HU211911A9 - A-típusú humán monoamin-oxidázt meghatározó DNS Az átmeneti oltalom az 1-5. igénypontokra vonatkozik. - Google Patents
A-típusú humán monoamin-oxidázt meghatározó DNS Az átmeneti oltalom az 1-5. igénypontokra vonatkozik. Download PDFInfo
- Publication number
- HU211911A9 HU211911A9 HU9500593P HU9500593P HU211911A9 HU 211911 A9 HU211911 A9 HU 211911A9 HU 9500593 P HU9500593 P HU 9500593P HU 9500593 P HU9500593 P HU 9500593P HU 211911 A9 HU211911 A9 HU 211911A9
- Authority
- HU
- Hungary
- Prior art keywords
- mao
- dna
- human
- cell
- gene
- Prior art date
Links
- 101000694718 Homo sapiens Amine oxidase [flavin-containing] A Proteins 0.000 title claims description 37
- 108020004414 DNA Proteins 0.000 claims description 59
- 210000004027 cell Anatomy 0.000 claims description 40
- 239000002299 complementary DNA Substances 0.000 claims description 34
- 238000000034 method Methods 0.000 claims description 28
- 239000013598 vector Substances 0.000 claims description 20
- 108010076504 Protein Sorting Signals Proteins 0.000 claims description 9
- 210000004962 mammalian cell Anatomy 0.000 claims description 7
- 102100028661 Amine oxidase [flavin-containing] A Human genes 0.000 claims description 6
- 108091028043 Nucleic acid sequence Proteins 0.000 claims description 5
- 230000001580 bacterial effect Effects 0.000 claims description 5
- 102000000154 human monoamine oxidase A Human genes 0.000 claims description 5
- 210000005253 yeast cell Anatomy 0.000 claims description 4
- 230000008569 process Effects 0.000 claims description 3
- 238000012258 culturing Methods 0.000 claims description 2
- 238000002360 preparation method Methods 0.000 claims description 2
- 101710185917 Amine oxidase [flavin-containing] A Proteins 0.000 claims 3
- 108010062431 Monoamine oxidase Proteins 0.000 description 138
- 102000010909 Monoamine Oxidase Human genes 0.000 description 114
- 108090000623 proteins and genes Proteins 0.000 description 36
- 229920002477 rna polymer Polymers 0.000 description 29
- 239000000523 sample Substances 0.000 description 28
- 108020004635 Complementary DNA Proteins 0.000 description 23
- 238000010804 cDNA synthesis Methods 0.000 description 23
- 239000012634 fragment Substances 0.000 description 23
- 108090000765 processed proteins & peptides Proteins 0.000 description 21
- 241000283690 Bos taurus Species 0.000 description 15
- 102000004196 processed proteins & peptides Human genes 0.000 description 15
- 150000001413 amino acids Chemical group 0.000 description 13
- 230000035772 mutation Effects 0.000 description 13
- 239000002773 nucleotide Substances 0.000 description 13
- 125000003729 nucleotide group Chemical group 0.000 description 13
- 229920001184 polypeptide Polymers 0.000 description 13
- 241000588724 Escherichia coli Species 0.000 description 12
- 240000004808 Saccharomyces cerevisiae Species 0.000 description 12
- 235000014680 Saccharomyces cerevisiae Nutrition 0.000 description 12
- 208000037265 diseases, disorders, signs and symptoms Diseases 0.000 description 11
- 108091008146 restriction endonucleases Proteins 0.000 description 11
- 108091034117 Oligonucleotide Proteins 0.000 description 10
- 210000004185 liver Anatomy 0.000 description 10
- 238000009396 hybridization Methods 0.000 description 9
- 102000004169 proteins and genes Human genes 0.000 description 9
- 108091026890 Coding region Proteins 0.000 description 8
- 201000010099 disease Diseases 0.000 description 8
- 108020002230 Pancreatic Ribonuclease Proteins 0.000 description 7
- 102000005891 Pancreatic ribonuclease Human genes 0.000 description 7
- 238000003776 cleavage reaction Methods 0.000 description 7
- 230000000694 effects Effects 0.000 description 7
- 238000007894 restriction fragment length polymorphism technique Methods 0.000 description 7
- 244000309466 calf Species 0.000 description 6
- 230000000295 complement effect Effects 0.000 description 6
- 230000002950 deficient Effects 0.000 description 6
- 239000013612 plasmid Substances 0.000 description 6
- 239000000047 product Substances 0.000 description 6
- 230000008707 rearrangement Effects 0.000 description 6
- 230000001105 regulatory effect Effects 0.000 description 6
- 238000013518 transcription Methods 0.000 description 6
- 230000035897 transcription Effects 0.000 description 6
- 238000012546 transfer Methods 0.000 description 6
- 241000700605 Viruses Species 0.000 description 5
- 229940082992 antihypertensives mao inhibitors Drugs 0.000 description 5
- 238000012217 deletion Methods 0.000 description 5
- 230000037430 deletion Effects 0.000 description 5
- 230000029087 digestion Effects 0.000 description 5
- 238000002955 isolation Methods 0.000 description 5
- 239000002899 monoamine oxidase inhibitor Substances 0.000 description 5
- 210000002826 placenta Anatomy 0.000 description 5
- 210000001519 tissue Anatomy 0.000 description 5
- ZHNUHDYFZUAESO-UHFFFAOYSA-N Formamide Chemical compound NC=O ZHNUHDYFZUAESO-UHFFFAOYSA-N 0.000 description 4
- 101000768078 Homo sapiens Amine oxidase [flavin-containing] B Proteins 0.000 description 4
- DBMJMQXJHONAFJ-UHFFFAOYSA-M Sodium laurylsulphate Chemical compound [Na+].CCCCCCCCCCCCOS([O-])(=O)=O DBMJMQXJHONAFJ-UHFFFAOYSA-M 0.000 description 4
- IXKSXJFAGXLQOQ-XISFHERQSA-N WHWLQLKPGQPMY Chemical compound C([C@@H](C(=O)N[C@@H](CC=1C2=CC=CC=C2NC=1)C(=O)N[C@@H](CC(C)C)C(=O)N[C@@H](CCC(N)=O)C(=O)N[C@@H](CC(C)C)C(=O)N1CCC[C@H]1C(=O)NCC(=O)N[C@@H](CCC(N)=O)C(=O)N[C@@H](CC(O)=O)C(=O)N1CCC[C@H]1C(=O)N[C@@H](CCSC)C(=O)N[C@@H](CC=1C=CC(O)=CC=1)C(O)=O)NC(=O)[C@@H](N)CC=1C2=CC=CC=C2NC=1)C1=CNC=N1 IXKSXJFAGXLQOQ-XISFHERQSA-N 0.000 description 4
- 238000003745 diagnosis Methods 0.000 description 4
- 230000007017 scission Effects 0.000 description 4
- 235000019333 sodium laurylsulphate Nutrition 0.000 description 4
- 108091032973 (ribonucleotides)n+m Proteins 0.000 description 3
- 208000020925 Bipolar disease Diseases 0.000 description 3
- 101000694730 Bos taurus Amine oxidase [flavin-containing] B Proteins 0.000 description 3
- 108020004705 Codon Proteins 0.000 description 3
- 108020005187 Oligonucleotide Probes Proteins 0.000 description 3
- 208000028017 Psychotic disease Diseases 0.000 description 3
- 230000002159 abnormal effect Effects 0.000 description 3
- 230000001919 adrenal effect Effects 0.000 description 3
- 208000028683 bipolar I disease Diseases 0.000 description 3
- 239000003184 complementary RNA Substances 0.000 description 3
- 208000035475 disorder Diseases 0.000 description 3
- 235000013305 food Nutrition 0.000 description 3
- 230000004927 fusion Effects 0.000 description 3
- 239000002609 medium Substances 0.000 description 3
- 239000002751 oligonucleotide probe Substances 0.000 description 3
- 238000012163 sequencing technique Methods 0.000 description 3
- 238000012360 testing method Methods 0.000 description 3
- 230000001225 therapeutic effect Effects 0.000 description 3
- 230000014621 translational initiation Effects 0.000 description 3
- PLRACCBDVIHHLZ-UHFFFAOYSA-N 1-methyl-4-phenyl-1,2,3,6-tetrahydropyridine Chemical compound C1N(C)CCC(C=2C=CC=CC=2)=C1 PLRACCBDVIHHLZ-UHFFFAOYSA-N 0.000 description 2
- GFFGJBXGBJISGV-UHFFFAOYSA-N Adenine Chemical compound NC1=NC=NC2=C1N=CN2 GFFGJBXGBJISGV-UHFFFAOYSA-N 0.000 description 2
- 102100028116 Amine oxidase [flavin-containing] B Human genes 0.000 description 2
- 101100136076 Aspergillus oryzae (strain ATCC 42149 / RIB 40) pel1 gene Proteins 0.000 description 2
- 102000053602 DNA Human genes 0.000 description 2
- 102000004190 Enzymes Human genes 0.000 description 2
- 108090000790 Enzymes Proteins 0.000 description 2
- NPBGTPKLVJEOBE-IUCAKERBSA-N Lys-Arg Chemical compound NCCCC[C@H](N)C(=O)N[C@H](C(O)=O)CCCNC(N)=N NPBGTPKLVJEOBE-IUCAKERBSA-N 0.000 description 2
- 241001465754 Metazoa Species 0.000 description 2
- 239000000020 Nitrocellulose Substances 0.000 description 2
- 208000025464 Norrie disease Diseases 0.000 description 2
- 108010079246 OMPA outer membrane proteins Proteins 0.000 description 2
- 108091005804 Peptidases Proteins 0.000 description 2
- 101710118538 Protease Proteins 0.000 description 2
- 101100084022 Pseudomonas aeruginosa (strain ATCC 15692 / DSM 22644 / CIP 104116 / JCM 14847 / LMG 12228 / 1C / PRS 101 / PAO1) lapA gene Proteins 0.000 description 2
- 108091034057 RNA (poly(A)) Proteins 0.000 description 2
- 101100173636 Rattus norvegicus Fhl2 gene Proteins 0.000 description 2
- 108020004511 Recombinant DNA Proteins 0.000 description 2
- 102000006382 Ribonucleases Human genes 0.000 description 2
- 108010083644 Ribonucleases Proteins 0.000 description 2
- 108091081021 Sense strand Proteins 0.000 description 2
