTG GTT 770 Tyr Asp Arg Ile Val Val Arg Gly Gln Glu Ile Val Asn Ser Val Val 240 245 250 CCC CGC TCC AGT GGC GTC TTT GAC TTT CAG AAA GCT TAT GAG TTG TCT 818 Pro Arg Ser Ser Gly Val Phe Asp Phe Gln lys Ala Tyr Glu Leu Ser 255 260 265 GAA GAG GAG GCC CTG GAT GAT GTC AGT GAC CAC TTT CCA GTT GAG TTT 866 Glu Glu Glu Ala Leu Asp Val Ser Asp His Phe Pro Val Glu Phe Lys 270 275 280 285 AAG CTA AGT TCA AGA GCC TTC ACC AAC AGC CGG AAA TCT GTT TCT CTA 914 Leu Gln Ser Ser Arg Ala Phe Thr Asn Ser Arg Lys Ser Val Ser Leu 290 295 300 AAG AAA AAG AAA AAA GGC AGT CGC TCC TAG GTCTCATGTT GCCATTTTCT 964 Lys Lys Lys Lys Lys Gly Ser Arg Ser 305 310 TTTCTTAAAG TCGTCCCTTG CTTCCAGATA AAATGGCCTC GTGGGTCTCA GCTCTCTGCA 1024 CACTCAGGAA TTAAGACTGG CTAAGCTGTT TTCACTGTCC ACTCTGGTTA ATTTTGCCTG 1084 GAGCCAAGTT GGGAGGAGAG CCTTCTGTTA CATCACCCTG ACCACGGGCA CCCTGCGAAC 1144 CACCATGGGT AACCTGAAGA GACACAAAGT CTATTCCATA ATAAATGCGT GTATTTATTA 1204 CCCG 1208
【０１１７】配列番号：3 配列の長さ：9 配列の型：アミノ酸 配列の種類：タンパク質
【０１１８】配列番号：4 配列の長さ：11 配列の型：アミノ酸 配列の種類：タンパク質
【０１１９】配列番号：5 配列の長さ：9 配列の型：アミノ酸 配列の種類：タンパク質
【０１２０】配列番号：6 配列の長さ：13 配列の型：アミノ酸 配列の種類：タンパク質 配列： Lys Asp Phe Val Ile Val Pro Leu His Thr Thr Pro Glu 5 10 13
【０１２１】配列番号：7 配列の長さ：9 配列の型：アミノ酸 配列の種類：タンパク質
【０１２２】配列番号：8 配列の長さ：4 配列の型：アミノ酸 配列の種類：タンパク質
【０１２３】配列番号：9 配列の長さ：17 配列の型：核酸 鎖の数：一本鎖 トポロジー：直鎖状 配列の種類：他の核酸 合成DNA 配列： AARGARAAYC AYAAYGC 17
【０１２４】配列番号：10 配列の長さ：20 配列の型：核酸 鎖の数：一本鎖 トポロジー：直鎖状 配列の種類：他の核酸 合成DNA 配列： AARGARCART AYGCNTTYYT 20
【０１２５】配列番号：11 配列の長さ：17 配列の型：核酸 鎖の数：一本鎖 トポロジー：直鎖状 配列の種類：他の核酸 合成DNA 配列： AARGAYTTYG TNATHG 17
