HU214412B - A-tipusú humán monoamin-oxidázt meghatározó dezoxi-ribonukleinsav - Google Patents

Abstract

A találmány tárgya eljárás hűmán mőnőamin-őxidáz A előállítására. Atalálmány szerinti eljárást az jellemzi, hőgy valamely gazdatestethűmán mőnőamin-őxidáz A-t kódőló tisztítőtt DNS-sel transzfőrmálnak, asejteket tenyésztik, majd a keletkezett enzimet kinyerik. ŕ

Description

(57) KIVONAT

A találmány tárgya eljárás humán monoamin-oxidáz A előállítására.

A találmány szerinti eljárást az jellemzi, hogy valamely gazdatestet humán monoamin-oxidáz A-t kódoló tisztított DNS-sel transzformáinak, a sejteket tenyésztik, majd a keletkezett enzimet kinyerik.

HU 214 412 B

A leírás terjedelme 12 oldal (ezen belül 4 lap ábra)

HU 214 412 Β

A találmány humán monoamin-oxidáz A-ra és rekombináns dezoxiribonukleinsav technikákra vonatkozik.

A monoamin-oxidáz (monoamin: 0₂ oxido-reduktáz, EC 1.4.3.4.; MAO) nagyszámú táplálékként szolgáló amin és neurotranszmitter (mint például a dopamin, norepinefrin vagy szerotonin) oxidatív dezaminációját dtalizálja. A monoamin a külső mitokondriális membrán egy belső proteinje, és minden típusú sejtben jelen van.

Két izoenzim alakot (A és B típus) azonosítottak, és tudományos vélemények szerint ezek hasonló, de nem azonos proteinek.

A MAO több neurofiziológiás megbetegedésben szerepet játszik, a MAO inhibitorokat antidepresszánsként használják. A MAO-B metabolizálja az l-metil-4-fenil-l,2,3,6-tetrahidro-piridin(MPTP)neurotoxint, az átalakulás után a molekula egy aktív alakja jön létre, amely szerepet játszik a Parkinson-kór szimptómák megjelenésében (Markey és munkatársai, 1984). Különböző pszichiátriás zavarokkal küszködő páciensekben a normális MAO aktivitásnál alacsonyabb értékeket figyeltek meg.

A humán MAO-A és MAO-B proteineket valószínűleg olyan, egymástól elkülönült gének kódolják, amelyek szorosan kötődnek az X kromoszómához. A humán X kromoszóma Xpl 1.3 régiójának szubmikroszkópikus deléciójakor az ember MAO-A és MAO-B aktivitása elveszik.

Az Abstract írom American Society of Humán Genetics May 22, 1987 cikke egy 0,5 kb cDNS klón (HP2A) izolálását ismerteti. A szakaszt szekvenálták és „humán DNS fragmensekké” hibridizálták. A HP2A azonban legfeljebb a MAO gén egyharmadát tartalmazta.

A Biochemistry 1985, 24: 556 cikke humán fenil-alanin hidroxilázt (PAH) kódoló DNS izolálását írja le humán máj cDNS könyvtárból. A rekombináns fág cDNS könyvtárat részleges PAH cDNS klónnal hibridizálva szkrinelték. A fág cDNS-t izolálták, EcoRI-gyel emésztették és a leghosszabb hibridizáló DNS inszerteket szekvenálták.

Általánosságban szólva, a találmány tárgya egy olyan vektor dezoxiribonukleinsav, amely érett humán mono-amin-oxidáz A (MAO-A) proteint meghatározó szakaszt tartalmaz. Ahogy az a későbbiek során nyilvánvalóvá lesz, az „érett humán monoamin-oxidáz A” kifejezés alatt biológiailag aktív MAO-A molekulát értünk; így a leírásban használt kifejezés elég széles ahhoz, hogy beleértsük azt a dezoxiribonukleinsav szekvenciát (genomi vagy előnyösebben cDNS), amely legalább az érett humán MAO-A molekulát kódolja, és amely kódolhat ezenkívül humán vagy más (például borjú, élesztő vagy baktérium) szignál szekvenciákat vagy hibrid szignál szekvenciákat.

Escherichia coli sejtekben a MAO-A polipeptid expressziójára olyan MAO-A dezoxiribonukleinsavat használunk, amely szabályozó DNS kontrollja alatt áll, ez a szabályozó szekvencia pedig egy promoterből és egy szignál peptidet meghatározó szekvenciából áll; előnyösen a lac promotert és az OmpA, phoA vagy pelB szignál szekvenciát használjuk. Az élesztőben történő kifejezéshez a MAO-A dezoxiribonukleinsav az

MFalfal promoter és szignál szekvencia szabályozása alatt áll. Emlős sejtekben a MAO-A dezoxiribonukleinsav egy vírus hosszú terminális ismétlődő (LTR) szekvenciájának szabályozása alatt áll.

A MAO-A dezoxiribonukleinsav által meghatározott terméket terápiás célokra használhatjuk, továbbá olyan betegségek diagnosztizálásakor, amelyekben a MAO-A és a MAO-B gén termékei szerepet játszanak, például a MAO-A gén valószínűleg a mentális retardációkban és betegségekben szerepet játszik, ezért a dezoxiribonukleinsav vagy ribonukleinsav diagnosztizáláskor próbaként használható fel a MAO-A gén változásainak vagy pontmutációinak vizsgálatára, továbbá az olyan MAO ribonukleinsav koncentrációk meghatározásakor, amelyek változásai szerepet játszanak a mániás depresszióban vagy pszichotikus állapotokban, köztük azokban, amelyek MAO inhibitorokkal történő kezelést igényelnek. A MAO-A gén terápiásán felhasználható a MAO gén hibáinak génterápiás korrigálásában is.

A találmány szerinti vektorokkal E. coli, élesztő, előnyösen Saccharomyces cerevisiae sejtek vagy emlős sejtek, például NIH3T3 vagyBHK21 sejtek ATCC gyűjteményből beszerezhető transzformálására, amiután biológiailag aktív humán MAO-A keletkezhet. A MAO-A polipeptidet felhasználhatjuk olyan MAO inhibitorok kutatására, amelyeket azután terápiásán használhatunk fel pszichotikus elváltozások kezelésére vagy bizonyos táplálékok emésztésekor felszabaduló monoaminok metabolizálására, olyan páciensek esetén, ahol a mono-amin-oxidázt hibás transzmitterként ható gyógyszerekkel gátoljuk. Ezenkívül a tisztított rekombináns MAO-A polipeptidet MAO-hiányos egyének kezelésére is alkalmazhatjuk. Ugyancsak alkalmazható a MAO-A diagnosztikumként oly módon, hogy monoklonális antitesteket készítünk, amelyek azután a humán megbetegedésekkel összefüggő, megváltozott MAO enzim értékek detektálására alkalmas.