- 238000002105 Southern blotting Methods 0.000 description 2
- 210000001766 X chromosome Anatomy 0.000 description 2
- 150000001412 amines Chemical class 0.000 description 2
- 238000004458 analytical method Methods 0.000 description 2
- 239000001506 calcium phosphate Substances 0.000 description 2
- 229910000389 calcium phosphate Inorganic materials 0.000 description 2
- 235000011010 calcium phosphates Nutrition 0.000 description 2
- 238000006243 chemical reaction Methods 0.000 description 2
- 150000001875 compounds Chemical class 0.000 description 2
- 210000004748 cultured cell Anatomy 0.000 description 2
- 230000009615 deamination Effects 0.000 description 2
- 238000006481 deamination reaction Methods 0.000 description 2
- 230000007547 defect Effects 0.000 description 2
- 238000013461 design Methods 0.000 description 2
- 229940039227 diagnostic agent Drugs 0.000 description 2
- 239000000032 diagnostic agent Substances 0.000 description 2
- VYFYYTLLBUKUHU-UHFFFAOYSA-N dopamine Chemical compound NCCC1=CC=C(O)C(O)=C1 VYFYYTLLBUKUHU-UHFFFAOYSA-N 0.000 description 2
- 229940079593 drug Drugs 0.000 description 2
- 239000003814 drug Substances 0.000 description 2
- 229940088598 enzyme Drugs 0.000 description 2
- 238000002474 experimental method Methods 0.000 description 2
- 239000013604 expression vector Substances 0.000 description 2
- 210000002950 fibroblast Anatomy 0.000 description 2
- 238000001415 gene therapy Methods 0.000 description 2
- UYTPUPDQBNUYGX-UHFFFAOYSA-N guanine Chemical compound O=C1NC(N)=NC2=C1N=CN2 UYTPUPDQBNUYGX-UHFFFAOYSA-N 0.000 description 2
- QRMZSPFSDQBLIX-UHFFFAOYSA-N homovanillic acid Chemical compound COC1=CC(CC(O)=O)=CC=C1O QRMZSPFSDQBLIX-UHFFFAOYSA-N 0.000 description 2
- 238000003780 insertion Methods 0.000 description 2
- 230000037431 insertion Effects 0.000 description 2
- 238000004519 manufacturing process Methods 0.000 description 2
- 238000005259 measurement Methods 0.000 description 2
- 244000005700 microbiome Species 0.000 description 2
- 239000000203 mixture Substances 0.000 description 2
- 229920001220 nitrocellulos Polymers 0.000 description 2
- 108020004707 nucleic acids Proteins 0.000 description 2
- 102000039446 nucleic acids Human genes 0.000 description 2
- 150000007523 nucleic acids Chemical class 0.000 description 2
- 238000007833 oxidative deamination reaction Methods 0.000 description 2
- 101150040383 pel2 gene Proteins 0.000 description 2
- 101150050446 pelB gene Proteins 0.000 description 2
- 101150009573 phoA gene Proteins 0.000 description 2
- 230000003169 placental effect Effects 0.000 description 2
- 238000002264 polyacrylamide gel electrophoresis Methods 0.000 description 2
- 238000003752 polymerase chain reaction Methods 0.000 description 2
- 239000002243 precursor Substances 0.000 description 2
- 230000002797 proteolythic effect Effects 0.000 description 2
- 208000020016 psychiatric disease Diseases 0.000 description 2
- 239000011541 reaction mixture Substances 0.000 description 2
- 230000008439 repair process Effects 0.000 description 2
- 150000003839 salts Chemical class 0.000 description 2
- 230000028327 secretion Effects 0.000 description 2
- 230000035945 sensitivity Effects 0.000 description 2
- QZAYGJVTTNCVMB-UHFFFAOYSA-N serotonin Chemical compound C1=C(O)C=C2C(CCN)=CNC2=C1 QZAYGJVTTNCVMB-UHFFFAOYSA-N 0.000 description 2
- 239000000243 solution Substances 0.000 description 2
- 230000009466 transformation Effects 0.000 description 2
- QORWJWZARLRLPR-UHFFFAOYSA-H tricalcium bis(phosphate) Chemical compound [Ca+2].[Ca+2].[Ca+2].[O-]P([O-])([O-])=O.[O-]P([O-])([O-])=O QORWJWZARLRLPR-UHFFFAOYSA-H 0.000 description 2
- 230000003612 virological effect Effects 0.000 description 2
- SFLSHLFXELFNJZ-QMMMGPOBSA-N (-)-norepinephrine Chemical compound NC[C@H](O)C1=CC=C(O)C(O)=C1 SFLSHLFXELFNJZ-QMMMGPOBSA-N 0.000 description 1
- DIGQNXIGRZPYDK-WKSCXVIASA-N (2R)-6-amino-2-[[2-[[(2S)-2-[[2-[[(2R)-2-[[(2S)-2-[[(2R,3S)-2-[[2-[[(2S)-2-[[2-[[(2S)-2-[[(2S)-2-[[(2R)-2-[[(2S,3S)-2-[[(2R)-2-[[(2S)-2-[[(2S)-2-[[(2S)-2-[[2-[[(2S)-2-[[(2R)-2-[[2-[[2-[[2-[(2-amino-1-hydroxyethylidene)amino]-3-carboxy-1-hydroxypropylidene]amino]-1-hydroxy-3-sulfanylpropylidene]amino]-1-hydroxyethylidene]amino]-1-hydroxy-3-sulfanylpropylidene]amino]-1,3-dihydroxypropylidene]amino]-1-hydroxyethylidene]amino]-1-hydroxypropylidene]amino]-1,3-dihydroxypropylidene]amino]-1,3-dihydroxypropylidene]amino]-1-hydroxy-3-sulfanylpropylidene]amino]-1,3-dihydroxybutylidene]amino]-1-hydroxy-3-sulfanylpropylidene]amino]-1-hydroxypropylidene]amino]-1,3-dihydroxypropylidene]amino]-1-hydroxyethylidene]amino]-1,5-dihydroxy-5-iminopentylidene]amino]-1-hydroxy-3-sulfanylpropylidene]amino]-1,3-dihydroxybutylidene]amino]-1-hydroxy-3-sulfanylpropylidene]amino]-1,3-dihydroxypropylidene]amino]-1-hydroxyethylidene]amino]-1-hydroxy-3-sulfanylpropylidene]amino]-1-hydroxyethylidene]amino]hexanoic acid Chemical compound C[C@@H]([C@@H](C(=N[C@@H](CS)C(=N[C@@H](C)C(=N[C@@H](CO)C(=NCC(=N[C@@H](CCC(=N)O)C(=NC(CS)C(=N[C@H]([C@H](C)O)C(=N[C@H](CS)C(=N[C@H](CO)C(=NCC(=N[C@H](CS)C(=NCC(=N[C@H](CCCCN)C(=O)O)O)O)O)O)O)O)O)O)O)O)O)O)O)N=C([C@H](CS)N=C([C@H](CO)N=C([C@H](CO)N=C([C@H](C)N=C(CN=C([C@H](CO)N=C([C@H](CS)N=C(CN=C(C(CS)N=C(C(CC(=O)O)N=C(CN)O)O)O)O)O)O)O)O)O)O)O)O DIGQNXIGRZPYDK-WKSCXVIASA-N 0.000 description 1
- FBWPWWWZWKPJFL-UHFFFAOYSA-N 3-Methoxy-4-hydroxyphenylethyleneglycol Chemical compound COC1=CC(C(O)CO)=CC=C1O FBWPWWWZWKPJFL-UHFFFAOYSA-N 0.000 description 1
- 101800000263 Acidic protein Proteins 0.000 description 1
- 101100295756 Acinetobacter baumannii (strain ATCC 19606 / DSM 30007 / JCM 6841 / CCUG 19606 / CIP 70.34 / NBRC 109757 / NCIMB 12457 / NCTC 12156 / 81) omp38 gene Proteins 0.000 description 1
- 229930024421 Adenine Natural products 0.000 description 1
- 229920000936 Agarose Polymers 0.000 description 1
- 102000002260 Alkaline Phosphatase Human genes 0.000 description 1
- 108020004774 Alkaline Phosphatase Proteins 0.000 description 1
- 241000972773 Aulopiformes Species 0.000 description 1
- 101000694720 Bos taurus Amine oxidase [flavin-containing] A Proteins 0.000 description 1
- 108091003079 Bovine Serum Albumin Proteins 0.000 description 1
- 241000252203 Clupea harengus Species 0.000 description 1
- 108700010070 Codon Usage Proteins 0.000 description 1
- 108091035707 Consensus sequence Proteins 0.000 description 1
- 108020003215 DNA Probes Proteins 0.000 description 1
- 239000003298 DNA probe Substances 0.000 description 1
- 102000016928 DNA-directed DNA polymerase Human genes 0.000 description 1
- 108010014303 DNA-directed DNA polymerase Proteins 0.000 description 1
- KCXVZYZYPLLWCC-UHFFFAOYSA-N EDTA Chemical compound OC(=O)CN(CC(O)=O)CCN(CC(O)=O)CC(O)=O KCXVZYZYPLLWCC-UHFFFAOYSA-N 0.000 description 1
- 238000012286 ELISA Assay Methods 0.000 description 1
- 241000206602 Eukaryota Species 0.000 description 1
- 108700024394 Exon Proteins 0.000 description 1
- 108010054147 Hemoglobins Proteins 0.000 description 1
- 208000026350 Inborn Genetic disease Diseases 0.000 description 1
- 108010044467 Isoenzymes Proteins 0.000 description 1
- 108091026898 Leader sequence (mRNA) Proteins 0.000 description 1
- 208000036626 Mental retardation Diseases 0.000 description 1
- 102000003792 Metallothionein Human genes 0.000 description 1
- 108090000157 Metallothionein Proteins 0.000 description 1
- 101710138657 Neurotoxin Proteins 0.000 description 1
- 108700026244 Open Reading Frames Proteins 0.000 description 1
- 208000018737 Parkinson disease Diseases 0.000 description 1
- 102000035195 Peptidases Human genes 0.000 description 1
- 108010033276 Peptide Fragments Proteins 0.000 description 1
- 102000007079 Peptide Fragments Human genes 0.000 description 1
- 241000276498 Pollachius virens Species 0.000 description 1
- 108010021757 Polynucleotide 5'-Hydroxyl-Kinase Proteins 0.000 description 1
- 102000008422 Polynucleotide 5'-hydroxyl-kinase Human genes 0.000 description 1
- 239000004365 Protease Substances 0.000 description 1
- 206010037180 Psychiatric symptoms Diseases 0.000 description 1
- 230000006819 RNA synthesis Effects 0.000 description 1
- 108091081062 Repeated sequence (DNA) Proteins 0.000 description 1
- 102100037486 Reverse transcriptase/ribonuclease H Human genes 0.000 description 1
- 238000012300 Sequence Analysis Methods 0.000 description 1
- 108020005038 Terminator Codon Proteins 0.000 description 1
- 102000004142 Trypsin Human genes 0.000 description 1
- 108090000631 Trypsin Proteins 0.000 description 1
- 108091000117 Tyrosine 3-Monooxygenase Proteins 0.000 description 1
- 102000048218 Tyrosine 3-monooxygenases Human genes 0.000 description 1
