JP4522632B2 - 新規デオキシリボヌクレアーゼ、それをコードする遺伝子およびそれらの用途 - Google Patents

Description

技術分野
本発明は、酸性条件下で二価カチオン非依存的にＤＮＡを切断し得る新規デオキシリボヌクレアーゼ、それをコードするＤＮＡ、並びに感染症の予防治療および嚢胞性線維症の治療のためのそれらの使用に関する。
背景技術
哺乳類細胞には種々のデオキシリボヌクレアーゼ（以下、ＤＮａｓｅという）が存在することが知られている。ＤＮａｓｅＩＩは最もよく研究されたＤＮａｓｅの１つであり、酸性ｐＨ下で二価カチオンの非存在下にＤＮＡの加水分解反応をを触媒する［ｉｎ Ｔｈｅ Ｅｎｚｙｍｅｓ（Ｂｏｙｅｒ，Ｐ．Ｄ．，ｅｄ）３ｒｄ Ｅｄ．，Ｖｏｌ．４，ｐｐ．２７１−２８７（１９７１），Ａｃａｄｅｍｉｃ Ｐｒｅｓｓ，Ｎｅｗ Ｙｏｒｋ；Ａｒｃｈ．Ｂｉｏｃｈｅｍ．Ｂｉｏｐｈｙｓ．，３００：４４０−４５０（１９９３）］。酸性ＤＮａｓｅ活性は種々の動物組織で広く見出されるが［Ｂｉｏｃｈｉｍ．Ｂｉｏｐｈｙｓ．Ａｃｔａ，１１１９：１８５−１９３（１９９２）；Ｊ．Ｂｉｏｌ．Ｃｈｅｍ．，２７３：２６１０−２６１６（１９９８）］、従来、ＤＮａｓｅＩＩが酸性ＤＮａｓｅ活性を担う唯一の酵素であると考えられてきた。ＤＮａｓｅＩＩは臓器特異性が低く、いたるところに分布することから、ＤＮＡ異化やアポトーシスなどの基本的な生命現象において重要な生理学的役割を果たしている可能性が示唆されている［Ｔｈｅ Ｅｎｚｙｍｅｓ（１９７１），上述；Ａｒｃｈ．Ｂｉｏｃｈｅｍ．Ｂｉｏｐｈｙｓ．，３００：４４０−４５０（１９９３）］。
異なる生物から単離されたＤＮａｓｅＩＩの酵素学的性質は非常に類似しているが、それらの物理化学的性状や分子構造は大きく異なっている。例えば、ブタＤＮａｓｅＩＩはその前駆体蛋白質由来の非同一なサブユニットからなる複合体蛋白質であるのに対し、他の動物由来のＤＮａｓｅＩＩは主に単一のポリペプチドであることがわかっている［Ｊ．Ｂｉｏｌ．Ｃｈｅｍ．，２６０：１０７０８−１０７１３（１９８５）；Ｂｉｏｃｈｅｍ．Ｂｉｏｐｈｙｓ．Ｒｅｓ．Ｃｏｍｍｕｎ．，２４７：８６４−８６９（１９９８）；Ｊ．Ｂｉｏｌ．Ｃｈｅｍ．，２５１：１１６−１２３（１９７６）；Ｇｅｎｅ，２１５：２８１−２８９（１９９８）］。さらに、ＤＮａｓｅＩＩのみかけの分子量は２６．５ｋＤａ〜４５ｋＤａまで変動する［Ｊ．Ｂｉｏｌ．Ｃｈｅｍ．（１９７６），上述；Ｇｅｎｅ，（１９９８），上述；Ｊ．Ｂｉｏｌ．Ｃｈｅｍ．，２４７：１４２４−１４３２（１９７２）；Ｅｕｒ．Ｊ．Ｂｉｏｃｈｅｍ．，２０２：４７９−４８４（１９９１）］。
酸性ＤＮａｓｅの多様性はまた、細胞のどの下位構造に局在するかにおいても認められる。ＤＮａｓｅＩＩは細胞内ではリソソームに局在すると考えられているが［Ｊ．Ｂｉｏｌ．Ｃｈｅｍ．（１９７２），上述；Ｂｉｏｃｈｉｍ．Ｂｉｏｐｈｙｓ．Ａｃｔａ，１００７：１５−２２（１９８９）］、酸性ＤＮａｓｅ活性は核画分にも見出される［Ａｒｃｈ．Ｂｉｏｃｈｅｍ．Ｂｉｏｐｈｙｓ．（１９９３），上述；Ｂｉｏｃｈｅｍ．Ｊ．，１３６：８３−８７（１９７３）］。
ＤＮａｓｅＩＩのこのような分子的多様性の理由は依然として不明であるが、上記の知見は、ＤＮａｓｅＩＩとは区別される別の酸性ＤＮａｓｅの存在を示唆するものである。実際、本発明者らはラット胸腺の核画分から新規な酸性ＤＮａｓｅ（ＤＮａｓｅαおよびβ）を同定し、部分精製している（特開平８−１８７０７９号公報）。このことから、さらなる新規な酸性ＤＮａｓｅを探索し、それらの特性を明らかにすることが、酸性ＤＮａｓｅの多様性を解明する上で重要であると考えられる。
一方、ＤＮａｓｅは、種々の疾患の予防および治療への応用という観点からも盛んに研究が行われている。ＤＮａｓｅの臨床応用において最近特に注目されているものの１つは、嚢胞性線維症（ｃｙｓｔｉｃ ｆｉｂｒｏｓｉｓ；以下、ＣＦという場合もある）の治療への応用である［Ａｎｎｕ．Ｒｅｖ．Ｐｈａｒｍａｃｏｌ．Ｔｏｘｉｃｏｌ．，３５：２５７−２７６（１９９５）；Ｃｈｅｓｔ，１０７：６５−７０（１９９５）］。ＣＦは外分泌腺の塩素イオンチャンネルの異常によって起こる致死性の遺伝病であり、コーカサス系白人では出生２５００人に１人の割合で起こり、保因者は２５人に１人の割合で存在する。ＣＦの約９０％は難治性の下気道緑膿菌感染による呼吸不全のために２０〜３０歳代で死亡するが［Ｃｕｒｒ．Ｏｐｉｎ．Ｐｕｌｍ．Ｍｅｄ．，６：４２５−４３４（１９９５）］、気道内に蓄積して呼吸機能を損なう痰の原因は、炎症部位に浸潤し破壊された白血球から放出される高濃度のＤＮＡである。米国Ｇｅｎｅｎｔｅｃｈ社は、この肺に蓄積した高分子ＤＮＡを除去し、呼吸機能を回復させ、感染症を予防する目的で、組換えＤＮａｓｅＩをＣＦ治療薬として欧米で発売している［Ａｎｎｕ．Ｒｅｖ．Ｐｈａｒｍａｃｏｌ．Ｔｏｘｉｃｏｌ．（１９９５），上述；Ｃｈｅｓｔ（１９９５），上述］。ＤＮａｓｅＩはＤＮＡを分解するだけでなく、ＣＦ患者の痰に多く存在するＦ−アクチンの脱ポリマー化にも作用する。しかしながら、その結果として生じる単量体のＧ−アクチンはＤＮａｓｅＩを強く阻害するため、ＤＮａｓｅＩは直ちに不活性化される。このため、現実的にはＤＮａｓｅＩにはほとんど治療効果がない。遺伝子組換えによりＧ−アクチン非感受性のＤＮａｓｅＩを作製する試みがなされているが、未だ満足のいくものは得られていない［Ｐｒｏｃ．Ｎａｔｌ．Ａｃａｄ．Ｓｃｉ．ＵＳＡ，９３：８２２５−８２２９（１９９６）；Ｊ．Ｂｉｏｌ．Ｃｈｅｍ．，２７３：１８３７４−１８３８１（１９９８）］。したがって、ＣＦ治療に有効なＧ−アクチン非感受性の新規ＤＮａｓｅの同定が望まれている。
ＤＮａｓｅの臨床応用における第２の関心は、感染症の予防および治療への適用である。ＤＮａｓｅのあるものは、他者のゲノムＤＮＡを分解することによって、細菌やウイルス感染に対する生体防御機構において重要な役割を担っていると考えられる。したがって、ヒト等の哺乳動物においてそのような感染防御に関与するＤＮａｓｅを同定し、それを医薬として利用することは、感染症の予防および治療の新たな可能性を開くものとして大いに期待されている。
したがって、本発明の目的は、新規な酸性ＤＮａｓｅを提供し、該酵素の特性を明らかにすることにより、酸性ＤＮａｓｅの分子的多様性の研究における重要な情報を提供することである。また、本発明の別の目的は、ＣＦの治療剤として有効に使用し得るＧ−アクチン非感受性の新規ＤＮａｓｅを提供することである。さらに別の本発明の目的は、感染症の予防および治療に有用な新規ＤＮａｓｅを提供することである。
発明の開示
本発明者らは、上記の目的を達成すべく鋭意検討を重ねた結果、ヒト、マウスおよびラット肝臓由来ＲＮＡからヒトＤＮａｓｅＩＩと相同性を有する新規蛋白質をコードするＯＲＦを含むｃＤＮＡクローンを単離することに成功した。さらに、該ｃＤＮＡクローンを含む発現ベクターで形質転換された宿主細胞を培養して組換え蛋白質を精製し、該蛋白質の物理化学的および酵素学的特徴を解析した結果、該蛋白質は、ＤＮａｓｅＩＩと同様、酸性条件下で二価カチオン非依存的にＤＮＡを切断し得るエンドヌクレアーゼ活性を有するが、中性ｐＨ領域までＤＮａｓｅ活性を発揮し得る点や二価金属イオン阻害剤に対する感受性において、ＤＮａｓｅＩＩとは明確に区別される新規な酸性ＤＮａｓｅであることが確認された。そこで、本発明者らは該新規酸性ＤＮａｓｅをＤＬＡＤ（ＤＮａｓｅ ＩＩ−Ｌｉｋｅ Ａｃｉｄ ＤＮａｓｅ）と命名した。本発明者らはまた、ＤＬＡＤの活性がＧ−アクチンにより阻害されないことを確認して、本酵素が有効なＣＦ治療薬となり得る可能性が高いことを実証した。また、ＤＬＡＤのウイルス感染症防御作用の可能性を確認して本発明を完成するに至った。
すなわち本発明は次に述べるものである。
１．酸性条件下で二価カチオン非依存的にＤＮＡを切断し得るエンドヌクレアーゼであって、下記性状を有することを特徴とするＤＮａｓｅ。
▲１▼活性ｐＨ範囲：約４．０〜約７．６
▲２▼ＤＮＡ切断様式：３’−Ｐ／５’−ＯＨ末端生成型
▲３▼阻害剤感受性：（ｉ）Ｚｎ^２＋により阻害される
（ｉｉ）Ｇ−アクチンにより阻害されない
２．さらに下記性状を有することを特徴とする上記１のＤＮａｓｅ。
▲１▼至適ｐＨ：約５．２
▲２▼分子量：翻訳後修飾産物として約５５ｋＤａ（ＳＤＳ−ＰＡＧＥ）
▲３▼局在性：細胞質および細胞外に存在し、細胞質により多い
▲４▼組織特異性：肝臓特異的に発現する
３．以下の（ａ）または（ｂ）のポリペプチドを有するＤＮａｓｅ。
（ａ）配列表配列番号１に示されるアミノ酸配列中アミノ酸番号１〜３３２で示されるアミノ酸配列からなるポリペプチド
（ｂ）上記（ａ）のアミノ酸配列において、１もしくは数個のアミノ酸が欠失、置換、挿入、付加もしくは修飾されたアミノ酸配列からなり、且つ成熟蛋白質がｐＨ約４．０〜約７．６の範囲で二価カチオン非依存的にＤＮＡを切断し得るエンドヌクレアーゼ活性を有するポリペプチド
４．初期翻訳産物がＮ末端シグナルペプチド配列、好ましくは配列表配列番号１に示されるアミノ酸配列中アミノ酸番号−２２〜−１で示されるアミノ酸配列を含む上記１〜３のいずれかのＤＮａｓｅ。
５．哺乳動物、好ましくはマウス由来である上記１〜４のいずれかのＤＮａｓｅ。
６．以下の（ａ）または（ｂ）のポリペプチドを有するＤＮａｓｅ。
（ａ）配列表配列番号３に示されるアミノ酸配列中アミノ酸番号１〜３３４で示されるアミノ酸配列からなるポリペプチド
（ｂ）上記（ａ）のアミノ酸配列において、１もしくは数個のアミノ酸が欠失、置換、挿入、付加もしくは修飾されたアミノ酸配列からなり、且つ成熟蛋白質がｐＨ約４．０〜約７．６の範囲で二価カチオン非依存的にＤＮＡを切断し得るエンドヌクレアーゼ活性を有するポリペプチド
７．初期翻訳産物がＮ末端シグナルペプチド配列、好ましくは配列表配列番号３に示されるアミノ酸配列中アミノ酸番号−２７〜−１で示されるアミノ酸配列を含む上記１、２または６のいずれかのＤＮａｓｅ。
８．哺乳動物、好ましくはヒト由来である上記１、２、６または７のＤＮａｓｅ。
９．上記１〜８のいずれかのＤＮａｓｅをコードするＤＮＡ。
１０．以下の（ａ）または（ｂ）の塩基配列からなるＤＮＡ。
（ａ）配列表配列番号２に示される塩基配列中塩基番号２７９〜１２７４で示される塩基配列
（ｂ）上記（ａ）の塩基配列とストリンジェントな条件でハイブリダイズし得る塩基配列であって、且つｐＨ約４．０〜約７．６の範囲で二価カチオン非依存的にＤＮＡを切断し得るエンドヌクレアーゼ活性を有するＤＮａｓｅをコードする塩基配列
１１．以下の（ａ）または（ｂ）の塩基配列からなるＤＮＡ。
（ａ）配列表配列番号２に示される塩基配列中塩基番号２１３〜１２７４で示される塩基配列
（ｂ）上記（ａ）の塩基配列とストリンジェントな条件でハイブリダイズし得る塩基配列であって、且つ成熟蛋白質がｐＨ約４．０〜約７．６の範囲で二価カチオン非依存的にＤＮＡを切断し得るエンドヌクレアーゼ活性を有するＤＮａｓｅの、初期翻訳産物をコードする塩基配列
１２．哺乳動物、好ましくはマウス由来である上記１０または１１のＤＮＡ。
１３．以下の（ａ）または（ｂ）の塩基配列からなるＤＮＡ。
（ａ）配列表配列番号４に示される塩基配列中塩基番号８２〜１０８３で示される塩基配列
（ｂ）上記（ａ）の塩基配列とストリンジェントな条件でハイブリダイズし得る塩基配列であって、且つｐＨ約４．０〜約７．６の範囲で二価カチオン非依存的にＤＮＡを切断し得るエンドヌクレアーゼ活性を有するＤＮａｓｅをコードする塩基配列