A találmány szerinti eljárás előnyös kiviteli módjainak és igénypontjainak leírásából nyilvánvalóvá válnak az eljárás egyéb jellemzői és előnyei is.

A leíráshoz mellékelt ábrák a következők:

az 1. ábrán egy peptidet mutatunk be, amelyet felhasználtunk a dezoxiribonukleinsav szekvencia megtervezésekor, amely egy szintetikus, 47 tagból álló próba.

A2. ábrán bemutatjuk a humán MAO-A cDNSHMl 1 teljes nukleotid szekvenciáját és a megfelelő aminosav sorrendet.

/. példa

A humán MAO-A cDNS-t emberi máj cDNS-ből és emberi méhlepény cDNS könyvtárból izoláltuk, amiután ezt a cDNS-t felhasználtuk a humán genomi kozmid könyvtárból való genomi MAO-A gén izolálására. A humán MAO-A cDNS szekvencia és a genomi dezoxiribonukleinsav előállításának stratégiája a következő volt: először a borjú MAO-B peptid fragmenst tisztítottuk és szekvenáltuk, ezután ezt a szekvenciát felhasználva, próbát készítettünk a borjú cDNS könyvtárhoz, így izolálhattuk a borjú cDNS-t. A borjú cDNS ezek után felhasználható volt a humán cDNS könyvtár

HU 214412 Β szkrinelésére, amiután a kapott humán cDNS-t felhasználva izolálhattuk a humán genomi szekvenciát.

A borjú MAO cDNS izolálására elkülönítettünk egy MAO cDNS kiónt, amit G1 jellel jelöltünk. A John Powell által kivitelezett izolálási technika (Biochem. I. 1989,259:407-413) során az XOB3 jellel jelölt, tisztított borjú MAO-B fragmens aminosav szekvenciájából indultunk ki. Az 1. ábrán megadjuk az XOB3 peptid aminosav sorrendjét, ebből következtetve terveztük meg a boijü MAO-B 4-1 tagú szintetikus oligonukleotid szekvenciát. A 47 tagú oligonukleotidot egy Applied Biosystems 380A szintetizátorral állítottuk elő foszfoamidit módszerrel, a terméket poliakril-amid gél-elektroforézissel tisztítottuk. 100 ng oligonukleotidot gamma (³²P)-adenozin-trifoszfáttal radioaktívan jelöltünk (7000 Ci/mMol, NEN., Boston, MA) T4-polinukleotid-kináz enzimet (Boehringer Mannheim, Indianapolis, Indiana). Az oligonukleotidot degenerációk nélkül szintetizáltuk, a megfelelő aminosavakat meghatározó, leggyakrabban jelentkező kodonfelhasználást figyelembe véve (Grandiam és munkatársai, 1980, Nucleic Acids Rés. 8, 49). A 47 tagú oligonukleotidot ezután felhasználtuk a borjú cDNS könyvtárának szkrinelésére.

A cDNS könyvtár előállítására borjú adrenális velő ribonukleinsavat használtunk, ebből azután a 47 tagú oligonukleotid próbával vizsgáltunk borjú MAO klón jelenlétére.

A borjú mellékvese velőből poli(A)-ribonukleinsavat izoláltunk, és LoMedico és Saunders módszere szerint (1976, Nucleic Acids, Rés., 3, 381) tisztítottuk. cDNS könyvtárat állítottunk elő pBR322 plazmidban Gubler és Hoffrnan módszere (1983, Gene, 25, 263) szerint. Összesen körülbelül 14 000 különböző kolóniát szkrineltünk. 7000 kolónia mindegyikét 20^20 cm méretű nitrocellulóz szűrőre juttattunk, és Grunstein és Hogness módszere szerint (1975, Proc. Nat. Aca. Sci., 72, 3961) lizáltuk, majd a szűrőket 37 °C hőmérsékleten 4 órán át hibridizációs pufferban előhibridizáltuk. A hibridizációs puffer az alábbi jelű illetve összetételű: 6xSSC; 5^xDenhardt; 50 mmól/1 nátrium-foszfát (pH = 6,5); 100 ug/ml forralt hering dezoxiribonukleinsav; 20 térfogat% ionmentes formamid; 0,1 g/ml dextrán-szulfát, molekulatömege 500 000. Ezután a szűrőket hibridizációs pufferban az oligonukleotiddal (100 000 cpm/ml) hibridizáljuk 37 °C hőmérsékleten, 12 órán át. 37 °C hőmérsékleten 30 percen át lxSSC/0,1 % nátrium-lauril-szulfát-oldattal mossuk, többszöri puffercserével a nitrocellulóz szűrőket, majd intenzifikáló szűrőn át egy éjszakán át -70 °C hőmérsékleten exponáljuk. A pozitív telepeket kiemeljük, és hasonló körülmények között újra vizsgáljuk.

G1 jellel jelölt, 14 000 cDNS klónból kiválasztott egyetlen, erősen hibridizáló kiónt elkülönítettünk, és a plazmid dezoxiribonukleinsavat PstI restrikciós enzimmel emésztettük, amiután 500 nukleotidból álló inszertet kaptunk. A borjú és a humán MAO körülbelül 59 650 dalton molekulatömegű, ez megfelel 527 aminosavnak vagy 1581, a dezoxiribonukleinsav kódoló szakaszát alkotó nukleotidnak. Ezért a borjú G1 klón nem kódolja a teljes borjú MAO proteint.

Hosszabb borjú MAO klón előállítására a G1 kiónt ribonukleinsavvá írtuk át, ezt pedig ezután próbaként használtuk fel a borjú mellékvese velőből nyert cDNS könyvtár szkrinelésére (a könyvtárt Icangelo és munkatársai szerint állítjuk elő, Natúré, 323, 82, 1986; a szkrinelést pedig Maniatis és munkatársai szerint végezzük, Molecular Cloning, A Laboratory Manual, Cold Spring Harbor, New York). Az 500 kb-ból álló G1 inszertet a pGEM2 vektor (Promega Biotec, Madison, WI) PstI helyére építjük be, az SP6 fág promotertől 3’-irányban, majd a rekombináns plazmidot használjuk templátként az inszertnek megfelelő komplementer ribonukleinsav próba SP6 promoterrel történő transzkripciójához.

