ES2370710T3

ES2370710T3 - ISÓMERO POSICIONAL DE PEG DE UN ANTICUERPO ANTI-TNFalfa (CDP870).

Info

Publication number: ES2370710T3
Application number: ES03731385T
Authority: ES
Inventors: Ned M. Mozier
Original assignee: UCB Pharma SA
Current assignee: UCB Pharma SA
Priority date: 2002-05-28
Filing date: 2003-05-28
Publication date: 2011-12-22
Anticipated expiration: 2023-05-28
Also published as: EP1534753A4; ATE518885T1; US20060110382A1; WO2003099226A3; WO2003099226A2; AU2003240790A8; JP4418745B2; JP2005529154A; AU2003240790A1; EP1534753B1; EP1534753A2; US7601817B2

Abstract

Una molécula de anticuerpo aislada que es un fragmento Fab modificado, cuyas secuencias de aminoácidos de la cadena ligera (SEQ ID NO:1) y de la cadena pesada (SEQ ID NO:2) son como se indica en la figura 2, en la que un resto polietilenglicol (PEG) está unido a Cys 214 de la cadena ligera.

Description

Is6mero posicional de PEG de un anticuerpo anti-TNFalfa (CDP870).

La presente solicitud reivindica la prioridad de la solicitud internacional nO de serie PCT/US 30/08608, presentada el 20 de marzo, 2003, y bajo el Tftulo 35, C6digo de EEUU §119, de la solicitud provisional de EEUU nO de serie 5 60/383.765, presentada el 28 de mayo, 2002, que se incorporan como referencia en su totalidad como si estuvieran escritas en la presente.

Campo de la inveneian

La presente descripci6n se refiere a is6meros posicionales de PEG de protefnas recombinantes. De modo mas especffico, se refiere a los is6meros posicionales de PEG de un anticuerpo que tiene especificidad por los

10 determinantes antigenicos del factor de necrosis tumoral-alfa (TNFα) humano. De modo mas especffico, se refiere a los is6meros posicionales de PEG de CDP870. La presente invenci6n tambien se refiere a composiciones que comprenden los is6meros posicionales de PEG y a los usos terapeuticos del anticuerpo.

Anteeedentes de la inveneian

En una molecula de anticuerpo existen dos cadenas pesadas y dos cadenas ligeras. Cada cadena pesada y cada

15 cadena ligera tienen, en su extremo N-terminal, un dominio variable. Cada dominio variable esta compuesto por cuatro regiones de marco (FR) que alternan con tres regiones determinantes de la complementariedad (CDR). Los restos en los dominios variables se numeran, de modo convencional, segun un sistema concebido por Kabat et al. Este sistema se expone en Kabat et al., 1987, en Sequences of Proteins of Immunological Interest, US Department of Health and Human Services, NIH, EEUU (en lo sucesivo "Kabat et al. (supra)"). Este sistema de numeraci6n se

20 emplea en la presente memoria descriptiva, excepto cuando se indique lo contrario.

Las denominaciones de restos de Kabat no siempre se corresponde directamente con la numeraci6n lineal de los restos aminoacidos. La secuencia de aminoacidos lineal real puede contener menos o mas aminoacidos que la numeraci6n de Kabat estricta, que se corresponden con un acortamiento de un componente estructural o con una inserci6n en un componente estructural, tanto un marco como una CDR, de la estructura basica del dominio variable.

25 La numeraci6n de Kabat correcta de los restos puede determinarse para un anticuerpo concreto mediante el alineamiento de los restos de homologfa en la secuencia del anticuerpo, con una secuencia numerada segun Kabat "patr6n".

Las CDR del dominio variable de cadena pesada se localizan en los restos 31-335 (CDRH1), los restos 50-65 (CDRH2), y los restos 95-102 (CDRH3), segun la numeraci6n de Kabat.

30 Las CDR del dominio variable de cadena ligera se localizan en los restos 24-34 (CDRL1), los restos 50-65 (CDRL2), y los restos 89-97 (CDRL3), segun la numeraci6n de Kabat.

La construcci6n de anticuerpos con CDR injertadas se describe en la solicitud de patente europea EP-A-0239400, que describe un proceso en el que las CDR de un anticuerpo monoclonal de rat6n se injertan en las regiones de marco de los dominios variables de una inmunoglobulina humana mediante mutagenesis dirigida especffica de sitio

35 utilizando oligonucle6tidos largos. Las CDR determinan la especificidad de uni6n al antfgeno de los anticuerpos, y son secuencias peptfdicas relativamente cortas portadas por las regiones de marco de los dominios variables.

El primer trabajo sobre la humanizaci6n de anticuerpos monoclonales mediante injertos de CDR se realiz6 con anticuerpos monoclonales que reconocen antfgenos sinteticos, tales como NP. Sin embargo, se han descrito ejemplos en los que un anticuerpo monoclonal de rat6n que reconoce a la lisozima, y un anticuerpo monoclonal de

40 rat6n que reconoce un antfgeno sobre celulas T humanas se han humanizado mediante injertos de CDR en Verhoeyen et al. (Science, 239, 1534-1536, 1988) y Riechmann et al. (Nature, 332, 323-324, 1988), respectivamente.

Riechmann et al. descubrieron que la transferencia s6lo de CDR (segun se define en Kabat (Kabat et al. (supra)), y Wu et al., J. Exp. Med., 132, 211-250, 1970) no es suficiente para proporcionar una actividad de uni6n al antfgeno

45 satisfactoria en el producto con CDR injertadas. Se descubri6 que debe alterarse una serie de restos del marco para que se correspondan con los de la regi6n de marco donante. Los criterios propuestos para seleccionar los restos del marco que es necesario alterar se describen en la solicitud de patente internacional WO 90/07861.

Se han publicado una serie de informes que analizan los anticuerpos con CDR injertadas, que incluye Vaughan et al. (Nature Biotechnology, 16, 535-539, 1998).

50 El TNFα es una citoquina proinflamatoria que es liberada por las celulas del sistema inmunol6gica e interacciona con estas. Por tanto, el TNFα es liberado por macr6fagos que han sido activados por lipopolisacaridos (LPS) de bacterias gram-negativas. Como tal, el TNFα parece ser un mediador end6geno de importancia capital implicado en el desarrollo y la patogenesis del choque endot6xico asociado con la sepsis bacteriana. Tambien se ha demostrado que el TNFα esta sobrerregulado en una serie de enfermedades humanas, que incluyen enfermedades cr6nicas,

tales como la artritis reumatoide, la enfermedad de Crohn, la colitis ulcerosa y la esclerosis multiple. Ratones transgenicos para la TNFα humana producen altos niveles de TNFα constitutivamente, y desarrollan una poliartritis espontanea y destructiva que se parece a la artritis reumatoide (Kaffer et al., EMBO J., 10, 4025-4031, 1991). Por tanto, el TNFα se denomina una citoquina proinflamatoria.