１４．以下の（ａ）または（ｂ）の塩基配列からなるＤＮＡ。
（ａ）配列表配列番号４に示される塩基配列中塩基番号１〜１０８３で示される塩基配列
（ｂ）上記（ａ）の塩基配列とストリンジェントな条件でハイブリダイズし得る塩基配列であって、且つ成熟蛋白質がｐＨ約４．０〜約７．６の範囲で二価カチオン非依存的にＤＮＡを切断し得るエンドヌクレアーゼ活性を有するＤＮａｓｅの、初期翻訳産物をコードする塩基配列
１５．哺乳動物、好ましくはヒト由来である上記１３または１４のＤＮＡ。
１６．上記９〜１５のいずれかのＤＮＡを含む組換えベクター。
１７．上記９〜１５のいずれかのＤＮＡおよび該ＤＮＡに機能的に連結されたプロモーターを含む発現ベクター。
１８．上記１７の発現ベクターで宿主細胞を形質転換して得られる形質転換体。
１９．上記１８の形質転換体を培地中で培養し、得られる培養物から上記１〜８のいずれかのＤＮａｓｅを採取することを特徴とする当該ＤＮａｓｅの製造方法。
２０．上記１〜８のいずれかのＤＮａｓｅ、上記１７の発現ベクターまたは上記１８の形質転換体を有効成分とする医薬組成物。
２１．感染症の予防および治療用または嚢胞性線維症の治療用である上記２０の医薬組成物。
本発明のＤＬＡＤは、酸性〜中性ｐＨ領域までの広いｐＨ範囲で二価カチオン非依存的に活性を発現する酸性ＤＮａｓｅであり、また、Ｇ−アクチン非感受性であることから、ＣＦ患者の痰に含まれる高濃度のＤＮＡを分解して呼吸機能を向上させるのに有用である。
また、本発明のＤＬＡＤは細胞内での外来遺伝子の発現を抑制することができるので、ウイルス感染等の感染症の予防および治療においても有用な手段を提供し得る。
発明を実施するための最良の形態
本発明のＤＬＡＤは、酸性条件下で二価カチオン非依存的にＤＮＡを３’−Ｐ／５’−ＯＨ末端を生じる様式で加水分解するエンドヌクレアーゼ活性を有する点で、公知の酸性ＤＮａｓｅであるＤＮａｓｅＩＩと類似するが、ＤＮａｓｅＩＩがｐＨ約５．６以下でしか活性がないのに対し、ＤＬＡＤはｐＨ約４．０〜約７．６の広いｐＨ範囲においてＤＮａｓｅ活性を示す点できわめて特徴的である。ＤＬＡＤの活性に好ましいｐＨ範囲はｐＨ約４．４〜約６．８であり、至適ｐＨは約５．２である。
また、ＤＬＡＤは、二価金属イオンに対する感受性においてもＤＮａｓｅＩＩと特徴的に相違する。すなわち、ＤＮａｓｅＩＩ活性に及ぼすＣｏ^２＋、Ｎｉ^２＋、Ｃｕ^２＋、Ｚｎ^２＋等の影響はほとんど同等であるのに対し、ＤＬＡＤはＣｏ^２＋やＮｉ^２＋等に比べてＺｎ^２＋に対して有意に高感受性である。
本発明のＤＬＡＤは、ＤＮａｓｅＩ等とは異なってＧ−アクチンにより阻害されない。
本発明のＤＬＡＤは、上記の特徴を有する限り特に制限はなく、その由来も限定されない。したがって、天然に存在する生物起源のものの他、自然もしくは人工の突然変異体、あるいは異種（すなわち、外来の）ＤＬＡＤ遺伝子を導入して得られる形質転換体由来のものもすべて包含される。好ましくは、ヒト、ウシ、ブタ、ウマ、サル、ヒツジ、ヤギ、イヌ、ネコ、ウサギ、マウス、ラット、モルモット等の哺乳動物由来のＤＬＡＤが例示される。特に好ましくは、ヒト、ウシ、ブタ、マウス、ラット由来のものである。
本発明のＤＬＡＤは、そのアミノ酸組成や糖鎖付加の相違により異なる分子量を有してもよいが、好ましくは、糖鎖付加されていない成熟ポリペプチド鎖として約３８〜３９ｋＤａ（理論値）、あるいは糖鎖付加された成熟蛋白質（翻訳後修飾産物）として約５５ｋＤａ（ＳＤＳ−ＰＡＧＥ）の分子量を有するものが挙げられる。また、ＤＬＡＤがシグナルペプチド配列を含む前駆体として翻訳される場合、初期翻訳産物として約４１〜４２ｋＤａの分子量を有するものが好ましく例示される。
本発明の一実施態様においては、ＤＬＡＤは細胞外および細胞質（ｃｙｔｏｐｌａｓｍ）の両方に分布する。より詳細には、ＤＬＡＤは細胞質により多く存在し、ＤＮａｓｅＩＩとは異なる存在比を示す。本実施態様においては、細胞外にも分泌されることから予測される通り、ＤＬＡＤ初期翻訳産物はそのＮ末端にシグナルペプチド配列を含む。シグナルペプチド配列は小胞体のシグナルペプチダーゼに認識されて切断され、成熟ＤＬＡＤ蛋白質を生じるものであれば特に限定されない。例えば、配列表配列番号１に示されるアミノ酸配列中アミノ酸番号−２２〜−１で示されるアミノ酸配列もしくは配列表配列番号３に示されるアミノ酸配列中アミノ酸番号−２７〜−１で示されるアミノ酸配列、あるいはこれらの該配列において、シグナル配列としての特性を保持すると通常理解される範囲で、１もしくは数個のアミノ酸を欠失、置換、挿入または付加したアミノ酸配列が挙げられる。ＤＮａｓｅＩＩなどの他の分泌蛋白質のシグナル配列もまた好ましい。
細胞質ＤＬＡＤが細胞質のどの下位構造に局在するかは特に限定されないが、好ましくはリソソームやペルオキシソーム等の１種以上の酸性環境のオルガネラに局在する。したがって、ＤＬＡＤは１または２以上のオルガネラへのターゲッティングモチーフをそのアミノ酸配列中に含み得る。
本発明のＤＬＡＤの発現は肝臓に高度に限定されており、臓器特異性の低いＤＮａｓｅＩＩとは対照的である。
本発明の好ましい態様においては、ＤＬＡＤは、配列表配列番号１に示されるアミノ酸配列中アミノ酸番号１〜３３２で示されるアミノ酸配列からなるポリペプチドもしくは配列表配列番号３に示されるアミノ酸配列中アミノ酸番号１〜３３４で示されるアミノ酸配列からなるポリペプチド、あるいはこれらのアミノ酸配列において、１もしくは数個のアミノ酸が欠失、置換、挿入、付加もしくは修飾されたアミノ酸配列からなり、且つｐＨ約４．０〜約７．６の範囲で二価カチオン非依存的にＤＮＡを切断し得るエンドヌクレアーゼ活性を有するポリペプチドである。
本発明のＤＬＡＤは、（１）該酵素を産生する組織または細胞を原料として抽出精製する方法、（２）化学的に合成する方法または（３）遺伝子組換え技術によりＤＬＡＤを発現するように操作された細胞から精製する方法等を適宜用いることによって取得することができる。
天然のＤＬＡＤ産生組織からのＤＬＡＤの単離精製は、例えば以下のようにして行うことができる。哺乳動物の組織、例えば、ヒト、マウス、ラット等の肝臓組織片を適当な抽出緩衝液中でホモジナイズし、超音波処理や界面活性剤処理等により細胞抽出液を得、そこから蛋白質の分離精製に常套的に利用される分離技術を適宜組み合わせることにより精製することができる。このような分離技術としては、例えば、塩析、溶媒沈澱法等の溶解度の差を利用する方法、透析、限外濾過、ゲル濾過、非変性ポリアクリルアミド電気泳動（ＰＡＧＥ）、ドデシル硫酸ナトリウム−ポリアクリルアミド電気泳動（ＳＤＳ−ＰＡＧＥ）等の分子量の差を利用する方法、イオン交換クロマトグラフィー、ヒドロキシアパタイトクロマトグラフィー等の荷電を利用する方法、アフィニティークロマトグラフィー等の特異的親和性を利用する方法、逆相高速液体クロマトグラフィー等の疎水性の差を利用する方法、等電点電気泳動等の等電点の差を利用する方法などが挙げられる。
あるいは、哺乳動物由来の培養細胞、例えば、ヒト、マウス、ラット等の肝細胞から誘導された培養細胞を適当な液体培地中で培養し、得られる培養上清から上記のような慣用的な蛋白質分離技術を用いて精製することもできる。
化学合成によるＤＬＡＤの製造は、例えば、配列表配列番号１に示されるアミノ酸配列（アミノ酸番号１〜３３２）もしくは配列表配列番号３に示されるアミノ酸配列（アミノ酸番号１〜３３４）を基にして、配列の全部または一部をペプチド合成機を用いて合成し、得られるポリペプチドを適当な再生条件下で再生（ｒｅｎａｔｕｒａｔｉｏｎ）させることにより行うことができる。
本発明のＤＬＡＤは、好ましくは、該蛋白質をコードするＤＮＡをクローニングし、該ＤＮＡを担持する発現ベクターを含む形質転換体の培養物から単離精製することにより製造することができる。
酵素遺伝子のクローニングは、通常、以下の方法により行われる。まず、所望の酵素を産生する細胞または組織より、上記のような手段により該酵素を完全または部分精製し、そのＮ末端アミノ酸配列をエドマン法を用いて決定する。また、ペプチドを配列特異的に切断するプロテアーゼや化学物質で該酵素を部分分解して得られるオリゴペプチドのアミノ酸配列を同様にエドマン法により決定する。決定された部分アミノ酸配列に対応する塩基配列を有するオリゴヌクレオチドを合成し、これをプローブとして用いて、該酵素を産生する細胞または組織より調製されたｃＤＮＡまたはゲノミックＤＮＡライブラリーから、コロニー（もしくはプラーク）ハイブリダイゼーション法によって該酵素をコードするＤＮＡをクローニングする。
あるいは、完全または部分精製された酵素の全部または一部を抗原として該酵素に対する抗体を常法にしたがって作製し、該酵素を産生する細胞または組織より調製されたｃＤＮＡまたはゲノミックＤＮＡライブラリーから、抗体スクリーニング法によって該酵素をコードするＤＮＡをクローニングすることもできる。
目的の酵素と酵素学的性質の類似する酵素の遺伝子が公知である場合、ＥＭＢＬやＧｅｎＢａｎｋ等の一般に利用可能なデータベース上に登録されたヒト、マウス、ラット等の哺乳動物のＥＳＴ（Ｅｘｐｒｅｓｓｅｄ Ｓｅｑｕｅｎｃｅ Ｔａｇ）クローンの中から、該公知遺伝子の塩基配列と相同性を有するクローンを検索し、抽出されたＥＳＴクローンの塩基配列を基にして、上記のようにプローブを作製し、コロニー（もしくはプラーク）ハイブリダイゼーション法によって該酵素をコードするＤＮＡをクローニングすることができる。本発明のＤＬＡＤの場合、ヒト等の哺乳動物由来ＤＮａｓｅＩＩの塩基配列とのホモロジー検索により、ＤＬＡＤをコードするｃＤＮＡの断片であるＥＳＴクローンを見出すことができる。
あるいは、より迅速かつ簡便にｃＤＮＡクローンを得る方法として、ＲＡＣＥ法を用いることができる。すなわち、上記のようにしてＤＬＡＤ遺伝子の一部に相当するＥＳＴクローンを抽出し、該ＥＳＴクローンのセンス鎖およびアンチセンス鎖の部分塩基配列に相同なオリゴヌクレオチドをそれぞれ合成して、各オリゴヌクレオチドと適当なアダプタープライマーとを一対のＰＣＲプライマーとして５’および３’ＲＡＣＥ反応を行い、各増幅断片を制限酵素とリガーゼを用いる等の方法で連結することにより、完全長のｃＤＮＡクローンを得ることができる。
上記のようにして得られたＤＮＡの塩基配列は、マキサム・ギルバート法やジデオキシターミネーション法等の公知のシークエンス技術を用いて決定することができる。
本発明のＤＬＡＤをコードするＤＮＡは、好ましくは、配列表配列番号１に示されるアミノ酸配列中アミノ酸番号１〜３３２で示されるアミノ酸配列もしくは配列表配列番号３に示されるアミノ酸配列中アミノ酸番号１〜３３４で示されるアミノ酸配列、あるいはこれらのアミノ酸配列において、１もしくは数個のアミノ酸が欠失、置換、挿入もしくは付加されたアミノ酸配列（但し、該変異アミノ酸配列からなる蛋白質はｐＨ約４．０〜約７．６の範囲で二価カチオン非依存的にＤＮＡを切断し得るエンドヌクレアーゼ活性を有する）をコードするＤＮＡである。より好ましくは、本発明のＤＬＡＤをコードするＤＮＡは、配列表配列番号２に示される塩基配列中塩基番号２７９〜１２７４で示される塩基配列もしくは配列表配列番号４に示される塩基配列中塩基番号８２〜１０８３で示される塩基配列、あるいはこれらの塩基配列とストリンジェントな条件でハイブリダイズし得る塩基配列（但し、該変異塩基配列はｐＨ約４．０〜約７．６の範囲で二価カチオン非依存的にＤＮＡを切断し得るエンドヌクレアーゼ活性を有する蛋白質をコードする）からなるものである。