【０１２６】配列番号：12 配列の長さ：11 配列の型：核酸 鎖の数：一本鎖 トポロジー：直鎖状 配列の種類：他の核酸 合成DNA 配列： GAYGTNTTYT C 11
【図１】アポトーシスにおけるＤＮＡの断片化を模式的
に示した図、および断片化されたＤＮＡのアガロースゲ
ル電気泳動像の写真である。
に示した図、および断片化されたＤＮＡのアガロースゲ
ル電気泳動像の写真である。
【図２】アポトーシスラット胸腺から抽出したＤＮＡを
エンドラベリング法によって分析したＤＮＡの一部を２
％アガロースゲル電気泳動にかけ、オートラジオグラフ
ィーした結果を示す写真（ａ，ｂ）である。ａは、放射
線照射したアポトーシスラット胸腺から抽出したＤＮ
Ａ、ｂは、デキサメタゾン処理したアポトーシスラット
胸腺から抽出したＤＮＡを示す。 レーン１：３’末端をラベルする前にアルカリホスファ
ターゼ（ＡＰａｓｅ）と共にインキュベーションしたＤ
ＮＡを示す。 レーン２：３’末端をラベルする前にＡＰａｓｅ非存在
下でインキュベーションしたＤＮＡを示す。 レーン３：５’末端をラベルする前にＡＰａｓｅ存在下
でインキュベーションしたＤＮＡを示す。 レーン４：５’末端をラベルする前にＡＰａｓｅ非存在
下でインキュベーションしたＤＮＡを示す。
エンドラベリング法によって分析したＤＮＡの一部を２
％アガロースゲル電気泳動にかけ、オートラジオグラフ
ィーした結果を示す写真（ａ，ｂ）である。ａは、放射
線照射したアポトーシスラット胸腺から抽出したＤＮ
Ａ、ｂは、デキサメタゾン処理したアポトーシスラット
胸腺から抽出したＤＮＡを示す。 レーン１：３’末端をラベルする前にアルカリホスファ
ターゼ（ＡＰａｓｅ）と共にインキュベーションしたＤ
ＮＡを示す。 レーン２：３’末端をラベルする前にＡＰａｓｅ非存在
下でインキュベーションしたＤＮＡを示す。 レーン３：５’末端をラベルする前にＡＰａｓｅ存在下
でインキュベーションしたＤＮＡを示す。 レーン４：５’末端をラベルする前にＡＰａｓｅ非存在
下でインキュベーションしたＤＮＡを示す。
【図３】正常のラット胸腺由来の、Ｓ−Ｓセファロース
により得られたＤＮａｓｅの活性画分をＣＭ５ＰＷカラ
ムに付したＨＰＬＣのプロファイルを示す図、および各
フラクションのアガロースゲル電気泳動像を示す写真で
ある。
により得られたＤＮａｓｅの活性画分をＣＭ５ＰＷカラ
ムに付したＨＰＬＣのプロファイルを示す図、および各
フラクションのアガロースゲル電気泳動像を示す写真で
ある。
【図４】アポトーシスラット胸腺由来の、Ｓ−Ｓセファ
ロースにより得られたＤＮａｓｅの活性画分をＣＭ５Ｐ
Ｗカラムに付したＨＰＬＣのプロファイルを示す図、お
よび各フラクションのアガロースゲル電気泳動像を示す
写真である。
ロースにより得られたＤＮａｓｅの活性画分をＣＭ５Ｐ
Ｗカラムに付したＨＰＬＣのプロファイルを示す図、お
よび各フラクションのアガロースゲル電気泳動像を示す
写真である。
【図５】ＤＮａｓｅα，βおよびγの活性ゲル分析の結
果（電気泳動像）を示す写真である。 レーン１：正常ラット胸腺の細胞核から精製したＤＮａ
ｓｅαの分子量を活性ゲルシステムで分析した結果であ
る。 レーン２：正常ラット胸腺の細胞核から精製したＤＮａ
ｓｅβの分子量を活性ゲルシステムで分析した結果であ
る。 レーン３：γ線照射したアポトーシス細胞から精製した
ＤＮａｓｅγの分子量を活性ゲルシステムで分析した結
果である。 タンパクの分子量マーカーは、それぞれホスフォリラー
ゼｂ（９７，４００）、ウシ血清アルブミン（６６，２
００）、オボアルブミン（４５，０００）、炭酸デヒド
ラターゼ（３１，５００）、大豆トリプシンインヒビタ