Tambien se han descrito anticuerpos monoclonales contra el TNFα en la tecnica anterior. Meager et al. (Hybridoma, 6, 305-311, 1987) describen anticuerpos monoclonales murinos contra TNFα recombinante. Fendly et al. (Hybridoma, 6, 359-370, 1987) describen el uso de anticuerpos monoclonales murinos contra TNFα recombinante para la definici6n de epitopos neutralizantes sobre el TNF. Shimamoto et al. (Immunology Letters, 17, 311-318, 1988) describen el uso de anticuerpos monoclonales murinos contra TNF7 y su uso para prevenir el choque endot6xico en ratones. Ademas, en la solicitud de patente internacional WO 92/11383, se describen anticuerpos recombinantes, que incluyen anticuerpos con CDR injertadas, especfficos para el TNFα. Rankin et al. (British J. Rheumatology, 34, 334-342, 1995) describen el uso de dichos anticuerpos con CDR injertadas para el tratamiento de la artritis reumatoide. El documento US-A-5.919.452 describe anticuerpos quimericos anti-TNF y su uso para tratar patologfas asociadas con la presencia de 5 TNF.

Se han propuesto anticuerpos contra el TNFα para la profilaxis y el tratamiento del choque endot6xico (Beutler et al., Science, 234, 470-474, 1985). Bodmer et al. (Critical Care Medicine, 21, S441-S336, 1993), y Wherry et al. (Critical Care Medicine, 21, S436-S440, 1993) analizan el potencial terapeutico de anticuerpos anti-TNFα para el tratamiento del choque septico. El uso de los anticuerpos anti-TNFα para el tratamiento del choque septico tambien es analizado por Kirschenbaum et al. (Critical Care Medicine, 26, 1625-1628, 1998). La artritis inducida por colageno tambien puede tratarse de modo eficaz utilizando un anticuerpo monoclonal anti-TNFα (Williams et al., PNAS-USA, 89, 97849788, 1992).

Se encuentran niveles mayores de TNFα en el fluido sinovial y en la sangre periferica de pacientes que padecen artritis reumatoide. Cuando se administran agentes bloqueantes del TNFα a pacientes que padecen artritis reumatoide, los agentes reducen la inflamaci6n, mejoran los sfntomas, y retrasan los dafos en las articulaciones (McKown et al., Arthritis Reum., 42, 1204-1208, 1999).

El uso de anticuerpos anti-TNFα para el tratamiento de la artritis reumatoide y de la enfermedad de Crohn se analiza en Feldman et al. (Transplantation Proceedings, 30, 4126-4127, 1998), Adorini et al. (Trends in Immunology Today, 18, 209-211, 1997), y en Feldman et al. (Advances in Immunology, 64, 283-350, 1997). Los anticuerpos contra TNFα utilizados en estos tratamientos son, en general, anticuerpos quimericos, tales como los descritos en el documento US-A-5919452.

En la actualidad se ha autorizado la comercializaci6n de dos productos bloqueantes del TNFα para el tratamiento de la artritis reumatoide. El primero, denominado etanercept, es comercializado por Immunex Corporation como Enbrel™. Es una protefna de fusi6n recombinante que comprende dos dominios del receptor de TNF soluble p75 unidos a la porci6n Fc de una inmunoglobulina humana. El segundo, denominado infliximab, es comercializado por Centocor Corporation como Remicade™. Es un anticuerpo quimerico que tiene dominios variables anti-TNFα murinos y dominios constantes de IgG I humanos.

Las moleculas de anticuerpos anti-TNFα recombinantes de la tecnica anterior en general tienen una afinidad reducida por el TNFα comparado con los anticuerpos a partir de los cuales se derivan las regiones variables o las CDR, en general deben producirse en celulas de mamffero y son caras de fabricar. Los anticuerpos anti-TNFα de la tecnica anterior se describen en Stephens et al. (Immunology, 85, 668-674, 1995), los documentos GB-A-2.246.570 y GB-A-2.297.145.

El documento WO 01/94585 describe moleculas de anticuerpo que tienen una alta afinidad por el TNFα y baja inmunogenicidad en seres humanos, que pueden utilizarse repetidamente y que pueden producirse de modo facil y eficaz, para tratar enfermedades inflamatorias cr6nicas.

Sumario de la inveneian

Esta descripci6n comprende is6meros posicionales de PEG de protefnas recombinantes, preferiblemente is6meros posicionales de PEG de un anticuerpo que tiene especificidad por determinantes antigenicos del factor de necrosis tumoral-alfa (TNFα). La presente invenci6n se refiere tambien a composiciones que comprenden los is6meros y a los usos terapeuticos del anticuerpo.

Breve deseripeian de los dibujos

La figura 1 muestra la secuencia de aminoacidos de las cadenas ligera y pesada de CDP870, el apareamiento de disulfuros intramolecular, el apareamiento de disulfuros intermolecular predominante entre las cadenas ligera y pesada y la cistefna para la conjugaci6n del PEG.

La figura 2 muestra la secuencia de aminoacidos de las cadenas ligera y pesada del is6mero posicional de PEG de CDP870, estando el PEG unido a Cys 214 de la cadena ligera (CDP870-PEG-1214). Los restos de interes (Cys-214

de la cadena ligera, Cys-221 de la cadena pesada, y Cys-227 de la cadena pesada) estan marcados.

Deseripeian detallada de la inveneian

En un primer aspecto, la presente invenci6n proporciona is6meros posicionales de PEG de protefnas recombinantes, que tienen un sitio de uni6n a PEG alternativo. Un "is6mero posicional de PEG de un anticuerpo" se define como un anticuerpo que tiene un sitio de uni6n a PEG distinto del sitio de uni6n a PEG predominante. Preferiblemente, el is6mero posicional de PEG es de un anticuerpo que tenga especificidad por los determinantes antigenicos del factor de necrosis tumoral-alfa (TNFα) humano. Preferiblemente, el anticuerpo de TNFα es un anticuerpo de TNFα descrito en el documento WO 01/04585. Preferiblemente, el anticuerpo es CDP870.

El documento WO 01/04585 proporciona una molecula de anticuerpo que tiene especificidad por TNFα, que comprende una cadena pesada en la que el dominio variable comprende una CDR (segun definen Kabat et al. (supra)) que tiene la secuencia indicada como HI en la figura 3 del documento WO 01/94585 (SEQ ID NO:1 del documento WO 01/94585) para CDRHI, como H2' en la figura 3 del documento WO 01/94585 (SEQ ID NO:2 del documento WO 01/94585), o como H2 en la figura 3 del documento WO 01/94585 (SEQ ID NO:7 del documento WO 01/94585) para CDRH2, o como H3 en la figura 3 del documento WO 01/94585 (SEQ ID NO:3 del documento WO 01/94585) para CDRH3.

