MXPA05007392A - Moleculas de anticuerpos que tienen especificidad para il-1beta humana. - Google Patents

Moleculas de anticuerpos que tienen especificidad para il-1beta humana.

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Abstract

La invencion se relaciona con una molecula de anticuerpo que tiene especificidad para determinantes antigenicos de IL-1¦, usos terapeuticos de la molecula de anticuerpo y metodos para producir esta molecula de anticuerpo.

Description

MOLECUIiAS DE ANTICUERPOS QUE TIENEN ESPECIFICIDAD PARA IL-1BETA HUMANA CAMPO DE LA INVENCIÓN La presente invención se relaciona con una molécula de anticuerpo que tiene especificidad para determinantes antigénicos de IL-?ß. La presente invención se relaciona también con los usos terapéuticos de la molécula de anticuerpo y con métodos para producir la molécula de anticuerpo. ANTECEDENTES DE LA INVENCION La citosina pro-inflamatoria interleucina-?ß (IL-?ß) es un miembro de la familia de genes IL-1, que incluye también IL-?a y el antagonista del receptor de IL-1 (IL-1RA) (revisado por Dinarello, 1996, Blood, 87, 6, 2095-2147) . IL-1ß está implicada fundamentalmente en la inflamación y tiene efectos directos sobre las células endoteliales y los macrófagos, así como sobre las células T y B. La misma estimula las células estromáticas de la médula ósea para producir IL-6 así como varios factores estimulantes de colonias, e induce también la producción de TNFa. IL-?ß está implicada en muchas afecciones patológicas que están asociadas con la inflamación. Éstas incluyen infecciones (víricas, bacterianas, fúngicas y parasitarias) , choque endotóxico, artritis, artritis reumatoide, enfermedad REF: 164827 inflamatoria pélvica, esclerosis múltiple, asma, osteoartritis , psoriasis, Enfermedad de Alzheimer, Enfermedad de Crohn, Enfermedad de Peyronies, enfermedad cardiaca (por ejemplo ateroesclerosis ) , cáncer de colon, enfermedad celíaca, enfermedad de la vesícula biliar, enfermedad pilonidal, peritonitis, meningoencefalitis , otros trastornos autoinmunes, pancreatitis, traumatismos (cirugía) , síndrome de rechazo inverso y rechazo de trasplantes . IL-?ß está implicada también en el cáncer, la osteoporosis y la señalización del dolor. La implicación de IL-?ß en la inflamación, el dolor y otras afecciones patológicas sugiere que IL-?ß es un blanco adecuado para fármacos y otras moléculas para la profilaxis y/o el tratamiento de estas afecciones. La forma madura de 17 kDa de IL-?ß ejerce sus efectos biológicos por unión al receptor de IL-1, IL-IR. Existen dos tipos de IL-IR: el receptor de tipo I IL-lRI y el receptor de tipo II IL-1RII. La unión de IL-?ß a IL-lRI conduce al reclutamiento de la proteína accesoria del receptor y la señalización. Por el contrario, IL-lRII ha sido denominado receptor de "reclamo", dado que la unión de IL-1B no transduce una señal. Puede esperarse que existan al menos tres tipos de anticuerpo que enlazan IL-?ß: (i) anticuerpos que enlazan IL-?ß pero que no neutralizan la actividad biológica de IL-lRI (un anticuerpo no neutralizante) ; (ii) anticuerpos que enlazan IL-?ß y que neutralizan la actividad biológica de IL-IRI por bloqueo de la unión al IL-1RI; y (iii) anticuerpos que enlazan IL-?ß y que neutralizan la actividad biológica de IL-lRI pero no bloquean la unión al IL-lRI, tales como los anticuerpos descritos en el documento US 2003/0026806. Anticuerpos anti-IL-?ß han sido identificados y propuestos para uso en el tratamiento de enfermedades y trastornos mediados por IL-?ß; véase, por ejemplo, el documento O 95/01997. Se ha identificado ahora un anticuerpo IL-?ß mejorado que es particularmente efectiva in vivo, por ejemplo en los modelos de inflamación in vivo descritos en la presente. El anticuerpo es un anticuerpo neutralizante como se define anteriormente en la alternativa (ii) . BREVE DESCRIPCIÓN DE LA INVENCIÓN En un primer aspecto, la presente invención proporciona un anticuerpo neutralizante que tiene especificidad para IL-1ß humana, que comprende una cadena pesada, en donde el dominio variable de la cadena pesada comprende por lo menos uno de una CDR {región determinante de la complementariedad} que tiene la secuencia dada en SEC ID NO: 5 para CDR-Hl, una CDR que tiene la secuencia dada en SEC ID NO: 6 para CDR-H2 y una CDR que tiene la secuencia dada en SEC ID NO: 7 para CDR-H3. Los residuos en los dominios variables de los anticuerpos se enumeran convencionalmente de acuerdo con un sistema ideado por abat et al. Este sistema se expone en Kabat et al., 1987, en Sequences of protexns of Immunological Interest, Departamento de Salud y Servicios Humanos de los Estados Unidos, NIH, USA {en lo sucesivo "Kabat et al. {supra}"). Este sistema de numeración se utiliza en la presente especificación excepto donde se indique lo contrario . Las designaciones de residuos de Kabat no siempre corresponden directamente a la numeración lineal de los residuos de aminoácidos . La secuencia lineal real de aminoácidos puede contener menos aminoácidos o aminoácidos adicionales que los incluidos en la numeración estricta de Kabat correspondientes a un acortamiento de un componente estructural, o inserción en el mismo, sea armazón o CDR, de la estructura básica del dominio variable. La numeración de Kabat correcta de los residuos puede determinarse para un anticuerpo dado por alineamiento de los residuos de homología en la secuencia del anticuerpo con una secuencia "estándar" de Kabat numerada. Las CDRs del dominio variable de la cadena pesada están localizadas en los residuos 31-35 {CDR-Hl}, los residuos 50-65 {CDR-H2} y los residuos 95-102 {CDR-H3 } de acuerdo con el sistema de numeración de Kabat. Sin embargo, de acuerdo con Chothia (Chothia, C. and Lesk, A.M. J. Mol. Biol . , 196, 901-917 (1987)), el bucle equivalente a CDR-H1 se extiende desde el residuo 26 a residuo 32. Asi 'CDR-Hl', tal como se usa en la presente, comprende los residuos 26 a 35, como se describe por una combinación del sistema de numeración de Kabat y la definición topologica de bucles de Chothia. Las CDRs del dominio variable de la cadena ligera están localizadas en los residuos 24-34 (CDR-Ll) , los residuos SO-56 (CDR-L2) y los residuos 89-97 (CDR-L3) de acuerdo con el sistema de numeración de Kabat . Tal como se usa en la presente, la expresión 'anticuerpo neutralizante' , describe un anticuerpo que es capaz de neutralizar la actividad biológica de señalización de IL-?ß, en particular por bloqueo de la unión de IL-?ß al IL-1RI. De preferencia, un anticuerpo del primer aspecto de la presente invención comprende una cadena pesada en la cual por lo menos dos de CDR-Hl, CDR-H2 y CDR-H3 del dominio variable de la cadena pesada se seleccionan de las siguientes: la secuencia dada en SEC ID NO: 5 para CDR-Hl, la secuencia dada en SEC ID NO: 6 para CDR-H2 y la secuencia dada en SEC ID NO: 7 para CDR-H3. Por ejemplo, el anticuerpo puede comprender una cadena pesada en la cual CDR-Hl tiene la secuencia dada en SEC ID NO : 5 y CDR-H2 tiene la secuencia dada en SEC ID NO: 6. Alternativamente, el anticuerpo puede comprender una cadena pesada en la cual CDR-Hl tiene la secuencia dada en SEC ID NO: 5 y CDR-H3 tiene la secuencia dada en SEC ID NO: 7 o el anticuerpo puede comprender una cadena pesada en la cual CDR-H2 tiene la secuencia dada en SEC ID NO: 6 y CDR-H3 tiene la secuencia dada en SEC ID NO: 7. Para evitar dudas, se entiende que están incluidas todas las permutaciones. De modo más preferible, el anticuerpo del primer aspecto de la presente invención comprende una cadena pesada, en la cual el dominio variable comprende la secuencia dada en SEC ID NO: 5 para CDR-Hl, la secuencia dada en SEC ID NO: 6 para CDR-H2 y la secuencia dada en SEC ID NO: 7 para CDR-H3. Todavía más preferiblemente, el anticuerpo del primer aspecto de la presente invención comprende una cadena pesada, comprendiendo el dominio variable de la cadena pesada la secuencia dada en SEC ID NO : 3. Alternativamente, el anticuerpo del primer aspecto de la presente invención comprende una cadena pesada, comprendiendo el dominio variable de la cadena pesada una secuencia que tiene al menos 60% de identidad o semejanza con la secuencia dada en SEC ID NO : 3. "Identidad", tal como se usa en la presente, indica que en cualquier posición particular en las secuencias alineadas, el residuo de aminoácidos es idéntico entre las secuencias. "Semejanza", tal como se usa en la presente, indica que, en cualquier posición particular en las secuencias alineadas, el residuo de aminoácidos es de un tipo similar entre las secuencias. Por ejemplo, la leucina puede emplearse en sustitución de isoleucina o valina. Otros aminoácidos que pueden emplearse frecuentemente en sustitución recíproca incluyen, pero sin carácter limitante: fenilalanina, tirosina y triptófano {aminoácidos que tienen cadenas laterales aromáticas}; lisina, arginina e histidina (aminoácidos que tienen cadenas laterales básicas) ; aspartato y glutamato (aminoácidos que tienen cadenas laterales ácidas) ; asparagina y glutamina (aminoácidos que tienen cadenas laterales amídicas) ; y cisteina y me ionina (aminoácidos que tienen cadenas laterales gue contienen azufre) . Los grados de identidad y semejanza pueden calcularse fácilmente (Computational Molecular Biology, Lesk, A.M. , compilador, Oxford University Press, New York, 1988; Biocomputing. Informatics and Genome Projects, and Genome Projects, Smith, D.W. , ed. , Academic Press, New York, 1993; Computer Analysis of Sequence Data, Part 1, and Griffin, Griffin, H.G., eds . , Humana Press, New Jersey, 1994; Sequence Analysis in Molecular Biology, von Heinje, G. , Academic Press, 1987; y Sequence Analysis Primer, Gribskov, M. and Devereux, J., eds . , M Stockton Press, New York, 1991). De preferencia, el anticuerpo del primer aspecto de la presente invención comprende una cadena pesada, comprendiendo el dominio variable de la cadena pesada una secuencia que tiene por lo menos 90%, 95% ó 98% de identidad o semejanza con la secuencia dada en SEC ID NO: 3. En una modalidad preferida alternativa de , la presente invención proporciona un anticuerpo neutralizante que tiene especificidad para la IL-?