JP2003009889A - インターロイキン−１β転換酵素様アポトーシスプロテアーゼ−３および４ - Google Patents

Abstract

(57)【要約】 （修正有） 【課題】 新規の成熟ポリペプチド、ならびにこれらの
生物学的に活性なおよび診断的または治療的に有用なフ
ラグメント、アナログ、および誘導体を提供する。 【解決手段】 単離されたポリヌクレオチドを提供し、
このポリヌクレオチドは、以下からなる群より選択され
るメンバーを含有する：（ａ）特定の配列で示されるア
ミノ酸１〜アミノ酸３４１を含有するポリペプチドをコ
ードするポリヌクレオチド；（ｂ）特定の配列で示され
るアミノ酸１〜アミノ酸２７７を含有するポリペプチド
をコードするポリヌクレオチド；（ｃ）（ａ）または
（ｂ）のポリヌクレオチドにハイブリダイズし得る、お
よび少なくとも９５％の同一性がある、ポリヌクレオチ
ド；および（ｄ）（ａ）、（ｂ）、または（ｃ）のポリ
ヌクレオチドのポリヌクレオチドフラグメント。

Description

【発明の詳細な説明】 【０００１】 【発明の属する技術分野】本発明は、新たに同定したポ
リヌクレオチド、このようなポリヌクレオチドによりコ
ードされるポリペプチド、このようなポリヌクレオチド
およびポリペプチドの使用、ならびにこのようなポリヌ
クレオチドおよびポリペプチドの生成に関する。より特
定すると、本発明のポリペプチドは、インターロイキン
−１β転換酵素様アポトーシスプロテアーゼ−３および
インターロイキン−１β転換酵素様アポトーシスプロテ
アーゼ−４であり、本明細書中以後、しばしば集合的に
「ＩＣＥ−ＬＡＰ−３および４」と呼ばれる。本発明は
また、このようなポリペプチドの作用を阻害することに
関する。 【０００２】インターロイキン−１β転換酵素（ＩＣ
Ｅ）は、ｐｒｏ−ＩＬ−１βを、成熟かつ活性型のＩＬ
−１βへ切断することに関与し、そしてまた生物体が望
まない細胞を除去するプロセスであるプログラムされた
細胞死（またはアポトーシス）に関与することが最近発
見された。本発明は、構造的にＩＣＥと関係のあるＩＣ
Ｅ−ＬＡＰ−３および４に関する。 【０００３】 【従来の技術】線虫ｃａｅｎｏｒｈａｂｄｉｔｉｓ ｅ
ｌｅｇａｎｓ において、プログラムされた細胞死の遺
伝的経路が確認された（Ｅｌｌｉｓ、Ｒ．Ｅ．ら、Ａｎ
ｎｕ．Ｒｅｖ．Ｃｅｌｌ Ｂｉｏｌ．、７：６６３−６
９８（１９９１））。２個の遺伝子（ｃｅｄ−３および
ｃｅｄ−４）は、Ｃ．ｅｌｅｇａｎｓにおいてプログラ
ムされた細胞死を経る細胞にとって不可欠なものである
（Ｅｌｌｉｓ、Ｈ．Ｍ．、およびＨｏｒｖｉｔｚ，Ｈ．
Ｒ．、Ｃｅｌｌ、４４：８１７−８２９（１９８
６））。これらの２個の遺伝子の機能を除去する劣性変
異体は、Ｃ．ｅｌｅｇａｎｓの発生の間、正常なプログ
ラムされた細胞死を妨げる。ｃｅｄ−３タンパク質に対
する公知の脊椎動物の対応物は、ＩＣＥである。ｃｅｄ
−３とＩＣＥとの間の全体にわたるアミノ酸の同一性は
２８％であり、１１５個のアミノ酸の領域（ｃｅｄ−３
の残基２４６−３６０およびＩＣＥの残基１６４−２７
８）で最も高い同一性（４３％）を示す。この領域は、
保存されたペンタペプチドＱＡＣＲＧ（ｃｅｄ−３の残
基３５６−３６０）を含み、このペプチドはＩＣＥ機能
にとって不可欠であると知られているシステインを含
む。本発明のＩＣＥ−ＬＡＰ−１および２ポリペプチド
はまた、同じ保存されたペンタペプチドおよびＩＣＥ機
能にとって不可欠なシステイン残基を有する。 【０００４】ｃｅｄ−３とＩＣＥとの間の類似性は、ｃ
ｅｄ−３がシステインプロテアーゼとして機能し得るこ
とだけでなく、ＩＣＥが脊椎動物のプログラムされた細
胞死の遺伝子として作用し得ることも示唆する。ｃｅｄ
−３および脊椎動物の対応物（ＩＣＥ）は、胚発生の
間、プログラムされた細胞死を制御する（Ｇａｇｌｉａ
ｒｎｉｎｉ、Ｖ．ら、Ｓｃｉｅｎｃｅ、２６３：８２
６：８２８（１９９４））。 【０００５】ＩＣＥ ｍＲＮＡは種々の組織で検出さ
れ、そのような組織としては、末梢血単球、末梢血リン
パ球、末梢血好中球、休止または活性化された末梢血Ｔ
リンパ球、胎盤、Ｂリンパ芽球株ＣＢ２３、および単球
白血病細胞株ＴＨＰ−１細胞（Ｃｅｒｒｅｔｔｉ、Ｄ．
Ｐ．、ら、Ｓｃｉｅｎｃｅ、２５６：９７−１００（１
９９２））が挙げられる。このことは、ＩＣＥがｐｒｏ
−ＩＬ−１βに加えてさらなる基質を有し得ることを示
唆する。ＩＣＥが作用し、細胞死を起こす基質は、現在
未知である。一つの可能性は、それが、Ｃ．ｅｌｅｇａ
ｎｓの細胞死遺伝子ｃｅｄ−４の脊椎動物ホモログであ
り得ることである。あるいは、ＩＣＥは、細胞生存に不
可欠なタンパク質をタンパク質分解的に切断することに
より、直接的に細胞死を起こし得る。 【０００６】哺乳動物遺伝子ｂｃｌ−２により、細胞自
己不活化からリンパ球と呼ばれる免疫細胞を保護するこ
とが発見された。また、ｃｒｍＡ（牛痘ウイルス遺伝子
産生物）は、ＩＣＥのタンパク質分割活性を阻害する。 【０００７】 【発明が解決しようとする課題】本発明の目的は、新規
の成熟ポリペプチド、ならびにこれらの生物学的に活性
なおよび診断的または治療的に有用なフラグメント、ア
ナログ、および誘導体を提供することである。 【０００８】 【課題を解決するための手段】本発明は、単離されたポ
リヌクレオチドを提供し、このポリヌクレオチドは、以
下からなる群より選択されるメンバーを含有する： （ａ）配列番号２に記載のアミノ酸１〜アミノ酸３４１
を含有するポリペプチドをコードするポリヌクレオチ
ド； （ｂ）配列番号４に記載のアミノ酸１〜アミノ酸２７７
を含有するポリペプチドをコードするポリヌクレオチ
ド； （ｃ）（ａ）または（ｂ）のポリヌクレオチドにハイブ
リダイズし得る、および少なくとも９５％の同一性があ
る、ポリヌクレオチド；および （ｄ）（ａ）、（ｂ）、または（ｃ）のポリヌクレオチ
ドのポリヌクレオチドフラグメント。 【０００９】１つの実施形態では、上記ポリヌクレオチ
ドはＤＮＡであり得る。 【００１０】１つの実施形態では、上記ポリヌクレオチ
ドはＲＮＡでであり得る。 【００１１】１つの実施形態では、上記ポリヌクレオチ
ドはゲノムＤＮＡであり得る。 【００１２】本発明はまた、単離されたポリヌクレオチ
ドを提供し、以下からなる群より選択されるメンバーを
含有する： （ａ）ＡＴＣＣ受託番号７５８７５に含まれるＤＮＡに
より発現されるアミノ酸配列を有する成熟ポリペプチド
をコードする、ポリヌクレオチド； （ｂ）ＡＴＣＣ受託番号７５８７３に含まれるＤＮＡに
より発現されるアミノ酸配列を有する成熟ポリペプチド
をコードする、ポリヌクレオチド； （ｃ）（ａ）のポリヌクレオチドにハイブリダイズし
得、および少なくとも９５％の同一性がある、ポリヌク
レオチド；および （ｄ）（ａ）、（ｂ）、または（ｃ）のポリヌクレオチ
ドのポリヌクレオチドフラグメント。 【００１３】本発明はまた、上記ＤＮＡを含有するベク
ターを提供する。 【００１４】本発明はさらに、上記ベクターにより遺伝
子操作される宿主細胞を提供する。 【００１５】本発明はまた、ポリペプチドを生成するプ
ロセスを提供し、上記ＤＮＡによりコードされるポリペ
プチドが、上記宿主細胞から発現される工程を包含す
る。 【００１６】本発明はまた、上記ベクターで、遺伝子操
作された細胞を含有する、ポリペプチドを発現し得る細
胞を作製するためのプロセスを提供する。 【００１７】本発明はまた、ポリペプチドを提供し、こ
のポリペプチドは、以下からなる群より選択される：
（ｉ）配列番号２の推定アミノ酸配列を有するポリペプ
チド、およびそれらのフラグメント、アナログ、および
誘導体；（ｉｉ）ＡＴＣＣ受託番号７５８７５のｃＤＮ
Ａによりコードされるポリペプチド、およびこのポリペ
プチドのフラグメント、アナログ、および誘導体；（ｉ
ｉｉ）配列番号４の推定アミノ酸配列を有するポリペプ
チド、およびそれらのフラグメント、アナログ、および
誘導体；および（ｉｖ）ＡＴＣＣ受託番号７５８７３の
ｃＤＮＡによりコードされるポリペプチド、およびこの
ポリペプチドのフラグメント、アナログ、および誘導
体。 【００１８】本発明はまた、上記ポリペプチドの活性化
を阻害する化合物を提供する。 【００１９】本発明はまた、ＩＣＥ−ＬＡＰ−３を必要
とする患者を処置するための方法を提供し、この方法
は、上記ポリペプチドの治療有効量を該患者への投与す
る工程を包含する。 【００２０】１つの実施形態では、上記ポリペプチドの
治療有効量が、上記ポリペプチドをコードし、インビボ
でこのポリペプチドを発現するＤＮＡを、上記患者に堤
供することにより投与され得る。 【００２１】本発明はまた、ＩＣＥ−ＬＡＰ−４を必要
とする患者を処置するための方法を提供し、この方法
は、上記ポリペプチドの治療有効量をこの患者に投与す
る工程を包含する。 【００２２】１つの実施形態では、上記ポリペプチドの
治療有効量が、上記ポリペプチドをコードし、インビボ
でポリペプチドを発現するＤＮＡを、上記患者に堤供す
ることにより投与され得る。 【００２３】本発明はまた、ＩＣＥ−ＬＡＰ−３ポリペ
プチドを阻害する必要を有する患者を処置するための方
法を提供し、この方法は、上記化合物の治療有効量をこ
の患者に投与する工程を包含する。 【００２４】本発明はまた、ＩＣＥ−ＬＡＰ−４ポリペ
プチドを阻害する必要を有する患者を処置するための方
法を提供し、この方法は、上記化合物の治療有効量をこ
の患者に投与する工程を包含する。 【００２５】本発明はさらに、疾患、または上記ポリペ
プチドの発現に関する疾患に対する感受性を診断するた
めのプロセスを提供し、このプロセスは、このポリペプ
チドをコードする核酸配列における変異を決定する工程
を包含する。 【００２６】本発明はまた、宿主由来のサンプルにおい
て、上記ポリペプチドの存在を分析する工程を包含する
診断プロセスを提供する。 【００２７】本発明はまた、上記ポリペプチドを阻害す
る化合物を同定するための方法を提供し、この方法は、
このポリペプチドとその天然の基質および化合物とを、
基質がこのポリペプチドにより正常に切断される条件下
で接触させる工程、および切断された基質が存在しない
ことを検出することにより、この化合物がこのポリペプ
チドを阻害するかどうかを決定する工程を包含する。 【００２８】 【発明の実施の形態】本発明の１つの局面によれば、新
規の成熟ポリペプチド、ならびにこれらの生物学的に活
性なおよび診断的または治療的に有用なフラグメント、
アナログ、および誘導体が提供される。本発明のポリペ
プチドは、ヒト起源のものである。 【００２９】本発明の別の局面によれば、本発明のポリ
ペプチドをコードする単離された核酸分子が、提供さ
れ、これは、ｍＲＮＡ、ＤＮＡ、ｃＤＮＡ、ゲノムＤＮ
Ａ、ならびにそのアナログ、および生物学的に活性なお
よび診断的または治療的に有用なフラグメントを包含す
る。 【００３０】本発明のさらなる局面によれば、本発明の
ポリペプチドをコードする核酸分子を含む原核生物およ
び／または真核生物の組換え宿主細胞を、タンパク質の
発現を促進する条件下で培養する工程、続いてタンパク
質を回収する工程を包含する組換え技術により、このよ
うなポリペプチドを生成するプロセスが提供される。 【００３１】本発明のなおさらなる局面によれば、この
ようなポリペプチド、またはこのようなポリペプチドを
コードするポリヌクレオチドを、治療目的（例えば、抗
ウイルス剤、抗腫瘍剤、ならびに胚発生および組織恒常
性（ｈｏｍｅｏｓｔａｓｉｓ）を制御することとして）
のために利用するためのプロセスが提供される。 【００３２】本発明のなおさらなる局面によれば、本発
明の核酸配列に特異的にハイブリダイズするに十分な長
さの核酸分子を含む核酸プローブもまた、提供される。 【００３３】本発明のさらなる局面によれば、このよう
なポリペプチドに対する抗体が提供される。 【００３４】本発明のさらに別の局面によれば、例え
ば、アルツハイマー病、パーキンソン病、慢性関節リウ
