ES2373953T3 - Moléculas de anticuerpos con especificidad para il-1 beta humana. - Google Patents

Abstract

Un anticuerpo neutralizante con especificidad para IL-1ß humana, que comprende una cadena pesada y una cadena ligera, en donde el dominio variable de la cadena pesada comprende la secuencia dada en SEQ ID NO: 5 para CDR-H1, la secuencia dada en SEQ ID NO: 6 para CDR-H2 y la secuencia dada en SEQ ID NO: 7 para CDR- H3, y en donde el dominio variable de la cadena ligera comprende la secuencia dada en SEQ ID NO: 8 para CDR- L1, la secuencia dada en SEQ ID NO: 9 para CDR-L2 y la secuencia dada en SEQ ID NO: 10 para CDR-L3.

Description

Moléculas de anticuerpos con especificidad para IL-1 beta humana.

La presente invención se refiere a una molécula de anticuerpo con especificidad para determinantes antigénicos de IL-1�. La presente invención se refiere también a los usos tera péuticos de la molécula de anticuerpo y a métodos para producir la molécula de anticuerpo.

La citoquina pro-inflamatoria interleuquina-1� (IL-1�) es un miembro de la familia de genes de IL-1 que también incluye IL-1a y el antagonista del receptor de IL-1 (IL-1RA) (revisado por Dinarello, 1996, Blood, 87, 6, 2095-2147). IL-1� está principalmente implicada en la inflamación y tiene efectos directos sobre las células endoteliales y macrofagos, asi como sobre celulas tanto T como B. Estimula las celulas del estroma de la médula ósea para producir IL-6 asi como un cierto numero de factores estimulantes de colonias y tambien induce la produccion de TNFa.

IL-1� está implicada en muchas afecciones patológicas que están asociadas con la inflamación. Éstas incluyen infecciones (virales, bacterianas, fungicas y parasiticas), choque endotoxico, artritis, artritis reumatoide, enfermedad inflamatoria pelvica, esclerosis multiple, asma, osteoartritis, psoriasis, enfermedad de Alzheimer, enfermedad de Crohn, enfermedad de Peyronie, enfermedades del corazon (tal como aterosclerosis), cancer de colon, enfermedad celiaca, enfermedad de la vesicula biliar, enfermedad pilonidal, peritonitis, meningoencefalitis, otras afecciones autoinmunes, pancreatitis, trauma (cirugia), enfermedad de injerto frente a hospedante y rechazo de trasplantes.

IL-1� esta tambien implicada en el cancer, la osteoporosis y la senalizacion del dolor.

La implicación de IL-1� en la inflamacion, el dolor y otras afecciones patologicas sugiere que IL -1� es una buena diana para fármacos y otras moleculas para la profilaxis y/o el tratamiento de estas afecciones.

La forma madura de 17 kDa de IL-1� ejerce sus efectos biológicos al unirse al receptor de IL-1, IL-1R. Existen dos tipos de IL-1R: el receptor de tipo I, IL-1RI y el receptor de tipo II, IL-1RII. La unión de IL-1� a IL-1RI conduce al reclutamiento de la proteina accesoria del receptor y a la senalizacion. Por otra parte, IL-1RII ha sido denominado un receptor de "senuelo", dado que la union de IL-1� no transduce una senal. Se puede esperar que sean al menos tres tipos de anticuerpos los que se unan a IL-1�:

(i) anticuerpos que se unen a IL-1�, pero que no neutralizan la actividad biológica de IL -1RI (un anticuerpo

no neutralizante);

(ii) anticuerpos que se unen a IL-1� y que neutralizan la actividad biológica de al IL-1RI; y

IL-1RI al bloque ar la unión

(iii) anticuerpos que se unen a IL-1� y que neutralizan la actividad biológica de

IL-1RI, pero que no

bloquean la unión al IL-1RI tales como los anticuerpos descritos en el documento US 2003/0026806.

Anticuerpos anti-EL-1� han sido identificados y propuestos para su uso en el tratamiento de enfermedades y afecciones mediadas por IL-1�; vease, por ejemplo, el documento WO 95/01997.

Los autores de la invención han identificado ahora un anticuerpo de IL-1� mejorado que es particularmente eficaz in vivo, por ejemplo en los modelos de inflamación in vivo descritos en esta memoria. El anticuerpo es un anticuerpo neutralizante segun se define en la alternativa (ii) anterior.

Sumario de la invencion

En un primer aspecto, la presente invencion proporciona un anticuerpo neutralizante con especificidad para IL-1� humana, que comprende una cadena pesada, en donde el dominio variable de la cadena pesada comprende una CDR (siglas inglesas de region determinante de la complementariedad) con la secuencia dada en SEQ ID NO:5 para CDR-H1, una CDR que tiene la secuencia dada en SEQ ID NO:6 para CDR-H2 y una CDR que tiene la secuencia dada en SEQ ID NO:7 para CDR-H3, y una cadena ligera, en donde el dominio variable de la cadena ligera comprende una CDR (region determinante de la complementariedad) que tiene la secuencia dada en SEQ ID NO:8 para CDR-L1, una CDR que tiene una secuencia dada en SEQ ID NO: 9 para CDR-L2 y una CDR que tiene la secuencia dada en SEQ ID NO:10 para CDR-L3.

Los residuos en los dominios variables del anticuerpo se enumeran convencionalmente de acuerdo con un sistema disenado por Kabat et al. Este sistema se recoge en Kabat et al., 1987, en Sequences of Proteins of Immunological Interest, US Department of Health and Human Services, NIH, EE.UU. (en lo que sigue "Kabat et al. (supra)"). Este sistema de numeracion se utiliza en la presente memoria descriptiva, excepto cuando se indique de otro modo.

Las designaciones de residuos segun Kabat no siempre se corresponden directamente con la numeracion lineal de los residuos aminoácidos. La secuencia de aminoácidos lineal real puede contener menos aminoácidos o aminoácidos adicionales que en la numeración estricta segun Kabat que corresponde a un acortamiento de o insercion en un componente estructural, ya sea marco o CDR, de la estructura de dominio variable basica. La numeracion de residuos correcta segun Kabat se puede determinar para un anticuerpo dado mediante alineación de residuos de homologia en la secuencia del anticuerpo con una secuencia numerada segun Kabat "estandar".

Las CDRs del dominio variable de la cadena pesada estan situadas en los residuos 31-35 (CDR-H1), residuos 50-65 (CDR-H2) y residuos 95-102 (CDR-H3) de acuerdo con el sistema de numeracion de Kabat. Sin embargo, de acuerdo con Chothia (Chothia, C. y Lesk, A. M. J. Mol. Biol., 196, 901-917 (1987)), el bucle equivalente a CDR-H1 se extiende desde el residuo 26 al residuo 32. Asi, "CDR-H1", tal como se utiliza en esta memoria, comprende los residuos 26 a 35 segun se describe por una combinacion del sistema de numeracion segun Kabat y la definicion de bucle topologico segun Chothia.

Las CDRs del dominio variable de la cadena ligera estan situadas en los residuos 24-34 (CDR-L1), residuos 50-56 (CDR-L2) y residuos 89-97 (CDR-L3) de acuerdo con el sistema de numeracion segun Kabat. Tal como se utiliza en esta memoria, la expresion "anticuerpo neutralizante" describe un anticuerpo que es capaz de neutralizar la actividad de senalizacion biologica de IL-1�, en particular bloqueando la unión de IL-1� al IL-1RI.

Incluso mas preferiblemente, el anticuerpo del primer aspecto de la presente invencion comprende una cadena pesada, en donde el dominio variable de la cadena pesada comprende la secuencia dada en SEQ ID NO:3.

Incluso mas preferiblemente, el anticuerpo del primer aspecto de la presente invencion comprende una cadena ligera, en donde el dominio variable de la cadena ligera comprende la secuencia dada en SEQ ID NO:4.

El anticuerpo de la presente invencion comprende una cadena pesada, en donde el dominio variable de la cadena pesada comprende la secuencia dada en SEQ ID NO:5 para CDR-H1, la secuencia dada en SEQ ID NO:6 para CDR-H2 y la secuencia dada en SEQ ID NO:7 para CDR-H3, y una cadena ligera, en donde el dominio variable de la cadena ligera comprende la secuencia dada en SEQ ID NO:8 para CDR-L1, la secuencia dada en SEQ ID NO:9 para CDR-L2 y la secuencia dada en SEQ ID NO:10 para CDR-L3

En una realizacion mas preferida de la invencion, el anticuerpo comprende una cadena pesada en donde el dominio variable de la cadena pesada comprende la secuencia dada en SEQ ID NO: 3 y una cadena ligera, en donde el dominio variable de la cadena ligera comprende la secuencia dada en SEQ ID NO: 4.

En otro aspecto de la presente invencion, se proporciona un anticuerpo de acuerdo con cualquiera del primer aspecto de la invencion, en donde dicho anticuerpo es un anticuerpo monoclonal.

En una realización preferida, el anticuerpo monoclonal comprende una cadena pesada, en donde el dominio variable de la cadena pesada comprende la secuencia dada en SEQ ID NO: 3 y una cadena ligera, en donde el dominio variable de la cadena ligera comprende la secuencia dada en SEQ ID NO: 4.

En una realizacion alternativamente preferida, el anticuerpo monoclonal es un anticuerpo monoclonal murino, en donde el anticuerpo monoclonal comprende una cadena pesada y una cadena ligera, en donde el dominio variable de la cadena pesada comprende la secuencia dada en SEQ ID NO: 3, y en donde el dominio variable de la cadena ligera comprende la secuencia dada en SEQ ID NO: 4. A este anticuerpo monoclonal murino se le alude en esta memoria como "IC8" o como el anticuerpo "donante" o como el "anticuerpo monoclonal murino". Las secuencias de nucleótidos y aminoácidos completas de los dominios variables de las cadenas pesada y ligera del anticuerpo monoclonal de raton IC8 se muestran en la Figura 1 y se dan SEQ ID NOs: 1 a 4. Las CDRs dadas en SEQ ID NOs: 5 a 10 se derivan del anticuerpo monoclonal murino IC8.

En otro aspecto de la invencion, se proporciona una molecula de anticuerpo injertada a CDR, en donde una o mas de las CDRs se han obtenido a partir del anticuerpo monoclonal murino IC8. Tal como se utiliza en esta memoria, la expresion "molecula de anticuerpo injertada a CDR" se refiere a una molecula de anticuerpo en donde la cadena pesada y/o ligera contiene una o mas CDRs (incluidas, si se desea, una o mas CDRs modificadas) procedentes de un anticuerpo donante (p. ej., un anticuerpo monoclonal murino) injertadas en un marco de la region variable de la cadena pesada y/o ligera de un anticuerpo aceptor (p. ej., un anticuerpo humano). Para un revision, vease, Vaughan et al, Nature Biotechnology, 16, 535-539, 1998.

Cuando las CDRs estan injertadas, se puede utilizar cualquier secuencia del marco de la region variable del aceptor apropiada, teniendo en cuenta la clase/tipo del anticuerpo donante del que se derivan las CDRs, incluidas regiones del marco de raton, primate y ser humano. Preferiblemente, el anticuerpo injertado a CDR de la presente invencion tiene un dominio variable que comprende regiones del marco del aceptor humano asi como una o mas de las CDRs derivadas del anticuerpo donante tal como se alude arriba. Asi, se proporciona un anticuerpo injertado a CDR neutralizante, en donde el dominio variable comprende regiones de marco del aceptor humano y CDRs donantes no humanas.

Ejemplos de marcos humanos que pueden utilizarse en la presente invencion son KOL, NEWM, REI, EU, TUR, TEI, LAY y POM (Kabat et al., supra). Por ejemplo, KOL y NEWM se pueden utilizar para la cadena pesada, REI se puede utilizar para la cadena ligera y EU, LAY y POM se pueden utilizar tanto para la cadena pesada como para la cadena ligera. Alternativamente, se pueden utilizar secuencias de la linea germinal humana.

En un anticuerpo injertado a CDR de la presente invencion, las cadenas pesada y ligera del aceptor no requieren necesariamente derivarse del mismo anticuerpo y pueden, si se desea, comprender cadenas compuestas con regiones de marco derivadas de cadenas diferentes.