ß humana, que comprende una cadena ligera, comprendiendo el dominio variable de la cadena ligera por lo menos uno de una CDR (región determinante de la complementariedad) que tiene la secuencia dada en SEC ID NO: 8 para CDR-Ll, una CDR que tiene la secuencia dada en SEC ID NO: 9 para CDR-L2 y una CDR que tiene la secuencia dada en SEC ID NO: 10 para CDR-L3. De preferencia, el anticuerpo del segundo aspecto de la presente invención comprende una cadena ligera, seleccionándose por lo menos dos de CDR-Ll, CDR-L2 y CDR-L3 del dominio variable de la cadena ligera de las siguientes secuencias: la secuencia dada en SEC ID NO: 8 para CDR-Ll, la secuencia dada en SEC ID NO: 9 para CDR-L2 y la secuencia dada en SEC ID NO: 10 para CDR-L3. Por ejemplo, el anticuerpo puede comprender una cadena ligera en la cual CDR-Ll tiene la secuencia dada en SEC ID NO: 8 y CDR-L2 tiene la secuencia dada en SEC ID NO: 9. Alternativamente, el anticuerpo puede comprender una cadena ligera en la cual CDR-Ll tiene la secuencia dada en SEC ID NO: 8 y CDR-L3 tiene la secuencia dada en SEC ID NO: 10, o el anticuerpo puede comprender una cadena ligera en la cual CDR-L2 tiene la secuencia dada en SEC ID NO: 9 y CDR-L3 tiene la secuencia dada en SEC ID NO: 10. Para evitar dudas, se entenderá que se incluyen todas las permutaciones . De modo más preferible, el anticuerpo del segundo aspecto de la presente invención comprende una cadena ligera, en la cual el dominio variable comprende la secuencia dada en SEC ID NO: 8 para CDR-Ll, la secuencia dada en SEC ID NO: 9 para CDR-L2 , y la secuencia dada en SEC ID NO: 10 para CDR-L3. De modo todavía más preferible, el anticuerpo del segundo aspecto de la presente invención comprende una cadena ligera, comprendiendo el dominio variable de la cadena ligera la secuencia dada en SEC ID NO: 4. Alternativamente, el anticuerpo del segundo aspecto de la presente invención comprende una cadena ligera, comprendiendo el dominio variable de la cadena ligera una secuencia que tiene por lo menos 60% de identidad o semejanza con la secuencia dada en SEC ID NO: 4. Preferiblemente, el anticuerpo del segundo aspecto de la presente invención comprende una cadena ligera, comprendiendo el dominio variable de la cadena ligera una secuencia que tiene por lo menos 90%, 95% ó 98% de identidad o semejanza con la secuencia dada en SEC ID NO: 4. Las moléculas de anticuerpo de los aspectos primero y segundo de la presente invención comprenden de preferencia una cadena ligera complementaria o una cadena pesada complementaria, respectivamente. De modo preferible, el anticuerpo de acuerdo con cualquiera de los aspectos primero y segundo de la presente invención comprende una cadena pesada, comprendiendo el dominio variable de la cadena pesada la secuencia dada en SEC ID NO: 5 para CDR-Hl , la secuencia dada en SEC ID NO: 6 para CDR-H2 y la secuencia dada en SEC ID NO: 7 para CDR-H3 , y una cadena ligera; comprendiendo el dominio variable de la cadena ligera la secuencia dada en SEC ID NO: 8 para CDR-Ll, la secuencia dada en SEC ID NO: 9 para CDR-L2 y la secuencia dada en SEC ID NO: 10 para CDR-L3. En una modalidad muy preferida de los aspectos primero y segundo de la invención, el anticuerpo comprende una cadena pesada, comprendiendo el dominio variable de la cadena pesada la secuencia dada en SEC ID NO: 3, y una cadena ligera, comprendiendo el dominio variable de la cadena ligera la secuencia dada en SEC ID NO : 4. En una modalidad preferida alternativa de de la presente invención, se proporciona un anticuerpo de acuerdo con cualquiera de los aspectos primero o segundo de la invención, en el cual el anticuerpo es un anticuerpo monoclonal . En una modalidad del tercer aspecto de la invención, el anticuerpo monoclonal comprende una cadena pesada, comprendiendo el dominio variable de la cadena pesada la secuencia dada en SEC ID NO: 3, y una cadena ligera, comprendiendo el dominio variable de la cadena ligera la secuencia dada en SEC ID NO: 4. En una modalidad preferida alternativa de de la invención, el anticuerpo monoclonal es un anticuerpo monoclonal murino, comprendiendo el anticuerpo monoclonal una cadena pesada y una cadena ligera, en donde el dominio variable de la cadena pesada comprende la secuencia dada en SEC ID NO: 3, y en donde el dominio variable de la cadena ligera comprende la secuencia dada en SEC ID NO: 4. Este anticuerpo monoclonal murino se designa en la presente como 'ICS' o como el anticuerpo "donante", o como el "anticuerpo monoclonal murino" . Las secuencias completas de nucleótidos y aminoácidos de los dominios variables de las cadenas pesada y ligera del anticuerpo monoclonal de ratón IC8 se muestran en la Figura 1, y se dan en las SEC ID NOS : 1 a 4. Las CDRs dadas en SEC ID NOS: 5 a 10 se derivan del anticuerpo monoclonal murino IC8. En una modalidad preferida alternativa de de la invención, se proporciona una molécula de anticuerpo injertada a CDR, en la cual una o más de las CDRs se han obtenido del anticuerpo monoclonal murino IC8. Tal como se usa en la presente, la expresión 'molécula de anticuerpo injertada a CDR' se refiere a una molécula de anticuerpo en la cual la cadena pesada y/o ligera contiene una o más CDRs (que incluyen, en caso deseado, una o más CDRs modificadas) procedentes de un anticuerpo donante (por ejemplo, un anticuerpo monoclonal murino) injertada (s) en un armazón de región variable de cadena pesada y/o ligera de un anticuerpo aceptor (por ejemplo, un anticuerpo humano) . Para una revisión, véase Vaughan et al., Mature Biotechnology, 16 , 535-539, 1998. Cuando se injertan las CDRs, puede usarse cualquier secuencia armazón de región variable aceptora apropiada atendiendo a la clase/tipo del anticuerpo donante del que se derivan las CDRs, con inclusión de regiones armazón de ratón, primate y humanas. De preferencia, el anticuerpo injertado a CDR del cuarto aspecto de la presente invención tiene un dominio variable que comprende regiones armazón aceptoras humanas asi como una o más de las CDRs derivadas del anticuerpo donante al que se ha hecho referencia anteriormente. Así, se proporciona un anticuerpo neutralizante injertado a CDR en el cual el dominio variable comprende regiones armazón aceptoras humanas y CDRs donantes no humanas .
Ejemplos de armazones humanos que pueden utilizarse en la presente invención son KOL, NEWM, REI, EU, TUR, TEI, LAY y POM (Kabat et al., supra) . Por ejemplo, pueden usarse KOL y NEWM para la cadena pesada, puede utilizarse REI para la cadena ligera y pueden utilizarse EU, LAY y POM tanto para la cadena pesada como para la cadena ligera. Alternativamente, pueden usarse secuencias humanas de la linea germinal . En un anticuerpo injertado a CDR de la presente invención, las cadenas aceptoras pesada y ligera no precisan derivarse necesariamente del mismo anticuerpo y pueden, en caso deseado, comprender cadenas compuestas que tengan regiones de armazón derivadas de cadenas diferentes. La región de estructura preferida para la cadena pesada del anticuerpo injertado a CDR de la presente invención se deriva de la secuencia humana del subgrupo VH3 3-11 (DP-35) que se muestra en la Figura 3 (SEC ID NO: 12) junto con JH4. Por lo tanto, se proporciona un anticuerpo neutralizante injertado a CDR que comprende por lo menos una CDR no humana donante en la cual la región de estructura de la cadena pesada se deriva de la secuencia del subgrupo humano 3-11 (DP-35) junto con JH4. La secuencia de JH4 humana es como sigue: . (YFDY) WGQGTLV VSS (SEC ID NO: 74) . La porción YFDY forma parte de CDR-H3 y no forma parte del armazón 4 (Ravetch, JV. et al., 1981, Cell, 27, 583-591). La secuencia donante es la secuencia VH de IC8 (SEC ID NO: 11) que se muestra en la Figura 3a. La región de estructura preferida para la cadena ligera del anticuerpo injertado a CDR de la presente invención se deriva de la secuencia de la línea germinal humana del subgrupo VKl 012 (DPK9) que se muestra en la Figura 3 (SEC ID NO: 17) junto con JKl . Por lo tanto, se proporciona un anticuerpo neutralizante injertado a CDR que comprende por lo menos una CDR donante no humana, en la cual la región de estructura de la cadena ligera se deriva de la secuencia del subgrupo humano 012 (DPK9) junto con JKl . La secuencia JKl es como sigue: ( T) FGQGTKVEIK (SEC ID NO: 75) . La porción WT forma parte de CDR-L3 y no forma parte del armazón 4 (Hieter, PA., et al., 1982, J. Biol . Chem. , 257, 1516-1522). La secuencia donante es la secuencia VL de IC8 (SEC ID NO: 16) que se muestra en la Figura 3d. Asimismo, en un anticuerpo injertado a CDR de la presente invención, las regiones de armazón no precisan tener exactamente la misma secuencia que las del anticuerpo aceptor. Por ejemplo, los residuos no usuales pueden cambiarse por residuos que aparecen más frecuentemente para esta clase o tipo de cadena aceptora. Alternativamente, los residuos seleccionados en las regiones de armazón aceptoras pueden cambiarse de tal manera que correspondan al residuo encontrado en la misma posición en el anticuerpo donante (véase Reichmann et al. Nature, 332, 323-324, 1988). Estos cambios deben mantenerse en el mínimo necesario para recuperar la afinidad del anticuerpo donante. Un protocolo para seleccionar residuos en las regiones armazón aceptoras que pueden precisar ser cambiadas se expone en WO 91/09967. De preferencia, en una molécula de anticuerpo injertada a CDR de la presente invención, si la cadena pesada aceptora tiene la secuencia humana DP-35+JH4, entonces las regiones armazón aceptoras de la cadena pesada comprenden, además de una o más CDRs donantes, un residuo donante en la posición 44 (de acuerdo con Kabat et al., (supra) ) . El efecto sorprendente sobre la afinidad del cambio del residuo 44 a un residuo donante no era de esperar. Así, en cualquier proceso de humanización de anticuerpos, convendrá examinar adicionalmente el efecto de tener el residuo 44 como residuo donante o aceptor. De esta manera, se proporciona un anticuerpo injertado a CDR, en el cual por lo menos el residuo en la posición 44 del dominio variable de la cadena pesada es un residuo donante. Alternativa o adicionalmente, si la cadena pesada aceptora tiene la secuencia humana DP-35+JH4, entonces las regiones de armazón aceptoras de la cadena pesada comprenden preferiblemente, además de una o más CDRs donantes, un residuo donante en la posición 89 (de acuerdo con Kabat et al., supra). Por lo tanto, se proporciona un anticuerpo injertado a CDR, en el cual por lo menos el residuo en la posición 44 y/o la posición 89 del dominio variable de la cadena pesada es un residuo donante. De preferencia, en una molécula de anticuerpo injertada a CDR de acuerdo con la presente invención, si la cadena ligera aceptora tiene la secuencia humana del subgrupo DPK9+JK1, entonces las regiones armazón aceptoras de la cadena ligera comprenden residuos donantes en las posiciones 45, 70 y 85 y pueden comprender adicionalmente residuos donantes en las posiciones 40 y 48 (de acuerdo con Kabat et al., supra) . Por esta razón, se proporciona un anticuerpo injertado a CDR en el cual por lo menos el residuo en la posición 40, 45, 48, 70 y/o 85 es un residuo donante. Se proporciona también un anticuerpo injertado a CDR en el cual los residuos en las posiciones 45, 70 y 85 son residuos donantes . Los residuos donantes son residuos del anticuerpo donante, es decir el anticuerpo del que se derivaron originalmente las CDRs , que en el caso de la presente invención es el anticuerpo monoclonal murino IC8. En una modalidad alternativa de los aspectos primero o cuarto de la presente invención, la cadena pesada comprende de preferencia la secuencia de gHl (SEC ID NO: 13), gH2 (SEC ID NO: 14) o gH3 (SEC ID NO: 15) . Las secuencias de los dominios variables de estas cadenas pesadas injertadas se muestran en la Figura 3a. En una modalidad alternativa de los aspectos segundo o cuarto de la presente invención, la cadena ligera comprende de preferencia la secuencia de gLl (SEC ID NO: 18), gL2 (SEC ID NO: 19) o gL3 (SEC ID NO: 20). Las secuencias de los dominios variables de estas cadenas ligeras injertadas se muestran en la Figura 3b. De modo más preferible, una molécula de anticuerpo de acuerdo con la modalidad alternativa de los aspectos segundo o cuarto de la presente invención comprende una cadena pesada que contiene la secuencia de gHl (SEC ID NO: 13), gH2 (SEC ID NO: 14) ó gH3 (SEC ID NO : 15) y una cadena ligera que comprende la secuencia de gLl (SEC ID NO: 18), gL2 (SEC ID NO: 19) ó gL3 (SEC ID NO: 20) . De modo todavía más preferido, la cadena pesada de la molécula de anticuerpo de acuerdo con la modalidad alternativa de los aspectos segundo o cuarto de la presente invención comprende el dominio variable gH3 (SEC ID NO: 15) y la cadena ligera de la molécula de anticuerpo de la presente invención comprende el dominio variable gL3 (SEC ID NO: 20) .