マチ、敗血症性ショック、および頭部傷害の処置におい
て、このようなポリペプチドの作用を阻害するために用
いられ得るこのようなポリペプチドに対するアンタゴニ
ストが提供される。 【００３５】本発明のなおさらなる局面によれば、疾患
または本発明のポリペプチドをコードする核酸配列にお
ける変異に関係する疾患に対する感受性を検出するため
の、診断アッセイが提供される。 【００３６】本発明のなおさらなる局面によれば、この
ようなポリペプチドまたはこのようなポリペプチドをコ
ードするポリヌクレオチドを、科学的な研究（例えばＤ
ＮＡ合成およびベクターＤＮＡの作製）に関するインビ
トロの目的のために利用するプロセスが、提供される。 【００３７】本発明のこれらの局面および他の局面は、
本明細書中の教示から当業者には明らかであるべきであ
る。 【００３８】本発明の局面によれば、図１および図２
（それぞれ、配列番号２および４）の推定アミノ酸配列
を有する成熟ポリペプチドをコードするか、またはＡＴ
ＣＣ受託番号７５８７５および７５８７３として受託さ
れたクローンのｃＤＮＡによりコードされる成熟ポリペ
プチドをコードする単離された核酸（ポリヌクレオチ
ド）が提供される。ＡＴＣＣ受託番号７５８７５は、Ｉ
ＣＥ−ＬＡＰ−３をコードするｃＤＮＡを含み、および
ＡＴＣＣ受託番号７５８７３は、ＩＣＥ−ＬＡＰ−４を
コードするｃＤＮＡを含む。受託は１９９４年８月２５
日に行われた。 【００３９】ＩＣＥ−ＬＡＰ−３をコードするポリヌク
レオチドは、ヒト前立腺、ヒト子宮内膜腫瘍、ヒト膵臓
腫瘍、ヒト副腎腫瘍、およびヒト扁桃腺から検出され得
る。ＩＣＥ−ＬＡＰ−３をコードする完全長は、ヒト子
宮内膜腫瘍由来のｃＤＮＡライブラリーにおいて発見さ
れた。このことは、インターロイキン−１β転換酵素フ
ァミリーに、構造的に関係する。この完全長は、約３４
１アミノ酸残基のタンパク質をコードするオープンリー
ディングフレームを含む。このタンパク質は、ヒトイン
ターロイキン−１β転換酵素のホモログであるＣ． ｅ
ｌｅｇａｎｓ細胞死遺伝子に、アミノ酸配列全体にわた
って６８％の類似性および４３％の同一性で最も高い程
度の相同性を示す。ペンタペプチドＱＡＣＲＧは、保存
され、アミノ酸２５９−２６３位に位置することが示さ
れる。 【００４０】ＩＣＥ−ＬＡＰ−４をコードするポリヌク
レオチドが、ヒト扁桃腺由来のｃＤＮＡライブラリーに
おいて発見された。このことは、ＩＣＥファミリーに構
造的に関係する。このポリヌクレオチドは、約２７７ア
ミノ酸残基のタンパク質をコードするオープンリーディ
ングフレームを１つ含む。このタンパク質は、Ｃ．ｅｌ
ｅｇａｎｓの細胞死遺伝子ｃｅｄ−３に、２７７アミノ
酸残基長にわたって２９％の同一性および４６％の類似
性で最も高い程度の相同性を示す。ペンタペプチドＱＡ
ＣＲＧは保存され、アミノ１６１−１６５位に位置する
こともまた重要である。 【００４１】本発明のポリヌクレオチドは、ＲＮＡの形
態、またはＤＮＡの形態であり得る。このＤＮＡの形態
は、ｃＤＮＡ、ゲノムＤＮＡ、および合成ＤＮＡを包含
する。ＤＮＡは二本鎖または一本鎖であり得る。そし
て、一本鎖の場合、コード鎖または非コード（アンチセ
ンス）鎖であり得る。成熟ポリペプチドをコードするコ
ード配列は、図１および図２に示すコード配列（配列番
号１および３）と同一であり得るか、または受託したク
ローンのコード配列と同一であり得る。あるいは、コー
ド配列が、遺伝コードの重複または縮重の結果として、
同じ成熟ポリペプチドをコードする異なるコード配列、
ならびに図１および図２のＤＮＡ（配列番号１または
３）または受託したｃＤＮＡのような、その誘導体であ
り得る。 【００４２】図１および図２の成熟ポリペプチド（配列
番号２または４）または受託したｃＤＮＡによりコード
される成熟ポリペプチドをコードするポリヌクレオチド
は以下を包含し得る：成熟ポリペプチドのコード配列の
み；成熟ポリペプチドのコード配列および付加的なコー
ド配列；成熟ポリぺプチドのコード配列（および必要に
応じて付加的なコード配列）および非コード配列（例え
ば、イントロンまたは成熟ポリペプチドのコード配列の
５’および／または３’の非コード配列）。 【００４３】従って、用語「ポリペプチドをコードする
ポリヌクレオチド」は、ポリペプチドのコード配列のみ
を含むポリヌクレオチドならびにさらなるコード配列お
よび／または非コード配列を含むポリヌクレオチドを包
含する。 【００４４】本発明はさらに、図１および図２の推定ア
ミノ酸配列（配列番号２および４）を有するポリペプチ
ドまたは受託したクローンのｃＤＮＡによりコードされ
るポリペプチドの、フラグメント、アナログ、および誘
導体をコードする本明細書中上記のポリヌクレオチドの
変異体に関する。ポリヌクレオチドの変異体は、ポリヌ
クレオチドの天然には存在しない対立遺伝子変異体また
はポリヌクレオチドの天然には存在しない変異体であり
得る。 【００４５】従って、本発明は、図１および図２に示す
もの（配列番号２および４）と同じ成熟ポリペプチドま
たはその受託したクローンのｃＤＮＡによりコードされ
る同じ成熟ポリペプチドをコードするポリヌクレオチ
ド、ならびにこのようなポリヌクレオチドの変異体を包
含する。これらの変異体は、図１および図２のポリペプ
チド（配列番号２または４）または受託したクローンの
ｃＤＮＡによりコードされるポリペプチドのフラグメン
ト、誘導体、またはアナログをコードする。このような
ヌクレオチド変異体は、欠失変異体、置換変異体、およ
び付加または挿入変異体を包含する。 【００４６】本明細書中上記で示したように、ポリヌク
レオチドは、図１および図２に示すコード配列（配列番
号１および３）または受託したクローンのコード配列の
天然に存在する対立遺伝子変異体であるコード配列を有
し得る。当該分野で公知であるように、対立遺伝子変異
体は、ヌクレオチドの置換、欠失、または付加を有し得
るポリヌクレオチド配列の別の形態であり、これはコー
ドされるポリペプチドの機能を実質的には変化させな
い。ポリヌクレオチドはまた、成熟タンパク質およびさ
らなる５’アミノ酸残基であるプロタンパク質をコード
し得る。 【００４７】本発明のポリヌクレオチドはまた、本発明
のポリペプチドの精製を可能にする配列にインフレーム
で融合されたコード配列を有し得る。マーカー配列は、
細菌宿主の場合にマーカーに融合された成熟ポリペプチ
ドの精製に備えるｐＱＥ−９ベクターにより供給される
ヘキサヒスチジンタグであり得る。または、例えば、マ
ーカー配列は、哺乳動物宿主（例えば、ＣＯＳ−７細
胞）が使用される場合、ヘマグルチニン（ＨＡ）タグで
あり得る。ＨＡタグは、インフルエンザヘマグルチニン
タンパク質由来のエピトープに対応する（Ｗｉｌｓｏ
ｎ， Ｉ．ら、Ｃｅｌｌ、３７：７６７ （１９８
４））。 【００４８】用語「遺伝子」は、ポリペプチド鎖の産生
に関与するＤＮＡセグメントを意味する；遺伝子は、コ
ード領域の前および後ろの領域（リーダーおよびトレイ
ラー）、ならびに個々のコードセグメント（エキソン）
間の介在配列（イントロン）を含む。 【００４９】本発明の完全長の遺伝子のフラグメント
は、ハイブリダイゼーションプローブとして、完全長の
遺伝子を単離するため、およびその遺伝子に高い配列類
似性を有するかまたは類似の生物学的活性を有する他の
遺伝子を単離するためｃＤＮＡライブラリーに対して用
いられ得る。このタイプのプローブは、好ましくは少な
くとも３０塩基を有し、および例えば、５０塩基または
それ以上を含み得る。このプローブはまた、完全長の転
写産物に対応するｃＤＮＡクローン、およびゲノムＤＮ
Ａクローン、または制御領域、プロモーター領域、エキ
ソン、およびイントロンを含む完全な遺伝子を含むクロ
ーンを同定するために用いられ得る。スクリーニングの
一つの例は、公知のＤＮＡ配列を用いてオリゴヌクレオ
チドプローブを合成することにより、その遺伝子のコー
ド領域を単離する工程を包含する。本発明の遺伝子の配
列に完全に補助的な配列を有する、標識オリゴヌクレオ
チドは、ヒトｃＤＮＡ、またはゲノムＤＮＡ、あるいは
ｍＲＮＡのライブラリーをスクリーニングして、プロー
ブがハイブリダイズするライブラリーのメンバーを決定
するために用いられる。 【００５０】本発明はさらに、配列間に少なくとも７０
％、好ましくは少なくとも９０％、およびさらに好まし
くは少なくとも９５％の同一性が存在する場合、本明細
書中上記の配列にハイブリダイズするポリヌクレオチド
に関する。本発明は特に、本明細書中上記のポリヌクレ
オチドにストリンジェントな条件下でハイブリダイズす
るポリヌクレオチドに関する。本明細書中で用いられる
用語「ストリンジェントな条件」は、ハイブリダイゼー
ションが、配列間に少なくとも９５％および好ましくは
少なくとも９７％の同一性が存在する場合のみに生じる
ことを意味する。好ましい実施態様において本明細書中
上記のポリヌクレオチドにハイブリダイズするポリヌク
レオチドは、図１および図２（配列番号１および３）の
ｃＤＮＡまたは受託したｃＤＮＡによりコードされる成
熟ポリペプチドと実質的に同じ生物学的機能または生物
学的活性のいずれかを保持するポリペプチドをコードす
る。 【００５１】あるいは、ポリヌクレオチドは、少なくと
も２０塩基、好ましくは３０塩基、およびさらに好まし
くは少なくとも５０塩基を有し得る。これは、本発明の
ポリヌクレオチドおよび本明細書中上記のように本発明
のポリヌクレオチドに同一性を有するポリヌクレオチ
ド、および活性を保持し得るかまたは保持しなくてもよ
いポリヌクレオチドにハイブリダイズする。例えば、こ
のようなポリヌクレオチドは、配列番号１および３のポ
リヌクレオチドに対するプローブとして用いられ得、例
えば、ポリヌクレオチドの回収のために、または診断プ
ローブとして、またはＰＣＲプライマーとして用いられ
得る。 【００５２】従って、本発明は、配列番号２および４の
ポリペプチド、および、そのフラグメント（このフラグ
メントは少なくとも３０塩基、および好ましくは５０塩
基を有する）に対して、ならびにこのようなオリゴヌク
レオチドにコードされるポリペプチドに対して、少なく
とも７０％、好ましくは少なくとも９０％、さらに好ま
しくは少なくとも９５％の同一性を有するポリヌクレオ
チドに関する。 【００５３】本明細書中でいう受託物は、特許手続きの
目的のための微生物の受託の国際的承認に関するブダペ
スト条約の条項下に維持される。これらの受託物は、当
業者に便宜上のみ提供され、そして米国特許法第１１２
条の下で受託が必要とされることを容認するものではな
い。受託物に含まれるポリヌクレオチドの配列、ならび
にそれによりコードされるポリペプチドのアミノ酸配列
は、本明細書中に参考として援用されており、そして本
明細書中の配列の記載とのいかなる矛盾の場合も制御さ
れている。受託物を製造し、使用し、または販売するた
めには実施許諾が必要とされ得、そしてこのような実施
許諾はこれによって与えられるわけではない。 【００５４】本発明はさらに、図１および図２の推定ア
ミノ酸配列（配列番号２および４）を有する、または受
託したｃＤＮＡによりコードされるアミノ酸配列を有す
るＩＣＥ−ＬＡＰ−３およびＩＣＥ−ＬＡＰ−４ポリペ
プチド、ならびにこのようなポリペプチドのフラグメン
ト、アナログ、および誘導体に関する。 【００５５】用語「フラグメント」、「誘導体」、およ
び「アナログ」は、図１および図２のポリペプチド（配
列番号２および４）、または受託したｃＤＮＡによりコ
ードされるポリペプチドをいう場合は、このようなポリ
ペプチドと本質的に同じ生物学的機能または生物学的活
性を保持するポリペプチドを意味する。そして、この場
合、誘導体は増強したまた低減した生物学的機能を有す
るポリペプチドを包含する。 【００５６】本発明のポリペプチドは、組換えポリペプ
チド、天然のポリペプチド、または合成ポリペプチドで
あり得、好ましくは組換えポリペプチドであり得る。 【００５７】図１および図２のポリペプチド（配列番号