La region de marco preferida para la cadena pesada del anticuerpo injertado a CDR de la presente invencion se deriva de la secuencia 3-11 del subgrupo VH3 humano (DP-35) mostrada en la Figura 3 (SEQ ID NO:12) junto con JH4. Por consiguiente, se proporciona un anticuerpo injertado a CDR neutralizante que comprende al menos una CDR donante no humana, en donde la región del marco de la cadena pesada se deriva de la secuencia 3-11 del subgrupo humano (DP-35) junto con JH4. La secuencia de JH4 humana es como sigue: (YFDY)WGQGTLVTVSS (SEQ ID NO: 74). El motivo YFDY es parte de CDR-H3 y no es parte del marco 4 (Ravetch, JV. et al. 1981, Cell, 27, 583-591). La secuencia donante es la secuencia VH de IC8 (SEQ ID NO: 11) mostrada en la Figura 3a.

La region del marco preferida para la cadena ligera del anticuerpo injertado a CDR de la presente invencion se deriva de la secuencia 012 de VK1 del subgrupo de la linea germinal humana (DPK9) mostrada en la Figura 3 (SEQ ID NO: 17) junto con JK1. Por consiguiente, se proporciona un anticuerpo injertado a CDR neutralizante que comprende al menos una CDR donante no humana, en donde la region del marco de la cadena ligera se deriva de la secuencia 012 (DPK9) del subgrupo humano junto con JK1. La secuencia JK1 es como sigue: (WT)FGQGTKVEIK (SEQ ID NO: 75). El motivo WT es parte de CDR-L3 y no es parte del marco 4 (Hieter, PA, et al., 1982, J. Biol. Chem., 257, 1516-1522). La secuencia donante es la secuencia VL de IC8 (SEQ ID NO: 16) mostrada en la Figura 3b.

Tambien, en un anticuerpo injertado a CDR de la presente invencion, las regiones de marco no requieren tener exactamente la misma secuencia que las del anticuerpo aceptor. Por ejemplo, residuos inusuales se pueden cambiar a residuos que se producen con mayor frecuencia para esa clase o tipo de cadena del aceptor. Alternativamente, residuos seleccionados en las regiones de marco del aceptor se pueden cambiar de modo que correspondan al residuo encontrado en la misma posicion en el anticuerpo donante (vease Reichmann et al. Nature, 332, 323-324, 1988). Cambios de este tipo deberian mantenerse en un minimo necesario para recuperar la afinidad del anticuerpo donante. En el documento WO 91/09967 se recoge un protocolo para seleccionar residuos en las regiones de marco del aceptor que puede ser necesario cambiar.

Preferiblemente, en una molecula de anticuerpo injertada a CDR de la presente invencion, si la cadena pesada del aceptor tiene la secuencia DP-35+JH4 humana, entonces las regiones de marco del aceptor de la cadena pesada comprenden, ademas de una o mas CDRs de donante, un residuo donante en la posicion 44 (de acuerdo con Kabat et al., (supra)). No se esperaba el efecto sorprendente sobre la afinidad de cambiar el residuo 44 por un residuo donante. Asi, en cualquier proceso de humanizacion de anticuerpos, merecera la pena examinar adicionalmente el efecto de tener el residuo 44 como un residuo donante o aceptor. Por consiguiente, se proporciona un anticuerpo injertado a CDR, en donde al menos el residuo en la posicion 44 del dominio variable de la cadena pesada es un residuo donante.

Alternativa o adicionalmente, si la cadena pesada del aceptor tiene la secuencia DP-35+JH4 humana, entonces las regiones de marco del aceptor de la cadena pesada comprenden preferiblemente, ademas de una o mas CDRs donantes, un residuo donante en la posicion 89 (de acuerdo con Kabat et al., supra). Por consiguiente, se proporciona un anticuerpo injertado a CDR, en donde al menos el residuo en la posicion 44 y/o en la posicion 89 del dominio variable de la cadena pesada es un residuo donante.

Preferiblemente, en una molecula de anticuerpo injertada a CDR de acuerdo con la presente invencion, si la cadena ligera del aceptor tiene la secuencia DPK9+JK1 del subgrupo humano, entonces las regiones de marco del aceptor de la cadena ligera comprenden residuos donantes en las posiciones 45, 70 y 85 y pueden comprender, adicionalmente, residuos donantes en las posiciones 40 y 48 (de acuerdo con Kabat et al., supra). Por consiguiente, se proporciona un anticuerpo injertado a CDR, en donde al menos el residuo en la posicion 40, 45, 48, 70 y/u 85 es un residuo donante. Tambien se proporciona un anticuerpo injertado a CDR, en donde los residuos en las posiciones 45, 70 y 85 son residuos donantes.

Residuos donantes son residuos procedentes del anticuerpo donante, es decir el anticuerpo del que se derivaron originalmente las CDRs que, en el caso de la presente invencion, es el anticuerpo monoclonal murino IC8.

En una realizacion alternativa de la presente invencion, la cadena pesada comprende preferiblemente la secuencia de gH1 (SEQ ID NO: 13), gH2 (SEQ ID NO: 14) o gH3 (SEQ ID NO: 15). Las secuencias de los dominios variables de estas cadenas pesadas injertadas se muestran en la Figura 3a.

En una realizacion alternativa de la presente invencion, la cadena ligera comprende preferiblemente la secuencia de gL1 (SEQ ID NO: 18), gL2 (SEQ ID NO: 19) o gL3 (SEQ ID NO: 20). Las secuencias de los dominios variables de estas cadenas pesadas injertadas se muestran en la Figura 3b.

Mas preferiblemente, una molecula de anticuerpo de acuerdo con la presente invencion comprende una cadena pesada que comprende la secuencia de gH1 (SEQ ID NO: 13), gH2 (SEQ ID NO: 14) o gH3 (SEQ ID NO: 15) y una cadena ligera que comprende la secuencia de gL1 (SEQ ID NO: 18), gL2 (SEQ ID NO: 19) o gL3 (SEQ ID NO: 20).

Incluso mas preferiblemente, la cadena pesada de la molecula de anticuerpo de la presente invención comprende el dominio variable gH3 (SEQ ID NO: 15), y la cadena ligera de la molécula de anticuerpo de la presente invención comprende el dominio variable gL3 (SEQ ID NO: 20).

Ademas de ello, se proporciona un anticuerpo de acuerdo con uno cualquiera de los aspectos de la presente invencion, que se une al mismo epitopo que IC8. Alternativamente, se proporciona un anticuerpo neutralizante con especificidad para IL-1 humana, el cual se une itopo que anticu erpo cuya cadena pesada

al mismo epun comprende la secuencia gH3 (SEQ ID NO: 15), y cuya cadena ligera comprende la secuencia gL3 (SEQ ID NO: 20).

La molécula de anticuerpo de la presente invención puede comprender una molécula de anticuerpo completa con cadenas pesada y ligera de longitud completa o un fragmento Fab, Fab', F(ab')2, Fv o scFv. Alternativamente, puede comprender un monomero o dimero de cadena ligera o cadena pesada o un anticuerpo de cadena sencilla, p. ej. un Fv de cadena sencilla, en el que los dominio variables de las cadenas pesada y ligera están unidos mediante un enlazador peptidico. De manera similar, las regiones variables de las cadenas pesada y ligera pueden combinarse con otros dominios de anticuerpos, segun sea apropiado.

La molécula de anticuerpo de la presente invención puede tener una molécula de efector o una molécula de informador fijada a la misma. Por ejemplo, puede tener un macrociclo para quelar un atomo de metal pesado, o una toxina tal como ricina, fijada a la misma por una estructura de puenteo covalente.

Preferiblemente, el anticuerpo de la presente invencion se puede modificar para permitir que una molecula de efector

o informador sea fijada al mismo. Lo mas preferiblemente, la molecula de anticuerpo de la presente invencion es un fragmento Fab modificado segun se describe mas abajo.

Alternativamente, se pueden utilizar procesos de tecnologia de ADN recombinante para producir una molecula de anticuerpo en la que el fragmento Fc (dominios CH2, CH3 y de bisagra), los dominios CH2 y CH3 o el dominio CH3 de una molécula de inmunoglobulina completa ha o han sido reemplazados por o ha o han sido fijados a la misma por un enlace peptidico, una proteina no inmunoglobulina funcional tal como una enzima o molecula de toxina. Alternativamente, se prefiere que la molecula de anticuerpo de la presente invencion sea un fragmento Fab modificado, en donde la modificacion consiste en la adicion al extremo C terminal de su cadena pesada de uno o más aminoácidos para permitir la fijación de una molécula de efector o informador. Preferiblemente, los aminoacidos adicionales forman una región de bisagra modificada que contiene uno o dos residuos cisteina a los que se puede fijar la molécula de efector o informador.

Tambien se proporciona una molecula de anticuerpo neutralizante de acuerdo con la presente invencion que tiene una molécula de efector o una molécula de informador fijada a la misma. Moléculas de efector o informador incluyen una molécula tal como un agente citotoxico, un radionucleido o un resto de farmaco. Otras moleculas que pueden estar fijadas incluyen una toxina tal como abrina, ricina A, exotoxina de pseudomonas o toxina difteria, una proteina tal como factor de necrosis tumoral, a-interferon, -interferon, factor de crecimiento nervioso, factor de crecimiento derivado de plaquetas o activador de plasminogeno tisular, un agente trombotico o un agente anti-angiogenico, p. ej., angiostatina o endostatina, o un modificador de la respuesta biologica tal como una linfocina, interleuquina-1 (IL-1), interleuquina-2 (IL-2), interleuquina-6 (IL-6), factor estimulante de colonias de granulocitos y macrofagos (GM-CSF – siglas en ingles), factor estimulante de colonias de granulocitos (G-CSF – siglas en ingles), factor del crecimiento nervioso (NGF – siglas en ingles) u otro factor de crecimiento.

Un grupo efector preferido es una molecula polimera que puede ser fijada al fragmento Fab modificado para aumentar su semivida in vivo.

La molecula de polimero puede, en general, ser un polimero sintetico o un polimero que se produce de forma natural, por ejemplo un polimero de polialquileno, polialquenileno o polioxialquileno de cadena lineal o ramificada, opcionalmente sustituido, o un polisacarido ramificado o no ramificado, p. ej. un homo- o hetero-polisacárido.

Sustituyentes opcionales particulares que pueden estar presentes en los polimeros sinteticos arriba mencionados incluyen uno o mas grupos hidroxi, metilo o metoxi.

Ejemplos particulares de polimeros sinteticos incluyen poli(etilenglicol), poli(propilenglicol), poli(alcohol vinilico) de cadena lineal o ramificada, opcionalmente sustituidos, o derivados de los mismos, especialmente poli(etilenglicol) opcionalmente sustituido tal como metoxipoli(etilenglicol) o derivados del mismo.

Polimeros que se producen de forma natural particulares incluyen lactosa, amilosa, dextrano, glicógeno o derivados de los mismos.

"Derivados" tal como se utiliza en esta memoria pretende incluir derivados reactivos, por ejemplo grupos reactivos tiol-selectivos tales como maleimidas y similares. El grupo reactivo puede estar enlazado al polimero directamente o a través de un segmento de enlazador. Se apreciara que el residuo de un grupo de este tipo formara parte, en algunos casos, del producto como el grupo enlazador entre el fragmento de anticuerpo y el polimero.

El tamano del polimero puede variar segun se desee, pero generalmente estara en un intervalo de pesos moleculares medios de 500 Da a 50.000 Da, preferiblemente de 5.000 a 40.000 Da y, mas preferiblemente, de

25.000 a 40.000 Da. El tamano del polimero puede seleccionarse, en particular, sobre la base del uso pretendido del producto. Asi, por ejemplo, en los casos en los que el producto pretenda abandonar la circulacion y penetrar en el tejido, por ejemplo para uso en el tratamiento de un tumor, puede ser ventajoso utilizar un polimero de bajo peso molecular, por ejemplo con un peso molecular de alrededor de 5.000 Da. Para aplicaciones en las que el producto permanezca en la circulacion, puede ser ventajoso utilizar un polimero de mayor peso molecular, por ejemplo con un peso molecular en el intervalo de 25.000 Da a 40.000 Da.

Polimeros particularmente preferidos incluyen un polimero de polialquileno tal como poli(etilenglicol) o, en especial, un metoxipoli(etilenglicol) o un derivado del mismo y, especialmente, con un peso molecular en el intervalo de aproximadamente 25.000 Da a aproximadamente 40.000 Da.

Cada una de las moleculas de polimero fijadas al fragmento de anticuerpo modificado puede estar enlazada covalentemente al atomo de azufre de un residuo cisteina localizado en el fragmento. El enlace covalente sera generalmente un enlace disulfuro o, en particular, un enlace azufre-carbono.