En un quinto aspecto de la invención, se proporciona un anticuerpo de acuerdo con cualquiera de los aspectos primero a cuarto de la presente invención, que se enlaza al mismo epítope que IC8. Alternativamente, se proporciona un anticuerpo neutralizante que tiene especificidad para IL-?ß humana, que se enlaza al mismo epítope que un anticuerpo cuya cadena pesada comprende la secuencia gH3 (SEC ID NO: 15) y cuya cadena ligera comprende la secuencia gL3 (SEC ID NO: 20) . La molécula de anticuerpo de la presente invención puede comprender una molécula de anticuerpo completa que tiene las cadenas pesada y ligera de longitud total o un fragmento de las mismas, tal como un fragmento Fab, Fab modificado, Fab' , F(ab')2, Fv o scFv. Alternativamente, puede comprender un monómero o dímero de cadena ligera o cadena pesada o un anticuerpo de cadena simple, por ejemplo, un Fv de cadena simple en el cual los dominios variables de las cadenas pesada y ligera están unidos por un enlazador peptídico. Análogamente, las regiones variables de las cadenas pesada y ligera pueden estar combinadas con otros dominios de anticuerpos en caso apropiado. La molécula de anticuerpo de la presente invención puede tener un efector o una molécula reportera unido a ella. Por ejemplo, la misma puede tener un macrociclo para formación de quelatos con un átomo de metal pesado o una toxina, tal como ricina, unida a ella por una estructura covalente de formación de puente. De preferencia, el anticuerpo de la presente invención puede estar modificado para hacer posible que una molécula efectora o reportera se una al mismo. De modo muy preferible, la molécula de anticuerpo de la presente invención es un fragmento Fab modificado como se describe más adelante. Alternativamente, pueden usarse procedimientos de tecnología de ADN recombinante para producir una molécula de anticuerpo en la cual el fragmento Fe (CH2, CH3 y dominios bisagra) , los dominios CH2 y CH3 o el dominio CH3 de una molécula completa de inmunoglobulina ha (han) sido reemplazado (s) por, o se ha (han) unido a aquélla por enlace peptídico, una proteína funcional distinta de las inmunoglobulinas , tal como una enzima o molécula de toxina. Alternativamente, se prefiere el caso en que la molécula de anticuerpo de la presente invención es un fragmento Fab modificado en el cual la modificación es la adición al extremo del terminal C de su cadena pesada de uno o más aminoácidos para permitir la unión de una molécula efectora o reportera. De preferencia, los aminoácidos adicionales forman una región bisagra modificada que contiene uno o dos residuos cisteína a los cuales puede unirse la molécula efectora o reportera . Se proporciona también una molécula de anticuerpo neutralizante de acuerdo con la presente invención, que tiene una molécula efectora o reportera unida a ella. Moléculas efectoras o reporteras incluyen una molécula tal como un agente citotóxico, un radionucleido o un radical de fármaco. Otras moléculas que pueden unirse incluyen una toxina, tal como abrina, ricina A, exotoxina de pseudomonas , o toxina de la difteria, una proteína tal como el factor de necrosis tumoral, interferón a, interferón ß, factor de crecimiento de los nervios, factor de crecimiento derivado de las plaquetas o activador del plasminógeno tisular, un agente trombótico o un agente anti-angiogénico, por ejemplo, angiostatina o endostatina, o bien un modificador de la respuesta biológica tal como una linfocina, interleucina-1 (IL-1) , interleucina-2 (IL-2) , interleucina-6 (IL-6) , factor estimulante de colonias de granulocitos-macrófagos (GM-CSF) , factor estimulante de colonias de los granulocitos (G-CSF) , factor de crecimiento de los nervios (NGF) u otro factor de crecimiento. Un grupo efector preferido es una molécula de polímero, que puede estar unida al fragmento Fab modificado para aumentar su vida media in vivo. La molécula de polímero puede, en general, ser un polímero sintético o existente naturalmente, por ejemplo un polímero de polialquileno, polialquenileno o polioxialquileno opcionalmente sustituido de cadena lineal o ramificada, o un polisacárido ramificado o no ramificado, por ejemplo, un homo- o hetero-polisacárido . Los sustituyentes opcionales particulares que pueden estar presentes en los polímeros sintéticos arriba mencionados incluyen uno o más grupos hidroxi, metilo o metoxi .
Ejemplos particulares de polímeros sintéticos incluyen poli (etilenglicol) , poli (propilenglicol ) , poli (alcohol vinílico) opcionalmente sustituidos de cadena lineal o ramificada o derivados de los mismos, especialmente poli (etilenglicol) opcionalmente sustituido tal como metoxipoli (etilenglicol) o derivados del mismo. Polímeros particulares existentes naturalmente incluyen lactosa, amilosa, dextrano, glucógeno o sus derivados. "Derivados", tal como se usa en la presente, tiene por objeto incluir derivados reactivos, por ejemplo grupos reactivos selectivos de tiol tales como maleimidas y análogos. El grupo reactivo puede estar enlazado al polímero directamente o a través de un segmento enlazador. Se apreciará que el residuo de un grupo de este tipo formará parte en algunos casos del producto como el grupo de enlace entre el fragmento de anticuerpo y el polímero. El tamaño del polímero puede modificarse en caso deseado, pero generalmente estará comprendido en un intervalo de peso molecular promedio de 500 Da a 50,000 Da, con preferencia de 5000 a 40,000 Da y más preferiblemente de 25,000 a 40,000 Da. El tamaño del polímero puede seleccionarse en particular sobre la base del uso a que se destine el producto. Así, por ejemplo, en los casos en que el producto tiene por objeto abandonar la circulación y penetrar en los tejidos, por ejemplo para el uso en el tratamiento de un tumor, puede ser ventajoso usar un polímero de peso molecular pequeño, por ejemplo con un peso molecular de aproximadamente 5000 Da. Para las aplicaciones en las cuales el producto se mantiene en la circulación, puede ser ventajoso usar un polímero de mayor peso molecular, por ejemplo que tenga un peso molecular comprendido en el intervalo de 25000 Da a 40,000 Da. Los polímeros particularmente preferidos incluyen un polímero de polialquileno, tal como un poli (etilenglicol) o especialmente, poli (etilenglicol) un metoxipoli (etilenglicol) o un derivado del mismo, y especialmente con un peso molecular comprendido en el intervalo de aproximadamente 25000 Da a aproximadamente 40,000 Da. Cada molécula de polímero unida al fragmento de anticuerpo modificado puede estar enlazada covalentemente al átomo de azufre de un residuo cisteína localizado en el fragmento. El enlace covalente será generalmente un enlace disulfuro o, en particular, un enlace azufre-carbono . En caso deseado, el fragmento de anticuerpo puede tener una o más moléculas efectoras o reporteras unidas a él. Las moléculas efectoras o reporteras pueden estar unidas al fragmento de anticuerpo a través de cualquier cadena lateral de aminoácido disponible o grupo funcional de aminoácido terminal localizado en el fragmento, por ejemplo cualquier grupo amino, hidroxilo o carboxilo libre.
Un polímero activado puede usarse como el material iniciador en la preparación de fragmentos de anticuerpo modificados con polímeros como se describe arriba. El polímero activado puede ser cualquier polímero que contenga un grupo reactivo con tiol tal como un ácido o éster -halocarboxílico , por ejemplo, yodoacetamida, una imida, por ejemplo, maleimida, una vinil sulfona o un disulfuro. Los materiales iniciadores pueden obtenerse comercialmente (por ejemplo de Nektar, anteriormente Shearwater Pol mers Inc., Huntsville, AL, USA) o se pueden preparar a partir de materiales iniciadores disponibles comercialmente, usando los procedimientos químicos convencionales. Las Moléculas PEG particulares incluyen metoxi-PEG-amina 20K (que puede obtenerse de Nektar, anteriormente Shearwater; Rapp Polymere; and SunBio) y M-PEG-SPA (que puede obtenerse de Nektar, anteriormente Shearwater) . En lo que respecta a la unión de radicales poli (etilenglicol) (PEG) , se hace referencia a ¾Poly (ethyleneglycol) Chemistry, Biotechnical and Biomedical Applications", 1992, J. Milton Harris (ed) , Plenum Press, New York; "Pol (ethyleneglycol) Chemistry, Biotechnical and Biological Applications", 1997, J. Milton Harris and S. Zalipsky (ed) , American Chemical Society, Washington DC and "Bioconjugation Protein Coupling Techniques for the Biomedical Sciences", 1998, M. Aslam and A. Dent, Grove Publishers, New York. En los casos en que se desea obtener un fragmento de anticuerpo enlazado a una molécula efectora o reportera, éste se puede preparar por procedimientos químicos estándares o de ADN recombinante, en los cuales el fragmento de anticuerpo se enlaza ya sea directamente o a través de un agente de acoplamiento a la molécula efectora o reportera, ya sea antes o después de la reacción con el polímero activado, según sea apropiado . Los procedimientos químicos particulares incluyen, por ejemplo, los descritos en el documento WO 93/06231, WO 92/22583, WO 89/00195 y WO 89/01476. Alternativamente, en los casos en que la molécula efectora o reportera es una proteína o un polipéptido, el enlace puede realizarse usando los procedimientos de ADN recombinante, por ejemplo como se describe en WO 86/01533 y EP 0392745. De preferencia, el fragmento Fab modificado de la presente invención está enlazado a PEG (es decir, tiene PEG (poli (etilenglicol} ) unido covalentemente al mismo) de acuerdo con el método descrito en el documento EP-A-094854 . De preferencia, la molécula de anticuerpo de la presente invención es un fragmento Fab modificado enlazado a PEG como se muestra en la Figura 12. El fragmento Fab modificado tiene preferiblemente un grupo maleimida enlazado covalentemente a un grupo tiol simple en una región bisagra modificada. Un residuo lisina está enlazado preferiblemente por unión covalente al grupo maleimida. A cada uno de los grupos amina en el residuo lisina está unido preferiblemente un polímero de metoxipoli (etilenglicol} que tiene un peso molecular de aproximadamente 20,000 Da. El peso molecular total de la molécula efectora completa es por consiguiente aproximadamente 40,000 Da. Por lo tanto, se proporciona un anticuerpo neutralizante que tiene unido a uno de los residuos cisteína en el extremo del terminal C de la cadena pesada un grupo lisil-maleimida o lisil-bis-maleimida, en el cual cada grupo amino del residuo lisilo tiene enlazado covalentemente a este un residuo de metoxipoli (etilenglicol} que tiene un peso molecular de aproximadamente 20,000 Da. Por ejemplo, el peso molecular puede ser 15,000-25,000 Da, o preferiblemente 18,000-22,000 Da, y todavía más preferiblemente 19,000-21,000 Da. En una modalidad preferida, la presente invención proporciona una molécula de anticuerpo neutralizante que tiene especificidad para IL-?ß humana, que es un fragmento Fab modificado que tiene una cadena pesada que comprende la secuencia dada en SEC ID NO: 15 y una cadena ligera que comprende la secuencia dada en SEC ID NO: 20, y que tiene en el extremo del terminal C de su cadena pesada una región bisagra modificada que contiene un residuo cisteína al cual puede estar unida una molécula efectora o reportera. En otra modalidad preferida, se proporciona una molécula de anticuerpo neutralizante que tiene especificidad para IL-1ß humana, que es un fragmento Fab modificado que tiene una cadena pesada que comprende la secuencia dada en SEC ID NO: 15 y una cadena ligera que comprende la secuencia dada en SEC ID NO: 20 y que tiene en el extremo del terminal C de su cadena pesada una región bisagra modificada que contiene un residuo cisteína al cual está unida una molécula efectora o reportera. Más preferiblemente, se proporciona una molécula de anticuerpo neutralizante que tiene especificidad para IL-?ß humana, que es un fragmento Fab modificado que tiene una cadena pesada que comprende la secuencia dada en SEC ID NO: 15 y una cadena ligera que comprende la secuencia dada en SEC ID NO: 20 que tiene unido al residuo cisteína en el extremo del terminal C de la cadena pesada un grupo lisil-maleimida, en el cual cada grupo amino del residuo lisilo tiene enlazado covalentemente a él un residuo de metoxipoli (etilenglicol) que tiene un peso molecular de aproximadamente 20,000 Da. Todavía más preferiblemente, se proporciona una molécula de anticuerpo neutralizante, en la cual su cadena pesada comprende o está constituida por los residuos de aminoácidos números 22 a 251 de la secuencia dada en SEC ID NO: 71, y en la cual su cadena ligera comprende o está constituida por los residuos de aminoácidos números 22 a 235 de la secuencia dada en SEC ID NO: 70. Los residuos de aminoácidos números 1 a 21 de las secuencias dadas en SEC ID NOS: 70 y 71 representan la secuencia líder de E. coli que se escinde muy preferentemente para dar una molécula de anticuerpo neutralizante de la presente invención. Muy preferiblemente, se proporciona una molécula de anticuerpo neutralizante, en la cual su cadena pesada comprende o está constituida por los residuos de aminoácidos números 22 a 251 de la secuencia dada en SEC ID NO: 71, y en la cual su cadena ligera comprende o está constituida por los residuos de aminoácidos números 22 a 235 de la secuencia dada en SEC ID NO: 70 que tiene unido al residuo cisterna en el extremo del terminal C de la cadena pesada un grupo lisil-maleimida, en el cual cada grupo amino del residuo lisilo tiene unido covalentemente a él un residuo de metoxipoli (etilenglicol) que tiene un peso molecular de aproximadamente 20,000 Da. Se proporciona también una molécula de anticuerpo neutralizante que tiene especificidad para IL-?