JP2003189883A5

JP2003189883A5 -

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Publication number: JP2003189883A5
Application number: JP2002287039A
Authority: JP
Filing date: 2002-09-30
Publication date: 2005-11-10

Description

【特許請求の範囲】
【請求項１】下記の群より選ばれる脱ユビキチン化活性を有するポリペプチド；
（１）配列表の配列番号１、配列番号３、配列番号５、配列番号７、配列番号９、配列番号１１、配列番号１３、または配列番号１５に記載のアミノ酸配列からなるポリペプチド、
（２）前記（１）のポリペプチドを含有するポリペプチド、
（３）前記（１）のポリペプチドと少なくとも７０％のアミノ酸配列上の相同性を有するポリペプチド、
および
（４）前記（１）のアミノ酸配列において１ないし数個のアミノ酸の欠失、置換、付加、または挿入といった変異を有するポリペプチド。
【請求項２】下記の群より選ばれるポリペプチドであって、ユビキチン（Ｕｂ）が結合したグルタチオンＳ−トランスフェラーゼからＵｂを解離する活性を有するポリペプチド；
（１）配列表の配列番号１、配列番号３、配列番号５、配列番号７、配列番号９、配列番号１１、配列番号１３、または配列番号１５に記載のアミノ酸配列からなるポリペプチド、
（２）前記（１）のポリペプチドを含有するポリペプチド、
（３）前記（１）のポリペプチドと少なくとも７０％のアミノ酸配列上の相同性を有し、かつ脱ユビキチン化活性を有するポリペプチド、
および
（４）前記（１）のアミノ酸配列において１ないし数個のアミノ酸の欠失、置換、付加、または挿入といった変異を有し、かつ脱ユビキチン化活性を有するポリペプチド。
【請求項３】請求項１または請求項２に記載のポリペプチドをコードするポリヌクレオチドまたはその相補鎖。
【請求項４】脱ユビキチン化活性、および／またはユビキチン（Ｕｂ）が結合したグルタチオンＳ−トランスフェラーゼからＵｂを解離する活性を有するポリペプチドをコードする、配列表の配列番号２、配列番号４、配列番号６、配列番号８、配列番号１０、配列番号１２、配列番号１４、または配列番号１６に記載の塩基配列からなるポリヌクレオチドまたはその相補鎖。
【請求項５】請求項３または請求項４に記載のポリヌクレオチドまたはその相補鎖とストリンジェントな条件下でハイブリダイゼーションするポリヌクレオチド。
【請求項６】請求項３から請求項５のいずれか１項に記載のポリヌクレオチドを含有する組換えベクター。
【請求項７】組換えベクターが発現組換えベクターである請求項６に記載の組換えベクター。
【請求項８】請求項６または請求項７に記載の組換えベクターを導入されてなる形質転換体。
【請求項９】請求項１または請求項２に記載のポリペプチドの製造方法であって、請求項７に記載の組換えベクターを導入されてなる形質転換体を培養する工程、または請求項６若しくは請求項７に記載の組換えベクターを利用した無細胞蛋白質合成手段を含む方法。
【請求項１０】請求項１または請求項２に記載のポリペプチドを免疫学的に認識する抗体。
【請求項１１】請求項１０に記載の抗体であって、脱ユビキチン化活性を抑制する抗体。
【請求項１２】請求項１または請求項２に記載のポリペプチドと相互作用してその生理活性を阻害するまたは活性化する化合物、および／または請求項３から請求項５のいずれか１項に記載のポリヌクレオチドと相互作用してその発現を阻害するまたは促進する化合物の同定方法であって、請求項１または請求項２に記載のポリペプチド、請求項３から請求項５のいずれか１項に記載のポリヌクレオチド、請求項６または請求項７に記載の組換えベクター、請求項８に記載の形質転換体、および請求項１０または請求項１１に記載の抗体のうちの少なくともいずれか１つを用いることを特徴とする方法。
【請求項１３】請求項１または請求項２に記載のポリペプチドと相互作用してその生理活性を阻害するまたは促進する化合物、および／または請求項３から請求項５のいずれか１項に記載のポリヌクレオチドと相互作用してその発現を阻害するまたは促進する化合物の同定方法であって、化合物と該ポリペプチドまたは該ポリヌクレオチドとの相互作用を可能にする条件下で、該ポリペプチドまたは該ポリヌクレオチドと化合物とを接触させ、次いで、化合物と該ポリペプチドまたは該ポリヌクレオチドとの相互作用により生じるシグナルの存在または不存在または変化を検出することにより、化合物が該ポリペプチドまたはポリヌクレオチドと相互作用して、該ポリペプチドの生理活性または該ポリヌクレオチドの発現を阻害するまたは促進するかどうかを決定する方法。
【請求項１４】請求項１または請求項２に記載のポリペプチドと相互作用してその生理活性を阻害するまたは促進する化合物、および／または請求項３から請求項５のいずれか１項に記載のポリヌクレオチドと相互作用してその発現を阻害するまたは促進する化合物の同定方法であって、請求項８に記載の形質転換体と化合物とを接触させ、請求項１または請求項２に記載のポリペプチドの発現または生理活性の有無を検出することのできるシグナルおよび／またはマーカーを使用する系を用い、このシグナルおよび／またはマーカーの存在または不存在または変化を検出することにより、該化合物が請求項１または請求項２に記載のポリペプチドの発現または生理活性を促進するまたは阻害するかどうかを決定する方法。
【請求項１５】生理活性が脱ユビキチン化活性である、請求項１２から請求項１４のいずれか１項に記載の方法。
【請求項１６】請求項１または請求項２に記載のポリペプチド、請求項３から請求項５のいずれか１項に記載のポリヌクレオチド、請求項６または請求項７に記載の組換えベクター、請求項８に記載の形質転換体、および請求項１０または請求項１１に記載の抗体のうちの少なくともいずれか１つを含有することを特徴とする医薬組成物。
【請求項１７】請求項１または請求項２に記載のポリペプチド、請求項３から請求項５のいずれか１項に記載のポリヌクレオチド、請求項６または請求項７に記載の組換えベクター、請求項８に記載の形質転換体、および請求項１０または請求項１１に記載の抗体のうちの少なくともいずれか１つを含有することを特徴とする神経変性疾患の防止剤および／または治療剤。
【請求項１８】前記神経変性疾患がアルツハイマー病および／またはパーキンソン病である請求項１７に記載の神経変性疾患の防止剤および／または治療剤。
【請求項１９】請求項１または請求項２に記載のポリペプチド、請求項３から請求項５のいずれか１項に記載のポリヌクレオチド、請求項６または請求項７に記載の組換えベクター、請求項８に記載の形質転換体、および請求項１０または請求項１１に記載の抗体のうちの少なくともいずれか１つを含有することを特徴とする筋萎縮症の防止剤および／または治療剤。
【請求項２０】請求項１または請求項２に記載のポリペプチド、または請求項３から請求項５のいずれか１項に記載のポリヌクレオチドを定量的あるいは定性的に測定する方法。
【請求項２１】請求項１２から請求項１４、および請求項２０のいずれか１項に記載の方法に使用する試薬キットであって、請求項１または請求項２に記載のポリペプチド、請求項３から請求項５のいずれか１項に記載のポリヌクレオチド、請求項６または請求項７に記載の組換えベクター、請求項８に記載の形質転換体、および請求項１０または請求項１１に記載の抗体を少なくとも１つ以上含んでなる試薬キット。