En los casos que se desee, el fragmento de anticuerpo puede tener una o mas moléculas de efector o de informador fijadas al mismo. Las moléculas de efector o de informador pueden estar fijadas al fragmento de anticuerpo a través de cualquier cadena lateral de aminoacidos o grupo funcional de aminoacido terminal disponible, localizado en el fragmento, por ejemplo cualquier grupo amino, imino, hidroxilo o carboxilo libre.

Un polimero activado puede utilizarse como el material de partida en la preparacion de fragmentos de anticuerpo modificados con polimero segun se describe arriba. El polimero activado puede ser cualquier polimero que contenga un grupo tiol-reactivo tal como un ácido o éster a -halocarboxilico, p. ej. yodoacetamida, una imida, p. ej. maleimida, una vinil-sulfona o un disulfuro. Materiales de partida de este tipo se pueden obtener comercialmente (por ejemplo de Nektar, antiguamente Shearrater Polymers Inc., Huntsville, AL, EE.UU), o se pueden preparar a partir de materiales de partida comercialmente disponibles utilizando procesos quimicos convencionales. Moleculas de PEG particulares incluyen metoxi-PEG-amina de 20K (obtenible de Nektar, antiguamente Shearrater; Rapp Polymere; y SunBio) y M-PEG-SPA (obtenible de Nektar, antiguamente Shearrater).

En relacion con la fijación de restos de poli(etilenglicol) (PEG), se hace referencia a “Poly(ethyleneglycol) Chemistry, Biotechnical and Biomedical Applications", 1992, J. Milton Harris (comp.), Plenum Press, Nueva York; "Poly(ethylenglycol) Chemistry and Biological Applications". 1997, J. Milton Harris y S. Zalipsky (comps.), American Chemical Society, Washington DC y "Bioconjugation Protein Coupling Techniques for the Biomedical Sciences". 1998, M. Aslam y A. Dent, Grove Publishers, Nueva York.

En los casos en los desee obtener un fragmento de anticuerpo enlazado a una molecula de efector o de informador, éste se puede preparar por procesos quimicos o de ADN recombinante convencionales, en los que el fragmento de anticuerpo es enlazado, directamente o a traves de un agente de acoplamiento, a la molecula de efector o de informador antes o despues de la reaccion con el polimero activado segun sea apropiado. Procesos quimicos particulares incluyen, por ejemplo, los descritos en los documentos WO 93/06231, WO 92/22583, WO 89/00195 y WO 89/01476. Alternativamente, en los casos en los que la molécula de efector o de informador sea una proteina o un polipeptido, el enlace se puede conseguir utilizando procesos de ADN recombinante, por ejemplo segun se describe en los documentos WO 86/01533 y EP 0392745.

Preferiblemente, el fragmento Fab modificado de la presente invencion esta PEGilado (es decir, tiene PEG (poli(etilenglicol)) fijado covalentemente al mismo) de acuerdo con el metodo descrito en el documento EP-A0948544. Preferiblemente, la molecula de anticuerpo de la presente invencion es un fragmento Fab modificado y PEGilado tal como se muestra en la Figura 12. El fragmento Fab modificado tiene preferiblemente un grupo maleimida covalentemente enlazado a un grupo tiol sencillo en una region de bisagra modificada. Un residuo lisina esta preferiblemente enlazado de forma covalente al grupo maleimida. A cada uno de los grupos amina en el residuo lisina está fijado preferiblemente un polimero de metoxipoli(etilenglicol) con un peso molecular de aproximadamente

20.000 Da. El peso molecular total de toda la molécula de efector es, por lo tanto, de aproximadamente 40.000 Da. Por consiguiente, se proporciona un anticuerpo neutralizante que tiene fijado a uno de los residuos cisteina en el extremo C-terminal de la cadena pesada un grupo lisil-maleimida o lisil-bis-maleimida, en donde cada uno de los grupos amino del residuo lisilo tiene enlazado covalentemente al mismo un residuo metoxipoli(etilenglicol) con un peso molecular de aproximadamente 20.000 Da. Por ejemplo, el peso molecular puede ser de 15.000-25.000 Da o, preferiblemente, de 18.000-22.000 Da, e incluso mas preferiblemente de 19.000-21.000 Da.

En una realizacion preferida, la presente invencion proporciona una molecula de anticuerpo neutralizante con especificidad para IL-1� humana, que es un fragmento Fab modificado con una cadena pesada que comprende la secuencia dada en SEQ ID NO: 15 y una cadena ligera que comprende la secuencia dada en SEQ ID NO: 20 y que tiene en el extremo C-terminal de su cadena pesada una región de bisagra modificada que contiene un residuo cisteina al que se puede fijar una molecula de efector o de informador.

En otra realizacion preferida, se proporciona una molecula de anticuerpo neutralizante con especificidad para IL-1� humana, que es un fragmento Fab modificado con una cadena pesada que comprende la secuencia dada en SEQ ID NO: 15 y una cadena ligera que comprende la secuencia dada en SEQ ID NO: 20 y que tiene en el extremo Cterminal de su cadena pesada una region de bisagra modificada que contiene un residuo cisteina al que está fijada una molécula de efector o de informador.

Mas preferiblemente, se proporciona una molecula de anticuerpo neutralizante con especificidad para IL-1� humana, que es un fragmento Fab modificado con una cadena pesada que comprende la secuencia dada en SEQ ID NO: 15 y una cadena ligera que comprende la secuencia dada en SEQ ID NO: 20, que tiene fijada al residuo cisteina en el extremo C-terminal de la cadena pesada un grupo lisil-maleimida, en donde cada uno de los grupos amino del residuo lisilo tiene enlazado covalentemente al mismo un residuo metoxipoli(etilenglicol) con un peso molecular de aproximadamente 20.000 Da.

Incluso mas preferiblemente, se proporciona una molecula de anticuerpo neutralizante, en donde su cadena pesada comprende o consiste en los residuos de aminoacidos numeros 22 a 251 de la secuencia dada en SEQ ID NO: 71, y en donde su cadena ligera comprende o consiste en los residuos de aminoacidos numeros 22 a 235 de la secuencia dada en SEQ ID NO: 70. Los residuos de aminoacidos numeros 1 a 21 de las secuencias dadas en SEQ ID NOs: 70 y 71 representan la secuencia conductora de E. coli que, de la manera mas preferible, se escinde para dar una molecula de anticuerpo neutralizante de la presente invencion.

Lo mas preferiblemente, se proporciona una molecula de anticuerpo neutralizante, en donde su cadena pesada comprende o consiste en los residuos de aminoacidos numeros 22 a 251 de la secuencia dada en SEQ ID NO: 71, y en donde su cadena ligera comprende o consiste en los residuos de aminoacidos numeros 22 a 235 de la secuencia dada en SEQ ID NO: 70 que tiene fijada al residuo cisteina en el extremo C-terminal de la cadena pesada un grupo lisil-maleimida, en donde cada uno de los grupos amino del residuo lisilo tiene enlazado covalentemente al mismo un residuo metoxipoli(etilenglicol) con un peso molecular de aproximadamente 20.000 Da.

Tambien se proporciona una molecula de anticuerpo neutralizante con especificiadad para IL-1� humana, que se une al mismo epitopo que un anticuerpo neutralizante que comprende una cadena ligera que comprende la secuencia dada en SEQ ID NO: 20.

Los dominios de la región constante de la molecula de anticuerpo de la presente invencion, si estan presentes, se pueden seleccionar con respecto a la funcion propuesta de la molecula de anticuerpo y, en particular, las funciones de efector que puedan requerirse. Por ejemplo, los dominios de la region constante pueden ser los dominios IgA, IgD, IgE, IgG o IgM humana. En particular, se pueden utilizar dominios de la region constante de IgG humana, especialmente de los isotipos IgG1 e IgG3 cuando la molécula de anticuerpo está destinada para usos terapéuticos y se requieren funciones de efector de anticuerpos. Alternativamente, los isotipos IgG2 e IgG4 se pueden utilizar cuando la molécula de anticuerpo está destinada para fines terapéuticos y no se requieren funciones de efector del anticuerpo, p. ej. para bloquear simplemente la actividad de IL-1�.

La molecula de anticuerpo de la presente invencion tiene preferiblemente una afinidad de union de al menos 4,4 x 10-10 M, mas preferiblemente de al menos 3,2 x 10-10M.

La presente solicitud se refiere también a variantes de las moléculas de anticuerpo de la presente invención que tienen una afinidad mejorada por IL-1�. Variantes de este tipo se pueden obtener mediante un cierto n

umero de protocolos de maduracion de afinidad, incluida la mutacion de las CDRs (Yang et al., J. Mol. Biol., 254, 392-403, 1995), intercambio de la cadena (Marks et al., Bio/Technology, 10, 779-783, 1992), uso de cepas de mutador de E. coli (Lor et al., J. Mol. Biol., 250, 359-368, 1996), intercambio de ADN (Patten et al., Curr. Opin. Biotechnol., 8, 724733, 1997), expresion del fago (Thompson et al., J. Mol. Biol. 256, 77-88, 1996) y PCR sexual (Crameri et al., Nature, 391, 288-291, 1998). Vaughan et al. (supra) comentan estos métodos de maduración de afinidad.

La presente invencion proporciona tambien una secuencia de ADN aislada que codifica la o las cadenas pesada y/o ligera de la molecula de anticuerpo de la presente invencion. Preferiblemente, la secuencia de ADN codifica la cadena pesada o la cadena ligera de la molecula de anticuerpo de la presente invencion. La secuencia de ADN de la presente invención puede comprender ADN sintetico, por ejemplo producido por tratamiento quimico, ADNc, ADN genómico o cualquier combinación de los mismos.

Secuencias de ADN que codifican la molecula de anticuerpo de la presente invencion se pueden obtener por metodos bien conocidos por los expertos en la tecnica. Por ejemplo, secuencias de ADN que codifican parte o la totalidad de las cadenas pesada y ligera del anticuerpo se pueden sintetizar segun se desee a partir de las secuencias de ADN determinadas o sobre la base de las correspondientes secuencias de aminoacidos.

ADN que codifica las secuencias del marco del aceptor esta ampliamente disponible para los expertos en la tecnica y puede ser sintetizado facilmente sobre la base de sus secuencias de aminoacidos conocidas.

Tecnicas convencionales de biologia molecular se pueden utilizar para preparar secuencias de ADN que codifiquen la molecula de anticuerpo de la presente invencion. Secuencias de ADN deseadas se pueden sintetizar, completamente o en parte, utilizando tecnicas de sintesis de oligonucleotidos. Segun sea apropiado, se pueden utilizar tecnicas de mutagenesis dirigida al lugar y de reaccion en cadena de la polimerasa (PCR – siglas en ingles).

La presente invencion se refiere tambien a un vector de clonacion o expresion que comprende una o mas secuencias de ADN de la presente invencion. Por consiguiente, se proporciona un vector de clonacion o expresion que comprende una o mas secuencias de ADN que codifican un anticuerpo de la presente invencion. Preferiblemente, el vector de clonacion o expresion comprende dos secuencias de ADN que codifican la cadena ligera y la cadena pesada de la molecula de anticuerpo de la presente invencion, respectivamente. Preferiblemente, un vector de acuerdo con la presente invencion comprende la secuencia dada en SEQ ID NO: 69.

Metodos generales mediante los cuales se pueden construir los vectores, métodos de transfección y métodos de cultivo son bien conocidos por los expertos en la tecnica. A este respecto, se hace referencia a "Current Protocols in Molecular Biology", 1999, F. M. Ausubel (comp.), Wiley Interscience, Nueva York y al manual de Maniatis producido por Cold Spring Harbor Publishing.

Tambien se proporciona una celula hospedante que comprende uno o mas vectores de clonacion o expresion que comprenden una o mas secuencias de ADN que codifican un anticuerpo de la presente invencion. Cualquier sistema de celula hospedante/vector adecuado puede utilizarse para la expresion de las secuencias de ADN que codifican la molecula de anticuerpo de la presente invencion. Se pueden utilizar sistemas bacterianos, por ejemplo E. coli y otros sistemas microbianos, o tambien se pueden utilizar sistemas de expresion de celulas hospedantes eucarioticas, por ejemplo de mamiferos. Celulas hospedantes de mamiferos adecuadas incluyen CHO, celulas de mieloma o de hibridoma.

La presente invención proporciona también un procedimiento para la producción de una molécula de anticuerpo de acuerdo con la presente invencion, que comprende cultivar una celula hospedante que contiene un vector de la presente invencion bajo condiciones adecuadas para conducir la expresion de la proteina a partir de ADN que codifica la molecula de anticuerpo de la presente invencion, y aislar la molecula de anticuerpo.