２および４）、または受託したｃＤＮＡによりコードさ
れるポリペプチドのフラグメント、誘導体、またはアナ
ログは、（ｉ）その中で１以上のアミノ酸残基が保存ま
たは非保存アミノ酸残基（好ましくは保存アミノ酸残
基）で置換され、そしてこのような置換されるアミノ酸
残基が、遺伝コードによりコードされるアミノ酸残基で
あり得るかまたはそうでなくてもよいフラグメント、誘
導体、またはアナログ、または（ｉｉ）その中で１以上
のアミノ酸残基が置換基を含むフラグメント、誘導体、
またはアナログ、または（ｉｉｉ）その中で成熟ポリペ
プチドがポリペプチドの半減期を増加させる化合物（例
えば、ポリエチレングリコール）のような別の化合物に
融合されているフラグメント、誘導体、またはアナロ
グ、または（ｉｖ）その中の１つは、成熟ポリペプチド
の精製に用いるために、さらなるアミノ酸が成熟ポリペ
プチドに融合されているフラグメント、誘導体、または
アナログである。このようなフラグメント、誘導体、お
よびアナログは、本明細書中の教示から、当業者の範囲
内にあると考えられる。 【００５８】本発明のポリペプチドおよびポリヌクレオ
チドは、好ましくは単離された形態で提供され、そして
好ましくは均質に精製される。用語「単離された」は、
物質がその本来の環境（例えば、天然に存在する場合
は、天然の環境）から取り出されていることを意味す
る。例えば、生きている動物に存在する天然に存在する
ポリヌクレオチドまたはポリペプチドは単離されていな
いが、天然において共存する物質の幾らかまたは全部か
ら分離された同一のポリヌクレオチドまたはポリペプチ
ドは、単離されている。このようなポリヌクレオチドは
ベクターの一部であり得、および／またはこのようなポ
リヌクレオチドまたはポリペプチドは、組成物の一部で
あり得、そしてさらにこのようなベクターまたは組成物
がその天然の環境の一部ではないため単離されている。 【００５９】本発明のポリペプチドは、以下のポリペプ
チドを含む；配列番号２および４（とくに成熟ポリペプ
チド）；および配列番号２および４のポリペプチドに少
なくとも７０％の類似性（好ましくは少なくとも７０％
の同一性）を有するポリペプチド：および、さらに好ま
しくは配列番号２および４のポリペプチドに少なくとも
９０％の類似性（さらに好ましくは少なくとも９０％の
同一性）を有するポリペプチド：および、なおさらに好
ましくは、配列番号２および４のポリペプチドに少なく
とも９５％の類似性（なおさらに好ましくは少なくとも
９５％の同一性）を有するポリペプチド。そしてさら
に、本発明のポリペプチドは少なくとも３０アミノ酸、
さらに好ましくは少なくとも５０アミノ酸を一般的に含
むポリペプチドのこのような一部を有するこのようなポ
リペプチドを包含する。 【００６０】当該分野において公知であるように、２つ
のポリペプチドの間の「類似性」は、アミノ酸配列の比
較により決定され、その一方のポリペプチドで保存され
たアミノ酸配列は、第２のポリペプチド配列を代用す
る。 【００６１】本発明の、ポリペプチドのフラグメントま
たはポリペプチドの部分は、ペプチド合成により対応の
完全長のポリペプチドを生成するために用いられ得る；
従って、フラグメントは、完全長のポリペプチドを生成
するための中間生産物として用いられ得る。本発明の、
ポリヌクレオチドのフラグメントまたはポリヌクレオチ
ドの部分は、本発明の完全長のポリヌクレオチドを合成
するために用いられ得る。 【００６２】本発明はまた、本発明のポリヌクレオチド
を含むベクター、本発明のベクターを用いて遺伝子操作
される宿主細胞、および組換え技術による本発明のポリ
ペプチドの生成に関する。 【００６３】宿主細胞は、本発明のベクター（これは例
えば、クローニングベクターまたは発現ベクターであり
得る）を用いて遺伝子操作（形質導入または形質転換ま
たはトランスフェクト）される。ベクターは、例えば、
プラスミド、ウイルス粒子、ファージなどの形態であり
得る。操作された宿主細胞は、プロモーターを活性化
し、形質転換体を選択し、またはＩＣＥ−ＬＡＰ−３お
よびＩＣＥ−ＬＡＰ−４遺伝子を増幅するために適切に
改変された従来の栄養培地中で培養され得る。培養条件
（例えば、温度、ｐＨなど）は、発現のために選択され
る宿主細胞で以前に使用された条件であり、そして当業
者には明らかである。 【００６４】本発明のポリヌクレオチドは、組換え技術
によりポリペプチドを生成するために用いられ得る。従
って、例えば、ポリヌクレオチドは、ポリペプチドを発
現するための種々の発現ベクターのいずれか１つ内に含
まれ得る。このようなベクターは、染色体、非染色体、
および合成ＤＮＡ配列を包含し、例えば、ＳＶ４０の誘
導体；細菌性プラスミド；ファージＤＮＡ；バキュロウ
イルス；酵母プラスミド；プラスミドおよびファージＤ
ＮＡの組み合わせに由来するベクター、ワクシニア、ア
デノウイルス、鶏痘ウイルス、および仮性狂犬病のよう
なウイルスＤＮＡである。しかし、宿主において複製可
能で、そして存続可能である限り、任意の他のベクター
が使用され得る。 【００６５】適切なＤＮＡ配列は、種々の手順によりベ
クターに挿入され得る。一般に、ＤＮＡ配列は当該分野
で公知の手順により適切な制限エンドヌクレアーゼ部位
に挿入される。このような手順および他の手順は、当業
者に公知の範囲内であると考えられる。 【００６６】発現ベクター中のＤＮＡ配列は、適切な発
現制御配列（プロモーター）に作動可能に連結され、ｍ
ＲＮＡの合成を指示する。このようなプロモーターの代
表的な例としては、以下が挙げられ得る：レトロウイル
ス（例えば、ＲＳＶ、ＨＩＶ、ＨＴＬＶＩ、ＣＭＶ、ま
たはＳＶ４０プロモーター）由来のＬＴＲ、Ｅ．ｃｏｌ
ｉ ｌａｃまたはｔｒｐ、λファージＰ_Ｌプロモータ
ー、および原核細胞または真核細胞あるいはそれらのウ
イルス内で遺伝子の発現を制御することが公知である他
のプロモーター。しかし、細胞シグナル（例えばヒト−
β−アクチンプロモーター）もまた、用いられ得る。発
現ベクターはまた、翻訳開始のためのリボソーム結合部
位および転写ターミネーターを含有し得る。ベクターは
また、遺伝子のコピー数を増幅するための適切な配列を
含み得る。 【００６７】さらに、発現ベクターは、好ましくは、形
質転換された宿主細胞の選択のための表現型特性（例え
ば、真核細胞培養物についてはジヒドロ葉酸レダクター
ゼまたはネオマイシン耐性、あるいはＥ． ｃｏｌｉに
おけるテトラサイクリン耐性またはアンピシリン耐性）
を提供する１つ以上の選択マーカー遺伝子を含有する。 【００６８】本明細書中上記のような適切なＤＮＡ配列
ならびに適切なプロモーター配列または制御配列を含有
するベクターは、適切な宿主を形質転換して宿主にタン
パク質を発現させるために用いられ得る。 【００６９】適切な宿主の代表的な例としては、以下が
挙げられ得る：細菌細胞（例えば、Ｅ． ｃｏｌｉ、Ｂ
ａｃｉｌｌｕｓ ｓｕｂｔｉｌｉｓ、Ｓｔｒｅｐｔｏｍ
ｙｃｅｓ、Ｓａｌｍｏｎｅｌｌａ ｔｙｐｈｉｍｕｒｉ
ｕｍ）；真菌細胞（例えば酵母）；昆虫細胞（例えば、
ＤｒｏｓｏｐｈｉｌａおよびＳｐｏｄｏｐｔｅｒａＳｆ
９）；アデノウイルス；動物細胞（例えば、ＣＨＯ、Ｃ
ＯＳ、ＨＥＫ ２９３、またはＢｏｗｅｓ黒色腫）；植
物細胞など。適切な宿主の選択は、本明細書中の教示か
ら当業者の範囲内であると考えられる。 【００７０】さらに詳細には、本発明はまた、上記で広
範に記載した１つ以上の配列を含む組換え構築物を包含
する。構築物は、ベクター（例えば、プラスミドベクタ
ーまたはウイルスベクター）を包含し、このベクターの
中には本発明の配列が正方向または逆方向に挿入されて
いる。この実施態様の好ましい局面によれば、構築物は
さらに、配列に作動可能に連結された調節配列（例え
ば、プロモーターを包含する）を含む。多数の適切なベ
クターおよびプロモーターが当業者には公知であり、そ
して市販されている。以下のベクターが例として提供さ
れる。細菌性：ｐＱＥ７０、ｐＱＥ６０、ｐＱＥ−９
（Ｑｉａｇｅｎ）、ｐｂｓ、ｐＤ１０、ｐｈａｇｅｓｃ
ｒｉｐｔ、ｐｓｉＸ１７４、ｐｂｌｕｅｓｃｒｉｐｔ
ＳＫ、ｐｂｓｋｓ、ｐＮＨ８Ａ、ｐＮＨ１６ａ、ｐＮＨ
１８Ａ、ｐＮＨ４６Ａ （Ｓｔｒａｔａｇｅｎｅ）；ｐ
ｔｒｃ９９ａ、ｐＫＫ２２３−３、ｐＫＫ２３３−３、
ｐＤＲ５４０、ｐＲＩＴ５ （Ｐｈａｒｍａｃｉａ）。
真核性：ｐＷＬＮＥＯ、ｐＳＶ２ＣＡＴ、ｐＯＧ４４、
ｐＸＴ１、ｐＳＧ （Ｓｔｒａｔａｇｅｎｅ） ｐＳＶ
Ｋ３、ｐＢＰＶ、ｐＭＳＧ、ｐＳＶＬ （Ｐｈａｒｍａ
ｃｉａ）。しかし、宿主において複製可能で、そして存
続可能である限り、任意の他のプラスミドまたはベクタ
ーも使用され得る。 【００７１】プロモーター領域は、ＣＡＴ（クロラムフ
ェニコールトランスフェラーゼ）ベクターまたは選択マ
ーカーを有する他のベクターを使用して、任意の所望の
遺伝子から選択され得る。２つの適切なベクターは、ｐ
ＫＫ２３２−８およびｐＣＭ７である。特によく知られ
た細菌プロモーターは、ｌａｃＩ、ｌａｃＺ、Ｔ３、Ｔ
７、ｇｐｔ、λＰ_Ｒ、Ｐ_Ｌ、およびｔｒｐを包含する。
真核プロモーターは、ＣＭＶ即時初期型、ＨＳＶチミジ
ンキナーゼ、初期ＳＶ４０および後期ＳＶ４０、レトロ
ウイルス由来のＬＴＲ、およびマウスメタロチオネイン
−Ｉを包含する。適切なベクターおよびプロモーターの
選択は、十分に当業者のレベルの範囲内にある。 【００７２】さらなる実施態様では、本発明は上記の構
築物を含有する宿主細胞に関する。宿主細胞は、高等真
核細胞（例えば、哺乳動物細胞）または下等真核細胞
（例えば、酵母細胞）であり得るか、または宿主細胞は
原核細胞（例えば、細菌細胞）であり得る。構築物の宿
主細胞への導入は、リン酸カルシウムトランスフェクシ
ョン、ＤＥＡＥ−デキストラン媒介トランスフェクショ
ン、リポフェクション、またはエレクトロポレーション
により達成され得る（Ｄａｖｉｓ， Ｌ．、Ｄｉｂｎｅ
ｒ， Ｍ．、Ｂａｔｔｅｙ， Ｉ．、Ｂａｓｉｃ Ｍｅ
ｔｈｏｄｓ ｉｎＭｏｌｅｃｕｌａｒ Ｂｉｏｌｏｇ
ｙ、（１９８６））。 【００７３】宿主細胞中の構築物は、組換え配列により
コードされる遺伝子産物を産生するために、従来の方法
で使用され得る。あるいは、本発明のポリペプチドは、
従来のペプチド合成機により合成的に生成され得る。 【００７４】成熟タンパク質は、哺乳動物細胞、酵母、
細菌、または他の細胞中で、適切なプロモーターの制御
下で発現され得る。無細胞翻訳系もまた、このようなタ
ンパク質を生成するために、本発明のＤＮＡ構築物に由
来するＲＮＡを使用して用いられ得る。原核宿主および
真核宿主で使用される適切なクローニングベクターおよ
び発現ベクターは、Ｓａｍｂｒｏｏｋら、Ｍｏｌｅｃｕ
ｌａｒ Ｃｌｏｎｉｎｇ： Ａ Ｌａｂｏｒａｔｏｒｙ
Ｍａｎｕａｌ， 第２版、Ｃｏｌｄ Ｓｐｒｉｎｇ
Ｈａｒｂｏｒ、Ｎ．Ｙ．、（１９８９）（この開示は、
本明細書中に参考として援用されている）に記載されて
いる。 【００７５】本発明のポリペプチドをコードするＤＮＡ
の高等真核生物による転写は、ベクターにエンハンサー
配列を挿入することにより増大される。エンハンサーは
ＤＮＡのシス作用エレメントであり、通常は約１０〜約
３００ｂｐであり、これはプロモーターに作用してその
転写を増大させる。例としては、複製起点ｂｐ１００〜
２７０の後期側のＳＶ４０エンハンサー、サイトメガロ
ウイルスの早期プロモーターエンハンサー、複製起点の
後期側のポリオーマエンハンサー、およびアデノウイル
スエンハンサーを包含する。 【００７６】一般に、組換え発現ベクターは、複製起点
および宿主細胞の形質転換を可能とする選択マーカー
（例えば、Ｅ． ｃｏｌｉのアンピシリン耐性遺伝子お
よびＳ． ｃｅｒｅｖｉｓｉａｅのＴＲＰ１遺伝子）、
および下流の構造配列の転写を指示する高発現遺伝子に
由来するプロモーターを包含する。このようなプロモー
ターは、特に解糖酵素（例えば、３−ホスホグリセリン
酸キナーゼ（ＰＧＫ））、α因子、酸性ホスファター
ゼ、または熱ショックタンパク質などをコードするオペ