ß humana, que se enlaza al mismo epítope como un anticuerpo neutralizante que comprende una cadena ligera que comprende la secuencia dada en SEC ID NO: 20. Los dominios de región constante de la molécula de anticuerpo de la presente invención, si están presentes, pueden seleccionarse atendiendo a la función propuesta de la molécula de anticuerpo, y en particular las funciones efectoras que puedan requerirse. Por ejemplo, los dominios de región constante pueden ser dominios humanos de IgA, igD, IgE, IgG ó IgM. En particular, pueden usarse los dominios de región constante de IgG humana, especialmente de los isotipos IgGl e IgG3 cuando la molécula de anticuerpo está destinada a usos terapéuticos y se requieren funciones efectoras de anticuerpo. Alternativamente, pueden usarse los isotipos IgG2 e IgG4 cuando la molécula de anticuerpo está destinada a propósitos terapéuticos y no se requieren funciones efectoras de anticuerpo, por ejemplo, para bloquear simplemente la actividad de IL-?ß. La molécula de anticuerpo de la presente invención tiene de preferencia una afinidad de unión de por lo menos 4.4 x ÍCT10 , más preferiblemente por lo menos 3.2 x 10~10 M. La presente invención se refiere también a variantes de las moléculas de anticuerpos de la presente invención, que tienen una afinidad mejorada para IL-?ß. Estas variantes pueden obtenerse por diferentes protocolos de maduración por afinidad que incluyen la mutación de las CDRs (Yang et al . , J. Mol. Biol., 254, 392-403, 1995), desordenamiento de cadenas (Marks et al., Bio/Technology, 10^ 779-783, 1992), uso de cepas mutágenas de E. coli (Lo et al., J. Mol. Biol., 250, 359-368, 1996), desordenamiento de ADN (Patten et al., Curr. Opin. Biotechnol . , 8, 724-733, 1997), presentación de fago (Thompson et al., J. Mol. Biol., 256, 77-88, 1996) y PCR sexual (Crameri et al., Nature, 391, 288-291, 1998). Vaughan et al. (supra) expone estos métodos de maduración por afinidad. La presente invención proporciona también una secuencia de ADN aislada que codifica la o las cadenas pesadas y/o ligeras de la molécula de anticuerpo de la presente invención. Preferiblemente, la secuencia de ADN codifica la cadena pesada o la cadena ligera de la molécula de anticuerpo de la presente invención. La secuencia de ADN de la presente invención puede comprender ADN sintético, por ejemplo producido por procesamiento químico, ADNc, ADN genómico o cualquier combinación de los mismos. Las secuencias de ADN que codifican la molécula de anticuerpo de la presente invención pueden obtenerse por los métodos bien conocidos por los experimentados en la técnica. Por ejemplo, las secuencias de ADN que codifican parte o la totalidad de las cadenas pesada y ligera del anticuerpo pueden sintetizarse en caso deseado, a partir de las secuencias de ADN determinadas o sobre la base de las secuencias de aminoácidos correspondientes. La codificación del ADN de las secuencias armazón aceptoras está disponible ampliamente para los experimentados en la técnica, y puede sintetizarse fácilmente sobre la base de sus secuencias de aminoácidos conocidas. Pueden usarse las técnicas estándares de biología molecular para preparar las secuencias de ADN codificantes de la molécula de anticuerpo de la presente invención. Las secuencias de ADN deseadas pueden sintetizarse completamente o en parte usando las técnicas de síntesis de oligonucleótidos . En el caso apropiado pueden usarse las técnicas de mutagénesis orientada y reacción en cadena de la polimerasa (PCR) , en caso apropiado. La presente invención se refiere también a un vector de clonación o expresión que comprende una o más secuencias de ADN de la presente invención. Por lo tanto, se proporciona un vector de clonación o expresión que comprende una o más secuencias de ADN que codifican un anticuerpo de la presente invención. De preferencia, el vector de clonación o expresión comprende dos secuencias de ADN, que codifican la cadena ligera y la cadena pesada de la molécula de anticuerpo de la presente invención, respectivamente. De preferencia, un vector de acuerdo con la presente invención comprende la secuencia dada en SEC ID NO : 69. Los métodos generales por los cuales pueden construirse los vectores, métodos de transfección y métodos de cultivo son bien conocidos por los experimentados en la técnica. A este respecto, se hace referencia a "Current protocols in Molecular Biology", 1999, F.M. Ausubel (ed) , Wiley Interscience, New York y el Manual de Maniatis producido por Cold Spring Harbor Publishing.
Se proporciona también una célula hospedera que comprende uno o más vectores de clonación o expresión que comprenden una o más secuencias de ADN que codifican un anticuerpo de la presente invención. Puede usarse cualquier sistema adecuado célula hospedera/vector para la expresión de las secuencias de ADN codificantes de la molécula de anticuerpo de la presente invención. También se pueden usar los sistemas bacterianos, por ejemplo E. coli, y otros sistemas microbianos o sistemas de expresión en células hospedera eucariotas, por ejemplo de mamífero. Las células hospedera adecuadas de mamífero incluyen CHO, células de mieloma o células de hibridoma. La presente invención proporciona también un proceso para la producción de una molécula de anticuerpo de acuerdo con la presente invención que comprende cultivar una célula hospedera que contiene un vector de la presente invención en condiciones adecuadas para conducir la expresión de proteína a partir de ADN codificante de la molécula de anticuerpo de la presente invención, y aislar la molécula de anticuerpo. La molécula de anticuerpo puede comprender solamente un polipéptido de cadena pesada o ligera, en cuyo caso es preciso usar únicamente una secuencia codificante de polipéptido de cadena pesada o cadena ligera para transfectar las células hospedera. Para la producción de productos que comprenden a la vez cadenas pesada y ligera, la línea de células puede transfectarse con dos vectores, un primer vector que codifica un polipéptido de cadena ligera y un segundo vector que codifica un polipéptido de cadena pesada. De manera alternativa, puede usarse un solo vector, incluyendo el vector secuencias codificantes de polipéptidos de cadena ligera y cadena pesada. Dado que los anticuerpos de la presente invención son útiles en el tratamiento y/o la profilaxis de una condición patológica, la presente invención proporciona también una composición farmacéutica o de diagnóstico, que comprende una molécula de anticuerpo de la presente invención en combinación con uno o más de un excipiente, diluyente o vehículo farmacéuticamente aceptable. Por lo tanto, se proporciona el uso de un anticuerpo de la invención para la fabricación de un medicamento . La composición se suministrará usualmente como parte de una composición farmacéutica estéril que incluirá normalmente un vehículo farmacéuticamente aceptable. Una composición farmacéutica de la presente invención puede comprender adicionalmente un adyuvante farmacéuticamente aceptable. La presente invención proporciona también un proceso para la preparación de una composición farmacéutica o de diagnóstico que comprende añadir y mezclar la molécula de anticuerpo de la presente invención junto con uno o más de un excipiente, diluyente o vehículo farmacéuticamente aceptable.
La molécula de anticuerpo puede ser el único ingrediente activo en la composición farmacéutica o de diagnóstico o puede ir acompañada por otros ingredientes activos con inclusión de otros ingredientes de anticuerpos, por ejemplo anticuerpos anti-células T, anti-lFNY o anti-LPS, o ingredientes distintos de anticuerpos tales como xantinas . Las composiciones farmacéuticas comprenden de preferencia una cantidad terapéuticamente efectiva del anticuerpo de la invención. La expresión "cantidad terapéuticamente efectiva", tal como se usa en la presente, hace referencia a una cantidad de un agente terapéutico necesaria para tratar, mejorar o prevenir una enfermedad o afección objetivo, o para exhibir un efecto terapéutico o preventivo detectable. Para cualquier anticuerpo, la cantidad terapéuticamente efectiva puede estimarse inicialmente sea en ensayos de cultivo de células o en modelos animales, usualmente en roedores, conejos, perros, cerdos o primates. El modelo animal puede usarse también para determinar el intervalo de concentraciones y la vía de administración apropiados. La información puede usarse luego para determinar las dosis y las vías de administración útiles en humanos. La cantidad terapéuticamente efectiva precisa para un individuo humano dependerá de la gravedad del estado de enfermedad, la salud general del individuo, la edad, el peso y el sexo del individuo, la dieta, el tiempo y la frecuencia de administración, la o las combinaciones de fármacos, las sensibilidades de reacción y la tolerancia/respuesta a la terapia. Esta cantidad puede determinarse por experimentación de rutina y está dentro del criterio del médico. En general, una cantidad terapéuticamente efectiva será de 0.01 mg/kg a 50 mg/kg, de preferencia 0.1 mg/kg a 20 mg/kg. Las composiciones farmacéuticas pueden presentarse convenientemente en formas de dosis unitaria que contienen una cantidad predeterminada de un agente activo de la invención por dosis . Las composiciones se pueden administrar individualmente a un paciente o pueden administrarse en combinación (por ejemplo, simultánea, secuencial o separadamente) con otros agentes , fármacos u hormonas . La dosis a la cual se administra la molécula de anticuerpo de la presente invención depende de la naturaleza de la condición a tratar, el grado de la inflamación presente y de si la molécula de anticuerpo se está usando profilácticamente o para tratar una condición existente. La frecuencia de la dosis dependerá de la vida media de la molécula de anticuerpo y de la duración de su efecto. Si la molécula de anticuerpo tiene una vida media corta (por ejemplo, 2 a 10 horas) puede ser necesario administrar una o más dosis por día. Alternativamente, si la molécula de anticuerpo tiene una vida media larga (por ejemplo, 2 a 15 días) puede ser necesario administrar solamente una dosis una vez al día, una vez a la semana o incluso una vez cada 1 ó 2 meses . El vehículo farmacéuticamente aceptable no debe inducir por sí mismo la producción de anticuerpos perjudiciales para el individuo que recibe la composición, y no debe ser tóxico. Los vehículos adecuados pueden ser macromoléculas de gran tamaño que se metabolizan lentamente, tales como proteínas, polipéptidos, liposomas, polisacáridos , poli (ácidos lácticos), poli (ácidos glicólicos) , aminoácidos polímeros, copolímeros de aminoácidos y partículas de virus inactivas . Pueden usarse sales farmacéuticamente aceptables, por ejemplo sales de ácidos minerales, tales como clorhidratos, bromhidratos, fosfatos y sulfatos, o sales de ácidos orgánicos, tales como acetatos, propionatos, malonatos y benzoatos . Los vehículos farmacéuticamente aceptables en las composiciones terapéuticas pueden contener adicionalmente líquidos tales como agua, solución salina, glicerol y etanol. Adicionalmente, pueden estar presentes en tales composiciones sustancias auxiliares, tales como agentes humectantes o emulsionantes o sustancias amortiguadoras del pH. Estos vehículos hacen posible que las composiciones farmacéuticas se formulen como tabletas, pildoras, grageas, cápsulas, líquidos, geles, jarabes, lechadas y suspensiones, para ingestión por el paciente. Las formas de administración preferidas incluyen formas adecuadas para administración parenteral, por ejemplo, por inyección o infusión, por ejemplo por inyección de tipo bolo o infusión continua. En los casos en que el producto está destinado a inyección o infusión, el mismo puede tomar la forma de una suspensión, solución o emulsión en un vehículo aceitoso o acuoso, y puede contener agentes de formulación, tales como agentes de suspensión, conservadores, estabilizadores y/o dispersantes. Alternativamente, la molécula de anticuerpo puede encontrarse en forma seca, para reconstitución antes de su uso con un líquido estéril apropiado . Una vez formuladas, las composiciones de la invención pueden administrarse directamente al individuo. Los individuos a tratar pueden ser animales. Sin embargo, se prefiere que las composiciones estén adaptadas para administración a individuos humanos. Las composiciones farmacéuticas de esta invención se pueden administrar por cualquier número de vías que incluye, pero sin carácter limitante, las vías oral, intravenosa, intramuscular, intra-arterial, intramedular, intratecal, intraventricular, transdérmica, transcutánea (por ejemplo, véase el documento WO 98/20734), subcutánea, intraperitoneal, intranasal, enteral, tópica, sublingual, intravaginal o rectal. También se pueden usar hipopulverizaciones para administrar las composiciones farmacéuticas de la invención. Típicamente, las composiciones terapéuticas se pueden preparar como inyectables, ya sea como soluciones o suspensiones líquidas. Pueden prepararse también formas sólidas adecuadas para disolución o suspensión en vehículos líquidos antes de la inyección. El suministro directo de las composiciones se realizará generalmente por inyección, por vías subcutánea, intraperitoneal , intravenosa o intramuscular, o se suministrarán al espacio intersticial de un tejido. Las composiciones pueden administrarse también a una lesión. El tratamiento de dosificación puede ser un protocolo de dosis simple o un protocolo de dosis múltiple. Se apreciará que el ingrediente activo en la composición será una molécula de anticuerpo. Como tal, la misma será susceptible de degradación en el tracto gastrointestinal. Como tal, si la composición debe administrarse por una vía que use el tracto gastrointestinal, la composición deberá contener agentes que protejan el anticuerpo contra la degradación, pero que liberen el anticuerpo una vez que ha sido absorbido del tracto gastrointestinal. Una exposición completa de vehículos farmacéuticamente aceptables está disponible en Remington's Pharmaceutical Sciences (Mack Publishing Company, N. J. 1991) .