Para la preparacion de productos que comprendan tanto cadenas pesadas como ligeras, la linea de celulas se puede transfectar con dos vectores, un primer vector que codifica un polipeptido de cadena ligera y un segundo vector que codifica un polipeptido de cadena pesada. Alternativamente, se puede utilizar un solo vector, incluyendo el vector secuencias que codifican polipéptidos de cadena ligera y de cadena pesada.

Dado que los anticuerpos de la presente invencion son utiles en el tratamiento y/o profilaxis de una afeccion patologica, la presente invencion proporciona tambien una composicion farmaceutica que comprende una molecula de anticuerpo de la presente invencion en combinacion con uno o mas de un excipiente, diluyente o soporte farmaceuticamente aceptable. Por consiguiente, se proporciona el uso de un anticuerpo de la invencion para la fabricación de un medicamento. La composición será suministrada habitualmente como parte de una composición farmacéutica estéril que normalmente incluirá un soporte farmacéuticamente aceptable. Una composición farmaceutica de la presente invencion puede comprender, adicionalmente, un adyuvante farmacéuticamente aceptable.

Se proporciona, ademas un procedimiento para la preparacion de una composicion farmaceutica o de diagnostico que comprende anadir y mezclar la molecula de anticuerpo de la presente invencion junto con uno o mas de un excipiente, diluyente o soporte farmaceuticamente aceptable.

La molecula de anticuerpo puede ser el unico ingrediente activo en la composicion farmaceutica o de diagnostico, o puede estar acompanada por otros ingredientes activos que incluyen otros ingredientes de anticuerpos, por ejemplo anticuerpos anti- celulas T, anti-IFNy o anti-LPS, o ingredientes no de anticuerpo tales como xantinas.

Las composiciones farmaceuticas comprenden preferiblemente una cantidad terapeuticamente eficaz del anticuerpo de la invencion. La expresion "cantidad terapeuticamente eficaz" tal como se utiliza en esta memoria se refiere a una cantidad de un agente terapéutico, necesaria para tratar, mejorar o prevenir una enfermedad o afeccion fijada como objetivo, o para exhibir un efecto terapeutico o preventivo detectable. Para cualquier anticuerpo, la cantidad terapeuticamente eficaz se puede estimar inicialmente en ensayos de cultivos celulares o en modelos con animales, habitualmente en roedores, conejos, perros, cerdos o primates. El modelo de animal puede tambien utilizarse para determinar el intervalo de concentraciones apropiado y la via de administracion. Informacion de este tipo puede luego utilizarse para determinar dosis y vias utiles para la administracion a seres humanos.

La cantidad terapeuticamente eficaz precisa para un sujeto humano dependera de la gravedad del estado patologico, de la salud general del sujeto, la edad, el peso y sexo del sujeto, la dieta, el tiempo y la frecuencia de administracion, la o las combinaciones de farmacos, las sensibilidades de reaccion y la tolerancia/respuesta a la terapia. Esta cantidad se puede determinar mediante una experimentacion rutinaria y se encuentra dentro del juicio del medico. Generalmente, una cantidad terapeuticamente eficaz sera de 0,01 mg/kg a 50 mg/kg, preferiblemente de 0,1 mg/kg a 20 mg/kg. Composiciones farmaceuticas pueden presentarse convenientemente en formas de dosis unitaria que contienen una cantidad predeterminada de un agente activo de la invención por dosis.

Las composiciones se pueden administrar individualmente a un paciente o se pueden administrar en combinacion (p. ej. simultanea, secuencialmente o por separado) con otros agentes, farmacos u hormonas.

La dosis a la que se administra la molécula de anticuerpo de la presente invencion depende de la naturaleza de la afección a tratar, del grado de inflamacion presente y de si la molecula de anticuerpo esta siendo utilizada profilacticamente o para tratar una afeccion existente.

La frecuencia de la dosis dependera de la semivida de la molecula de anticuerpo y de la duracion de su efecto. Si la molecula de anticuerpo tiene una semivida corta (p. ej. de 2 a 10 horas), puede ser necesario administrar una o mas dosis al dia. Alternativamente, si la molecula de anticuerpo tiene una semivida larga (p. ej. 2 a 15 dias), puede ser solo necesario administrar una dosificacion una vez al dia, una vez por semana o incluso una vez cada 1 ó 2 meses.

El soporte farmaceuticamente aceptable no deberia por si mismo inducir la producción de anticuerpos nocivos para el individuo que recibe la composicion y no deberia ser toxico. Soportes adecuados pueden ser macromoléculas grandes, lentamente metabolizadas tales como proteinas, polipetidos, liposomas, polisacaridos, acidos polilacticos, acidos poliglicolicos, aminoacidos polimericos, copolimeros de aminoacidos y particulas de virus inactivas.

Se pueden utilizar sales farmaceuticamente aceptables, por ejemplo sales de acidos minerales tales como hidrocloruros, hidrobromuros, fosfatos y sulfatos, o sales de acidos organicos tales como acetatos, propionatos, malonatos y benzoatos.

Soportes farmaceuticamente aceptables en composiciones terapeuticas pueden contener adicionalmente liquidos tales como agua, solucion salina, glicerol y etanol. Adicionalmente, en composiciones de este tipo pueden estar presentes agentes humectantes o emulsionantes o sustancias tamponadoras del pH. Soportes de este tipo permiten que las composiciones farmacéuticas sean formuladas en forma de comprimidos, pildoras, grageas, capsulas, liquidos, geles, jarabes, disoluciones y suspensiones, para ingestion por parte del paciente.

Formas preferidas de administracion incluyen formas adecuadas para la administracion por via parenteral, p. ej. mediante inyección o infusion, por ejemplo mediante inyeccion en bolo o infusion continua. En los casos en los que el producto sea para inyeccion o infusion, este puede adoptar la forma de una suspension, disolucion o emulsion en un vehiculo oleoso o acuoso, y puede contener agentes de formulacion tales como agentes de suspension, conservantes, estabilizantes y/o dispersantes. Alternativamente, la molecula de anticuerpo puede estar en forma seca para la reconstitucion antes del uso con un liquido esteril apropiado.

Una vez formuladas, las composiciones de acuerdo con la invención se pueden administrar directamente al sujeto. Los sujetos a tratar pueden ser animales. Sin embargo, se prefiere que las composiciones esten destinadas a la administración a sujetos humanos.

Las composiciones farmaceuticas de esta invencion se pueden administrar por cualquier numero de vias que incluyen, pero no se limitan a las vias oral, intravenosa, intramuscular, intra-arterial, intramedular, intratecal, intraventricular, transdermal, transcutanea (por ejemplo, vease el documento WO 98/20734), subcutanea, intraperitoneal, intranasal, enteral, topica, sublingual, intravaginal o rectal. Tambien se pueden utilizar hiposprays para administrar las composiciones farmaceuticas de la invencion. Tipicamente, las composiciones terapéuticas se pueden preparar en forma de inyectables, ya sea como disoluciones o suspensiones liquidas. Tambien se pueden preparar formas solidas adecuadas para la disolucion en o suspension en vehiculos liquidos antes de la inyeccion.

El suministro directo de las composiciones se conseguira, generalmente, mediante inyeccion por via subcutanea, intraperitoneal, intravenosa o intramuscular, o se puede suministrar al espacio intersticial de un tejido. Las composiciones también se pueden administrar a una lesion. El tratamiento de dosificacion puede ser un programa de dosis sencillo o un programa de dosis multiple.

Se apreciara que el ingrediente activo en la composicion sera una molecula de anticuerpo. Como tal, sera susceptible a la degradacion en el tracto gastrointestinal. Asi, si la composicion se ha de administrar por una via que utilice el tracto gastrointestinal, la composicion necesitara contener agentes que protejan al anticuerpo frente a la degradación, pero que liberen el anticuerpo una vez que haya sido absorbido a partir del tracto gastrointestinal.

Una discusión a fondo de soportes farmaceuticamente aceptables esta disponible en Remington's Pharmacetical Sciences (Mack Publishing Compay, N. J. 1991).

Tambien esta previsto que el anticuerpo de la presente invención se administre mediante el uso de la terapia génica. Con el fin de conseguir esto, secuencias de ADN que codifican las cadenas pesada y ligera de la molecula de anticuerpo bajo el control de componentes de ADN apropiados se introducen en un paciente, de modo que las cadenas de anticuerpos se expresen a partir de las secuencias de ADN y se ensamblen in situ.

Se proporciona, ademas, una molecula de anticuerpo para uso en el control de la inflamacion. Preferiblemente, la molecula de anticuerpo se puede utilizar para reducir el proceso inflamatorio o para evitar el proceso inflamatorio.

Tambien se proporciona la molecula de anticuerpo de la presente invencion para el uso en el tratamiento o la profilaxis de una afeccion patológica que es mediada por IL-1� o está asociada con un nivel incrementado de IL-1�. Preferiblemente, la afeccion patologica se selecciona del grupo que consiste en infecciones (virales, bacterianas, fungicas y parasiticas), choque endotoxico asociado con infeccion, artritis, artritis reumatoide, enfermedad inflamatoria pelvica, enfermedad de Alhzeimer, enfermedad de Crohn, enfermedad de Peyronie, enfermedad celiaca, enfermedad de la vesicula biliar, enfermedad pilonidal, peritonitis, meningoencefalitis, otras afecciones autoinmunes, pancreatitis, trauma (cirugia), enfermedad de injerto frente a hospedante, rechazo de trasplantes, cancer (tanto tumores sólidos como melanomas, hepatoblastomas, sarcomas, carcinomas de celulas escamosas, canceres de células de transicion, canceres de ovarios y malignidades hematologicas y, en particular, leucemia mielogena aguda, leucemia mielogena cronica, cancer gastrico y cancer de colon), enfermedades del corazon, incluidas enfermedades isquémicas tales como infarto de miocardio asi como aterosclerosis, coagulacion intravascular, resorcion osea, osteoporosis, periodontitis e hipoclorhidria.

La presente solicitud proporciona también una molécula de anticuerpo de acuerdo con la presente invención para uso en el tratamiento o la profilaxis del dolor.

La presente solicitud proporciona, ademas, el uso de una molecula de anticuerpo de acuerdo con la presente invencion en la fabricacion de un medicamento para el tratamiento o la profilaxis de un trastorno patologico que es mediado por IL-1� o está asociado con un nivel incrementado de IL-1�.

La presente solicitud proporciona, ademas, el uso de una molecula de anticuerpo de acuerdo con la presente invencion en la fabricacion de un medicamento para el tratamiento o la profilaxis del dolor.

Una molécula de anticuerpo de la presente invencion se puede utilizar en cualquier terapia en la que se desee reducir los efectos de IL-1� en el cuerpo humano o animal. IL-1� puede estar circulando en el cuerpo o puede estar presente en un nivel indeseablemente elevado localizado en un sitio particular del cuerpo, por ejemplo un sitio de inflamación.

La molecula de anticuerpo de la presente invencion se utiliza preferiblemente para el control de la inflamacion.

La presente solicitud proporciona también un método para tratar sujetos humanos o animales que padecen o están en riesgo de padecer una afección mediada por IL-1�, comprendiendo el método administrar al sujeto una cantidad eficaz de la molecula de anticuerpo de la presente invencion.

La molecula de anticuerpo de la presente invencion se puede utilizar tambien en el diagnostico, por ejemplo en el diagnóstico in vivo y la representación en imágenes de estados patológicos que implican IL-1�.

La presente invencion se describe, adicionalmente, a modo de ilustración sólo, en los siguientes ejemplos, que se refieren a las figuras que se acompanan, en las que:

La Figura 1a) muestra la secuencia de nucleotidos y aminoacidos (SEQ ID NOS: 1 y 3, respectivamente) de los dominios variables de la cadena pesada, y la Figura 1b) muestra la secuencia de nucleotidos y aminoacidos (SEQ ID NOS: 2 y 4, respectivamente) de los dominios variables de la cadena ligera del anticuerpo monoclonal murino IC8.

La Figura 2 muestra los vectores MRR14 y pMRR10.

La Figura 3 muestra el diseno de injerto para las secuencias de la cadena pesada (Figura 3a; SEQ ID NOS: 11-15) y ligera (Figura 3b; SEQ ID NOS 16-20) de IC8. El simbolo (|) destaca las diferencias entre las secuencias donante:aceptor:marco injertado; las CDRs están subrayadas con una sola linea para las secuencias de IC8. Estas son como se definen por Kabat, excepto CDR-H1 que comprende las definiciones tanto de Kabat como de Chothia. Las secuencias subrayadas con doble linea son residuos donantes retenidos en los injertos. Los residuos con asterisco (*) son comunes en las secuencias de la linea germinal humana subgrupo VH3, pero no estan presentes en esta linea germinal particular – éstas no se consideran residuos de ratones, incluso a pesar de que estan presentes en la secuencia donante original.