ー（２１，５００）およびリゾチーム（１４，４００）
を示す。
果（電気泳動像）を示す写真である。 レーン１：正常ラット胸腺の細胞核から精製したＤＮａ
ｓｅαの分子量を活性ゲルシステムで分析した結果であ
る。 レーン２：正常ラット胸腺の細胞核から精製したＤＮａ
ｓｅβの分子量を活性ゲルシステムで分析した結果であ
る。 レーン３：γ線照射したアポトーシス細胞から精製した
ＤＮａｓｅγの分子量を活性ゲルシステムで分析した結
果である。 タンパクの分子量マーカーは、それぞれホスフォリラー
ゼｂ（９７，４００）、ウシ血清アルブミン（６６，２
００）、オボアルブミン（４５，０００）、炭酸デヒド
ラターゼ（３１，５００）、大豆トリプシンインヒビタ
ー（２１，５００）およびリゾチーム（１４，４００）
を示す。
【図６】ＤＮａｓｅα（図ａ）、ＤＮａｓｅβ（図ｂ）
およびＤＮａｓｅγ（図ｃ）のＴＳＫＧ−２０００ＳＷ
ゲル濾過ＨＰＬＣのプロファイルを示す図である。溶出
は流速０．５ｍｌ／ｍｉｎで行った。なお、図ａ中の挿
入図は、分子量標準品〔ＩｇＧ（１５８，０００）、オ
ボアルブミン（４４，０００）、ミオグロビン（１７，
０００）〕による検量線を示す。
およびＤＮａｓｅγ（図ｃ）のＴＳＫＧ−２０００ＳＷ
ゲル濾過ＨＰＬＣのプロファイルを示す図である。溶出
は流速０．５ｍｌ／ｍｉｎで行った。なお、図ａ中の挿
入図は、分子量標準品〔ＩｇＧ（１５８，０００）、オ
ボアルブミン（４４，０００）、ミオグロビン（１７，
０００）〕による検量線を示す。
【図７】ＤＮａｓｅα（図ａ），β（図ｂ）およびγ
（図ｃ）のｐＨ依存性を示す写真（アガロースゲル電気
泳動像）である。精製したＤＮａｓｅα，βおよびγの
活性を酸性〜塩基性（写真中、向かって左から右）の緩
衝液中でそれぞれ測定した。写真中の左端レーンから、
酢酸−ＫＯＨ緩衝液（ｐＨ４．０、ｐＨ４．４、ｐＨ
４．８、ｐＨ５．２およびｐＨ５．６）、ＭＥＳ−Ｎａ
ＯＨ緩衝液（ｐＨ５．６およびｐＨ６．２）、ＭＯＰＳ
−ＮａＯＨ緩衝液（ｐＨ６．８、ｐＨ７．２およびｐＨ
７．６）、Ｔｒｉｓ−ＨＣｌ緩衝液（ｐＨ７．４、ｐＨ
７．８、ｐＨ８．２およびｐＨ９．０）およびＣＨＥＳ
−ＮａＯＨ緩衝液（ｐＨ８．６、ｐＨ９．４およびｐＨ
１０．４）中での結果を示す。
（図ｃ）のｐＨ依存性を示す写真（アガロースゲル電気
泳動像）である。精製したＤＮａｓｅα，βおよびγの
活性を酸性〜塩基性（写真中、向かって左から右）の緩
衝液中でそれぞれ測定した。写真中の左端レーンから、
酢酸−ＫＯＨ緩衝液（ｐＨ４．０、ｐＨ４．４、ｐＨ
４．８、ｐＨ５．２およびｐＨ５．６）、ＭＥＳ−Ｎａ
ＯＨ緩衝液（ｐＨ５．６およびｐＨ６．２）、ＭＯＰＳ
−ＮａＯＨ緩衝液（ｐＨ６．８、ｐＨ７．２およびｐＨ
７．６）、Ｔｒｉｓ−ＨＣｌ緩衝液（ｐＨ７．４、ｐＨ
７．８、ｐＨ８．２およびｐＨ９．０）およびＣＨＥＳ
−ＮａＯＨ緩衝液（ｐＨ８．６、ｐＨ９．４およびｐＨ
１０．４）中での結果を示す。
【図８】ＤＮａｓｅα，βおよびγの活性に対する２価
陽イオンの影響を示した図である。ａは、精製したＤＮ
ａｓｅα（─△─）、β（─□─）、γ（─●─）の活
性を３ｍＭ ＣａＣｌ2 の存在下でＭｇＣｌ2 の濃度を
増加させて測定した結果を示す。ｂは、精製したＤＮａ
ｓｅα（─△─），β（─□─）およびγ（─●─）の
活性を３ｍＭ ＭｇＣｌ2 の存在下でＣａＣｌ2 の濃度
を増加させて測定した結果を示す。ｃは、それぞれのＤ
Ｎａｓｅに対する至適条件下でＺｎＣｌ2の濃度を増加
させて測定した結果を示す。