- CGQCWMIAEPEHNQ-UHFFFAOYSA-N Vanillylmandelic acid Chemical compound COC1=CC(C(O)C(O)=O)=CC=C1O CGQCWMIAEPEHNQ-UHFFFAOYSA-N 0.000 description 1
- 230000005856 abnormality Effects 0.000 description 1
- 239000002253 acid Substances 0.000 description 1
- 238000010306 acid treatment Methods 0.000 description 1
- 229960000643 adenine Drugs 0.000 description 1
- 230000000692 anti-sense effect Effects 0.000 description 1
- 239000000935 antidepressant agent Substances 0.000 description 1
- 229940005513 antidepressants Drugs 0.000 description 1
- 101150042295 arfA gene Proteins 0.000 description 1
- 238000003556 assay Methods 0.000 description 1
- 238000000376 autoradiography Methods 0.000 description 1
- 230000037429 base substitution Effects 0.000 description 1
- 230000003115 biocidal effect Effects 0.000 description 1
- 230000015572 biosynthetic process Effects 0.000 description 1
- 230000036983 biotransformation Effects 0.000 description 1
- 210000000601 blood cell Anatomy 0.000 description 1
- 230000037396 body weight Effects 0.000 description 1
- 210000001185 bone marrow Anatomy 0.000 description 1
- 239000002775 capsule Substances 0.000 description 1
- 125000003178 carboxy group Chemical group [H]OC(*)=O 0.000 description 1
- 150000003943 catecholamines Chemical class 0.000 description 1
- 238000004113 cell culture Methods 0.000 description 1
- 239000013592 cell lysate Substances 0.000 description 1
- 230000001413 cellular effect Effects 0.000 description 1
- 238000010367 cloning Methods 0.000 description 1
- 238000012937 correction Methods 0.000 description 1
- 239000013601 cosmid vector Substances 0.000 description 1
- 230000008878 coupling Effects 0.000 description 1
- 238000010168 coupling process Methods 0.000 description 1
- 238000005859 coupling reaction Methods 0.000 description 1
- SUYVUBYJARFZHO-RRKCRQDMSA-N dATP Chemical compound C1=NC=2C(N)=NC=NC=2N1[C@H]1C[C@H](O)[C@@H](COP(O)(=O)OP(O)(=O)OP(O)(O)=O)O1 SUYVUBYJARFZHO-RRKCRQDMSA-N 0.000 description 1
- SUYVUBYJARFZHO-UHFFFAOYSA-N dATP Natural products C1=NC=2C(N)=NC=NC=2N1C1CC(O)C(COP(O)(=O)OP(O)(=O)OP(O)(O)=O)O1 SUYVUBYJARFZHO-UHFFFAOYSA-N 0.000 description 1
- 230000007850 degeneration Effects 0.000 description 1
- 238000001514 detection method Methods 0.000 description 1
- 238000011161 development Methods 0.000 description 1
- 229960000633 dextran sulfate Drugs 0.000 description 1
- 229960003638 dopamine Drugs 0.000 description 1
- 238000009585 enzyme analysis Methods 0.000 description 1
- 108010052305 exodeoxyribonuclease III Proteins 0.000 description 1
- 239000012091 fetal bovine serum Substances 0.000 description 1
- 208000016361 genetic disease Diseases 0.000 description 1
- 230000002068 genetic effect Effects 0.000 description 1
- 238000010353 genetic engineering Methods 0.000 description 1
- 239000001963 growth medium Substances 0.000 description 1
- 235000019514 herring Nutrition 0.000 description 1
- 229940088597 hormone Drugs 0.000 description 1
- 239000005556 hormone Substances 0.000 description 1
- 210000004090 human X chromosome Anatomy 0.000 description 1
- 238000001727 in vivo Methods 0.000 description 1
- 230000001939 inductive effect Effects 0.000 description 1
- 208000015181 infectious disease Diseases 0.000 description 1
- 230000005764 inhibitory process Effects 0.000 description 1
- 238000010253 intravenous injection Methods 0.000 description 1
- 210000004698 lymphocyte Anatomy 0.000 description 1
- 239000006166 lysate Substances 0.000 description 1
- 101150057280 mao gene Proteins 0.000 description 1
- 238000013507 mapping Methods 0.000 description 1
- 230000035800 maturation Effects 0.000 description 1
- 239000012528 membrane Substances 0.000 description 1
- 230000003340 mental effect Effects 0.000 description 1
- 230000002503 metabolic effect Effects 0.000 description 1
- 239000002207 metabolite Substances 0.000 description 1
- 210000001700 mitochondrial membrane Anatomy 0.000 description 1
- 230000004048 modification Effects 0.000 description 1
- 238000012986 modification Methods 0.000 description 1
- 238000010369 molecular cloning Methods 0.000 description 1
- 210000000653 nervous system Anatomy 0.000 description 1
- 230000001537 neural effect Effects 0.000 description 1
- 210000005044 neurofilament Anatomy 0.000 description 1
- 239000002581 neurotoxin Substances 0.000 description 1
- 231100000618 neurotoxin Toxicity 0.000 description 1
- 239000002858 neurotransmitter agent Substances 0.000 description 1
- 229960002748 norepinephrine Drugs 0.000 description 1
- SFLSHLFXELFNJZ-UHFFFAOYSA-N norepinephrine Natural products NCC(O)C1=CC=C(O)C(O)=C1 SFLSHLFXELFNJZ-UHFFFAOYSA-N 0.000 description 1
- 101150087557 omcB gene Proteins 0.000 description 1
- 101150115693 ompA gene Proteins 0.000 description 1
- 239000002245 particle Substances 0.000 description 1
- 108010087558 pectate lyase Proteins 0.000 description 1
- 210000001322 periplasm Anatomy 0.000 description 1
- 239000013600 plasmid vector Substances 0.000 description 1
- 229920002401 polyacrylamide Polymers 0.000 description 1
- 230000008488 polyadenylation Effects 0.000 description 1
- 229940024999 proteolytic enzymes for treatment of wounds and ulcers Drugs 0.000 description 1
- 238000000746 purification Methods 0.000 description 1
- 230000002285 radioactive effect Effects 0.000 description 1
- 230000003252 repetitive effect Effects 0.000 description 1
- 238000011160 research Methods 0.000 description 1
- 230000001177 retroviral effect Effects 0.000 description 1
- 235000019515 salmon Nutrition 0.000 description 1
- 238000012216 screening Methods 0.000 description 1
- 239000013606 secretion vector Substances 0.000 description 1
- 229940076279 serotonin Drugs 0.000 description 1
- 239000013605 shuttle vector Substances 0.000 description 1
- 210000004927 skin cell Anatomy 0.000 description 1
- 210000001626 skin fibroblast Anatomy 0.000 description 1
- 239000001488 sodium phosphate Substances 0.000 description 1
- 229910000162 sodium phosphate Inorganic materials 0.000 description 1
- 210000002784 stomach Anatomy 0.000 description 1
- 239000006228 supernatant Substances 0.000 description 1
- 208000024891 symptom Diseases 0.000 description 1
- 238000003786 synthesis reaction Methods 0.000 description 1
- 238000002560 therapeutic procedure Methods 0.000 description 1
- 230000005030 transcription termination Effects 0.000 description 1
- 230000002103 transcriptional effect Effects 0.000 description 1
- 230000001131 transforming effect Effects 0.000 description 1
- 238000013519 translation Methods 0.000 description 1
- RYFMWSXOAZQYPI-UHFFFAOYSA-K trisodium phosphate Chemical compound [Na+].[Na+].[Na+].[O-]P([O-])([O-])=O RYFMWSXOAZQYPI-UHFFFAOYSA-K 0.000 description 1
- 239000012588 trypsin Substances 0.000 description 1
- 241000701161 unidentified adenovirus Species 0.000 description 1
- 210000002700 urine Anatomy 0.000 description 1
- 239000013603 viral vector Substances 0.000 description 1
- 230000000007 visual effect Effects 0.000 description 1
- 238000005406 washing Methods 0.000 description 1
Landscapes
- Preparation Of Compounds By Using Micro-Organisms (AREA)
- Micro-Organisms Or Cultivation Processes Thereof (AREA)
Description
A találmány a NIH által odaítélt NS 21 921 sz. kormánytámogatással került kidolgozásra. A kormány ezért a találmánnyal kapcsolatban bizonyos jogokkal rendelkezik.
A találmány humán monoamin-oxidáz A-ra és rekombináns dezoxi-ribonukleinsav technikákra vonatkozik.
A találmány háttere
A monoamin-oxidáz (monoamino: O2 oxido-reduktáz EC 1.4.3.4.; MAO) nagyszámú táplálékként szolgáló amin és neurotranszmitter (mint például a dopamin, norepinefrin vagy szerotonin) oxidatív dezaminációját katalizálja. A monoamin-oxidáz a külső mitokondriális membrán egy belső proteinje, és minden típusú sejtben jelen van. Két izoenzim alakot (A és B típus) azonosítottak, és tudományos vélemények szerint ezek hasonló, de nem azonos proteinek.
A MAO több neurofiziológiás megbetegedésben szerepet játszik, a MAO inhibitorokat antidepresszánsként használják. A MAO-B metabolizálja az 1 -metil-4fenil-l,2,3,6-tetrahidro-piridin (MPTP) neurotoxint, az átalakulás után a molekula egy aktív alakja jön létre, amely szerepet játszik a Parkinson-kór szimptómáinak megjelenésében (Markey és munkatársai, 1984). Különböző pszichiátriás zavarokkal küszködő páciensekben a normális MAO aktivitással alacsonyabb értékeket figyeltek meg.
A humán MAO-A és MAO-B proteineket valószínűleg olyan, egymástól elkülönült gének kódolják, amelyek szorosan kötődnek az X kromoszómához. A humán X kromoszóma Xpll.3 régiójának szubmikroszkopikus deléciójakor az ember MAO-A és MAO-B aktivitása elveszik.