La Figura 4 muestra las secuencias de nucleotidos y aminoacidos de los genes disenados gH1 (Figura 4a) y gL1 (Figura 4b).

La Figura 5 muestra los oligonucleotidos que se utilizaron para la construccion de genes.

La Figura 6 muestra las casetes de oligonucleotidos que se utilizaron para injertos adicionales. Se muestran: la secuencia de cadena sentido de ICg8L2 (SEQ ID NO: 59), la secuencia de cadena inversa (SEQ ID NO: 72) y la correspondiente secuencia de aminoacidos (SEQ ID NO: 60); y la secuencia de cadena sentido de IC8gL3 (SEQ ID NO: 61), la secuencia de cadena inversa (SEQ ID NO: 73) y la correspondiente secuencia de aminoacidos (SEQ ID NO: 62); la secuencia de cadena sentido de IC8gH2 (SEQ ID NO: 63), la secuencia de cadena inversa (SEQ ID NO: 64) y la correspondiente secuencia de aminoacidos (SEQ ID NO: 65), y la secuencia de cadena sentido de IC8gH3 (SEQ ID NO: 66), la secuencia de cadena inversa (SEQ ID NO: 67) y la correspondiente secuencia de aminoacidos (SEQ ID NO: 68). Los residuos subrayados indican aminoácidos cambiados.

La Figura 7 muestra los resultados del ensayo de neutralizacion de IL-1� con injertos de IC8.

La Figura 8 muestra un mapa del vector pTTOD(Fab').

La Figura 9 muestra las etapas 1-4 en la clonacion de genes de la region V de IC8 en el vector intermedio pTTOD(Fab').

La Figura 10 muestra un mapa del vector pTTOD(gH3gL3 Fab' IGS-2).

La Figura 11 muestra las secuencias codificadora y flanqueante de pTTOD(gH3gL3 Fab' IGS-2); SEQ ID NO: 69.

La Figura 12 muestra la estructura de un fragmento Fab modificado derivado de un anticuerpo contra IL-1� enlazado covalentemente a traves de un residuo cisteina a un enlazador de lisilo-maleimida, en donde cada uno de los grupos amino en el residuo lisilo tiene covalentemente fijado al mismo un residuo metoxi PEG, en donde n es aproximadamente 420.

Manipulaciones de ADN y métodos generales

La cepa INVaF' de E. coli (Invitrogen) se utilizo para la transformacion y el crecimiento rutinario del cultivo. Enzimas de restriccion y modificacion del ADN se obtuvieron de Roche Diagnostics Ltd. y Ner England Biolabs. Las preparaciones de los plásmidos se realizaron utilizando los kits de purificacion Maxi Plasmid (QIAGEN, n° de catalogo 12165). Las reacciones de secuenciacion del ADN se realizaron utilizando el kit de secuenciacion del terminador ABI Prism Big Dye (n° de catalogo 4304149) y se realizaron en un secuenciador automatizado ABI 3100 (Applied Biosystems). Los datos se analizaron utilizando el programa AutoAssembler (Applied Biosystems). Los oligonucleótidos se obtuvieron de OSWEL. La concentracion de Fab' se determino utilizando un ELISA de ensamblaje a Fab'.

Ejemplo 1: Clonación y expresión de genes de las regiones variables del anticuerpo monoclonal murino IC8

Preparación de ARN total

El hibridoma que expresa IC8 se genero por parte de Cistron utilizando una tecnologia de hibridoma convencional después de la inmunizacion de ratones con la proteina IL-1� humana. Despues, el hibridoma se obtuvo por parte de Celltech R&D Limited. El ARN total se preparo a partir de celulas de hibridoma de IC8 utilizando kit de QIAGEN RNeasy (QIAGEN Ltd. n° de catalogo 74104). El ARN obtenido se transcribió de forma inversa en ADNc utilizando el kit de Clontech cDNA Advantage RT para PCR (n° de catalogo K1402).

Clonación por PCR de las regiones VH y VL de IC8

El ADNc preparado a partir de celulas de hibridoma se utilizo como el molde para PCR en una serie de reacciones disenadas para amplificar las secuencias de la region V. Las reacciones utilizaban un conjunto de cebadores degenerados "directos", disenados para reasociarse al ADN dentro de la secuencia de senal conservada, y un cebador inverso que se reasocia a ADN que codifica la union marco 4/region constante. La PCR se realizo utilizando TaqPlusPrecision (Stratagene, n° de catalogo 600211) y una concentracion 0,25 mM de dNTP. Los productos de la PCR resultantes se clonaron en vectores de secuenciacion (kit de clonacion de InVitrogen Zero Blunt TOPO PCR para la secuenciacion, n° de catalogo K2875) y se determino la secuencia de ADN. Se utilizo la secuenciacion de la proteina N-terminal del anticuerpo IC8 purificado (procedente del hibridoma) para confirmar que las secuencias traducidas correspondian a la secuencia de proteinas observada. Las secuencias de la region V se muestran en la Figura 1 yen SEQ ID NOS: 1 a 4.

Los genes de la region V murinos se sub-clonaron después en los vectores de expresion pMRR10 y pMRR14 (Figura 2). Estos son vectores separados para la expresion de las cadenas ligera y pesada, respectivamente, y contienen ADN genomico que codifica genes de la region constante para la cadena ligera kappa humana y la cadena pesada gamma-4, respectivamente.

La molecula de anticuerpo IC8 doble quimérica cHcL se expreso mediante co-transfección transitoria de los vectores de expresion de la cadena pesada y ligera arriba descritos (pMRR10 y pMRR14 que contenian VL y VH de IC8, respectivamente) en celulas CHO-L761. Las transfecciones se realizaron utilizando el proceso de lipofectamina de acuerdo con las instrucciones del fabricante (In Vitrogen, n° de catalogo 18324).

Ejemplo 2: Injerto en CDR de IC8

Las CDRs de IC8 se injertaron a CDRs en marcos humanos con el fin de reducir la potencial inmunogenicidad y para facilitar la expresion de E. coli. Marcos de aceptor de la linea germinal humana se eligieron de los subgrupos VH3 y VK1. La Figura 3 muestra una alineacion entre la secuencia de raton donante y los marcos humanos aceptores. El marco del aceptor de la cadena pesada es la secuencia VH3-11 (DP-35) de la linea germinal humana, procediendo el marco 4 de esta porcion de la linea germinal JH4 de la region JH humana. El marco del aceptor de la cadena ligera es la secuencia 012 (DPK9) de la linea germinal humana, procediendo el marco 4 de esta porcion de la linea germinal JK1 de la region JK humana.

La alineacion en la Figura 3 muestra que existen 13 diferencias de marco entre las cadenas pesadas del donante y del aceptor (excluyendo las CDRs). En cada una de estas posiciones se realizo un analisis del potencial de ese residuo para que contribuyera a la union del antigeno, a traves del contacto directo con el antigeno, a traves de un papel en el empaquetamiento de la CDR o a traves de la implicacion en la interfaz VL/VH; si se considero importante, se conservo el residuo del donante murino. La alineacion de la cadena ligera muestra que existen 15 diferencias de marco entre las secuencias del donante y del aceptor (excluyendo las CDRs). Se analizo de nuevo el potencial del residuo murino para contribuir a la union al antigeno. De esta manera, se disenaron tres injertos VH y tres injertos VL. Estos se muestran tambien en la Figura 3 y corresponden a SEQ ID NO: 13 (gH1); SEQ ID NO: 14 (gH2), SEQ ID NO: 15 (gH3), SEQ ID NO: 18 (gL1), SEQ ID NO: 19 (gL2) y SEQ ID NO: 20 (gL3).

Ejemplo 3: Diseño y construcción de genes para secuencias injertadas

Se disenaron genes para codificar las secuencias injertadas utilizando codones frecuentemente utilizados en E. coli y evitando codones "raros" de E. coli (Wada et al. 1991), Nucl. Acids. Res., 19, 1981-86). Se introdujeron sitios de restriccion en la secuencia de ADN a intervalos para facilitar una manipulacion genetica adicional. La Figura 4 muestra el diseno de genes para gH1 y gL1, cuyas secuencias se dan en SEQ ID NOS: 21 y 22. Las correspondientes secuencias de aminoacidos se dan en SEQ ID NOS: 23 y 24, respectivamente.

Se utilizaron oligonucleotidos completamente solapantes para construir los genes que codifican gH1 y gL1 (Figura 5; SEQ ID NOS: 27-58). Los oligonucleotidos que codifican los genes disenados se reasociaron juntos mediante mezcladura a una concentracion de 100 pmol/ll en tampon (TrisHCl 12,5 mM, pH 7,5, MgCl 2 2,5 mM, NaCl 25 mM, ditioeritritol 0,25 mM) y calentando hasta 95°C durante 3 minutos en un bloque de PCR programado para el enfriamiento hasta 30°C a una tasa de -0,01°C cada 10 segundos. Se anadieron T4 ADN ligasa (5 U) y su tampon de reaccion apropiado, y los oligonucleotidos se ligaron juntos mediante incubacion a 25°C durante 1 hora. Los genes de las cadenas pesada y ligera ligados se amplificaron luego mediante PCR, despues de la adicion de un exceso de 10 veces de cebadores T1 (SEQ ID NO: 25) y B1 (SEQ ID NO: 26) "extremos". Para esta amplificacion se utilizo una ADN polimerasa de lectura de prueba (Taq Plus Precision, Stratagene). Los productos de amplificacion se extendieron en un gel de agarosa al 1,5%. Se aislo la banda de 400-450 y se purifico con gel y luego se clono en el vector intermedio pCR4 blunt TOPO de acuerdo con las instrucciones del fabricante (InVitrogen). Esto creo los plásmidos intermedios pCR4(IC8gL1) y pCR4(IC8gH1). Despues, estos plasmidos se utilizaron como moldes para crear las formas injertadas adicionales gL2, gL3, gH2 y gH3.

Se utilizo un metodo de reemplazo de la casete de oligonucleotidos para crear los injertos humanizados gL2 y gL3. La Figura 6 muestra el diseno de las casetes de oligonucleotidos. Para construir cada una de las variantes, el vector pCR4(IC8gL1) se corto con las enzimas de restriccion KpnI y NheI. El fragmento de vector grande resultante se purificó en gel de agarosa y se utilizo en ligamiento con la casete de oligonucleótidos. Los pares de oligonucleótidos se reasociaron juntos mezclando a una concentracion de 0,5 pmol/ll en un volumen de 200 ll de tampon (TrisHCl 12,5 mM, pH 7,5, MgCl2 2,5 mM, NaCl 25 mM, ditioeritritol 0,25 mM) y calentando hasta 95°C durante 3 minutos en un bano de agua (volumen, 500 ml) y luego dejando enfriar lentamente hasta la temperatura ambiente. La casete de oligonucleotidos reasociada se diluyo luego diez veces en agua antes del ligamento en el vector apropiadamente cortado. Se utilizo la secuenciacion de ADN para confirmar la secuencia correcta, creando los plasmidos pCR4(IC8gL2) y pCR4(IC8gL3).

La variante gH2 se construyó a partir de pCR4(IC8gH1) utilizando una estrategia de PCR. La cadena inversa de la casete mostrada en la Figura 6 (SEQ ID NO: 64) se utilizo como un cebador inverso en la PCR utilizando un cebador directo 5' especifico para el vector para generar un producto que representa la secuencia de gH2 parcial. Ésta se digirio con las enzimas de restriccion HindIII y BspEI y luego se clono en pCR4(IC8gH1) restringido con HindIII-BspEI para crear pCR4(IC8gH2).

La variante gH3 se construyo utilizando una estrategia de PCR diferente. Los dos oligonucleótidos gH3 mostrados en la figura 6 se utilizaron en reacciones de PCR separadas: la cadena sentido (SEQ ID NO: 66) en calidad de un cebador directo utilizando un cebador inverso 3' especifico para el vector, y la cadena sin sentido (SEQ ID NO: 67) como un cebador inverso utilizando un cebador directo 5' especifico para el vector. En ambos casos, el molde era pCR4(IC8gH1). Los dos productos de amplificacion resultantes se aislaron y purificaron, luego se anadieron juntos con los dos cebadores 5' y 3' especificos para el vector y se ciclaron a través de amplificaciones adicionales por PCR para generar un producto gH3 de longitud completa. Éste se digirió con HindIII y ApaI y se insertó en pCR4(IC8gH1) restringido con HindIII-ApaI para crear pCR4(IC8gH3). Todas las variantes se confirmaron mediante secuenciacion del ADN.