ロンに由来し得る。異種構造配列は、翻訳開始配列およ
び翻訳終止配列、および好ましくは翻訳されたタンパク
質を細胞周辺腔または細胞外培地へ分泌することを指向
し得るリーダー配列と適切な相内で組立てられる。必要
に応じて、異種配列は、所望の特徴（例えば、発現され
た組換え産物の安定化または簡略化された精製）を与え
るＮ末端同定ペプチドを含む融合タンパク質をコードし
得る。 【００７７】細菌の使用に有用な発現ベクターは、機能
的なプロモーターと作動可能なリーディングフレーム
で、所望のタンパク質をコードする構造ＤＮＡ配列を適
切な翻訳開始シグナルおよび翻訳終止シグナルと共に挿
入することにより構築される。ベクターは、１つ以上の
表現型選択マーカー、ならびにベクターの維持を保証す
るため、および所望により宿主内での増幅を提供するた
めに複製起点を含む。形質転換のために適切な原核宿主
は、Ｅ． ｃｏｌｉ、Ｂａｃｉｌｌｕｓ ｓｕｂｔｉｌ
ｉｓ、Ｓａｌｍｏｎｅｌｌａ ｔｙｐｈｉｍｕｒｉｕ
ｍ、ならびにＰｓｅｕｄｏｍｏｎａｓ属、Ｓｔｒｅｐｔ
ｏｍｙｃｅｓ属、およびＳｔａｐｈｙｌｏｃｏｃｃｕｓ
属の種々の種を包含するが、他の種もまた選択対象とし
て用いられ得る。 【００７８】代表的な、しかし限定しない例として、細
菌の使用に有用な発現ベクターは、周知のクローニング
ベクターｐＢＲ３２２（ＡＴＣＣ ３７０１７）の遺伝
エレメントを含む市販のプラスミドに由来する選択マー
カーおよび細菌の複製起点を含み得る。このような市販
のベクターは、例えば、ｐＫＫ２２３−３（Ｐｈａｒｍ
ａｃｉａ Ｆｉｎｅ Ｃｈｅｍｉｃａｌｓ、Ｕｐｐｓａ
ｌａ、Ｓｗｅｄｅｎ）およびＧＥＭ１（Ｐｒｏｍｅｇａ
Ｂｉｏｔｅｃ、Ｍａｄｉｓｏｎ、ＷＩ、ＵＳＡ）を包
含する。これらのｐＢＲ３２２「骨格」部分は、適切な
プロモーターおよび発現されるべき構造配列と組み合わ
される。 【００７９】適切な宿主系統の形質転換および適切な細
胞密度への宿主系統の増殖に続いて、選択されたプロモ
ーターは、適切な手段（例えば、温度シフトまたは化学
的誘導）により誘導され、そして細胞はさらなる期間培
養される。 【００８０】細胞は、代表的には遠心分離により収集さ
れ、物理的手段または化学的手段により破砕され、そし
て得られた粗抽出物はさらなる精製のために保持され
る。 【００８１】タンパク質の発現において用いられる微生
物細胞は、凍結融解サイクル、超音波処理、機械的破
砕、または細胞溶解剤の使用を包含する任意の簡便な方
法により破砕され得、このような方法は、当業者に周知
である。 【００８２】種々の哺乳動物細胞の培養系もまた、組換
えタンパク質を発現するために用いられ得る。哺乳動物
発現系の例は、Ｇｌｕｚｍａｎ、Ｃｅｌｌ、２３： １
７５（１９８１）に記載されているサル腎臓繊維芽細胞
のＣＯＳ−７株、および適合性のベクターを発現し得る
他の細胞株（例えば、Ｃ１２７、３Ｔ３、ＣＨＯ、Ｈｅ
Ｌａ、およびＢＨＫ細胞株）を包含する。哺乳動物発現
ベクターは、複製起点、適切なプロモーターおよびエン
ハンサー、ポリアデニル化部位、スプライスドナー部位
およびスプライスアクセプター部位、転写終止配列、お
よび５’フランキング非転写配列を包含し得る。ＳＶ４
０スプライスおよびポリアデニル化部位に由来するＤＮ
Ａ配列は、必要な非転写遺伝エレメントを提供するため
に使用され得る。 【００８３】ＩＣＥ−ＬＡＰ−３およびＩＣＥ−ＬＡＰ
−４ポリペプチドは、以下に挙げる方法により組換え細
胞培養物から回収され、そして精製され得る。これらの
方法には、硫安沈殿またはエタノール沈殿、酸抽出、陰
イオンまたは陽イオン交換クロマトグラフィー、リン酸
セルロースクロマトグラフィー、疎水性相互作用クロマ
トグラフィー、アフィニティークロマトグラフィー、ヒ
ドロキシルアパタイトクロマトグラフィー、およびレク
チンクロマトグラフィーが包含される。必要に応じて、
タンパク質の再折りたたみ（ｒｅｆｏｌｄｉｎｇ）工程
が、成熟タンパク質の配置を完全にするために使用され
得る。最終的に、高速液体クロマトグラフィー（ＨＰＬ
Ｃ）が、最終的な精製工程に用いられ得る。 【００８４】本発明のポリペプチドは、天然の精製され
た産物、または化学合成手順の産物であり得るか、ある
いは原核宿主または真核宿主（例えば、培養物中の細
菌、酵母、高等植物、昆虫、および哺乳動物細胞によ
り）から組換え技術により生成され得る。組換え産生手
順に用いられる宿主に依存して、本発明のポリペプチド
は、グリコシル化され得るか、あるいはグリコシル化さ
れ得ない。本発明のポリペプチドはまた、開始メチオニ
ンアミノ酸残基を含み得る。 【００８５】ＩＣＥ−ＬＡＰ−３およびＩＣＥ−ＬＡＰ
−４ポリペプチドは、異常に制御されたプログラム細胞
死を処置するために用いられ得る。異常に制御されたプ
ログラム細胞死は、細胞成長の異常な量によるガンの基
礎的な原因であり得る。それゆえ、ＩＣＥ−ＬＡＰ遺伝
子は、プログラムされた細胞死に関係するので、望まれ
ない細胞（例えば、ガン細胞）を標的するのに用いられ
得る。ＩＣＥ−ＬＡＰ−３およびＩＣＥ−ＬＡＰ−４は
また、脊椎動物の成長および組織の恒常性（そのアポト
ーシス能による）を制御するのに用いられ得る。また、
プログラム細胞死は、細胞の主要な抗ウイルス防衛メカ
ニズムの一つであり得るので、ＩＣＥ−ＬＡＰ−３およ
びＩＣＥ−ＬＡＰ−４ポリペプチドは、抑制されたプロ
グラム細胞死に打ち勝つことで、多くのウイルス感染に
打ち勝つために用いられ得る。 【００８６】ＩＣＥ−ＬＡＰ−３およびＩＣＥ−ＬＡＰ
−４はまた、細胞死に対するウイルス感染細胞を標的す
ることにより免疫抑制に関連する異常（例えば、ＡＩＤ
Ｓ）を処置するのに用いられ得る。 【００８７】本発明はさらに、ＩＣＥ−ＬＡＰ−３およ
びＩＣＥ−ＬＡＰ−４に対するアンタゴニストを同定す
るための化合物をスクリーニングするためのプロセスに
関する。このようなアッセイの例は、これは天然の基質
と共に、基質上での作用を可能にする条件下において、
ＩＣＥ−ＬＡＰ−３またはＩＣＥ−ＬＡＰ−４と、潜在
的なアンタゴニスト化合物とを結合させる工程、および
化合物が、ＩＣＥ−ＬＡＰ−３またはＩＣＥ−ＬＡＰ−
４が基質を切断することを妨げるかどうかを決定する工
程を包含する。 【００８８】潜在的なアンタゴニストは、抗体、また
は、いくつかの場合、ポリペプチドに結合するオリゴペ
プチドを含む。あるいは、潜在的なアンタゴニストは、
基質に結合するタンパク質に密接に関係し得るが、これ
らは、ポリペプチドの形態では不活性であり、それゆ
え、本発明のポリペプチドの作用を妨げる。 【００８９】別の潜在的なアンタゴニストは、アンチセ
ンス技術を用いて調製されたアンチセンス構築物であ
る。アンチセンス技術は、トリプル−ヘリックス構造あ
るいはアンチセンスＤＮＡまたはＲＮＡを介してコント
ロール遺伝子の発現を制御するために用いられ得る。こ
の方法は、どちらもポリヌクレオチドをＤＮＡまたはＲ
ＮＡに結合させることに基づく。例えば、ポリヌクレオ
チド配列の５’コード部分は、本発明の成熟ポリペプチ
ドをコードし、約１０塩基対〜４０塩基対の長さのアン
チセンスＲＮＡオリゴヌクレオチドを設計するために用
いられる。ＤＮＡオリゴヌクレオチドは、転写に関与す
る遺伝子の領域（トリプル−ヘリックス、Ｌｅｅら、Ｎ
ｕｃｌ． Ａｃｉｄｓ Ｒｅｓ．， ６：３０７３
（１９７９）；Ｃｏｏｎｅｙら、Ｓｃｉｅｎｃｅ， ２
４１：４５６ （１９８８） ；およびＤｅｒｖａｎ
ら、Ｓｃｉｅｎｃｅ， ２５１：１３６０ （１９９
１）、を参照のこと）に相補的になるように設計され、
それゆえ、ＩＣＥ−ＬＡＰ−３およびＩＣＥ−ＬＡＰ−
４の転写および生成を妨げる。アンチセンスＲＮＡオリ
ゴヌクレオチドは、インビボでｍＲＮＡにハイブリダイ
ズし、ｍＲＮＡ分子のＩＣＥ−ＬＡＰ−３およびＩＣＥ
−ＬＡＰ−４への翻訳をブロックする（アンチセンス−
Ｏｋａｎｏ， Ｊ． Ｎｅｕｒｏｃｈｅｍ．， ５６：
５６０ （１９９１）；遺伝子発現のアンチセンスイン
ヒビターとしてのオリゴヌクレオチド、ＣＲＣＰｒｅｓ
ｓ， Ｂｏｃａ Ｒａｔｏｎ， ＦＬ （１９８
８））。上記のオリゴヌクレオチドはまた、細胞に送達
され、ＩＣＥ−ＬＡＰ−３およびＩＣＥ−ＬＡＰ−４の
生成を阻害するように、インビボでアンチセンスＲＮＡ
またはＤＮＡを発現し得る。 【００９０】潜在的なアンタゴニストは、ポリペプチド
の触媒部位に結合して、占有する小分子を含む。それに
より、提供された触媒部位を基質に対して接触不可能に
して、正常な生物学的活性を妨げる。小分子の例は、小
ペプチドまたはペプチド様分子を含むが、これらに限定
されない。 【００９１】アンタゴニストは、アンタゴニストのプロ
グラムされない壊死（ｎｅｃｒｏｔｉｃ）細胞死を処置
するために用いられ得る。壊死細胞死は、心臓血管疾
患、発作、外傷、および他の変性疾患に関連し、ここ
で、ＩＣＥ−ＬＡＰ−３およびＩＣＥ−ＬＡＰ−４の異
常な調節が病理学的な細胞死（例えば免疫抑制関連性障
害、アルツハイマー病、パーキンソン病、および慢性関
節リウマチ）を導き得る。 【００９２】アンタゴニストはまた、肺、気管（ａｉｒ
ｗａｙ）、中枢神経系、目および耳、関節、骨、心臓血
管系、ならびに胃腸系および泌尿器系の免疫に基づく疾
患を処置するために用いられ得る。アンタゴニストは、
例えば本明細書に記載されるような薬学的に受容可能な
キャリアと共に組成物として用いられ得る。 【００９３】本発明のポリペプチドおよびアンタゴニス
ト化合物は、適切な薬学的キャリアと組み合わせて用い
られ得る。このような組成物は、治療有効量のポリペプ
チドまたはアンタゴニスト、および薬学的に受容可能な
キャリアまたは賦形剤を含む。このようなキャリアとし
ては、生理食塩水、緩衝化生理食塩水、デキストロー
ス、水、グリセロール、エタノール、およびそれらの組
み合わせが挙げられるが、これらに限定されない。処方
は、投与の態様に合わせるべきである。 【００９４】本発明はまた、本発明の薬学的組成物の１
つ以上の成分で満たされた１つ以上の容器を含有する薬
学的パックまたはキットを提供する。このような容器
は、薬剤または生物学的製品の製造、使用、または販売
を統制する政府機関により規定された形式の通知と関連
し得、この通知はヒトへの投与についての製造、使用、
または販売における政府機関による認可を反映する。さ
らに、本発明のポリペプチドまたはアンタゴニストは、
他の治療用化合物と併用して用いられ得る。 【００９５】薬学的組成物は、静脈内、腹腔内、筋内、
皮下、鼻腔内、または皮内経路によるような、簡便な方
法で投与され得る。ＩＣＥ−ＬＡＰ−３およびＩＣＥ−
ＬＡＰ−４は、特定の徴候の処置および／または予防に
対して有効である量で投与される。一般に、ＩＣＥ−Ｌ
ＡＰ−３およびＩＣＥ−ＬＡＰ−４は、少なくとも１０
μｇ／ｋｇ体重の量で投与され、そしてほとんどの場
合、１日当たり８ｍｇ／ｋｇ体重を超えない量で投与さ
れる。ほとんどの場合、投与経路、症状などを考慮し
て、投薬量は毎日約１０μｇ／ｋｇ体重〜約１ｍｇ／ｋ
ｇ体重である。 【００９６】このポリペプチドはまた、インビボでのこ
のようなポリペプチドの発現により本発明に従って、使
用され得る。これはしばしば「遺伝子治療」と呼ばれ
る。 【００９７】従って、例えば、患者由来の細胞は、ポリ
ペプチドをコードするポリヌクレオチド（ＤＮＡまたは
ＲＮＡ）を用いてエキソビボで操作され得、次いで、操
作された細胞はこのポリペプチドで処置されるべき患者
に提供される。このような方法は当該分野で周知であ
る。例えば、細胞は、本発明のポリペプチドをコードす
るＲＮＡを含有するレトロウイルス粒子の使用により、
当該分野で公知の手順によって操作され得る。 【００９８】同様に、細胞は、インビボでのポリペプチ
ドの発現のために、例えば、当該分野で公知の手順によ
りインビボで操作され得る。当該分野で公知のように、
本発明のポリペプチドをコードするＲＮＡを含有するレ
トロウイルス粒子を産生するための産生細胞は、インビ
ボで細胞を操作するためおよびインビボでのポリペプチ