La molecula de anticuerpo del documento WO 01/94585 comprende al menos una CDR seleccionada de H1, H2' o H2 y H3 (SEQ ID NO:1, SEQ ID NO:2 o SEQ ID NO:7 y SEQ ID NO:3 del documento WO 01/94585) para el dominio variable de cadena pesada. Preferiblemente, la molecula de anticuerpo comprende al menos dos, y mas preferiblemente las tres CDR en el dominio variable de cadena pesada.

En el documento WO 01/94585 se proporciona una molecula de anticuerpo que tiene especificidad por el TNFα humano, que comprende una cadena ligera en la que el dominio variable comprende una CDR (segun definen Kabat et al. (supra)) que tiene la secuencia indicada como L1 en la figura 3 del documento WO 01/94585 (SEQ ID NO:4 del documento WO 01/94585) para CDRL1, L2 en la figura 3 del documento WO 01/91585 (SEQ ID NO:5 del documento WO 01/94585) para CDRL2, o L3 en la figura 3 del documento WO 01/94585 (SEQ ID NO:6 del documento WO 01/94585) para CDRL3.

La molecula de anticuerpo del documento WO 01/94585 comprende al menos una CDR seleccionada de L1, L2 y LE (SEQ ID NO:4 a SEQ ID NO:6 del documento WO 01/94585) para el dominio variable de cadena ligera. Preferiblemente, la molecula de anticuerpo comprende al menos dos, y mas preferiblemente las tres CDR en el dominio variable de cadena ligera.

Las moleculas de anticuerpos del documento WO 01/94585 preferiblemente tienen una cadena ligera complementaria o una cadena pesada complementaria, respectivamente.

Preferiblemente, la molecula de anticuerpo del documento WO 01/94585 comprende una cadena pesada en la que el dominio variable comprende una CDR (segun definen Kabat et al. (supra)) que tiene la secuencia indicada como H1 en la figura 3 del documento WO 01/94585 (SEQ ID NO:1 del documento WO 01/94585) para CDRH1, como H2'

o H2 en la figura 3 del documento WO 01/94585 (SEQ ID NO:2 o SEQ ID NO:7 del documento WO 01/94585) para CDRH2, o como H3 en la figura 3 del documento WO 01/94585 (SEQ ID NO:3 del documento WO 01/94585) para CDRH3, y una cadena ligera en la que el dominio variable comprende una CDR (segun definen Kabat et al. (supra)) que tiene la secuencia indicada como L1 en la figura 3 del documento WO 01/94585 (SEQ ID NO:4 del documento WO 01/94585) para CDRL1, como L2 en la figura 3 del documento WO 01/94585 (SEQ ID NO:5 del documento WO 01/94585) para CDRL2, o como L3 en la figura 3 del documento WO 01/94585 (SEQ ID NO:6 del documento WO 01/94585) para CDRL3.

Las CDR que aparecen en SEQ ID NO:1 y 3 a 7 del documento WO 01/94585, y en la figura 3 del documento WO 01/94585, se derivan de un anticuerpo monoclonal de rat6n de hTNF40. Sin embargo, SEQ ID NO:2 del documento WO 01/94585 consiste en una CDR hfbrida. La CDR hfbrida comprende parte de la CDR2 de cadena pesada del anticuerpo monoclonal de rat6n de hTNF40 (SEQ ID NO:7 del documento WO 01/94585) y parte de la CDR2 de cadena pesada de una secuencia de la regi6n V de la lfnea germinal del grupo 3 humana.

Las secuencias completas de los dominios variables del anticuerpo de hTNF40 de rat6n se muestran en la figura 6 del documento WO 01/94585 (cadena ligera) (SEQ ID NO:99 del documento WO 01/94585) y la figura 7 del documento WO 01/94585 (cadena pesada) (SEQ ID NO:100 del documento WO 01/94585). Este anticuerpo de rat6n se denomina en lo sucesivo "anticuerpo donante".

Una primera realizaci6n alternativa del documento WO 01/94585 es el anticuerpo monoclonal de rat6n de hTNF40 que tiene las secuencias del dominio variable de cadena ligera y pesada mostradas en la figura 6 del documento WO 01/94585 (SEQ ID NO:99 del documento WO 01/94585) y la figura 7 del documento WO 01/94585 (SEQ ID NO:100 del documento WO 01/94585), respectivamente. La regi6n constante de la cadena ligera de hTNF40 es kappa, y la regi6n constante de la cadena pesada es IgG2a.

En una segunda realizaci6n alternativa del documento WO 01/94585, el anticuerpo segun cualquiera del primer y

segundo aspecto del documento WO 01/94585 es una molecula de anticuerpo quimerica de rat6n/humana, denominada en la presente molecula de anticuerpo de hTNF40 quimerica. La molecula de anticuerpo quimerica comprende los dominios variables del anticuerpo monoclonal de rat6n de hTNF40 (SEQ ID NO:99 y 100 del documento WO 01/94585) y dominios constantes humanos. Preferiblemente, la molecula de anticuerpo de hTNF40 quimerica comprende el dominio C kappa humano (Hieter et al., Cell, 22, 197-207, 1980; nO de registro de Genebank J00241) en la cadena ligera, y los dominios gamma 4 humanos (Flanagan et al., Nature, 300, 709-713, 1982) en la cadena pesada.

En una tercera realizaci6n alternativa del documento WO 01/94585, el anticuerpo es una molecula de anticuerpo con CDR injertadas. La expresi6n "una molecula de anticuerpo con CDR injertadas", tal como se emplea en la presente, se refiere a una molecula de anticuerpo en la que la cadena pesada y/o ligera contiene una o mas CDR (incluyendo, si se desea, una CDR hfbrida) procedentes del anticuerpo donante (por ejemplo, un anticuerpo monoclonal murino) injertada en el marco de la regi6n variable de cadena pesada y/o ligera de un anticuerpo aceptor (por ejemplo, un anticuerpo humano).

Preferiblemente, dicho anticuerpo con CDR injertadas tiene un dominio variable que comprende regiones marco aceptoras humanas, asf como una o mas de las CDR del donante indicadas anteriormente.

Cuando las CDR se injertan, puede utilizarse cualquier secuencia de marco de la regi6n variable del aceptor apropiada teniendo en cuenta la clase/tipo de anticuerpo donante del cual se derivan las CDR, incluyendo regiones marco de rat6n, primate y humanas. Los ejemplos de marcos humanos del documento WO 01/94585 son KOL, NEWM, REI, EU, TUR, TEI, LAY, y PQM (Kabat et al. (supra)). Por ejemplo, KOL y NEWM pueden utilizarse para la cadena pesada, REI puede utilizarse para la cadena ligera, y EU, LAY y POM pueden utilizarse para ambas cadena pesada y cadena ligera. Las regiones de marco preferidas para la cadena ligera son las regiones de marco del grupo 1 humanas mostradas en la figura 1 (SEQ ID NO:83, 85, 87 y 89 del documento WO 01/94585). Las regiones de marco preferidas para la cadena pesada son las regiones de marco del grupo 1 y del grupo 3 humanas mostradas en la figura 2 (SEQ ID NO:91, 93, 95 y 97, y SEQ ID NO:106, 107, 108 y 109 del documento WO 01/94585), respectivamente.