ＵＳＰの発現や活性の増加、減少若しくは欠失等の機能障害は、ＵＳＰが係るユビキチンシステムの異常をきたし、ひいては病的症状を引き起こす。例えば、ＵＳＰの異常と発癌や神経変性疾患との関連が示唆されている（非特許文献１７）。ＵＳＰは染色体構造の維持にも関与しており、ユビキチン化されたヒストンの脱ユビキチン化が染色体凝集に重要であることが知られている（非特許文献２４）し、ＵＳＰファミリーの１つであるＵＳＰ１６がＨ２Ａを脱ユビキチン化することが報告されている（非特許文献２５）。また、アルツハイマー病やパーキンソン病で観察される蛋白質凝集体の多くが抗ユビキチン抗体に反応することからも（非特許文献１７）、神経変性疾患とＵＳＰの機能異常の関係が示唆される。本発明に係るＵＳＰは、種々の組織における発現が認められており、特にＫＩＡＡ１０９７およびＡＫ０２４３１８は脳における発現が強い。また、細胞内においては、ＫＩＡＡ１０９７、ＫＩＡＡ１００３、ＫＩＡＡ１３７２、ＫＩＡＡ１０６３、およびＫＩＡＡ０１９０はいずれも発現量の約５０％〜約６５％が、ＫＩＡＡ０８９１およびＡＫ０２４３１８はそれぞれ約２６％および約３９％が、核内に認められた。さらにＫＩＡＡ１４５３は、発現量の約８７％が核内に認められた。
従って、本発明は、ＵＳＰの関与する生体機能の解明、例えば発癌プロセスの解明、神経変性疾患、例えばアルツハイマー病やパーキンソン病等の解明、および筋萎縮症の解明、並びにそれらの防止剤および／または治療剤の開発、およびそれらの診断手段として用いる測定法の開発を可能とする上で非常に有用なものである。