本発明のＤＬＡＤをコードするＤＮＡは、好ましくは、上記のような塩基配列の５’末端にシグナルペプチド配列をコードする塩基配列をさらに含むものである。より好ましくは、本発明のＤＬＡＤをコードするＤＮＡは、配列表配列番号２に示される塩基配列中塩基番号２１３〜１２７４で示される塩基配列もしくは配列表配列番号４に示される塩基配列中塩基番号１〜１０８３で示される塩基配列、あるいはこれらの塩基配列とストリンジェントな条件でハイブリダイズし得る塩基配列（但し、該変異塩基配列は、成熟蛋白質がｐＨ約４．０〜約７．６の範囲で二価カチオン非依存的にＤＮＡを切断し得るエンドヌクレアーゼ活性を有する蛋白質の初期翻訳産物をコードする）からなるものである。
本発明において、「ストリンジェントな条件」とは、塩基配列において約６０％以上の相同性を有するＤＮＡがハイブリダイズし得る条件をいう。ストリンジェンシーは、ハイブリダイゼーション反応や洗浄の際の塩濃度および温度等を適宜変化させることにより調節することができる。
本発明のＤＬＡＤをコードするＤＮＡは、配列表配列番号２に示される塩基配列中塩基番号２７９〜１２７４もしくは塩基番号２１３〜１２７４で示される塩基配列、あるいは配列表配列番号４に示される塩基配列中塩基番号８２〜１０８３もしくは塩基番号１〜１０８３で示される塩基配列を基にして、化学的に合成されるＤＮＡであってもよい。
本発明はまた、本発明のＤＬＡＤをコードするＤＮＡを含む組換えベクターを提供する。本発明の組換えベクターは原核および／または真核細胞の各種宿主細胞内で複製保持または自律増殖できるものであれば特に限定されず、プラスミドベクターやウイルスベクター等が包含される。当該組換えベクターは、簡便には当該技術分野において入手可能な公知のクローニングベクターまたは発現ベクターに、上記のＤＬＡＤをコードするＤＮＡを適当な制限酵素およびリガーゼ、あるいは必要に応じてさらにリンカーもしくはアダプターＤＮＡを用いて連結することにより調製することができる。このようなベクターとしては、大腸菌由来のプラスミドとして、例えばｐＢＲ３２２，ｐＢＲ３２５，ｐＵＣ１８，ｐＵＣ１９など、酵母由来プラスミドとして、例えばｐＳＨ１９，ｐＳＨ１５など、枯草菌由来プラスミドとして、例えばｐＵＢ１１０，ｐＴＰ５，ｐＣ１９４などが挙げられる。また、ウイルスとして、λファージなどのバクテリオファージや、ＳＶ４０、ウシパピローマウイルス（ＢＰＶ）等のパポバウイルス、モロニーマウス白血病ウイルス（ＭｏＭｕＬＶ）等のレトロウイルス、アデノウイルス（ＡｄＶ）、アデノ随伴ウイルス（ＡＡＶ）、ワクシニヤウイルス、バキュロウイルスなどの動物および昆虫のウイルスが例示される。
特に、本発明は、目的の宿主細胞内で機能的なプロモーターの制御下にＤＬＡＤをコードするＤＮＡが配置されたＤＬＡＤ発現ベクターを提供する。使用されるベクターとしては、原核および／または真核細胞の各種宿主細胞内で機能して、その下流に配置された遺伝子の転写を制御し得るプロモーター領域（例えば宿主が大腸菌の場合、ｔｒｐプロモーター、ｌａｃプロモーター、ｌｅｃＡプロモーター等、宿主が枯草菌の場合、ＳＰＯ１プロモーター、ＳＰＯ２プロモーター、ｐｅｎＰプロモーター等、宿主が酵母の場合、ＰＨＯ５プロモーター、ＰＧＫプロモーター、ＧＡＰプロモーター、ＡＤＨプロモーター等、宿主が哺乳動物細胞の場合、ＳＶ４０由来初期プロモーター、ＭｏＭｕＬＶ由来ロングターミナルリピート、アデノウイルス由来初期プロモーター等のウイルスプロモーター）と、該遺伝子の転写終結シグナル、すなわちターミネーター領域を含有し、該プロモーター領域と該ターミネーター領域とが、少なくとも１つの制限酵素認識部位、好ましくは該ベクターをその箇所のみで切断するユニークな制限部位を含む配列を介して連結されたものであれば特に制限はないが、形質転換体選択のための選択マーカー遺伝子（テトラサイクリン、アンピシリン、カナマイシン、ハイグロマイシン、ホスフィノスリシン等の薬剤に対する抵抗性を付与する遺伝子、栄養要求性変異を相補する遺伝子等）をさらに含有していることが好ましい。さらに、挿入されるＤＬＡＤをコードするＤＮＡが開始コドンおよび終止コドンを含まない場合には、開始コドン（ＡＴＧまたはＧＴＧ）および終止コドン（ＴＡＧ、ＴＧＡ、ＴＡＡ）を、それぞれプロモーター領域の下流およびターミネーター領域の上流に含むベクターが好ましく使用される。
宿主細胞として細菌を用いる場合、一般に発現ベクターは上記のプロモーター領域およびターミネーター領域に加えて、宿主細胞内で自律複製し得る複製可能単位を含む必要がある。また、プロモーター領域は、プロモーターの近傍にオペレーターおよびＳｈｉｎｅ−Ｄａｌｇａｒｎｏ（ＳＤ）配列を包含する。
宿主として酵母，動物細胞または昆虫細胞を用いる場合、発現ベクターは、エンハンサー配列、ＤＬＡＤ ｍＲＮＡの５’側および３’側の非翻訳領域、ポリアデニレーション部位等をさらに含むことが好ましい。
また、形質転換体の培地中にＤＬＡＤを分泌させる場合、あるいは成熟ＤＬＡＤ蛋白質が適切にグリコシル化されることを所望する場合において、挿入されるＤＬＡＤをコードするＤＮＡがシグナルペプチドのコード配列を含まない場合は、ベクターとして、開始コドンに続いて適当なシグナルコドンをさらに含む分泌発現用ベクターが好ましく使用される。
本発明のＤＬＡＤをコードするＤＮＡがゲノミックＤＮＡから単離され、本来のプロモーターおよびターミネーター領域を含む形態で得られる場合には、本発明の発現ベクターは、目的の宿主細胞内で複製保持または自律増殖できる公知のクローニングベクターの適当な部位に該ＤＮＡを挿入することにより調製することができる。本発明の好ましい態様においては、ＤＬＡＤは肝臓特異的に発現することから、上記のようにして構築される発現ベクターは、ＤＬＡＤの組織または臓器特異的発現を所望する場合（例えば、肝管の閉塞を起こしたＣＦ患者の治療など）に好ましく使用され得る。
本発明はまた、上記のＤＬＡＤ発現ベクターで宿主細胞を形質転換して得られる形質転換体を提供する。
本発明で用いられる宿主細胞としては、前記の発現ベクターに適合し、形質転換され得るものであれば特に限定されず、本発明の技術分野において通常使用される天然の細胞あるいは人工的に樹立された変異細胞または組換え細胞など種々の細胞［例えば、細菌（大腸菌、枯草菌、乳酸菌等）、酵母（サッカロマイセス属、ピキア属、クリベロマイセス属等）、動物細胞または昆虫細胞など］が例示される。後述の医薬としてのＤＬＡＤの使用を考慮すると、宿主細胞は哺乳動物細胞、特にヒト、サル、マウス、ラット、ハムスター等の細胞、就中ヒト由来細胞であることが好ましい。具体的には、ＣＯＰ、Ｌ、Ｃ１２７、Ｓｐ２／０、ＮＳ−１、ＮＩＨ３ Ｔ３等のマウス由来細胞、ラット由来細胞、ＢＨＫ、ＣＨＯ等のハムスター由来細胞、ＣＯＳ１、ＣＯＳ３、ＣＯＳ７、ＣＶ１、Ｖｅｒｏ等のサル由来細胞、およびＨｅＬａ、２倍体線維芽細胞由来の細胞、ミエローマ細胞、Ｎａｍａｌｗａ等のヒト由来細胞などが例示される。
発現ベクターの宿主細胞への導入は従来公知の方法を用いて行うことができる。例えば、細菌の場合は、Ｃｏｈｅｎらの方法［Ｐｒｏｃ．Ｎａｔｌ．Ａｃａｄ．Ｓｃｉ．ＵＳＡ．，６９，２１１０（１９７２）］、プロトプラスト法［Ｍｏｌ．Ｇｅｎ．Ｇｅｎｅｔ．，１６８，１１１（１９７９）］、コンピテント法［Ｊ．Ｍｏｌ．Ｂｉｏｌ．，５６，２０９（１９７１）］等によって、酵母の場合は、Ｈｉｎｎｅｎらの方法［Ｐｒｏｃ．Ｎａｔｌ．Ａｃａｄ．Ｓｃｉ．ＵＳＡ．，７５，１９２７（１９７８）］、リチウム法［Ｊ．Ｂａｃｔｅｒｉｏｌ．，１５３，１６３（１９８３）］等によって、動物細胞の場合は、Ｇｒａｈａｍの方法［Ｖｉｒｏｌｏｇｙ，５２，４５６（１９７３）］等によって、また昆虫細胞の場合は、Ｓｕｍｍｅｒｓらの方法［Ｍｏｌ．Ｃｅｌｌ．Ｂｉｏｌ．，３，２１５６−２１６５（１９８３）］等によって、それぞれ形質転換することができる。
本発明のＤＬＡＤは、上記のようにして調製されるＤＬＡＤ発現ベクターを含む形質転換体を培地中で培養し、得られる培養物からＤＬＡＤを回収することによって製造することができる。
使用される培地は、宿主細胞（形質転換体）の生育に必要な炭素源，無機窒素源もしくは有機窒素源を含んでいることが好ましい。炭素源としては、例えばグルコース，デキストラン，可溶性デンプン，ショ糖などが、無機窒素源もしくは有機窒素源としては、例えばアンモニウム塩類，硝酸塩類，アミノ酸，コーンスチープ・リカー，ペプトン，カゼイン，肉エキス，大豆粕，バレイショ抽出液などが例示される。また所望により他の栄養素〔例えば、無機塩（例えば塩化カルシウム，リン酸二水素ナトリウム，塩化マグネシウム），ビタミン類，抗生物質（例えばテトラサイクリン，ネオマイシン，アンピシリン，カナマイシン等）など〕を含んでいてもよい。
培養は当分野において知られている方法により行われる。下記に宿主細胞に応じて用いられる具体的な培地および培養条件を例示するが、本発明における培養条件はこれらに何ら限定されるものではない。
宿主が細菌，放線菌，酵母，糸状菌等である場合、例えば上記栄養源を含有する液体培地が適当である。好ましくは、ｐＨが５〜８である培地である。宿主が大腸菌の場合、好ましい培地としてＬＢ培地，Ｍ９培地［Ｍｉｌｌｅｒ．Ｊ．，Ｅｘｐ．Ｍｏｌ．Ｇｅｎｅｔ，ｐ．４３１，Ｃｏｌｄ Ｓｐｒｉｎｇ Ｈａｒｂｏｒ Ｌａｂｏｒａｔｏｒｙ，Ｎｅｗ Ｙｏｒｋ（１９７２）］等が例示される。培養は、必要により通気・攪拌をしながら、通常１４〜４３℃で約３〜２４時間行うことができる。宿主が枯草菌の場合、必要により通気・攪拌をしながら、通常３０〜４０℃で約１６〜９６時間行うことができる。宿主が酵母の場合、培地として、例えばＢｕｒｋｈｏｌｄｅｒ最少培地［Ｂｏｓｔｉａｎ．Ｋ．Ｌ．ｅｔ ａｌ，Ｐｒｏｃ．Ｎａｔｌ．Ａｃａｄ．Ｓｃｉ．ＵＳＡ，７７，４５０５（１９８０）］が挙げられ、ｐＨは５〜８であることが望ましい。培養は通常約２０〜３５℃で約１４〜１４４時間行なわれ、必要により通気や攪拌を行うこともできる。
宿主が動物細胞の場合、培地として、例えば約５〜２０％のウシ胎仔血清を含む最少必須培地（ＭＥＭ）［Ｓｃｉｅｎｃｅ，１２２，５０１（１９５２）］、ダルベッコ改変最少必須培地（ＤＭＥＭ）［Ｖｉｒｏｌｏｇｙ，８，３９６（１９５９）］、ＲＰＭＩ１６４０培地［Ｊ．Ａｍ．Ｍｅｄ．Ａｓｓｏｃ．，１９９，５１９（１９６７）］、１９９培地［Ｐｒｏｃ．Ｓｏｃ．Ｅｘｐ．Ｂｉｏｌ．Ｍｅｄ．，７３，１（１９５０）］等を用いることができる。培地のｐＨは約６〜８であるのが好ましく、培養は通常約３０〜４０℃で約１５〜７２時間行なわれ、必要により通気や攪拌を行うこともできる。
宿主が昆虫細胞の場合、培地として、例えばウシ胎仔血清を含むＧｒａｃｅ’ｓ培地［Ｐｒｏｃ．Ｎａｔｌ．Ａｃａｄ．Ｓｃｉ．ＵＳＡ，８２，８４０４（１９８５）］等が挙げられ、そのｐＨは約５〜８であるのが好ましい。培養は通常約２０〜４０℃で１５〜１００時間行なわれ、必要により通気や攪拌を行うこともできる。
ＤＬＡＤの精製は、ＤＬＡＤ活性の存在する画分に応じて、通常使用される種々の分離技術を適宜組み合わせることにより行うことができる。本発明の好ましい態様においては、ＤＬＡＤは細胞質と細胞外（すなわち、培地）の両方に存在する。
培養物の培地中に存在するＤＬＡＤは、培養物を遠心または濾過して培養上清（濾液）を得、該培養上清から、例えば、塩析、溶媒沈澱、透析、限外濾過、ゲル濾過、非変性ＰＡＧＥ、ＳＤＳ−ＰＡＧＥ、イオン交換クロマトグラフィー、ヒドロキシルアパタイトクロマトグラフィー、アフィニティークロマトグラフィー、逆相高速液体クロマトグラフィー、等電点電気泳動などの公知の分離方法を適当に選択して行うことにより得ることができる。