A találmány összefoglalása
Általánosságban szólva, a találmány tárgya egy olyan vektor dezoxi-ribonukleinsav, amely érett humán monoamin-oxidáz A (MAO-A) proteint meghatározó szakaszt tartalmaz. Ahogy az a későbbiek során nyilvánvalóvá lesz, az „érett humán monoamin-oxidáz A” kifejezés alatt biológiailag aktív MAO-A molekulát értünk; így a leírásban használt kifejezés elég széles ahhoz, hogy beleértsük azt a dezoxi-ribonukleinsav szekvenciát (genomi vagy előnyösebben cDNS), amely legalább az érett humán MAO-A molekulát kódolja, és amely kódolhat ezenkívül humán vagy más (például borjú, élesztő vagy baktérium) szignál szekvenciákat vagy hibrid szignál szekvenciákat.
Előnyösen Escherichia coli sejtekben a MAO-A polipeptid expressziójára olyan MAO-A dezoxi-ribonukleinsavat használunk, amely szabályozó DNS kontrollja alatt áll, ez a szabályozó szekvencia pedig egy promoterből és egy szignál peptidet meghatározó szekvenciából áll; előnyösen a lac promotert és az OmpA, phoA vagy pelB szignál szekvenciát használjuk. Az élesztőben történő kifejezéshez a MAO-A dezoxi-ribonukleinsav az MFalfal promoter és szignál szekvencia szabályozása alatt áll. Emlős sejtekben a MAO-A dezoxi-ribonukleinsav egy vírus hosszú terminális ismétlődő (LTR) szekvenciájának szabályozása alatt áll.
AMAO-Adezoxi-ribonukleinsavat terápiás célokra használhatjuk, továbbá olyan betegségek diagnosztizálásakor, amelyekben a MAO-A és MAO-B gén termékei szerepet játszanak, például a MAO-A gén valószínűleg a mentális retardációkban és betegségekben szerepet játszik, ezért a dezoxi-ribonukleinsav vagy ribonukleinsav diagnosztizáláskor próbaként használható fel a MAO-A gén változásainak vagy pontmutációinak vizsgálatára, továbbá az olyan MAO ribonukleinsav koncentrációk meghatározásakor, amelyek változásai szerepet játszanak a mániás depresszióban vagy pszichotikus állapotokban, köztük azokban, amelyek MAO inhibitorokkal történő kezelést igényelnek. A MAO-A gén terápiásán felhasználható a MAO gén hibáinak génterápiás korrigálásában is.
A találmány szerinti vektorokkal E. coli, élesztő, előnyösen Saccharomyces cerevisiae sejtek vagy emlős sejtek, például NIH3T3 vagy BHK21 sejtek transzformálhatók, amiután biológiailag aktív humán MAO-A keletkezhet. A MAO-A polipepüdet felhasználhatjuk olyan MAO inhibitorok kutatására, amelyeket azután terápiásán használhatunk fel pszichotikus elváltozások kezelésére vagy bizonyos táplálékok emésztésekor felszabaduló monoaminok metabolízálására, olyan páciensek esetén, ahol a monoamin-oxidázt hibás transzmitterként ható gyógyszerekkel gátoljuk. Ezenkívül a tisztított rekombináns MAO-A polipeptidet MAO-hiányos egyének kezelésére is alkalmazhatjuk. Ugyancsak alkalmazható a MAO-A diagnosztikumként oly módon, hogy monoklonális antitesteket készítünk, amelyek azután a humán megbetegedésekkel összefüggő, megváltozott MAO enzim értékek detektálására alkalmas.
A találmány szerinti eljárás előnyös kiviteli módjainak és igénypontjainak leírásából nyilvánvalóvá válnak az eljárás egyéb jellemzői és előnyei is.
A leíráshoz mellékelt ábrák a következők:
Az 1. ábrán egy peptidet mutatunk be, amelyet felhasználhatunk a dezoxi-ribonukleinsav szekvencia megtervezésekor, amely egy szintetikus, 47 tagból álló próba.
A 2. ábrán bemutatjuk a humán MAO-A komplementer dezoxi-ribonukleinsav, HM 11 teljes nukleotid szekvenciáját és a megfelelő aminosav sorrendet.
A találmány előnyös megvalósítási módjai
A humán MAO-A komplementer dezoxi-ribonukleinsavat emberi máj komplementer dezoxi-ribonukleinsavból és emberi méhlepény komplementer dezoxi-ribonukleinsav könyvtárból izoláltuk, amiután ezt a komplementer dezoxi-ribonukleinsavat felhasználtuk a humán genomi kozmid könyvtárból való genomi MAO-A gén izolálására. A humán MAO-A cDNS szekvencia és a genomi dezoxi-ribonukleinsav előállításának stratégiája a következő volt: először a borjú MAO-B peptid fragmenst tisztítottuk és szekvenáltuk, ezután ezt a szekvenciát felhasználva, próbát készítettünk a borjú cDNS könyvtárhoz.
így izolálhattuk a borjú cDNS-t. A borjú cDNS ezek után felhasználható volt a humán komplementer dezoxi-ribonukleinsav könyvtár szkrinelésére, amiután a kapott humán komplementer dezoxi-ribonukleinsavat felhasználva izolálhattuk a humán genomi szekvenciát.
HU 211 911 A9
A borjú MAO cDNS izolálása
A borjú MAO komplementer dezoxi-ribonukleinsav izolálására elkülönítettünk egy MAO cDNS kiónt, amit G1 jellel jelöltünk. A John Powell által kivitelezett izolálási technika során az XOB3 jellel jelölt, tisztított borjú MAO-B fragmens aminosav szekvenciájából indultunk ki. Az 1. ábrán megadjuk az XOB3 peptid aminosav sorrendjét, ebből következtetve terveztük meg a borjú MAO-B 47 tagú szintetikus oligonukleotid szekvenciát. A 47 tagú oligonukleotidot egy Applied Biosystems 380A szintetizátorral állítottuk elő foszfoamidit módszerrel, a terméket poliakril-amid gél-elektroforézissel tisztítottuk. 100 ng oligonukleotidot gamma (32P)-adenozin-trifoszfáttal radioaktívan jelöltünk (7000 Ci/mMol. NEN., Boston, MA) T4-polinukleotidkináz enzimet (Boehringer Mannheim, Indianapolis, Indiana). Az oligonukleotidot degenerációk nélkül szintetizáltuk, a megfelelő aminosavakat meghatározó, leggyakrabban jelentkező kodonfelhasználást figyelembevéve (Grantham és munkatársai, 1980, Nucleic Acids Rés. 8, 49). A 47 tagú oligonukleotidot ezután felhasználtuk a borjú komplementer dezoxi-ribonukleinsav könyvtárának szkrinelésére.
A komplementer dezoxi-ribonukleinsav könyvtár előállítására borjú adrenális velő ribonukleinsavat használtunk, ebből azután a 47 tagú oligonukleotidot próbával vizsgáltunk borjú MAO klón jelenlétére.
A borjú adrenális velőből poli(A)-ribonukleinsavat izoláltunk, és LoMedico és Saunders módszere szerint (1976, Nucleic Acids, Rés., 3, 381) tisztítottuk. Komplementer dezoxi-ribonukleinsav könyvtárat állítottunk elő pBR322 plazmidban Gubler és Hoffman módszer (1983, Gene, 25, 263) szerint. Összesen körülbelül 14 000 különböző kolóniát szkrineltünk. 7 000 kolónia mindegyikét 20 x 20 cm méretű nitrocellulóz szűrőre juttattunk, és Grunstein és Hogness módszere szerint (1975, Proc. Nat. Aca. Sci., 72, 3961) lizáltuk, majd a szűrőket 37 ’C hőmérsékleten 4 órán át hibridizációs pufferban előhibridizáltuk. A hibridizációs puffer az alábbi jelű illetve összetételű: 6 x SSC; 5 x Denhardt; 50 mmol nátrium-foszfát (pH = 6,5); 100 pg/ml forralt hering dezoxi-ribonukleinsav; 20 térfogat% ionmentes formamid; 0,1 g/ml dextrán-szulfát, molekulasúlya: 500 000. Ezután a szűrőket hibridizációs pufferban az oligonukleotiddal (100 000 cpm/ml) hibridizáljuk 37 ’C hőmérsékleten, 12 órán át. 37 ’C hőmérsékleten 30 percen át 1 x SSC/0,1% nátrium-lauril-szulfát-oldattal mossuk, többszöri puffercserével a nitrocellulóz szűrőket, majd intenzifikáló szűrőn át egy éjszakán át -70 ’C hőmérsékleten exponáljuk. A pozitív telepeket kiemeljük, és hasonló körülmények között újra vizsgáljuk.
G1 jellel jelölt, 14 000 komplementer dezoxi-ribonukleinsav klónból kiválasztott egyetlen, erősen hibridizáló kiónt elkülönítettünk, és a plazmid dezoxi-ribonukleinsavat PstI restrikciós enzimmel emésztettük, amiután 500 nukleotidból álló inszertet kaptunk. A borjú és a humán MAO körülbelül 59 650 dalton molekulasúlyú, ez megfelel 527 aminosavnak vagy 1581, a dezoxi-ribonukleinsav kódoló szakaszát alkotó nukleotidnak. Ezért a borjú G1 klón nem kódolja a teljes borjú MAO proteint.
Hosszabb boíjú MAO klón előállítására a G1 kiónt ribonukleinsavvá írtuk át, ezt pedig ezután próbaként használtuk fel a borjú adrenális velőből nyert komplementer dezoxi-ribonukleinsav könyvtár szkrinelésére (a könyvtárt Icangelo és munkatársai szerint állítjuk elő, Natúré, 323, 82, 1986; a szkrinelést pedig Maniatis és munkatársai szerint végezzük, Molecular Cloning, A Laboratory Manual, Cold Spring Harbor, New York). Az 500 kb-ból álló G1 inszertet a pGEM2 vektor (Promega Biotec, Madison, WI) Pstl helyére építjük be, az SP6 fág promotertől 3’-irányban, majd a rekombináns plazmidot használjuk templátként az inszertnek megfelelő komplementer ribonukleinsav próba SP6 promoterrel történő transzkripciójához.