ドの発現のために患者に投与され得る。このような方法
により本発明のポリペプチドを投与するためのこれらの
方法および他の方法は、本発明の教示から当業者には明
らかである。例えば、細胞を操作するための発現ベヒク
ル（ｖｅｈｉｃｌｅ）は、レトロウイルス以外のもの
（例えば、アデノウイルス）であり得る。これは、適切
な送達ベヒクルと組み合わせた後、インビボで細胞を操
作するために使用され得る。 【００９９】本明細書上記のレトロウイルスプラスミド
ベクターが由来し得るレトロウィルスは、モロニーマウ
ス白血病ウイルス、脾臓壊死（ｓｐｌｅｅｎ ｎｅｃｒ
ｏｓｉｓ）ウイルス、レトロウイルス（例えば、ラウス
肉腫ウイルス、ハーベイ（Ｈａｒｖｅｙ）肉腫ウイル
ス、鳥類白血病ウイルス、テナガザル白血病ウイルス、
ヒト免疫不全ウイルス、アデノウイルス、骨髄増殖性肉
腫ウイルス、および哺乳動物腫瘍ウイルス）を含むが、
これらに限定されない。一つの実施態様において、レト
ロウイルスプラスミドベクターは、モロニーマウス白血
病ウイルスに由来する。 【０１００】ベクターは一つまたはそれより多いプロモ
ーターを含有する。使用され得る適切なプロモーター
は、レトロウイルスＬＴＲ；ＳＶ４０プロモーター；お
よびＭｉｌｌｅｒら、Ｂｉｏｔｅｃｈｎｉｑｕｅｓ，第
７巻，第９号，９８０−９９０（１９８９）に記載のヒ
トサイトメガロウイルス（ＣＭＶ）プロモーター、また
は他の任意のプロモーター（例えば、真核細胞プロモー
ターのような細胞プロモーター。これはヒストン、ｐｏ
ｌ ＩＩＩ、およびβ−アクチンプロモーターを含む
が、これらに限定されない。）を含むが、これらに限定
されない。使用され得る他のウイルスプロモーターは、
アデノウイルスプロモーター、チミジンキナーゼ（Ｔ
Ｋ）プロモーター、およびＢ１９パルボウイルスプロモ
ーターを含むが、これらに限定されない。適切なプロモ
ーターの選択は、本明細書中に含まれる教示から当業者
には明白である。 【０１０１】本発明のポリペプチドをコードする核酸配
列は、適切なプロモーターの制御下にある。使用され得
る適切なプロモーターは、アデノウイルスプロモーター
（例えば、アデノウイルス主要後期プロモーター）；ま
たは異種のプロモーター（例えば、サイトメガロウイル
ス（ＣＭＶ）プロモーター）；呼吸シンシチアルウイル
ス（ＲＳＶ）プロモーター；誘導性プロモーター（例え
ば、ＭＭＴプロモーター、メタロチオネインプロモータ
ー）；熱ショックプロモーター；アルブミンプロモータ
ー；ＡｐｏＡＩプロモーター；ヒトグロビンプロモータ
ー；ウイルスチミジンキナーゼプロモーター（例えば、
単純ヘルペスチミジンキナーゼプロモーター）；レトロ
ウイルスＬＴＲ（これは本明細書上記の改変レトロウイ
ルスＬＴＲを含む）；β−アクチンプロモーター；およ
びヒト成長ホルモンプロモーターを含むが、これらに限
定されない。プロモーターはまた、ポリペプチドをコー
ドする遺伝子を制御する天然のプロモーターであり得
る。 【０１０２】レトロウイルスプラスミドベクターは、パ
ッケージ細胞株に形質導入して、産生細胞株を形成する
ために使用され得る。トランスフェクトされ得るパッケ
ージ細胞の例は、その全体が本明細書中に参考として援
用されているＭｉｌｌｅｒ、Ｈｕｍａｎ Ｇｅｎｅ Ｔ
ｈｅｒａｐｙ，第１巻，５〜１４頁（１９９０）に記載
されたＰＥ５０１、ＰＡ３１７、Ψ−２、Ψ−ＡＭ、Ｐ
Ａ１２、Ｔ１９−１４Ｘ、ＶＴ−１９−１７−Ｈ２、Ψ
ＣＲＥ、ΨＣＲＩＰ、ＧＰ＋Ｅ−８６、ＧＰ＋ｅｎｖＡ
ｍ１２、およびＤＡＮ細胞株を含むが、これらに限定さ
れない。ベクターは、当該分野に公知の任意の手段によ
ってパッケージ細胞に形質導入し得る。このような手段
は、エレクトロポレーション、リポソームの使用、およ
びＣａＰＯ_４沈澱を含むが、これらに限定されない。別
の一つの実施態様において、レトロウイルスプラスミド
ベクターは、リポソーム中にカプセル化されるか、また
は脂質と結合され、そして次に宿主に投与され得る。 【０１０３】産生細胞株は、ポリペプチドをコードする
核酸配列を含む感染性レトロウイルスベクター粒子を生
じる。次に、このようなレトロウイルスベクター粒子
は、インビトロまたはインビボのどちらかで真核細胞に
形質導入するために使用され得る。形質導入された真核
細胞は、ポリペプチドをコードする核酸配列を発現す
る。形質導入され得る真核細胞は、胚性幹細胞、胚性ガ
ン細胞ならびに造血幹細胞、肝細胞、線維芽細胞、筋芽
細胞、ケラチノサイト、内皮細胞、および気管支上皮細
胞を含むが、これらに制限されない。 【０１０４】本発明はまた、診断薬としての本発明の遺
伝子の使用に関する。この遺伝子の変異形態の検出は、
疾患、または本発明のポリペプチドの発現低下から生じ
る疾患に対する感受性の診断を可能にする。 【０１０５】ヒトＩＣＥ−ＬＡＰ ３および４遺伝子に
変異を有する個体は、多様な技術によってＤＮＡレベル
で検出され得る。診断用の核酸は、患者の細胞から得ら
れ得る。これは、血液、尿、唾液、組織生検および剖検
材料を含むが、これらに制限されない。ゲノムＤＮＡ
は、検出のために直接使用され得るか、または分析の前
にＰＣＲ（Ｓａｉｋｉら、Ｎａｔｕｒｅ，３２４：１６
３−１６６（１９８６））を使用して酵素的に増幅され
得る。ＲＮＡまたはｃＤＮＡもまた、同じ目的に使用さ
れ得る。例として、本発明のポリペプチドをコードする
核酸と相補的なＰＣＲプライマーは、変異を同定および
分析するために使用され得る。例えば、欠失および挿入
は、正常な遺伝子型と比較したときの増幅産物のサイズ
変化によって検出され得る。点変異は、増幅されたＤＮ
Ａを放射標識ＩＣＥ−ＬＡＰ ３および４ＲＮＡ、また
はあるいは放射標識ＩＣＥ−ＬＡＰ ３および４アンチ
センスＤＮＡ配列とハイブリダイズすることによって同
定され得る。完全にマッチした配列は、ＲＮａｓｅ Ａ
消化または融解温度の差によってミスマッチ二本鎖と区
別され得る。 【０１０６】参照遺伝子と変異を有する遺伝子との間の
配列の差は、直接ＤＮＡ配列決定法によって明らかにさ
れ得る。さらに、クローン化されたＤＮＡセグメント
は、特異的なＤＮＡセグメントを検出するためのプロー
ブとして使用され得る。この方法の感受性は、ＰＣＲと
組み合わせた場合、非常に増強される。例えば、配列決
定プライマーは、二本鎖ＰＣＲ産物または改変ＰＣＲに
よって生じた一本鎖テンプレート分子と共に使用され
る。配列決定は、放射標識ヌクレオチドを用いる従来の
手順または蛍光タグを用いる自動配列決定手順によって
行われる。 【０１０７】ＤＮＡ配列の差に基づく遺伝子試験は、変
性試薬を含むかまたは含まないゲルにおけるＤＮＡフラ
グメントの電気泳動移動度の変化の検出によって達成さ
れ得る。小さな配列欠失および挿入は高分解能ゲル電気
泳動によって可視化され得る。異なる配列のＤＮＡフラ
グメントは、変性ホルムアミド勾配ゲルで分けられ得
る。そこでは異なるＤＮＡフラグメントの移動度は、そ
の特異的な融解温度または部分融解温度に従って、ゲル
中で異なる位置で遅らされる（例えば、Ｍｙｅｒｓら、
Ｓｃｉｅｎｃｅ，２３０：１２４２（１９８５）を参照
のこと）。 【０１０８】特異的な位置での配列変化はまた、ヌクレ
アーゼ保護アッセイ（例えば、ＲＮａｓｅおよびＳ１保
護または化学切断法）によって明らかにされ得る（例え
ば、Ｃｏｔｔｏｎら、ＰＮＡＳ，ＵＳＡ，８５：４３９
７−４４０１（１９８５））。 【０１０９】従って、特異的なＤＮＡ配列の検出は、ゲ
ノムＤＮＡのハイブリダイゼーション、ＲＮａｓｅ保
護、化学切断、直接ＤＮＡ配列決定、または制限酵素の
使用（例えば、制限断片長多型（ＲＦＬＰ））およびサ
ザンブロッティングのような方法によって達成され得
る。 【０１１０】さらに伝統的なゲル電気泳動およびＤＮＡ
配列決定に加えて、変異はまたインサイチュ分析によっ
て検出され得る。 【０１１１】本発明はまた、種々の組織におけるＩＣＥ
−ＬＡＰ ３および４タンパク質のレベル変化を検出す
るための診断アッセイに関する。宿主に由来するサンプ
ルにおけるＩＣＥ−ＬＡＰ ３および４タンパク質のレ
ベルを検出するために使用されるアッセイは、当業者に
は周知であり、そしてラジオイムノアッセイ、競合結合
アッセイ、ウエスタンブロット分析および好ましくはＥ
ＬＩＳＡアッセイを含む。ＥＬＩＳＡアッセイは、初め
にＩＣＥ−ＬＡＰ ３および４抗原に特異的な抗体、好
ましくはモノクローナル抗体を調製する工程を包含す
る。さらにレポーター、抗体はモノクローナル抗体に対
して調製される。このレポーター、抗体に検出可能な試
薬（例えば、放射活性、蛍光または本実施例における西
洋ワサビペルオキシダーゼ酵素）を接着させる。ここで
サンプルは宿主から取り出され、そしてサンプル中のタ
ンパク質を結合する固体支持体（例えば、ポリスチレン
ディッシュ）上でインキュベートされる。次に、ディッ
シュ上の任意の遊離タンパク質結合部位は、非特異的タ
ンパク質（例えば、ウシ血清アルブミン）と共にインキ
ュベートすることによって覆われる。次に、モノクロー
ナル抗体を、このモノクローナル抗体が、ポリスチレン
ディッシュに接着された任意のＩＣＥ−ＬＡＰ３および
４タンパク質に接着する時間、ディッシュ中でインキュ
ベートする。全ての非結合モノクローナル抗体は、緩衝
液で洗い流される。西洋ワサビペルオキシダーゼに結合
されたレポーター抗体は、ここでディッシュ中に入れら
れ、ＩＣＥ−ＬＡＰ ３および４に結合した任意のモノ
クローナル抗体へのレポーター抗体の結合を生じる。次
に、非接着レポーター抗体は洗い流される。次に、ペル
オキシダーゼの基質がディッシュに加えられ、そして所
定の時間内での発色量が、標準曲線と比較した場合の、
所定量中の患者サンプルに存在するＩＣＥ−ＬＡＰ ３
および４タンパク質の量の測定値である。 【０１１２】競合アッセイが使用され得る。ここでは、
ＩＣＥ−ＬＡＰ ３および４に特異的な抗体が固体支持
体に接着し、標識ＩＣＥ−ＬＡＰ ３および４ならびに
宿主由来のサンプルが固体支持体上を流され、固体支持
体に接着した検出された標識の量が、サンプル中のＩＣ
Ｅ−ＬＡＰ ３および４の量と相関し得る。 【０１１３】本発明の配列はまた、染色体の同定に有益
である。この配列は、個々のヒト染色体上の特定の位置
に対して特異的に標的付けられ、そしてその位置とハイ
ブリダイズし得る。さらに、現在、染色体上の特定の部
位を同定する必要がある。現在、染色体位置のマーキン
グに利用可能な、実際の配列データ（反復多型）に基づ
く染色体マーキング標識試薬はほとんどない。本発明に
よるＤＮＡの染色体へのマッピングは、これらの配列と
疾患に関連する遺伝子とを相関させることにおいて重要
な第１段階である。 【０１１４】簡略に述べれば、配列は、ｃＤＮＡからＰ
ＣＲプライマー（好ましくは１５〜２５ｂｐ）を調製す
ることにより染色体にマップされ得る。遺伝子の３’非
翻訳領域のコンピューター解析が、ゲノムＤＮＡ中で１
つより多いエキソンにまたがらず、従って増幅プロセス
を複雑化しないプライマーを迅速に選択するために使用
される。次いで、これらのプライマーは、個々のヒト染
色体を含有する体細胞ハイブリッドのＰＣＲスクリーニ
ングに使用される。プライマーに対応するヒト遺伝子を
含有するハイブリッドのみが増幅フラグメントを生じ
る。 【０１１５】体細胞ハイブリッドのＰＣＲマッピング
は、特定の染色体に特定のＤＮＡを割り当てるための迅
速な手順である。本発明を同じオリゴヌクレオチドプラ
イマーと共に使用して、類似の様式で特定の染色体由来
のフラグメントのパネルまたは大きなゲノムクローンの
プールを用いて下位位置決め（ｓｕｂｌｏｃａｌｉｚａ
ｔｉｏｎ）が達成され得る。染色体にマップするために
同様に使用され得る他のマッピングストラテジーは、イ
ンサイチュハイブリダイゼーション、標識したフローサ
イトメトリーで選別した（ｆｌｏｗ−ｓｏｒｔｅｄ）染
色体を用いるプレスクリーニング、および染色体特異的
ｃＤＮＡライブラリーを構築するためのハイブリダイゼ