一方、細胞質に存在するＤＬＡＤは、培養物を遠心または濾過して細胞を集め、これを適当な緩衝液に懸濁し、例えば超音波処理、リゾチーム処理、凍結融解、浸透圧ショック、および／またはトライトン−Ｘ１００等の界面活性剤処理などにより、細胞およびオルガネラ膜を破砕（溶解）した後、遠心分離や濾過などによりデブリスを除去して可溶性画分を得、該可溶性画分を、上記と同様の方法で処理することにより単離精製することができる。
組換えＤＬＡＤを迅速且つ簡便に取得する手段として、ＤＬＡＤのコード配列のある部分（好ましくはＣ末端）に、金属イオンキレートに吸着し得るアミノ酸配列（例えば、ヒスチジン、アルギニン、リシン等の塩基性アミノ酸からなる配列、好ましくはヒスチジンからなる配列）をコードするＤＮＡ配列を、遺伝子操作により付加して宿主細胞で発現させ、該細胞の培養物のＤＬＡＤ活性画分から、該金属イオンキレートを固定化した担体とのアフィニティーによりＤＬＡＤを分離回収する方法が好ましく例示される。金属イオンキレートに吸着し得るアミノ酸配列をコードするＤＮＡ配列は、例えば、ＤＬＡＤをコードするＤＮＡをクローニングする過程で、ＤＬＡＤのＣ末端アミノ酸配列をコードする塩基配列に該ＤＮＡ配列を連結したハイブリッドプライマーを用いてＰＣＲ増幅を行ったり、あるいは該ＤＮＡ配列を終止コドンの前に含む発現ベクターにＤＬＡＤをコードするＤＮＡをインフレームで挿入することにより、ＤＬＡＤコード配列に導入することができる。また、精製に使用される金属イオンキレート吸着体は、遷移金属、例えばコバルト、銅、ニッケル、鉄の二価イオン、あるいは鉄、アルミニウムの三価イオン等、好ましくはコバルトまたはニッケルの二価イオン含有溶液を、リガンド、例えばイミノジ酢酸（ＩＤＡ）基、ニトリロトリ酢酸（ＮＴＡ）基、トリス（カルボキシメチル）エチレンジアミン（ＴＥＤ）基等を付着したマトリックスと接触させて該リガンドに結合させることにより調製される。キレート吸着体のマトリックス部は通常の不溶性担体であれば特に限定されない。
本発明は、本発明のＤＬＡＤ、ＤＬＡＤ発現ベクターまたはＤＬＡＤを発現する形質転換体を有効成分とする医薬組成物、具体的には、高濃度ＤＮＡの蓄積に起因する慢性閉塞性疾患（特に、嚢胞性線維症）の治療剤、またはウイルス等による感染症の予防および治療剤を提供する。
従来、ＣＦの治療に使用されているＤＮａｓｅＩは、活性発現に二価カチオンを要求するが、肺嚢胞では二価カチオンの濃度がＤＮａｓｅＩの活性発現に必要なほど高くないと推測されている。また、ＤＮａｓｅＩの至適ｐＨは約７．１であるが、肺嚢胞の炎症部位ではｐＨが中性から酸性側に傾いていると考えらている。そして、ＤＮａｓｅＩはＣＦ患者の痰中に多量に存在するＧ−アクチンにより阻害されるという致命的な性質のために、ＣＦ治療薬としてほとんど効果がないのが実情である。これに対し、本発明のＤＬＡＤは酸性条件下で二価カチオン非依存的にＤＮＡを切断し得る。さらに、本発明のＤＬＡＤは、Ｇ−アクチンにより阻害されない、活性発現にコファクターを必要としない、中性ｐＨ領域でも活性を発現し得る等、ＣＦ患者の肺嚢胞の炎症部位で高いＤＮａｓｅ活性を発現するのに優れた性質を有している。
また、ＤＬＡＤは鶏痘ウイルス（ＦＷＰＶ）のＤＮａｓｅＩＩ関連蛋白質であるＦＰ−ＣＥＬ１［Ｊ．Ｖｉｒｏｌ．，７２：６７４２−６７５１（１９９８）］と高い相同性を有するが、ＦＷＰＶのＤＬＡＤホモログは該ウイルスが感染した細胞内に他のウイルスが侵入した際に、そのウイルスのＤＮＡを切断することにより、競合するウイルスを排除する作用を有すると考えられることから［Ｊ．Ｖｉｒｏｌ．（１９９８），上述］、ＤＬＡＤもまた、ウイルスなどの感染に対する生体防御機能を増強することができ、感染症の予防および治療に有効である。予防および治療され得る感染症は特に限定されないが、例えば、Ａ型、Ｂ型およびＣ型肝炎ウイルス、ヒト免疫不全ウイルス、インフルエンザウイルス、ヘルペスウイルス等が挙げられる。
本発明の医薬組成物の投与対象は、高濃度ＤＮＡの蓄積に起因する慢性閉塞性疾患の治療、またはウイルス等による感染症の予防および治療を必要とする動物であれば特に制限されないが、好ましくは哺乳動物、より好ましくはヒト、サル、ウシ、ウマ、ブタ等の哺乳動物、就中ヒトである。
ＤＬＡＤ蛋白質を有効成分とする本発明の医薬組成物は、ＤＬＡＤを医薬上許容される担体と適宜混合し、液状製剤、粉末、顆粒、錠剤、カプセル剤、シロップ剤、注射剤、エアロゾル剤等の剤形で、経口的または非経口的に投与することができる。
医薬上許容される担体としては、例えば、ショ糖、デンプン、マンニット、ソルビット、乳糖、グルコース、セルロース、タルク、リン酸カルシウム、炭酸カルシウム等の賦形剤、セルロース、メチルセルロース、ヒドロキシプロピルセルロース、ポリプロピルピロリドン、ゼラチン、アラビアゴム、ポリエチレングリコール、ショ糖、デンプン等の結合剤、デンプン、カルボキシメチルセルロース、ヒドロキシプロピルスターチ、ナトリウム−グリコール−スターチ、炭酸水素ナトリウム、リン酸カルシウム、クエン酸カルシウム等の崩壊剤、ステアリン酸マグネシウム、エアロジル、タルク、ラウリル硫酸ナトリウム等の滑剤、クエン酸、メントール、グリシルリシン・アンモニウム塩、グリシン、オレンジ粉等の芳香剤、安息香酸ナトリウム、亜硫酸水素ナトリウム、メチルパラバン、プロピルパラバン等の保存剤、クエン酸、クエン酸ナトリウム、酢酸等の安定剤、メチルセルロース、ポリビニルピロリドン、ステアリン酸アルミニウム等の懸濁剤、界面活性剤等の分散剤、水、生理食塩水、オレンジジュース等の希釈剤、カカオ脂、ポリエチレングリコール、白灯油等のベースワックスなどが挙げられるが、それらに限定されるものではない。
好ましくは、ＤＬＡＤ蛋白質を有効成分とする医薬組成物は、経口、注射またはエアロゾル製剤である。
経口投与に好適な製剤は、水、生理食塩水、オレンジジュースのような希釈液に有効量のＤＬＡＤを溶解させた液剤、有効量のＤＬＡＤを固体や顆粒として含んでいるカプセル剤、サッシェ剤または錠剤、適当な分散媒中に有効量のＤＬＡＤを懸濁させた懸濁液剤、有効量のＤＬＡＤを溶解させた溶液を適当な分散媒中に分散させ乳化させた乳剤等である。
エアロゾル製剤としては、ＤＬＡＤをジクロロジフロロメタン、プロパン、窒素等で圧縮したもの、あるいはネブライザーやアトマイザーのような非圧縮性製剤が挙げられ、吸入、噴霧によって気道内等に投与される。
非経口的な投与に好適な製剤としては、水性および非水性の等張な無菌の注射液剤があり、これには抗酸化剤、緩衝液、制菌剤、等張化剤等が含まれていてもよい。また、水性および非水性の無菌の懸濁液剤が挙げられ、これには懸濁剤、可溶化剤、肥厚剤、安定化剤、防腐剤等が含まれていてもよい。ＤＬＡＤ製剤は、アンプルやバイアルのように単位投与量あるいは複数回投与量ずつ容器に封入することができる。また、ＤＬＡＤおよび医薬上許容される担体を凍結乾燥（フリーズドライ）し、使用直前に適当な無菌のビヒクルに溶解または懸濁すればよい状態で保存することもできる。
本発明のＤＬＡＤ蛋白質含有医薬組成物の投与量は、予防または治療すべき疾患の種類、病気の進行度、投与対象動物種、投与対象の薬物受容性、体重、年齢等によって異なるが、通常、成人１日あたり１〜１０，０００Ｉ．Ｕ．／ｋｇ体重、好ましくは１０〜１，０００Ｉ．Ｕ．／ｋｇ体重であり、この量を１回または数回に分けて投与することができる。
本発明はまた、本発明のＤＬＡＤ発現ベクターを有効成分とする医薬組成物を提供する。ＤＮａｓｅを用いたＣＦ治療は、対症療法であって根本的な治療法ではないので、肺嚢胞の炎症部位に継続的にＤＬＡＤが供給される必要がある。したがって、ＤＬＡＤ発現ベクターを投与し、炎症部位またはその周辺の細胞に導入する遺伝子治療はＣＦの持続的な治療手段として有効である。また、家畜などのウイルス感染症を未然に防止するために、ＤＬＡＤ発現ベクターを胚細胞に導入して感染防御機能が増強されたトランスジェニック動物を作製することもできる。
使用されるベクターは投与対象に応じて適宜選択されるが、ヒト等の哺乳動物への投与に好適なベクターとしては、レトロウイルス、アデノウイルス、アデノ随伴ウイルス等のウイルスベクターが挙げられる。アデノウイルスは、遺伝子導入効率が極めて高く、非分裂細胞にも導入可能であり、また、気道上皮細胞指向性であることから、ＣＦ治療のためのＤＬＡＤ遺伝子導入ベクターとして特に好ましい。但し、導入遺伝子の宿主染色体への組込みは極めて稀であるので、遺伝子発現は一過性で通常約４週間程度である。治療効果の持続性を考慮すれば、比較的遺伝子導入効率が高く、非分裂細胞にも導入可能で、且つ逆位末端繰り返し配列（ＩＴＲ）を介して染色体に組み込まれ得るアデノ随伴ウイルスの使用もまた好ましい。
ＤＬＡＤ発現ベクターを有効成分とする医薬組成物に含まれる医薬上許容される担体としては、上記ＤＬＡＤ蛋白質含有医薬組成物と同様のものが好ましく例示される。
ベクター導入は、投与対象から標的細胞を体外に取り出し、培養してから導入を行って体内に戻すｅｘ ｖｉｖｏ法と、投与対象の体内に直接ベクターを投与して導入を行うｉｎ ｖｉｖｏ法のいずれかで行われる。ｉｎ ｖｉｖｏ法の場合、静脈内注射などによりベクターを投与すると、ウイルスベクターの抗原性が問題となるが、標的細胞の存在する臓器／組織に局所的にベクターを注入すれば（ｉｎ ｓｉｔｕ法）、抗体の存在による悪影響を軽減することができる。
ベクターとして非ウイルスベクターを使用する場合、ＤＬＡＤ発現ベクターの導入は、リポソームやポリリジン−ＤＮＡ−蛋白質複合体などの高分子キャリアーを用いて行うことができる。
本発明はまた、本発明のＤＬＡＤ発現ベクターを含む宿主細胞を有効成分とする医薬組成物を提供する。使用される宿主細胞としては、上記ＤＬＡＤ発現ベクターを用いた遺伝子治療のｅｘ ｖｉｖｏ法において、投与対象から標的細胞として取り出される自己細胞、または同系もしくは同種異系の個体から取り出した細胞、あるいはそれらの細胞の継代培養により誘導された樹立細胞株などが例示される。また、別の態様においては、投与対象となる動物の鼻腔、咽頭、口腔、腸管、皮膚、膣等に常在する細菌等を宿主細胞として、常法によりこれをＤＬＡＤ発現ベクターで形質転換し、得られる形質転換体を宿主細胞が通常存在する投与対象内の部位に送達することもできる。
本発明のＤＬＡＤ発現ベクターおよび該ベクターを発現する宿主細胞を有効成分とする医薬組成物の投与量は、ＤＬＡＤ蛋白質自体を投与する場合の適切な投与量に相当する量のＤＬＡＤを、それらを投与された動物の体内で発現させる程度であることが望ましい。
以下に実施例を挙げて本発明をさらに具体的に説明するが、これらは単なる例示であって、本発明の範囲を何ら限定するものではない。
実施例１ マウスＤＬＡＤ ｃＤＮＡのクローニングおよび配列解析
ｔｂｌａｓｔｎプログラムを用いて、ＮＣＢＩ ＧｅｎＢａｎｋデータベースのＥＳＴサブディビジョンを、ヒトＤＮａｓｅＩＩ（ＧｅｎＢａｎｋ ＡＦ０６０２２２）の推定アミノ酸配列と相同性を有するアミノ酸配列をコードするＥＳＴについてスクリーニングした。その結果、マウスＥＳＴクローン（ＧｅｎＢａｎｋ ＡＩ０４８６４１）が同定された。該ＥＳＴクローンの塩基配列を基にして、下記の２つのオリゴヌクレオチドプライマー（ＧＳＰ２／ｍＤおよびＧＳＰ１／ｍＤ）を合成した。さらに、リンカープライマーとして下記のオリゴヌクレオチド（ＡＰ１）を合成した。
ＧＳＰ２／ｍＤ：