A ribonukleinsav próba hibridizációját a nagyobb boqú cDNS könyvtárhoz az alábbi összetételű elegyben végezzük: 20 térfogat% formamid, 6xSSC, 5xDenhardtoldat (lásd előbb), 0,1 tömeg% nátrium-lauril-szulfát, 0,2 mg/ml denaturált lazac sperma dezoxiribonukleinsav, 0,2 mg/ml élesztő transzfer ribonukleinsav, 1 mmól/1 etilén-diamin-tetraecetsav. A reakcióelegyet 48 órán át 50°C hőmérsékleten inkubáljuk. A szűrőket 2xSSC/0,l tömeg% nátrium-lauril-szulfát elegyben mossuk háromszor, a mosást egyenként 10-10 percen át végezzük szobahőmérsékleten, majd megismételjük 50 °C hőmérsékleten, 30-30 percen át két alkalommal, 0,5xSSC/0,l tömeg% nátrium-lauril-szulfát eleggyel.

A 200 000 kolóniából álló könyvtárból 8 pozitív kiónt kapunk, mindegyik vagy egy 2,7, vagy egy 1,2 kb nagyságú inszertet tartalmaz. A restrikciós enzimmel végzett térképezés szerint az 1,2 kb nagyságú inszert a 2,7 kb nagyságú klón része. Egyetlen, 34-3A jellel jelölt, 2,7 kb nagyságú kiónt használunk a további kísérletekhez.

A G1 és 34—3A borjú kiónok restrikciós fragmenseit M13mpl8 és M13mpl9 plazmidokban szubkl ón ózzuk, és dezoxiribonukleinsav szekvenciájukat didezoxi-módszerrel meghatározzuk ³⁵S-jelzett dATP-t használva (Williams és munkatársai, 1986, Biotechniques, 4, 138; Reed és munkatársai, 1986, Biotechniques, 4, 306). Henikof és munkatársai (Gene, 28, 351, 1984) szerint exonukleáz III enzimmel kezeljük a dezoxiribonukleinsavat a szekvencia-analízishez szükséges további kiónok előállítására. A 47 tagból álló oligonukleotid próbával komplementer, 0,5 kb nagyságú inszert régiója kódolja azt a protein szekvenciát, amely azonosítható a megfelelő borjú máj MAO peptiddel, kivéve három eltérést. Ennek a két boijü MAO kiónnak a dezoxiribonukleinsavából következő, várható aminosav szekvenciáját összehasonlítva a borjú máj MAO-B tripszines kezelés után kapott peptidjeivel, 73%-os homológiát találunk. Ez azt jelenti, hogy bár a G1 és 34—3A kiónokat a MAO-B peptid szekvenciából számított oligonukleotid próbával azonosítottuk, az izolált cDNS ki ónok MAO-A kiónok.

A humán MAO-A cDNS-t tartalmazó kiónok izolálására humán máj komplementer cDNS könyvtárat (Kwok és munkatársai, Biochem., 24, 556, 1985) és humán placenta cDNS könyvtárat szkrinelünk, próbaként a 34—3A borjú MAO cDNS kiónt használjuk. A humán máj mind a MAO-A és MAO-B proteint expresszálja, a placenta viszont csak a MAO-A-t. A HM11 jellel jelölt, egyetlen pozitív klón 2,0 kb inszertet hordoz, amely a humán máj könyvtárból származik, ugyanakkor 4 pozitív klón 2,8 kb, 2,5 kb, 0,5 kb és 0,2 kb nagyságú inszertet hordoz a humán placenta könyvtárból.

A könyvtárral való azonosítást a borjú cDNS próbával végezzük. A pozitív kiónok inszertjeit M13mpl8 dezoxiribonukleinsav vektorba szubklónozzuk, és didezoxi-módszerrel szekvenálunk (Williams és munkatársai, továbbá Reed és munkatársai, lásd előbb). A máj cDNS klón szekvenálásának elősegítésére irányított deléciókat hoztunk létre, és a kétséges régiókat szintetikus helyspecifikus primerekkel helyettesítettük.

A mellékelt 2. ábrán megadjuk a humán májból származó (HM11), 2,0 kb nagyságú cDNS teljes nukleotid szekvenciáját. 527 aminosavat meghatározó, ún. nyitott leolvasási keretet tartalmaz, amely az 51. sorszámú nukleotidnál ATG triplettel kezdődik, és az 1632. nukleotidnál TGA triplettel fejeződik be. Ha a 161 aminosavból 156-ot megvizsgálunk a humán placenta MAO-A proteolitikusan kapott peptidjeivel, úgy az aminosavak 97%-a azonos. Arra vonatkozóan, hogy a HM11 egy MAO-A klón további bizonyítékot jelent az, hogy az összehasonlításkor használt 1,2 kb nagyságú régióban elhelyezkedő humán placenta klón és a HM11 között több mint 99%-os homológia mutatható ki. Azokon a helyeken, ahol a HM 11 és a MAO-A peptidek között eltérés mutatkozik (Asp-150, Asp-153, Gly-224, Gln-225 és Met-231) a két hosszabb placenta klón és a HM 11 máj klón azonos aminosavakat tartalmaz. így igen valószínűtlen, hogy ezek az eltérések a dezoxiribonukleinsav klónozásából és a szekvenálás hibáiból erednek; valószínűsíthető, hogy dezoxiribonukleinsav polimorfizmussal vagy heterogén MAO-A alegységekkel állunk szemben.

A HM 11 májból származó klón olyan transzlációs iniciációs nukleotidokat tartalmaz, amely a magasabbrendű eukarióták optimális transzlációs iniciációjának megfelelő konszenzus szekvenciával azonosíthatók (Kozák, Cell., 44, 283, 1986); a HM11 első ATG triplettje körül 2 nukleotid, egy adenin három bázissal 5 ’-irányban (lásd a 2. ábra 48. nukleotidját), továbbá egy guanin közvetlenül 3’-irányban (az 54. nukleotid). A HM11 nukleotid szekvenciája 88%-os homológiát mutat a borjú MAO-A cDNS molekulával a teljes kódoló régiót figyelembe véve. Ezzel szemben az első ATG triplettől 5’-irányban a szekvencia teljesen eltérő, 26 nukleotidból csak 11 azonos. Ez megfelel egy 5’-nem transzlatálódó régiónak. Az első leolvasási fázisba eső stop kodont a HM11 szekvenciában 60 nukleotid követi 3’-irányban, ebben két további stop kodon (TGA és TAA) található. A 3 ’-végen adenin-sorozat látszik, ezt a poliadenilező szignál (AATAAA) követi az 1870-es pozíció körül. A számított protein várható molekulatömege 59 677, ami a biokémiailag meghatározott értékkel (Cawthon és munkatársai, Neurochem., 37, 363, 1981) megegyező.