A ribonukleinsav próba hibridizációját a nagyobb borjú komplementer dezoxi-ribonukleinsav könyvtárhoz az alábbi összetételű elegyben végezzük: 20 térfogat% formamid, 6 x SSC, 5 x Denhardt-oldat (lásd előbb), 0,1 tömeg% nátrium-lauril-szulfát, 0,2 mg/ml denaturált lazac sperma dezoxi-ribonukleinsav, 0,2 mg/ml élesztő transzfer ribonukleinsav, 1 mmol etilén-diamin-tetraecetsav. A reakcióelegyet 48 órán át 50 ’C hőmérsékleten inkubáljuk. A szűrőket 2 x SSC/0,1 tömeg% nátrium-lauril-szulfát elegyben mossuk háromszor, a mosást egyenként 10-10 percen át végezzük szobahőmérsékleten, majd megismételjük 50 ’C hőmérsékleten, 30-30 percen át két alkalommal, 0,5 x SSC/0,1 tömeg% nátrium-lauril-szulfát eleggyel.
A 200 000 kolóniából álló könyvtárból 8 pozitív kiónt kapunk, mindegyik vagy egy 2,7, vagy egy 1,2 kb nagyságú inszertet tartalmaz. A restrikciós enzimmel végzett térképezés szerint az 1,2 kb nagyságú inszert a 2,7 kb nagyságú klón része. Egyetlen, 34 - 3A jellel jelölt, 2,7 kb nagyságú kiónt használunk a további kísérletekhez.
A G1 és 34 - 3A borjú kiónok restrikciós fragmenseit M13mpl8 és M13mpl9 plazmidokban szubklónozzuk, és dezoxi-ribonukleinsav szekvenciájukat didezoxi-módszerrel meghatározzuk 35S-jeIzett dATP-t használva (Williams és munkatársai, 1986, Biotechniques, 4, 138; Reed és munkatársai, 1986, Biotechniques, 4, 306). Henikof és munkatársai (Gene, 28, 351, 1984) szerint exonukleáz III enzimmel kezeljük a dezoxi-ribonukleinsavat a szekvencia-analízishez szükséges további kiónok előállítására. A 47 tagból álló oligonukleotid próbával komplementer, 0,5 kb nagyságú inszert régiója kódolja azt a protein szekvenciát, amely azonosítható a megfelelő borjú máj MAO peptiddel, kivéve három eltérést. Ennek e két borjú MAO kiónnak a dezoxi-ribonukleinsavából következő, várható aminosav szekvenciáját összehasonlítva a borjú máj MAO-B tripszines kezelés után kapott peptidjeivel, 73%-os homológiát találunk. Ez azt jelenti, hogy bár a G1 és 34 - 3A kiónokat a MAO-B peptid szekvenciából számított oligonukleotid próbával azonosítottuk, az izolált komplementer dezoxi-ribonukleinsav kiónok MAO-A kiónok.
A humán MAO-A cDNS izolálása
A humán MAO-A komplementer dezoxi-ribonukleinsavat tartalmazó kiónok izolálására humán máj komplementer dezoxi-ribonukleinsavat könyvtárat (Kwok és munkatársai, Biochem., 24, 556, 1985) és humán placenta komplementer dezoxi-ribonukleinsav könyvtárat szkrinelünk, próbaként a 34 - 3A borjú MAO komplementer dezoxi-ribonukleinsav kiónt használjuk. A humán máj mind a MAO-A és MAO-B proteint expresszálja, a placenta viszont csak a MAOA-t. A HM11 jellel jelölt, egyetlen pozitív klón 2,0 kb inszertet hordoz, amely a humán máj könyvtárból származik, ugyanakkor 4 pozitív klón 2,8 kb, 2,5 kb, 0,5 kb és 0,2 kb nagyságú inszertet hordoz a humán placenta könyvtárból.
A könyvtárral való azonosítást a borjú komplementer dezoxi-ribonukleinsav próbával végezzük. A pozitív kiónok inszertjeit M13mpl8 dezoxi-ribonukleinsav vektorba szubklónozzuk, és didezoxi-módszerrel szekvenálunk (Williams és munkatársai, továbbá Reed és munkatársai, lásd előbb). A máj komplementer dezoxiribonukleinsav klón szekvenálásának elősegítésére irányított deléciókat hoztunk létre, és a kétséges régiókat szintetikus helyspecifikus primerekkel helyettesítettük.
A mellékelt 2. ábrán megadjuk a humán májból származó (HM11), 2,0 kb nagyságú cDNS teljes nukleotid szekvenciáját. 527 aminosavat meghatározó, ún. nyitott íremet (open reading frame) tartalmaz, amely az
51. sorszámú nukleotidnál ATG triplettel kezdődik, és az 1632. nukleotidnál TGA triplettel fejeződik be. Ha a 161 aminosavból 156-ot megvizsgálunk a humán placenta MAO-A proteolitikusan kapott peptidjeivel, úgy az aminosavak 97%-a azonos. Arra vonatkozóan, hogy a HM 11 egy MAO-A klón további bizonyítékot jelent az, hogy az összehasonlításkor használt 1,2 kb nagyságú régióban elhelyezkedő humán placenta klón és a HM 11 között több mint 99%-os homológja mutatható ki. Azokon a helyeken, ahol a HM11 és a MAO-A peptidek között eltérés mutatkozik (Asp-150, Asp-153, Gly-224, Gln-225 és Met-231) a két hosszabb placenta klón és a HM 11 máj klón azonos aminosavakat tartalmaz. így igen valószínűtlen, hogy ezek az eltérések a dezoxi-ribonukleinsav klónozásból és a szekvenálás hibáiból erednek; valószínűsíthető, hogy dezoxi-ribonukleinsav polimorfizmussal vagy heterogén MAO-A alegységekkel állunk szemben.
A HM 11 májból származó klón olyan transzlációs iniciációs nukleotidokat tartalmaz, amely a magasabbrendű eukarióták optimális transzlációs iniciációjának megfelelő konszenzus szekvenciával azonosíthatók (Kozák, Cell., 44, 283, 1986); a HM11 első ATG triplettje körül 2 nukleotid, egy adenin három bázissal 5’-irányban (lásd a 2. ábra 48. nukleotidját), továbbá egy guanin közvetlenül 3’-irányban (az 54. nukleotid). A HM 11 mukleotid szekvenciája 88%-os homológiát mutat a borjú MAO-A cDNS molekulával a teljes kódoló régiót figyelembevéve. Ezzel szemben az első ATG triplettöl 5'-irányban a szekvencia teljesen eltérő, 26 nukleotidból csak 11 azonos. Ez megfelel egy 5’nem transzlatálódó régiónak. Az első leolvasási fázisba eső stop kodont a HM 11 szekvenciában 60 nukleotid követi 3’-irányban, ebben két további stop kodon (TGA és TAA) található. A 3’-végen adenin-sorozat látszik, ezt a poliadenilező szignál (AATAAA) követi az 1870-es pozíció körül. A számított protein várható molekulasúlya 59 677, ami a biokémiailag meghatározott értékkel (Cawthon és munkatársai, Neurochem., 37,363, 1981) megegyező.
Ezek a tulajdonságok azt jelzik, hogy a HM 11 klón tartalmazza a MAO-A teljes kódoló régióját (a HM 11 szekvenciát hordozó E. coli törzset az American Type Culture Collection törzsgyűjteményébe helyeztük letétbe, ahol a mikroorganizmus a 67 740 sorszámot kapta).
A humán MAO-A genomi dezoxi-ribonukleinsav izolálása.
Egy humán genom kozmid könyvtárból izoláljuk a MAO-A proteint kódoló genomi kiónt (A2). Az izoláláshoz a MAO-A-t kódoló, a HM 11 klónból származó inszertet használjuk próbaként. A könyvtárt humán genomi dezoxi-ribonukleinsavból állították össze kozmid vektorban (C2XB; Bates és munkatársai, Gene, 26, 137, 1983; Bates és munkatársai, Methods Enzymol., 753, 82, 1987). Az A2 klón egy körülbelül 30 kb nagyságú genomi dezoxi-ribonukleinsav inszertet tartalmaz, amelyen belül exonok helyezkednek el, és amelyek együttesen kódolják a MAO-A proteint (az A2 szekvenciát hordozó E. coli sejteket az American Type Culture Collection törzsgyűjteményébe helyeztük letétbe, ahol a törzs az sorszámot kapta).
A humán MAO expresszálása E. coli sejtekkel az alábbiak szerint történik.
A humán MAO-A gént baktérium gazdasejtekben expresszálhatjuk és a terméket szekretálhatjuk, előnyösen E. coli baktériumban, oly módon, hogy a pUC típusú plazmid vektorokat használjuk fel (Yanisch-Perron és munkatársai, Gene, 33, 103, 1985). Ezek a plazmidok lac promoter-operátor rendszert tartalmaznak (lac P/O), ami izopropil-béta-D-tio-galaktozidázzal (IPTG) indukálható (Yanisch-Perron és munkatársai, lásd fent). A processzált protein membránon való átvitelét az E. coli sejt periplazmatikus terébe vagy a termék szekrécióját a táptalajba, a következő gének szignál szekvenciáival oldhatjuk meg:
1) az A külső membrán protein (ompA; Movva és munkatársai, J. Bioi. Chem., 255, 27, 1980),
2) alkalikus foszfatáz (phoA; Inouye és munkatársai,
J. Bact., 149, 434, 1982), vagy
3) pektát liáz (pelB; Lei és munkatársai, J. Bact., 769,
4379, 1987).
A HM11 komplementer dezoxi-ribonukleinsav klón MAO-A kódoló régióját pontosan kapcsolhatjuk olyan dezoxi-ribonukleinsav fragmensekhez, amelyek szignál szekvenciát határoznak meg. A kapcsolást standard dezoxi-ribonukleinsav módszerekkel végezhetjük. A kódoló régiót egy riboszóma kötőhely követi, a transzláció iniciációjának biztosítása érdekében. A ligáit dezoxi-ribonukleinsavat ismert technikákkal E. coli sejtekbe transzformálhatjuk, és a rekombináns plazmidokat tartalmazó transzformánsokat restrikciós enzimes analízissel vizsgálhatjuk. Ezután a humán MAO-A
HU 211 911 A9 polipeptid termelhető a plazmidot hordozó törzzsel és a táptalajból vagy a sejtek lizátumából tisztítható. Ha a humán MAO-A polipeptidet az E. coli proteolitikus enzimei hasítják, úgy a polipeptid expresszióját biztosíthatjuk oly módon, hogy egy kisebb proteáz rezisztens aminosav vezető szekvenciát kapcsolunk a molekulához, ahogy azt Sung és munkatársai megadják (Methods in Enzymology, 153, 385, 1987).