（配列表配列番号２に示される塩基配列中塩基番号３００〜３２６で示される塩基配列と同一配列）
ＧＳＰ１／ｍＤ：

（配列表配列番号２に示される塩基配列中塩基番号５０９〜５３５で示される塩基配列に相補的な配列）
ＡＰ１：

オリゴｄＴを含む下記プライマー：

（但し、ＶはＧ、ＡまたはＣであり、ＮはＧ、Ａ、ＣまたはＴである。）
を用いて、Ｃ５７ｂｌａｃｋ／６マウス肝臓由来ポリＡ（＋）ＲＮＡを鋳型に逆転写反応を行い、一本鎖ｃＤＮＡ（アンチセンス鎖）を作製した。さらに常法に従ってセンス鎖の合成を行い２本鎖ＤＮＡとした後、その両端にＡＰ１配列を含むリンカーＤＮＡのライゲーションを行った。このｃＤＮＡを鋳型に、ＧＳＰ２／ｍＤをセンスプライマー、ＡＰ１をアンチセンスプライマーとして３’末端のＲＡＣＥ反応を行った。さらにＡＰ１をセンスプライマー、ＧＳＰ１／ｍＤをアンチセンスプライマーとして５’末端のＲＡＣＥ反応を行った。ＲＡＣＥ反応はＭａｒａｔｈｏｎ ｃＤＮＡ Ａｍｐｌｉｆｉｃａｔｉｏｎ ｋｉｔ（Ｃｌｏｎｔｅｃｈ社製）を用いて行った。各増幅産物をｐＢｌｕｅｓｃｒｉｐｔ ＫＳ＋（Ｓｔｒａｔａｇｅｎｅ社製）にサブクローニングし、７−Ｄｅａｚａ Ｔｈｅｒｍｏ Ｓｅｑｕｅｎａｓｅ ｋｉｔ（Ａｍａｓｈａｍ社製）およびＤＳＱ１０００Ｌ ＤＮＡシークエンサー（島津製作所製）を用いてサイクルシークエンス法により各インサートの塩基配列を決定した。
その結果、ＤＮａｓｅＩＩと相同性を有するＥＳＴクローンを配列の一部として含むｍＲＮＡは、配列表配列番号２に示される塩基配列からなることが明らかとなった。３’ＲＡＣＥ反応により、ポリアデニレーション部位が異なる２つのｃＤＮＡ断片が得られた。第１のポリアデニレーション部位（塩基番号１４０９）の１４塩基上流（塩基番号１３９０〜１３９５）および第２のポリアデニレーション部位（塩基番号１６３４）の１８塩基上流（塩基番号１６１１〜１６１６）にはポリＡ付加シグナルのコンセンサス配列（ＡＡＴＡＡＡ）が存在し、この観察を裏付けている。
解析の結果、このｃＤＮＡ配列は３５４アミノ酸からなる新規ポリペプチドをコードする１０６５ｂｐのＯＲＦ（塩基番号２１３〜１２７７）を含んでいた。該ＯＲＦはアミノ酸レベルでＤＮａｓｅＩＩと３７．１％の同一性を有していた。また、該ＯＲＦにコードされるポリペプチドの、推定アミノ酸配列から計算される分子量は４０７６７であった。組換え生産された蛋白質の酵素学的性質（後述）に基づいて、本発明者らはこの新規蛋白質をＤＮａｓｅＩＩ様酸性ＤＮａｓｅ（ＤＬＡＤ）と命名した。
ＤＬＡＤは８つの可能性のあるＮ−グリコシル化部位［Ａｓｎ−Ｘａａ−Ｔｈｒ／Ｓｅｒ（Ｘａａは任意のアミノ酸）のＡｓｎ残基；配列表配列番号１で示されるアミノ酸配列中、アミノ酸番号４８、５５、７６、９２、１０７、１８６、２４９および２９７］を含む塩基性に富んだ蛋白質である（等電点：９．６７）。ｖｏｎ Ｈｅｉｊｎｅ法［Ｎｕｃｌｅｉｃ Ａｃｉｄｓ Ｒｅｓ．，１４：４６８３−４６９０（１９８６）］により予測されるＮ末シグナルペプチドは最初の２２アミノ酸（アミノ酸番号−２２〜−１）であった。
ＧｅｎＢａｎｋデータベースのホモロジー検索により、ＤＬＡＤは線虫Ｃ．エレガンスのゲノムの推定ＯＲＦにコードされる３つの蛋白質、Ｃ０７Ｂ５．５、Ｆ０９Ｇ８．２およびＫ０４Ｈ４．６と、アミノ酸レベルでそれぞれ３２．１％、２５．１％および１９．４％の同一性があることがわかった。さらにＤＬＡＤは、ＦＷＰＶゲノムの第３ＯＲＦにコードされるＦＰ−ＣＥＬ１と、アミノ酸レベルで３７．５％の同一性を有していた。これは、ＤＮａｓｅＩＩとＦＰ−ＣＥＬ１との同一性（２８．４％）よりも高い値である。
実施例２ ＤＬＡＤ ｍＲＮＡの組織分布
種々のマウス組織内でのＤＬＡＤ ｍＲＮＡの発現を調べるためにノーザンブロット分析を行った。成体マウスの脳、胸腺、肺、心臓、肝臓、胃、小腸、脾臓、腎臓および精巣の各組織より、ＴＲＩｚｏｌ試薬（Ｇｉｂｃｏ ＢＲＬ社製）を用いて全ＲＮＡを抽出した。各ＲＮＡアリコート（１５μｇ）を１％アガロースホルムアミドゲル電気泳動にかけた後、Ｂｉｏｄｙｎｅ−Ａメンブレン（Ｐａｕｌ社製）にブロッティングした。このメンブレンを、５×ＳＳＰＥ、５×Ｄｅｎｈａｒｄｔ’ｓ溶液、５０％ホルムアミド、０．１％ ＳＤＳおよび１００μｇ／ｍｌ熱変性サケ精子ＤＮＡからなるハイブリダイゼーション溶液中、ヒスチジンタグを有するＤＬＡＤ−Ｍｙｃ融合蛋白質をコードするＤＮＡを担持するベクターｐｃＤＬＡＤ−Ｍｙｃ−Ｈｉｓ（後述）のＸｈｏ Ｉ消化断片を用いたランダムプライミングにより得られた^３２Ｐ標識プローブと、４２℃で一晩ハイブリダイズさせた。反応終了後、ハイブリダイゼーション溶液を除去し、メンブレンを０．１×ＳＳＣ、０．１％ ＳＤＳ中、５０℃で洗浄し、増感スクリーンを用いて−８０℃で５日間Ｘ線フィルムに感光させた。その結果、肝臓においてのみ１．９ｋｂのＤＬＡＤ ｍＲＮＡのバンドが検出された。ＤＬＡＤの肝臓特異的な発現はＤＮａｓｅＩＩの低い臓器特異性とは対照的であり、ＤＬＡＤの生理機能がＤＮａｓｅＩＩのそれとは明確に区別されるものであることを示唆している。
実施例３ ＤＬＡＤ蛋白質の局在性
実施例１におけるＤＬＡＤの一次構造解析から、ＤＬＡＤ初期翻訳産物はＮ末にシグナルペプチドの条件を満たす疎水性ドメインを有することがわかった。すなわち、ＤＬＡＤは分泌蛋白質であることが示唆された。そこで、これを検証するためにＤＬＡＤ発現ベクターをヒト培養細胞に導入し、細胞内外のＤＬＡＤの存在比を比較した。また、細胞内に存在するＤＬＡＤが細胞のどの下位構造に局在しているかについて分析した。
（１）ＤＬＡＤ発現ベクターの構築
下記のプライマー対を用いて、Ｃ５７ｂｌａｃｋ／６マウス肝臓由来ポリＡ（＋）ＲＮＡを鋳型にＲＴ−ＰＣＲを行い、終止コドンを除くＤＬＡＤのＯＲＦを含むｃＤＮＡ断片を生成し、ｐＢｌｕｅｓｃｒｉｐｔ ＫＳ＋にサブクローニングした。
センスプライマー：