陽イオンの影響を示した図である。ａは、精製したＤＮ
ａｓｅα（─△─）、β（─□─）、γ（─●─）の活
性を３ｍＭ ＣａＣｌ2 の存在下でＭｇＣｌ2 の濃度を
増加させて測定した結果を示す。ｂは、精製したＤＮａ
ｓｅα（─△─），β（─□─）およびγ（─●─）の
活性を３ｍＭ ＭｇＣｌ2 の存在下でＣａＣｌ2 の濃度
を増加させて測定した結果を示す。ｃは、それぞれのＤ
Ｎａｓｅに対する至適条件下でＺｎＣｌ2の濃度を増加
させて測定した結果を示す。
【図９】ＤＮａｓｅα，βおよびγそれぞれによるＤＮ
Ａの分解様式を示す写真（２％アガロースゲル電気泳動
したものをオートラジオグラフィーで見たもの）であ
る。写真ａは、ＤＮａｓｅαで消化したＨｅＬａ Ｓ３
細胞核から抽出したＤＮＡの分解様式を、写真ｂはＤＮ
ａｓｅβで消化したＨｅＬａ Ｓ３細胞核から抽出した
ＤＮＡの分解様式を、そして写真ｃはＤＮａｓｅγで消
化したＨｅＬａ Ｓ３細胞核から抽出したＤＮＡの分解
様式を示す。 レーン１：アルカリホスファターゼ（ＡＰａｓｅ）で前
処理した後、３’末端ラベリングしたもの。 レーン２：ＡＰａｓｅで前処理しないで、３’末端ラベ
リングしたもの。 レーン３：ＡＰａｓｅで前処理した後、５’末端ラベリ
ングしたもの。 レーン４：ＡＰａｓｅで前処理しないで、５’末端ラベ
リングしたもの。
Ａの分解様式を示す写真（２％アガロースゲル電気泳動
したものをオートラジオグラフィーで見たもの）であ
る。写真ａは、ＤＮａｓｅαで消化したＨｅＬａ Ｓ３
細胞核から抽出したＤＮＡの分解様式を、写真ｂはＤＮ
ａｓｅβで消化したＨｅＬａ Ｓ３細胞核から抽出した
ＤＮＡの分解様式を、そして写真ｃはＤＮａｓｅγで消
化したＨｅＬａ Ｓ３細胞核から抽出したＤＮＡの分解
様式を示す。 レーン１：アルカリホスファターゼ（ＡＰａｓｅ）で前
処理した後、３’末端ラベリングしたもの。 レーン２：ＡＰａｓｅで前処理しないで、３’末端ラベ
リングしたもの。 レーン３：ＡＰａｓｅで前処理した後、５’末端ラベリ
ングしたもの。 レーン４：ＡＰａｓｅで前処理しないで、５’末端ラベ
リングしたもの。
【図１０】ＳＰ５ＰＷ ＨＰＬＣのプロファイル。各フ
ラクションのＤＮａｓｅ活性（―●―）、各フラクショ
ンの２８０ｎｍの吸光度( ―）、ＮａＣｌ濃度勾配（−
−）。
ラクションのＤＮａｓｅ活性（―●―）、各フラクショ
ンの２８０ｎｍの吸光度( ―）、ＮａＣｌ濃度勾配（−
−）。
【図１１】逆相ＨＰＬＣを用いたエンドペプチダーゼに
より限定分解されたＤＮａｓｅγフラグメントの分離。 ａ：Ｌｙｓ−Ｃエンドペプチダーゼで消化されて遊離し
たフラグメント。 ｂ：Ｌｙｓ−Ｃエンドペプチダーゼ処理でＰＶＤＦ膜上
に残ったペプチドをさらにＡｓｐ−Ｎエンドペプチダー
ゼで消化したときに遊離するフラグメント。
より限定分解されたＤＮａｓｅγフラグメントの分離。 ａ：Ｌｙｓ−Ｃエンドペプチダーゼで消化されて遊離し
たフラグメント。 ｂ：Ｌｙｓ−Ｃエンドペプチダーゼ処理でＰＶＤＦ膜上
に残ったペプチドをさらにＡｓｐ−Ｎエンドペプチダー
ゼで消化したときに遊離するフラグメント。
───────────────────────────────────────────────────── フロントページの続き (51)Int.Cl.6 識別記号 庁内整理番号 ＦＩ 技術表示箇所 Ｃ１２Ｎ 15/09 ＺＮＡ //(Ｃ１２Ｎ 1/21 Ｃ１２Ｒ 1:19）
Claims (13)
- 【請求項１】 クロマチンＤＮＡのリンカー部位を選択
的に切断し得るエンドヌクレアーゼであって、かつ下記