A humán MAO-A expressziója élesztő sejtekben.
A MAO-A gén élesztő szekréciós vektorral, például a palfaC3 plazmiddal élesztő sejtekkel expresszálható.
A fenti plazmid 1,7 kb nagyságú élesztő genomi fragmenst hordoz az MFalfal stmktúrgénnel, hordozza továbbá ennek promoterét és transzkripciós terminációs szekvenciáját egy pBR322 alapú vektorban (Zsebo és munkatársai, J. Bioi., Chem.; 261, 5858, 1986). A MAO-A-t kódoló HM11 klón egy restrikciós fragmensét (szükség esetén megfelelő adapter vagy linker szekvenciákkal a végek módosíthatók; New England Biolabs., Beverly. MA) a palfaC3 HindlII-Sall fragmense helyére építhető be 3’-irányban, az alfa-faktort meghatározó fragmenshez képest; ekkor a lizin-arginin dipeptid a MAO-A első kodonjától közvetlenül 5’-irányba esik. A lizin-arginin dipeptid felismerő helyet képvisel a KR endoproteáz számára, ez úgy helyezkedik el, hogy az alfa-faktor szekvencia kihasíthatja a hibrid proteint az alfa-faktor peptid és a humán MAO-A közül. A BamHI élesztő fragmens úgy tartalmazza az MFalfal szekvenciát, hogy az közvetlenül kapcsolódik a MAO-A génhez, a boxot egy élesztő alapú vektorba építjük, például az egyetlen BamHI helyet tartalmazó pYE DNS vektorba, így biztosítva az expressziót élesztő sejtekben. A rekombináns dezoxi-ribonukleinsavat élesztőbe, előnyösen Saccharomyces cerevisiae fajba transzformálva, a transzformánsokat megfelelő körülmények között tenyésztve MFalfal-humán MAO-A fúziós peptid keletkezik. A kódolt termék tartalmazza a natív alfa-faktor prekurzor első 83 aminosavát, ez magába foglalja a fúziós polipeptid élesztőben való szekrécióját biztosító szignál peptid szekvenciát. Ez a fúziós polipeptid tartalmazza a KR endoproteáz felismerő szekvenciáját, és így a 83 aminosavból álló prekurzor a sejtben lehasad a MAO-A polipeptidről. A karboxilvég nem igényli a proteolitikus folyamatot az éréshez, mivel a MAO-A gén végén transzlációs terminációs kodon helyezkedik el.
A humán MAO-A expressziója emlős sejtekben.
A humán MAO-A előállítható emlős sejtekkel, például NIH3T3 vagy BHK21 sejtekkel, megfelelő emlős sejt vektor DNS-eket használva, például a retrovírus shuttle vektorral: pZIP-NeoSVX (Cepko és munkatársai, Coll, 37, 1053, 1984). Ezen felül egy metallo-theionein promotert (Choo és munkatársai, DNA, 5, 529, 1986) is beépíthetünk a MAO-A géntől 5’-irányban, amikor a MAO-A expresszió indukálható lesz.
A HM11 kiónból származó MAO-A-t meghatározó restrikciós fragmens a SVX vektor LTR (long terminál repeat) helyzetéről 3’-irányban eső BamHI helyére beépíthető, megfelelő adapter szekvenciák használatával, így például a humán MAO-A gén kihasítható a HM 11 kiónból, és beépíthető az SVX vektorba úgy, hogy először EcoRI és Dral restrikciós enzimekkel emésztünk, és izoláljuk a MAO-A proteint kódoló fragmenst. A fragmens EcoRI-Dral végei BamHI végekké alakíthatók Dral/BamHI adapter molekulákkal, és ezután a MAO-A BamHI inszertet Iigáljuk a BamHI enzimmel emésztett SVX-hez. Természetesen felhasználhatjuk a HM 11 klón vagy az SVX vektor más, megfelelő restrikciós helyeit is. A ligáit dezoxi-ribonukleinsavat E. coli sejtekbe transzformálhatjuk, mivel az SVX dezoxi-ribonukleinsav vektor E. coli és emlős sejtekben is fennmarad. Ily módon szelektálhatjuk a MAO-A-SVX rekombináns kiónt, és ezután NIH3T3 vagy BHK21 sejtekbe juttathatjuk. A Dulbecco módosított Eagle, 10% borjú szérummal kiegészített táptalajban fenntartott NIH3T3 sejteket Graham és van dér Eb kalciumfoszfát technikájával transzformálhatjuk a MAO-ASVX ingázó vektorral (Parker és Stark, J. Virol., 31, 360, 1979). A BHK21 sejteket hasonlóképpen transzformálhatjuk Wigler és munkatársai kalcium-foszfátos módszerével (Cell, 14, 725, 1978), és GIBCO táptalajban, G418 antibiotikum rezisztenciára szelektálhatunk.
A MAO-A proteinek tisztítása
A fenti rendszerekkel kifejezett rekombináns MAO-A proteineket a sejt felülúszóból izoláljuk Weyler és Salach módszerei szerint (J. Bioi. Chem., 260, 13 199,1985).
Diagnosztikumként és terápiás célokra való használat.
A humán MAO-A gén vagy ennek komplementer ribonukleinsava diagnózisra vagy egészségügyi zavarok kezelésére használható fel, ideértve a MAO-A és MAO-B géneket és a gén által meghatározott termékeket. így például a humán MAO-A génben bekövetkező változások megváltoztathatják a gén kifejeződését, vagy egy megváltozott protein termelését eredményezhetik, ez viszont zavarokat okozhat, például mentális problémákat, mániás depressziót vagy pszichikai tüneteket. Ilyen változások, például átrendeződések, pontmutációk vagy mutációk a szabályozó szekvenciákban okozhatnak megváltozott MAO-A ribonukleinsav szintézist, ezeket a változásokat a MAO-A dezoxi-ribonukleinsavval vagy ribonukleinsavval diagnosztizálhatjuk. A génváltozások háromféle detekciós rendszerének leírását az alábbiakban adjuk meg.
MAO-A próbák
A MAO-A dezoxi-ribonukleinsav vagy ribonukleinsav radioaktívan jelezhető, és próbaként használható fel a Southern biot vizsgálatokban, ahogy azt Maniatis és munkatársai (lásd fent) megadják. Ezzel a módszerrel a teljes humán dezoxi-ribonukleinsavban felismerhetjük a MAO-A gént. A MAO-B gén ezekkel a technikákkal szintén detektálható, ha bizonyos paramétereket variálunk, például a hibridizációs hőmérsékletet vagy a sókoncentrációt. A MAO-A dezoxi-ribonukleinsav próba előállítására a MAO-A-t kódoló, a HM11 fragmensből kihasított EcoRI szegmenst ismert módszerekkel elkülönítjük, és Maniatis és munkatársai szerint (lásd előbb) radioaktívan jelezzük. A MAO-A ribonuklein5 sav próba előállítására a MAO-A EcoRI dezoxi-ribonukleinsav fragmenst SP6 vektor dezoxi-ribonukleinsavba építjük be, és a MAO-A dezoxi-ribonukleinsav értelmes szálját templátként használjuk a transzkripcióhoz, radioaktív nukleotidok jelenlétében.
A dezoxi-ribonukleinsav biot analízis A radioaktívan jelzett dezoxi-ribonukleinsavat vagy ribonukleinsav próbát felhasználhatjuk a MAO-A gén kimutatására a teljes humán dezoxi-ribonukleinsavból, ami utóbbit előzőleg egy vagy több restrikciós enzimmel emésztettünk. A próba egy vagy több restrikciós fragmenst fog azonosítani, ezek a MAO-A gén egy részét vagy teljes szekvenciáját hordozzák. A MAO-A génben bekövetkező nagyobb átrendeződéseket úgy detektálhatjuk, hogy a dezoxi-ribonukleinsavat a génhez közel vagy a génen belül két vagy csak néhány helyen hasító restrikciós enzimekkel emésztünk, a gén kisebb régióiban bekövetkező átrendeződéseket nagy valószínűséggel úgy detektálhatjuk, hogy a dezoxi-ribonukleinsav emésztését a génhez közel, vagy a génen belül több helyen hasító restrikciós enzimmel végezzük. A MAO-val összefüggő megbetegedésben szenvedő egyének dezoxi-ribonukleinsav mintáját összehasonlíthatjuk egészséges egyénekből származó humán dezoxi-ribonukleinsavval, és abnormális emésztési kép alapján feltárhatjuk a MAO-val összefüggő rendellenességeket.
Az RFLP és a kapcsolódási analízis módszer. Véletlenszerűen vett dezoxi-ribonukleinsav mintákat vizsgálhatunk abból a szempontból, hogy a MAOA kódoló régiókban és a kapcsolódó szekvenciákban egyetlen nukleotid különbség van-e. Úgy járunk el, hogy a dezoxi-ribonukleinsav mintát restrikciós enzimekkel kezeljük, és a kapott restrikciós fragmenseket Southern hibridizációval elkülönítjük. A módszert Maniatis és munkatársai korábban megadott munkájából ismerhetjük meg. A MAO-A komplementer dezoxi-ribonukleinsav klón meghatároz egy EcoRV RFLP-t (lásd előbb), amit felhasználhatunk a MAO-A lókusz és a megbetegedési státusz összefüggéseinek feltárásában. A MAO-A genomi kiónt felhasználhatjuk a restrikciós fragmens hosszúságában bekövetkező polimorfizmus (RFLP) feltárásában is, ami a MAO-A génben előfordulhat, például az Mspl RFLP. Az A2 genomi kiónt próbaként használhatjuk az ismétlődő szekvenciák eltávolítását követően. Az ismétlődő szekvenciákat úgy távolítjuk el, hogy az A2 kiónt először EcoRI vagy PstI és Sau3A, vagy bármely megfelelő olyan enzimpárral emésztünk, amely a kiónból kihasítja a MAO-A iszertet, és ezt ffagmensekké hasítja. Az emésztett MAO-A gént meghatározó dezoxi-ribonukleinsavat ezután EcoRI vagy PstI és BamHI enzimekkel emésztett pBR322 plazmid dezoxi-ribonukleinsavba szubklónozzuk, és a szubklónozott fragmenseket radioaktívan jelzett humán dezoxi-ribonukleinsavval vizsgáljuk. Az ismétlődő dezoxi-ribonukleinsavat hordozó szubklónok erősen fognak hibridizálódni, és ezek kizárhatók. A negatív szubklónokat a HM 11 klónnal újra vizsgáljuk, és a vizsgálat során pozitívnak bizonyultakat kiemeljük, és RFLP próbaként használjuk fel. Az RFLP módszert Drayna és munkatársai szerint vitelezzük ki (Biotechniques, 4,412,1986; lásd továbbá Watkins és munkatársai, Biotechniques, 6, 310, 1988).