Se contempla también que el anticuerpo de la presente invención se administrará mediante el uso de terapia génica. Para realizar esto, las secuencias de ADN que codifican las cadenas pesada y ligera de la molécula de anticuerpo bajo el control de componentes de ADN apropiados se introducen en un paciente de tal manera que las cadenas del anticuerpo se expresan a partir de las secuencias de ADN y se ensamblan in situ. La presente invención proporciona también una molécula de anticuerpo para uso en el control de la inflamación. De preferencia, la molécula de anticuerpo puede usarse para reducir el proceso inflamatorio o para prevenir el proceso inflamatorio . La presente invención proporciona también la molécula de anticuerpo de la presente invención para uso en el tratamiento o la profilaxis de un trastorno patológico que está mediado por IL-?ß o asociado con un nivel incrementado de IL-?ß. De preferencia, la afección patológica se selecciona del grupo constituido por infecciones (víricas, bacterianas, fúngicas y parasitarias), choque endotóxico asociado con infección, artritis, artritis reumatoide, enfermedad inflamatoria pélvica, Enfermedad de Alzheimer, Enfermedad de Crohn, Enfermedad de Peyronie, enfermedad celí ca, enfermedad de la vesícula biliar, enfermedad pilonidal, peritonitis, meningoencefalitis, otros trastornos autoinmunes , pancreatitis, traumatismos (cirugía) , síndrome de rechazo inverso, rechazo de trasplantes, cáncer (tanto tumores sólidos como melanomas, hepatoblastomas, sarcomas, carcinomas de células escamosas, cánceres de células de transición, cánceres ováricos y enfermedades malignas hematológicas y en particular leucemia mielogénica aguda, leucemia mielogénica crónica, cáncer gástrico y cáncer de colon) , enfermedades cardiacas con inclusión de enfermedades isquémicas tales como infarto de miocardio y ateroesclerosis, coagulación intravascular, resorción ósea, osteoporosis , periodontitis e hiperclorhidria . La presente invención proporciona también una molécula de anticuerpo de acuerdo con la presente invención para uso en el tratamiento o la profilaxis del dolor. La presente invención proporciona adicionalmente el uso de una molécula de anticuerpo de acuerdo con la presente invención en la fabricación de un medicamento para el tratamiento o la profilaxis de un trastorno patológico que está mediado por IL-?ß o asociado con un nivel incrementado de IL-?ß. La presente invención proporciona adicionalmente el uso de una molécula de anticuerpo de acuerdo con la presente invención en la fabricación de un medicamento para el tratamiento o la profilaxis del dolor. Una molécula de anticuerpo de la presente invención puede utilizarse en cualquier terapia en la que se desee reducir los efectos de IL-?ß en el cuerpo humano o animal. IL-?ß puede ser circulante en el cuerpo o puede estar presente en un nivel indeseablemente alto localizada en un sitio particular del cuerpo, por ejemplo un sitio de inflamación . La molécula de anticuerpo de la presente invención se usa de preferencia para el control de la inflamación. La presente invención proporciona también un método de tratamiento de individuos humanos o animales que padecen o se encuentran en riesgo de padecer un trastorno mediado por IL-1ß, comprendiendo el método administrar al individuo una cantidad efectiva de la molécula de anticuerpo de la presente invención . La molécula de anticuerpo de la presente invención puede usarse también en diagnóstico, por ejemplo en el diagnóstico in vivo y la formación de imágenes de estados de enfermedad que implican IL-?ß. BREVE DESCRIPCIÓN DE LAS FIGURAS - La presente invención se describe adicionalmente sólo a modo de ilustración en los ejemplos que siguen, los cuales hacen referencia a las Figuras adjuntas, en las cuales: La Figura la muestra la secuencia de nucleótidos de aminoácidos (SEC ID NOS: 1 y 3, respectivamente) de los dominios variables de la cadena pesada, y la Figura Ib muestra la secuencia de nucleótidos y aminoácidos (SEC ID NOS: 2 y 4, respectivamente) de los dominios variables de la cadena ligera del anticuerpo monoclonal murino IC8. La Figura 2 muestra los vectores MRR14 y pMRRlO. La Figuras 3 muestra el diseño de injerto para las secuencias de la cadena pesada (Figura 3a SEC ID NOS: 11-15) y la cadena ligera de IC8 (Figura 3b; SEC ID NOS: 16-20) . El símbolo (I) pone de relieve las diferencias entre las secuencias armazón donante : aceptor : injertada. Las' CDR's llevan subrayado simple para las secuencias de IC8. Estas son como se define por Kabat, excepto en el caso de CDR-Hl que abarca a la vez las definiciones de Kabat y de Chothia. Las secuencias con subrayado doble son residuos donantes retenidos en los injertos. Los residuos marcados con asterisco (*) son comunes en las secuencias germinales humanas del subgrupo VH3, pero no están presentes en esta línea germinal particular - éstos no se consideran residuos de ratón aun cuando los mismos estén presentes en la secuencia donante original. Las Figuras 4a - 4b muestran las secuencias de nucleótidos y aminoácidos de los genes diseñados gHl (Figura 4a) y gLl (Figura 4b) . Las Figuras 5a-5b muestra los oligonucleotidos que se usaron para la construcción génica. La Figura 6 muestra las casetes de oligonucleotidos que se usaron para injertos ulteriores. Se muestran: la secuencia de la cadena de sentido IC8gL2 (SEC ID NO: 59), la secuencia de la cadena inversa (SEC ID NO: 72) y la secuencia de aminoácidos correspondiente (SEC ID NO: 60) ; la secuencia de la cadena de sentido IC8gL3 (SEC ID NO: 61), la secuencia de la cadena inversa (SEC ID NO: 73) y la secuencia de aminoácidos correspondiente (SEC ID NO: 62); la secuencia de la cadena de sentido IC8gH2 (SEC ID NO: 63), la secuencia de la cadena inversa (SEC ID NO: 64) y la secuencia de aminoácidos correspondiente (SEC ID NO: 65), y la secuencia de la cadena de sentido IC8gH3 (SEC ID NO: 66) , la secuencia de la cadena inversa (SEC ID NO: 67) y la secuencia de aminoácidos correspondiente (SEC ID NO: 65) . Los residuos sin subrayar designan aminoácidos cambiados . La Figura 7 muestra los resultados del ensayo de neutralización de IL-?ß con injertos de IC8. La Figura 8 muestra un mapa del vector pTTOD(Fab') . La Figura 9 muestra las etapas 1-4 en la clonación de los genes de la región V de IC8 en el vector intermedio pTTOD (Fa 1 ) . La Figura 10 muestra un mapa del vector pTTOD (gH3gL3Fab' IGS-2) . La Figura 11 muestra la secuencia codificante y de flanqueo de pTTOD (gH3gL3 Fab'IGS-2); SEC ID NO: 69. La Figura 12 muestra la estructura de un fragmento Fab modificado derivado de un anticuerpo para IL-?ß enlazado covalentemente por un residuo cisteína a un enlazador lisil-maleimida en el cual cada grupo amino en el residuo lisilo tiene unido covalentemente a él un residuo metoxi PEG en el cual n es aproximadamente 42 0 .
Manipulaciones de ???G y métodos generales Se usó la cepa INVOÍF ' de E. coli (Invitrogen) para transformación y crecimiento en cultivo de rutina. Las enzimas de restricción y modificación de ADN se obtuvieron de Roche Diagnostics Ltd. y New England Biolabs . Las preparaciones de plásmido se realizaron usando estuches (kits) de purificación Maxi Plasmid (QIAGEN, No. de catálogo 12165 ) . Las reacciones de secuenciación de ADN se realizaron utilizando el estuche (terminador de secuenciación ABI prism Big Dye (no. de catálogo 43 04149 ) y se ejecutaron en un secuenciador automático ABI 3100 (Applied Biosystems) . Los datos se analizaron utilizando el programa AutoAssembler (Applied Biosystems) . Los oligonucleótidos se obtuvieron de OSWEL. La concentración de Fab' se determinó utilizando ELISA de ensambla e Fab' . Ejemplo 1; Clonación de genes y expresión de las regiones variables del anticuerpo monoclonal murino IC8 Preparación del ARN total El hibridoma de expresión de I C 8 fue generado por Cistron usando tecnología convencional de hibridoma subsiguiente a la inmunización de ratones con la proteína humana IL-?ß. El hibridoma se obtuvo luego por Celltech R&D Limited. El ARN total se preparó a partir de células de hibridoma de IC8 usando el estuche QIAGEN RNeasy (QIAGEN Ltd, no. de catálogo 74104) . El ARN obtenido se transcribió inversamente a ADNc usando el estuche Clontech cDNA Advantage RT para PCR (no. de catálogo K1402) .
Clonación por PCR de las regiones VH y VL de IC8 El ADNc preparado a partir de las células de hibridoma se usó como el molde para la PCR en una serie de reacciones diseñadas para multiplicar las secuencias de región V. Las reacciones utilizaron un conjunto de iniciadores degenerados 'directos' diseñados para reasociarse a ADN dentro de la secuencia de señal observada, y un iniciador inverso que se reasociaba a ADN codificante de la unión armazón 4 /región constante. La PCR se realizó usando Taq Plus Precisión (Stratagene, No. de catálogo 600211) y una concentración 0.25 mM de dNTP . Los productos de la PCR resultantes se clonaron en vectores de secuenciación (estuche de clonación InVitrogen zero Blunt TOPO PCR para secuenciación, No. de catálogo K2875) y se determinó la secuencia del ADN. Se usó la secuenciación de proteínas N-terminal del anticuerpo IC8 purificado (a partir del hibridoma) para confirmar que las secuencias traducidas correspondían a la secuencia observada de la proteína. Las secuencias de la región V se muestran en la Figura 1 y en SEC ID NOS: 1 a 4. Los genes de la región V de murino se sub-clonaron luego en los vectores de expresión pMRRlO y pMRRl4 (Figura 2). Éstos son vectores separados para la expresión de la cadena ligera y pesada respectivamente y contienen ADN genómico que codifica los genes de la región constante para la cadena ligera kappa humana y la cadena pesada gamma-4, respectivamente . La molécula cHcL quimérica doble del anticuerpo IC8 se expresó por co-transfección transitoria de los vectores de expresión de la cadena pesada y ligera arriba descritos (pMRRIO y pMRRl4 que contenían VL y VH de IC8 respectivamente) en células CHO-L761. Las transfecciones se realizaron usando el procedimiento de la lipofectamina de acuerdo con las instrucciones del fabricante (InVitrogen, No. de catálogo 18324) .