Ezek a tulajdonságok azt jelzik, hogy a HM11 klón tartalmazza a MAO-A teljes kódoló régióját (a HM 11 szekvenciát hordozó E. coli törzset az American Type

Culture Collection törzsgyűjteményébe helyeztük letétbe, ahol a mikroorganizmus a 67 740 sorszámot kapta).

2. példa

Az alábbiakban ismertetjük a humán MAO-A genomi dezoxiribonukleinsav izolálását.

Egy humán genom kozmid könyvtárból izoláljuk a MAO-A proteint kódoló genomi kiónt (A2). Az izoláláshoz a MAO-A-t kódoló, a HM 11 klónból származó inszertet használjuk próbaként. A könyvtárt humán genomi dezoxiribonukleinsavból állították össze kozmid vektorban (C2XB; Bates és munkatársai, Gene, 26, 137,1983; Bates és munkatársai, Methods Enzymol., 153, 82, 1987). Az A2 klón egy körülbelül 30 kb nagyságú genomi dezoxiribonukleinsav inszertet tartalmaz, amelyen belül exonok helyezkednek el, és amelyek együttesen kódolják a MAO-A proteint (az A2 szekvenciát hordozó E. coli sejteket az American Type Culture Collection törzsgyűjteményébe helyeztük letétbe, ahol a törzs a 67 741 sorszámot kapta).

3. példa

A humán MAO expresszálása E. coli sejtekkel az alábbiak szerint történik.

A humán MAO-A gént baktérium gazdasejtekben expresszálhatjuk és a terméket szekretálhatjuk, előnyösen E. coli baktériumban, oly módon, hogy a pUC típusú plazmid vektorokat használjuk fel (Yanisch-Perron és munkatársai, Gene, 33, 103,1985). Ezekaplazmidoklac promoter-operátor rendszert tartalmaznak (lac P/0), ami izopropil-béta-D-tio-galaktozidázzal (IPTG) indukálható (Yanisch-Perron és munkatársai, lásd fent). A processzált protein membránon való átvitelét az E. coli sejt periplazmatikus terébe vagy a termék szekrécióját a táptalajba, a következő gének szignál szekvenciáival oldhatjuk meg:

1) az A külső membrán protein (ompA; Mowa és munkatársai, J. Bioi. Chem., 255, 27, 1980),

2) alkalikus foszfatáz (phoA; Inouye és munkatársai, J.

Bact., 149, 434,1982), vagy

3) pektát liáz (pelB; Lei és munkatársai, J. Bact., 169,

4379,1987).

A HM11 cDNS klón MAO-A kódoló régióját pontosan kapcsolhatjuk olyan dezoxiribonukleinsav fragmensekhez, amelyek szignál szekvenciát határoznak meg. A kapcsolást standard dezoxiribonukleinsav módszerekkel végezhetjük. A kódoló régiót egy riboszóma kötőhely követi, a transzláció iniciációjának biztosítása érdekében. A ligáit dezoxiribonukleinsavat ismert technikákkal E. coli sejtekbe transzformálhatjuk, és arekombináns plazmidokat tartalmazó transzformánsokat restrikciós enzimes analízissel vizsgálhatjuk. Ezután a humán MAO-A polipeptid termelhető a plazmidot hordozó törzzsel és a táptalajból vagy a sejtek lizátumából tisztítható. Ha a humán MAO-A polipeptidet az E. coli proteolitikus enzimei hasítják, úgy a polipeptid expresszióját biztosíthatjuk oly módon, hogy egy kisebb proteáz rezisztens aminosav vezető szekvenciát kapcsolunk a molekulához, ahogy azt Sung és munkatársai megadják (Methods in Enzymology, 153, 385, 1987).

4. példa

Az alábbiakban ismertetjük a humán MAO-A expresszióját élesztő sejtekben.

A MAO-A gén élesztő szekréciós vektorral, például a palfaC3 plazmiddal élesztő sejtekkel expresszálható. A fenti plazmid 1,7 kb nagyságú élesztő genomi fragmenst hordoz az MFalfal strukturgénnel, hordozza továbbá ennek promoterét és transzkriciós terminációs szekvenciáját egy pBR322 alapú vektorban (Zsebo és munkatársai, J. Bioi., Chem., 261, 5858, 1986). A MAO-A-t kódoló HM11 klón egy restrikciós fragmensét (szükség esetén megfelelő adapter vagy linker szekvenciákkal a végek módosíthatók; New England Biolabs., Beverly, MA) a palfaC3 HindlII-sall fragmense helyére építhető be 3’-irányban, az alfa-faktort meghatározó ffagmenshez képest; ekkor a lizin-arginin dipeptid a MAO-A első kodonjától közvetlenül 5’-irányba esik. A lizin-arginin dipeptid felismerő helyet képvisel a KR endoproteáz számára, ez úgy helyezkedik el, hogy az alfa-faktor szekvencia kihasíthatja a hibrid proteint az alfa-faktor peptid és a humán MAO-A közül. A BamHI élesztő fragmens úgy tartalmazza az MFalfal szekvenciát, hogy az közvetlenül kapcsolódik a MAO-A génhez, a boxot egy élesztő alapú vektorba építjük, például az egyetlen BamHI helyet tartalmazó pYE DNS vektorba [FEBS Letters 1991, 286: 142. 146], így biztosítva az expressziót élesztő sejtekben. A rekombináns dezoxiribonukleinsavat élesztőbe, előnyösen Saccharomyces cerevisiae fajba transzformálva, a transzformánsokat megfelelő körülmények között tenyésztve MFalfal-humán MAO-A fúziós peptid keletkezik. A kódolt termék tartalmazza a natív alfa-faktor prekurzor első 83 aminosavát, ez magába foglalja a fúziós polipeptid élesztőben való szekrécióját biztosító szignál peptid szekvenciát. Ez a fúziós polipeptid tartalmazza a KR endoproteáz felismerő szekvenciáját, és így a 83 aminosavból álló prekurzor a sejtben lehasad a MAO-A polipeptidről. A karboxil-vég nem igényli a proteolitikus folyamatot az éréshez, mivel a MAO-A gén végén transzlációs terminációs kodon helyezkedik el.