（配列表配列番号２に示される塩基配列中塩基番号２１３〜２３６で示される塩基配列の５’末端にＸｈｏ Ｉ認識部位（ＣＴＣＧＡＧ）を含むリンカー配列を付加したもの）
アンチセンスプライマー：

（配列表配列番号２に示される塩基配列中塩基番号１２５２〜１２７４で示される塩基配列に相補的な配列の５’末端にＸｈｏ Ｉ認識部位（ＣＴＣＧＡＧ）を含むリンカー配列を付加したもの）
サイクルシークエンスにより配列を確認した後、Ｘｈｏ Ｉで消化してインサートＤＮＡを切り出し、ｐｃＤＮＡ３−Ｍｙｃ−Ｈｉｓ Ｃ（Ｉｎｖｉｔｒｏｇｅｎ社製）およびｐＥＧＦＰ−Ｎ３（Ｃｌｏｎｔｅｃｈ社製）のＸｈｏ Ｉ部位にそれぞれリクローニングして、Ｃ末端にＭｙｃおよびヒスチジンタグを含むＤＬＡＤをコードする発現ベクターｐｃＤＬＡＤ−Ｍｙｃ−Ｈｉｓ、およびＤＬＡＤ−ＧＦＰ（Ｇｒｅｅｎ Ｆｌｕｏｒｅｓｃｅｎｃｅ Ｐｒｏｔｅｉｎ）融合蛋白質をコードする発現ベクターｐＤＬＡＤ−ＧＦＰを得た。比較のために、Ｃ末端にＭｙｃおよびヒスチジンタグを含むＤＮａｓｅＩＩをコードする発現ベクターｐｃＤＮａｓｅＩＩ−Ｍｙｃ−Ｈｉｓを同様の手順で作製した。
さらに、ＤＬＡＤのシグナルペプチドの分泌効率を調べるために、ＤＬＡＤのシグナルペプチドをＤＮａｓｅＩＩのそれに置換したキメラ蛋白質をコードする発現ベクターｐｃＤＮａｓｅＩＩ／ＤＬＡＤを以下の手順で作製した。すなわち、下記の２つのプライマー対を用いて、ＤＮａｓｅＩＩのシグナルペプチドをコードするＤＮＡ断片およびシグナルペプチドを含まないＤＬＡＤをコードするＤＮＡ断片を、それぞれＰＣＲにより増幅した後、Ｈａｅ ＩＩで消化し、両断片をライゲーションしてｐＢｌｕｅｓｃｒｉｐｔ ＫＳ＋にサブクローニングし、配列を確認した後、ｐｃＤＮＡ３−Ｍｙｃ−Ｈｉｓ ＣにリクローニングしてｐｃＤＮａｓｅＩＩ／ＤＬＡＤを得た。
ＤＮａｓｅＩＩシグナルペプチドコード配列の増幅
センスプライマー：