（ＫＩＡＡ１００３の大腸菌における発現）
かずさＤＮＡ研究所から入手したＫＩＡＡ１００３クローン（ｐＢｌｕｅｓｃｒｉｐｔＩＩＳＫ（＋）のＳａｌＩ−ＮｏｔＩ部位に挿入）を鋳型とし、プライマーとして、ａｔｔＢ−ＫＩＡＡ１００３（＋）とａｔｔＢ−ＫＩＡＡ１００３（−）とを用いて（表２）実施例１と同様に、ＯＲＦ領域を増幅した後に組替え反応によりエントリーベクター（ｐＤＯＮＲ２０１）に挿入して、ｐＤＯＮＲ−Ｋ１００３を作成した。次に、ｐＤＯＮＲ−Ｋ１００３とｐＤＥＳＴ１７を用いて、実施例１と同様Ｈｉｓ−タグが付加されたＫＩＡＡ１００３発現プラスミド（ｐＨｉｓ−Ｋ１００３）を作製した。発現プラスミドは大腸菌ＢＬ２１−ＳＩ（ＬｉｆｅＴｅｃｈｎｏｌｏｇｉｅｓ社）に導入した。なお、ＯＲＦ領域にＰＣＲエラー等の変異が起きていないことはシーケンシングにより確認した。

このＫＩＡＡ１０６３のヒト脳における存在の確認を行った。かずさＤＮＡ研究所で取得した新規遺伝子ＫＩＡＡ１０６３は、５．２ｋｂであったが、バイオインフォマティックスを用いた解析により、ＯＲＦの５’末端側の一部が欠損していると推定された。現在公開されている配列で必要なＯＲＦは約１．７ｋｂであった。まず、本クローンの塩基配列の整合性について検討した。まずＲＴ−ＰＣＲを試みたが、ＯＲＦ１．７ｋｂは増幅されなかったことから、断片化して検討した。ヒト脳ｐｏｌｙ（Ａ）＋ＲＮＡ（ｗｈｏｌｅｃｅｒｅｂｒａｌｂｒａｉｎ，ＣＬＯＮＴＥＣＨ）５００ｎｇを鋳型とし、ランダムヘキサマーを使用して逆転写反応を行なってｃＤＮＡを合成した。このｃＤＮＡを鋳型として各種プライマーを組み合わせてＰＣＲを行なった。予想されるサイズのＰＣＲ産物を精製し（ＤＮＡｐｕｒｉｆｉｃａｔｉｏｎｋｉｔ、ＢｉｏＲａｄ社）、平滑末端化、リン酸化処理した（ＢＫＬｋｉｔ，Ｔａｋａｒａ）。このＰＣＲ産物をｐＢｌｕｅｓｃｒｉｐｔＫＳ（＋）ベクター（制限酵素ＳｍａＩ消化により平滑末端化、脱リン酸化処理）とライゲーションし、コンピテントセル（ＪＭ１０９）にトランスフォーメーションした。目的とするインサートを有するプラスミドを含む大腸菌コロニーを選択し、プラスミドを抽出した。