5. példa

Az alábbiakban ismertetjük a humán MAO-A expresszióját emlős sejtekben.

A humán MAO-A előállítható emlős sejtekkel, például NIH3T3 vagy BHK21 sejtekkel, megfelelő emlős sejt vektor DNS-eket használva, például a retrovírus shuttle vektorral: pZIP-NeoSVX (Cepko és munkatársai, Cell, 37, 1053, 1984). Ezen felül egy metallo-theionein promotert (Choo és munkatársai, DNA, 5, 529, 1986) is beépíthetünk a MAO-A géntől 5'-irányban, amikor a MAO-A expresszió indukálható lesz.

A HM 11 kiónból származó MAO-A-t meghatározó restrikciós fragmens a SVX vektor FTR (long terminál repeat) helyzetéről 3'-irányban eső BamHI helyére beépíthető, megfelelő adapter szekvenciák használatával, így például a humán MAO-A gén kihasítható a HM11 klónból, és beépíthető az SVX vektorba úgy, hogy először EcoRI és Dral restrikciós enzimekkel emésztünk, és izoláljuk a MAO-A proteint kódoló fragmenst. A fragmens EcoRI-Dral végei BamHI végekké alakíthatók Dral/BamHI adapter molekulákkal, és ezután a MAO-A BamHI inszertet ligáljuk a BamHI enzimmel emésztett SVX-hez. Természetesen felhasználhatjuk a HM11 klón vagy az SVX vektor más, megfelelő restrikciós helyeit is. A ligáit dezoxiribonukleinsavat E. coli sejtekbe transzformálhatjuk, mivel az SVX dezoxiribonukleinsav vektor E. coli és emlős sejtekben is fennmarad. Ily módon szelektálhatjuk a MAO-A-SVX rekombináns kiónt, és ezután NIH3T3 vagy BHK21 sejtekbe juttathatjuk. A Dulbecco módosított Eagle, 10% borjú szérummal kiegészített táptalajban fenntartott NIH3T3 sejteket Graham és van dér Eb kalcium-foszfát technikájával transzformálhatjuk a MAO-A-SVX ingázó vektorral (Parker és Stark, J. Virol., 31, 360, 1979). A BHK21 sejteket hasonlóképpen transzformálhatjuk Wigler és munkatársai kalcium-foszfátos módszerével (Cell, 14, 725, 1978), és GIBCO táptalajban, G418 antibiotikum rezisztenciára szelektálhatunk.

Az alábbiakban ismertetjük a MAO-A proteinek tisztítását.

6. példa

A fenti rendszerekkel kifejezett rekombináns MAO-A proteineket a sejt felülúszóból izoláljuk Weyler és Salach módszerei szerint (J. Bioi. Chem., 260, 13199,1985).

7. példa

A továbbiakban diagnosztikumként és terápiás célokra való használatot ismertetünk.

A humán MAO-A gén vagy ennek komplementer ribonukleinsava diagnózisra vagy egészségügyi zavarok kezelésére használható fel, ideértve a MAO-A és MAO-B géneket és a gén által meghatározott termékeket. így például a humán MAO-A génben bekövetkező változások megváltoztathatják a gén kifejeződését, vagy egy megváltozott protein termelését eredményezhetik, ez viszont zavarokat okozhat, például mentális problémákat, mániás depressziót vagy pszichikai tüneteket. Ilyen változások, például átrendeződések, pontmutációk vagy mutációk a szabályozó szekvenciákban okozhatnak megváltozott MAO-A ribonukleinsav szintézist, ezeket a változásokat a MAO-A dezoxiribonukleinsavval vagy ribonukleinsavval diagnosztizálhatjuk. A génváltozások háromféle detekciós rendszerének leírását az alábbiakban adjuk meg.

Ismertetjük a MAO-A próbákat.

A MAO-A dezoxiribonukleinsav vagy ribonukleinsav radioaktívan jelezhető, és próbaként használható fel a Southern biot vizsgálatokban, ahogy azt Maniatis és munkatársai (lásd fent) megadják. Ezzel a módszerrel a teljes humán dezoxiribonukleinsavban felismerhetjük a MAO-A gént. A MAO-B gén ezekkel a technikákkal szintén detektálható, ha bizonyos paramétereket variálunk, például a hibridizációs hőmérsékletet vagy a sókoncentrációt. A MAO-A dezoxiribonukleinsav próba előállítására a MAO-A-t kódoló a HM 11 fragmensből kihasított EcoRI szegmenst ismert módszerekkel elkülönítjük, és Maniatis és munkatársai szerint (lásd előbb) radioaktívan jelezzük. A MAO-A ribonukleinsav próba

HU 214 412 Β előállítására a MAO-A EcoRI dezoxiribonukleinsav fragmenst SP6 vektor dezoxiribonukleinsavba építjük be, és a MAO-A dezoxiribonukleinsav értelmes szálját templátként használjuk a transzkripcióhoz, radioaktív nukleotidok jelenlétében.

A dezoxiribonukleinsav biot analízist az alábbiak szerint végezzük.

A radioaktívan jelzett dezoxiribonukleinsavat vagy ribonukleinsav próbát felhasználhatjuk a MAO-A gén kimutatására a teljes humán dezoxiribonukleinsavból, ami utóbbit előzőleg egy vagy több restrikciós enzimmel emésztettünk. A próba egy vagy több restrikciós fragmenst fog azonosítani, ezek a MAO-A gén egy részét vagy teljes szekvenciáját hordozzák. A MAO-A génben bekövetkező nagyobb átrendeződéseket úgy detektálhatjuk, hogy a dezoxiribonukleinsavat a génhez közel vagy a génen belül két vagy csak néhány helyen hasító restrikciós enzimekkel emésztünk, a gén kisebb régióiban bekövetkező átrendeződéseket nagy valószínűséggel úgy detektálhatjuk, hogy a dezoxiribonukleinsav emésztését a génhez közel, vagy a génen belül több helyen hasító restrikciós enzimmel végezzük. A MAOval összefüggő megbetegedésben szenvedő egyének dezoxiribonukleinsav mintáját összehasonlíthatjuk egészséges egyénekből származó humán dezoxiribonukleinsavval, és abnormális emésztési kép alapján feltárhatjuk a MAO-val összefüggő rendellenességeket.

Az alábbiakban ismertetjük az RFLP és a kapcsoltsági analízis módszerét.