アンチセンスプライマー：

シグナルペプチド（−）ＤＬＡＤコード配列の増幅
センスプライマー：

アンチセンスプライマー：

（２）トランスフェクションおよびウエスタンブロット分析
１０％胎仔ウシ血清添加ＲＰＭＩ１６４０培地中で増殖させたＨｅＬａ Ｓ３細胞（２×１０^５個）を、ＦｕＧｅｎｅ６トランスフェクション試薬（Ｂｏｅｈｒｉｎｇｅｒ社製）を用いて、ｐｃＤＬＡＤ−Ｍｙｃ−Ｈｉｓ、ｐｃＤＮａｓｅＩＩ／ＤＬＡＤまたはｐｃＤＮａｓｅＩＩ−Ｍｙｃ−Ｈｉｓ（１μｇ）で個々にトランスフェクトした。４８時間培養後、培養上清（細胞外画分）と細胞とを別個に回収した。氷冷した０．１％ノニデットＰ−４０を含む緩衝液Ａ［１００ｍＭ トリス塩酸（ｐＨ７．８）、３ｍＭ ＭｇＣｌ_２、１ｍＭ ２−メルカプトエタノール、０．３ｍＭ ＰＭＳＦ］２ｍｌ中で、テフロン−ガラスホモジナイザーを用いて（１０ストローク）細胞をホモジナイズした。ホモジネートを１０，０００×ｇで１０分間遠心し、上清を細胞内（細胞質）画分として回収した。細胞内および細胞外画分のそれぞれから、Ｎｉ−ＮＴＡスピンカラム（Ｑｉａｇｅｎ社製）を製造元のプロトコールに従って使用し、ヒスチジンタグを有する組換え蛋白質を精製した。Ｕｌｔｒａｆｒｅｅ ＭＣ（Ｍｉｌｌｉｐｏｒｅ社製）で濃縮した後、溶出液アリコートを１０％ ＳＤＳ−ＰＡＧＥにかけ、Ｉｍｍｏｂｉｌｏｎ Ｐメンブレン（Ｍｉｌｌｉｐｏｒｅ社製）にトランスファーした。該メンブレンを２．５％ウシ血清アルブミン含有ＴＢＳＴ［２０ｍＭ トリス塩酸（ｐＨ８．０）、４００ｍＭ ＮａＣｌ、０．０５％（ｗ／ｖ） Ｔｒｉｔｏｎ Ｘ−１００］中で１時間ブロッキングした後、マウス抗Ｍｙｃ抗体（Ｎｏｖａｇｅｎ社製）と反応させた。ＴＢＳＴで洗浄後、メンブレン上に保持された抗体を、アルカリホスファターゼで標識した抗マウスＩｇＧ（Ｐｒｏｍｅｇａ社製）を用いて検出した。染色像をＣＣＤカメラ（Ａｔｔｏ社製）を用いてスキャニングし、バンドの光学密度をデンシトメトリー（ＮＩＨ ｉｍａｇｅ１．６０）にて定量した。その結果を図１に示す。
Ｍｙｃおよびヒスチジンタグを有するＤＬＡＤは５８ｋＤａの単一バンドとして検出された。すなわち、Ｃ末端に付加されたＭｙｃおよびヒスチジンタグの分子量（約３ｋＤａ）を考慮すると、ＤＬＡＤ本体の分子量はＳＤＳ−ＰＡＧＥ上、約５５ｋＤａと見積もられる。この値はＤＬＡＤのアミノ酸配列から予測される分子量３８，４５２Ｄａ（アミノ酸番号１〜３３２）よりも大きいが、これは糖鎖の付加によるものと考えられる。
ＤＮａｓｅＩＩは約８０％が細胞外に分泌されたのに対し、ＤＬＡＤは約７０％が細胞内にとどまり、約３０％が細胞外に見出された（図１）。ＤＬＡＤはＨｅＬａ Ｓ３細胞の培地中でＤＮａｓｅＩＩと同程度に安定であるので、細胞外ＤＬＡＤの存在比の低さは培地でのＤＬＡＤの急速な分解によるものではない。また、ＤＬＡＤのシグナルペプチドをＤＮａｓｅＩＩのそれに置き換えても分泌効率が向上しなかったことから、分泌効率の低さはＤＬＡＤの分泌シグナルが弱いせいでもない。したがって、成熟ＤＬＡＤ蛋白質中に細胞内保持シグナルとなるターゲッティングモチーフが存在することが示唆される。
（３）ＤＬＡＤ−ＧＦＰ融合蛋白質の蛍光顕微鏡解析
カバーガラス上で増殖させたＨｅＬａ Ｓ３細胞（２×１０^５個）を、上記（２）と同様にしてｐＤＬＡＤ−ＧＦＰ（１μｇ）でトランスフェクトした。細胞を４８時間培養し、室温で１０分間１％グルタルアルデヒド［ＰＢＳ（−）中］で固定した。ＰＢＳ（−）でカバーガラスを洗浄した後、１ｍＭ Ｈｏｅｃｈｓｔ ３３２５８［ＰＢＳ（−）中］で細胞核を染色し、ＧＦＰおよびＤＮＡの像を蛍光顕微鏡（オリンパス光学製）で観察した。対照として、ＧＦＰのみを発現するように操作されたＨｅＬａ Ｓ３細胞についても同様の観察を行った。その結果、ＧＦＰは細胞質と核の両方の領域にわたって拡散した像を与えたのに対し、ＤＬＡＤ−ＧＦＰ融合蛋白質は細胞質中に顆粒状のパターンとして検出された。このことから、細胞内のＤＬＡＤは細胞質に局在し、いずれかのオルガネラにターゲッティングされることが示唆される。ＰＳＯＲＴＩＩプログラムを用いたモチーフ検索により、ＤＬＡＤはミトコンドリアおよび核への移行シグナルを含まないことが明らかとなった。したがって、細胞質ＤＬＡＤの可能性のある標的オルガネラはリソソームやペルオキシソームのような酸性オルガネラであると推測される。
実施例４ ＤＬＡＤの酵素学的性質の解析
（１）組換えＤＬＡＤの精製
実施例３の（２）と同様にして、ＨｅＬａＳ３細胞（５×１０^６個）を２５μｇのｐｃｍＤＬＡＤ−Ｍｙｃ−ＨｉｓまたはｐｃｍＤＮａｓｅＩＩ−Ｍｙｃ−Ｈｉｓで個々にトランスフェクトした。該プラスミドはそれぞれ、ＤＬＡＤおよびＤＮａｓｅＩＩの成熟蛋白質のＣ末端にＭｙｃおよびヒスチジンタグが付加された蛋白質をコードする。細胞を４８時間培養した後、実施例３の（２）と同様にして、Ｎｉ−ＮＴＡスピンカラムを用いたＩＭＡＣにより組換えＤＬＡＤおよび組換えＤＮａｓｅＩＩを精製した。溶出バッファー［２５０ｍＭ イミダゾールおよび３００ｍＭ ＮａＣｌを含む５０ｍＭ リン酸ナトリウム（ｐＨ８．０）］３００μｌ中に溶出した精製ＤＬＡＤ（またはＤＮａｓｅＩＩ）を、１ｍＭ ２−メルカプトエタノール含有２０ｍＭ Ｍｅｓ−ＮａＯＨに対して透析したものを以下の酵素活性測定に使用した。なお、空のベクターでトランスフェクトしたＨｅＬａ Ｓ３細胞を同様に処理して得られた試料を対照として用いた。
以下の実験において、ＤＮａｓｅ活性測定は、特に記載されない限り下記のようにして行った。反応混合物［５０ｍＭ ＭｅＳ−ＮａＯＨ（ｐＨ５．２）、１ｍＭ ２−メルカプトエタノール、酵素１単位、５００ｎｇ スーパーコイル状またはＥｃｏ ＲＩ消化した線状ｐＢｌｕｅｓｃｒｉｐｔ ＫＳ＋］２０μｌを氷上で調製し、４５℃で２０分間インキュベートした。フェノール／クロロホルムにて反応を停止させ、反応物アリコート５μｌを１％アガロースゲル電気泳動に付した。エチジウムブロマイド染色後、泳動像をＵＶ照射下ＣＣＤカメラ（Ａｔｔｏ社製）でスキャニングし、完全長の基質ＤＮＡに相当するバンドの光学密度をデンシトメトリー（ＮＩＨｉｍａｇｅ １．６０）にて定量した。ＤＮａｓｅ活性は完全長の基質ＤＮＡに相当するバンド強度の減少を指標に測定した。本発明では、１単位のＤＬＡＤおよびＤＮａｓｅＩＩ活性を、上記反応条件において２００ｎｇの完全長の基質ＤＮＡに相当するバンド強度を減少させるのに必要な酵素量と定義する。
（２）二価カチオン要求性
基質としてスーパーコイル状のプラスミドを用い、二価カチオンキレート剤の存在下および非存在下でのＤＬＡＤ活性を、酸性（５０ｍＭ Ｍｅｓ−ＮａＯＨ，ｐＨ５．２）および中性（５０ｍＭ Ｍｏｐｓ−ＮａＯＨ，ｐＨ７．２）条件下でそれぞれ測定した。キレート剤としては１ｍＭのＥＤＴＡおよびＥＧＴＡを個々に使用した。その結果、ＤＬＡＤは、いずれのｐＨ条件下においてもスーパーコイル状のプラスミドＤＮＡの分解を触媒するエンドヌクレアーゼ活性を示した。しかしながら、酸性条件下でのＤＬＡＤ活性は中性条件下での活性よりもはるかに高かった。また、ｐＨ範囲に関係なく、二価カチオンキレート剤であるＥＤＴＡやＥＧＴＡの添加はＤＬＡＤ活性に影響を及ぼさなかった。したがって、ＤＬＡＤは二価カチオン非依存性の酸性ＤＮａｓｅであることが実証された。なお、空のベクターをトランスフェクトしたＨｅＬａ Ｓ３細胞由来試料を用いて同様のアッセイを行っても、エンドヌクレアーゼ活性は検出されなかったことから、検出されたＤＬＡＤ活性はＨｅＬａ Ｓ３細胞の内在ＤＮａｓｅの夾雑によるものではない。
（３）活性ｐＨ範囲および至適ｐＨ
基質としてスーパーコイル状のプラスミドを用い、緩衝液の種類およびｐＨを酢酸塩−ＮａＯＨ（ｐＨ４．０および４．４）、Ｍｅｓ−ＮａＯＨ（ｐＨ４．８、５．２、５．６、６．０および６．４）、並びにＭｏｐｓ−ＮａＯＨ（ｐＨ６．４、６．８、７．２および７．６）と種々変化させる以外は上記の標準的条件で、ＤＬＡＤおよびＤＮａｓｅＩＩの各酵素活性を測定した。その結果、ＤＬＡＤでは、調べたすべてのｐＨ範囲でＤＮａｓｅ活性が認められた。最も高い活性はＭｅｓ−ＮａＯＨ（ｐＨ５．２）で観察された。しかしながら、ＤＮａｓｅＩＩの活性はｐＨ５．６以下でのみ検出された。
（４）阻害剤に対する感受性
種々の濃度のＤＮａｓｅ阻害剤［ＭｇＣｌ_２（図２Ａ，○）、ＭｇＳＯ_４（図２Ａ，●）、オウリントリカルボン酸（図２Ｂ）、Ｇ−アクチン（図２Ｃ）、ＣｏＣｌ_２（図２Ｄ，■）、ＮｉＣｌ_２（図２Ｄ，△）およびＺｎＣｌ_２（図２Ｄ，●）］の存在下に、上記の標準的条件でＤＬＡＤ活性を測定し、各種阻害剤に対する感受性について分析した。その結果、ＭｇＣｌ_２は高濃度ではＤＬＡＤ活性を阻害した（ＩＣ_５０＝１３ｍＭ）。ＤＮａｓｅＩＩ阻害剤であるＭｇＳＯ_４は、ＭｇＣｌ_２よりも効率よくＤＬＡＤを阻害した（ＩＣ_５０＝７ｍＭ）。このことは、ＳＯ_４ ^２−イオンがＤＬＡＤの阻害に効果的であることを示している。ヌクレアーゼの一般的な阻害剤であるオウリントリカルボン酸はＤＬＡＤを強く阻害したのに対し（ＩＣ_５０＝６μＭ）、ＤＮａｓｅＩ阻害剤であるＧ−アクチンはＤＬＡＤを阻害しなかった。３種の二価金属イオンに対する感受性を比較した結果、ＤＬＡＤはＺｎ^２＋に対して最も感受性が高いことがわかった（ＩＣ_５０＝０．２ｍＭ）。一方、ＤＮａｓｅＩＩに対するこれら３種の二価金属イオンの阻害効果にはほとんど差がないことが知られている［Ｊ．Ｂｉｏｃｈｅｍ．，８７：１０９７−１１０３（１９８０）］。
（５）ＤＮＡ加水分解様式
基質としてスーパーコイル状のｐＢｌｕｅｓｃｒｉｐｔ ＫＳ＋を用い、上記の標準的な条件でＤＬＡＤおよびＤＮａｓｅＩＩの酵素反応を実施した。反応終了後、フェノール／クロロホルム処理して夾雑物を除去し、プラスミドＤＮＡ分解物を単離した。３’末端をターミナルデオキシヌクレイチジルトランスフェラーゼ（東洋紡製）２０単位、０．８３ｍＣｉ／ｍｌ［γ−^３２Ｐ］ｄＣＴＰ、１００ｍＭ カコジル酸ナトリウム（ｐＨ７．２）、０．２ｍＭ ＤＴＴおよび１ｍＭ ＣｏＣｌ_２からなる反応液５０μｌ中で標識した。一方、５’末端は、ポリヌクレオチドキナーゼ（東洋紡製）２０単位、０．８３ｍＣｉ／ｍｌ［γ−^３２Ｐ］ＡＴＰ、５０ｍＭ トリス塩酸（ｐＨ８．０）、１０ｍＭ ＭｇＣｌ_２および１０ｍＭ ２−メルカプトエタノールからなる反応液５０μｌ中で標識した。各末端標識処理は、５０ｍＭ トリス塩酸（ｐＨ８．０）および１ｍＭ ＭｇＣｌ_２の存在下にウシ小腸アルカリホスファターゼ（宝酒造製）２０単位を反応させてＤＮＡ末端のリン酸基を除去する前処理を行ったものと、行わななかったものの両方についてそれぞれ実施した。取り込まれなかったヌクレオチドはエタノール沈澱により除去した。該標識処理したＤＮＡを１％アガロースゲル電気泳動にかけ、ナイロンメンブレンにトランスファーした後、ＢＡＳ１５００画像解析装置（富士フィルム製）を用いて解析した。その結果、ＤＬＡＤおよびＤＮａｓｅＩＩのいずれで処理したＤＮＡ断片も、５’末端はアルカリホスファターゼによる前処理に関係なく標識されたが、３’末端はリン酸基を除去した後でしか標識されなかった。したがって、ＤＬＡＤはＤＮａｓｅＩＩと同じく、３’−Ｐ／５’−ＯＨ末端を生じるようなＤＮＡ加水分解を触媒することが明らかとなった。
実施例５ ＤＬＡＤの外来ＤＮＡ発現抑制効果
（１）ラットＤＬＡＤ ｃＤＮＡの単離
実施例１と同様のストラテジーを用いて、ヒトＤＮａｓｅＩＩの推定アミノ酸配列と相同性を有するアミノ酸配列をコードするラットＥＳＴクローン（ＧｅｎＢａｎｋ ＡＦ１７８９７４）を同定した。このクローンの塩基配列を基にオリゴヌクレオチドプライマーを合成し、先天性色素欠損（ａｌｂｉｎｏ）のＷｉｓｔａｒラット肝臓由来ポリＡ（＋）ＲＮＡを鋳型としたＲＡＣＥ法により、全長ラットＤＬＡＤ ｃＤＮＡをクローニングした。常法により配列決定を行った結果、このｃＤＮＡは３５６アミノ酸をコードするＯＲＦを含み、Ｎ末端に２２アミノ酸からなるシグナルペプチドを含むことが推定された。マウスＤＬＡＤとは、ＤＮＡレベルで８３．３％、アミノ酸レベルで７０．８％の同一性が認められた。実施例３の（１）と同様のストラテジーにより、Ｃ末端にＭｙｃおよびヒスチジンタグを含むラットＤＬＡＤをコードする発現ベクターｐｒＤＬＡＤ−Ｍｙｃ−Ｈｉｓを構築し、これをＨｅＬａ Ｓ３細胞にトランスフェクトして組換えラットＤＬＡＤを得た。得られた組換え蛋白質を用いて特性解析を行った結果、この蛋白質は、活性ｐＨ範囲、二価カチオン要求性、ＤＮＡ切断様式、阻害剤に対する感受性等において、マウスＤＬＡＤと同様の性質を有することが確認された。
（２）ＤＬＡＤ発現ＨｅＬａ細胞における外来レポーター遺伝子の発現抑制
カバーガラス上で増殖させたＨｅＬａ Ｓ３細胞（２×１０^５）を、実施例３の（２）と同様の方法を用いて、ｐｒＤＬＡＤ−Ｍｙｃ−Ｈｉｓ（１μｇ）およびｐｃＤＮＡ３．１−Ｍｙｃ−Ｈｉｓ／ｌａｃＺ（β−ガラクトシダーゼ発現ベクター；Ｉｎｖｉｔｒｏｇｅｎ社製）もしくはｐＥＧＦＰ−Ｎ３（Ｃｌｏｎｔｅｃｈ社製；上述）（０．５μｇ）で同時トランスフェクションした。ＧＦＰ活性は実施例３の（３）に記載の方法に従った。また、β−ガラクトシダーゼ活性は、β−ガラクトシダーゼアッセイシステム（Ｐｒｏｍｅｇａ社製）を用いて、添付のプロトコールに従って測定した。比較のために、ＤＬＡＤに代えて、Ｃ末端にＭｙｃおよびヒスチジンタグを含むラットＤＮａｓｅＩＩをコードする発現ベクターｐｒＤＮａｓｅＩＩ−ｍｙｃ−Ｈｉｓを用い、同様の実験を行った。また、コントロールとして、空のベクターｐｃＤＮＡ３．１−Ｍｙｃ−Ｈｉｓ（Ｉｎｖｉｔｒｏｇｅｎ社製）を用いた。その結果を第３図に示す。
図から明らかなように、ＤＮａｓｅＩＩが外来のレポーター遺伝子の発現に全く影響を及ぼさないのに対し、ＤＬＡＤはコントロールに対して約２０〜２５％これらの外来遺伝子の発現を抑制した。このことから、ＤＬＡＤは細胞内に侵入した異種ＤＮＡ、例えばウイルスＤＮＡに作用して、これを分解除去する効果があることが示唆された。
実施例６ ヒトＤＬＡＤ ｃＤＮＡの単離
実施例１と同様のストラテジーを用いて、マウスＤＬＡＤのアミノ酸配列と相同性を有するアミノ酸配列をコードするヒトＥＳＴクローン（ＧｅｎＢａｎｋ Ｎｏ．ＡＡ９８８１２５）を同定した。このクローンの塩基配列を基に以下のオリゴヌクレオチドプライマー：
ＧＳＰ２／ｈ２Ｌ：