En un anticuerpo con CDR injertadas del documento WO 01/94585 se prefiere utilizar, como anticuerpo aceptor, un anticuerpo que tenga cadenas que sean hom6logas con las cadenas del anticuerpo donante. No es necesario que las cadenas pesada y ligera del aceptor se deriven del mismo anticuerpo y pueden comprender, si se desea, cadenas compuestas que tengan regiones de marco derivadas de diferentes cadenas.

Ademas, en un anticuerpo con CDR injertadas del documento WO 01/94585, no es necesario que las regiones de marco tengan exactamente la misma secuencia que las del anticuerpo aceptor. Por ejemplo, pueden cambiarse restos poco habituales por restos que aparezcan con mas frecuencia para la cadena de esa clase o tipo de aceptor. Como alternativa, pueden cambiarse restos seleccionados en las regiones de marco del aceptor de forma que se correspondan con el resto que se encuentra en la misma posici6n en el anticuerpo donante. Estos cambios deben mantenerse al grado mfnimo necesario para recuperar la afinidad del anticuerpo donante. Un protocolo para seleccionar restos en las regiones de marco del aceptor que puede ser necesario cambiar se indica en el documento WO 91/09967.

Preferiblemente, en una molecula de anticuerpo con CDR injertadas del documento WO 01/94585, si la cadena pesada del aceptor tiene regiones de marco del grupo 1 humanas (que se muestran en la figura 2 del documento WO 01/94585) (SEQ ID NO:91, 93, 95 y 97 del documento WO 01/94585), entonces las regiones de marco de la cadena pesada del aceptor comprenden, ademas de una o mas CDR del donante, restos del donante en las posiciones 28, 69 y 71 (segun Kabat et al. (supra)).

Como alternativa, si la cadena pesada del aceptor tiene regiones de marco del grupo 1, entonces las regiones de marco de la cadena pesada del aceptor comprenden, ademas de una o mas CDR del donante, restos del donante en las posiciones 28, 38, 46, 67, 69 y 71 (segun Kabat et al. (supra)).

Preferiblemente, en una molecula de anticuerpo con CDR injertadas del documento WO 01/94585, si la cadena pesada del aceptor tiene regiones de marco del grupo 3 humanas (que se muestran en la figura 2 del documento WO 01/94585) (SEQ ID NO:106, 107, 108 y 109 del documento WO 01/94585), entonces las regiones de marco de la cadena pesada del aceptor comprenden, ademas de una o mas CDR del donante, restos del donante en las posiciones 27, 28, 30, 48, 49, 69, 71, 73, 76 y 78 (segun Kabat et al. (supra)).

Preferiblemente, en una molecula de anticuerpo con CDR injertadas del documento WO 01/94585, si la cadena ligera del aceptor tiene regiones de marco del grupo 1 humanas (que se muestran en la figura 1 del documento WO 01/94585) (SEQ ID NO:83, 85, 87 y 89 del documento WO 01/94585), entonces las regiones de marco de la cadena ligera del aceptor comprenden restos del donante en las posiciones 46 y 60 (segun Kabat et al. (supra)).

Los restos del donante son restos procedentes del anticuerpo donante, es decir, el anticuerpo del cual se derivaron originariamente las CDR.

La molecula de anticuerpo del documento WO 01/94585 puede comprender una molecula de anticuerpo completa,

que tiene cadenas pesadas y ligeras de longitud completa; su fragmento, tal como un fragmento Fab, Fab modificado, Fab', F(ab')2, o Fv; un mon6mero o un dfmero de cadena ligera o de cadena pesada; un anticuerpo monocatenario, es decir, un Fv monocatenario en el que los dominios variables de cadena pesada y ligera estan unidos mediante un conector peptfdico. De forma similar, las regiones variables de cadena pesada y ligera pueden combinarse con otros dominios de anticuerpos segun sea apropiado.

Preferiblemente, la molecula de anticuerpo del documento WO 01/94585 es un fragmento Fab. Preferiblemente, el fragmento Fab tiene una cadena pesada que posee la secuencia indicada como SEQ ID NO:111 del documento WO 01/94585, y una cadena ligera que posee la secuencia indicada como SEQ ID NO:113 del documento WO 01/94585. Las secuencias de aminoacidos indicadas en SEQ ID NO:111 y SEQ ID NO:113 del documento WO 01/94585 estan codificadas preferiblemente por las secuencias de nucle6tidos indicadas en SEQ ID NO:110 y SEQ ID NO:112 del documento WO 01/94585, respectivamente.

Como alternativa, se prefiere que la molecula de anticuerpo del documento WO 01/94585 sea un fragmento Fab modificado, en el que la modificaci6n es la adici6n al extremo C-terminal de su cadena pesada de uno o mas aminoacidos para permitir la uni6n de una molecula efectora o indicadora. Los aminoacidos adicionales forman una regi6n bisagra modificada que contiene uno o dos restos cistefna a los cuales puede unirse la molecula efectora o indicadora. Este fragmento Fab modificado preferiblemente tiene una cadena pesada que posee la secuencia indicada como SEQ ID NO:115 del documento WO 01/94585, y la cadena ligera que tiene la secuencia indicada como SEQ ID NO:113 del documento WO 01/94585. La secuencia de aminoacidos indicada en SEQ ID NO:115 del documento WO 01/94585 esta codificada preferiblemente por la secuencia de nucle6tidos indicada en SEQ ID NO:114 del documento WO 01/94585.

Un grupo efector preferido del documento WO 01/94585 es una molecula polimerica, que puede estar unida al fragmento Fab modificado para aumentar su semivida in vivo.

La molecula polimerica puede ser, en general, un polfmero natural o sintetico, por ejemplo un polfmero de polialquileno, polialquenileno o polioxialquileno de cadena lineal o ramificada opcionalmente sustituido, o un polisacarido ramificado o no ramificado, por ejemplo un homo-o heteropolisacarido.

Los sustituyentes opcionales concretos, que pueden estar presentes sobre los polfmeros sinteticos mencionados anteriormente, incluyen uno o mas grupos hidroxi, metilo o metoxi. Los ejemplos concretos de polfmeros sinteticos incluyen polietilenglicol, polipropilenglicol y poli(alcohol vinflico) de cadena lineal o ramificada opcionalmente sustituidos o sus derivados, en especial polietilenglicol opcionalmente sustituido, tal como metoxipolietilenglicol o sus derivados. Los polfmeros naturales concretos incluyen lactosa, amilosa, dextrano, gluc6geno o sus derivados. "Derivados", tal como se emplea en la presente, pretende incluir derivados reactivos, por ejemplo grupos reactivos selectivos de tiol, tales como maleimidas y similares. El grupo reactivo puede estar unido directamente o a traves de un segmento conector al polfmero. Se apreciara que el resto de dicho grupo en algunos casos formara parte del producto como grupo conector entre el fragmento de anticuerpo y el polfmero.