Ejemplo 2: Injerto por CDR de IC8 Las CDRs de IC8 se injertaron por CDR en armazones humanos a fin de reducir la inmunogenicidad potencial y facilitar la expresión en E. coli . Se seleccionaron armazones aceptores humanos de la línea germinal a partir de los subgrupos VH3 y VKl. La Figura 3 muestra un alineamiento entre la secuencia donante de ratón y los armazones aceptores humanos . El armazón aceptor de la cadena pesada es la secuencia de línea germinal humana VH3-11 (DP-35) , procediendo el armazón 4 de esta porción de la línea germinal JH4 de la región JH humana. El armazón aceptor de la cadena ligera es la secuencia 012 .de la línea germinal humana (DPK9) , procediendo el armazón 4 de esta porción de la línea germinal JKl de la región JK humana. El alineamiento en la Figura 3 muestra que existen 13 diferencias de armazón entre las cadenas pesadas donante y aceptora (con exclusión de las CDRs) . En cada una de estas posiciones se realizó un análisis del potencial del residuo para contribuir a la unión de antígeno, por contacto directo con el antígeno, por una función en el empaquetamiento de CDR, o por implicación en la interfaz VL/VH en caso de considerarse importante, se retuvo el residuo donante murino. El alineamiento de la cadena ligera muestra que existen 15 diferencias de armazón entre las secuencias donante y aceptora (con exclusión de las CDRs) . Se analizó nuevamente el potencial del residuo murino para contribuir a la unión de antígeno. De este modo, se diseñaron tres injertos de VH y tres injertos de VL. Éstos se muestran también en la Figura 3 y corresponden a SEC ID NO: 13 (gHl) , SEC ID NO: 14 (gH2), SEC ID NO: 15 (gH3), SEC ID NO: 18 (gLl) , SEC ID NO: 19 (gL2) y SEC ID NO: 20 (gL3) .
Ejemplo 3: Diseño y construcción de genes para secuencias injertadas Se diseñaron genes para codificar las secuencias injertadas, usando los codones empleados frecuentemente en E. coli y evitando los codones de E. coli 'raros' (Wada et al. (1991), Nucí. Acids Res., 19, 1981-86). Se introdujeron sitios de restricción en la secuencia de ADN a intervalos para facilitar la manipulación genética ulterior. La Figura 4 muestra el diseño de genes para gHl y gLl, cuyas secuencias se dan en SEC ID NOS: 21 y 22. Las secuencias de aminoácidos correspondientes se dan en SEC ID NOS: 23 y 24, respectivamente. Se utilizaron oligonucleótidos totalmente traslapados para construir los genes que codifican gHl y gLl (Figura 5 SEC ID NOS: 27-58). Los oligonucleótidos codificantes de los genes diseñados se unieron por reasociación mezclándolos a una concentración de 100 pmoles/µ? en amortiguador (TrisHCl 12.5 mM de pH 7.5, MgCl2 2.5 mM, NaCl 25 mM, ditioeritritol 0.25 mM) y calentamiento a 95°C durante 3 minutos en un bloque de PCR programado para enfriamiento a 30°C a una tasa de -0.01°C cada 10 segundos. Se añadieron ADN-ligasa T4 (5U) y su amortiguador de reacción apropiado, y los oligonucleótidos se unieron por ligación mediante incubación a 25°C durante 1 hora. Los genes ligados de las cadenas pesada y ligera se multiplicaron luego por PCR después de la adición de un exceso décuplo de iniciadores Ti (SEC ID NO: 25) y Bl (SEC ID NO: 26) 'extremos'. Para esta multiplicación se utilizó una ADN-polimerasa de corrección de lectura (Taq Plus Precisión, Stratagene) . Los productos de multiplicación se corrieron sobre un gel de agarosa al 1.5%. La banda 400-450 se aisló y se purificó en gel, después de lo cual se clonó al vector intermedio pCR4 blunt TOPO de acuerdo con las instrucciones del fabricante (InVitrogen) . Esto creó los plásmidos intermedios pCR4(IC8gLl) y pCR4 (IC8gHl ) . Estos plásmidos se utilizaron luego como los moldes para crear las formas gL2 , gL3 , gH2 y gH3 injertadas ulteriormente. Se utilizó un método de reemplazamiento de cásete oligonucleotídica para crear los injertos humanizados gL2 y gL3. La Figura 6 muestra el diseño de las casetes oligonucleotídicas . Para construir cada variante, se cortó el vector pCR4 (lC8gLl) con las enzimas de restricción Kpnl y Nhel . El fragmento del vector grande resultante se purificó en gel a partir de agarosa y se utilizó en ligación con la cásete oligonucleotídica. Los pares de oligonucleótidos se unieron por reasociación por mezcla a una concentración de 0.5 pmoles/µ? en un volumen de 200 µ? de amortiguador (TrisHCl 12.5 mM de pH 7.5, MgCl2 2.5 iriM, NaCl 25 mM, ditioeritritol 0.25 mM) , y calentamiento a 95°C durante 3 minutos en un baño maría (volumen 500 mi) , después de lo cual se dejaron enfriar lentamente a la temperatura ambiente. La cásete oligonucleotídica reasociada se diluyó luego diez veces en agua antes de la ligación en el vector cortado adecuadamente. Se utilizó secuenciacion de ADN para confirmar la secuencia correcta, creando los plásmidos pCR4(IC8gL2) y pCR4 (IC8gL3) . La variante gH2 se construyó a partir de pCR4(IC8gHl) usando una estrategia de PCR. La cadena inversa de la cásete mostrada en la Figura 6 (SEC ID NO: 64) se utilizó como iniciador inverso en PCR utilizando un iniciador directo 5' específico del vector para generar un producto que representaba la secuencia parcial gH2. Éste se digirió con las enzimas de restricción HindIII y BspEI, después de lo cual se clonó en pCR4(IC8gHl) restringido para crear pCR4 (IC8gH2) . La variante gH3 se construyó utilizando una estrategia de PCR diferente. Los dos oligonucleótidos gH3 mostrados en la Figura 6 se utilizaron en reacciones PCR separadas: la hebra de sentido (SEC ID NO: 66) como iniciador directo usando un iniciador inverso 3' específico del vector, y la cadena sin sentido (SEC ID NO: 67) como iniciador inverso utilizando un iniciador directo 5' específico del vector. En ambos casos el molde fue pCR4 (IC8gHl) . Los dos productos de multiplicación resultantes se aislaron y purificaron, después de lo cual se añadieron junto con ambos iniciadores 5 'y 3' específicos del vector y se sometieron a ciclos por multiplicaciones PCR adicionales para generar un producto gH3 de longitud total. Éste se digirió con HindIII y Apal y se insertó en pCR4(IC8gHl) restringido con HindIII-Apal , para crear pCR (IC8gH3 ) . Todas las variantes se confirmaron por secuenciación de ADN. Cada uno de los injertos de la cadena pesada se sub-clonó luego en el vector de expresión p RRl4 como fragmentos HindIII-Apal. Cada uno de los 3 injertos de la cadena ligera se sub-clonó en el vector de expresión de la cadena ligera pMRRlO como fragmentos SfuI-BsiWI.
Selección de la variante injertada óptima Los anticuerpos injertados se expresaron por co-transfección transitoria de los vectores de expresión de las cadenas pesada y ligera injertados arriba descritos (pMRRlO y PMRR14 que contenían gLl, gL2 y gL3 y gHl, gH2 y gH3 de IC8 respectivamente) en células CHO-L761. Las transfecciones se realizaron utilizando el procedimiento de la lipofectamina de acuerdo con las instrucciones del fabricante (InVitrogen, no. de catálogo 18324) . Todas las combinaciones de cadena injertada y cadena quimérica se expresaron y compararon contra el anticuerpo quimérico doble cHcL. La unión se evaluó en un ensayo BIAcore y en un ensayo de neutralización de IL-?ß.
Ensayo BIAcore El formato de ensayo utilizó el anticuerpo anti-IL-?ß capturado por anti-hFc con una titulación de IL-?ß humana recombinante en la fase de solución. Se inmovilizó la IgG de ratón anti-humana, específica del fragmento Fe (Celltech) en la célula de flujo 2 de un Sensor Chip CM5 mediante química de acoplamiento de aminas a un nivel de 12757RU. Se preparó una superficie de referencia bloqueada en la célula de flujo 1 por activación con EDC/WHS y desactivación con etanolamina usando los mismos volúmenes que para la célula de flujo 2. Se utilizó el amortiguador HBS-EP (HEPES 10 mM de pH 7.4, NaCl 0.15 M, EDTA 3 mM, Surfactant P20 al 0.005%, Biacore AB) como el amortiguador de ejecución y los ensayos se realizaron a 25°C. Se pasó el anticuerpo anti-IL-?ß a través de las células de flujo 1 y 2 y se capturó en la superficie inmovilizada anti-hFc usando un caudal de 10 µ?/min. Se inyectó IL-?ß desde 400-0 nM sobre la superficie del anticuerpo anti-IL-?ß bloqueado y capturado utilizando un caudal de 30 µ?/min durante 3 min. La superficie de anti-hFc se regeneró con una inyección de 30 µ? de HC1 40 mM. Los parámetros cinéticos se calcularon utilizando los elementos de programación (software) BIAevaluation 3.1.
Para Fab' de gIC8, el formato de ensayo utilizó el anticuerpo anti-IL-?ß capturado por anti-hF (ab' ) 2 (donde 4h' indica que es un F(ab')2 humano) y se tituló luego la IL-?ß. Se inmovilizó IgG de cabra anti-humana Affinipure, específica del fragmento F(ab')2 (Jackson ImmunoResearch Code 109-005-097) en la célula de flujo 2 de un Sensor Chip CM5 mediante química de acoplamiento de aminas hasta un nivel de 13025RU. Se preparó una superficie de referencia bloqueada en la célula de flujo 1 por activación con EDC/NHS y desactivación con etanolamina usando los mismos volúmenes que para la célula de flujo 2. Se utilizó el amortiguador HBS-EP (HEPES 10 mM de pH 7.4, NaCl 0.15 M, EDTA 3 mM, Surfactant P20 al 0.005%, Biacore AB) como el amortiguador de ejecución y los ensayos se realizaron a 25°C. Se pasó el anticuerpo anti-IL-ip a través de las células de flujo 1 y 2 y se capturó en la superficie inmovilizada anti-hF (ab' ) 2 usando un caudal de 10 µ?/min. Se inyectó IL-?ß (Strathmann) desde 400-0 nM sobre la superficie del anticuerpo anti-IL-?ß bloqueado y capturado, usando un caudal de 30 µ?/min durante 3 min. Se regeneró la superficie de anti-hF (ab' ) 2 con una inyección de 30 µ? de HCl 40 mM seguida por una inyección de 15 µ? de NaOH 5 mM. Los parámetros cinéticos se calcularon utilizando los elementos de programación BIAevaluation 3.1. La Tabla 1 muestra un resumen de los datos de afinidad del antígeno Biacore. Está claro que el injerto gHl , que tiene residuos donantes en las posiciones 44 y 89, tiene mayor afinidad que gH2 , que tiene únicamente un residuo donante en la posición 89. Por esta razón se rechazó el injerto gH2. Sorprendentemente, se observó afinidad alta en el injerto gH3 , en el cual únicamente la posición 44 es un residuo armazón donante.