性状を有することを特徴とするデオキシリボヌクレアー
ゼ。 局在性 ： 細胞核 分子量 ： (i) ３３，０００ （ＳＤＳ−ＰＡＧＥ） (ii) ３１，０００ （ゲル濾過法） 至適ｐＨ： ７．２ ２価陽イオン要求性： Ｃａ2+／Ｍｇ2+，Ｍｎ2+依存性 Ｚｎ2+による阻害 ： ＩＣ50＝４０μＭ ＤＮＡ切断様式 ： ３’−ＯＨ，５’−Ｐ末端生成型 - 【請求項２】 クロマチンＤＮＡのリンカー部位を選択
的に切断し得るエンドヌクレアーゼであって、かつ下記
性状を有することを特徴とするデオキシリボヌクレアー
ゼ。 局在性 ： 細胞核 分子量 ： (i) ３２，０００ （ＳＤＳ−ＰＡＧＥ） (ii) ２８，０００ （ゲル濾過法） 至適ｐＨ： ５．６ ２価陽イオン要求性： 非依存性 Ｚｎ2+による阻害 ： ＩＣ50＞１ｍＭ ＤＮＡ切断様式 ： ３’−Ｐ，５’−ＯＨ末端生成型 - 【請求項３】 クロマチンＤＮＡのリンカー部位を選択
的に切断し得るエンドヌクレアーゼであって、かつ下記
性状を有することを特徴とするデオキシリボヌクレアー
ゼ。 局在性 ： 細胞核 分子量 ： (i) ３２，０００ （ＳＤＳ−ＰＡＧＥ） (ii) ３０，０００ （ゲル濾過法） 至適ｐＨ： ５．６ ２価陽イオン要求性： 非依存性 Ｚｎ2+による阻害 ： ＩＣ50＞１ｍＭ ＤＮＡ切断様式 ： ３’−Ｐ，５’−ＯＨ末端生成型 - 【請求項４】 実質的に、配列表配列番号１に示される
アミノ酸配列中、アミノ酸番号２６乃至３１０で示され
るアミノ酸配列を有する請求項１記載のデオキシリボヌ
クレアーゼ。 - 【請求項５】 細胞中でプロテアーゼによってプロセッ
シングされる前の前駆体がＮ末端プリカーサーペプチド
領域を有する請求項１記載のデオキシリボヌクレアー
ゼ。 - 【請求項６】 Ｎ末端プリカーサーペプチド領域が、実
質的に配列表配列番号１に示されるアミノ酸配列中、ア
ミノ酸番号１乃至２５で示されるアミノ酸配列を有する
請求項４記載のデオキシリボヌクレアーゼ。 - 【請求項７】 請求項１又は４〜６のいずれかに記載の
デオキシリボヌクレアーゼをコードする塩基配列を含む
ＤＮＡ。 - 【請求項８】 配列表配列番号２に示される塩基配列
中、塩基番号８７乃至９４１で示される塩基配列を有す
る請求項７記載のＤＮＡ。 - 【請求項９】 配列表配列番号２に示される塩基配列
中、塩基番号１２乃至９４１で示される塩基配列を有す
る請求項６に記載のＤＮＡ。 - 【請求項１０】 請求項７〜９のいずれかに記載のＤＮ
Ａを含有する組換えベクター。 - 【請求項１１】 請求項１０記載の組換えベクターで形
質転換された宿主細胞。 - 【請求項１２】 請求項１１記載の宿主細胞を培養し、
得られる培養物から請求項１又は４〜６のいずれかに記
載のデオキシリボヌクレアーゼを採取することを特徴と
する請求項１又は４〜６のいずれかに記載のデオキシリ
ボヌクレアーゼの製造法。 - 【請求項１３】 実質的に、配列表配列番号１に示され
るアミノ酸配列中、アミノ酸番号１乃至３１０で示され
るアミノ酸配列の全部又は一部を有するペプチドに親和
性を示す抗体。
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|---|---|---|---|
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Applications Claiming Priority (3)
| Application Number | Priority Date | Filing Date | Title |