ーションによるプレ選択を包含する。 【０１１６】中期染色体展開物へのｃＤＮＡクローンの
蛍光インサイチュハイブリダイゼーション（ＦＩＳＨ）
は、１工程で正確な染色体位置を提供するために使用さ
れ得る。この技術は、少なくとも５０または６０塩基を
有するｃＤＮＡで使用され得る。この技術の総説として
は、Ｖｅｒｍａら、Ｈｕｍａｎ Ｃｈｒｏｍｏｓｏｍｅ
ｓ： ａ Ｍａｎｕａｌ ｏｆ Ｂａｓｉｃ Ｔｅｃｈ
ｎｉｑｕｅｓ、Ｐｅｒｇａｍｏｎ Ｐｒｅｓｓ、Ｎｅｗ
Ｙｏｒｋ （１９８８）を参照のこと。 【０１１７】一旦配列が正確な染色体位置にマップされ
ると、染色体上での配列の物理的な位置を遺伝子地図の
データと相関させ得る。このようなデータは、例えば、
Ｖ．ＭｃＫｕｓｉｃｋ、Ｍｅｎｄｅｌｉａｎ Ｉｎｈｅ
ｒｉｔａｎｃｅ ｉｎ Ｍａｎ に見出される（Ｊｏｈ
ｎｓ Ｈｏｐｋｉｎｓ Ｕｎｉｖｅｒｓｉｔｙ Ｗｅｌ
ｃｈ Ｍｅｄｉｃａｌ Ｌｉｂｒａｒｙからオンライン
で入手可能である）。次いで、同一の染色体領域にマッ
プされている遺伝子と疾患との関係が、連鎖解析（物理
的に隣接する遺伝子の同時遺伝）により同定される。 【０１１８】次に、罹患個体と非罹患個体との間のｃＤ
ＮＡまたはゲノム配列の差異を決定する必要がある。変
異がいくつかまたはすべての罹患個体に観察されるが正
常な個体のいずれにも観察されない場合、この変異はこ
の疾患の原因因子であると思われる。 【０１１９】物理的マッピングおよび遺伝子マッピング
技術の現在の分解能では、疾患に関連する染色体領域に
正確に位置決めされたｃＤＮＡは、５０と５００との間
の可能性のある原因遺伝子の１つであり得る。（これ
は、１メガ塩基のマッピング分解能で、そして２０ｋｂ
あたり１遺伝子と仮定する。）このポリペプチド、その
フラグメントまたは他の誘導体、またはそれらのアナロ
グ、あるいはそれらを発現する細胞は、それらに対する
抗体を生成するための免疫原として使用され得る。これ
らの抗体は、例えば、ポリクローナル抗体またはモノク
ローナル抗体であり得る。本発明はまた、キメラ抗体、
単鎖抗体およびヒト化抗体、ならびにＦａｂフラグメン
ト、またはＦａｂ発現ライブラリーの産物を包含する。
当該分野で公知の種々の手順が、このような抗体および
フラグメントの生成のために使用され得る。 【０１２０】本発明の配列に対応するポリペプチドに対
して生成される抗体は、動物へのポリペプチドの直接注
射により、または動物（好ましくは、非ヒト）にポリペ
プチドを投与することにより得られ得る。次いで、この
ようにして得られる抗体は、ポリペプチド自体に結合す
る。このようにして、ポリペプチドのフラグメントのみ
をコードする配列でさえも、天然のポリペプチド全体に
結合する抗体を生成するために使用され得る。次いで、
このような抗体は、そのポリペプチドを発現する組織か
らそのポリペプチドを単離するために使用され得る。 【０１２１】モノクローナル抗体の調製のために、連続
的な細胞株培養物により産生される抗体を提供する任意
の技術が使用され得る。例としては、ハイブリドーマ技
術（ＫｏｈｌｅｒおよびＭｉｌｓｔｅｉｎ、１９７５、
Ｎａｔｕｒｅ、２５６： ４９５−４９７）、トリオー
マ技術、ヒトＢ細胞ハイブリドーマ技術（Ｋｏｚｂｏｒ
ら、１９８３、Ｉｍｍｕｎｏｌｏｇｙ Ｔｏｄａｙ
４：７２）、およびヒトモノクローナル抗体を生成する
ためのＥＢＶハイブリドーマ技術（Ｃｏｌｅら、１９８
５、Ｍｏｎｏｃｌｏｎａｌ Ａｎｔｉｂｏｄｉｅｓ ａ
ｎｄ Ｃａｎｃｅｒ Ｔｈｅｒａｐｙ、Ａｌａｎ Ｒ．
Ｌｉｓｓ， Ｉｎｃ．、７７−９６頁）が挙げられ
る。 【０１２２】単鎖抗体を生成するために記載された技術
（米国特許第４，９４６，７７８号）を、本発明の免疫
原性ポリペプチド産物に対する単鎖抗体を生成するため
に適合させ得る。また、トランスジェニックマウスが、
本発明の免疫原性ポリペプチド産物に対するヒト化抗体
を発現させるために使用され得る。 【０１２３】本発明を以下の実施例を参照にしてさらに
記載する；しかし、本発明はこのような実施例に限定さ
れないことを理解されたい。すべての部または量は、他
に明記しない限り重量基準である。 【０１２４】以下の実施例の理解を容易にするために、
現れる頻度の高い特定の方法および／または用語を記載
する。 【０１２５】「プラスミド」は、小文字のｐの前および
／または後の大文字および／または数字により示され
る。本明細書中の出発プラスミドは、市販であるか、制
限基準なく公的に入手可能であるか、または公表された
手順に従って入手可能なプラスミドから構築され得るか
のいずれかである。さらに、記載されるプラスミドと等
価なプラスミドが当該分野で公知であり、そして当業者
には明らかである。 【０１２６】ＤＮＡの「消化」は、ＤＮＡ中の特定の配
列でのみ作用する制限酵素でそのＤＮＡを触媒的に切断
することをいう。本明細書中で使用される種々の制限酵
素は、市販されており、そしてそれらの反応条件、補因
子、および他の必要条件は当業者に公知のものが使用さ
れた。分析目的には、代表的には１μｇのプラスミドま
たはＤＮＡフラグメントを、約２単位の酵素とともに約
２０μｌの緩衝溶液中で使用する。プラスミド構築のた
めのＤＮＡフラグメントを単離する目的のために、代表
的には５〜５０μｇのＤＮＡを２０〜２５０単位の酵素
で、より大きな容量中で消化する。特定の制限酵素のた
めの適切な緩衝液および基質量は、製造者により特定さ
れる。３７℃での約１時間のインキュベーション時間が
通常使用されるが、これは供給者の説明書に従って変化
し得る。消化後、反応物をポリアクリルアミドゲルで直
接電気泳動して所望のフラグメントを単離する。 【０１２７】切断されたフラグメントのサイズ分離は、
Ｇｏｅｄｄｅｌ， Ｄ．ら、Ｎｕｃｌｅｉｃ Ａｃｉｄ
ｓ Ｒｅｓ．、８：４０５７ （１９８０）により記載
された８％ポリアクリルアミドゲル、またはアガロース
ゲル（０．５〜１．５％）を使用して行われる。 【０１２８】「オリゴヌクレオチド」は、一本鎖ポリデ
オキシヌクレオチドまたは２つの相補的なポリデオキシ
ヌクレオチド鎖のいずれかをいい、これらは化学的に合
成され得る。このような合成オリゴヌクレオチドは、
５’リン酸を有さず、従ってキナーゼの存在下でリン酸
とＡＴＰとを添加しなければ別のオリゴヌクレオチドに
連結しない。合成オリゴヌクレオチドは、脱リン酸化さ
れていないフラグメントに連結する。 【０１２９】「連結」は、２つの二本鎖核酸フラグメン
トの間でリン酸ジエステル結合を形成するプロセスをい
う（Ｍａｎｉａｔｉｓ， Ｔ．ら、前出、１４６頁）。
他に提供しない限り、連結は、ほぼ等モル量の連結され
るべきＤＮＡフラグメント０．５μｇあたり１０単位の
Ｔ４ ＤＮＡリガーゼ（「リガーゼ」）とともに、公知
の緩衝液および条件を用いて達成され得る。 【０１３０】他に記載しない限り、形質転換はＧｒａｈ
ａｍ， Ｆ．およびＶａｎ ｄｅｒＥｂ， Ａ．、Ｖｉ
ｒｏｌｏｇｙ、５２：４５６−４５７ （１９７３）の
方法に記載されるように行った。 【０１３１】 【実施例】（実施例１） （ＩＣＥ−ＬＡＰ−３の細菌発現および精製）最初に、
ＩＣＥ−ＬＡＰ−３をコードするＤＮＡ配列（ＡＴＣＣ
第７５８７５号）を、プロセスされたＩＣＥ−ＬＡＰ−
３タンパク質（シグナルペプチド配列がない）の５’配
列およびＩＣＥ−ＬＡＰ−３遺伝子に対して３’側のベ
クター配列に対応するＰＣＲオリゴヌクレオチドプライ
マーを使用して増幅する。ＩＣＥ−ＬＡＰ−３に対応す
るさらなるヌクレオチドをそれぞれ５’および３’配列
に付加する。５’オリゴヌクレオチドプライマーは、配
列 【０１３２】 【数１】 を有し、ＢａｍＨＩ制限酵素部位（下線）、続いてプロ
セスされたタンパク質コドンの推定末端アミノ酸から開
始する１８ヌクレオチドのＩＣＥ−ＬＡＰ−３コード配
列を含む。３’配列である 【０１３３】 【数２】 は、ＸｂａＩ部位に相補的な配列（下線）に続いて２１
ヌクレオチドのＩＣＥ−ＬＡＰ−３コード配列を含む。
制限酵素部位は、細菌発現ベクターｐＱＥ−９（Ｑｉａ
ｇｅｎ， Ｉｎｃ． ９２５９ Ｅｔｏｎ Ａｖｅｎｕ
ｅ， Ｃｈａｔｓｗｏｒｔｈ， ＣＡ， ９１３１１）
の制限酵素部位に対応する。ｐＱＥ−９は、抗生物質耐
性（Ａｍｐ^ｒ）、細菌の複製起点（ｏｒｉ）、ＩＰＴＧ
調節可能プロモーターオペレーター（Ｐ／Ｏ）、リボソ
ーム結合部位（ＲＢＳ）、６−Ｈｉｓタグ、および制限
酵素部位をコードする。次いで、ｐＱＥ−９をＢａｍＨ
ＩおよびＸｂａＩで消化する。増幅配列をｐＱＥ−９に
連結し、そしてヒスチジンタグおよびＲＢＳをコードす
る配列とインフレームで挿入する。次いで、連結混合物
を用いて、Ｑｉａｇｅｎから商標Ｍ１５／ｒｅｐ４で入
手可能なＥ． ｃｏｌｉを、Ｓａｍｂｒｏｏｋ， Ｊ．
ら、Ｍｏｌｅｃｕｌａｒ Ｃｌｏｎｉｎｇ：Ａ Ｌａｂ
ｏｒａｔｏｒｙ Ｍａｎｕａｌ， Ｃｏｌｄ Ｓｐｒｉ
ｎｇ Ｌａｂｏｒａｔｏｒｙ Ｐｒｅｓｓ， （１９８
９）に記載の手順により形質転換する。Ｍ１５／ｒｅｐ
４はプラスミドｐＲＥＰ４の多数のコピーを含み、その
プラスミドは、ｌａｃＩリプレッサーを発現させ、そし
てカナマイシン耐性（Ｋａｎ^ｒ）をも与える。形質転換
体をＬＢプレートでのその増殖能力によって同定し、そ
してアンピシリン／カナマイシン耐性コロニーを選択す
る。プラスミドＤＮＡを単離し、そして制限分析によっ
て確認する。所望の構築物を含むクローンを、Ａｍｐ
（１００μｇ／ｍｌ）およびＫａｎ（２５μｇ／ｍｌ）
の両方を補充したＬＢ培地中で液体培養で一晩（Ｏ／
Ｎ）増殖させる。Ｏ／Ｎ培養物を使用して１：１００か
ら１：２５０の割合で大量培養物（ｌａｒｇｅ ｃｕｌ
ｔｕｒｅ）に接種する。細胞を０．４と０．６の間の光
学密度６００（Ｏ．Ｄ．^６００）まで増殖させる。次
に、ＩＰＴＧ（「イソプロピル−Ｂ−Ｄ−チオガラクト
ピラノシド」）を１ｍＭの最終濃度まで加える。ＩＰＴ
ＧはｌａｃＩリプレッサーを不活化することによって、
遺伝子発現の増加を導くＰ／Ｏの解除を誘導する。細胞
を余分に３〜４時間増殖させる。次に、細胞を遠心分離
によって集める。細胞ペレットをカオトロピック試薬６
ＭグアニジンＨＣｌで可溶化する。明瞭化後、可溶化し
たＩＣＥ−ＬＡＰ−３を、６−Ｈｉｓタグを含むタンパ
ク質による堅固な結合を可能にする条件下で、ニッケル
キレートカラム上でのクロマトグラフィーによってこの
溶液から精製する（Ｈｏｃｈｕｌｉ，Ｅ．ら、Ｊ．Ｃｈ
ｒｏｍａｔｏｇｒａｐｈｙ ４１１：１７７−１８４
（１９８４））。ＩＣＥ−ＬＡＰ−３（９５％純度）
を、６モルのグアニジンＨＣｌ（ｐＨ５．０）でカラム
から溶出し、そして再生の目的には、３ＭグアニジンＨ
Ｃｌ、１００ｍＭリン酸ナトリウム、１０ｍＭグルタチ
オン（還元型）および２ｍＭグルタチオン（酸化型）に
調整する。この溶液中で１２時間インキュベートした
後、タンパク質を１０ｍＭリン酸ナトリウムに透析し
た。 【０１３４】（実施例２） （ＩＣＥ−ＬＡＰ−４の細菌発現および精製）最初に、
ＩＣＥ−ＬＡＰ−４をコードするＤＮＡ配列（ＡＴＣＣ
第７５８７３号）を、プロセスされたＩＣＥ−ＬＡＰ−
４タンパク質（シグナルペプチド配列がない）の５’配
列およびＩＣＥ−ＬＡＰ−４遺伝子に対して３’側のベ
クター配列に対応するＰＣＲオリゴヌクレオチドプライ
マーを使用して増幅する。ＩＣＥ−ＬＡＰ−４に対応す
るさらなるヌクレオチドをそれぞれ５’および３’配列
に付加する。５’オリゴヌクレオチドプライマーは、配
列 【０１３５】 【数３】 を有し、ＢａｍＨＩ制限酵素部位（下線）、続いてプロ
セスされたタンパク質コドンの推定末端アミノ酸から開
始する１８ヌクレオチドのＩＣＥ−ＬＡＰ−４コード配
列を含む。３’配列である 【０１３６】 【数４】 は、ＸｂａＩ部位に相補的な配列（下線）に続いて２１
ヌクレオチドのＩＣＥ−ＬＡＰ−４コード配列を含む。
制限酵素部位は、細菌発現ベクターｐＱＥ−９（Ｑｉａ
ｇｅｎ， Ｉｎｃ． ９２５９ Ｅｔｏｎ Ａｖｅｎｕ
ｅ， Ｃｈａｔｓｗｏｒｔｈ， ＣＡ， ９１３１１）