El tamafo del polfmero puede variar segun se desee, pero en general estara en un intervalo de peso molecular medio de 500 Da a 50000 Da, preferiblemente de 5000 a 40000 Da, y mas preferiblemente de 25000 a 40000 Da. El tamafo del polfmero puede seleccionarse, en particular, basandose en el uso previsto del producto. Asf, por ejemplo, cuando este previsto que el producto abandone la circulaci6n y penetre en los tejidos, por ejemplo para su uso para el tratamiento de un tumor, puede resultar ventajoso utilizar un polfmero de peso molecular bajo, por ejemplo con un peso molecular de aproximadamente 5000 Da. Para aplicaciones en las que el producto permanece en la circulaci6n, puede resultar ventajoso utilizar un polfmero de peso molecular mayor, por ejemplo que tenga un peso molecular en el intervalo de 25000 a 40000 Da.

Los polfmeros particularmente preferidos incluyen un polfmero de polialquileno, tal como polietilenglicol o, en especial, un metoxipolietilenglicol o su derivado, y en especial con un peso molecular en el intervalo de aproximadamente 25000 Da a aproximadamente 40000 Da.

Cada molecula polimerica unida al fragmento de anticuerpo modificado puede estar unida covalentemente al atomo de azufre de un resto cistefna localizado en el fragmento. El enlace covalente sera en general un enlace disulfuro o, en particular, un enlace azufre-carbono.

Cuando se desee, el fragmento de anticuerpo puede tener una o mas moleculas efectoras o indicadoras unidas a el. Las moleculas efectoras o indicadoras pueden estar unidas al fragmento de anticuerpo a traves de cualquier cadena lateral de aminoacidos disponible o al grupo funcional aminoacido terminal localizado en el fragmento, por ejemplo cualquier grupo amino, imino, hidroxilo o 5 carboxilo libres.

Puede utilizarse un polfmero activado como material de partida para la preparaci6n de fragmentos de anticuerpos modificados con polfmeros, tal como se describi6 anteriormente. El polfmero activado puede ser cualquier polfmero que contenga un grupo reactivo tiol, tal como un ester o acido α-halocarboxflico, por ejemplo yodoacetamida, una imida, por ejemplo maleimida, una vinil sulfona, o un disulfuro. Estos materiales de partida pueden obtenerse en el mercado (por ejemplo, en Shearwater Polymers Inc., Hunstville, AL, EEUU) o pueden prepararse a partir de materiales de partida disponibles en el mercado utilizando procedimientos qufmicos convencionales.

Con respecto a los restos polietilenglicol (PEG) unidos, se hace referencia a "Poly(ethyleneglycol) Chemistry, Biotechnical and Biomedical Applications", 1992, J. Milton Harris (ed.), Plenum Press, Nueva York; "Poly(ethyleneglycol) Chemistry and Biological Applications", 1997, J. Milton Harris y S. Zalipsky (eds.), American Chemical Society, Washington D.C.; y "Bioconjugation Protein Coupling Techniques for the Biomedical Sciences", 1998, M. Aslam y A. Dent, Grove Publishers, Nueva York.

Cuando se desee obtener un fragmento de anticuerpo unido a una molecula efectora o indicadora, esto puede realizarse mediante procedimientos qufmicos o de ADN recombinante convencionales, en los que el fragmento de anticuerpo se une directamente o a traves de un agente acoplante a la molecula efectora o indicadora antes o despues de la reacci6n con el polfmero activado, segun sea apropiado. Los procedimientos qufmicos concretos incluyen, por ejemplo, los descritos en los documentos WO 93/62331, WO 92/22583, WO 90/00195 y WO 89/01476. Como alternativa, cuando la molecula efectora o indicadora es una protefna o un polipeptido, la uni6n puede lograrse utilizando procedimientos de ADN recombinante, por ejemplo, tal como se describe en los documentos WO 86/01533 y EP-A-392.745.

Preferiblemente, el fragmento Fab modificado del documento WO 01/94585 esta PEGilado (es decir, tiene PEG (polietilenglicol) unido covalentamente a el) segun el metodo descrito en el documento EP-A-948.544. Preferiblemente, la molecula de anticuerpo del documento WO 01/94585 es un fragmento Fab modificado PEGilado tal como se muestra en la figura 13 del documento WO 01/94585. Tal como se muestra en la figura 13 del documento WO 01/94585, el fragmento Fab modificado tiene un grupo maleimida unido covalentemente a un unico grupo tiol en una regi6n bisagra modificada. Un resto lisina esta unido covalentemente al grupo maleimida. A cada uno de los grupos amina sobre el resto lisina se une un polfmero de metoxipolietilenglicol que tiene un peso molecular de aproximadamente 20.000 Da. El peso molecular total de la molecula efectora completa, por tanto, es de aproximadamente 40.000 Da. Estos PEG unidos a lisina se denominan "PEG ramificados" o "U-PEG", segun se describe en los documentos US 6.113.906: US 5.919.455; US 5.643.575; y US 5.932.462.

Preferiblemente, en el compuesto mostrado en la figura 13 del documento WO 01/94585, la cadena pesada de la parte del anticuerpo tiene la secuencia mostrada en SEQ ID NO:115 del documento WO 01/94585, y la cadena ligera tiene la secuencia mostrada en SEQ ID NO:113 del documento WO 01/94585. Este compuesto se denomina CDP870 en el documento WO 01/94585.

Los dominios de la regi6n constante de la molecula de anticuerpo del documento WO 01/94585, si estan presentes, pueden seleccionarse teniendo en cuenta la funci6n propuesta de la molecula de anticuerpo y, en particular, las funciones efectoras que puedan ser necesarias. Por ejemplo, los dominios de la regi6n constante pueden ser dominios de IgA, IgD, IgE, IgG o IgM humanas. En particular, pueden utilizarse los dominios de la regi6n constante de la IgG humana, en especial de los isotipos IgG1 e IgG3, cuando la molecula de anticuerpo esta prevista para usos terapeuticos y se requieran las funciones efectoras del anticuerpo. Como alternativa, los isotipos IgG2 e IgG4 pueden utilizarse cuando la molecula de anticuerpo esta prevista para fines terapeuticos y no se requieran las funciones efectoras del anticuerpo, por ejemplo, para simplemente bloquear la actividad del TNFα.

Ademas, la molecula de anticuerpo del documento WO 01/94585 puede tener una molecula efectora o indicadora unida a ella. Por ejemplo, puede tener un macrociclo, para quelar un atomo de metal pesado, o una toxina, tal como ricina, unidos mediante una estructura de puente covalente. Como alternativa, pueden utilizarse procedimientos de la tecnologfa del ADN recombinante para producir una molecula de anticuerpo en la que el fragmento Fc (dominios CH2, CH3 y bisagra), los dominios CH2 y CH3 o el dominio CH3 de una molecula de inmunoglobulina completa se ha reemplazado o se han reemplazado, o tiene unida a ella, mediante un enlace peptfdico, una protefna funcional que no es una inmunoglobulina, tal como una enzima o una molecula de toxina.