Cada uno de los injertos de la cadena pesada se sub-clono luego en el vector de expresion pMRR14 como fragmentos HindIII-ApaI. Cada uno de los 3 injertos de cadena ligera se sub-clono en el vector de expresion de la cadena ligera pMRR10 como fragmentos SfuI-BsiWI.

Selección de la variante injertada óptima

Los anticuerpos injertados se expresaron mediante co-transfección transitoria de los vectores de expresion de cadena pesada y ligera injertados descritos anteriormente (pMRR10 y pMRR14 que contenian gL1, gL2 y gL3 y gH1, gH2 y gH3 de IC8, respectivamente) en celulas CHO-L761. Las transfecciones se realizaron utilizando el proceso de lipofectamina de acuerdo con las instrucciones del fabricante (InVitrogen, n° de catalogo 18324).

Todas las combinaciones de la cadena injertada y de la cadena quimerica se expresaron y compararon frente al anticuerpo doble quimérico cHcL. La unión se confirmo en un ensayo BIAcore y en un ensayo de neutralizacion con IL-1�.

Ensayo BIAcore

El formato de ensayo utilizaba anticuerpo anti-IL-1� capturado por anti-hFc con una titulacion de IL-1� humana recombinante en la fase de disolucion. IgG anti-humana de raton, especifica para el fragmento Fc (Celltech) se inmovilizo sobre florcell 2 de un CM5 Sensor Chip a traves de una quimica de acoplamiento de la amina a un nivel de 12757RU. Una superficie de referencia bloqueada se preparó sobre flowcell 1 mediante activacion con EDC/NHS y desactivacion con etanolamina utilizando los mismos volumenes que para florcell 2. Como tampon de desarrollo se utilizo tampon HBS-EP (HEPES 10 mM, pH 7,4, NaCl 0,15 M, EDTA 3 mM, tensioactivo P20 al 0,005%, Biacore AB) y los ensayos se realizaron a 25°C. Anticuerpo anti- IL-1� se hizo pasar sobre los flowcells 1 y 2 y se capturó en la superficie anti-hFc inmovilizada utilizando un caudal de 10 ll/min. IL-1� de 400-0 nM se inyecto sobre la superficie del anticuerpo anti- IL-1� bloqueado y capturado utilizando un caudal de 30 ll/min durante 3 min. La superficie antihFc se regenero con una inyeccion de 30 ll de HCl 40 mM. Los par

ametros cineticos se calcularon utilizando el softrare BIAevaluation 3.1.

Para el Fab' de gIC8, el formato de ensayo utilizaba anticuerpo anti-IL-1� capturado por anti-hF(ab')2 (en que "h" indica que es un F(ab')2 humano) y luego se titulo por encima IIL-1�. IgG anti-humana de cabra Affinipure especifica para el fragmento F(ab')2 (Jackson ImmunoResearch, codigo 109-005-097) se inmovilizo sobre florcell 2 de un CM5 Sensor Chip a traves de quimica de acoplamiento de amina hasta un nivel de 13025RU. Una superficie de referencia bloqueada se preparó sobre flowcell 1 mediante activacion con EDC/NHS y desactivacion con etanolamina utilizando los mismos volumenes que para florcell 2. Como tampon de desarrollo se utilizo el tampon HBS-EP (HEPES 10 mM, pH 7,4, NaCl 0,15 M, EDTA 3 mM, tensioactivo P20 al 0,005%, Biacore AB) y los ensayos se realizaron a 25°C. Anticuerpo anti-IL-1� se hizo pasar sobre los flowcells 1 y 2 y se capturó sobre la superficie anti-hF(ab')2 inmovilizada utilizando un caudal de 10 ll/min. IL-1� (Strathmann) de 400-0 nM se inyecto sobre la superficie del anticuerpo anti IL-1� bloqueado y capturado utilizando un caudal de 30 ll/min durante 3 min. La superficie anti-hF(ab')2 se regeneró con una inyeccion de 30 ll de HCl 40 mM, seguido de una inyeccide NaOH 5 mM . Los parametros

ón de 15 ll cineticos se calcularon utilizando el softrare BIAevaluation 3.1.

La Tabla 1 muestra un sumario de los datos de afinidad por el antigeno Biacore. Resulta claro que el injerto gH1, que tiene residuos donantes en las posiciones 44 y 89, tiene una mayor afinidad que gH2, el cual sólo tiene un residuo donante en la posicion 89. Por lo tanto, se rechazo el injerto gH2. Sorprendentemente, se observo una elevada afinidad en el injerto gH3 en el que solamente la posición 44 es un residuo del marco donante.

Tabla 1: Afinidad mediante BIAcore

Anti-IL-11

KD (nM)

mIC8

0,30

cHcL

0,38

gH1gL1

0,35

gH1gL2

0,34

gH1gL3

0,30

gH2gL1

1,27

gH2gL3

1,14

gH2gL3

1,07

gH3gL1

0,28

gH3gL2

0,32

gH3gL3

0,28

gH3gL3 Fab'

0,32

Ensayo de neutralización in vitro

Fibroblastos se hicieron crecer hasta una confluencia del 80% en placas de 96 pocillos. Los anticuerpos se titularon en diluciones semi-logaritmicas a partir de 1 lg/ml y se anadio IL -1� para proporcionar una concentracion final de 20

10 pg/ml. Las placas se incubaron a la temperatura ambiente durante 30 min. El medio de cultivo se retiro de los cultivos de fibroblastos y se anadieron 100 ll de una mezcla de anticuerpo/IL -1� a los pocillos apropiados y se cultivaron durante una noche a 37°C. La cantidad de IL-6 producida en respuesta a IL-1� se estimó desp ués utilizando el kit DY206 Human IL-6 Duoset de R&D Systems.

15 Los resultados del ensayo de neutralizacion se muestran en la Figura 7, en la que las formas injertadas del anticuerpo (excluido gH2) se comparan con el anticuerpo de raton parental. Al igual que con los datos de afinidad Biacore, existia una diferencia muy pequena entre cualesquiera de los injertos remanentes. Por lo tanto, gL3gH3 se selecciono como la variante con la actividad optima y el numero menor de residuos marco de raton. Tal como se muestra en la Figura 3, la secuencia de gH3 tiene 1 residuo marco donante, mientras que la secuencia de gL3 tiene

20 3 residuos marcos donantes.

Ensayo de neutralización in vivo

Para determinar la eficacia de neutralizacion del gH3gL3Fab' in vivo, el gH3gL3Fab' se sometio ensayo en dos 25 modelos de inflamación in vivo

gH3gL3Fab’-PEG (40K) intraperitoneal/hIL-1{ intraperitoneal en ratones

A ratones Balb/c machos (18-25 g) se les inyecto por via intraperitoneal (i.p.) gH3gL3Fab'-PEG (40K) (100 ll, en

30 vehiculo de PBS) o Fab'-PEG (40K) control (100 ll, en vehiculo PBS) 5 minutos antes de la inyeccion i.p. con hIL-1� (150 ng/kg o vehiculo (100 ll de PBS). Al cabo de 120 minutos, se sacrific

ó a los ratones mediante dislocación

cervical y se realizo un lavado peritoneal (3 ml de HBSS (sales equilibradas de Hanks) + BSA al 0,25%, HEPES 12

mM). Se realizo un recuento total de leucocitos utilizando un contador Coulter. Para la identificacion de neutrofilos,

50 ll del fluido de lavado peritoneal se tineron con una dilucion 1:300 del anticuerpo monoclonal (mAb) anti-CD45

35 CyChrome y una dilucion 1:300 de mAb anti-GR-1 marcado con ficoeritrina (anti-Ly6G/Ly6C) durante 20 min (4°C, en la oscuridad). Los leucocitos se lavaron una vez en HBSS (BSA al 0,25%, HEPES 12 mM), se resuspendieron en 300 ll de HBSS (BSA al 0,25%, HEPES 12 mM) y se analizaron mediante citometrjo. Los neutrófilos se

ia de flu

identificaron como CD45+GR-1HGH. La concentracion de proteina quimioatractante de monocitos murinos-1 (mMCP

1) en las muestras de lavado peritoneal se midio mediante ELISA sandwich de acuerdo con las instrucciones del

40 fabricante (BD Biosciences OPT-EIA mMCP-1).

gH3gL3Fab’-Peg(40K) intravenoso/hIL-1{ intravenoso en ratones

Ratones Balb/c machos (18-25 g) se anestesiaron con halotano y se les inyecto por via intravenosa (i.v.) gH3gL3Fab'-PEG (40K) (100 ll, en vehiculo de PBS) o Fab-PEG control (100 ll, en vehiculo PBS) 15 minutos antes de la inyección i.v. con hIL-1� (37,5 o 50 l g/kg) o vehiculo (100 ll de PBS). Despues de 90 minutos, se tomo una muestra de sangre mediante puncion cardiaca en heparina (20 ó mediante

5 ll, 100 U/ml) y el plasma se preparcentrifugacion (14.000 x g, 2 min, TA). Muestras de plasma se almacenaron a -20°C. Las muestras de plasma se sometieron a ensayo en cuanto a la interleuquina-6 murina (mIL-6) mediante ELISA sandwich de acuerdo con las instrucciones del fabricante (BD Biosciences OPT-EIA-mIL-6).

10 Los resultados demuestran que el pre-tratamiento de ratones con gH3gL3Fab'-PEG (40 k) por via i.p. era eficaz para reducir la acumulación de neutrófilos inducida por hIL-1� i.p. (Tabla 2) y la generación de mMCP -1 (Tabla 3). El pretratamiento de ratones con gH3gL3Fab'-PEG (40 K) por via i.v. tambien era eficaz para reducir la generacion de mIL6 inducida por hIL-1� i. v. Datos procedentes de 3 experimentos separados se resumen en la Tabla 4.

15 No se observaron efectos de enfermedad en ninguna de las dosis utilizadas en ninguno de los modelos. Por lo tanto, se puede esperar que el anticuerpo gH3gL3Fab' pueda ser util en el tratamiento de la inflamacion y de otras enfermedades mediadas por IL-1�.

Tabla 2: Acumulación de neutrófilos

Dosis de hIL-1� i.p. (ng/kg)

gH3gL3Fab'-PEG(40K) DE50 (mg/kg) Inhibicion max. (%, dosis, mg/kg)

150

0,02 96 (1)

150

0,02 97 (1)

150

0,03 95 (1)

150

0,06 86 (0,1)

150

0,03 89 (1)

150

0,03 98 (0,3)

Tabla 3: Generación de mMCP-1

Dosis de hIL-1� i.p. (ng/kg)

gH3gL3Fab'-PEG(40K) DE50 (mg/kg) Inhibicion max. (%, dosis, mg/kg)

150

0,02 98 (1)

150

0,01 100 (1)

150

0,02 98 (1)

150

0,04 92 (1)

150

0,02 98 (1)

150

ND 99 (0,3)

Tabla 4

Dosis de hIL-1� i.v. (ng/kg)

gH3gL3Fab'-PEG(40K) DE50 (mg/kg) Inhibicion max. (%, dosis, mg/kg)

50

1,88 75 (10)

37,5

5,39 81 (10)

37,5

2,95 86 (10)

Ejemplo 4: Clonación y expresión de fragmentos Fab’

Clonación de regiones V seleccionadas en el plásmido de expresión en Fab’ de E. coli pTTOD(Fab’)

35 En la Figura 8 se muestra el vector de expresion que contiene un Fab' irrelevante, denominado pTTOD(Fab'). El ADN que codifica tanto la cadena ligera como la cadena pesada esta precedido por ADN que codifica la secuencia

senal OmpA de E. coli (Mora NR, Nakamura K e Inouye M. Amino acid sequence of the signal peptide of ompA protein a major outer membrane protein of Escherichia coli. J Biol. Chem. 1980; 255(1): 27-9). Las regiones V de IC8 se clonaron en este vector, de modo que se mantiene esta secuencia senal, dirigiendo la translocacion de las dos cadenas al periplasma de E. coli. El peptido senal se escinde tras la translocacion, de modo que no forma parte de la 5 secuencia Fab' del producto (nota: la secuencia del peptido senal OmpA son los residuos de aminoácidos 1 a 21 de la secuencia dada en SEQ ID NO: 70. El plasmido pTTOD(Fab') se digirio con enzimas de restriccion EcoRV y BsiWI (BsiWI y SpII son iso-esquizomeros) para separar la secuencia VL irrelevante y se insertó la región gL3V de IC8 seguido de su aislamiento a partir de pMRR10(IC8gL3). Esto creo la clonacion de pTTOD(IC8gL3) intermedio. Despues pTTOD(IC8gL3) se escindio con BsiWI y ApaI y 2 fragmentos se insertaron en un ligamiento de 3 vias; un fragmento c-kappa/IGS (IGS-2 o IGS-3) y el fragmento IC8gH3 (vease la representacion esquematica en la Figura 9). De esta manera, se construyeron las 2 variantes del vector pTTOD(IC8gL3gH3IGS-2) y pTTOD(IC8gL3gH3IGS3). Éstas se encontraban solamente en la secuencia de nucleótidos entre los genes de las cadenas ligera y pesada; IGS-2 confiere un acoplamiento de translación muy estrecho entre los 2 genes, dando una rapida tasa de traduccion de la cadena pesada, IGS-3 confiere una tasa más lenta de traducción de la cadena pesada (vease la solicitud de

15 patente del Reino Unido n° 0129105).