の制限酵素部位に対応する。ｐＱＥ−９は、抗生物質耐
性（Ａｍｐ^ｒ）、細菌の複製起点（ｏｒｉ）、ＩＰＴＧ
調節可能プロモーターオペレーター（Ｐ／Ｏ）、リボソ
ーム結合部位（ＲＢＳ）、６−Ｈｉｓタグ、および制限
酵素部位をコードする。次いで、ｐＱＥ−９をＢａｍＨ
ＩおよびＸｂａＩで消化する。増幅配列をｐＱＥ−９に
連結し、そしてヒスチジンタグおよびＲＢＳをコードす
る配列とインフレームで挿入する。次いで、連結混合物
を用いて、Ｑｉａｇｅｎから商標Ｍ１５／ｒｅｐ４で入
手可能なＥ． ｃｏｌｉを、Ｓａｍｂｒｏｏｋ， Ｊ．
ら、Ｍｏｌｅｃｕｌａｒ Ｃｌｏｎｉｎｇ：Ａ Ｌａｂ
ｏｒａｔｏｒｙ Ｍａｎｕａｌ， Ｃｏｌｄ Ｓｐｒｉ
ｎｇ Ｌａｂｏｒａｔｏｒｙ Ｐｒｅｓｓ， （１９８
９）に記載の手順により形質転換する。Ｍ１５／ｒｅｐ
４はプラスミドｐＲＥＰ４の多数のコピーを含み、その
プラスミドは、ｌａｃＩリプレッサーを発現させ、カナ
マイシン耐性（Ｋａｎ^ｒ）をも与える。形質転換体をＬ
Ｂプレートでのその増殖能力によって同定し、そしてア
ンピシリン／カナマイシン耐性コロニーを選択する。プ
ラスミドＤＮＡを単離し、そして制限分析によって確認
する。所望の構築物を含むクローンを、Ａｍｐ（１００
μｇ／ｍｌ）およびＫａｎ（２５μｇ／ｍｌ）の両方を
補充したＬＢ培地中で液体培養で一晩（Ｏ／Ｎ）増殖さ
せる。Ｏ／Ｎ培養物を１：１００から１：２５０の割合
で大量培養物に接種する。細胞を０．４と０．６の間の
光学密度６００（Ｏ．Ｄ．^６００）まで増殖させた。次
に、ＩＰＴＧ（「イソプロピル−Ｂ−Ｄ−チオガラクト
ピラノシド」）を１ｍＭの最終濃度まで加える。ＩＰＴ
ＧはｌａｃＩリプレッサーを不活化し、遺伝子発現の増
加を導くＰ／Ｏの解除を誘導する。細胞を余分に３〜４
時間増殖させる。次に、細胞を遠心分離によって集め
る。細胞ペレットをカオトロピック試薬６Ｍグアニジン
ＨＣｌで可溶化する。明瞭化後、可溶化したＩＣＥ−Ｌ
ＡＰ−４を、６−Ｈｉｓタグを含むタンパク質による堅
固な結合を可能にする条件下で、ニッケルキレートカラ
ム上でのクロマトグラフィーによってこの溶液から精製
する（Ｈｏｃｈｕｌｉ，Ｅ．ら、Ｊ．Ｃｈｒｏｍａｔｏ
ｇｒａｐｈｙ ４１１：１７７−１８４（１９８
４））。ＩＣＥ−ＬＡＰ−４（９５％純度）を、６Ｍグ
アニジンＨＣｌ（ｐＨ５．０）でカラムから溶出し、そ
して再生の目的には、３ＭグアニジンＨＣｌ、１００ｍ
Ｍリン酸ナトリウム、１０ｍＭグルタチオン（還元型）
および２ｍＭグルタチオン（酸化型）に調整する。この
溶液中で１２時間インキュベートした後、タンパク質を
１０ｍＭリン酸ナトリウムに透析した。 【０１３７】（実施例３） （ＣＯＳ細胞における組換えＩＣＥ−ＬＡＰ−３の発
現）プラスミド（ＩＣＥ−ＬＡＰ−３ ＨＡ）の発現
は、以下を含むベクターｐｃＤＮＡＩ／Ａｍｐ（Ｉｎｖ
ｉｔｒｏｇｅｎ）に由来する：１）ＳＶ４０複製起点、
２）アンピシリン耐性遺伝子、３）Ｅ．ｃｏｌｉ複製起
点、４）ＣＭＶプロモーター、それに続くポリリンカー
領域、ＳＶ４０イントロンおよびポリアデニル化部位。
全ＩＣＥ−ＬＡＰ−３前駆体をコードするＤＮＡフラグ
メントおよびその３’末端にインフレームで融合したＨ
Ａタグを、ベクターのポリリンカー領域にクローン化し
た。従って、組換えタンパク質発現は、ＣＭＶプロモー
ター下の支配を受ける。ＨＡタグは、前記のインフルエ
ンザヘマグルチニンタンパク質由来のエピトープに対応
する（Ｉ． Ｗｉｌｓｏｎ、Ｈ． Ｎｉｍａｎ、Ｒ．
Ｈｅｉｇｈｔｅｎ、Ａ． Ｃｈｅｒｅｎｓｏｎ、Ｍ．
Ｃｏｎｎｏｌｌｙ、およびＲ． Ｌｅｒｎｅｒ、１９８
４、Ｃｅｌｌ ３７、７６７）。本発明者らの目標であ
るタンパク質に対するＨＡタグの融合は、ＨＡエピトー
プを認識する抗体を用いる、組換えタンパク質の容易な
検出を可能にする。 【０１３８】プラスミド構築ストラテジーは、以下の通
りである：ＩＣＥ−ＬＡＰ−３をコードするＤＮＡ配列
（ＡＴＣＣ第７５８７５号）を、２つのプライマーを用
いて、完全長のＩＣＥ−ＬＡＰ−３に対するＰＣＲによ
り構築した：５’プライマー（５’ＧＡＣＴＡＴＧＣＧ
ＴＧＣＧＧＧＧＡＣＡＣＧＧ３’（配列番号９））は、
ＩＣＥ−ＬＡＰ−３翻訳開始部位ＡＴＧ、続いて開始コ
ドンから始まるＩＣＥ−ＬＡＰ−３コード配列の５ヌク
レオチドを含有する；３’配列である５’ＡＡＴＣＡＡ
ＧＣＧＴＡＧＴＣＴＧＧＧＡＣＧＴＣＧＴＡＴＧＧＧＴ
ＡＴＴＣＡＣＣＣＴＧＧＴＧＧＡＧＧＡＴＴＴＧ３’
（配列番号１０）は、翻訳停止コドン、ＨＡタグおよび
ＩＣＥ−ＬＡＰ−３コード配列の最後の２１ヌクレオチ
ド（停止コドンを含まない）を含有する。従って、ＰＣ
Ｒ産物は、ＩＣＥ−ＬＡＰ−３コード配列、続いてイン
フレームに融合したＨＡタグ、およびＨＡタグに隣接す
る翻訳終止停止コドンを含有する。ＰＣＲ増幅ＤＮＡフ
ラグメントを、平滑末端連結によりｐｃＤＮＡＩ／Ａｍ
ｐと連結した。連結混合物を、Ｅ．ｃｏｌｉ株ＳＵＲＥ
（Ｓｔｒａｔａｇｅｎｅ Ｃｌｏｎｉｎｇ Ｓｙｓｔｅ
ｍｓ、１１０９９ Ｎｏｒｔｈ Ｔｏｒｒｅｙ Ｐｉｎ
ｅｓ Ｒｏａｄ、Ｌａ Ｊｏｌｌａ、ＣＡ ９２０３７
から入手可能）に形質転換した。形質転換培養物をアン
ピシリン培地プレート上に播種して、そして耐性コロニ
ーを選択した。プラスミドＤＮＡを、形質転換体から単
離し、そして正しいフラグメントの存在について制限分
析により検査した。組換えＩＣＥ−ＬＡＰ−３の発現の
ために、ＣＯＳ細胞を、ＤＥＡＥデキストラン法により
発現ベクターを用いてトランスフェクトした（Ｊ． Ｓ
ａｍｂｒｏｏｋ、Ｅ． Ｆｒｉｔｓｃｈ、Ｔ． Ｍａｎ
ｉａｔｉｓ、Ｍｏｌｅｃｕｌａｒ Ｃｌｏｎｉｎｇ：Ａ
ＬａｂｏｒａｔｏｒｙＭａｎｕａｌ、Ｃｏｌｄ Ｓｐ
ｒｉｎｇ Ｌａｂｏｒａｔｏｒｙ Ｐｒｅｓｓ、（１９
８９））。ＩＣＥ−ＬＡＰ−３ ＨＡタンパク質の発現
を、放射標識法および免疫沈降法により検出した（Ｅ．
Ｈａｒｌｏｗ、Ｄ． Ｌａｎｅ、Ａｎｔｉｂｏｄｉｅ
ｓ：Ａ Ｌａｂｏｒａｔｏｒｙ Ｍａｎｕａｌ、Ｃｏｌ
ｄ Ｓｐｒｉｎｇ Ｈａｒｂｏｒ Ｌａｂｏｒａｔｏｒ
ｙ Ｐｒｅｓｓ、（１９８８））。細胞を、トランスフ
ェクションの２日後に^３５Ｓ−システインで８時間標識
した。次いで培養培地を採集し、そして細胞を界面活性
剤で溶解した（ＲＩＰＡ緩衝液（１５０ｍＭ ＮａＣ
ｌ、１％ ＮＰ−４０、０．１％ ＳＤＳ、１％ ＮＰ
−４０、０．５％ ＤＯＣ、５０ｍＭ Ｔｒｉｓ、ｐＨ
７．５）（Ｗｉｌｓｏｎ，Ｉ．ら、前出 ３７：７６
７（１９８４））。細胞溶解物および培養培地の両方
を、ＨＡ特異的モノクローナル抗体で沈澱させた。沈澱
したタンパク質を、１５％ＳＤＳ−ＰＡＧＥゲルで分析
した。 【０１３９】（実施例４） （ＣＯＳ細胞における組み換えＩＣＥ−ＬＡＰ−４の発
現）プラスミド（ＩＣＥ−ＬＡＰ−４ ＨＡ）発現は、
以下を含むベクターｐｃＤＮＡＩ／Ａｍｐ（Ｉｎｖｉｔ
ｒｏｇｅｎ）に由来する：１）ＳＶ４０複製起点、２）
アンピシリン耐性遺伝子、３）Ｅ．ｃｏｌｉ複製起点、
４）ＣＭＶプロモーター、それに続くポリリンカー領
域、ＳＶ４０イントロンおよびポリアデニル化部位。全
ＩＣＥ−ＬＡＰ−４前駆体およびその３’末端にインフ
レームで融合したＨＡタグをコードするＤＮＡフラグメ
ントを、ベクターのポリリンカー領域にクローン化し
た。従って、組換えタンパク質発現は、ＣＭＶプロモー
ター下の支配を受ける。ＨＡタグは、前記のインフルエ
ンザヘマグルチニンタンパク質由来のエピトープに対応
する（Ｉ． Ｗｉｌｓｏｎ、Ｈ． Ｎｉｍａｎ、Ｒ．
Ｈｅｉｇｈｔｅｎ、Ａ． Ｃｈｅｒｅｎｓｏｎ、Ｍ．
Ｃｏｎｎｏｌｌｙ、およびＲ． Ｌｅｒｎｅｒ、１９８
４、Ｃｅｌｌ ３７、７６７）。本発明者らの目標タン
パク質に対するＨＡタグの融合は、ＨＡエピトープを認
識する抗体を用いる、組換えタンパク質の容易な検出を
可能にする。 【０１４０】プラスミド構築ストラテジーは、以下の通
りである：ＩＣＥ−ＬＡＰ−４（ＡＴＣＣ ＃ ７５８
７３）をコードするＤＮＡ配列を、２つのプライマーを
用いて、完全長のＩＣＥ−ＬＡＰ−４に対するＰＣＲに
より構築した：５’プライマー（５’ＡＣＣＡＴＧＧＡ
ＧＡＡＣＡＣＴＧＡＡＡＡＣ３’（配列番号１１））
は、ＩＣＥ−ＬＡＰ−４翻訳開始部位（ＡＴＧ）、続い
て開始コドンから始まるＩＣＥ−ＬＡＰ−４コード配列
の１５ヌクレオチドを含有する；３’配列（５’ ＡＡ
ＴＣＡＡＧＣＧＴＡＧＴＣＴＧＧＧＡＣＧＴＣＧＴＡＴ
ＧＧＧＴＡＧＴＧＡＴＡＡＡＡＡＴＡＧＡＧＴＴＣＴＴ
Ｔ ３’（配列番号１２））は、翻訳停止コドン、ＨＡ
タグおよびＩＣＥ−ＬＡＰ−４コード配列の最後の２１
ヌクレオチド（停止コドンを含まない）を含有する。従
って、ＰＣＲ産物は、ＩＣＥ−ＬＡＰ−４コード配列、
続いてインフレームに融合したＨＡタグ、およびＨＡタ
グに隣接する翻訳終止停止コドンを含有する。ＰＣＲ増
幅ＤＮＡフラグメントを、平滑末端連結によるｐｃＤＮ
ＡＩ／Ａｍｐと連結した。連結混合物を、Ｅ．ｃｏｌｉ
株ＳＵＲＥ（Ｓｔｒａｔａｇｅｎｅ Ｃｌｏｎｉｎｇ
Ｓｙｓｔｅｍｓ、１１０９９ Ｎｏｒｔｈ Ｔｏｒｒｅ
ｙ Ｐｉｎｅｓ Ｒｏａｄ、Ｌａ Ｊｏｌｌａ、ＣＡ
９２０３７から入手可能）に形質転換した。形質転換培
養物をアンピシリン培地プレート上に播種し、そして耐
性コロニーを選択した。プラスミドＤＮＡを、形質転換
体から単離し、そして正しいフラグメントの存在につい
て制限分析により検査した。組換えＩＣＥ−ＬＡＰ−４
の発現のために、ＣＯＳ細胞を、ＤＥＡＥデキストラン
法により発現ベクターを用いてトランスフェクトした
（Ｊ． Ｓａｍｂｒｏｏｋ、Ｅ． Ｆｒｉｔｓｃｈ、
Ｔ．Ｍａｎｉａｔｉｓ、Ｍｏｌｅｃｕｌａｒ Ｃｌｏｎ
ｉｎｇ：Ａ Ｌａｂｏｒａｔｏｒｙ Ｍａｎｕａｌ、Ｃ
ｏｌｄ Ｓｐｒｉｎｇ Ｌａｂｏｒａｔｏｒｙ Ｐｒｅ
ｓｓ、（１９８９））。ＩＣＥ−ＬＡＰ−４ ＨＡタン
パク質の発現を、放射標識法および免疫沈降法により検
出した（Ｅ． Ｈａｒｌｏｗ、Ｄ． Ｌａｎｅ、Ａｎｔ
ｉｂｏｄｉｅｓ：Ａ Ｌａｂｏｒａｔｏｒｙ Ｍａｎｕ
ａｌ、Ｃｏｌｄ Ｓｐｒｉｎｇ Ｈａｒｂｏｒ Ｌａｂ
ｏｒａｔｏｒｙ Ｐｒｅｓｓ、（１９８８））。細胞
を、トランスフェクションの２日後に^３５Ｓ−システイ
ンで８時間標識した。次いで培養培地を採集し、そして
細胞を界面活性剤で溶解した（ＲＩＰＡ緩衝液（１５０
ｍＭ ＮａＣｌ、１％ ＮＰ−４０、０．１％ ＳＤ
Ｓ、１％ ＮＰ−４０、０．５％ ＤＯＣ、５０ｍＭ
Ｔｒｉｓ、ｐＨ ７．５）（Ｗｉｌｓｏｎ，Ｉ．ら、前
出 ３７：７６７（１９８４））。細胞溶解物および培
養培地の両方を、ＨＡ特異的モノクローナル抗体で沈澱
させた。沈澱したタンパク質を、１５％ＳＤＳ−ＰＡＧ
Ｅゲルで分析した。 【０１４１】（実施例５） （ヒト組織におけるＩＣＥ−ＬＡＰ−３の発現パター
ン）ノーザンブロット分析を行い、ヒト組織におけるＩ
ＣＥ−ＬＡＰ−３の発現レベルを検査した。細胞の全Ｒ
ＮＡサンプルを、ＲＮＡｚｏｌ^ＴＭＢシステム（Ｂｉｏ
ｔｅｃｘ Ｌａｂｏｒａｔｏｒｉｅｓ，Ｉｎｃ．６０２
３ Ｓｏｕｔｈ Ｌｏｏｐ Ｅａｓｔ、Ｈｏｕｓｔｏ
ｎ、ＴＸ ７７０３３）で単離した。指定のヒト組織そ
れぞれから単離された約１０μｇの全ＲＮＡを１％アガ
ロースゲルで分離し、そしてナイロンフィルター上にブ
ロットした（Ｓａｍｂｒｏｏｋ、Ｆｒｉｔｓｃｈ、およ
びＭａｎｉａｔｉｓ、Ｍｏｌｅｃｕｌａｒ Ｃｌｏｎｉ
ｎｇ、Ｃｏｌｄ Ｓｐｒｉｎｇ Ｈａｒｂｏｒ Ｐｒｅ
ｓｓ、（１９８９））。標識反応を、５０ｎｇのＤＮＡ
フラグメントを用いてＳｔｒａｔａｇｅｎｅ Ｐｒｉｍ
ｅ−Ｉｔキットに従って行った。標識されたＤＮＡを、
Ｓｅｌｅｃｔ−Ｇ−５０カラムで精製した。（５Ｐｒｉ
ｍｅ−３Ｐｒｉｍｅ，Ｉｎｃ． ５６０３ Ａｒａｐａ
ｈｏｅ Ｒｏａｄ、Ｂｏｕｌｄｅｒ、ＣＯ ８０３０
３）。次いで、フィルターを、１，０００，０００ｃｐ
ｍ／ｍｌで放射活性標識された完全長のＩＣＥ−ＬＡＰ
−３遺伝子と、０．５Ｍ ＮａＰＯ_４（ｐＨ７．４）
および７％ＳＤＳ中、６５℃で一晩、ハイブリダイズし