Véletlenszerűen vett dezoxiribonukleinsav mintákat vizsgálhatunk abból a szempontból, hogy a MAO-A kódoló régiókban és a kapcsolódó szekvenciákban egyetlen nukleotid különbség van-e. Úgy járunk el, hogy a dezoxiribonukleinsav mintát restrikciós enzimekkel kezeljük, és a kapott restrikciós fragmenseket Southern hibridizációval elkülönítjük. A módszert Maniatis és munkatársai korábban megadott munkájából ismerhetjük meg. A MAO-A komplementer dezoxiribonukleinsav klón meghatároz egy EcoRV RFLP-t (lásd előbb), amit felhasználhatunk a MAO-A lókusz és a megbetegedési státusz összefüggéseinek feltárásában. A MAO-A genomi kiónt felhasználhatjuk a restrikciós fragmens hosszúságában bekövetkező polimorfizmus (RFLP) feltárásában is, ami a MAO-A génben előfordulhat, például az Mspl RFLP. Az A2 genomi kiónt próbaként használhatjuk az ismétlődő szekvenciák eltávolítását követően. Az ismétlődő szekvenciákat úgy távolítjuk el, hogy az A2 kiónt először EcoRI vagy PstI és Sau3A, vagy bármely megfelelő olyan enzimpárral emésztünk, amely a klónból kihasítja a MAO-A inszertet, és ezt fragmensekké hasítja. Az emésztett MAO-A gént meghatározó dezoxiribonukleinsavat ezután EcoRI vagy PstI és BamHI enzimekkel emésztett pBR 322 plazmid dezoxiribonukleinsavba szubklónozzuk, és a szubklónozott fragmenseket radioaktívan jelzett humán dezoxiribonukleinsawal vizsgáljuk. Az ismétlődő dezoxiribonukleinsavat hordozó szubklónok erősen fognak hibridizálódni, és ezek kizárhatók. A negatív szubklónokat a HM11 klónnal újra vizsgáljuk, és a vizsgálat során pozitívnak bizonyultakat kiemeljük, és RFLP próbaként használjuk fel. Az RFLP módszert Drayna és munkatársai szerint vitelezzük ki (Biotechniques, 4, 412, 1986; lásd továbbá Watkins és munkatársai, Biotechniques, 6, 310, 1988).

Az alábbiakban ismertetjük a ribonukleáz A hasítási reakciót.

A Southern hibridizációval ki nem mutatható MAO-A génen belüli változásokat, például deléciókat, inszerciókat, átrendeződéseket, bázispár-növekedéseket, pontmutációkat úgy tudjuk detektálni, hogy a MAO-A RNS: DNS vagy RNS : RNS duplexek idegen bázispárjait ribonukleáz A enzimmel hasítjuk. A humán bőr fibroblasztok és limfociták használhatók fel, sorrendben, a MAO-A és MAO-B ribonukleáz forrásaként. A ribonukleáz A hasítási reakció azon a tényen alapszik, hogy egyes hibás helyek a ribonukleinsavval vagy dezoxi-ribonukleinsawal alkotott ribonukleinsav hibridekben ribonukleáz A enzimmel hasíthatok. Bázishelyettesítődést egyetlen ribonukleinsav próbával azonosíthatunk, átfedő próbák párjait használhatjuk fel mutált helyek egyértelmű lokalizálására. Egyenlőre nem világos az, hogy mi szükséges a ribonukleáz A érzékenységhez, valószínűnek látszik azonban, hogy a lehetséges egyetlen bázis hiba 30-50%-os valószínűséggel hasad. A deléciókból, inszerciókból vagy átrendeződésekből származó hibás báziskapcsolódások nagy lehetőséget nyitnak a ribonukleáz A hasításhoz, mivel a hibrideken belül j elentősebb mértékben vannak jelen egyszálú régiók. A ribonukleáz A hasítási reakciót (részleteiben lásd Gibbs és munkatársai, Science, 236, 303, 1987) úgy végezzük, hogy a HM 11 MAO-A komplementer dezoxiribonukleinsavból származó humán MAO-A gént hordozó radioaktívan jelzett restrikciós fragmenst, vagy ebből a dezoxiribonukleinsavból szintetizált radioaktívan jelzett értelmetlen (antiszensz) ribonukleinsavat izolálunk.

Az antiszensz ribonukleinsav szintézisére a MAO-A restrikciós fragmenst először pSP6 vektor dezoxiribonukleinsavba építjük be, és az értelmes szálról ribonukleinsavat szintetizálunk. A dezoxiribonukleinsav eltávolítására dezoxi-ribonukleázos kezelést alkalmazunk. A radioaktívan jelzett MAO-A próbát poli(A)-ribonukleinsavhoz hibridizáljuk, ez utóbbit ismert módszerekkel állítjuk elő (lásd Maniatis és munkatársai, lásd előbb). A hibrdeket ezután ribonukleáz A enzimmel hasítjuk, az egyszálú régiók emésztésére és a belső, hibás bázispárosodások megszüntetésére, majd ezt követően a kapott fragmenseket poliakril-amid gélelektroforézissel (denaturáló körülmények között) és autoradiográfiával analizáljuk. A ribonukleáz A mérés további módosításait az alábbi irodalmi forrásokból ismerhetjük meg: Winter és munkatársai, Proc. Nat. Aca. Sci., 82, 7575, 1985; és Myers és munkatársai, Science, 230, 1241, 1985).

Az alábbiakban megadjuk a genomi dezoxiribonukleinsav szekvenálását.

A MAO-A komplementer dezoxiribonukleinsav szekvencia felhasználható a MAO-A kódolórégióban jelenlevő mutációk keresésére. Először a dezoxiribonukleinsav polimeráz láncreakciót (PCR) használjuk (Saiki és munkatársai, Science, 230, 1350, 1985), amit

Lee és munkatársai módosítottak (Science, 239, 1288, 1988). Ily módon a genomi dezoxiribonukleinsavból származó MAO-A kódoló szekvenciát a HM11 printerként használt oligonukleotid szekvenciát felhasználva, enzimatikusan sokszorosítjuk. Egy printernek komplementernek kell lennie a (-) lánccal, a másiknak a MAO-A gén (+) lánchoz. Másodszor, a sokszorosított dezoxiribonukleinsavat didezoxi-módszerrel szekvenáljuk (Sawyer, PNAS, 74, 5463,1977; Read és munkatársai, Biotechniques, 4, 306, 1986). Ha egyszer a MAO-A mutációt szenvedett helyén a szekvenciát meghatároztuk, a mutációt átfedő szintetikus oligonukleotidot szintetizálunk és használunk a továbbiakban próbaként, a hasonló mutációk rutinszerű szkrinelésére; ezt genomi szelektív hibridizációval végezzük.