Tabla 1: Afinidad por BIAcore Anti-IL-?ß KD (nM) mIC8 0.30 cHcL 0.38 gHlgLl 0.35 gHlgL2 0.34 gHlgL3 0.30 gH2gLl 1.27 gH2gL3 1.14 gH2gL3 1.07 gH3gLl 0.28 gHlgL2 0.32 gH3gL3 0.28 gH3gL3Fab' 0.32 Ensayo de neutralización in vi tro Se dejaron crecer fibroblastos hasta 80% de confluencia en placas de 96 pozos. Los anticuerpos se titularon en diluciones semilogarítmicas a partir de 1 pg/ml y se añadió IL-?ß para dar una concentración final de 20 pg/ml . Las placas se incubaron a la temperatura ambiente durante 30 min. El medio de cultivo se separó de los cultivos de fibroblastos, se añadieron 100 µ? de mezcla anticuerpo/IL-ip a los pozos apropiados y se cultivaron durante una noche a 37°C. Se estimó luego la cantidad de IL-6 producida en respuesta a IL-?ß usando el Estuche Human IL-6 Duoset DY206 de R&D Systems . Los resultados del ensayo de neutralización se muestran en la Figura 7 , en la cual las formas inj ertadas del anticuerpo (con exclusión de gH2) se comparan con el anticuerpo de ratón originario . Como en el caso de los datos de afinidad de Biacore, existe muy poca diferencia entre cualquiera de los injertos restantes. Por esta razón se seleccionó gL3gH3 como la variante con actividad óptima y el número mínimo de residuos armazón de ratón. Como se muestra en la Figura 3 , la secuencia gH3 tiene 1 residuo armazón donante, mientras que la secuencia gL3 tiene 3 residuos armazón donantes .
Ensayo de neutralización in vivo Para determinar la eficacia de neutralización del gH3gL3Fab' in vivo, se ensayó el gH3gL3Fab' en dos modelos de inflamación in vivo. gH3gL3Fab' -PEG(40K) intraperitoneal/hIL-?ß intraperitoneal en ratones Se inyectaron ratones macho Balb/c (18-25 g) por vía intraperitoneal (i.p.) con gH3gL3Fa ' -PEG (4OK) (100 µ?, en vehículo de PBS) o Fab'-PEG(40K) de control (100 µ?, en vehículo de PBS) 5 minutos antes de la inyección i.p. con hIL-?ß (150 ng/kg) o vehículo (100 µ? de PBS) . Después de 120 minutos, los ratones se sacrificaron por dislocación cervical y se realizó un lavado peritoneal (3 mi de HBSS (Sales de Hanks Equilibradas) + BSA al 0.25%, HEPES 12 mM) . Se realizó un recuento total de leucocitos utilizando un Contador Coulter. Para identificación de los neutrófilos, se tiñeron 50 µ? de fluido de lavado peritoneal con una dilución 1:300 de mAb anti-CD45-CyChrome y una dilución 1:300 de mAb GR-1 marcado con anti-ficoeritrina (anti-Ly6G/Ly6C) durante 20 min (4°C, en la oscuridad) . Los leucocitos se lavaron una sola vez en HBSS (BSA al 0.25%, HEPES 12 mM) , se resuspendieron en 300 µ? de HBSS (BSA al 0.25%, HEPES 12 mM) y se realizaron por citometría de flujo. Los neutrófilos se identificaron como CD45+GR-1ALT0. Se midió la concentración de proteína 1 de murino quimioatractiva de monocitos (mMCP-1) en las muestras de lavado peritoneal por ELISA de superposición de acuerdo con las instrucciones del fabricante (BD Biosciences OPT-EIA itiMCP-1) . gH3gL3 Fab' -PEG (40K) intravenosoZhIL-?ß intravenosa en ratones Se anestesiaron ratones macho Balb/c (18-25 g) con halotano y se inyectaron por vía intravenosa (i.v.) con gH3gL3Fab'-PEG(40K) (100 µ?, en vehículo de PBS) o Fab-PEG de control (100 µ?, en vehículo de PBS) 15 minutos, antes de la inyección i.v. con hlL-?ß (37.5 ó 50 ug/kg) o vehículo (100 µ? de PBS) . Después de 90 minutos, se tomó una muestra de sangre por punción cardiaca en heparina (20 µ?, 100 U/ml) , y se preparó plasma por centrifugación (14,000 x g, 2 min, TA). Las muestras de plasma se almacenaron a -20°C. Las muestras de plasma se ensayaron respecto a interleucina-6 de murino (mIL-6) por ELISA de superposición de acuerdo con las instrucciones del fabricante (BD Biosciences OPT-EIA mIL-6) .
Los resultados demuestran que el pre-tratamiento de los ratones con gH3gL3Fab' -PEG (40K) intraperitoneal era efectiva para reducir la acumulación de neutrófilos inducida por hlL-1ß i.p. (Tabla 2) y la generación de mMCP-1 (Tabla 3). El pre-tratamiento de los ratones con gH3gL3Fab' -PEG( 0K) intravenoso era efectiva también para reducir la generación de mIL-6 inducida por hIL-?ß i.v. Los datos de 3 experimentos separados se resumen en la Tabla . No se observó efecto adverso alguno a ninguna de las dosis utilizadas en cualquiera de los modelos . Por consiguiente, puede esperarse que el anticuerpo gH3gL3Fab' sea útil en el tratamiento de la inflamación y otras enfermedades mediadas por IL-?ß.
Tabla 2 : Acumulación de neutrofilos Dosis de hIL-?ß gH3gL3Fab'- Inhibición máxima i.p. (ng/kg) PEG( 0K) ED50 (%, dosis, mg/kg) (mg/kg) 150 0.02 96(1) 150 0.02 97(1) 150 0.03 95(1) 150 0.06 86(0.1) 150 0.03 89 (1) 150 0.03 98 (0.3) Tabla 3: generación de itiMCP-1 Tabla 4 Ejemplo 4; Clonación y expresión de los fragmentos Fab' Clonación de regiones V seleccionadas en el plásmido de expresión de Fab' pTTOD (Fab') de E. coli El vector de expresión que contiene un Fab' irrelevante, denominado pTTOD (Fab ' ) , se muestra en la Figura 8. El ADN que codifica a la vez la cadena ligera y la cadena pesada está precedido por ADN codificante de la secuencia de señal OmpA de E. coli (Mowa R, Nakamura K and Inouye M. Amino acid sequence of the signal peptide of ompA protein, a major outer membrane protein of Escherichia coli. J. Biol. Chem. 1980; 255(1): 27-9). Las regiones V de IC8 se clonaron en este vector de tal manera que se mantiene esta secuencia de señal, dirigiendo la translocación de ambas cadenas al periplasma de E. coli. El péptido de señal se escinde en la translocación, por lo que no forma parte de la secuencia del producto Fab' . (Observación: la secuencia del péptido de señal OmpA está constituida por los residuos de aminoácido 1 a 21 de la secuencia dada en SEC ID NO: 70. El plásmido pTTOD(Fab') se digirió con las enzimas de restricción EcoRV y BsiWI (BsiWI y SplI son isoesquizómeros) para eliminar la secuencia irrelevante VL y se insertó la región V gL3 de IC8, después de su aislamiento a partir de pMRRlO (lC8gL3). Esto creó el producto de clonación intermedio pTTOD (IC8gL3). Se escindió luego pTTOD (IC8gL3 ) con BsiWI y Apal, y se insertaron 2 fragmentos en una ligación de 3 vías; un fragmento c-kappa/IGS (que podía ser IGS-2 ó IGS-3) y el fragmento IC8gH3 (véase la representación esquemática en la Figura 9). De este modo, se construyeron las 2 variantes del vector pTTOD(lC8gL3gH3 IGS-2) y pTTOD (IC8gL3gH3 IGS-3). Éstas varían únicamente en la secuencia de nucleótidos entre los genes de las cadenas ligera y pesada: IGS-2 confiere un acoplamiento por traducción muy fuerte entre los 2 genes, que da una tasa rápida de traducción de la cadena pesada, IGS-3 confiere una tasa más lenta de traducción de la cadena pesada (véase la solicitud de patente U No. 0129105) .
Expresión en f rmentador de Fab' en E. coli Los plásmidos pTTOD(IC8gL3gH3 IGS-2) y pTTOD (IC8gL3gH3 IGS-3) se transformaron en la cepa W 3110 de E. coli usando los protocolos estándares. El Fab' periplásmico soluble de E. coli se extrajo usando el amortiguador tris-EDTA a 50°C. Después de extracción y enfriamiento, se ajustó el pH del extracto y se separaron las células por centrifugación y filtración. La corriente de alimentación clarificada se diluyó con agua (aproximadamente 2 veces) a fin de reducir la conductividad. Se capturó Fab' usando cromatografía de intercambio de catión (resina SP Sepharose FF) y el Fab' enlazado se eluyó utilizando un etapa de NaCl . La corriente de producto eluida se concentró, se sometió a diafiltración en el amortiguador Tris usando ultrafiltración y se sometió a cromatografía de intercambio de anión (resina Q Sepharose FF) donde el Fab' estaba contenido en la fracción no enlazada. El Fab' purificado se concentró y sometió a diafiltración en tampón de reducción (por ultrafiltración) seguido por reducción usando 2-mercaptoetilamina para activar el tiol bisagra. Se separa luego el reductor por intercambio del tampón de ultrafiltración . La secuenciación del terminal N confirmó la secuencia correcta de aminoácidos y la escisión del conductor OmpA. Se comparó la expresión de Fab' por estos dos plásmidos . La Tabla 5 muestra una comparación de los rendimientos de Fab' del termentador para las variantes IGS-2 e IGS-3. La construcción de IGS-2 supera claramente a IGS-3 en cuanto a productividad de Fab' . Por ello se seleccionó la variante IGS-2. El mapa del plásmido se muestra en la Figura 10. La Figura 11 muestra la secuencia codificante y pTTOD (gH3gL3 Fab' IGS-2) .
Tabla 5: Rendimientos de expresión del termentador,· una comparación de los rendimientos de Fab' periplásmico anti IL-1ß gIC8 Fermentación Fecha Construcción Peri . Proteína Fab' G A280 ELISA (mg/1) (mg/1) FM264 25/09/01 gIC8 IGS2 602 588 FM265 25/09/01 gIC8 IGS2 742 533 FM266 25/09/01 gIC8 IGS3 243 FM267 25/09/01 gIC8 IGS3 224 Actividad, de Fab' producido por E. coli Se analizó luego cierta cantidad del Fab' purificado producido por E. coli en cuanto a afinidad en el ensayo Biacore, como se muestra en la Tabla 1. Como puede verse, este material retiene efectivamente la actividad total en este ensayo.
Unión de PEG del Fab El Fab modificado purificado se conjuga con especificidad de sitio con una molécula ramificada de PEG. Esto se consigue por activación de un solo residuo cisterna en una región bisagra truncada del Fab modificado, seguido por reacción con (PEG) -lisil-maleimida como se ha descrito previamente (A.P. Chapman et al., Nature Biotechnology 17, 780-783, 1999). Una molécula enlazada a PEG de la invención se representa en la Figura 12. El PEG usado fue metoxi-PEG-amina de 20K (que puede obtenerse de Nektar, anteriormente Shearwater) . El Fab' -PEG resultante se purificó por cromatografía de intercambio de catión (SP Sepharose HP) usando una elución en gradiente lineal de NaCl. El Fab' -PEG purificado se concentró y se formuló por ultrafiltración en acetato de sodio 50 mM + NaCl 125 mM, de pH 5.5 para producir el anticuerpo terapéutico neutralizante de la invención.
Se comprenderá, por supuesto, que la presente invención se ha descrito únicamente por vía de ejemplo, que la misma no tiene en modo alguno la intención de ser limitante, y que pueden hacerse modificaciones de detalle dentro del alcance de las reivindicaciones que figuran a continuación. Las características preferidas de cada modalidad de la invención son, como para cada una de las otras modalidades, mutatis mutandis . Todas las publicaciones, con inclusión pero sin carácter limitante de patentes y solicitudes de patente, citadas en la presente descriptiva se incorporan por la presente por referencia como si se indicara específica e individualmente que cada publicación individual se incorporase por referencia en la presente como si se expusiera con todo detalle. Se hace constar que con relación a esta fecha, el mejor método conocido por la solicitante para llevar a la práctica la citada invención, es el que resulta claro de la presente descripción de la invención.