La molecula de anticuerpo del documento WO 01/94585 preferiblemente tiene una afinidad de uni6n de al menos 0,85 x 10-10 M, mas preferiblemente al menos 0,75 x 10-10 M, y lo mas preferiblemente 0,5 x 10-10 M. Merece advertirse que la molecula de anticuerpo humanizado preferida del documento WO 01/94585, tal como se describe a continuaci6n, tiene una afinidad de aproximadamente 0,5 x 10-10 M, que es mejor que la afinidad del anticuerpo monoclonal murino a partir del cual se deriva. El anticuerpo murino tiene una afinidad de aproximadamente 0,85 x

10-10 M.

Preferiblemente, la molecula de anticuerpo del documento WO 01/94585 comprende el dominio variable de cadena ligera hTNF40-gL1 (SEQ ID NO:8 del documento WO 01/94585) y el dominio variable de cadena pesada gh3hTNF40.4 (SEQ ID NO:11 del documento WO 01/94585). Las secuencias de los dominios variables de estas cadenas ligera y pesada se muestran en las figuras 8 y 11 del documento WO 01/94585, respectivamente.

El documento WO 01/94585 tambien se refiere a variantes de la molecula de anticuerpo, que tienen una mejor afinidad por el TNFα. Estos variantes pueden obtenerse mediante una serie de protocolos de maduraci6n de afinidad, que incluyen mutar las CDR (Yang et al., J. Mol. Biol., 254, 392-403, 1995), el reordenamiento de cadenas (Marks et al., Bio/Technology, 10, 779-783, 1992), el uso de cepas mutadoras de E. coli (Low et al., J. Mol. Biol., 250, 359-368, 1996), el reordenamiento del ADN (Patten et al., Curr. Opin. Biotechnol., 8, 724-733, 1997), la presentaci6n de fagos (Thompson et al., J. Mol. Biol., 256, 77-88, 1996), y la PCR sexual (Crameri et al., Nature, 391, 288-291, 1998). En Vaughan et al. (supra) se analizan estos metodos de maduraci6n de afinidad.

El documento WO 01/94585 tambien proporciona una secuencia de ADN que codifica la cadena o cadenas pesada y/o ligera de la molecula de anticuerpo.

El documento WO 01/94585 tambien se refiere a un vector de clonaci6n o de expresi6n que comprende una o mas secuencias de ADN. Preferiblemente, el vector de clonaci6n o de expresi6n comprende dos secuencias de ADN, que codifican la cadena ligera y la cadena pesada de la molecula de anticuerpo.

El documento WO 01/94585 tambien se refiere a sistemas de celula hospedante/vector utilizados para la expresi6n de las secuencias de ADN que codifican la molecula de anticuerpo. Pueden utilizarse sistemas bacterianos, por ejemplo de E. coli, y otros sistemas microbianos, en parte, para la expresi6n de fragmentos de anticuerpos, tales como fragmentos Fab y F(ab')2, y en especial fragmentos Fv y fragmentos de anticuerpos monocatenarios, por ejemplo Fv monocatenarios. Pueden utilizarse sistemas de expresi6n de celulas hospedantes eucariotas, por ejemplo de mamffero, para la producci6n de moleculas de anticuerpos mas grandes, incluyendo moleculas de anticuerpos completos. Las celulas hospedantes de mamffero adecuadas incluyen celulas CHO, de mieloma o de hibridoma.

El documento WO 01/94585 tambien proporciona un proceso para la producci6n de una molecula de anticuerpo, que comprende cultivar una celula hospedante que comprende un vector bajo condiciones adecuadas para conducir a la expresi6n de protefnas a partir del ADN que codifica la molecula de anticuerpo, y aislar la molecula de anticuerpo.

Preferiblemente, el proceso para la producci6n de la molecula de anticuerpo del documento WO 01/94585 comprende cultivar E. coli que comprende un vector de expresi6n de E. coli que comprende la secuencia de ADN bajo condiciones adecuadas para conducir a la expresi6n de una protefna a partir de la secuencia de ADN, y aislar la molecula de anticuerpo. La molecula de anticuerpo puede segregarse desde la celula o puede ser dirigida al periplasma mediante secuencias sefal apropiadas. Como alternativa, las moleculas de anticuerpos pueden acumularse dentro del citoplasma celular. Preferiblemente, la molecula de anticuerpo se dirige al periplasma. Dependiendo de la molecula de anticuerpo que se esta produciendo y del proceso utilizado, resulta deseable permitir que la molecula de anticuerpo se vuelva a plegar y adopte una conformaci6n funcional. Los procedimientos para permitir que las moleculas de anticuerpos se vuelvan a plegar son muy conocidos por los expertos en la tecnica.

La molecula de anticuerpo puede comprender s6lo un polipeptido de cadena pesada o ligera, en cuyo caso s6lo es necesario utilizar una secuencia codificadora del polipeptido de cadena pesada o de cadena ligera para transfectar a las celulas hospedantes. Para la producci6n de productos que comprendan cadenas pesadas y ligeras, la lfnea celular puede ser transfectada con dos vectores, un primer vector que codifica un polipeptido de cadena ligera, y un segundo vector que codifica un polipeptido de cadena pesada. Como alternativa, puede utilizarse un unico vector, incluyendo dicho vector las secuencias que codifican los polipeptidos de cadena pesada y de cadena ligera.

La presente invenci6n describe un is6mero de CP870 que tiene un PEG sobre Cys 214 de la cadena ligera (CDP870-PEG-1214). La forma predominante del anticuerpo de CDP870 tiene un enlace disulfuro entre Cys 214 de la cadena ligera y Cys 221 de la cadena pesada, y una uni6n de PEG en Cys 227 de la cadena pesada. Se identific6 un is6mero posicional de PEG inesperado en CDP870, que contiene un PEG en Cys 214 de la cadena ligera.

La presente invenci6n describe un is6mero de CP870 que tiene un PEG sobre Cys 214 de la cadena ligera, y un enlace disulfuro entre Cys 221 de la cadena pesada y Cys 227 de la cadena pesada.

La presente descripci6n se refiere a un is6mero de CP870 que tiene un PEG sobre Cys 214 de la cadena ligera, y un aducto en Cys 221 de la cadena pesada y Cys 227 de la cadena pesada. En una realizaci6n preferida, los aductos son glutati6n o glutationes, o MEA.