Az alábbiakban ismertetjük a restrikciós helyek próbáinak használatát.

Ha a mutációt szenvedett szekvencia egy restrikciós enzim által felismert helyen belül fekszik, akkor a minta dezoxiribonukleinsavat az alábbiak szerint szkrineljük, a mutáció felderítésére. A genomi dezoxiribonukleinsavban, vagy a sejtes ribonukleinsavban jelenlevő MAO-A mutációt először sokszorosítjuk oly módon, hogy a dezoxiribonukleinsavat vagy a ribonukleinsavat olyan szintetikus oligonukleotid primerhez hibridizáljuk, amelynek szekvenciáját a MAO-A szekvenciára specifikáltuk. Ezután a sokszorosított dezoxiribonukleinsavhoz egy radioaktívan jelzett szintetikus oligonukleotid próbát, vagy egy, a vad típusú MAO-A génnel komplementer dezoxiribonukleinsav fragmenst hibridizáljunk. A próba szekvenciáját úgy választjuk meg, hogy az átfedje a genetikai mutációt. Egy második, referencia restrikciós enzim által felsimert hasítási hely is benne van a próba szekvenciájában, de ez nem tartalmaz genetikai mutációt. Amikor a próba hibridet alkot a vad típusú dezoxiribonukleinsavval, a két adott restrikciós hasítási helyet a megfelelő restrikciós enzimekkel hasítjuk, és ekkor olyan fragmensek keletkeznek, amelyeket poliakril-amid gélen vagy agarózon megfigyelhetünk. Ugyanakkor, amikor a próba hibridet képez a mutáns dezoxiribonukleinsavval, akkor a hibrid egy báziscserélődést hordoz, és az ezt tartalmazó restrikciós hely az adott restrikciós enzimmel nem hasad; ellentétben a hasítható referencia restrikciós hellyel. Tehát a mutáns hibridek emésztésekor keletkező restrikciós fragmensek a gélen a vad típusú hibridektől különböző látható képet fognak mutatni.

Az alábbiakban ismertetjük a ribonukleinsav hibridizációs analízisét.

Egy MAO-A dezoxiribonukleinsav vagy ribonukleinsav próbát is használhatunk a Northern hibridizációhoz az abnormális MAO-A gén expressziójának detektálására, ahogy azt Maniatis és munkatársai (lásd előbb) leírják, amivel azonosítjuk a ribonukleinsavat kódoló MAO-A-t. A MAO-B ribonukleinsav a MAO-A ribonukleinsav próbával szintén azonosítható oly módon, hogy megfelelően változtatjuk a technika kivitelezése során a hibridizációs hőmérsékletet vagy a sókoncentrációt. A MAO-A gén abnormalitásait, például a reguláló szekvenciákban bekövetkező mutációkat vagy génátrendeződéseket úgy mutathatjuk ki, hogy összehasonlítjuk a MAO-A specifikus ribonukleinsavat abnormális és egészséges egyénektől származó mintákban, vagy detektálunk egy megváltozott transzkripciós nagyságot.

A MAO-gátlás mérését az alábbiak szerint végezzük.

A fentiek szerint expresszált és tisztított MAO-A polipeptidet tesztvegyületként használhatjuk fel bizonyos pszichotikus rendellenességek kezelésére potenciálisan felhasználható MAO-inhibitorok vizsgálatára. Ezeket a vegyületeket hozzáadjuk egy olyan reakcióelegyhez, amelyben megfelelő reakciókörülmények között MAO-katalizált oxidatív dezamináció játszódik le (aminok dezaminációja).

A módszert Edelstein és Breakefield írták le (Cell. Mól. Neurobiol., 6, 121, 1986).

A továbbiakban ismertetjük a MAO mérését.

A MAO-A molekulát felhasználhatjuk diagnosztikumként is oly módon, hogy a MAO-A proteinnel vagy protein fragmensekkel monoklonális antitesteket készítünk a humán megbetegedésekkel együttjáró, megváltozott MAO enzimaktivitás vizsgálatára. A MAO-A és MAO-B vagy a MAO-A egyedüli kimutatására képes monoklonális antitesteket ismert módszerekkel állíthatjuk elő, ahogy azt például Kohler és Milstein leírták (Euro. J. Immunoi., 6, 511, 1976). A monoklonális antitesteket ismert módon ELISA tesztben használjuk, az emberi szöveti minták, például vérsejtek vagy bőrsejtek MAO enzim-tartalmának kvantitatív meghatározására. Szokatlanul magas vagy alacsony MAO koncentrációk jelezhetik a MAO génekben bekövetkező genetikai zavarokat, és bizonyos MAO-val összefüggő megbetegedéseket is.

A MAO-A terápiás adagolása. A MAO-A polipeptidet használhatjuk lokálisan, például a gyomorban, a táplálékokból felszabaduló monoaminok dezaminációjának katalizálására; ezeket fals transzmittereknek nevezzük. A MAO inhibitorokkal kezelt páciensek abnormálisán alacsony MAO-aktivitással rendelkeznek, és ezért nem képesek a kezelés alatt a monoaminokat dezaminálni. Ekkor a monoaminokat tartalmazó élelmekkel szemben fokozott érzékenység nyilvánul meg.

A MAO-A a MAO-t igénylő pácienseknek olyan kapszulákban is adagolható, amelyek sav-rezisztensek, adagolható orálisan vagy intravénás injekcióval, testtömegkilogrammra számítva 0,1-5 mg mennyiségben.

A MAO-A gén vagy rekombináns MAO-A polipeptid felhasználható MAO-hiányos egyének kezelésére, például mániás depressziókor vagy olyan betegek esetén, akik Norrie megbetegedésekben szenvednek, amit egyes esetekben a MAO-A és a MAO-B gének teljes hiánya jellemez.