Expresión de Fab’ en E. coli en el fermentador

Los plasmidos pTTOD(IC8gL3gH3 IGS-2) y pTTOD(IC8(gL3gH3 IGS-3) se transformaron en la cepa W3110 de E. coli utilizando protocolos estandares. El Fab' periplasmico de E. coli soluble se extrajo utilizando el tampon tris-EDTA a 50°C. Despues de extraccion y enfriamiento, se ajustó el pH del extracto y las celulas se separaron mediante centrifugación y filtración. La corriente de alimentacion clarificada se diluyo con agua (aproximadamente 2 veces) con el fin de reducir la conductividad. Fab' se capturo utilizando cromatografia de intercambio de cationes (resina SP sepharose FF) y el Fab' unido se eluyo utilizando una etapa en NaCl. La corriente de producto eluida se concentro,

25 se diafiltró en tampón tris utilizando ultrafiltracion y se sometio a cromatografia de intercambio de aniones (resina Q Sepharose FF) en donde el Fab' estaba contenido en la fraccion no unida. El Fab' purificado se concentró y diafiltró en tampon de reduccion (mediante ultrafiltracion), seguido de reduccion utilizando 2-mercaptoetilamina para activar el tiol bisagra. El agente reductante se separa entonces mediante intercambio de tampon por ultrafiltracion. La secuenciacion N-terminal confirmo la secuencia correcta de aminoacidos y la escision del conductor OmpA. Se comparo la expresion de Fab' por parte de estos dos plasmidos.

La Tabla 5 muestra una comparación de rendimientos de Fab' en el fermentador para las variantes IGS-2 e IGS-3. La construccion IGS-2 supera claramente a IGS-3 en cuanto a la productividad de Fab'. Por lo tanto, se selecciono la variante IGS-2. El mapa de plasmido se muestra en la Figura 10. La Figura 11 muestra la secuencia codificadora y

35 flanqueante de Fab' de pTTOD(gH3gL3Fab'IGS-2).

Tabla 5: Rendimientos de expresión en el fermentador; una comparación de rendimientos de Fab’ periplásmico de gIC8 anti-IL-11

Fermentaciones

Fecha Construcción ELISA de fab’ peri. (mg/l) Proteína G A280 (mg/l)

FM264

25/09/01 gIC8IGS2 602 588

FM265

25/09/01 gIC8IGS2 742 533

FM266

25/09/01 gIC8IGS3 243

FM267

25/09/01 gIC8IGS3 224

Actividad de Fab’ producido por E. coli

Algo del Fab' producido por E. coli purificado se analizo despues en cuanto a la afinidad en el ensayo Biacore tal como se muestra en la Tabla 1. Como se puede observar, este material conserva eficazmente la actividad completa

45 en este ensayo.

PEGilación del Fab

El Fab modificado y purificado se conjuga de manera especifica para el lugar con una molecula ramificada de PEG. Esto se consigue mediante la activacion de un solo residuo cisteina en una region bisagra truncada del Fab modificado, seguido de la reaccion con (PEG)-lisil-maleimida, tal como se ha descrito previamente (A. P. Chapman et al., Nature Biotechnology 17, 780-783, 1999). En la Figura 12 se representa una molecula PEGilada de la invencion. El PEG utilizado era metoxi-PEG-amina 20 K (obtenible de Nektar, antiguamente Shearrater). El Fab'-PEG resultante se purifico mediante cromatografia de intercambio de cationes (SP sepharose HP) utilizando una elucion de gradiente de NaCl lineal. Fab'-PEG purificado se concentro y formulo mediante ultrafiltracion en acetato

5 de sodio 50 mM + NaCl 125 mM, pH 5,5 para producir el anticuerpo neutralizante terapeutico de la invencion.

Se entendera, naturalmente, que la presente invencion ha sido descrita a modo de ejemplo solamente, que no ha de considerarse de modo alguno limitante, y que las modificaciones de detalle pueden realizarse dentro del alcance de las reivindicaciones que figuran más adelante en esta memoria.

10 LISTADO DE SECUENCIAS

<110> CELLTECH R&amp;D LIMITED

15 <120> Un anticuerpo neutralizante con especificidad para IL-1� humana

<160> 75

<170> SeqWin99, version 1.02 20

<210> 1

<211> 414

<212> ADN

<213> Secuencia Artificial 25

<220>

<223>

<220> 30 <221> Secuencia de nucleotidos VH de IC8

<400> 1

35

<210><211><212><213> 2 384 ADN

40

<220> <221> Secuencia VL de IC8

<400>

2

<210>

3

<211>

138

<212>

PRT

<213>

5

<220>

<221>

Secuencia de proteinas VH de IC8

15

<211><212><213> <220> <221> 128 PRT Secuencia de proteinas VL de IC8

<400>

4

5

<210><211><212><213> 5 10 PRT

<220> <221>

CDR1 de VH de IC8

10

<400> 5

15

<210><211><212><213> 6 17 PRT

20

<220> <221><400> CDR2 de VH de IC8 6

<210> 7

<211> 10

<212> PRT

<213> <220><221> CDR3 de VH de IC8

<400> 7

<210>

8

<211>

11

<212>

PRT

<213>

<220>

<221>

CDR1 de VL de IC8

<400>

8

<210>

9

<211>

7

<212>

PRT

<213>

<220>

<221>

CDR2 de VL de IC8

<400>

9

<210>

10

<211>

9

<212>

PRT

<213>

<220>

<221>

CDR3 de VL de IC8

<400>

10

<210>

11

<211>

119

<212>

PRT

<213>

<220>

<221> diseno de injerto VH a IC8

<400> 11

5

<210>

12

<211>

109

<212>

PRT

<213>

10

<220>

<221>

diseno de injerto 3.11 (DP-35) a IC8

<400>

12

15

5

<210><211><212><213> 13 119 PRT

<220> <221>

diseno de injerto gH1 a IC8

10

<400> 13

<210>

14

<211>

119

<212>

PRT

<213>

5

<220> <221><400> diseno de injerto gH2 a IC8 14

10

<210><211><212><213> 15 119 PRT

15

<220> <221> diseno de injerto gH3 a IC8

<400>

15

5

<210><211><212><213> 16 108 PRT

<220> <221>

diseno de injerto VL a IC8

10

<400> 16

<210> 17

<211><212><213>

106 PRT

5

<220> <221> diseno de injerto 012 (DPK9) a IC8

<400>

17

10

100 105

15

<210><211><212><213> 18 108 PRT

<220> <221>

diseno de injerto gL1 a IC8

20

<400> 18

5

<210><211><212><213> 19 108 PRT

10

<220> <221><400> diseno de injerto gL2 a IC8 19

<210>

20

15

<211> 108

28

<212><213>

PRT

5

<220> <221> diseno de injerto gL3 a IC8

<400>

20

10

<210><211><212><213> 21 458 ADN

15

<220> <221> gH1 de IC8

<400>

21

25

<210><211><212><213> 22 414 ADN

<220> <221>

secuencia de nucleotidos de gL1 de IC8

<400> 22

5

<210><211><212><213> 23 144 PRT

10

<220> <221> secuencia de aminoacidos de gH1 de IC8

<400>

23

15

<210><211><212><213> 24 129 PRT

20

<220> <221> secuencia de aminoacidos de gL1 de IC8

<400>

24

<210> 25

<211> 21

<212> ADN

<213> Secuencia Artificial

<220>

<221> cebador de oligonucleótidos

<220>

<221> cebador T1 extremo de gH1

<400> 25 gaataaaagc ttgccgccac c 21

<210> 26

<211> 22

<212> ADN

<213> cebador de oligonucleótidos

<220>

<223> cebador B1 extremo de gH1

<400> 26 tttcttgggc cctttgtaga ag 22

<210> 27

<211> 54 <212> ADN

<213>

<220>

<221> gH1 F1 de IC8

<400> 27 atggactttg ggctcagctt gattttcctt gtccttactt taaaaggtgt gcag 54

<210> 28

<211> 54

<212> ADN

<213>

<220>

<221> gH1 F2 de IC8

<400> 28 tgtgaggtgc agctggtcga gtctggaggc gggcttgtcc agcctggagg gage 54

<210> 29

<211> 54

<212> ADN

<213>

<220>

<221> gH1 F3 de IC8

<400> 29 ctgcgtctct cttgtgcagc aagcggcttc gacttttccc gttacgatat gtcc 54

<210> 30

<211> 54

<212> ADN

<213>

<220>

<221> gH1 F4 de IC8

<400> 30 tgggtgcggc aggcacctgg gaagcgcctg gagtgggtgg catacattag ctcc 54

<210> 31

<211> 54

<212> ADN

<213>

<220>

<221> gH1 F5 de IC8

<400> 31 ggaggcggct ctacatactt cccggacacc gtcaagggcc gtttcaccat ttcc 54

<210> 32

<211> 54

<212> ADN <213>

<220>

<221> gH1 F6 de IC8

<400> 32 cgggacaatg caaagaatac cctttacctc cagatgaact ctctccgcgc agag 54

<210> 33

<211> 54

<212> ADN

<213>

<220>

<221> gH1 F7 de IC8

<400> 33 gacacagcaa tgtattactg tgcacggcag aacaagaaac tgacctggtt tgac 54

<210> 34

<211> 59

<212> ADN

<213>

<220>

<221> gH1 F8 de IC8

<400> 34 tactggggac aggggaccct tgtgacagtc tcctctgctt ctacaaaggg cccaagaaa 59

<210> 35

<211> 58

<212> ADN

<213>

<220>

<221> gH1 R1 de IC8

<400> 35 cagaggagac tgtcacaagg gtcccctgtc cccagtagtc aaaccaggtc agtttctt 58

<210> 36

<211> 54

<212> ADN

<213>

<220>

<221> gH1 R2 de IC8

<400> 36 gttctgccgt gcacagtaat acattgctgt gtcctctgcg cggagagagt tcat 54

<210> 37

<211> 54

<212> ADN

<213> <220>

<221> gH1 R3 de IC8

<400> 37 ctggaggtaa agggtattct ttgcattgtc ccgggaaatg gtgaaacggc cctt 54

<210> 38

<211> 54

<212> ADN

<213>

<220>

<221> gH1 R4 de IC8

<400> 38 gacggtgtcc gggaagtatg tagagccgcc tccggagcta atgtatgcca ccca 54

<210> 39

<211> 54

<212> ADN

<213>

<220>

<221> gH1 R5 de IC8

<400> 39 ctccaggcgc ttcccaggtg cctgccgcac ccaggacata tcgtaacggg aaaa 54

<210> 40

<211> 54

<212> ADN

<213>

<220>

<221> gH1 R6 de ICS

<400> 40 gtcgaagccg cttgctgcac aagagagacg caggctccct ccaggctgga caag 54

<210> 41

<211> 54

<212> ADN

<213>

<220>

<221> gH1 R7 de IC8

<400> 41 cccgcctcca gactcgacca gctgcacctc acactgcaca ccttttaaag taag 54

<210> 42

<211> 54

<212> ADN

<213> <220>

<221> gH1 R8 de IC8

<400> 42 gacaaggaaa atcaagctga gcccaaagtc catggtggcg gcaagctttt attc 54

<210> 43

<211> 20

<212> ADN

<213>

<220>

<221> cebador T1 extremo de gL1

<400> 43 ggatgattcg aagccgccac 20

<210> 44

<211> 21

<212> ADN

<213>

<220>

<221> cebador B1 extremo de gL1

<400> 44 gcacgccgta cgtttgattt c 21

<210> 45

<211> 55

<212> ADN

<213>

<220>

<221> gL1 F1 de IC8

<400> 45 catgagtgtg ctcactcagg tcctggcgtt gctgctgctg tggcttgcag gtgcc 55

<210> 46

<211> 57

<212> ADN

<213>

<220>

<221> gL1 F2 de IC8

<400> 46 agatgtgata tccagatgac ccagagtcca agcagtctct ccgccagcgt aggcgat 57

<210> 47

<211> 57

<212> ADN

<213>

<220> <221> gL1 F3 de IC8

<400> 47 cgtgtgacta ttacctgtcg taccagtggc aacatccata attacctgac gtggtac

<210> 48

<211> 57

<212> ADN

<213>

<220>

<221> gL1 F4 de IC8

<400> 48 cagcaaaaac tgggcaaagc cccgcagctc ctggtctata acgcgaaaac gctagca

<210> 49

<211> 57

<212> ADN

<213>

<220>

<221> gL1 F5 de IC8

<400> 49 gacggtgtgc caagccgttt cagtggcagt ggcagcggta ctcagtttac cctcaca 57

<210> 50

<211> 57

<212> ADN

<213>

<220>

<221> gL1 F6 de IC8

<400> 50 atttcgtctc tccagccgga agatttcgcc aattactatt gtcagcactt ttggagc 57

<210> 51

<211> 54

<212> ADN

<213>

<220>

<221> gL1 F7 de IC8

<400> 51 ctgcctttca ccttcggtca gggcactaaa gtagaaatca aacgtacggc gtgc 54

<210> 52

<211> 54

<212> ADN

<213>

<220>

<221> gL1 R1 de IC8 <400> 52 tactttagtg ccctgaccga aggtgaaagg caggctccaa aagtgctgac aata 54