Otra realizaci6n de la presente descripci6n es una composici6n que comprende un is6mero posicional de PEG de CDP870, que tiene un PEG unido en Cys 214 de la cadena ligera (CDP870-PEG-1214). La composici6n terapeutica

o de diagn6stico puede venir acompafada de otros ingredientes activos, incluyendo otros ingredientes de anticuerpo, por ejemplo anticuerpos anti-celulas T, anti-IFNγ o anti-LPS, o ingredientes que no son anticuerpos, tales como xantinas.

Otra realizaci6n de la composi6n de la presente descripci6n comprende ademas un is6mero de disulfuro de CDP870, que contiene un enlace disulfuro entre Cys 214 de la cadena ligera y Cys 227 de la cadena pesada (1214/h227). Preferiblemente, el is6mero de disulfuro de CDP870 (1214/h227) tiene un PEG unido en Cys 221 de la cadena pesada.

Las composiciones farmaceuticas deben comprender preferiblemente una cantidad terapeuticamente eficaz del anticuerpo de la presente invenci6n. La expresi6n "cantidad terapeuticamente eficaz", tal como se emplea en la presente, se refiere a una cantidad de un agente terapeutica necesaria para tratar, mejorar o prevenir una enfermedad o trastorno diana, o para mostrar un efecto preventivo o terapeutico detectable. Para cualquier anticuerpo, la dosis terapeuticamente eficaz puede estimarse inicialmente en ensayos de cultivo celular o en modelos animales, habitualmente en roedores, conejos, perros, cerdos o primates. El modelo animal tambien puede utilizarse para determinar el intervalo de concentraci6n y la vfa de administraci6n apropiados. Esta informaci6n entonces puede utilizarse para determinar las dosis y las vfas de administraci6n utiles en seres humanos.

La cantidad eficaz precisa para un sujeto humano dependera de la gravedad del estado de enfermedad, la salud general del sujeto, la edad, el peso y el genero del sujeto, la dieta, el momento y la frecuencia de la administraci6n, la combinaci6n o combinaciones de farmacos, las sensibilidades de reacci6n y la tolerancia/respuesta a la terapia. Esta cantidad puede ser determinada mediante la experimentaci6n habitual y esta dentro del criterio del medico. En general, una dosis eficaz sera de 0,01 mg/kg a 50 mg/kg, preferiblemente de 0,1 mg/kg a 20 mg/kg, y mas preferiblemente de aproximadamente 15 mg/kg. Tal como se muestra en los ejemplos a continuaci6n, se han utilizado unas dosis de 1, 5 y 20 mg/kg para tratar pacientes que padecen artritis reumatoide.

Las composiciones pueden administrarse de manera individual a un paciente, o pueden administrarse en combinaci6n con otros agentes, farmacos u hormonas.

La dosis en que la molecula de anticuerpo de la presente invenci6n se administra depende de la naturaleza del trastorno que se va a tratar, del grado en que se encuentra el nivel de TNFα que se va a neutralizar, o en que se espera que sea, por encima de un nivel deseable, y si la molecula de anticuerpo se esta utilizando de modo profilactico o para tratar un trastorno existente.

Asf, por ejemplo, cuando el producto es para el tratamiento o la profilaxis de una enfermedad inflamatoria cr6nica, tal como la artritis reumatoide, las dosis adecuadas de la molecula de anticuerpo de la presente invenci6n estan en el intervalo entre 0,5 y 50 mg/kg, mas preferiblemente entre 1 y 20 mg/kg, y lo mas preferiblemente de aproximadamente 15 mg/kg. La frecuencia de la dosis dependera de la semivida de la molecula de anticuerpo y de la duraci6n de su efecto.

Si la molecula de anticuerpo tiene una semivida corta (por ejemplo, de 2 a 10 horas), puede ser necesario administrar una o mas dosis diarias. Como alternativa, si la molecula de anticuerpo tiene una semivida larga (por ejemplo, de 2 a 15 dfas) puede que s6lo sea necesario administrar una dosificaci6n diaria, semanal o incluso una vez cada 1 6 2 meses.

Una composici6n farmaceutica tambien puede contener un vehfculo farmaceuticamente aceptable para la administraci6n del anticuerpo. El vehfculo no debe inducir la producci6n de anticuerpos perjudiciales para el individuo que recibe la composici6n y no debe ser t6xico. Los vehfculos adecuados pueden ser macromoleculas grandes que se metabolizan lentamente, tales como protefnas, polipeptidos, liposomas, polisacaridos, acidos polilacticos, acidos poliglic6licos, aminoacidos polimericos, copolfmeros de aminoacidos, y partfculas vfricas inactivas.

Pueden utilizarse las sales farmaceuticamente aceptables, por ejemplo las sales de acidos minerales, tales como las sales clorhidrato, bromhidrato, fosfato y sulfato, o las sales de acidos organicos, tales como las sales acetato, propionato, malonato y benzoato.

Los vehfculos farmaceuticamente aceptables en las composiciones terapeuticas tambien pueden contener lfquidos, tales como agua, disoluci6n salina, glicerol y etanol. Ademas, en estas composiciones pueden estar presentes sustancias auxiliares, tales como agentes humectantes o emulgentes, o sustancias tamponantes del pH. Estos vehfculos permiten que las composiciones farmaceuticas puedan formularse como comprimidos, pfldoras, grageas, capsulas, lfquidos, geles, jarabes, suspensiones y suspensiones espesas, para la ingesti6n por el paciente.

Las formas de administraci6n preferidas incluyen formas adecuadas para la administraci6n parenteral, por ejemplo mediante inyecci6n o infusi6n, por ejemplo mediante una inyecci6n en embolada o una infusi6n continua. Cuando el producto es para la inyecci6n o la infusi6n, puede tomar la forma de una suspensi6n, disoluci6n o emulsi6n en un vehfculo oleoso o acuoso, y puede contener agentes formulatorios, tales como agentes suspensores, conservantes, estabilizantes y/o dispersantes. Como alternativa, la molecula de anticuerpo puede estar en forma seca, para su reconstituci6n antes del uso con un lfquido esteril apropiado.

Cuando estan formuladas, las composiciones de la presente descripci6n pueden administrarse directamente al sujeto. Los sujetos que se van a tratar pueden ser animales. Sin embargo, se prefiere que las composiciones esten adaptadas para la administraci6n a sujetos humanos.

Las composiciones farmaceuticas de esta descripci6n pueden administrarse mediante cualquiera de una serie de vfas que incluyen, pero no se limitan a la vfa oral, intravenosa, intramuscular, intraarterial, intramedular, intratecal, intraventricular, transdermica, transcutanea (por ejemplo, vease el documento WO 98/20734), subcutanea, intraperitoneal, intranasal, enterica, t6pica, sublingual, intravaginal o rectal. Tambien pueden utilizarse hipopulverizados para administrar las composiciones farmaceuticas de la invenci6n. En general, las composiciones terapeuticas pueden prepararse como inyectables, en forma de disoluciones o suspensiones lfquidas. Tambien pueden prepararse formas s6lidas adecuadas para la disoluci6n o la suspensi6n en vehfculos lfquidos antes de la inyecci6n.