（酵素活性中心の確認）
ＫＩＡＡ１０６３の酵素活性中心を、ＫＩＡＡ１０６３変異体を用いて基質との共発現系で確認した。まず、ＫＩＡＡ１０６３の推定活性残基である１７４−ＣｙｓのＡｌａへの置換を、クイックチェンジサイト−ディレクティドミュータジェネシスキットを用いて行った。使用したプライマーは、１７４−ＣｙｓのコドンであるＴＧＣがＡｌａのコドンであるＧＣＣに置換するように設計した（５’−ＧＡＴＣＡＡＣＣＴＴＧＧＧＡＡＣＡＣＡＧＣＣＴＴＣＡＴＧＡＡＣＴＧＣＡＴＣＧＴＧＣ−３’（配列番号７２）および５’−ＧＣＡＣＧＡＴＧＣＡＧＴＴＣＡＴＧＡＡＧＧＣＴＧＴＧＴＴＣＣＣＡＡＧＧＴＴＧＡＴＣ−３’（配列番号７３））。これらのプライマーを用い、ｐＤＯＮＲ−ＫＩＡＡ１０６３を鋳型として使用し、酵素にはＰｆｕターボＤＮＡポリメラーゼを使用して、ＰＣＲ反応を行った。このＰＣＲ産物を制限酵素（ＤｐｎＩ）で消化した後、コンピテントセル（ＪＭ１０９）にトランスフォーメーションし、カナマイシン含有ＬＢ−プレートに播種し、ｐＤＯＮＲ−ｍｕｔ−ＫＩＡＡ１０６３を獲得した。変異の導入をシーケンシングにて確認し、ｐＤＯＮＲ−ｍｕｔ−ＫＩＡＡ１０６３とｐＤＥＳＴ１７ベクターを用い、ＬＲクロナーゼエンザイムミックスを使用して室温で１時間反応させた。この反応液をコンピテントセル（ＢＬ２１−ＳＩ）にトランスフォーメーションし、アンピシリン含有ＬＢ−プレートに播種し、Ｈｉｓ−タグが付加されたＫＩＡＡ１０６３変異体蛋白質発現ベクター（ｐＤＥＳＴ１７−ｍｕｔ−ＫＩＡＡ１０６３）を獲得した。これを上記同様に各種基質発現用プラスミドを導入した大腸菌ＢＬ２１−ＳＩコンピテントセルに形質転換させて組換え大腸菌を得た。その結果、Ｃ１７４Ａ変異体では活性が消失し、本活性がＣｙｓｂｏｘ中の^１７４Ｃｙｓによるものであることが明らかとなった（図２４）。ここで、ＫＩＡＡ１０６３^{Ｃ１７４Ａ}の発現を確認したところ、野生型（ＫＩＡＡ１０６３）と同レベルの発現が認められたことから、活性の消失は発現量の差ではないことが判明した。

【図２２】ＫＩＡＡ１０６３についてＵｂ−Ｍ−ＧＳＴ融合蛋白質の分解活性を共発現系で検討した結果を示す図である。レ−ン１はＮａＣｌ非誘導時のＫＩＡＡ１０６３、レーン２は０．０５ＭのＮａＣｌで誘導時のＫＩＡＡ１０６３、レーン３は０．１ＭのＮａＣｌで誘導時のＫＩＡＡ１０６３、レーン４は０．２ＭのＮａＣｌで誘導時のＫＩＡＡ１０６３、レーン５は０．３ＭのＮａＣｌで誘導時のＫＩＡＡ１０６３、レーンＭは分子量マーカーを表す。

【図２３】ＫＩＡＡ１０６３について、Ｕｂ−Ｍ−ＧＳＴ、Ｕｂ−Ｒ−ＧＳＴ、Ｕｂ−Ｉ−ＧＳＴ、Ｕｂ−Ｐ−ＧＳＴ各融合蛋白質の分解活性を共発現系で比較検討した結果を示す図である。レーン１から４はそれぞれ０．１ＭのＮａＣｌで誘導時のＫＩＡＡ１０６３、レーン５から８は非誘導時のＫＩＡＡ１０６３を示す。レーン１および５はＵｂ−Ｍ−ＧＳＴ、レーン２および６はＵｂ−Ｒ−ＧＳＴは、レーン３および７はＵｂ−Ｉ−ＧＳＴ、レーン４および８はＵｂ−Ｐ−ＧＳＴを示す。

【図２４】ＫＩＡＡ１０６３^{Ｃ１７４Ｓ}についてＵｂ−Ｍ−ＧＳＴ融合蛋白質の分解活性をインビトロで、野生型ＫＩＡＡ１０６３と比較検討した結果を示す図である。Ａは各タンパク質の発現を確認した結果を、Ｂは分解活性の結果を示す。レーン１から５はそれぞれ０．１ＭのＮａＣｌで誘導時の各蛋白質、レーン６から１０は非誘導時の各蛋白質を示す。レーンＭは分子量マーカーを表す。レ−ン１および６はＫＩＡＡ１０６３＃１、レ−ン２および７はＫＩＡＡ１０６３＃２、レ−ン３および８はＫＩＡＡ１０６３^{Ｃ１７４Ｓ}＃１、レ−ン４および９はＫＩＡＡ１０６３^{Ｃ１７４Ｓ}＃２、レーン５および１０は陽性対照であるＫＩＡＡ０５２９である。