た。０．５×ＳＳＣ、０．１％ＳＤＳを用いて、室温で
２回、そして６０℃で２回洗浄した後、次いでフィルタ
ーを、−７０℃で増感スクリーン（ｉｎｔｅｎｓｉｆｙ
ｉｎｇ ｓｃｒｅｅｎ）とともに一晩曝した。ＩＣＥ−
ＬＡＰ−３のメッセージＲＮＡは、肝臓において豊富で
ある。 【０１４２】（実施例６） （ヒト組織におけるＩＣＥ−ＬＡＰ−４の発現パター
ン）ノーザンブロット分析を行い、ヒト組織におけるＩ
ＣＥ−ＬＡＰ−４の発現レベルを検査した。細胞の全Ｒ
ＮＡサンプルを、ＲＮＡｚｏｌ^ＴＭＢシステム（Ｂｉｏ
ｔｅｃｘ Ｌａｂｏｒａｔｏｒｉｅｓ，Ｉｎｃ．６０２
３ Ｓｏｕｔｈ Ｌｏｏｐ Ｅａｓｔ、Ｈｏｕｓｔｏ
ｎ、ＴＸ ７７０３３）で単離した。指定のヒト組織そ
れぞれから単離された約１０μｇの全ＲＮＡを１％アガ
ロースゲルで分離し、そしてナイロンフィルター上にブ
ロットした。（Ｓａｍｂｒｏｏｋ、Ｆｒｉｔｓｃｈ、お
よびＭａｎｉａｔｉｓ、Ｍｏｌｅｃｕｌａｒ Ｃｌｏｎ
ｉｎｇ、Ｃｏｌｄ Ｓｐｒｉｎｇ Ｈａｒｂｏｒ Ｐｒ
ｅｓｓ、（１９８９））。標識反応を、５０ｎｇのＤＮ
Ａフラグメントを用いてＳｔｒａｔａｇｅｎｅ Ｐｒｉ
ｍｅ−Ｉｔキットに従って行った。標識されたＤＮＡ
を、Ｓｅｌｅｃｔ−Ｇ−５０カラムで精製した。（５Ｐ
ｒｉｍｅ−３Ｐｒｉｍｅ，Ｉｎｃ． ５６０３ Ａｒａ
ｐａｈｏｅ Ｒｏａｄ、Ｂｏｕｌｄｅｒ、ＣＯ ８０３
０３）。次いで、フィルターを、１，０００，０００ｃ
ｐｍ／ｍｌで放射活性標識された完全長のＩＣＥ−ＬＡ
Ｐ−４遺伝子と、０．５Ｍ ＮａＰＯ_４（ｐＨ７．４）
および７％ＳＤＳ中、６５℃で一晩、ハイブリダイズ
した。０．５×ＳＳＣ、０．１％ＳＤＳを用いて、室温
で２回、そして６０℃で２回洗浄した後、次いでフィル
ターを、−７０℃で増感スクリーンとともに一晩曝し
た。 【０１４３】（実施例７） （遺伝子治療による発現）線維芽細胞を皮膚生検により
被験体から得る。得られた組織を組織培養培地に置き、
そして小片に分離する。組織の小片を組織培養フラスコ
の湿潤表面に置き、約１０個の小片を各フラスコに置
く。フラスコを上下逆にして、きつく閉め、そして一晩
室温に放置する。室温で２４時間後、フラスコを逆に
し、組織の小片をフラスコの底に固定したままにし、そ
して新鮮な培地（例えば、１０％ＦＢＳ、ペニシリンお
よびストレプトマイシンを含むＨａｍ’ｓ Ｆ１２培
地）を加える。次に、これを約１週間３７℃でインキュ
ベートする。この時に、新鮮な培地を加え、その後、数
日毎に培地を変える。その培養でさらに２週間後、単層
の線維芽細胞が現れる。単層をトリプシン処理し、そし
てより大きなフラスコに落とす。 【０１４４】モロニーマウス肉腫ウイルスの長末端反復
の側面に位置するｐＭＶ−７（Ｋｉｒｓｃｈｍｅｉｅ
ｒ，Ｐ．Ｔ．ら、ＤＮＡ，７：２１９−２５（１９８
８））をＥｃｏＲＩおよびＨｉｎｄＩＩＩで消化し、そ
してその後、子牛腸ホスファターゼで処理する。線状ベ
クターをアガロースゲルで分画し、そしてガラスビーズ
を使用して精製する。 【０１４５】本発明のポリペプチドをコードするｃＤＮ
Ａを、それぞれ５’および３’末端配列に対応するＰＣ
Ｒプライマーを使用して増幅する。ＥｃｏＲＩ部位を含
む５’プライマーおよび３’プライマーはさらにＨｉｎ
ｄＩＩＩ部位を含む。等量のモロニーマウス肉腫ウイル
ス線状骨格ならびに増幅されたＥｃｏＲＩおよびＨｉｎ
ｄＩＩＩフラグメントを、Ｔ４ＤＮＡリガーゼの存在下
で共に加える。得られた混合物を、２つのフラグメント
の連結に適切な条件下で維持する。連結混合物を使用し
て、細菌ＨＢ１０１を形質転換し、次にそれをベクター
が適切に挿入された目的の遺伝子を有することを確認す
る目的のために、カナマイシンを含む寒天に播種する。 【０１４６】両種性ｐＡ３１７またはＧＰ＋ａｍ１２パ
ッケージ細胞を、１０％子牛血清（ＣＳ）、ペニシリン
およびストレプトマイシンを含むＤｕｌｂｅｃｃｏ改変
Ｅａｇｌｅｓ培地（ＤＭＥＭ）中で密集密度まで組織培
養で増殖させる。次に、遺伝子を含むＭＳＶベクターを
培地に加え、パッケージ細胞をベクターで形質導入す
る。パッケージ細胞は、この時点で遺伝子を含む感染性
ウイルス粒子を産生する（ここで、パッケージ細胞は産
生細胞と呼ばれる）。 【０１４７】新鮮な培地を形質導入された産生細胞に加
え、その後、その培地を密集産生細胞の１０ｃｍプレー
トから集める。感染性ウイルス粒子を含む消費された培
地を、分離した産生細胞を取り出すためにミリポアフィ
ルターに通して濾過し、次にこの培地を線維芽細胞を感
染させるために使用する。培地を線維芽細胞の亜密集プ
レートから取り除き、そして素早く産生細胞からの培地
と取り替える。この培地を取り除き、そして新鮮な培地
に取り替える。ウイルスの力価が高ければ、実質的に全
ての線維芽細胞が感染し、そして選択を必要としない。
力価が非常に低ければ、選択マーカー（例えば、ｎｅｏ
またはｈｉｓ）を有するレトロウイルスベクターを使用
する必要がある。 【０１４８】次に、操作された線維芽細胞を、単独また
はｃｙｔｏｄｅｘ３マイクロキャリアービーズ上で密集
するまで増殖させた後のいずれかで宿主に注射する。こ
こで、線維芽細胞はタンパク質産物を産生する。 【０１４９】本発明の多くの改変および変形は、上記の
教示に照らして可能であり、従って添付の請求の範囲内
で、本発明は、具体的に記載される以外にも実施し得
る。 【０１５０】 【発明の効果】本発明によれば、新規の成熟ポリペプチ
ド、ならびにこれらの生物学的に活性なおよび診断的ま
たは治療的に有用なフラグメント、アナログ、および誘
導体が提供される。 【０１５１】 【配列表】

【図面の簡単な説明】 以下の図面は、本発明の実施態様の例示であり、請求の
範囲に含まれる本発明の範囲を限定することを意図しな
い。 【図１】図１は、ＩＣＥ−ＬＡＰ−３のｃＤＮＡ配列お
よび対応する推定アミノ酸配列を示す。示されるアミノ
酸配列によりコードされるポリペプチドは、ポリペプチ
ドの推定の成熟形態（最初のメチオニン残基を除く）で
あり、そしてアミノ酸については、標準的な１文字略記
が用いられる。 【図２】図２は、ＩＣＥ−ＬＡＰ−４のｃＤＮＡ配列お
よび対応する推定アミノ酸配列を示す。示されるアミノ
酸配列によりコードされるポリペプチドは、ポリペプチ
ドの推定の成熟形態（最初のメチオニン残基を除く）で
ある。 【図３】図３は、ＩＣＥ−ＬＡＰ−３、ＩＣＥ−ＬＡＰ
−４、ヒトＩＣＥ、およびＣ．ｅｌｅｇａｎｓ 細胞死
遺伝子である ｃｅｄ−３の間のアミノ酸配列の比較を
示す。影を付けた領域は、異なる配列間で一致するアミ
ノ酸を示す。

─────────────────────────────────────────────────────
【手続補正書】 【提出日】平成１４年６月３日（２００２．６．３） 【手続補正１】 【補正対象書類名】明細書 【補正対象項目名】図面の簡単な説明 【補正方法】変更 【補正内容】 【図面の簡単な説明】 以下の図面は、本発明の実施態様の例示であり、請求の
範囲に含まれる本発明の範囲を限定することを意図しな
い。 【図１Ａ】図１Ａは、ＩＣＥ−ＬＡＰ−３のｃＤＮＡ配
列および対応する推定アミノ酸配列を示す。示されるア
ミノ酸配列によりコードされるポリペプチドは、ポリペ
プチドの推定の成熟形態（最初のメチオニン残基を除
く）であり、そしてアミノ酸については、標準的な１文
字略記が用いられる。 【図１Ｂ】図１Ｂは、ＩＣＥ−ＬＡＰ−３のｃＤＮＡ配
列および対応する推定アミノ酸配列を示す。示されるア
ミノ酸配列によりコードされるポリペプチドは、ポリペ
プチドの推定の成熟形態（最初のメチオニン残基を除
く）であり、そしてアミノ酸については、標準的な１文
字略記が用いられる。 【図２Ａ】図２Ａは、ＩＣＥ−ＬＡＰ−４のｃＤＮＡ配
列および対応する推定アミノ酸配列を示す。示されるア
ミノ酸配列によりコードされるポリペプチドは、ポリペ
プチドの推定の成熟形態（最初のメチオニン残基を除
く）である。 【図２Ｂ】図２Ｂは、ＩＣＥ−ＬＡＰ−４のｃＤＮＡ配
列および対応する推定アミノ酸配列を示す。示されるア
ミノ酸配列によりコードされるポリペプチドは、ポリペ
プチドの推定の成熟形態（最初のメチオニン残基を除
く）である。 【図３Ａ】図３Ａは、ＩＣＥ−ＬＡＰ−３、ＩＣＥ−Ｌ
ＡＰ−４、ヒトＩＣＥ、およびＣ． ｅｌｅｇａｎｓ
細胞死遺伝子である ｃｅｄ−３の間のアミノ酸配列の
比較を示す。影を付けた領域は、異なる配列間で一致す
るアミノ酸を示す。 【図３Ｂ】図３Ｂは、ＩＣＥ−ＬＡＰ−３、ＩＣＥ−Ｌ
ＡＰ−４、ヒトＩＣＥ、およびＣ． ｅｌｅｇａｎｓ
細胞死遺伝子である ｃｅｄ−３の間のアミノ酸配列の
比較を示す。影を付けた領域は、異なる配列間で一致す
るアミノ酸を示す。 【図３Ｃ】図３Ｃは、ＩＣＥ−ＬＡＰ−３、ＩＣＥ−Ｌ
ＡＰ−４、ヒトＩＣＥ、およびＣ． ｅｌｅｇａｎｓ
細胞死遺伝子である ｃｅｄ−３の間のアミノ酸配列の
比較を示す。影を付けた領域は、異なる配列間で一致す
るアミノ酸を示す。 【図３Ｄ】図３Ｄは、ＩＣＥ−ＬＡＰ−３、ＩＣＥ−Ｌ
ＡＰ−４、ヒトＩＣＥ、およびＣ． ｅｌｅｇａｎｓ
細胞死遺伝子である ｃｅｄ−３の間のアミノ酸配列の
比較を示す。影を付けた領域は、異なる配列間で一致す
るアミノ酸を示す。 【手続補正２】 【補正対象書類名】図面 【補正対象項目名】全図 【補正方法】変更 【補正内容】 【図１Ａ】 【図１Ｂ】 【図３Ａ】 【図２Ａ】 【図２Ｂ】 【図３Ｂ】 【図３Ｄ】 【図３Ｃ】

───────────────────────────────────────────────────── フロントページの続き (51)Int.Cl.⁷ 識別記号 ＦＩ テーマコート゛(参考） Ａ６１Ｐ 19/02 Ａ６１Ｐ 29/00 １０１ 25/16 31/04 25/28 43/00 １１１ 29/00 １０１ Ｃ１２Ｎ 15/00 ＺＮＡＡ 31/04 Ａ６１Ｋ 37/02 43/00 １１１ 37/48 (71)出願人 597018381 9410 Ｋｅｙ Ｗｅｓｔ Ａｖｅｎｕｅ, Ｒｏｃｋｖｉｌｌｅ， Ｍａｒｙｌａｎ ｄ 20850， Ｕｎｉｔｅｄ Ｓｔａｔｅ ｓ ｏｆ Ａｍｅｒｉｃａ (72)発明者 ヒ ウェイ ウ アメリカ合衆国 メリーランド 21045, コロンビア， フリー ストーン コー ト 6225 (72)発明者 クレイグ エイ． ローゼン アメリカ合衆国 メリーランド 20882, レイトンズビル， ローリング ヒル ロード 22400 (72)発明者 ピーター エル． ハドソン アメリカ合衆国 メリーランド 20874, ジャーマンタウン， ハイストリーム ドライブ 19041 (72)発明者 グレッグ エイ． ハスティングス アメリカ合衆国 メリーランド 20874, ジャーマンタウン， アンセル テラス 13504 Ｆターム(参考） 4B024 AA01 BA14 CA04 DA02 DA06 EA04 GA11 HA17 4C084 AA02 AA06 AA07 AA13 BA01 BA02 BA08 BA22 BA23 CA53 CA56 DA12 DC01 NA14 ZA022 ZA162 ZA962 ZB152 ZB352 4C087 AA01 AA02 BC83 MA02 NA13 NA14 ZA02 ZA16 ZA96 ZB01 ZB15 ZB35 ZC20

Claims (1)

1. 【特許請求の範囲】 【請求項１】 単離されたポリヌクレオチドであって、
   以下からなる群より選択されるメンバーを含有するポリ
   ヌクレオチド： （ａ）図１に記載のアミノ酸１〜アミノ酸３４１を含有
   するポリペプチドをコードするポリヌクレオチド； （ｂ）図２に記載のアミノ酸１〜アミノ酸２７７を含有
   するポリペプチドをコードするポリヌクレオチド； （ｃ）（ａ）または（ｂ）のポリヌクレオチドにハイブ
   リダイズし得る、および少なくとも９５％の同一性があ
   る、ポリヌクレオチド；および （ｄ）（ａ）、（ｂ）、または（ｃ）のポリヌクレオチ
   ドのポリヌクレオチドフラグメント。