（配列表配列番号４に示される塩基配列中塩基番号８３２〜８５８で示される塩基配列と同一配列）
ＧＳＰ１／ｈ２Ｌ：

（配列表配列番号４に示される塩基配列中塩基番号９７３〜９９９で示される塩基配列に相補的な配列）
を合成し、さらに上記リンカープライマーＡＰ１を用いて、ヒト肝臓由来ポリＡ（＋）ＲＮＡを鋳型としたＲＡＣＥ法により、全長ヒトＤＬＡＤ ｃＤＮＡをクローニングした。常法により配列決定を行った結果、このｃＤＮＡは３６１アミノ酸（配列表配列番号３）をコードするＯＲＦ（配列表配列番号４）を含み、Ｎ末端に２７アミノ酸からなるシグナルペプチドを含むことが推定された。マウスＤＬＡＤとは、ＤＮＡレベルで７５．１％、アミノ酸レベルで６５．４％の同一性が認められた。実施例３の（１）と同様のストラテジーにより、Ｃ末端にＭｙｃおよびヒスチジンタグを含むヒトＤＬＡＤをコードする発現ベクターｐｈＤＬＡＤ−Ｍｙｃ−Ｈｉｓを構築し、これをＨｅＬａ Ｓ３細胞にトランスフェクトして組換えヒトＤＬＡＤを得た。得られた組換え蛋白質を用いて特性解析を行った結果、この蛋白質は、活性ｐＨ範囲、二価カチオン要求性、ＤＮＡ切断様式、阻害剤に対する感受性等において、マウスＤＬＡＤと同様の性質を有することが確認された。
配列リストのフリーテキスト
配列番号５：マウスＤＬＡＤ ｃＤＮＡの３’末端を増幅するためのセンスプライマーとして作用すべく設計されたオリゴヌクレオチド。
配列番号６：マウスＤＬＡＤ ｃＤＮＡの５’末端を増幅するためのアンチセンスプライマーとして作用すべく設計されたオリゴヌクレオチド。
配列番号７：ＤＬＡＤ ｃＤＮＡの５’および３’末端を増幅するためのリンカープライマーとして作用すべく設計されたオリゴヌクレオチド。
配列番号８：マウスＤＬＡＤ ＲＮＡの逆転写反応のためのプライマーとして作用すべく設計されたオリゴヌクレオチド、但し、Ｖはｇ，ａまたはｃであり、ｎはｇ，ａ，ｃまたはｔである。
配列番号９：全長マウスＤＬＡＤ ｃＤＮＡを増幅するためのセンスプライマーとして作用すべく設計されたオリゴヌクレオチド。
配列番号１０：全長マウスＤＬＡＤ ｃＤＮＡを増幅するためのアンチセンスプライマーとして作用すべく設計されたオリゴヌクレオチド。
配列番号１１：ＤＮａｓｅＩＩシグナルペプチドのコード配列を増幅するためのセンスプライマーとして作用すべく設計されたオリゴヌクレオチド。
配列番号１２：ＤＮａｓｅＩＩシグナルペプチドのコード配列を増幅するためのアンチセンスプライマーとして作用すべく設計されたオリゴヌクレオチド。
配列番号１３：シグナルペプチドを欠くＤＬＡＤのコード配列を増幅するためのセンスプライマーとして作用すべく設計されたオリゴヌクレオチド。
配列番号１４：ヒトＤＬＡＤ ｃＤＮＡの３’末端を増幅するためのセンスプライマーとして作用すべく設計されたオリゴヌクレオチド。
配列番号１５：ヒトＤＬＡＤ ｃＤＮＡの５’末端を増幅するためのアンチセンスプライマーとして作用すべく設計されたオリゴヌクレオチド。
本出願は日本で出願された平成１１年特許願第２３０８７０号を基礎としており、その内容は本明細書にすべて包含されるものである。
また、本明細書において引用された特許および特許出願を含む文献は、引用したことによってその内容のすべてが開示されたと同程度に本明細書中に組み込まれるものである。
【配列表】

【図面の簡単な説明】
第１図は、ＤＬＡＤ、ＤＮａｓｅＩＩシグナル−ＤＬＡＤキメラ蛋白質およびＤＮａｓｅＩＩを発現すべく操作されたＨｅＬａ Ｓ３細胞における細胞内および細胞外（培地）の各蛋白質の存在比（全体に対する％）を示す図である。黒線が細胞内、白線が細胞外を示す。
第２図は、ＤＬＡＤの各種ＤＮａｓｅ阻害剤に対する感受性を示す図である。Ａ（○）：ＭｇＣｌ_２，（●）：ＭｇＳＯ_４；Ｂ：オウリントリカルボン酸；Ｃ：Ｇ−アクチン；Ｄ（■）：ＣｏＣｌ_２，（△）：ＮｉＣｌ_２，（●）：ＺｎＣｌ_２
第３図は、ＤＬＡＤもしくはＤＮａｓｅＩＩ発現ベクターと、ＧＦＰ（塗りつぶしたカラム）もしくはβ−ガラクトシダーゼ（白抜きのカラム）発現ベクターとを同時トランスフェクションしたＨｅＬａ Ｓ３細胞におけるＧＦＰもしくはβ−ガラクトシダーゼ活性を示す。活性はコントロールベクターとレポーター遺伝子発現ベクターとを同時トランスフェクションしたＨｅＬａ Ｓ３細胞における活性に対する割合（％）で示している。データは３つの独立した実験の平均値（カラム）±標準誤差（エラーバー）である。

Claims (24)

1. 酸性条件下で二価カチオン非依存的にＤＮＡを切断し得るエンドヌクレアーゼであって、下記性状を有することを特徴とする哺乳動物由来のデオキシリボヌクレアーゼ。
   （１）活性ｐＨ範囲：４．０〜７．６
   （２）ＤＮＡ切断様式：３’−Ｐ／５’−ＯＨ末端生成型
   （３）阻害剤感受性：(i) Ｚｎ²⁺により阻害される
   (ii) Ｇ−アクチンにより阻害されない
   （４） 至適ｐＨ：５．２
   （５） 分子量：翻訳後修飾産物として５５ｋＤａ（ＳＤＳ−ＰＡＧＥ）
   （６） 局在性：細胞質および細胞外に存在し、細胞質により多い
   （７） 組織特異性：肝臓特異的に発現する
2. 初期翻訳産物がＮ末端シグナルペプチド配列を含む請求項１のデオキシリボヌクレアーゼ。
3. 以下の（ａ）または（ｂ）のアミノ酸配列からなるデオキシリボヌクレアーゼ。
   （ａ）配列表配列番号１に示されるアミノ酸配列中アミノ酸番号１〜３３２で示されるアミノ酸配列
   （ｂ）上記（ａ）のアミノ酸配列において、１もしくは数個のアミノ酸が欠失、置換、挿入、付加もしくは修飾されたアミノ酸配列からなり、且つ成熟蛋白質がｐＨ４．０〜７．６の範囲で二価カチオン非依存的にＤＮＡを切断し得るエンドヌクレアーゼ活性を有するポリペプチドとなるアミノ酸配列
4. 初期翻訳産物がＮ末端シグナルペプチド配列を含む請求項３のデオキシリボヌクレアーゼ。
5. Ｎ末端シグナルペプチドが配列表配列番号１に示されるアミノ酸配列中アミノ酸番号−２２〜−１で示されるアミノ酸配列からなる請求項４のデオキシリボヌクレアーゼ。
6. 哺乳動物由来である請求項３〜５のいずれかのデオキシリボヌクレアーゼ。
7. マウス由来である請求項１、２または６のデオキシリボヌクレアーゼ。
8. 以下の（ａ）または（ｂ）のアミノ酸配列からなるデオキシリボヌクレアーゼ。
   （ａ）配列表配列番号３に示されるアミノ酸配列中アミノ酸番号１〜３３４で示されるアミノ酸配列
   （ｂ）上記（ａ）のアミノ酸配列において、１もしくは数個のアミノ酸が欠失、置換、挿入、付加もしくは修飾されたアミノ酸配列からなり、且つ成熟蛋白質がｐＨ４．０〜７．６の範囲で二価カチオン非依存的にＤＮＡを切断し得るエンドヌクレアーゼ活性を有するポリペプチドとなるアミノ酸配列
9. 初期翻訳産物がＮ末端シグナルペプチド配列を含む請求項８のデオキシリボヌクレアーゼ。
10. Ｎ末端シグナルペプチドが配列表配列番号３に示されるアミノ酸配列中アミノ酸番号−２７〜−１で示されるアミノ酸配列からなる請求項９のデオキシリボヌクレアーゼ。
11. 哺乳動物由来である請求項８〜１０のいずれかのデオキシリボヌクレアーゼ。
12. ヒト由来である請求項１、２または１１のデオキシリボヌクレアーゼ。
13. 請求項１〜１２のいずれかのデオキシリボヌクレアーゼをコードするＤＮＡ。
14. 以下の（ａ）または（ｂ）の塩基配列からなるＤＮＡ。
    （ａ）配列表配列番号２に示される塩基配列中塩基番号２７９〜１２７４で示される塩基配列
    （ｂ）上記（ａ）の塩基配列とストリンジェントな条件でハイブリダイズし得る塩基配列であって、且つｐＨ４．０〜７．６の範囲で二価カチオン非依存的にＤＮＡを切断し得るエンドヌクレアーゼ活性を有するデオキシリボヌクレアーゼをコードする塩基配列
15. 以下の（ａ）または（ｂ）の塩基配列からなるＤＮＡ。
    （ａ）配列表配列番号２に示される塩基配列中塩基番号２１３〜１２７４で示される塩基配列
    （ｂ）上記（ａ）の塩基配列とストリンジェントな条件でハイブリダイズし得る塩基配列であって、且つ成熟蛋白質がｐＨ４．０〜７．６の範囲で二価カチオン非依存的にＤＮＡを切断し得るエンドヌクレアーゼ活性を有するデオキシリボヌクレアーゼの、初期翻訳産物をコードする塩基配列
16. 以下の（ａ）または（ｂ）の塩基配列からなるＤＮＡ。
    （ａ）配列表配列番号４に示される塩基配列中塩基番号８２〜１０８３で示される塩基配列
    （ｂ）上記（ａ）の塩基配列とストリンジェントな条件でハイブリダイズし得る塩基配列であって、且つｐＨ４．０〜７．６の範囲で二価カチオン非依存的にＤＮＡを切断し得るエンドヌクレアーゼ活性を有するデオキシリボヌクレアーゼをコードする塩基配列
17. 以下の（ａ）または（ｂ）の塩基配列からなるＤＮＡ。
    （ａ）配列表配列番号２に示される塩基配列中塩基番号１〜１０８３で示される塩基配列
    （ｂ）上記（ａ）の塩基配列とストリンジェントな条件でハイブリダイズし得る塩基配列
    であって、且つ成熟蛋白質がｐＨ４．０〜７．６の範囲で二価カチオン非依存的にＤＮＡを切断し得るエンドヌクレアーゼ活性を有するデオキシリボヌクレアーゼの、初期翻訳産物をコードする塩基配列
18. 哺乳動物由来である請求項１３〜１７のいずれかのＤＮＡ。
19. マウス由来である請求項１４または１５のＤＮＡ。
20. ヒト由来である請求項１６または１７のＤＮＡ。
21. 請求項１３〜２０のいずれかのＤＮＡを含む組換えベクター。
22. 請求項１３〜２０のいずれかのＤＮＡおよび該ＤＮＡに機能的に連結されたプロモーターを含む発現ベクター。
23. 請求項２２の発現ベクターで宿主細胞を形質転換して得られる形質転換体。
24. 請求項２３の形質転換体を培地中で培養し、得られる培養物から請求項１〜１２のいずれかのデオキシリボヌクレアーゼを採取することを特徴とするデオキシリボヌクレアーゼの製造方法。

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