A ribonukleáz A hasítási reakció
A Southern hibridizációval ki nem mutatható MAO-A génen belüli változásokat, például deléciókat, inszerciókat, átrendeződéseket, bázispár-növekedéseket, pontmutációkat úgy tudjuk detektálni, hogy a MAO-A RNS : DNS vagy RNS : RNS duplexek idegen bázispáijait ribonukleáz A enzimmel hasítjuk. A humán bőr fibroblasztok és limfociták használhatók fel, sorrendben, a MAO-A és MAO-B ribonukleáz forrásaként. A ribonukleáz A hasítási reakció azon a tényen alapszik, hogy egyes hibás helyek a ribonukleinsavval vagy dezoxi-ribonukleinsavval alkotott ribonukleinsav hibridekben ribonukleáz A enzimmel hasíthatók. Bázishelyettesítődést egyetlen ribonukleinsav próbával azonosíthatunk, átfedő próbák párjait haszálhatjuk fel mutált helyek egyértelmű lokalizálására. Egyelőre nem világos az, hogy mi szükséges a ribonukleáz A érzékenységhez, valószínűnek látszik, hogy a lehetséges egyetlen bázis hiba 30-50%-os valószínűséggel hasad. A deléciókból, inszerciókból vagy átrendeződésekből származó hibás báziskapcsolódások nagy lehetőséget nyitnak a ribonukleáz A hasításhoz, mivel a hibrideken belül jelentősebb mértékben vannak jelen egyszálú régiók. A ribonukleáz A hasítási reakciót (részleteiben lásd Gibbs és munkatársai. Science, 236, 303, 1987) úgy végezzük, hogy a HM 11 MAO-A komplementer dezoxi-ribonukleinsavból származó humán MAO-A gént hordozó radiokatívan jelzett restrikciós fragmenst, vagy ebből a dezoxi-ribonukleinsavból szintetizált radioaktívan jelzett értelmetlen (antiszensz) ribonukleinsavat izolálunk.
Az antiszensz ribonukleinsav szintézisére a MAOA restrikciós fragmenst először pSP6 vektor dezoxi-ribonukleinsavba építjük be, és az értelmes szálról ribonukleinsavat szintetizálunk. A dezoxi-ribonukleinsav eltávolítására dezoxi-ribonukleázos kezelést alkalmazunk. A radioaktívan jelzett MAO-A próbát poli(A)-ribonukleinsavhoz hibridizáljuk, ez utóbbit ismert módszerekkel állítjuk elő (lásd Maniatis és munkatársai, lásd előbb). A hibrideket ezután ribonukleáz A enzimmel hasítjuk, az egyszálú régiók emésztésére és a belső, hibás bázispárosodások megszüntetésére, majd ezt követően a kapott fragmenseket poliakril-amid gélelektroforézissel (denaturált körülmények között) és autoradiográfiával analizáljuk. A ribonukleáz A mérés további módosításait az alábbi irodalmi forrásokból ismerhetjük meg: Winter és munkatársai, Proc. Nat. Aca. Sci., 82, 7575, 1985; és Myers és munkatársai, Science, 230, 1241, 1985).
A genomi dezoxi-ribonukleinsav szekvenálása
A MAO-A komplementer dezoxi-ribonukleinsav szekvencia felhasználható a MAO-A kódol régióban jelenlevő mutációk keresésére. Először a dezoxi-ribonukleinsav polimeráz láncreakciót (PCR) használjuk
HU 211 911 A9 (Saiki és munkatársai, Science, 230, 1350, 1985), amit Lee és munkatársai módosítottak (Science, 239, 1288, 1988). Ily módon a genomi dezoxi-ribonukleinsavból származó MAO-A kódoló szekvenciát a HM11 primerként használt oligonukleotid szekvenciát felhasználva, enzimatikusan sokszorosítjuk. Egy primemek komplementernek kell lennie a (-) lánccal, a másiknak a MAO-A gén (+) lánchoz. Másodszor, a sokszorosított dezoxi-ribonukleinsavat didezoxi-módszerrel szekvenáljuk (Sawyer, PNAS, 74, 5463, 1977; Read és munkatársai, Biotechniques, 4, 306, 1986). Ha egyszer a MAO-A mutációt szenvedett helyén a szekvenciát meghatároztuk, a mutációt átfedő szintetikus oligonukleotidot szintetizálunk és használunk a továbbiakban próbaként, a hasonló mutációk rutinszerű szkrinelésére; ezt genomi szelektív hibridizációval végezzük.
A restrikciós helyek próbáinak használata
Ha a mutációt szenvedett szekvencia egy restrikciós enzim által felismert helyen belül fekszik, akkor a minta dezoxi-ribonukleinsavat az alábbiak szerint szkrineljük, a mutáció felderítésére. A genomi dezoxi-ribonukleinsavban, vagy a sejtes ribonukleinsavban jelenlevő MAO-A mutációt először sokszorosítjuk oly módon, hogy a dezoxi-ribonukleinsavat vagy a ribonukleinsavat olyan szintetikus oligonukleotid primerhez hibridizáljuk, amelynek szekvenciáját a MAO-A szekvenciára specifikáltuk. Ezután a sokszorosított dezoxi-ribonukleinsavhoz egy radioaktívan jelzett szintetikus oligonukleotid próbát, vagy egy, a vad típusú MAO-A génnel komplementer dezoxiribonukleinsav fragmenst hibridizáljunk. A próba szekvenciáját úgy választjuk meg, hogy az átfedje a genetikai mutációt. Egy második, referencia restrikciós enzim által felismert hasítási hely is benne van a próba szekvenciájában, de ez nem tartalmaz genetikai mutációt. Amikor a próba hibridet alkot a vad típusú dezoxi-ribonukleinsavval, a két adott restrikciós hasítási helyet a megfelelő restrikciós enzimekkel hasítjuk, és ekkor olyan fragmensek keletkeznek, amelyeket poliakril-amid gélen vagy agarózon megfigyelhetünk. Ugyanakkor, amikor a próba hibridet képez a mutáns dezoxi-ribonukleinsavval, akkor a hibrid egy báziscserélődést hordoz, és az ezt tartalmazó restrikciós hely az adott restrikciós enzimmel nem hasad; ellentétben a hasítható referencia restrikciós hellyel. Tehát a mutáns hibridek emésztésekor keletkező restrikciós fragmensek a gélen a vad típusú hibridektől különböző látható képet fognak mutatni.
Ribonukleinsv hibridizációs analízise
Egy MAO-A dezoxi-ribonukleinsav vagy ribonukleinsav próbát is használhatunk a Northern hibridizációhoz az abnormális MAO-A gén expressziójának detektálására, ahogy azt Maniatis és munkatársai (lásd előbb) leírják, amivel azonosítjuk a ribonukleinsavat kódoló MAO-A-t. A MAO-B ribonukleinsav a MAO-A ribonukleinsav próbával szintén azonosítható oly módon, hogy megfelelően változtatjuk a technika kivitelezése során a hibridizációs hőmérsékletet vagy a sókoncentrációt. A MAO-A gén abnormalitásait, például a reguláló szekvenciákban bekövetkező mutációkat vagy génátrendeződéseket úgy mutathatjuk ki, hogy összehasonlítjuk a MAO-A specifikus ribonukleinsavat abnormális és egészséges egyénektől származó mintákban, vagy detektálunk egy megváltozott transzkripciós nagyságot.
A MAO-gátlás mérését az alábbiak szerint végezzük.
A fentiek szerint expresszált és tisztított MAO-A polipeptidet tesztvegyületként használhatjuk fel bizonyos pszichotikus rendellenességek kezelésére potenciálisan felhasználható MAO-inhibitorok vizsgálatára. Ezeket a vegyületeket hozzáadjuk egy olyan reakcióelegyhez, amelyben megfelelő reakciókörülmények között MAO-katalizált oxidatív dezamináció játszódik le (aminok dezaminációja).
A módszert Edelstein és Breakefield írták le (Cell. Mól. Neurobiol., 6, 121, 1986).
A továbbiakban ismertetjük a MAO mérését.
A MAO-A molekulát felhasználhatjuk diagnosztikumként is oly módon, hogy a MAO-A proteinnel vagy protein ffagmensekkel monoklonális antitesteket készítünk a humán megbetegedésekkel együttjáró, megváltozott MAO enzimaktivitás vizsgálatára. A MAO-A és MAO-B vagy a MAO-A egyedüli kimutatására képes monoklonális antitesteket ismert módszerekkel állíthatjuk elő, ahogy azt például Kohler és Milstein leírták (Euro. J. Immunoi., 6, 511, 1976). A monoklonális antitesteket ismert módon ELISA tesztben használjuk, az emberi szöveti minták, például vérsejtek vagy bőrsejtek MAO enzim-tartalmának kvantitatív meghatározására. Szokatlanul magas vagy alacsony MAO koncentrációk jelezhetik a MAO génekben bekövetkező genetikai zavarokat, és bizonyos MAO-val összefüggő megbetegedéseket is.
A MAO-A terápiás adagolása.
A MAO-A polipeptidet használhatjuk lokálisan, például a gyomorban, a táplálékokból felszabaduló monoaminok dezaminációjának katalizálására; ezeket fals transzmittereknek nevezzük. A MAO inhibitorokkal kezelt páciensek abnormálisán alacsony MAO-aktivitással rendelkeznek, és ezért nem képesek a kezelés alatt a monoaminokat dezaminálni. Ekkor a monoaminokat tartalmazó élelmekkel szemben fokozott érzékenység nyilvánul meg.
A MAO-A a MAO-A-t igénylő pácienseknek olyan kapszulákban is adagolható, amelyek sav-rezisztensek, adagolható orálisan vagy intravénás injekcióval, testtömegkilogrammra számítva 0,1-5 mg mennyiségben.
A MAO-A gén vagy a rekombináns MAO-A polipeptid felhasználható MAO-hiányos egyének kezelésére, például mániás depressziókor vagy olyan betegek esetén, akik Norrie megbetegedésekben szenvednek, amit egyes esetekben a MAO-A és a MAO-B gének teljes hiánya jellemez.