Claims (42)

  1. REIVINDICACIONES Habiéndose descrito la invención como antecede, se reclama como propiedad lo contenido en las siguientes reivindicaciones : 1. Un anticuerpo neutralizante que tiene especificidad para IL-?ß humana que comprende una cadena pesada, caracterizado porque el dominio variable de la cadena pesada comprende por lo menos una de una CDR que tiene la secuencia dada en SEC ID NO: 5 para CDR-Hl, una CDR que tiene la secuencia dada en SEC ID NO: 6 para CDR-H2 y una CDR que tiene la secuencia dada en SEC ID NO: 7 para CDR-H3.
  2. 2. Un anticuerpo neutralizante de conformidad con la reivindicación 1, caracterizado porque el dominio variable de la cadena pesada comprende la secuencia dada en SEC ID NO: 5 para CDR-Hl, la secuencia dada en SEC ID NO: 6 para CDR-H2 y la secuencia dada en SEC ID NO: 7 para CDR-H3.
  3. 3. Un anticuerpo neutralizante que tiene especificidad para IL-?ß humana que comprende una cadena ligera, caracterizado porque el dominio variable de la cadena ligera comprende al menos una de una CDR que tiene la secuencia dada en SEC ID NO: 8 para CDR-Ll, una CDR que tiene la secuencia dada en SEC ID NO: 9 para CDR-L2 y una CDR que tiene la secuencia dada en SEC ID NO: 10 para CDR-L3.
  4. 4. Un anticuerpo neutralizante de conformidad con la reivindicación 3, caracterizado porque el dominio variable de la cadena ligera comprende la secuencia dada en SEC ID NO: 8 para CDR-Ll, la secuencia dada en SEC ID NO: 9 para CDR-L2 y la secuencia dada en SEC ID NO: 10 para CDR-L3.
  5. 5. Un anticuerpo neutralizante de conformidad con la reivindicación 1 ó 2, que comprende adicionalmente una cadena ligera, caracterizado porque el dominio variable de la cadena ligera comprende por lo menos una de una CDR que tiene la secuencia dada en SEC ID NO: 8 para CDR-Ll, una CDR que tiene la secuencia dada en SEC ID NO: 9 para CDR-L2 y una CDR que tiene la secuencia dada en SEC ID NO: 10 para CDR-L3.
  6. 6. Un anticuerpo neutralizante de conformidad con la reivindicación 5, caracterizado porque el dominio variable de la cadena ligera comprende la secuencia dada en SEC ID NO: 8 para CDR-Ll, la secuencia dada en SEC ID NO: 9 para CDR-L2 y la secuencia dada en SEC ID NO: 10 para CDR-L3.
  7. 7. Un anticuerpo neutralizante de conformidad con cualquiera de las reivindicaciones 1 a 6, caracterizado porque el dominio variable de la cadena pesada comprende la secuencia dada en SEC ID NO: 5 para CDR-Hl, la secuencia dada en SEC ID NO: 6 para CDR-H2 y la secuencia dada en SEC ID NO: 7 para CDR-H3 , y en el cual el dominio variable de la cadena ligera comprende la secuencia dada en SEC ID NO: 8 para CDR-Ll, la secuencia dada en SEC ID NO: 9 para CDR-L2 y la secuencia dada en SEC ID NO: 10 para CDR-L3.
  8. 8. Un anticuerpo neutralizante de conformidad con cualquiera de las reivindicaciones 1 a 7, caracterizado porque el anticuerpo neutralizante es una molécula de anticuerpo injertada a CDR.
  9. 9. La molécula de anticuerpo de conformidad con la reivindicación 8, caracterizada porque el dominio variable comprende regiones armazón aceptoras humanas y CDRs donantes no humanas .
  10. 10. Una molécula de anticuerpo injertada a CDR de conformidad con la reivindicación 9, caracterizada porgue la región de estructura de la cadena pesada se deriva de la secuencia del subgrupo humana 3-11 (DP-35) junto con JH4.
  11. 11. Una molécula de anticuerpo injertada a CDR de conformidad con la reivindicación 10, caracterizada porgue el residuo en por lo menos una de las posiciones 44 y 89 del dominio variable de la cadena pesada es un residuo donante.
  12. 12. Una molécula de anticuerpo injertada a CDR de conformidad con la reivindicación 10, caracterizada porque el residuo en al menos la posición 44 del dominio variable de la cadena pesada es un residuo donante.
  13. 13. Una molécula de anticuerpo injertada a CDR de conformidad con cualquiera de las reivindicaciones 8 a 12 , caracterizada porque la región de estructura de la cadena ligera se deriva de la secuencia del subgrupo humana 012 (DPK9) junto con JKl .
  14. 14. Una molécula de anticuerpo injertada a CDR de conformidad con la reivindicación 13, caracterizada porgue el residuo en al menos una de las posiciones 40, 45, 48, 70 Y 85 es un residuo donante.
  15. 15. Una molécula de anticuerpo injertada a CDR de conformidad con la reivindicación 14, caracterizada porgue los residuos en las posiciones 45, 70 y 85 son residuos donantes .
  16. 16. Un anticuerpo injertado a CDR de conformidad con cualquiera de las reivindicaciones 8 a 15, caracterizado porque la cadena pesada comprende la secuencia gH3 (SEC ID NO: 15) .
  17. 17. Un anticuerpo injertado a CDR de conformidad con cualquiera de las reivindicaciones 8 a 15, caracterizado porque la cadena ligera comprende la secuencia gL3 (SEC ID NO: 20) .
  18. 18. Un anticuerpo injertado a CDR de conformidad con cualquiera de las reivindicaciones 8 a 15, caracterizado porque la cadena pesada comprende la secuencia gH3 (SEC ID NO: 15) y la cadena ligera comprende la secuencia gL3 (SEC ID NO: 20) .
  19. 19. Un anticuerpo neutralizante que tiene especificidad para IL-?ß humana, que tiene una cadena pesada, caracterizado porque comprende la secuencia dada en SEC ID NO: 3 y una cadena ligera que comprende la secuencia dada en SEC ID NO: 4.
  20. 20. Un anticuerpo neutralizante que tiene especificidad para IL-?ß humana, que tiene un dominio variable, caracterizado porque es por lo menos idéntico o similar en un 90% al anticuerpo de una cualquiera de las reivindicaciones 2, 4, 18 ó 19.
  21. 21. Una molécula de anticuerpo neutralizante de conformidad con cualquiera de las reivindicaciones 1 a 20, caracterizada porque la molécula de anticuerpo se selecciona del grupo constituido por: una molécula de anticuerpo completa que tiene cadenas pesada y ligera de longitud total o un fragmento de las mismas, tal como un fragmento Fab, Fab modificado, Fab', F(ab' )2, Fv o scFv.
  22. 22. Una molécula de anticuerpo neutralizante de conformidad con la reivindicación 21, caracterizada porque se ha modificado para permitir que se fije a ella una molécula efectora o reportera.
  23. 23. Una molécula de anticuerpo neutralizante de conformidad con la reivindicación 22, caracterizada porque la modificación es la adición al extremo del terminal C de su cadena pesada de uno o más aminoácidos para permitir la unión de una molécula efectora o informadora.
  24. 24. La molécula de anticuerpo de conformidad con la reivindicación 23, caracterizada porque los aminoácidos adicionales forman una región bisagra modificada que contiene uno o dos residuos cisterna a los cuales puede enlazarse la molécula efectora o reportera.
  25. 25. Una molécula de anticuerpo neutralizante de conformidad con cualquiera de las reivindicaciones 22 a 24, caracterizada porque tiene una molécula efectora o reportera enlazada a ella.
  26. 26. Una molécula de anticuerpo neutralizante de conformidad con la reivindicación 25, caracterizada porque la molécula efectora comprende uno o más polímeros .
  27. 27. Una molécula de anticuerpo neutralizante de conformidad con la reivindicación 26, caracterizada porque uno o más polímeros es/son polímero de polialquileno, polialquenileno o polioxialquenileno de cadena lineal o ramificada opcionalmente sustituido o un polisacárido ramificado o no ramificado .
  28. 28. Una molécula de anticuerpo neutralizante de conformidad con la reivindicación 26, caracterizada porque el uno o más polímeros es/son un metoxipoli (etilenglicol) o poli (etilenglicol) .
  29. 29. Una molécula de anticuerpo neutralizante de conformidad con la reivindicación 25, caracterizada porque tiene enlazado a uno de los residuos cisteína en el extremo del terminal C de la cadena pesada un grupo lisil-maleimida o lisil-bis-maleimida, en el cual cada grupo amino del residuo lisilo tiene enlazado covalentemente a él un residuo metoxipoli (etilenglicol) que tiene un peso molecular de aproximadamente 20, 000 Da .
  30. 30. Una molécula de anticuerpo neutralizante, caracterizada porgue tiene especificidad para IL-?ß humana, que es un fragmento Fab modificado que tiene una cadena pesada que comprende la secuencia dada en SEC ID NO: 15 y una cadena ligera que comprende la secuencia dada en SEC ID NO: 20 y que tiene en el extremo del terminal C de su cadena pesada una región bisagra modificada que contiene un residuo cisteína al cual puede enlazarse una molécula efectora o reportera.
  31. 31. Una molécula de anticuerpo neutralizante, caracterizada porque tiene especificidad para IL-?ß humana, que es un fragmento Fab modificado que tiene una cadena pesada que comprende la secuencia dada en SEC ID NO: 15 y una cadena ligera que comprende la secuencia dada en SEC ID NO: 20, y que tiene en el extremo del terminal C de su cadena pesada un región bisagra modificada que contiene un residuo cisteína al cual está enlazada una molécula efectora o reportera .
  32. 32. Una molécula de anticuerpo neutralizante de conformidad con la reivindicación 31, caracterizada porque su cadena pesada comprende o está constituida por los residuos de aminoácido números 22 a 251 de la secuencia dada en SEC ID NO: 71, y en la cual su cadena ligera comprende o está constituida por los residuos de aminoácido números 22 a 235 de la secuencia dada en SEC ID NO: 70.
  33. 33. Una molécula de anticuerpo neutralizante de conformidad con la reivindicación 31 ó la reivindicación 32, caracterizada porque tiene enlazado al residuo ciste na en el extremo del terminal C de la cadena pesada un grupo lisil-maleimida, en el cual cada grupo amino del residuo lisilo tiene enlazado covalentemente a él un residuo metoxipoli (etilenglicol) que tiene un peso molecular de aproximadamente 20,000 Da.
  34. 34. Una molécula de anticuerpo neutralizante que tiene especificidad para IL-?ß humana, caracterizada porque se enlaza al mismo ep tope que el anticuerpo de conformidad con la reivindicación 18.
  35. 35. Una secuencia de ADN aislada, caracterizada porque codifica la o las cadenas pesada y/o ligera de una molécula de anticuerpo de conformidad con cualquiera de las reivindicaciones 1 a 34.
  36. 36. Un vector de clonación o expresión, caracterizado porque comprende una o más secuencias de ADN de conformidad con la reivindicación 35.
  37. 37. El vector de conformidad con la reivindicación 36, caracterizado porque comprende el vector la secuencia dada en SEC ID NO: 69.
  38. 38. Una célula hospedera, caracterizada porque comprende uno o más vectores de clonación o expresión de conformidad con las reivindicaciones 36 ó 37.
  39. 39. Un proceso para la producción de la molécula de anticuerpo de conformidad con cualquiera de las reivindicaciones 1 a 34, caracterizado porque comprende cultivar la célula hospedera de la reivindicación 38 y aislar la molécula de anticuerpo.
  40. 40. Una composición farmacéutica, caracterizada porque comprende una molécula de anticuerpo de conformidad con cualquiera de las reivindicaciones 1 a 34, en combinación con uno o más de un excipiente, diluyente o vehículo farmacéuticamente aceptable.
  41. 41. Una composición farmacéutica de conformidad con la reivindicación 40, caracterizada porque comprende adicionalmente otros ingredientes activos .
  42. 42. Una molécula de anticuerpo de conformidad con cualquiera de conformidad con cualquiera de las reivindicaciones 1 a 34, o una composición farmacéutica de acuerdo con la reivindicación 40 o la reivindicación 41, caracterizada porque es para el uso en el tratamiento o la profilaxis de un trastorno patológico que está mediado por IL-?ß, o que está asociado con un nivel incrementado de IL- 1P-
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