A humán MAO-A gént hordozó komplementer dezoxiribonukleinsav kiónt felhasználták Norrie megbetegedésben szenvedő két hímnemű unokatestvér deléciót szenvedett génjeinek helyreállításához. Fibroblasztjaikban MAO-A aktivitás nem volt detektálható. Ugyancsak nem volt detektálható ezen betegek MAO-B aktivitása vériemezkéikben és fibroblasztjaikban. Ezen felül a major katekol-amin metabolitok, köztük a vanillil-mandelsav, homovanillinsav és a 3-metoxi-4-hidroxi7

HU 214 412 Β

-fenil-glikol jelentősen csökkent koncentrációban volt jelen vizeletükben. Ezek a megfigyelések azt jelzik, hogy ezekben a betegekben a MAO-A és MAO-B aktivitásokhoz szükséges gének deletálódtak. Ez a genetikai deléció tudomásunk szerint az X kromoszóma Xpl 1.3 régiójában következik be. A rekombináns humán MAO-A polipeptidet a MAO-A deficiens, fentiekhez hasonló pácienseknek adagolható. Eljárhatunk úgy is, hogy a humán MAO-A gént génterápiában a MAO-A forrásaként használjuk fel. A MAO-A hibáival összefüggő betegségeket okozó metabolikus defektusok tartós helyreállítása érdekében a génszekvenciát expresszálható formában kell bevezetnünk a sejtekbe, mégpedig olyanokba, amelyek rendelkeznek szaporodási képességgel, és regenerálják a szövetet. Az alábbiakban ismertetjük a géntranszfert.

Az élő állatokba való génbevitelhez nagyszámú sejtet kell hatékonyan transzformálnunk. A dezoxiribonukleinsav irányított géntranszfer technikái tenyésztett sejtekkel végzett kísérletekben felhasználhatók, azonban nem alkalmasak primer sejttenyészetek vagy élő állatok sejtjeinek transzformálására. Ezért igen hatékony módszereket fejlesztettek ki, amelyek során a rekombináns géneket génsebészettel előállított vírusrészecskékbe zárják, és a rekombináns vírussal kivitelezett fertőzéssel juttatják a sejtekbe. Ezt a technikát vírus által szabályozott géntranszfemek hívják, és a rekombináns vírusokat vírusvektoroknak nevezik. Bizonyos esetekben előnyös lehet, ha a bevitt gén csak bizonyos szövetekbe fejeződik ki, vagy csak bizonyos szövetekben szabályozódik a gén kifejeződése. Előállítható olyan expressziós vektor, amelynek promotere mindegyik sejtben, vagy csak előre kiválasztott sejtekben funkcionál, például a majom vírus (simian viral 40) vagy az adeno vírus promoterek hatékony transzkripciót biztosítanak gyakorlatilag az összes sejtben. Egyes promoterek a direkt kifejeződést szövetspecifikus módon szabályozzák. A hemoglobin gének promoterei a transzkripciót csak bizonyos csontvelőből származó sejtekben szabályozzák, míg a neurofilamentumokból származó promoterek, a tirozin-hidroxiláz vagy a gliafibrilláris savas protein (GFAP) gének promoterei a transzkripciót csak az idegrendszer bizonyos sejtjeiben irányítják. Más promoterek csak különböző hormonok vagy gyógyszerek jelenlétében aktívak. Az expressziós vektorokban ilyan promotereket használva, a rekombináns gén transzkripciój a in vivő regulálható. Ami a MAO-A hiányos páciensek terápiáját illeti, MAO-A gént hordozó vírusokkal fertőzött tenyésztett sejtekkel kezelhetők, oly módon, hogy ezeket a test megfelelő régióiba transzplantáljuk.

A leírásban megadott mikroorganizmusokat az alábbi helyeken tettük letétbe:

A HM 11 és A2 szekvenciákat tartalmazó E. coli sejteket az American Type Culture Collection, Rockville, Maryland helyeztük letétbe 1988. június 30-án, ahol a „Budapest Egyezmény” értelmében az alábbi sorszámokat kapták: 67740 és 67741.

Claims (14)

1. Eljárás humán monoamin-oxidáz A előállítására, azzal jellemezve, hogy valamely gazdasejtet humán monoamin-oxidáz A-t kódoló tisztított DNS-sel transzformálunk, a sejteket tenyésztjük, majd a keletkezett enzimet kinyerjük.

2. Az 1. igénypont szerinti eljárás, azzal jellemezve, hogy genomális DNS-ből származó DNS-t alkalmazunk.

3. Az 1. igénypont szerinti eljárás, azzal jellemezve, hogy cDNS-ből származó DNS-t alkalmazunk.

4. Eljárás humán monoamin-oxidáz A-t termelő sejt előállítására, azzal jellemezve, hogy egy gazdasejtet monoamin-oxidázt kódoló DNS-t magában foglaló vektorral transzformálunk.

5. A 4. igénypont szerinti eljárás, azzal jellemezve, hogy egy promoterből és egy szignál peptidet kódoló szekvenciából álló szabályozó DNS szakasz szabályozása alatt álló DNS-szekvenciát tartalmazó vektort alkalmazunk.

6. A 4. igénypont szerinti eljárás, azzal jellemezve, hogy gazdasejtként baktérium sejtet alkalmazunk.

7. A 4. igénypont szerinti eljárás, azzal jellemezve, hogy gazdasejtként emlős sejtet alkalmazunk.

8. A 4. igénypont szerinti eljárás, azzal jellemezve, hogy gazdasejtként élesztő sejtet alkalmazunk.

9. Az 1. igénypont szerinti eljárás, azzal jellemezve, hogy a 6-8. igénypontok bármelyike szerint előállított sejteket tenyésztjük.

10. A 6. igénypont szerinti eljárás, azzal jellemezve, hogy az E. coli ATCC 67740 törzset tenyésztjük.

11. A 6. igénypont szerinti eljárás, azzal jellemezve, hogy az E. coli ATCC 67741 törzset tenyésztjük.

12. Diagnosztikai eljárás a monoamin-oxidáz A génnel vagy géntermékkel összefüggő betegségek meghatározására, azzal jellemezve, hogy a betegtől DNS-t izolálunk, és azt humán monoamin-oxidáz A-t kódoló tisztított DNS-sel hibridizáljuk.

13. A 12. igénypont szerinti eljárás, azzal jellemezve, hogy cDNS-ből származó DNS-t alkalmazunk.

14. Diagnosztikai eljárás a monoamin-oxidáz A génnel vagy géntermékkel összefüggő betegségek meghatározására, azzal jellemezve, hogy a betegtől DNS-t izolálunk, és azt humán monoamin-oxidáz A-t kódoló tisztított DNS-ből átírt RNS-sel hibridizáljuk.

HU 214 412 Β Int. Cl.⁶: C 12 N 9/02 kJ >1

I rt

I

0) —<

1—

-Ω '03 o

ki

CM

P in <

Pi ki

H

I r—4 (Ö >

t

M