<210> 53

<211> 57

<212> ADN

<213>

<220>

<221> gL1 R2 de IC8

<400> 53 gtaattggcg aaatcttccg gctggagaga cgaaattgtg agggtaaact gagtacc 57

<210> 54

<211> 57

<212> ADN

<213>

<220>

<221> gL1 R3 de IC8

<400> 54 gctgccactg ccactgaaac ggcttggcac accgtctgct agcgttttcg cgttata 57

<210> 55

<211> 57

<212> ADN

<213>

<220>

<221> gL1 R4 de IC8

<400> 55 gaccaggagc tgcggggctt tgcccagttt ttgctggtac cacgtcaggt aattatg 57

<210> 56

<211> 57

<212> ADN

<213>

<220>

<221> gL1 R5 de IC8

<400> 56 gatgttgcca ctggtacgac aggtaatagt cacacgatcg cctacgctgg cggagag 57

<210> 57

<211> 57

<212> ADN

<213>

<220>

<221> gL1 R6 de IC8 <211> 51

<400> 57 actgcttgga ctctgggtca tctggatatc acatctggca cctgcaagcc acagcag

57

5

<210><211><212><213> 58 54 ADN

<220> <221>

gL1 R7 de IC8

<400> 58 cagcaacgcc aggacctgag tgagcacact catggtggcg gcttcgaatc atcc

54

15

<210><211><212><213> 59 51 ADN

<220> <221>

secuencia gL2 de IC8

25

<400> 59 cagcaaaaac cgggcaaagc cccgcagctc ctggtctata acgcgaaaac g 51 <210> 60 <211> 21 <212> PRT <213>

<220> <221>

secuencia gL2 de IC8

<400>

60

<212> ADN

<213>

<220>

<221> secuencia gL3 de IC8

<400> 61 45 cagcaaaaac cgggcaaagc cccgcagctc ctgatctata acgcgaaaac g 51

<210> 62

<211> 21

<212> PRT

<213>

38 <210> 66

<220>

<221>

secuencia gL3 de IC8

<400>

62

<210><211><212><213>

63 48 ADN

<220> <221>

secuencia gH2 de IC8

<400> 63 cctgggaagg gcctggagtg ggtggcatac attagctccg gaggcggc

48

<210><211><212><213>

64 48 ADN

<220> <221>

secuencia inversa gH2 de IC8

<400> 64 ggacccttcc cggacctcac ccaccgtatg taatcgaggc ctccgccg

48

<210><211><212><213>

65 16 PRT

<220> <221>

secuencia gH2 de IC8

<400>

65

<211> 54

<212> ADN

<213>

<220>

<221> secuencia gH3 de IC8

<400> 66 gacacagcag tgtattactg tgcacggcag aacaagaaac tgacctggtt tgac 54

<210> 67

<211><212><213>

54 ADN

5

<220> <221> secuencia inversa gH3 de IC8

10 15

<400> 67 ctgtgtcgtc acataatgac acgtgccgtc ttgttctttg actggaccaa actg <210> 68 <211> 18 <212> PRT <213> <220> <221> secuencia gH3 de IC8 54

<400>

68

25

<210><211><212><213> 69 2050 ADN

<220> <221>

secuencia codificadora y flanqueante de pTTOD(gH3gL3 Fab' IGS-2)

30

<400> 69

5

<210><211><212><213> 70 235 PRT

<400>

70

5

<210><211><212><213> 71 251 PRT

<400>

71

5

<210><211><212><213> 72 59 ADN

43

<220> <221>

secuencia complementaria gL2 de IC8

<400> 72 ctagcgtttt cgcgttatag accaggagct gcggggcttt gcccggtttt tgctggtac

59

<210><211><212><213>

73 59 ADN

<220> <221>

secuencia complementaria gL3 de IC8

<400> 73 ctagcgtttt cgcgttatag atcaggagct gcggggcttt gcccggtttt tgctggtac

59

<210><211><212><213>

74 15 PRT

<400>

74

<210>

75

<211>

12

<212>

PRT

<213>

<400>

75

Claims (27)

1. REIVINDICACIONES

   1.- Un anticuerpo neutralizante con especificidad para IL-1� humana, que comprende una cadena pesada y una cadena ligera, en donde el dominio variable de la cadena pesada comprende la secuencia dada en SEQ ID NO: 5 para CDR-H1, la secuencia dada en SEQ ID NO: 6 para CDR-H2 y la secuencia dada en SEQ ID NO: 7 para CDR-H3, y en donde el dominio variable de la cadena ligera comprende la secuencia dada en SEQ ID NO: 8 para CDR-L1, la secuencia dada en SEQ ID NO: 9 para CDR-L2 y la secuencia dada en SEQ ID NO: 10 para CDR-L3.
2. 2.- Un anticuerpo neutralizante de acuerdo con la reivindicacion 1, en donde dicho anticuerpo neutralizante es una molecula de anticuerpo injertada a CDR.
3. 3.- La molécula de anticuerpo de la reivindicacion 2, en donde el dominio variable comprende regiones marco del aceptor humano y CDRs de donantes no humanas.
4. 4.- Un anticuerpo injertado a CDR de acuerdo con la reivindicacion 2 o la reivindicacion 3, en donde la cadena pesada comprende la secuencia gH3 dada en SEQ ID NO: 15.
5. 5.- Un anticuerpo injertado a CDR de acuerdo con la reivindicacion 2 o la reivindicacion 3, en donde la cadena ligera comprende la secuencia gL3 dada en SEQ ID NO: 20.
6. 6.- Un anticuerpo injertado a CDR de acuerdo con una cualquiera de las reivindicaciones 2 a 5, en donde la cadena pesada comprende la secuencia gH3 dada en SEQ ID NO: 15 y la cadena ligera comprende la secuencia gL3 dada en SEQ ID NO: 20.
7. 7.- Un anticuerpo neutralizante de acuerdo con la reivindicacion 1, que tiene una cadena pesada que comprende la secuencia dada en SEQ ID NO: 3 y una cadena ligera que comprende la secuencia dada en SEQ ID NO: 4.
8. 8.- Una molecula de anticuerpo neutralizante de acuerdo con una cualquiera de las reivindicaciones 1 a 7, en donde la molécula de anticuerpo es una molécula de anticuerpo completa con cadenas pesada y ligera de longitud completa.
9. 9.- Una molecula de anticuerpo neutralizante de acuerdo con una cualquiera de las reivindicaciones 1 a 7, en donde la molécula de anticuerpo es un fragmento Fab, Fab', F(ab')2, Fv o scFv.
10. 10.- Una molecula de anticuerpo neutralizante de acuerdo con la reivindicacion 9, que tiene en el extremo C-terminal de su cadena pesada, una region de bisagra modificada que contiene uno o dos residuos cisteina a los que se puede fijar una molécula de efector o de informador.
11. 11.- Una molecula de anticuerpo neutralizante de acuerdo con la reivindicacion 10, que tiene una molecula de efector

    o una molécula de informador fijada a la misma.
12. 12.- Una molecula de anticuerpo neutralizante de acuerdo con la reivindicacion 11, en donde la molecula de efector comprende uno o mas polimeros.
13. 13.- Una molecula de anticuerpo neutralizante de acuerdo con la reivindicacion 12, en donde el uno o mas polimeros es/son un polimero de polialquileno, polialquenileno o polioxialquileno de cadena lineal o ramificada, opcionalmente sustituido, o un polisacarido ramificado o no ramificado.
14. 14.- Una molecula de anticuerpo neutralizante de acuerdo con la reivindicacion 13, en donde el uno o mas polimeros es/son un metoxipoli(etilenglicol) o poli(etilenglicol).
15. 15.- Una molecula de anticuerpo neutralizante de acuerdo con la reivindicacion 11, que tiene fijada a uno de los residuos cisteina en el extremo C-terminal de la cadena pesada un grupo lisil-maleimida o lisil-bis-maleimida, en donde cada uno de los grupos amino del residuo lisilo tiene enlazado covalentemente al mismo un residuo metoxipoli(etilenglicol) con un peso molecular de aproximadamente 20.000 Da.
16. 16.- Una molécula de anticuerpo neutralizante de acuerdo con la reivindicacion 1, que es un fragmento Fab modificado que tiene una cadena pesada que comprende la secuencia dada en SEQ ID NO: 15 y una cadena ligera que comprende la secuencia dada en SEQ ID NO: 20 y que tiene en el extremo C-terminal de su cadena pesada una region de bisagra modificada que contiene un residuo cisteina al que puede fijarse una molecula de efector o de informador.
17. 17.- Una molecula de anticuerpo neutralizante de acuerdo con la reivindicacion 1, que es un fragmento Fab modificado que tiene una cadena pesada que comprende la secuencia dada en SEQ ID NO: 15 y una cadena ligera que comprende la secuencia dada en SEQ ID NO: 20 y que tiene en el extremo C-terminal de su cadena pesada una región de bisagra modificada que contiene un residuo cisteina al que puede fijarse una molecula de efector o de informador.
18. 18.- Una molecula de anticuerpo neutralizante de acuerdo con la reivindicacion 17, en donde su cadena pesada comprende o consiste en los residuos de aminoacidos numeros 22 a 251 de la secuencia dada en SEQ ID NO: 71, y en donde su cadena ligera comprende o consiste en los residuos de aminoacidos numeros 22 a 235 de la secuencia dada en SEQ ID NO. 70.
19. 19.- Una molecula de anticuerpo neutralizante de acuerdo con la reivindicacion 17 o la reivindicacion 18, que tiene fijado al residuo cisteina en el extremo C-terminal de la cadena pesada un grupo lisil-maleimida, en donde cada uno de los grupos amino del residuo lisilo tiene enlazado de forma covalente al mismo un residuo metoxipoli(etilenglicol) con un peso molecular de aproximadamente 20.000 Da.
20. 20.- Una secuencia de ADN aislada que codifica la o las cadenas pesada y/o ligera de una molecula de anticuerpo de acuerdo con una cualquiera de las reivindicaciones 1 a 19.
21. 21.- Un vector de clonacion o expresion que comprende una o mas secuencias de ADN de acuerdo con la reivindicacion 20.
22. 22.- El vector de acuerdo con la reivindicacion 21, en donde el vector comprende la secuencia dada en SEQ ID NO:
23. 69.
24. 23.- Una celula hospedante que comprende uno o mas vectores de clonacion o expresion de acuerdo con las reivindicaciones 21 ó 22.
25. 24.- Un procedimiento para la producción de la molécula de anticuerpo de una cualquiera de las reivindicaciones 1 a 19, que comprende cultivar la celula hospedante de la reivindicacion 23 y aislar la molecula de anticuerpo.
26. 25.- Una composición farmacéutica que comprende una molécula de anticuerpo de acuerdo con una cualquiera de las reivindicaciones 1 a 19, en combinacion con uno o mas de un excipiente, diluyente o soporte farmaceuticamente aceptable.
27. 26.- Una composición farmacéutica de acuerdo con la reivindicación 25, que comprende adicionalmente otros ingredientes activos.