La administraci6n directa de las composiciones normalmente se realiza mediante una inyecci6n, por vfa subcutanea, intraperitoneal, intravenosa o intramuscular, o se transportan hasta el espacio intersticial de un tejido. La composici6n tambien puede administrarse a una lesi6n. El tratamiento de dosificaci6n puede ser un programa de una sola dosis o un programa de multiples dosis.

Se apreciara que el ingrediente activo en la composici6n sera una molecula de anticuerpo. Como tal, es susceptible a la degradaci6n en el tracto gastrointestinal. Por tanto, si la composici6n se va a administrar mediante una vfa que emplee el tracto gastrointestinal, sera necesario que la composici6n contenga agentes que protejan al anticuerpo frente a la degradaci6n, pero que liberen el anticuerpo tras haber sido absorbido desde el tracto gastrointestinal.

Un analisis en profundidad de los vehfculos farmaceuticamente aceptables esta disponible en Remington's Pharmaceutical Sciences (Mack Publishing Company, NJ, 1991).

La presente descripci6n tambien proporciona la molecula de anticuerpo o las composiciones de la presente invenci6n para su uso en el tratamiento de una enfermedad mediada por TNFα.

La presente descripci6n proporciona tambien el uso de la molecula de anticuerpo o de la composici6n segun la presente invenci6n para la fabricaci6n de un medicamento para el tratamiento de una enfermedad mediada por TNFα.

La molecula de anticuerpo o la composici6n de la presente invenci6n puede utilizarse en cualquier terapia en la que se desee reducir el nivel de TNFα biol6gicamente activo presente en el cuerpo humano o animal. El TNFα puede estar circulando en el cuerpo o estar presente a un nivel indeseablemente alto en un sitio concreto del cuerpo.

Por ejemplo, unos niveles elevados de TNFα estan implicados en trastornos inmunol6gicos e inmunorregulatorios agudos y cr6nicos, infecciones, que incluyen el choque septico, endot6xico y cardiovascular, trastornos inflamatorios, trastornos neurodegenerativos, enfermedades malignas y hepatitis inducida por alcohol. Los detalles de los numerosos trastornos asociados con unos niveles elevados de TNFα se indican en el documento US

5.919.452. La molecula de anticuerpo o la composici6n de la presente invenci6n pueden utilizarse en la terapia de enfermedades mediadas por TNFα. Las enfermedades particularmente pertinentes que pueden ser tratadas con la molecula de anticuerpo de la presente invenci6n incluyen sepsis, insuficiencia cardfaca congestiva, choque septico o endot6xico, caquexia, sfndrome de insuficiencia respiratoria de adultos, SIDA, alergias, psoriasis, TB, trastornos 6seos inflamatorios, trastornos de coagulaci6n de la sangre, quemaduras, episodios de rechazo tras un transplante de 6rganos o de tejidos, enfermedad de Crohn y enfermedades autoinmunol6gicas, tales como tiroiditis y artritis reumatoide y osteoartritis.

Ademas, la molecula de anticuerpo o la composici6n puede utilizarse para reducir los efectos secundarios asociados con la generaci6n de TNFα durante una terapia neoplasica, para eliminar o reducir los sfntomas relacionados con el choque asociados con el tratamiento o la prevenci6n del rechazo de injertos mediante el uso de un anticuerpo antilinfocitos, o para tratar la insuficiencia de multiples 6rganos.

La molecula de anticuerpo o la composici6n de la presente descripci6n se emplea preferiblemente para el tratamiento de la artritis reumatoide o de la osteoartritis.

La presente descripci6n tambien proporciona una cantidad eficaz de la molecula de anticuerpo descrita en la presente para su uso para tratar sujetos humanos o animales que padecen o que estan en riesgo de padecer un trastorno mediado por TNFα.

La molecula de anticuerpo o la composici6n de la presente descripci6n tambien puede utilizarse para el diagn6stico, por ejemplo el diagn6stico in vivo y la formaci6n de imagenes de estados de enfermedad que implican unos niveles elevados de TNFα.

La presente invenci6n se describe mas a fondo s6lo como ilustraci6n en los siguiente ejemplos, que hacen referencia a las figuras adjuntas. Los siguientes ejemplos se proporcionan s6lo con fines de ejemplificaci6n y no pretenden limitar el alcance de la invenci6n, que se ha descrito en terminos amplios anteriormente.

Ejemplos

Ejemplo 1

Se fabrica un is6mero posicional de PEG de CDP870, en el que la PEG maleimida ramificada se conjuga al resto Cys 214 de la cadena ligera, en lugar de la Cys 227 diana de la cadena pesada. Este material se identific6 mediante el analisis de (1) los fragmentos de PEG-peptido separados mediante HPLC y analizados mediante secuenciaci6n N-terminal, y (2) la identificaci6n de la cadena pesada no pegilada y de la cadena ligera pegilada en extractos procedentes de una electroforesis en gel de SDS-PAGE reductora. Otras tecnicas, tales como HPLC de exclusi6n molecular desnaturalizante, han corroborado estos resultados. La reducci6n de las muestras para producir una cadena pesada no pegilada es la prueba de que la asociaci6n de cadena pesada/ligera en el is6mero posicional de PEG es debida a fuerzas no covalentes distintas de un enlace disulfuro.

LISTADO DE SECUENCIAS

<110>: Celltech R&D Limited

<120>: Is6meros posicionales de PEG de un anticuerpo, composiciones que los comprenden, y su uso

<130>: P037675EP

<140>: 03731385.5

<141>: 28-05-2003

<150>: US 60/383765

<151>: 28-05-2002

<150>: PCT/US03/08608

<151>: 20-03-2003

<160>: 2

<170>: SeqWin99, versi6n 1.02

<210>: 1

<211>: 214

<212>: PRT

<213>: Secuencia Artificial

<220>

<223>: Cadena ligera de is6mero posicional de PEG

<400>: 1

<210>: 2

<211>: 229

<212>: PRT

<213>: Secuencia Artificial

<220>

<223>: Cadena pesada de is6mero posicional de PEG

<400>: 2

Claims

REIVINDICACIONES

1.-Una molecula de anticuerpo aislada que es un fragmento Fab modificado, cuyas secuencias de aminoacidos de la cadena ligera (SEQ ID NO:1) y de la cadena pesada (SEQ ID NO:2) son como se indica en la figura 2, en la que un resto polietilenglicol (PEG) esta unido a Cys 214 de la cadena ligera.

5 2.-La molecula de anticuerpo aislada de la reivindicaci6n 1, que comprende ademas un enlace disulfuro entre Cys 221 y Cys 227 de la cadena pesada.
3.-Una composici6n terapeutica o de diagn6stico que comprende una cantidad terapeuticamente eficaz de la molecula de anticuerpo aislada de la reivindicaci6n 1 o de la reivindicaci6n 2, en asociaci6n con un vehfculo farmaceuticamente aceptable.