A humán MAO-A gént hordozó komplementer dezoxi-ribonukleinsav kiónt felhasználták Norrie megbetegedésben szenvedő két hímnemű unokatestvér deléciót szenvedett génjeinek helyreállításához. Fibroblasztjaikban MAO-A aktivitás nem volt detektálható. Ugyancsak nem volt detektálható ezen betegek MAOB aktivitása vérlemezkéikben és fibroblasztjaikban.
HU 211 911 A9
Ezen felül a major katekol-amin metabolitok, köztük a vanillil-mandelsav, homovanillinsav, és a 3-metoxi-4hidroxi-fenil-glikol jelentősen csökkent koncentrációban volt jelen vizeletükben. Ezek a megfigyelések azt jelzik, hogy ezekben a betegekben a MAO-A és MAOB aktivitásokhoz szükséges gének deletálódtak. Ez a genetikai deléció tudomásunk szerint az X kromoszóma Xpll.3 régiójában következik be. A rekombináns humán MAO-A polipeptidet a MAO-A deficiens, fentiekhez hasonló pácienseknek adagolható. Eljárhatunk úgy is, hogy a humán MAO-A gént génterápiában a MAO-A forrásaként használjuk fel. A MAO-A hibáival összefüggő betegségeket okozó metabolikus defektek tartós helyreállítása érdekében a génszekvenciát expresszálható formában kell bevezetnünk a sejtekbe, mégpedig olyanokba, amelyek rendelkeznek szaporodási képességgel, és regenerálják a szövetet. Az alábbiakban ismertetjük a géntranszfert.
Génbevitel
Az élő állatokba való génbevitelhez nagyszámú sejtet kell hatékonyan transzformálnunk. A dezoxi-ribonukleinsav irányított géntranszfer technikái tenyésztett sejtekkel végzett kísérletekben felhasználhatók, azonban nem alkalmasak primer sejttenyészetek vagy élő állatok sejtjeinek transzformálására. Ezért igen hatékony módszereket fejlesztettek ki, amelyek során a rekombináns géneket génsebészettel előállított vírusrészecskékbe zárják, és a rekombináns vírussal kivitelezett fertőzéssel juttatják a sejtekbe. Ezt a technikát vírus által szabályozott géntranszfernek hívják, és a rekombináns vírusokat vírusvektoroknak nevezik. Bizonyos esetekben előnyös lehet, ha a bevitt gén csak bizonyos szövetekbe fejeződik ki, vagy csak bizonyos szövetekben szabályozódik a gén kifejeződése. Előállítható olyan expressziós vektor, amelynek promotere mindegyik sejtben, vagy csak előre kiválasztott sejtekben funkcionál, például a majom vírus (simian viral 40) vagy az adeno vírus promoterek hatékony transzkripciót biztosítanak gyakorlatilag az összes sejtben. Egyes promoterek a direkt kifejeződést szövetspecifikus módon szabályozzák. A hemoglobin gének promoterei a transzkripciót csak bizonyos csontvelőből származó sejtekben szabályozzák, míg a neurofilamentekből származó promoterek, a tirozin-hidroxiláz vagy a gliafibrilláris savas protein (GFAP) gének promoterei a transzkripciót csak az idegrendszer bizonyos sejtjeiben irányítják. Más promoterek csak különböző hormonok vagy gyógyszerek jelenlétében aktívak. Az expressziós vektorokban ilyen promotereket használva, a rekombináns gén transzkripciója in vivő regulálható. Ami a MAO-A hiányos páciensek terápiáját illeti, MAO-A gént hordozó vírusokkal fertőzött tenyésztett sejtekkel kezelhetők, oly módon, hogy ezeket a test megfelelő régióiba transzplantáljuk.
A leírásban megadott mikroorganizmusokat az alábbi helyeken tettük letétbe:
A HM 11 és A2 szekvenciákat tartalmazó E. coli sejteket az American Type Culture Collection, Rockville, Maryland helyeztük letétbe, 1988. június 30-án, ahol a „Budapest Egyezmény” értelmében az alábbi sorszámokat kapták: 67 740 és 67 741.
Claims (12)
- SZABADALMI IGÉNYPONTOK1. A humán monoamin-oxidáz A-t kifejező, tisztított dezoxi-ribonukleinsav.
- 2. Az 1. igénypont szerinti dezoxi-ribonukleinsav, mely tartalmazza a MAO-A-t kódoló genomiális dezoxi-ribonukleinsavat.
- 3. Az 1. igénypont szerinti dezoxi-ribonukleinsav, mely MAO-A-t kódoló cDNS szekvenciát tartalmaz.
- 4. Humán monoamin-oxidáz A-t kódoló dezoxi-ribonukleinsavat tartalmazó vektor.
- 5. A 4. igénypont szerinti vektor, 5’—>3 irányban az alábbi működőképesen kapcsolt elemeket tartalmazza; szignál peptidet kódoló DNS, és humán MAO-A-t kódoló DNS.
- 6. Az 5. igénypont szerinti vektorral transzformált sejt.
- 7. A 6. igénypont szerinti sejt, azzal jellemezve, hogy az egy baktériumsejt.
- 8. A 6. igénypont szerinti sejt, azzal jellemezve, hogy az egy emlős sejt.
- 9. A 6. igénypont szerinti sejt, azzal jellemezve, hogy az egy élesztő sejt.
- 10. Eljárás rekombináns humán A-típusú monoamin-oxidáz (MAO-A) előállítására, azzal jellemezve, hogy a 7., 8. vagy 9. igénypontok bármelyikében megadott sejtet állítjuk elő, ezeket táptalajban tenyésztjük, és a tenyészetből vagy a táptalajból izoláljuk a rekombináns humán MAO-A-t.
- 11. A 4. igénypont szerinti vektor, dezoxi-ribonukleinsavval transzformált, ATCC 67 740 letéti számú baktérium sejt.
- 12. A 4. igénypont szerinti dezoxi-ribonukleinsav vektorra] transzformált ATCC 67 741 letéti számú baktérium sejt.
Priority Applications (1)
| Application Number | Priority Date | Filing Date | Title |
|---|---|---|---|
| HU9500593P HU211911A9 (hu) | 1995-06-29 | 1995-06-29 | A-típusú humán monoamin-oxidázt meghatározó DNS Az átmeneti oltalom az 1-5. igénypontokra vonatkozik. |
Applications Claiming Priority (1)
| Application Number | Priority Date | Filing Date | Title |
|---|---|---|---|
| HU9500593P HU211911A9 (hu) | 1995-06-29 | 1995-06-29 | A-típusú humán monoamin-oxidázt meghatározó DNS Az átmeneti oltalom az 1-5. igénypontokra vonatkozik. |
Publications (1)
| Publication Number | Publication Date |
|---|---|
| HU211911A9 true HU211911A9 (hu) | 1996-01-29 |
Family
ID=10986539
Family Applications (1)
| Application Number | Title | Priority Date | Filing Date |
|---|---|---|---|
| HU9500593P HU211911A9 (hu) | 1995-06-29 | 1995-06-29 | A-típusú humán monoamin-oxidázt meghatározó DNS Az átmeneti oltalom az 1-5. igénypontokra vonatkozik. |
Country Status (1)
| Country | Link |
|---|---|
| HU (1) | HU211911A9 (hu) |
-
1995
- 1995-06-29 HU HU9500593P patent/HU211911A9/hu unknown
Similar Documents
| Publication | Publication Date | Title |
|---|---|---|
| Aimi et al. | De novo purine nucleotide biosynthesis: cloning of human and avian cDNAs encoding the trifunctional glycinamide ribonucleotide synthetase-aminoimidazole ribonucleotide synthetase-glycinamide ribonucleotide transformylase by functional complementation in E. coli | |
| Delfau et al. | Two different point G to A mutations in exon 10 of the porphobilinogen deaminase gene are responsible for acute intermittent porphyria. | |
| Cain et al. | Interaction between Glu-219 and His-245 within the a subunit of F1F0-ATPase in Escherichia coli. | |
| Sumi-Ichinose et al. | Molecular cloning of genomic DNA and chromosomal assignment of the gene for human aromatic L-amino acid decarboxylase, the enzyme for catecholamine and serotonin biosynthesis | |
| HU214412B (hu) | A-tipusú humán monoamin-oxidázt meghatározó dezoxi-ribonukleinsav | |
| Stoll et al. | Characterization and chromosomal mapping of a cDNA encoding tryptophan hydroxylase from a mouse mastocytoma cell line | |
| US6210666B1 (en) | Truncated α-galactosidase A to treat fabry disease | |
| US6602693B1 (en) | Gene encoding hyaluronan synthase | |
| EP0378224A2 (en) | Method of detecting small cell carcinoma and use of acylpeptide hydrolase encoding sequences therefor | |
| US20020035078A1 (en) | Enzyme having S-adenosyl-L-homocysteine hydrolase (AHCY) type activity | |
| EP0748376A1 (en) | Rna editing enzyme and methods of use thereof | |
| WO1995023849A1 (en) | Novel protein-kinase, nucleic acid sequences encoding the same and methods related thereto | |
| HU211911A9 (hu) | A-típusú humán monoamin-oxidázt meghatározó DNS Az átmeneti oltalom az 1-5. igénypontokra vonatkozik. | |
| US5962230A (en) | Diagnosis and treatment of glaucoma | |
| US5045471A (en) | Cloned DNA for P450scc and expression thereof | |
| CA2358380A1 (en) | Testis-specific gene | |
| JP3132618B2 (ja) | 安定化された改変タンパク質 | |
| WO1997026369A1 (en) | A GENETIC TEST FOR α-MANNOSIDOSIS | |
| JP2984143B2 (ja) | 新規なウリカーゼ遺伝子、新規な組み換え体ｄｎａ及びウリカーゼの製造法 | |
| JP2003502014A (ja) | ヒトメチレンテトラヒドロ葉酸還元酵素のｃＤＮＡ | |
| JPH0656895A (ja) | 新規なポリペプチド、その製造方法、そのポリペプチドをコードするｄｎａ、そのｄｎａからなるベクター、およびそのベクターで形質転換された宿主細胞 | |
| JPH0568571A (ja) | ヒト由来グリオキサラ−ゼｉをコ−ドするｄｎａ | |
| JPH10201473A (ja) | フルクトシルアミンオキシダーゼを生産する実質上純粋な微生物 | |
| WO1994026765A1 (en) | Use of genes of m. tuberculosis, m. bovis and m. smegmatis which confer isoniazid resistance | |
| JPH10248572A (ja) | 改変ザルコシンオキシダーゼおよびその用途 |