|---|---|---|---|
| JP6-239518 | 1994-09-06 | ||
| JP23951894 | 1994-09-06 | ||
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ID=26534289
Family Applications (1)
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|---|---|---|---|
| JP25564795A Expired - Fee Related JP3378706B2 (ja) | 1994-09-06 | 1995-09-06 | 新規デオキシリボヌクレアーゼ |
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| Country | Link |
|---|---|
| JP (1) | JP3378706B2 (ja) |
Cited By (3)
| Publication number | Priority date | Publication date | Assignee | Title |
|---|---|---|---|---|
| JP2003088369A (ja) * | 2001-08-10 | 2003-03-25 | Olympus Optical Co Ltd | Ｄｎａエンドヌクレアーゼ活性の検出法 |
| JP4522632B2 (ja) * | 1999-08-17 | 2010-08-11 | 靖一 田沼 | 新規デオキシリボヌクレアーゼ、それをコードする遺伝子およびそれらの用途 |
| CN114250208A (zh) * | 2021-12-22 | 2022-03-29 | 武汉瀚海新酶生物科技有限公司 | 耐高盐高活性DNase I突变体的制备及应用 |
-
1995
- 1995-09-06 JP JP25564795A patent/JP3378706B2/ja not_active Expired - Fee Related
Cited By (4)
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|---|---|---|---|---|
| JP4522632B2 (ja) * | 1999-08-17 | 2010-08-11 | 靖一 田沼 | 新規デオキシリボヌクレアーゼ、それをコードする遺伝子およびそれらの用途 |
| JP2003088369A (ja) * | 2001-08-10 | 2003-03-25 | Olympus Optical Co Ltd | Ｄｎａエンドヌクレアーゼ活性の検出法 |
| CN114250208A (zh) * | 2021-12-22 | 2022-03-29 | 武汉瀚海新酶生物科技有限公司 | 耐高盐高活性DNase I突变体的制备及应用 |
| CN114250208B (zh) * | 2021-12-22 | 2023-07-25 | 武汉瀚海新酶生物科技有限公司 | 耐高盐高活性DNase I突变体的制备及应用 |
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|---|---|
| JP3378706B2 (ja) | 2003-02-17 |
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